UPDATE MALATTIA CELIACA SIEROLOGIA DELLA MALATTIA CELIACA UNITA
DI PATOLOGIA CLINICA AZIENDA OSPEDALI RIUNITI VILLA SOFIA-CERVELLO
Direttore Dott: Tomaso Stampone
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Negli anni passati questa malattia veniva sospettata solo nei
bambini che non crescevano. Negli ultimi anni, lepidemia della
celiachia ha assunto dimensioni inaspettate a livello globale, ed
in molti paesi occidentali da malattia rara divenuta una condizione
molto diffusa, con un elevato impatto sociale essendo una malattia
che dura tutta la vita se non si inizia una dieta priva di
glutine.
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Recentemente si visto che la M.C. in realt molto diffusa e
subdola e pu comparire in un periodo qualsiasi della vita con
sintomi molto sfumati Nellet adulta caratterizzata dalla presenza
di una combinazione variabile di manifestazioni cliniche associate
o no ai sintomi gastro-intestinali Oggi si pu affermare che i
celiaci con il classico quadro di malassorbimento intestinale,
caratterizzato da diarrea e perdita di peso, sono sempre pi rari ad
osservarsi, mentre predominano altri sintomi la stipsi ostinata, i
dolori addominali, lanemia sideropenica e losteoporosi.
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E una malattia cronica sistemica immunomediata indotta
dallingestione di glutine che, in soggetti geneticamente
suscettibili, determina un processo infiammatorio che porta a
lesioni della mucosa dellintestino tenue con conseguente
malassorbimento e manifestazioni extraintestinali
extraintestinali
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Malattia celiaca Glutine ingerito Genetica HLA II DQ2/DQ8
Antigliadina ( Ag esogeno ) Anti transglutaminasi ( Ag endogeno)
Anti endomisio ( Ag endogeno ) Fattori di rischio (Sesso
allattamento infezioni altro )
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sistema nervoso cuore cute e cavit orale fegato sistema
emopoiteco tiroide osso sistema riproduttivo femminile e maschile
Organo bersaglio intestino tenue
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La celiachia una malattia per cui l'ingestione di glutine (in
particolare della proteina gliadina) determina un aumento della
permeabilit epiteliale e contemporaneamente unattivazione della
transglutaminasi tissutale che ha un ruolo importante nellinnescare
il disordine immunologico attraverso la deamidazione della gliadina
che viene trasformata in peptidi ricchi di acido glutammico ad alta
affinit per la tasca recettoriale HLA DQ2/DQ8 situate sulla
superficie delle APC. Questi peptidi vengono processati dalle APC
ed esposti sulla loro superficie stimolano i linfociti T CD4+ ( che
una volta attivati iniziano a produrre citochine ) e i linfociti B
( produzione di anticorpi AGA, anti-tTG ed EMA )
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MARCATORI SIEROLOGICI A partire dagli anni 80,grazie alla
individuazione della patogenesi e la comparsa dei primi marcatori
sierologici, il laboratorio diventato componente fondamentale del
percorso diagnostico della malattia celiaca Si tratta di analisi di
laboratorio che prevedono un normale prelievo di sangue e che non
richiedono alcuna specifica preparazione.
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G li anticorpi appartengono alla classe IgA ed IgG, ma in
generale solamente gli anticorpi di classe IgA possono essere
considerati marker altamente sensibili e specifici per
lintolleranza al glutine. Limpiego dei marker di classe IgG e
spesso fuorviante a causa dellelevata percentuale di falsi positivi
ed il loro uso dovrebbe essere limitato ai pazienti con deficit di
IgA., condizione strettamente associata alla celiachia. IgA che
corrispondono al 20% delle immunoglobuline circolanti (immunit
locale)
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IgA. 70-370 mg/dl (normal range) IgM.. 60-260 mg/dl IgG
700-1600 mg/dl Si osservano, molto spesso deficit parziali, ossia
casi in cui la produzione anticorpale esiste, ma in quantit
insufficiente per let. IgA n.d. (alla nascita) 8-74( 3 mesi) 10-85
(1 anno) 60-270 (2-10 anni) IgA DEFICIENCY
Sono i primi anticorpi messi in evidenza nei soggetti con CD:
sono Ab diretti contro un Ag esogeno, la alfa gliadina da glutine
di grano. Nel siero dei soggetti con CD si trovano Ab AGA isotipi
IgA e IgG. La determinazione delle IgA utile nella diagnosi delle
malattia in fase attiva e nel monitoraggio del comportamento
alimentare dopo prescrizione della dieta priva di glutine.
ANTICORPI ANTIGLIADINA- AGA ANTICORPI ANTIGLIADINA- AGA
ANTIGLIADINA AGA IgA IgG (1967- 1970) (Dike 1950) ELISA Un tempo
esame di elezione per la diagnosi di celiachia risultano positivi
anche in altre patologie BASSA SENSIBILITA 70-90% E SPECIFICITA
82-92%
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Valori di riferimento Unit Negativo 30 METODICA ELISA
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Limiti della metodica legati alla scarsa specificit (rischio di
falsi positivi)
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LA TRANSGLUTAMINASI TISSUTALE (tTG) Caratteristiche: Enzima
ubiquitario Ca++dip. Amino--glutamil-transferasi Peso molecolare:
78,24 k Catena aminoacidica: 689 aa Assenza di ponti di-solfuro
Esistono diverse forme isoenzimatiche: Transglutaminasi 2 presente
a livello della lamina propria dellintestino tenue nei celiaci
ANTITRANSGLUTAMINASI tTG IgA/ IgG (1997 W. Dieterick) E stata
identificata come l'antigene pi importante nella malattia celiaca.
Gli anticorpi IgA anti-tTG sono dei marcatori sierologici altamente
specifici per la malattia celiaca. Gli anticorpi IgG anti-tTG sono
meno specifici, ma sono comunque un valido marker nei pazienti con
deficit di IgA. METODICA : ELISA automatica risultati affidabili
precisi quantitativi Valori di riferimento: Unit Negativo 30
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T RANSGLUTAMINASITISSUTALE FONTI DI ANTIGENE Fonti naturali
Tecniche ricombinanti Purificato da fegato Procarioti(E. Coli) di
guinea pig Baculovirus / cellule eucariote di insetto Estratto da
eritrociti umani 293-EBNA cellule renali embrionali
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I baculovirus sono una famiglia di virus in grado di infettare
una grande variet di artropodi ed in particolar modo le larve di
Spodoptera frugiperda (Sf9) assumono unimportanza fondamentale
nella pratica di laboratorio cos come nellindustria, in quanto
attraverso opportune modificazioni genetiche del loro genoma
(baculovirus ricombinante) possibile impiegarli come vettori di
espressione per la produzione su larga scala di proteine
ricombinanti. Coltura di cellule d'insetto Spodoptera frugiperda
(Sf9) infettate con baculovirus ricombinante a 48 ore
dall'infezione
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Figura 1 Profilo elettroforetico della tTG ottenuto con diverse
tecnologie di produzione (Gel- filtrazione con 0.3 mg/ml di
preparato proteico). La transglutaminasi ottenuta con la tecnologia
DNA ricombinante eucariota Baculovirus/cellule di insetto presenta
un profilo elettroforetico tipico di una proteina omogenea, in
forma integra e priva di contaminazioni. La proteina ottenuta con
le altre tecnologie di produzione presentano invece limiti o di
integrit e/o di purezza.
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Anticorpi Anti-Endomisio su esofago distale di scimmia MONKEY
EOSOPHAGUS ENDOMYSIAL Detection of endomysial antibodies
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ANTIENDOMISIO EMA IFA (1983 Chorzelski) Sono autoanticorpi
diretti verso lendomisio della muscolatura liscia dellintestino. Il
test degli anticorpi anti-endomisio, effettuato con la metodica
dellimmunofluorescenza indiretta che utilizza come substrato
antigenico lesofago distale di scimmia o il cordone ombelicale
umano e che rende visibile la reazione ANTIGENE-ANTICORPO marcando
con la fluorescina o la rodamina. Al microscopio la positivit degli
EMA appre come una intensa fluorescenza a nido dape Viene
attualmente utilizzato dalla maggior parte dei laboratori come test
di conferma per i casi positivi per gli anti-tTG ANTICORPI ANTI
ENDOMISIO EMA
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EMA Elementi critici della procedura Interpretazione soggettiva
Utilizzo di substrati ottenuti da due particolari linee cellulari
Metodica semiquantitativa
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ANTI-tTG EMA
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DGP-AGA Sono un nuovo interessante marcatore, avente una
specificit talmente elevata (99%) un Valore Predittivo Positivo
molto elevato da raggiungere quella degli EmA IgA e quella degli
anti-tTG IgA I DGP-AGA, inoltre, si sono rivelati anche ottimi
marcatori immunologici per individuare celiaci al di sotto dei due
anni di et infatti sono rilevabili ancora prima rispetto alle IgA
tTG. Deamidated gliadin peptide
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C CH 2 C H O NH 2 H 2 N COOH Gln C CH 2 C H O O - H 2 N COOH
Glu Le cariche negative introdotte da questo processo di
deamidazione aumentano laffinit dei peptidi con la molecola DQ2.
Lenzima transglutaminasi tissutale (tTG) a livello della mucosa
intestinale attraverso un processo di deaminazione converte la
glutammina ad acido glutammico. * Range di normalit
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Lanticorpo di classe IgG (IgG DGP) la vera novit In aggiunta
alle tTG aumenta la nostra capacit diagnostica IgG DGP: Pu essere
impiegato nei deficit di IgA sia nei bambini che negli adulti unico
esame utile da richiedere Pu essere impiegato nei bambini al di
sotto dei due anni di et come test aggiuntivo Il test Gliadina
Deamidata IgG consente il recupero significativo dei cosiddetti
falsi positivi IgG DGP un marcatore pi tempestivo della aderenza
alla dieta aglutinata in quanto gli anti tTg e gli EMA si
negativizzano in ritardo
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IgA DGP IgA - tTG
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Sono anche disponibili test rapidi, eseguiti su goccia di
sangue, per la ricerca degli anti-tTG. Laccuratezza diagnostica dei
test rapidi indubbiamente inferiore a quella dei marker sierologici
tradizionali, per cui il risultato di questi test dovrebbe essere
sempre controllato con la ricerca degli anti-tTG in ELISA. Si
tratta di un test qualitativo (anticorpi s - anticorpi no )
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ALGORITMO DIAGNOSTICO Quali anticorpi devono essere utilizzati
nello screening della celiachia?
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Unaltra importante pietra miliare nella storia della
celiachia!
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CONGRESSO ESPGHAN 2011: 25-27 maggio 2011, Sorrento Da diversi
anni un gruppo dellESPGHAN sta lavorando alla formulazione di pi
attuali criteri diagnostici, la cui validazione clinica dovrebbe
concludersi a breve con la pubblicazione delle nuove linee guida.
In accordo a tali criteri, la diagnosi di celiachia dovr
realizzarsi attraverso lintegrazione di dati clinici, sierologici,
genetici, istologici, definire nuovi percorsi diagnostici pi
appropriati e richieste di esami pi mirate In presenza del sospetto
clinico di celiachia (soggetto con manifestazioni tipiche ed
atipiche), si proceder al dosaggio delle IgA totali e alla ricerca
degli anticorpi anti- transglutaminasi. Sulla base del valore delle
transglutaminasi, possibile distinguere 3 scenari clinici
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SCENARIO CLINICO 1: in caso di forte positivit degli
anti-transglutaminasi (valori superiori a 10 volte i valori massimi
di riferimento) in soggetti sintomatici, per confermare la diagnosi
di celiachia sar sufficiente riscontrare gli anti-endomisio e,
mediante il test di tipizzazione genetica, un HLA compatibile (DQ2
o DQ8); in caso di negativit degli anti-endomisio e del test
genetico, si dovr riconsiderare la diagnosi; in caso di discordanza
tra il risultato degli anti-endomisio e del test genetico, la
biopsia intestinale sar comunque necessaria.
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SCENARIO CLINICO 2: in caso di anti-transglutaminasi presenti a
basso titolo (