Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Institut für Tierwissenschaften, Abteilung Physiologie und Hygiene Universität Bonn
Untersuchungen zur energetischen Regulation des Leptinsystems bei der Ziege
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von CHRISTOPH SEYBOLD
aus Heilbronn
Hannover 2008
Wissenschaftliche Betreuung: Herr Prof. Dr. Gerhard Breves Frau Prof. Dr. Dr. Helga Sauerwein 1. Gutachter: Herr Prof. Dr. G. Breves 2. Gutachter: Herr Prof. Dr. M. Ganter Tag der mündlichen Prüfung: 30. Mai 2008 Diese Arbeit wurde durch die H. Wilhelm Schaumann Stiftung finanziell unterstützt.
Für meine Familie.
Ergebnisse dieser Dissertation wurden auf der International Conference on Farm
Animal Endocrinology 2004 in Budapest, (Ungarn, Poster und Abstrakt), der 59.
Tagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie 2005 in Stuttgart-Hohenheim
(Vortrag und Poster), der 16. Tagung der Fachgruppe Physiologie und Biochemie der
Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft 2006 in Gießen (Vortrag und
Abstrakt), der 8th European Congress of Endocrinology 2006 in Glasgow
(Großbritannien, Poster und Abstrakt), in Journal of Animal Science 84, Suppl. 1/
Journal of Dairy Science 89, Suppl. 1: 348 (2006, Volltext und Abstrakt) und in
Journal of Livestock Science, doi:10.1016/j.livsci.2008.02.001 (2008, Volltext und
Abstrakt) veröffentlicht.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung und Literaturübersicht 1 2 Material und Methoden 16 2.1 Versuchstiere 16 2.1.1 Haltung und Fütterung 16 2.1.2 Versuchsablauf 16 2.1.3 Tierschutz, Tierbetreuung und Belastungsbeurteilung 17 2.2 Bestimmung von Metaboliten und Hormone im Blut 18 2.2.1 Glukose 18 2.2.2 Serumgewinnung 18 2.2.3 Leptin 18 2.2.4 Insulin 19 2.2.5 Freie Fettsäuren 19 2.3 Effekte einer Propionatinfusion auf das periphere Leptin-
system und Parameter des Glukosestoffwechsels bei der Ziege 20
2.3.1 Entwicklung von real-time RT-PCR Assays für Leptin (ob), die lange Form des Leptinrezeptors (ob-Rb), den G-proteingekoppelten Rezeptor 41 (GPR41) und die 18S rRNA 20
2.3.1.1 Mengenbestimmung und Kontrolle der RNA 20 2.3.1.2 Reverse Transkription (RT) 23 2.3.1.3 Zielgene und interne Kontrolle für die PCR 24 2.3.1.4 Real-time RT-PCR 27 2.3.1.5 Statistische Auswertung 33 2.3.2 Untersuchung von Leptin, Insulin und Glukose im Blut 34 2.3.2.1 Versuchstiere 34 2.3.2.2 Euthanasie und Entnahme der Gewebeproben 34 2.3.2.3 Infusionslösungen 35 2.3.2.4 Versuchsaufbau und Blutentnahmen 36 2.3.2.5 Statistische Auswertung 37 2.4 Untersuchung von Plasmaleptingehalt und Glukosestoff-
wechsel bei Ziegen peri partum 37 2.4.1 Versuchstiere 37 2.4.2 Hyperglykämischer Clamp und Euglykämisch/hyperinsulinämischer
Clamp 38 2.4.3 Messgrößen 40 2.4.4 Vergleichsgrößen der Clampstudien 41 2.4.5 Erfassung der Milchmenge und Laktosekonzentration 41 2.4.6 Statistische Auswertung 42
Inhaltsverzeichnis
3 Ergebnisse 43 3.1 Effekte intravenöser Propionatinfusionen auf verschiedene
Zielparameter 43 3.1.1 Beeinflussung der mRNA-Mengen in verschiedenen Geweben 43 3.1.1.1 Qualität der Gesamt-RNA 43 3.1.1.2 cDNA-Sequenz der langen Form des Leptinrezeptor und
putativen G-proteingekoppelten Rezeptor bei der Ziege 43 3.1.1.3 Gelelektrophorese der real-time PCR-Amplifikate 44 3.1.1.4 Ergebnisse der mRNA-Quantifizierung 48 3.1.1.4.1 Unterschiede der mRNA-Mengen in den Fettgeweben 48 3.1.1.4.2 Leptin 49 3.1.1.4.3 Lange Form des Leptinrezeptors 49 3.1.1.4.4 Putativer G-proteingekoppelter Rezeptor GPR41 49 3.1.2 Veränderungen spezifischer Blutparameter durch intravenöse
Propionatinfusion 51 3.1.2.1 Leptin 51 3.1.2.2 Insulin 51 3.1.2.3 Glukose 52 3.1.2.4 Freie Fettsäuren 52 3.2 Veränderungen im Glukosestoffwechsel bei trächtigen und bei
laktierenden Ziegen 54 3.2.1 Hyperglykämischer Clamp 54 3.2.2 Euglykämisch/hyperinsulinämischer Clamp 55 3.2.3 Leptin 56 3.2.4 Freie Fettsäuren 59 3.2.5 Einflüsse der Glukose- und Insulininfusion auf die Milchleistung 60 4 Diskussion 62 4.1 Quantifizierende real-time RT-PCR 62 4.2 Veränderungen durch Propionatinfusion und deren Einfluss
auf die Genexpression der untersuchten mRNA-Spezies 69 4.3 Veränderungen von Leptin und Insulin, sowie Einflüsse der
Galaktopoese bei der Ziege peri partum 82 5 Zusammenfassung 91 6 Summary 93 7 Literaturverzeichnis 95
Inhaltsverzeichnis
8 Tabellenverzeichnis 113 9 Abbildungsverzeichnis 114 10 Anhang 115
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
ad lib. ad libitum ADP Adenosindiphosphat Aq. bidest. Aqua bidestillata ATP Adenosintriphosphat BCS Body conditioning score cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat cDNA komplementäre DNA CoA Coenzym A CT Threshold cycle CV Variationskoeffizient DEPC Diethylpyrocarbonat EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EST Expressed sequence tags FFA Free fatty acid GAPDH Glyceraldehyd 3-Phosphat Dehydrogenase GIR Glukoseinfusionsrate GDP Guanosindiphosphat GLM General linear model GLUT Glukosetransporter GTC Guanidinthiocyanat GTP Guanosintriphosphat HBW Hexosaminbiosyntheseweg HHG Haushaltsgene JAK Januskinase IRS Insulin-Rezeptorsubstrat LCFA Long-chained fatty acids MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase MCR Metabolic clearance rate of insulin MOPS 3-N-Morphlino-Propansulfonsäure mRNA Messenger RNA n Anzahl der Tiere NEFA Non-esterified fatty acid NSP Nutrient-sensing pathway r Korrelationskoeffizient rRNA Ribosomale RNA RT-PCR Reverse transcription PCR PCR Polymerase chain reaction qPCR Quantitative PCR SCFA Short-chained fatty acid SDR Systemic delivery rate of insulin SEM Standard Error of Means SGLT Sodium Glucose Cotransporter STAT Signal transducer and activator of transcription TGF-ß Transforming growth factor ß TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin TNFα Tumor Nekrose Faktor TS Trockensubstanz
Einleitung und Literaturübersicht 1
1 Einleitung und Literaturübersicht
Die Tierhaltung in der modernen Landwirtschaft steht großen Herausforderungen
gegenüber. Einerseits steigen die Anforderungen an Umwelt- und Tierschutz,
andererseits erfordert ein zunehmender Preis- und Konkurrenzdruck höhere
Produktionsleistungen. Um diesen Entwicklungen nachzukommen, und gleichzeitig
eine gute Tiergesundheit zu gewährleisten ist die Erforschung und das Wissen über
die genauen Zusammenhänge der Stoffwechselphysiologie und ihrer Regulation
wichtig.
Die Leistungen der Nutztiere werden durch die Parameter Wachstum, Laktation und
Reproduktion beschrieben, einhergehend mit hohen Stoffwechselraten der Tiere.
Voraussetzung dafür ist eine ausreichende Energieversorgung. Sie ist nicht nur für
die Aufrechterhaltung der Stoffwechselvorgänge bedeutsam, sondern ist auch direkt
mit der Tiergesundheit verbunden.
Eine mangelnde Versorgung resultiert nicht nur in verminderter Leistung, sondern
birgt auch gesundheitliche Risiken für den betroffenen Bestand. Energiedefizite
treten insbesondere bei hochleistenden Tieren auf (FUHRMANN et al., 1989). Bei
der Milcherzeugung, aber auch für die Reproduktion, ist dabei gerade der Zeitraum
um die Geburt eine besonders kritische Zeit in der Versorgung des Organismus
(DRACKLEY, 1999). Namentlich stellt das Fettmobilisationssyndrom der Milchkuh
ein Problem in der Milchviehwirtschaft dar, denn damit sind weitere Erkrankungen,
wie Endometritis, Mastitis oder Dislocatio abomasi verbunden (CAMERON et al.,
1998; DRACKLEY, 1999). Auch bei anderen landwirtschaftlichen Nutztieren sind
peripartale Stoffwechselerkrankungen bekannt, wie die Trächtigkeitstoxikose bei
Schaf und Ziege (BOSTEDT u. DEDIE, 1996).
Der Organismus ermöglicht einerseits die metabolische Anpassung des Organismus
an verschiedene Belastungszustände (z.B. Nahrungsmangel), und andererseits
gleichzeitig die Aufrechterhaltung der lebens- bzw. arterhaltenden Funktionen
(Reproduktion, Gravidität, Laktation, Wachstum). Diese homöorhetische Regulation
wird durch ein fein abgestimmtes Regelwerk von Faktoren und Hormonen
ermöglicht. Dabei wird die Nährstoffversorgung des Gewebes gewährleistet, das für
die jeweilige Stoffwechselleistung im Vordergrund steht („Nutrient partitioning“). Eine
hervorgehobene Bedeutung wird dabei dem Hormon Leptin zugeschrieben (zur
Übersicht: VERNON u. POND, 1997; INGVARTSEN u. BOISCLAIR, 2001).
Einleitung und Literaturübersicht 2
Hauptsyntheseort für Leptin ist bei monogastrischen und ruminierenden Spezies das
weiße Fettgewebe (zur Übersicht: FRIEDMAN und HALAAS, 1998; CHILLIARD et
al., 2001; DELAVAUD et al., 2002). Das Fettgewebe synthetisiert zudem eine Reihe
von Hormonen, Vorläufern, Gewebshormonen und Zytokinen, wie z.B. Adiponektin,
Angiotensinogen, Transforming Growth Factor-ß (TGF-ß) und Tumor Nekrose
Faktor α (TNFα). Neben seiner Funktion als Energiespeicher, auf den im Bedarfsfall
zurückgegriffen wird, wirkt es als endokrines Organ in vielfältiger Weise auf den
Energiestoffwechsel und die Körperfunktionen.
Leptin (griech. leptos = schlank) ist ein niedermolekulares Protein und besteht aus
167 Aminosäuren. Am N-terminalen Ende trägt es eine Signalsequenz aus 21
Aminosäuren, welches bei der Translokation in Mikrosomen und anschließender
Exozytose entfernt wird. Das zirkulierende Peptid hat eine Größe von 146
Aminsäuren mit einer molekularen Masse von 14–16 kDa. Aufgrund von
Strukturähnlichkeiten wird es der Familie der Zytokine zugerechnet. Leptin ist das
Produkt des ob-Gens, (ob für griech. obesitas = Fettleibigkeit), welches 1994 von
ZHANG et al. sequenziert wurde. Das zirkulierende Hormon wird durch ein
spezifisches Bindungsprotein reguliert. Bei Ratten liegt 88% des zirkulierenden
Leptins frei, und bei Menschen 24% in gebundener Form vor. Die Halbwertszeit des
Proteins beim Menschen liegt im Durchschnitt bei 25 Minuten. Bei Nagern verlängert
sich durch die Bindung die Halbwertszeit von 3,4 min auf 71 Minuten. (GARCIA et
al., 2002; MAČAJOVA et al., 2004; LIEFERS et al., 2005; ZIEBA et al., 2005).
Die Expression von Leptin in verschiedenen Fettdepots differiert zwischen den
Tierarten. CHELIKANI et al. (2003a) wiesen Leptin-mRNA bei Rindern in
subkutanem, perikardialem, perirenalem und mesenterialem Fettgewebe nach.
Konzentrationsunterschiede zwischen den Depots bestanden dabei nicht. Dies
bestätigt die Untersuchungen nach JI et al. (1998), die ebenfalls beim Rind keine
Unterschiede zwischen Unterhautfett, omentalem und perirenalem Fettgewebe
nachweisen konnten. Nach KIM et al. (2000) ist jedoch die Expression in perirenalem
Fett höher gegenüber anderen Fettdepots. Hingegen wurde bei Schafen eine
tendenziell höhere, und bei Ziegen signifikant höhere mRNA-Menge im subkutanen
Fettgewebe gegenüber perirenalem Fettgewebe gezeigt (KUMAR et al., 1998;
CHILLIARD et al., 2001). Angaben über die Expression im mesenterialen
Fettgewebe machen die Autoren nicht. Leptin-mRNA wurde außerdem in
Einleitung und Literaturübersicht 3
Eutergewebe, Skelettmuskulatur, Plazenta, Magen-/ Pansenschleimhaut, braunem
Fettgewebe und Gehirn nachgewiesen (CHILLIARD et al., 2001; BARTHA et al.,
2005).
Die Hormonaktivität von Leptin wird durch membranständige Rezeptoren vermittelt.
Diese werden durch das db-Gen codiert. Man unterscheidet mindestens sechs
Isoformen, deren mRNAs durch alternatives Splicing entstehen. Die extrazelluläre
Domäne ist bei allen identisch. Sie unterscheiden sich durch ihre Transmembran-
und intrazelluläre Domäne, und werden als Splice-Varianten a bis f des Ob-R
bezeichnet (FRUHBECK, 2006).
Durch Bindung von Leptin kommt es zur Rezeptordimerisierung. Im intrazellulären
Bereich binden Abschnitte des Rezeptors an Janus-aktivierte Proteinkinasen (JAK).
Diese werden durch Bindung eines Dimers aktiviert. Die JAK wiederum aktiviert den
Signaltransduktions- und Transkriptions (STAT)-Mechanismus, der die Expression
von Genen steuert. Ein weiterer Weg der Signaltransduktion ist die Aktivierung der
mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK) durch die JAK (HOUSEKNECHT u.
PORTOCARRERO, 1998; ZABEAU et al., 2003).
Der Ob-Rb ist durch eine lange intrazelluläre Domäne charakterisiert, und wird
deshalb auch als die lange Form des Leptinrezeptors bezeichnet. Synonym werden
die Bezeichnungen, ob-Rl und LR geführt. Er wird bei Rind und Monogastriern in
einer Vielzahl von Geweben nachgewiesen. Beim Rind wird ob Rb unter anderem im
weißen Fettgewebe, in Skelettmuskulatur, Leber, Milz, Hoden, Hypophyse,
Blutgefäßen und Lunge, sowie im Euterparenchym beobachtet. Der ob-Rb aktiviert
den JAK-STAT und MAPK-Mechanismus. Aufgrund seines Vorkommens in vielen
Geweben ist der ob-Rb somit bestimmend für die Aktivität von Leptin in der
Körperperipherie (zur Übersicht: TARTAGLIA, 1997; INGVARTSEN u. BOISCLAIR,
2001; ZABEAU et al., 2003; FRUHBECK, 2006).
Die Splice-Variante Ob-Ra wird bei der Ratte im Hypothalamus und
Hypophysenvorderlappen, sowie in geringen Mengen in Lunge, Niere, Pankreas,
Leber und Fettgewebe gebildet (LOLLMANN et al., 1997). Nach CHELIKANI et al.
(2003a) wird ob-Ra beim Rind in der Hypophyse, Leber, Milz, Nebennierenrinde und
Hirnstamm exprimiert. YONEKURA et al. (2003) zeigten in boviner Hypophysen-
zellkultur, dass die Ob-Ra-Expression durch die Gabe von Butyrat gesenkt wird. Dies
Einleitung und Literaturübersicht 4
spricht für eine Rolle des Rezeptors bei der zentralnervösen Steuerung der
Energiehomöostase.
Der Ob-Re wird auch als sekretorischer Leptinrezeptor bezeichnet. Seine Expression
steht im Zusammenhang mit Körpermasse, Trächtigkeit und Energieaufnahme. Dem
Ob-Re wird die Rolle als Bindungsprotein für freies Leptin im Blutplasma
zugeschrieben. Beim Menschen konnte dadurch eine Bedeutung bei der Regulation
der Leptinwirkung und Leptinsensitivität gezeigt werden (GAVRILOVA et al., 1997;
LEWANDOWSKI et al., 1999; YANNAKOULIA et al., 2003, YANG et al., 2004). Für
die kurzen Formen Ob-Rc, d und f ist keine Funktion bekannt.
Die allgemeinen Funktionen und Wirkungen von Leptin werden im Folgenden
skizziert. Leptin ist an der Regulation der Energiehomöostase, Steuerung der
Reproduktion, und der kardiovaskulären Entwicklung (z.B. Wundheilung), sowie der
renalen Funktion und der Immunantwort beteiligt (FRUHBECK, 2006). Die primäre
Wirkung des Leptins liegt in der Regulation der Nahrungsaufnahme und
Energiehomöostase. Diese wird hauptsächlich zentralnervös über das
Hypothalamus-Hypophysensystem vermittelt. Im Hypothalamus wird die
Ausschüttung orexigener Neuropeptide vermindert, und die der anorexigenen erhöht.
Gleichzeitig beeinflusst es Wachstum, Stoffwechsel und Fortpflanzung, indem
verschiedene hypothalamische Hormone moduliert werden.
Dabei wird Leptin durch einen negativen Feed-back-Mechanismus reguliert. Seine
Wirkung wird wiederum über diese erhöhten und erniedrigten Plasmaleptinspiegel
gesteuert. Diese Verhältnisse sind sowohl in Monogastriern, als auch bei
Wiederkäuern zu finden (zur Übersicht: INGVARTSEN und BOISCLAIR, 2001).
Für Leptin sind sowohl endokrine, als auch parakrine und autokrine Wirkungen und
Regulation beschrieben (WANG et al., 1999a; CHILLIARD et al., 2001). Bei
Wiederkäuern wird Leptin unabhängig von Tagesrhythmus sezerniert.
(INGVARTSEN u. BOISCLAIR, 2001; ZIEBA et al., 2005).
Beim Rind konnte nachgewiesen werden, dass Polymorphismen des Leptingens in
Zusammenhang mit der Fruchtbarkeit und Leistungsparametern bei den Fleisch- und
Milchrinderrassen stehen, insbesondere mit der Milchmenge, Energieverteilung und
postpartalen Gelbkörperaktivität (LIEFERS et al., 2005).
DELAVAUD et al. (2002) beschreiben, dass bei Wiederkäuern der
Plasmaleptingehalt durch mehrwöchige Futterrestriktion gesenkt wurde, der nach
Einleitung und Literaturübersicht 5
Anfüttern in einigen Tagen wieder anstieg. Der Plasmaleptingehalt war dabei positiv
mit der Fettzellgröße und dem Body-conditioning-score (BCS) korreliert. Schon bei
geringer Futterrestriktion kam es jedoch zum Rückgang des Plasmaleptinspiegels,
ohne eine Änderung der Fettzellgröße oder des BCS herbeizuführen. Die
Nahrungsaufnahme führte bei gut genährten Rindern zu einem Abfall sowohl des
Plasmaleptin-, als auch des Glukosespiegels. Bei schlecht genährten Tieren kam es
dagegen zu einem Anstieg von Plasmaleptin, und einem Erhalt der
Blutglukosekonzentration. Die Konzentration an ß-Hydroxybutyrat und der
Plasmaleptinspiegel nach Nahrungsaufnahme hingegen waren negativ korreliert.
Einen Zusammenhang zwischen dem präprandialen Plasmaleptinspiegel und ß-
Hydroxybutyrat wiesen die Autoren nicht nach. Die Autoren vermuten, dass die
postprandialen Veränderungen der Glukose- und ß-Hydroxybutyratkonzentrationen
zu einer Veränderung der Glukoseaufnahme im Fettgewebe führen, die die
Leptinkonzentration beeinflusst, und so mittelfristig regulierend auf die
Leptinsekretion bei Wiederkäuern wirken.
Da bei Kühen mit geringem Körperfettanteil der niedrige Plasmaleptingehalt jedoch
nicht durch Futterentzug beeinflusst wird, schlussfolgern DELAVAUD et al. (2002),
dass langfristige Effekte von größerer Bedeutung in der Regulation sind, als
mittelfristige.
Bei der energetischen Regulation konnten für dieses Hormon zudem vielfältige
Effekte und Wechselwirkungen mit Hormonen und Metaboliten nachgewiesen
werden. Aufgrund der Komplexität des Systems wird bei der Beschreibung vor allem
auf jene Wirkungen eingegangen, die direkt mit dem Glukose- und Fettstoffwechsel
im Zusammenhang stehen.
Von diesen direkten Wirkungen auf Zellen verschiedener Gewebe sind für die
Regulation der Energiehomöostase die Wirkungen auf den Lipid- und Kohlenhydrat-,
sowie den Intermediärstoffwechsel des Muskelgewebes von besonderem Interesse.
In einer Studie über die Effekte von Insulin und Leptin auf die Leptinsynthese in
Skelettmuskelzellen von Ratten, stimulierte Leptin die Glukoseaufnahme, -oxidation
und Glykogensynthese (CEDDIA et al. 1999). SWEENEY et al. (2001) konnten
jedoch in der Myozytenzellkultur zeigen, daß Leptin keinen Einfluss auf die basale
Glukoseaufnahme, sowie die GLUT4-Translokation (Glucosetransporter 4) ausübt,
aber über verschiedene Wege den insulinabhängigen Glukosetransport senkt.
Einleitung und Literaturübersicht 6
Infolgedessen scheint der Einfluss von Leptin auf den Glukosestoffwechsel indirekt
über Insulin zu erfolgen.
Zusamenfassend scheint Leptin von grundsätzlicher Bedeutung für die Ausbildung
einer verminderten systemischen Insulinsensitivität. Ein mögliches Schlüsselenzym
bei der Ausbildung leptinassoziierter Insulinresistenz ist die Stearoyl-CoA
Desaturase-1, die in der Leber durch Leptin gehemmt wird (COHEN et al., 2002;
COHEN u. FRIEDMAN, 2004).
Gleichzeitig führt Leptin zur Senkung des Plasmaspiegels von Insulin, der
Triacyglyzeride (TAG) und Glukose, und einer Erhöhung des ß-Hydroxybutyrat-
Spiegels. Bei Rindern wiederum wurde eine positive Wirkung des Plasmaleptins auf
die Glykämie und eine negative Korrelation zu ß-Hydroxybutyrat im Plasma in Folge
der Nahrungsaufnahme beobachtet (CHILLIARD et al., 2001).
WANG et al. (1999b) zeigten allerdings bei Ratten, dass Leptin die
Glukoseverwertung im Muskel- und braunen Fettgewebe erhöht, im weißen
Fettgewebe jedoch reduziert. Es bestehen somit gewebespezifische Unterschiede in
der Beeinflussbarkeit durch Leptin, was einen Erklärungsansatz für die teilweise
gegensätzlichen Wirkungen des Leptins im Energiestoffwechsel bildet. Diese
Gewebespezifität weist auf die Bedeutung dieses Hormons bei der Steuerung des
Nutrient partitioning. Freie Fettsäuren (FA) und Lipide im Blutplasma werden durch
Leptin gesenkt, indem es in monogastrischen Muskel- und Leberzellen die FA-
Oxidation erhöht und FA-Veresterung hemmt (SHIMABUKURO et al. 1997;
MINOKOSHI et al., 2002).
Bei trächtigen Ziegen wird durch exogene Leptingabe die Fettsäurenkonzentration im
Blut gesenkt, und die Insulinsensitivität erhöht, während bei laktierenden Ziegen, die
Fettsäuren unbeeinflusst bleiben, und die Insulinsensitivität reduziert wird
(HEINTGES, 2003).
Die Mechanismen der gegenseitigen Beeinflussung von Leptin und Insulin sind noch
nicht abschließend geklärt. Während HOUSEKNECHT et al. (2000) die Erhöhung der
Leptin-mRNA in boviner Adipozytenkultur durch Insulin nachwiesen, zeigten RICCI et
al. (2005), dass die insulininduzierte Leptinerhöhung in der Fettzellkultur von Ratten
und Menschen nicht über die Genexpression, sondern durch posttranskriptionale
Mechanismen reguliert wird.
Einleitung und Literaturübersicht 7
Leptin ist mit Körperfettgehalt, Energiebalance und Höhe der Nahrungsaufnahme
positiv korreliert (KUMAR et al., 1998; DELAVAUD et al., 2002; GEARY et al. 2003).
Der Einfluss von Adipositas auf den Plasmaleptingehalt wurde in den Studien von
DELAVAUD et al. (2000 und 2002) und EHRHARDT et al. (2003) mit 17% bis 35%
angegeben. Allerdings zeigten EHRHARDT et al. (2003) bei nichtruminierenden
Schaflämmern, die physiologisch mit sehr geringem Körperfettgehalt geboren
werden, dass deren Plasmaleptinspiegel vom Ernährungsniveau dominiert wird.
Über die Regulationsmechanismen der Leptinsynthese in peripheren Geweben und
physiologische Zusammenhänge auf zellulärer Ebene, ist beim Wiederkäuer noch
wenig bekannt. Grundsätzlich kann der Plasmaleptinspiegel durch transkriptionale,
posttranskriptionale und posttranslationale Mechanismen gesteuert werden (GARCIA
et al., 2002; LIEFERS et al., 2005; RICCI et al., 2005). Neben hormonellen
Mechanismen wurde zudem bei Rodentia auch eine Autoregulation durch negativen
feed-back im Fettgewebe nachgewiesen, d.h. Plasmaleptin hemmt die
Leptinexpression im Fettgewebe. Da es gleichzeitig die Expression im Skelettmuskel
einleitet, wird dieser Regulationskreis als weiteren Einfluss auf das Nutrient
partitioning angesehen (WANG et al., 1999a; CHILLIARD et al., 2001).
Von größerer Bedeutung für die Regulation der Leptinsynthese sind Nutrient sensing
pathways (NSP). Beim Monogastrier konnte gezeigt werden, dass Glukose
bedeutende Effekte auf die Regulation der Leptinsynthese hat (ZHANG et al., 2002).
Bei Mensch und Nagetieren wurde in vivo wie auch in vitro eine Erhöhung der Leptin-
mRNA und des Proteins im Fettgewebe, sowie des Plasmaleptingehaltes, durch
Infusion von Insulin und Glukose nachgewiesen (MALMSTROM et al., 1996;
MIZUNO et al., 1996; WANG et al., 1998). Auch durch eine übermäßige Zufuhr von
freien Fettsäuren bzw. Glukose oder Glukosamin konnte die Leptinexpression
gesteigert werden (EMILSSON et al., 2001; WANG et al., 1998).
Diese Stoffwechselwege beeinflussen direkt die Leptinsynthese, und bilden somit ein
wichtiges Bindeglied zwischen Nahrungsangebot und –aufnahme, und hormoneller
Steuerung des Energiestoffwechsels. Insbesondere wird der Erforschung von NSP
im Zusammenhang mit der Entstehung von Diabetes Typ 2 Bedeutung beigemessen.
Ein bedeutender Pfad ist der Hexosaminbiosyntheseweg (WANG et al., 1998;
EMILSSON et al., 2001). Schlüsselenzym ist die GFAT (Glutamin:Fruktose-6-
phosphat-Amidotransferase). Als Substrat wird Glukose durch Konjugation mit einer
Einleitung und Literaturübersicht 8
Aminogruppe zu Glukosamin umgebildet. Dieses wird durch Konjugation mit
Uridinphoshat zu einer aktivierten Verbindung. Durch Glykolysierung von Proteinen
können diese reguliert werden. Die Relevanz als Nahrungssensor für Glukose ist
nicht abschließend geklärt (BOSCH et al., 2003 und 2004). POUWELS et al. (2004)
schreiben dem Hexosaminbiosyntheseweg beim Menschen eine Funktion als NSP
für freie Fettsäuren im Fettgewebe zu.
Während jedoch beim Monogastrier ein Zusammenhang zwischen Leptin und der
Entstehung von Insulinresistenz bekannt ist, gibt es für die Wiederkäuer bisher nur
wenige Untersuchungen. Allgemein wird bei den Ruminantia der Blutglukosespiegel
vornehmlich über das Verhältnis von Glucagon und Insulin und die hepatische
Glukoneognense beeinflusst. Dem Insulin wird bei der Regulation der Steuerung der
Glukoseversorgung nur eine untergeordnete Rolle zugeschrieben, wobei die
Zellaufnahme von Glukose in der Körperperipherie grundsätzlich den gleichen
Mechanismen unterliegt (SALLMANN u. FUHRMANN, 2000).
Bei Rindern stimuliert Leptin in einer mittleren Konzentration die Insulinsekretion,
während bei hohen und niedrigen Konzentrationen nur geringe Veränderungen
auftreten. ZIEBA et al. (2005) werten dies so, dass Leptin die Insulinsekretion
normalisiert, und Entgleisungen der Insulinsynthese möglicherweise durch eine
verminderte Leptinsensitivität ausgelöst sein können.
Bei Nagetieren und Menschen wurde schon frühzeitig nachgewiesen, dass eine
supraphysiologische Hyperinsulinämie zu einer Erhöhung der
Plasmaleptinkonzentration führt. Diese Effekte treten jedoch nach mehreren Stunden
auf (4 Stunden) (UTRIAINEN et al., 1996). Der Einfluss von Glukose und Insulin auf
die Leptinsekretion bei Wiederkäuern wurde von verschiedenen Autoren untersucht.
KAUTER et al. (2000) und GABAI et al. (2002) konnten durch Insulininfusion keine
Erhöhung der Leptinsekretion nachweisen. LEURY et al. (2003) konnten nach 24
Stunden euglykämisch-hyperinsulinämischer Clamps eine Erhöhung des
zirkulierenden Leptins nachweisen.
Bei verschiedenen Autoren ist der ältere Begriff der volatile (engl.) oder flüchtigen
Fettsäuren (VFA) für Fettsäuren aus der Wiederkäuervormagenfermentation
gebräuchlich. Zudem findet in der Literatur der Begriff NEFA für freie, nicht veresterte
Fettsäuren Verwendung. In dieser Arbeit wird der Begriff der kurzkettigen Fettsäuren
(SCFA) verwendet für Fettsäuren mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen (BREVES, 2000;
Einleitung und Literaturübersicht 9
XIONG et al., 2004; COVINGTON et al., 2006). Fettsäuren in ungebundener Form
mit mehr als 12 Kohlenstoffatomen werden als langkettige Fettsäuren (LCFA)
bezeichnet. Aus Gründen der Genauigkeit ist allerdings in Zitaten die Begrifflichkeit
der Autoren übernommen worden, und die Bezeichnungen werden dadurch teilweise
synonym gebraucht.
Die Nährstoffversorgung der Wiederkäuer erfolgt über die SCFA aus der
Vormagenfermentation. Hauptmetaboliten sind Azetat, Propionat und Butyrat, aber
auch Valerat und dessen Derivate, die jedoch im Stoffwechsel eine untergeordnete
Rolle spielen. Wenngleich Azetat prozentual überwiegt, ist besonders Propionat für
die Energieversorgung wichtig. Die Glukosebereitstellung der Wiederkäuer ist
vollständig von der hepatischen Glukoneogenese abhängig. Propionat dient als
Substrat, welches, als Succinyl-CoA, über Oxalazetat der Glukoneogenese zugeführt
wird und somit der Glukosebildung (glukoplastisch) dient. Wenngleich es Hinweise
gibt, wonach auch Azetat zur Glukosebildung herangezogen wird, wird der
überwiegende Anteil und Butyrat in den Mitochondrien als Acetyl-CoA im Citratzyklus
metabolisiert (BREVES, 2000; SALLMANN u. FUHRMANN, 2000; KIM et al., 2005).
Die Anteile der unterschiedlichen SCFA aus der mikrobiellen Fermentation im
Pansen unterliegen Schwankungen. Die Synthese ist vom Substrat abhängig und
erfolgt über unterschiedliche Stoffwechselwege. Diese Schwankungen werden durch
das Azetat-Propionat-Verhältnis charakterisiert. Raufaserreiches Futter führt zu
einem Anstieg des Azetatanteiles, energiereiches oder fein gemahlenes Futter führt
zu einem relativen Anstieg von Propionat (MENKE u. HUSS, 1987).
Propylenglykol (1,2-Propandiol) ist eine glukoplastische Verbindung, die zur
Vorbeugung und Behandlung von Ketosen in der Frühlaktation bei Milchkühen
eingesetzt werden kann. Die Ketose wird auf eine Hyperlipidämie in Folge von
peripherer Insulinresistenz zurückgeführt. In ihren Untersuchungen beim Rind wiesen
CHRISTENSEN et al. (1997) durch die Propylenglykolbehandlung einen Abfall von
Azetat nach, und eine Erhöhung des Azetat-Propionat-Verhältnisses. Der
Insulinspiegel wurde erhöht, und die NEFA-Konzentration (non-esterified fatty acids)
fiel ab. KIM et al. (2005) untersuchten weiter Effekte von Propylenglykol auf die
Leptinsynthese bei Rindern. Sie bestätigten die Untersuchungen von
CHRISTENSEN et al. (1997), und wiesen zudem eine Erhöhung des Anteiles von
Propionat im Pansen nach. Die Messung der Leptin-mRNA im Unterhautfett zeigte
Einleitung und Literaturübersicht 10
keine Veränderungen. Allerdings führte die Behandlung zum Anstieg der Leptin-
mRNA im intramuskulären Fettgewebe.
LEE u. HOSSNER (2002) zeigten einen Anstieg der Leptin-mRNA im Fettgewebe
zwei Stunden nach Propionatinfusion. Die Autoren postulieren, dass dieser nicht
allein durch die Insulinwirkung zu erklären ist. In der Hypophysenzellkultur und in
Adipozytenkultur des Rindes konnte ebenfalls eine Erhöhung der Leptin-mRNA
durch kurzkettige Fettsäuren gezeigt werden. Demgegenüber senken LCFA die
Leptin-mRNA Konzentration (YONEKURA et al., 2003; SOLIMAN et al., 2007).
Allerdings bestreiten BRADFORD et al. (2006) eine bedeutende Rolle von Propionat
für die Leptinexpression. Intravenöse Bolusinfusion von Propionat hatte einen Abfall
der Plasmaleptinkonzentration zu Folge. Die intraruminale Infusion von Propionat
führte zu keiner relevanten Erhöhung der Plasmaleptinkonzentration.
Weitere Erklärungsansätze für die Zusammenhänge zwischen Energie-, Insulin- und
Leptinstoffwechsel ergaben sich aus der Erforschung der Signalwege verschiedener
Rezeptoren. Dabei rückten insbesondere Rezeptoren aus der Superfamilie der G-
proteingekoppelten Rezeptoren (GPR) in den Blickpunkt.
Von den verschiedenen Familien ist die große Gruppe der heterotrimeren G-Proteine
in die Regulation verschiedenster Stoffwechselvorgänge eingebunden, und verfügt
über eine dementsprechende Vielzahl von Liganden, und bildet therapeutisch
bedeutsame, pharmakologische Angriffspunkte. Beispielhaft sei an dieser Stelle auf
die muskarinergen und adrenergen Rezeptoren des vegetativen Nervensystems
verwiesen.
Alle heterotrimeren GPR bestehen aus drei Untereinheiten (α,β und γ), und sind in
der Zellmembran lokalisiert. Die Rezeptoren sind schleifenförmig aufgebaut, mit
einem extrazellulären N-Terminus und intrazellulären C-Terminus. Dazwischen
liegen 7 Transmembrandomänen. Die Bindung eines Liganden führt zur
Konformationsänderung des Rezeptors. Über die darauffolgende Assoziation und
Dissoziation der α-Untereinheit und den Austausch von GDP (Guanosindiphosphat)
durch GTP (Guanosintriphosphat), wird die α-Untereinheit aktiviert. Dieser Komplex
reguliert in der Signalkaskade, unter Abspaltung von Phosphat, weitere Enzyme, wie
die Phospholipasen A und C (PLA und PLC), die MAPK oder die Adenylatzyklase
(LOEFFLER, 1998a; ROZENGURT, 2007).
Einleitung und Literaturübersicht 11
In den letzten Jahren wurde eine Reihe von GPR durch Klonierung identifiziert, für
die bisher keine Liganden bekannt waren. Diese werden als „orphan GPRs“
bezeichnet (orphan (engl.) = Waise) (LE POUL et al, 2003), und werden durch
Nummerierung unterschieden. Für eine Reihe dieser Rezeptoren konnten kurz-,
mittel- und langkettige Fettsäuren als Liganden nachgewiesen werden, die als
GPR40, 41, 42 und 43 klassifiziert sind (BRISCOE et al., 2003; BROWN et al., 2003;
LE POUL et al., 2003). Ihre Expression kann in verschiedenen Geweben
nachgewiesen werden, wie in den Granulozyten des Blutes und in Adipozyten. Ihrem
Vorkommen in Abwehrzellen wird eine nutritiv-regulative Rolle bei der Immunantwort
zugesprochen. Im Fettgewebe ist der GPR41 von besonderem Interesse, da dieser
Rezeptor die Leptinexpression im Fettgewebe und Plasmaleptingehalte bei Mäusen
erhöht, und somit von Bedeutung für die hormonelle Kopplung von
Nahrungsaufnahme und Energiestatus des Körpers sein könnte. Die höchste
Stimulation wird durch Propionat erreicht (XIONG et al., 2004). In Anbetracht dessen,
und der Bedeutung von Propionat beim Wiederkäuer, ist die Untersuchung des
GPR41 bei dieser Tiergruppe von großem Interesse.
Zur Klassifizierung des G-Proteins des GPR41 konnte in Untersuchungen mit
Pertussistoxin die Funktion dieses Rezeptorproteins aufgehoben werden.
Pertussistoxin hemmt spezifisch die G-Proteine der Gi/0-Familie (BROWN et al.,
2003). LE POUL et al. (2003) wiesen außerdem den Abfall des intrazellulären
zyklischen Adenosinmonophosphats (cAMP), die Bildung von Inositol-(1,4,5)-
Triphosphat (‚IP3) und Freisetzung des intrazellulären Ca2+ und die Phosphorylierung
zweier MAPK (p42 und p44), nach. Dies weist darauf hin, dass der GPR41 über drei
verschiedene intrazelluläre Signalkaskaden, die Hemmung der Adenylatzyklase,
sowie die Aktivierung der Phosphatidylinostol 3-Kinase (PI3-K), die wiederum durch
die Phospholipase C aktiviert wird, und einer MAPK, verfügt. Nach BROWN et al.
(2005) kann somit der GPR41 der Familie der (inhibitorischen) Gαi-assoziierten
Rezeptoren zugeordnet werden.
Verschiedene Autoren wiesen wechselseitige Beeinflussung der GPR und
Insulinrezeptoren nach (MOXHAM u. MALBON, 1996; KATADA et al., 1999; YU et
al., 2001). Aufgrund des funktionellen Zusammenhangs von Leptin und Insulin, und
der nachgewiesenen Sekretion von Leptin durch den GPR41, untersuchten XIONG
et al. (2004) mögliche Einflüsse von Insulin auf die Rezeptoraktivität. Dabei konnten
sie zeigen, dass die Leptinproduktion bei geichzeitiger Gabe von Propionsäure und
Einleitung und Literaturübersicht 12
Insulin mehr als nur additiv erhöht war, und schließen danach auf Wechselwirkungen
zwischen Insulin und GPR41.
Der Insulinrezeptor ist ein tetrameres Molekül aus zwei identischen Teilen bestehend
aus je einer α- und β-Untereinheit. Die β-Untereinheiten durchziehen die
Cytoplasmamembran, während die beiden α-Untereinheiten extrazellulär gelegen
sind. Hier sind die beiden Teile durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden.
Insulin bindet an die α-Einheiten. Eine Konformationsänderung aktiviert intrazellulär
eine Tyrosinkinase. Nach der Phosphorylierung bindet das spezifische Protein IRS-1
(Insulin Rezeptor Substrat). Durch Phosphorylierung werden verschiedene Enzyme
wie die PI3-K, aktiviert (PLUM et al., 2006; KASHYAP u. DEFRONZO, 2007).
Mögliche Kreuzungspunkte der Signaltransduktion bildet bei den Monogastriern
dieses Enzym. In Untersuchungen an kultivierten humanen Adenokarzinomzellen
bestätigten KISFALVI et al. (2007), dass über die PI3-K der G-proteinvermittelte
Rezeptormechanismus und der Insulinrezeptor kommunizieren können. Der genaue
Mechanismus der Beeinflussung, die Verhältnisse am GPR41 in den Adipozyten und
die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf die Wiederkäuerzellen jedoch erfordern noch
weitere Untersuchungen (s. Abb.1).
Auf die Zusammenhänge von Insulin, Glukose, Fett und Fettsäuren auf der einen,
und Leptin auf der anderen Seite, wurde im Vorhergehenden eingegangen. Neben
der energetischen Regulation, ist dieser Sachverhalt insbesondere in der
Trächtigkeit, in der Laktation, und in der Umstellung des Metabolismus im Zeitraum
der Geburt wichtig. Dem Wechsel zwischen erhöhter und verminderter Leptin- und
Insulinresistenz in diesen Stadien, wird eine tragende Rolle beigemessen.
Bei Schafen steigt zirkulierendes Leptin zu Beginn der Trächtigkeit an, und bleibt bis
zur Geburt erhöht. Auch bei Kühen ist die Leptinplasmakonzentration im Verlauf der
späten Trächtigkeit bis vor der Geburt erhöht. Nach LIEFERS et al. (2005) ist dies
nach den bisherigen Kenntnissen auf einen Anstieg des Körperfettanteils einerseits,
andererseits auf eine Leptinresistenz zurückzuführen. Als Ursache konnte beim
Schaf in diesem Zeitraum mehr Bindungsprotein nachgewiesen werden, bei der
Ratte konnte zudem eine Abnahme der Ob-Rb-Expression, und verminderter
Transport über die Blut-Hirn-Schranke gezeigt werden. Dies führt aufgrund eines
geringen Feed-back zu einer Erhöhung der Leptin-mRNA-Expression im Fettgewebe.
Diese Expression wird durch Insulin nicht beeinflusst (CHILLIARD et al., 2005;
LIEFERS et al., 2005).
Einleitung und Literaturübersicht 13
Um den Geburtszeitraum fällt Plasmaleptin innerhalb von 3-4 Wochen bei Kühen ab
(BLOCK et al., 2001; CHILLIARD et al., 2005; HACHENBERG et al., 2007). Beim
Schaf sind ähnliche Verhältnisse zu sehen, allerdings hängt der Abfall sehr von der
Energiezufuhr ab. Während der ersten drei Laktationswochen sind Leptin-mRNA und
-protein in allen Fällen niedrig (CHILLIARD et al., 2005).
Für den Verlauf der Leptinwerte peri partum bei der Ziege gibt es die Besonderheit,
dass sich bei diesen Tieren, im Gegensatz zu zum Rind, die frühe Trächtigkeit und
späte Laktation überschneiden. Vermutlich sind die Regulationsmechanismen
grundsätzlich dieselben, es überdecken sich aber dabei verschiedene Effekte.
Bei nulliparen Ziegen verläuft die Leptinkurve mit einem Anstieg um die Mitte der
Trächtigkeit, und einem deutlichen Abfall im Übergang zur Laktation. Bei primiparen
laktierenden, trächtigen Ziegen gibt es keinen Anstieg des Leptinspiegels in der
Abb. 1: Schematische Darstellung der Signalkaskaden des GPR41 und der möglichen
Überkreuzung der Signalwege mit dem Insulinrezeptor durch Stimulation der PI-
3K.
Erklärung: Giα: α-Untereinheit des inhibitorischen G-Proteins; Adenzyk.:
Adenylatzyklase; PLC: Phopholipase C; IRS-1: Insulin Rezeptorsubstrat 1; PI3-K:
Phospatidylinositol 3-Kinase; IP3: Inositol Triphosphat; MAPK: mitogen-aktivierte
Proteinkinase; PP: Pyrophosphat
(In Anlehnung an: LOEFFLER, 1998a; BROWN et al., 2005; PLUM et al., 2006;
KASHYAP u. DEFRONZO, 2007; ROZENGURT, 2007)
GTP
Giα Giα
Propionat
GTPGDP
Giα
GTP
PLC↑
GTP
Adenzyk.↓
ATP
GPR41
cAMPP P PI3-K↑
IP3 ↑ Ca++ ↑
MAPK ↑
Insulin
Insulinrezeptor
PPP P
P
PI3-K↑
IRS-1
extrazellulär
intrazellulär
GTP
Giα Giα
Propionat
GTPGDP
Giα
GTP
PLC↑
GTP
Adenzyk.↓
ATP
GPR41
cAMPP P PI3-K↑
IP3 ↑ Ca++ ↑
MAPK ↑
Insulin
Insulinrezeptor
PPP P
P
PI3-K↑
Insulin
Insulinrezeptor
PPP P
P
Insulin
Insulinrezeptor
PPP P
P
PI3-K↑
IRS-1
extrazellulär
intrazellulär
Einleitung und Literaturübersicht 14
Trächtigkeit, die Kurve fällt jedoch zu Beginn der Laktation ebenfalls leicht ab.
Vergleicht man laktierende primipare trächtige Tiere mit laktierenden primiparen
güsten Tieren, kommt es nach dem Trockenstellen bei Letzteren zu einem Anstieg
von Leptin auf das Vierfache, während bei den trächtigen Ziegen, Leptin auf
demselben Niveau bleibt.
Fasst man diese Ergebnisse zusammen, zeigt sich, dass die späte Laktation einen
dominierenden Effekt darstellt, in dem der Leptinspiegel auf einem niedrigen Niveau
verläuft. Dieser Effekt überwiegt den Anstieg in der Trächtigkeit. Dies zeigt zum
einen, dass unterschiedliche Regulationsmechanismen durch Laktation und
Trächtigkeit bestehen. Zum anderen sind dies weitere Hinweise auf die Bedeutung
von Leptin beim Nutrient partitioning. Zusammen mit den erwähnten Untersuchungen
von WANG et al. (1999b) und ZIEBA et al. (2005) zeigt dies, dass dieser niedrige
Leptinspiegel in der Laktation für die Entstehung der Insulinresistenz in der Laktation
verantwortlich sein kann (BONNET et al., 2005; CHILLIARD et al., 2005).
Nach LIEFERS et al. (2005) könnte ein Teil des Leptinabfalls zu Beginn der Laktation
durch den Abbau von Fettgewebe in Folge negativer Energiebalance entstehen.
Wenn bei laktierenden Ratten oder Rindern die Laktogenese verhindert wird, und
somit der Energieverlust über die Milch abfällt, steigt der Plasmaleptinspiegel
(BLOCK et al., 2001). Nach LIEFERS et al. (2005) zeigt dies, dass die energetische
Situation den Abfall von Leptin beeinflusst. Außerdem führt erniedrigtes Insulin zu
einem Abfall von Leptin, sich also Leptin und Insulin gegenseitig beeinflussen
(BLOCK et al., 2003; LIEFERS et al., 2005). Wenngleich einzelne Zusammenhänge
bereits gezeigt werden konnten, ist das Zusammenspiel dieser Komponenten in der
homöorhetischen Gesamtbetrachtung noch nicht hinreichend bekannt.
In dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit eine intravenöse Kurzzeitinfusion
von Propionat, als dem Hauptmetaboliten der ruminalen Energieversorgung, Einfluss
auf die Leptinsynthese im Fettgewebe von Ziegen hat. Um die Rolle der
Leptinsynthese und der –sekretion abschätzen zu können, wurde sowohl die mRNA,
als auch das Protein, im Kontext der Veränderungen von Insulin, Glukose und freien
langkettigen Fettsäuren, im Blut gemessen. Zudem sollten mögliche Einflüsse auf
periphere Regulationsmechanismen durch die Propionatinfusion untersucht werden.
Dazu wurde die Menge der Ob-Rb-mRNA und des GPR41 im Fettgewebe
quantifiziert.
Einleitung und Literaturübersicht 15
Ein weiteres Ziel war, die Zusammenhänge zwischen Insulinsensitivität und
Plasmaleptinspiegel bei graviden und frühlaktierenden Ziegen zu beleuchten. Im
Fokus stand dabei auch der mögliche Einfluss des Glukoseeffluxes über die Laktose
in der Milchsynthese.
Material und Methoden 16
2. Material und Methoden
2.1 Versuchstiere
2.1.1 Haltung und Fütterung
Die Tiergruppen beider Versuche wurden in einem Laufstall auf Stroheinstreu
gehalten. Heu stand in zwei Raufen zur freien Verfügung und wurde durch die
tägliche Gabe von Kraftfutter (1550 KOFU VIII, KOFU Tiernahrung Kottmann, Neuss)
ergänzt. Die Ziegenböcke erhielten 100 g/d Kraftfutter je Tier, die trächtigen Ziegen
500 g/d. Den laktierenden Ziegen wurde die Ration individuell nach Milchleistung
(300 g/l) zugeteilt. Zudem waren eine Selbsttränke sowie ein Salzleckstein (KNZ S.C.
Akzo Nobel Salz GmbH, Stade) angebracht.
2.1.2 Versuchsablauf
Am Abend vor dem Versuch wurden die Probanden durch ein Gatter von der Gruppe
abgetrennt, um die Aufnahme von Heu zu unterbinden und um vergleichbare
Ausgangsbedingungen zu schaffen. Wasser und Stroh zur Erhaltung der
Pansentätigkeit stand diesen Tieren weiter zur freien Verfügung. Als Zugabe in die
Infusionslösungen wurde, unter aseptischen Bedingungen, 10 ml Blut, zur
Herstellung tiereigenen Serums, entnommen (20 min, 3000 g; Biofuge primo R,
Heraeus Instruments GmbH, Osterode).
Am Morgen des Versuchstages wurde unter Lokalanästhesie (Procasel 2 %,
Selectavet, Weyarn-Holzolling) ein intravenöser Dauerverweilkatheter (Cavafix
Certo mit Splittocan, Braun Melsungen AG, Melsungen) über die V. jugularis
externa in die V. cava cranialis verbracht. In die V. jugularis externa der
kontralateralen Seite wurde eine Venenverweilkanüle eingeführt (Vasocan, Braun
Melsungen AG, Melsungen). Dieser Katheter diente der regelmäßigen Entnahme der
Blutproben. Für die Durchführung der Infusionen wurde das Versuchstier, unter
Sicht-, Geruchs- und Hörkontakt zur Tiergruppe, in einem Kastenstand fixiert. Stroh
und Wasser wurden ad libitum angeboten. Zum Erhalt der Durchgängigkeit und zur
Prävention von Thrombenbildung im Katheter wurde dieser regelmäßig mit
heparinhaltiger Ringerlösung (10 I.E./ ml; Braun Melsungen AG, Melsungen) gespült
(Heparin-Natrium-5000-ratiopharm, Merckle GmbH, Blaubeuren).
Material und Methoden
17
Die Lösungen wurden mittels einer kalibrierten, peristaltischen Pumpe (Meredos HP-
60 12 AC/DC, Meredos GmbH, Bovenden) infundiert.
2.1.3 Tierschutz, Tierbetreuung und Belastungsbeurteilung
Die Tiere wurden mehrmals täglich von einer Betreuungsperson beobachtet. Vor
Versuchsbeginn wurde jedes Tier einem allgemeinen klinischen Untersuchungsgang
unterzogen, und insbesondere die innere Körpertemperatur gemessen. Bei
Abweichungen von den physiologischen Werten wurde der Versuch nicht
durchgeführt. Während des Versuches wurde in regelmäßigen Abständen Atmung,
Puls, Herztöne, Pansenaktivität und Körpertemperatur überwacht. Die Nachkontrolle
erfolgte in der Regel für drei Tage mit Kontrolle und Pflege der Einstichstellen.
Die Katheterisierung und Blutentnahme sind Eingriffe, die bei Mensch und Tier
routinemäßig ohne Betäubung durchgeführt werden. Katheter, Fixation und
Manipulation schienen die Tiere in ihrem Verhalten nicht wesentlich einzuschränken.
Alle Tiere ruminierten, fraßen Stroh und käuten wieder. Sie zeigten während des
Versuches keine wesentlichen Unterschiede in den Ruhe- und Aktivitätsphasen.
Allerdings zeigten mehrere Tiere am Ende des Versuches Ermüdungsanzeichen und
Erhöhung der Kreislaufparameter, die sich in allen Fällen nach wenigen Stunden
normalisierten. Diese Belastung des Allgemeinbefindens über einen begrenzten
Zeitraum ist als mäßig einzuschätzen. Keines der Tiere zeigte aufgrund der
Versuchsbehandlung klinisch relevante Folgeerscheinungen. Die Belastung der Tiere
durch die Infusionen ist als gering bis mäßig einzustufen.
Aufgrund der Durchführung von Vorversuchen unterlagen die Ziegenböcke der
Propionatinfusion 3 bis 4 Eingriffen. Zwischen zwei Versuchen lag mindestens eine
Woche Pause.
Die angewandte Infusionsrate im Propionatversuch wurde aus Erfahrungen in
Vorversuchen als die höchstmögliche Infusionsrate bei mäßiger Beeinträchtigung der
Versuchstiere eingeschätzt. Im Anschluss an den Versuch wurden die Tiere zum
Zweck der Probengewinnung getötet.
Material und Methoden 18
2.2 Bestimmung von Metaboliten und Hormone im Blut
2.2.1 Glukose
Die Glukosemessungen konnten mit dem tragbaren Glukoseanalyser YSI 1500
Sidekick Version 2.2 (YSI Incorporated, Yellow Springs, Ohio, USA) zeitnah und
direkt im Versuchsstall durchgeführt werden. Dieses Gerät ist für die Messung in
Vollblut, Blutplasma und -serum von Wiederkäuern validiert. Die Messung erfolgte in
heparinisiertem Vollblut (Heparin-Natrium-5000-ratiopharm, Merckle GmbH,
Blaubeuren).
Durch die Oxidation von Glukose durch eine spezifische Glukoseoxidase wird
Wasserstoffperoxid gebildet. In einer zweiten Reaktion, die durch eine Membran, die
für Wasserstoffperoxid diffundibel ist, von der ersten räumlich abgetrennt verläuft,
wird dieses an einer Platinanode weiter oxidiert. Es entsteht ein dynamisches
Gleichgewicht der Bildung und des Abbaus des Wasserstoffperoxids. Die
Stromstärke der Elektronen, die an der Sonde freigesetzt werden, ist proportional der
Gukosekonzentration in der gemessenen Probe (Herstellerangaben).
2.2.2 Serumgewinnung
Von jeder entnommenen Blutprobe wurde unmittelbar die Glukosekonzentration im
Vollblut gemessen (sh. 2.2.1). Für weitere Analysen wurden die Proben auf Eis
gekühlt, zur Serumgewinnung zentrifugiert (20 min, 3000 g; Sigma, 1K15,
Taufkirchen) und aliquotiert. Die Lagerung erfolgte bei –20 °C.
2.2.3 Leptin
Zur Erstellung von Verlaufsprofilen der Serumleptinkonzentrationen wurden diese mit
einem kompetitiven Enzymimmuntest (EIA) nach SAUERWEIN et al. (2004)
gemessen. Als Antiserum diente polyklonales Kaninchenserum, welches gegen
rekombinantes ovines Leptin (roLeptin; GERTLER et al., 1998), sowie zwei
synthetische bovine Peptidabschnitte gerichtet ist. Zur Herstellung des Tracers
wurde roLeptin nach HENNIES et al. (2001) biotinyliert. Die Mikrotiterplatten (EIA
plate 9018, Corning Star, Cambridge, MA, USA) wurden mit Schafantikörper gegen
Material und Methoden
19
das Fc-Fragment von Kaninchen beschichtet, und freie Bindungsstellen mit Casein
abgesättigt. Als Standard wurde roLeptin verwendet.
Dieser Test wurde zur Messung von Leptin in Blutserumproben von Ziegen, Rindern,
Schafen, Schweinen und Pferden entwickelt und validiert (SAUERWEIN et al, 2004).
Der Intra-Assay und Inter-Assay Variationskoeffizient beträgt 6,3% (n=12), bzw.
13,9% (n=41).
2.2.4 Insulin
Zur Messung der Insulinkonzentrationen kam ebenfalls ein kompetitiver
Enzymimmuntest zum Einsatz. Als Antiserum dienten Meerschweinchen-
immunglobuline gegen ovines Insulin. Zur Beschichtung wurden gegen
Meerschweinchen-IgG gerichtete Kaninchenantikörper eingesetzt. Bovines Insulin
(Sigma-Aldrich) wurde als Tracer nach dem oben genannten Protokoll biotinyliert. Als
Standardverdünnungsreihe wurde ebenfalls bovines Insulin verwendet. Dieser Test
ist außer für bovine auch für caprine Blutseren validiert (Wiederfindungsrate 98%).
Intra- und Interassay Variationskoeffizient sind bei diesem Test 5,9% (n = 10) und
10,8% (n = 15). Die Abfolge der Arbeitsschritte verlief entsprechend Protokoll
(HEINTGES, 2003; SAUERWEIN et al., 2006).
2.2.5 Freie Fettsäuren
Freie (FFA) oder nicht-veresterten (NEFA) Fettsäuren wurden mit einem kommerziell
erhältlichen Testkit (Nr. 1 383 175, Roche Mannheim) gemessen. Fettsäuren
werden durch Bindung von CoenzymA aktiviert, und oxidiert. Das dabei entstehende
Wasserstoffperoxid wird durch enzymatisch katalysierte Farbentwicklung gemessen
(SHIMUZU et al., 1980). Der Test ist nach OLIVER et al. (1995), zur Anwendung in
Mikrotiterplatten modifiziert. Die kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) werden aufgrund
ihrer hohen Flüchtigkeit durch diesen Kit nicht quantifiziert. Als Standard stand eine
Palmitinsäureverdünnungsreihe zur Verfügung.
Material und Methoden 20
2.3 Effekte einer Propionatinfusion auf das periphere
Leptinsystem und Parameter des Glukosestoffwechsels bei
der Ziege
2.3.1 Entwicklung von real-time RT-PCR Assays für Leptin (ob), die
lange Form des Leptinrezeptors (ob-Rb), den G-
proteingekoppelten Rezeptor 41 (GPR41) und die 18S rRNA
Ziel war es, die Expression der Gene ob, ob-Rb, und des putativen GPR 41 zu
quantifizieren. Funktion und Zweck des GPR41 ist noch unzureichend geklärt, so
dass das codierende Segment als Gen des putativen GPR41 bezeichnet wird. Im
Text wird vereinfachend die Bezeichnung GPR41 verwendet.
Das ob-Gen codiert für das Proteohormon Leptin. Mit dieser Messung sollen
mögliche Veränderungen der mRNA-Menge von Leptin auf RNA-Ebene den
Veränderungen von Leptin auf Proteinebene im Blut gegenübergestellt werden. Das
ob-Rb-Gen codiert für die lange Form des Leptinrezeptors, während GPR 41, als
Rezeptor von kurzkettigen Fettsäuren, geeignet ist bei Mäusen die Leptinexpression
zu erhöhen (XIONG et al.; 2004).
Aufgrund der hohen Empfindlichkeit insbesondere von RNA, aber auch von DNA,
gegenüber Nukleasen, wurden alle Arbeitsabläufe mit Schutzhandschuhen
durchgeführt. Alle Materialien wurden autoklaviert, sofern sie nicht vom Hersteller
bereits nukleasenfrei hergestellt waren. Mit Wasser wird im Folgenden autoklaviertes
Reinstwasser bezeichnet. DEPC-Wasser ist mit Diethylpyrocarbonat behandeltes,
ribonukleasefreies Reinstwasser.
Die Extraktion der Gesamt-RNA erfolgte nach modifizierter Phenol-Chloroform-
Methode (CHOMCZYNSKI u. SACCHI, 1987; CHOMCZYNSKI u. MACKEY 1995).
Die Aufbereitung der RNA aus Fettgewebe wurde nach einem modifizierten Protokoll
nach LOUVEAU et al. (1991) durchgeführt. (s. Anhang)
2.3.1.1 Mengenbestimmung und Kontrolle der RNA
Photometrische Konzentrationsbestimmung
Nach der Gewinnung der RNA-Präparationen wurde deren Konzentration
photometrisch bestimmt. Zusätzlich erhielt man hierbei Aufschluss über
Material und Methoden
21
Proteinverunreinigungen der Probe, und somit über den Erfolg der RNA-
Aufreinigung. Die Bestimmung der Konzentration erfolgte photometrisch (Hitachi U-
2000 UV/VIS Spectrophotometer, Hitachi Scientific Instruments, Tokyo, Japan) über
die Messung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 260 nm, da Nukleinsäuren in
diesem Wellenlängenbereich ihr Absorptionsmaximum besitzen.
Als Maß für Proteinverunreinigungen wurde das Verhältnis der beiden Wellenlängen
260/280 (OD-Ratio) verwendet, da das Absorptionsmaximum von Proteinen bei
280 nm liegt. Es wurden nur Proben verwendet, deren OD-Ratio-Werte über 1,6
lagen (WILKINSON, 2000). Andernfalls wurde die Aufreinigung mit einer anderen
Gewebeprobe des Versuchstieres wiederholt.
Die Messung erfolgte in Doppelbestimmung. Ein relativer Fehler unter 10 %
zwischen zwei Messungen wurde akzeptiert. Lag die Abweichung unter 15 % wurde
eine Dreifachbestimmung durchgeführt. Der sich daraus ergebende Mittelwert wurde
zur Berechnung der Nukleinsäurenkonzentration verwandt. Die
Nukleinsäurenkonzentration ist proportional der gemessenen Absorption. Die
Konzentrationsberechnung für RNA erfolgte anhand der Formel:
RNA (µg/ml) = OD260 · 40 µg/ml · Verdünnungsfaktor
DNase-Verdau
Um das Risiko falsch-positiver Ergebnisse durch DNA-Kontaminationen in der PCR
zu vermindern, wurde eine enzymatische Zerstörung der DNA mit DNase I
(DNaseverdau) angeschlossen. Durch diese Behandlung konnte auf die Konstruktion
intronspannender PCR-Primer verzichtet werden. Dies war aufgrund der z.T. nur
sehr kurzen bekannten RNA-Sequenzen von Vorteil und erleichterte die Auswahl der
Primer (BUSTIN, 2002). Die Gesamt-RNA aus Muskelgewebe wurde direkt dem
DNaseverdau zugeführt (s. Anhang). Für die Leber- und Fettproben konnte eine
bessere Qualität der RNA über eine DNasebehandlung mit Aufreinigung über ein
Kitsystem auf Basis der Silicagel-Membrantechnologie (Nucleospin®RNA II,
Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) erzielt werden. Prinzip der Aufreinigung ist die
Bindung der Nukleinsäuren aufgrund ihrer Ladungen unter bestimmten
Ionenkonzentrationen an die Membran. Rückstände wie z.B. Salze oder
Kohlenhydrate werden in Waschschritten entfernt. Das Protokoll wurde gemäß
Herstellerangaben durchgeführt.
Material und Methoden 22
Die gesamte isolierte RNA der Fettgewebsproben wurde dieser Aufreinigung
zugeführt. Von den Leberproben wurden bis zu 70 µg Gesamt-RNA je Probe
gereinigt. Die DNA-Kontaminationen aus Muskel-RNA wurden im 50 µl-Ansatz
entfernt. Dazu wurde je Probe eine Menge von 50 µg Gesamt-RNA bearbeitet (s.
Anhang)
Aus den gereinigten Stammlösungen wurden Aliquote mit einer Konzentration von
ca. 0,3 µg/µl hergestellt, und danach photometrisch exakt bestimmt. Die
Stocklösungen und Reservealiquote wurden bei –80 °C gelagert, die
Gebrauchsaliquote lagerten bei –20 °C.
Denaturierende RNA-Gelelektrophorese
Um die Verluste gering zu halten, wurde die RNA ohne vorherige Kontrolle ihrer
Integrität gereinigt. Diese Kontrolle erfolgte erst im Anschluss in einer horizontalen,
denaturierenden Gelelektrophorese in einem 1,2 % Formaldehyd-Agarosegel, mit
Ethidiumbromid als Farbstoff. Als Laufpuffer diente 1X MOPS-Puffer (s. Anhang). Zur
Beurteilung der Qualität der Nukleinsäuren wurden 2 µg Gesamt-RNA der
Fettproben, und 5 µg der Muskel- und Leberproben, eingesetzt. Dazu wurden 4 µl
Ladepuffer (s. Anhang) zugegeben, und jeweils auf 12 µl mit Wasser aufgefüllt.
Diese Ansätze wurden vor dem Auftrag zusammen bei 65 °C für zehn Minuten im
Wasserbad denaturiert. Danach wurden sie sofort auf Eis gestellt, um eine
Renaturierung zu verhindern, und in die Taschen des Gels pipettiert. Die Spannung
in der Kammer betrug 5 bis 7 V/cm für 80 bis 100 Minuten.
Die Qualität der Präparationen sowie die Länge der darin enthaltenen Fragmente
wird in einer Gelelektrophorese kontrolliert. Agarose bildet als Polysaccharid eine
dreidimensionale Netzstruktur aus. In dieser kommt es zu einer Auftrennung der
RNA-Fragmente in den Präparationen nach ihrer Größe. Fragmente gleicher Größe
werden als klar abgegrenzte Bande sichtbar. Werden diese durch Enzyme
degradiert, bilden diese unspezifischen Schlieren, da die dabei entstehenden Größen
dem Zufallsprinzip unterliegen.
Um die Banden sichtbar zu machen wurde der interkalierende Fluoreszenzfarbstoff
Ethidiumbromid, eingesetzt. Diese aromatischen Kationen lagern sich in die
Nukleotidketten ein, und fluoreszieren durch UV-Bestrahlung (s. Anhang).
Material und Methoden
23
Die bildliche Darstellung und Dokumentation der Gele erfolgte mit dem FluorImager
SI und der dazugehörigen Software ImageQuant, Version 4.1 (beide: Molecular
Dynamics, Sunnyvale, CA, USA).
2.3.1.2 Reverse Transkription (RT)
Für den indirekten Nachweis der RNA mittels PCR, wurde diese in cDNA
umgeschrieben (Reverse Transkription). Als Startmoleküle für die reverse
Transkriptase, einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase, dienten random hexamer
Primer. Diese Oligomere bestehen aus sechs nach der Wahrscheinlichkeitsverteilung
kombinierten Nukleotiden. Die damit dargestellten Sequenzen binden an die
jeweilige komplementäre Sequenz der RNA, die beliebig in der Matrize verteilt sind.
Von diesen Primern ausgehend startet die cDNA-Synthese (cDNA = engl.
complementary DNA), bis sie an der nächstliegenden Bindungsstelle eines
Hexamers gestoppt wird. Auf diese Weise wird die gesamte in der Präparation
vorhandene RNA, incl. der ribosomalen, umgeschrieben. Dadurch war die
Verwendung von 18S rRNA als interne Kontrolle in der real-time PCR möglich.
Jede RNA wurde zweimal, in voneinander unabhängigen Ansätzen, umgeschrieben
(s. 2.3.2.4). Da die Interassayvarianz in der cDNA-Synthese einen großen Einfluss
auf die weitere Quantifizierung haben kann (ØVSTEBØ et al., 2003; STÅHLBERG et
al., 2004), wurden je alle Fettproben gemeinsam, und alle Leber- und Muskelproben
in einem gemeinsamen Durchlauf, mit demselben Mastermix, transkribiert. Dieses
Design wurde dann auch für die PCR-Messungen verwendet. Die Auswertung
erfolgte zwischen den Behandlungsgruppen, sowie zum Vergleich der mRNA-Menge
zwischen den beiden Fettgeweben.
Die Reverse Transkription zur Synthese der cDNA wurde in einer von der PCR
getrennten Reaktion durchgeführt, um eine höhere Sensitivität in der PCR zu
erreichen (zur Übersicht: BUSTIN, 2002). Es wurden 1,8 µg RNA im 20 µl-Ansatz
eingesetzt (Thermocycler: MJ Research, Biozym Diagnostik, Oldendorf). Ein Teil der
hergestellten cDNA wurde gleich im Anschluss in einer zweistufigen
Verdünnungsreihe auf 1:4 und 1:40 verdünnt, um die CT (Threshold cycle), die
Messgrößen für die Quantifizierung, zwischen Ziel- und Referenzgenen einander
anzunähern. Die Lagerung mehrerer Aliquote erfolgte bei -20 °C. Jedes Aliquot
wurde zur Auswertung höchstens dreimal aufgetaut.
Material und Methoden 24
2.3.1.3 Zielgene und interne Kontrolle für die PCR
Als Zielgene werden im Folgenden jene Gene bezeichnet, deren Expression in
diesen Untersuchungen quantifiziert werden sollten. Das sind die bereits oben
erwähnten Gene für Leptin (ob), Leptinrezeptor (ob-Rb) und den G-
proteingekoppelten Rezeptor 41 (GPR41).
Die interne oder endogene Amplifikationskontrolle dient als Bezugsgröße zur
indirekten Quantifizierung des Transkriptionsniveaus der Zielgene. Geeignete RNA-
Spezies müssen in allen analysierten Gewebetypen in verleichbarer Menge
vorhanden sein, direkt proportional der enthaltenen Gesamt-RNA sein, und ihre
Masse darf nur geringen Variationen unterliegen. Für diese Verwendung wurde in
diesem Versuch die 18S ribosomale RNA (rRNA) als interne Kontrolle ausgewählt
(zur Übersicht: IVELL, 1998; DEINDL, 2001). Im Weiteren wird diese auch verkürzt
als 18S bezeichnet. Als aktive Referenz wird diese Kontrolle in einem eigenen
Ansatz amplifiziert. Die anhand einer Standardkurve ermittelte theoretische
Molekülmenge der Ziel-mRNA wird ins Verhältnis zur Kontrolle gesetzt. Anhand der
errechneten Quotienten werden die Einzelproben verglichen und statistisch
ausgewertet.
Produktamplifikation für die PCR-Standards
Die Quantifizierung der spezifischen RNA-Mengen erfolgte in der real-time PCR
gegen eine Standardverdünnungsreihe (s. 2.3.2.4). Die Fragmente wurden per PCR
amplifiziert (Protokolle s. Anhang). Für Leptin und 18S wurde die Zielsequenz der
real-time PCR auch zur Herstellung der Standardverdünnungsreihe verwendet. Die
Primer, welche die Fragmente für die beiden Rezeptoren festlegen, wurden je auf
Grundlage eines längeren PCR-Fragmentes bestimmt. Dieses Fragment wurde bei
diesen Assays als Standard eingesetzt.
Die Primer wurden von Invitrogen (Karlsruhe) bezogen. Die PCR-Protokolle für die
Standardamplifikation sind im Anhang aufgeführt.
Sequenzierung
Die Produkte für die Standardverdünnungsreihen von Leptin- und Leptinrezeptor-
RNA wurden nach der Didesoxy-Kettenabbruchmethode (SANGER et al., 1977) mit
dem CEQTM Dye Terminator Cycle Sequencing (DTCS) mit Quick Start Kit (Beckman
Coulter, Fullerton, CA, USA) nach folgendem Standardprotokoll sequenziert:
Material und Methoden
25
Der Sequenzier-PCR-Mix enthielt 6 µl cDNA, 2 µl Primer und 4 µl DTCS-Mastermix.
Die Cycling Reaktion wurde mit 30 Zyklen bei 96 °C für 20 s, 50 °C für 20 s und
60 °C für 4 min. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 µl Stoppreagenz (2 µl
3M NaOAc pH 5,2; 2 µl 100 mM EDTA pH8; 1 µl Glykogen) abgebrochen. Das
Produkt wurde mit 99 % Ethanol präzipitiert, gewaschen und getrocknet. Das Pellet
wurde in CEQTM-Ladepuffer suspendiert und in den Sequencer (CEQTM8000;
Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) geladen.
Die Sequenzierung der entsprechenden Fragmente von GPR41 und 18S erfolgte
durch MWG Biotech AG (Ebersberg). Alle Sequenzierungen wurden sowohl in
sense, als auch antisense-Richtung durchgeführt. Als Primer für die Sequenzierung
wurden jene aus der PCR verwendet. Die Ergebnisse wurden sowohl anhand der
Fluoreszenzpeaks, als auch den Basencodes, visuell kontrolliert. Insbesondere sich
überlappende Bereiche wurden auf Widersprüchlichkeiten miteinander verglichen. Im
Falle von Leptin und 18S wurden die Ergebnisse mit Hilfe von BLAST (engl.: basic
local alignment search tool; ALTSCHUL et al., 1990;
(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast/; 2004)) und Multalin Version 5.4.1 (CORPET, 1988)
mit der veröffentlichten Sequenz auf Übereinstimmung überprüft.
Leptin
Bei Leptin wurde dieselbe Sequenz für die Standardverdünnungsreihe und die
quantifizierende real-time PCR verwendet. Die Primer dafür wurden von YUEN et al.
(2002) übernommen, die ein Fragment von 183 Nukleotiden festlegen. Sie wurden
von Invitrogen (Karlsruhe) bezogen. Das Ergebnis stimmte mit der veröffentlichten
Sequenz ob-mRNA AF372504 (Capra hircus) überein.
18S rRNA
Die Primer für die 18S mRNA wurden anhand der bekannten Sequenz nach
AF102857 (Sus scrofa) online mit der Software Primer 3 ( 2004, Whitehead
Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA, USA) konzipiert. Sie codieren für
81 Nukleotide. Die Bestätigung des amplifizierten Fragments erfolgte durch Vergleich
mit der veröffentlichten Sequenz für die Ziege AF379200 (Capra hircus).
Material und Methoden 26
Leptinrezeptor
Die partielle cDNA-Sequenz des caprinen Leptinrezeptors wurde auf Basis eines
PCR-Fragmentes analysiert, welches für einen Abschnitt von 383 Basenpaaren
codiert. Die Primer dazu wurden nach LIN et al. (2000) synthetisiert, die ursprünglich
vom Schwein (AF092422; Sus scrofa) abgeleitet sind. Das Sequenziergebnis wurde
in Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/; 2005) unter der Accession
number AY846770 veröffentlicht (Capra hircus leptin receptor long form mRNA,
partial cds). Auf Basis dieser Sequenz wurden die Primer für eine real-time PCR
konzipiert. Zum Nachweis für die lange Form des Leptinrezeptors wurde ein
TaqMan-Kit konstruiert Die Berechnung und Synthese der Primer und der MGB
TaqMan-Sonden (MGB = engl. minor groove binder) wurden von Applied
Biosystems durchgeführt. Das amplifizierte Fragment hat eine Länge von 89 Basen
und die Sonde bindet an den Plusstrang.
Putativer GPR41
Zur Ermittlung einer partiellen cDNA-Sequenz des putativen caprinen GPR41 wurden
Primer nach der humanen Sequenz (NM005304) gestaltet, die ein PCR-Produkt mit
einer Fragmentlänge von 215 Basenpaare bilden. Das Sequenzierergebnis wurde
unter der Accession number AY885226 (Capra hircus putative G-protein coupled
receptor 4 mRNA, partial cds.) in Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/;
2005) veröffentlicht.
Dieses Fragment bildete die Ausgangssequenz für die die real-time PCR-Primer und
MGB TaqMan-Sonde. Diese wurden von Applied Biosystems konzipiert und
sythetisiert. Sie umfassen ein Fragment von 74 Basenpaaren, mit einer Sonde, die
an den Reversstrang bindet. Im Folgenden sind die Primer aufgeführt:
Material und Methoden
27
Tab. 1: Sequenzen der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Primer und Sonden für die real-
time RT-PCR Assays und die RT-PCR-Primer zur Herstellung der Verdünnungsreihen für die Ob-Rb-
und GPR41-RNA.
Ob-RNA Primer
Forward: 5`GACATCTCACACACGCAG3`
Reverse: 5`GAGGTTCTCCAGGTCATT3`
18S rRNA Primer
Forward: 5`GCTCCACCAACTAAGAACG3`
Reverse: 5`GGACACGGACAGGATTGAC3`
Ob-Rb-RNA Primer (Standard)
Forward: 5`TCGGAAGATATCAGTGTTGA3`
Reverse: 5`TTGGGATGCTGATCTGATAA3`
GPR 41-RNA Primer (Standard)
Forward: 5`ACCTGATGGCCCTGGTG3`
Reverse: 5`GGTGAGGTTTAGCAACAGCA3`
ob-Rb-RNA Primer und Sonde
Forward: 5`GGAGACAGCCCTCTGTTAAATATGC3`
Reverse: 5`TGAGCTGTTTATAAGCCCTTGCT3`
Sonde: 5`TCGGCTTCACCTGATTTA3`
GPR 41-RNA Primer und Sonde
Forward: 5`TGGTGATCTTCGTGGGCAAG3`
Reverse: 5`CGAGAGGGTGAGATTTAGCAAGAG3`
Sonde: 5`CTGCGGCGCCGCC3`
2.3.1.4 Real-time RT-PCR
Die real-time RT-PCR ist eine Weiterentwicklung der RT-PCR (MULLIS et al., 1986;
RAPPOLEE et al., 1991), bei der die Detektion der amplifizierten Fragmente nicht als
Endpunktanalyse in einem Gel durchgeführt wird, sondern durch
Material und Methoden 28
fluoreszenzmarkierte Farbstoffe direkt im Reaktionsgefäß erfolgt (HOLLAND et al.,
1991).
Voraussetzung für die Quantifizierung mit der real-time PCR ist die stöchiometrische
Bindung des Farbstoffes, so dass das Fluoreszenzsignal proportional der Menge
spezifischer PCR-Fragmente ist (IVELL, 1998).
Technologisch werden dabei zwei Methoden unterschieden: unspezifische Detektion
mittels DNA-bindender Farbstoffe, und die spezifische unter Verwendung von
Hybridisierungssonden (LEE et al., 1993; ISHIGURO et al., 1995; LIVAK et al.,
1995).
SybrGreen I (Molecular Probes Inc., Eugene, USA) ist ein unspezifisch DNA-
bindender Fluoreszenzfarbstoff. Die Bindung erfolgt in der kleinen Furche der
Doppelhelix, weist also nur doppelsträngige DNA nach. Dabei ist SybrGreen I nicht
interkalierend d.h., dass die Bindung der Farbstoffmoleküle die räumliche
Molekülstruktur nicht beeinflusst, und somit eine Linearität zwischen Signalintensität
und Fragmentlänge besteht (IVELL, 1998).
Die sequenzspezifische TaqMan-Sonde basiert auf dem Fluoreszenzresonanz
Energietransfer (FRET). Die Sonde ist mit einem Fluorophor (FAM;
Fluoreszeinderivat 6-Carboxy-Fluorescein) am 5`-Ende, und dem Quencher
TAMRA am 3`-Ende markiert, welcher die Fluoreszenz unterdrückt („Förster type
energy transfer“, FÖRSTER, 1948).
Die Sonde bindet neben den Primern spezifisch an eine Sequenz des Amplikons,
und wird bei der Nukleotidsynthese durch die Taq-DNA-Polymerase hydrolysiert. Der
Quencher wird dadurch vom Fluorophor getrennt und dieses setzt somit das
Fluoreszenzsignal frei. Das verwendete FAM emittiert Licht der Wellenlänge
518 nm.
Die Reaktionen wurden in einem Thermocycler des Typs Abi Prism 7000 (Applied
Biosystems (ABI), Foster City; CA, USA) durchgeführt. Dieser nutzt als Lichtquelle
eine Tungsten-Halogenlampe. Das Licht durchleuchtet die mit Folie gasdicht
verschlossenen Vertiefungen. Das emittierte Fluoreszensignal wird über ein Optik-
und Filtersystem geleitet, und von einer CCD-Kamera detektiert. Zur Korrektur
möglicher optischer Fehler wird eine passive Referenz dem Mastermix beigegeben,
welche die Referenzemission zur Messung des Reportersignals bildet. In allen
Assays wurde der Farbstoff ROX (6-Carboxy-X-rhodamin; 602 nm) verwendet.
Material und Methoden
29
Die Primer sind in Tab. 1 gelistet. Der Probenansatz und die Cyclingprotokolle sind
im Anhang aufgeführt. Jede cDNA wurde einmal in einem Doppelansatz gemessen.
Es wurden jeweils alle Proben aus einer cDNA-Synthese zusammen angesetzt.
Nach Herstellung des Mastermix wurde dieser in die Wells einer 96er Mikrotiterplatte
pipettiert. Um mögliche Kontaminationen durch den Pipettiervorgang
auszuschließen, wurden die Negativkontrollen NTCs (no template controls) als letzte
Proben, sowie in regelmäßigen Abständen (nach ca. 20 bis 26 Proben) auf die
Mikrotiterplatte gegeben. Eine Folienabdichtung schützt vor Verlusten.
Durch einen initialen 10-minütigen Erhitzungsschritt (95 °C) wurde die hot-start Taq-
Polymerase aktiviert. Annealing- und Extensionsschritt erfolgten beide bei 60 °C.
Dies ist möglich, da die im Kit verwendete Polymerase bereits ab 55°C eine
signifikante Aktivität besitzt, und somit diese beiden Reaktionsabschnitte
zusammengefasst werden können (GELFAND, 1989). Die Detektion erfolgt beim
verwendeten real-time Cycler Abi Prism 7000 (Applied Biosystems (ABI), Foster City;
CA, USA) am Ende der Elongation bei 60°C (aquisition point) jedes Zyklus.
Herstellung der Standardverdünnungsreihen
Zur indirekten Quantifizierung wurden Standardverdünnungsreihen der spezifischen
DNA-Abschnitte hergestellt (sh. 2.3.1.3). Die synthetisierten PCR-Produkte wurden
nach Herstellerangaben mit einem kommerziellen Kit gereinigt und konzentriert
(QiaQuick PCR-Purification Kit, Qiagen, Hilden). Die gereinigten Amplifikate wurden
in 10 mM Tris·Cl-Puffer (pH 8,5; Qiagen, Hilden) gelöst, und sodann auf ein DNA-Gel
aufgetragen. Als Massenstandard diente der Größenmarker ΦX174 DNA/BsuRI
(HaeIII) (MBI Fermentas, St. Leon-Rot). Mit dem Fluorimager wurde das
Fluoreszenzsignal der Bande des PCR-Produktes und Markerbanden einer
ähnlichen Länge gemessen. Die Menge des PCR-Fragmentes wurde nach folgender
Berechnungsformel bestimmt:
cPCR-Fragment = (MGPCR-Fragment · mMarkerbande / MGGes · VMarker)
cPCR-Fragment: Konzentration des PCR-Fragmentes; MGPCR-Fragment: Molekülgröße des PCR-Fragmentes;
mMarkerbande: Masse der Markerbande im Gel ; MGGes: Summe der Fragmentlängen aller Markerbanden;
VMarker: Volumen des Markerauftrags
Material und Methoden 30
Aus der Konzentration konnte die molare Konzentration sowie die Molekülanzahl je
Volumeneinheit berechnet werden. Diese lag für alle Amplifikate in einer
Größenordnung von 1011 Moleküle / µl. Diese Stammlösung wurde aliquotiert und bei
–80 °C gelagert. Ein Aliquot wurde auf die Ausgangskonzentration von 109 verdünnt,
und aus dieser Konzentration die Standardverdünnungsreihe hergestellt (10 mM
Tris·Cl-Puffer; pH 8,5). In der real-time PCR wurde jeweils eine Reihe über 6
Potenzen eingesetzt. Für die Zielgene erstreckte sie sich von 100 bis 105 Moleküle/µl,
für 18S rRNA wurden eine Reihe von 103 bis 108 Moleküle/µl verwendet.
Die Quantifizierung der Proben erfolgte durch Interpolation der gemessenen cT-
Werte (engl. threshold cycle) gegen die jeweilige Standardkurve, um die Menge an
Ziel-DNA zu messen. Mit den ermittelten Einzelwerten wurde für jede Proben-RNA
der Mittelwert aus den beiden Assays gebildet. Diese Werte der Zielgene wurden
durch die Werte der endogenen Kontrolle dividiert. Somit erhielt man für jede Probe
einen normalisierten Quotienten, der in die statistische Analyse einging.
Abb. 2: Beispielhafte Darstellung einer Standardkurve über 6 Dezimalverdünnungs-stufen
(GPR41) als Bildschirmausschnitt (Slope = 3,309; R² = 0,996).
x-Achse: Logarithmus der Verdünnungsstufe; y-Achse: CT
Material und Methoden
31
Standardkurve, Amplifikationseffizienz und Wiederholbarkeit
Störgrößen, wie z.B. die Einwirkung von Inhibitoren, können die Reaktionskinetik der
PCR beeinflussen. Qualitätskriterium der Reaktion ist die Effizienz. Die Erfassung
der Effizienz ist für die quantifizierende PCR von besonderer Bedeutung, da eine
genaue Messung nur bei konstanter Reaktionseffizienz gewährleistet ist (KUBISTA
et al., 2006).
Die Effizienz wurde nach der Standardkurvenmethode ermittelt. Dazu wird der CT als
Ordinate über der Startkopienzahl der Standardverdünnungsreihe dargestellt. Diese
Standardkurve wurde nach Bestimmtheitsmaß (R²) und Geradensteigung analysiert,
wobei die Steigung oder slope als Grundlage der Berechung von prominenter
Bedeutung war. Als valide erachtet wurden Geraden mit R² > 0,97 über mindestens 5
Verdünnungsstufen, wobei bis zu zwei Ausreißer aus der Doppelbestimmung und
der Berechnung genommen wurden. Die Effizienz berechnet sich dann nach
folgender Formel:
E = 10-1/m
E = Effizienz; m = Steigung der Regressionsgeraden (slope)
Auf Grundlage der validen Standards wurde zudem die Wiederholbarkeit der PCR-
Assays untersucht. Die Berechnung erfolgte für Leptin auf der Basis von n = 8
Standardkurven, Leptinrezeptor n = 6, und GPR41 sowie 18S jeweils n = 5 validen
Verdünnungsreihen (s. a. Abb. 2).
Threshold, Basislinie und CT
Die Quantifizierung erfolgte anhand des CT. Mit der Festlegung des Threshold (engl.:
Schwellenwert) wurde eine Mindestmenge an synthetisierten PCR-Fragmenten als
Detektionslimit definiert, und dann für alle Proben einer RNA-Spezies beibehalten.
Für alle vier Abschnitte wurde er mit 0,2 festgelegt. Der CT oder auch Crossing point
bezeichnet jenen Zyklus, bei dem die Amplifikationskurve diesen Threshold
schneidet. Ihr Wert ist umgekehrt korreliert mit der Menge an Matrizen-cDNA.
Mit der Basislinie wurde die Signalstärke des Hintergrundrauschens bestimmt, die als
noch nicht spezifisch betrachtet wird. Die Einstellung der Basislinie wurde nach
Herstellerempfehlung durch die Software des ABI Prism 7000 im Modus „Automatic
Material und Methoden 32
Baseline“ vorgenommen, die aus allen Proben eines Assays eine ideale Basislinie
berechnet. Die Stärke des Signals wird mit Delta Rn bezeichnet.
Spezifität
Sybr Green I
Sybr Green I bindet an jegliche doppelsträngige DNA. Durch unspezifische Bindung
von Primern, aber auch durch unvollständige Elongation entstehen sog.
Primerdimere, unspezifische Fragmente, die die Genauigkeit der
Fluoreszenzmessung, und damit der Quantifizierung, beeinträchtigen (ISHIGURO et
al., 1995; RIRIE et al, 1997). Insbesondere wird dann auch die Sensitivität des
Assays durch erhöhtes Hintergrundrauschen und späteren CT verringert (PETERS et
al, 2004).
Die Fragmentlänge der PCR-Produkte wurde für jede quantifizierte cDNA-Spezies in
einer Gelelektorphorese stichprobenartig bestätigt (2 % Agarose/TBE; gefärbt mit
Ethidiumbromid) Als Marker diente ΦX174 DNA/BsuRI (HaeIII). Mit der
Schmelzkurvenanalyse wurde am Ende der PCR die Spezifität jeder Reaktion
bestätigt. Durch Temperaturerhöhung wird dabei die enthaltene DNA denaturiert.
Durch die Dissoziation der PCR-Fragmente wird das gebundene Sybr Green I frei,
was in einem Abfall des Fluoreszenzsignals resultiert. Die Schmelz- oder
Dissoziationskurve wurde über ein Temperaturspektrum von 60°C bis 90 °C
aufgezeichnet, und als Graph der Fluoreszenz über der Temperatur als Abszisse
erstellt (s. Abb. 3).
TaqMan-Sonden
Die Spezifität der Sonden für Leptinrezeptor und GPR41 wurde mit BLAST bestätigt.
Da die Hydrolyse der TaqMan-Sonde nur erfolgte, wenn es zu einer
sequenzspezifischen Hybridisierung zwischen Sonde und Template kommt, wird das
Fluoreszenzsignal nur generiert, falls es zu einer Amplifikation der Zielsequenzen
kommt. Unspezifische Nebenprodukte wurden dadurch nicht detektiert, und Post-
PCR-Processing wie die Schmelztemperaturanalyse entfielen somit. Als zusätzliche
Bestätigung wurde die Größe der PCR-Fragmente von Proben und Standardkurven
beider Assays stichprobenartig in einer Gelektrophorese verifiziert.
Material und Methoden
33
2.3.1.5 Statistische Auswertung
Die gewonnenen Daten wurden mittels t-Test mit dem Programm SigmaStat (Version
2.03; Systat Software Inc., Chicago, IL, USA) ausgewertet. Für jedes Zielgen wurden
die Mittelwerte von Behandlungs- und Kontrollgruppe verglichen (Mittelwerte ± SEM).
Abb. 3: Beispielhafte Darstellung von Schmelzkurven / Dissoziationskurven der real-time
RT-PCR mit Sybr-Green I als Detektor (oben: Leptin; unten: 18S rRNA). Alle
Proben zeigen einen deutlich abgesetzten Temperaturpeak in der
1. mathematischen Ableitung, wohingegen in den Negativkontrollen kein Signal
gemessen wird (Ausschnitt der Bildschirmanzeige). X-Achsen: Temperatur (°C) y-
Achsen: Ableitung des Fluoreszenzsignals
Material und Methoden 34
Das Signifikanzniveau wurde bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05
festgelegt.
2.3.2 Untersuchung von Leptin, Insulin und Glukose im Blut
2.3.2.1 Versuchstiere
Der Versuch wurde an 9 männlichen Ziegen der Rasse Deutsche Edelziege
durchgeführt. Zum Versuchszeitpunkt waren die Tiere 10 – 12 Monate alt, und waren
im Alter von 2 – 4 Monaten kastriert worden. Aufgrund großer Heterogenität der
Tiergewichte (29 – 49 kg Körpergewicht) wurden die Tiere in vier Gewichtsgruppen
eingeteilt. Um mögliche Einflüsse der Gewichte auf die Ergebnisse der Untersuchung
zu minimieren, wurden die Tiere aus jeder Gewichtsgruppe gleichmäßig auf die
beiden Behandlungsgruppen verteilt. Die Versuchsdurchführung wurde, als
genehmigungspflichtiger Tierversuch, von der Bezirksregierung Köln bestätigt
(Aktenzeichen 50.203.2-BN 13, 19/03).
2.3.2.2 Euthanasie und Entnahme der Gewebeproben
Hauptziel dieser Arbeit ist die Darstellung und der Vergleich der mRNA-Expression
ausgewählter Proteine, die in der Regulation des Leptinsystems, des Glukose- und
des Fettsäurenstoffwechsel relevant sein könnten. Es wurden Proben von Leber und
Skelett- oder quergestreifter Muskulatur (kurz: Muskel), sowie retroperitoneales
Fettgewebe (kurz: Organfett) aus dem Nierenbereich und Unterhautfettgewebe
entnommen, da diese Gewebe für die Regulation dieser Stoffwechselwege von
großer Bedeutung sind (CHILLIARD et al., 2001; CHELIKANI et al., 2003a).
Unmittelbar nach Entnahme der letzen Blutprobe wurde das Tier durch die
intravenöse Applikation von Pentobarbital® (0,2 ml/kg Körpergewicht, Essex
Tierarznei, Essex Pharma, München, Deutschland) euthanasiert (WANG et al.,
1998). Der Ablauf der Probenentnahme entsprach immer demselben Muster, und
wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Haut des gesamten Tierkörpers
wurde an der rechten Seite, von der Linea alba ausgehend, abgelöst. Zuerst wurde
eine Probe des M. semitendinosus entnommen, und anschließend das subkutane
Fett der rechten Körperseite gewonnen. Danach erfolgte die Öffnung der Bauchhöhle
entlang des Rippenbogens, zur Entnahme einer Probe des rechten Leberlappens
distal der Gallenblase. Zuletzt wurden das Unterhautfett der linken Körperseite und
das Nierenkapselfett reseziert.
Material und Methoden
35
Die Gewebe wurden sofort in eisgekühlter steriler Kochsalzlösung gespült. Muskel
und Leber wurde direkt in Trockeneis gefroren, das Fettgewebe wurde zuvor in
flüssigem Stickstoff schockgefroren, und dann in Trockeneis gelegt. Gelagert wurden
die Proben bei –80° C. Die Probennahme war spätestens 1,5 Stunden nach Tötung
des Tieres abgeschlossen.
2.3.2.3 Infusionslösungen
Die Propionatlösung wurde nach einem modifizierten Protokoll in Anlehnung an die
Arbeiten von LEE u. HOSSNER (2002) und JANES et al. (1985) hergestellt. Die
Mengen wurden für die Infusionsdauer von 260 min berechnet. Die Infusion setzte
sich aus den Komponenten Propionsäure (Sigma-Aldrich, Taufkirchen),
Natriumhydroxid (NaOH, Roth, Karlsruhe), Kaliumchlorid (KCl, Roth, Karlsruhe),
Reinstwasser (s. Anhang) und tiereigenem Serum (s. 2.1.2) zusammen, mit einer
Propionatkonzentration von 1,2 M. Zur Herstellung wurde Propionsäure (100 %) mit
Reinstwasser verdünnt. Anschließend wurde der pH-Wert mittels pH-Meter (Orion,
ORI037002, pH/mV/ISE/Temp Meter, Colora, Lorch) kontrolliert, und unter Zugabe
der NaOH - Plätzchen auf pH 7,4 eingestellt. Weiter wurde Kalium (1,2 mg·100 ml-1)
zugegeben. Nach Sterilisierung im Autoklaven (Systec-Tischautoklav, 2540 EL,
Tuttnauer, Breda, Niederlande) wurde der pH-Wert erneut überprüft und bei Bedarf
korrigiert. Das Kalium diente dazu, einer Hypokaliämie (RABINOWITZ et al., 1984)
während der Behandlung vorzubeugen. Unmittelbar vor der Applikation wurde das
tiereigene Serum (0,6 ml·100 ml-1) zur zusätzlichen Pufferung des eingestellten pH-
Wertes zugefügt.
Die Zusammensetzung der Negativkontrolle wurde entsprechend der
Propionatlösung konzipiert. Aufgrund der osmotischen Aktivität von Natriumionen
und dessen Bedeutung im Organismus, wurde als Negativkontrolle eine Lösung mit
derselben Natriumkonzentration hergestellt. Auf Grundlage der zugegebenen Menge
an NaOH wurde dafür die Natriumkonzentration der Propionatlösung berechnet. Die
enthaltene Menge Natrium entsprach einer 1,15 M Lösung. Wegen der einfachen
Verfügbarkeit und aufgrund des physiologischen Vorkommens, wurden die
Natriumionen als Kochsalz (NaCl, Roth, Karlsruhe) eingesetzt. Gemäß dem
Herstellungsprotokoll wurde Kaliumchlorid zugegeben, autoklaviert, und das
tiereigene Serum für die gebrauchsfertige Lösung zugemischt.
Material und Methoden 36
2.3.2.4 Versuchsaufbau und Blutentnahmen
Um die Anzahl der Versuchstiere gering zu halten, wurden Vorversuche
durchgeführt, in denen die Konzentration und Dauer der Infusionen optimiert wurde.
Die Behandlungsprotokolle wurden dabei ohne Gewebeentnahme durchgeführt. Fünf
dieser Versuche mit entsprechender Konzentration wurden in die statistische
Auswertung aufgenommen. Diese unterschieden sich allerdings in Dauer
(Infusionsdauer 255 min, Gesamtdauer 315 min) und Probennahmefrequenz
(15minütig). Die Versuchsdauer im Hauptversuch betrug 320 min (Infusionsdauer
260 min). Die Tiere wurden unmittelbar am Ende der Infusion getötet, und
Gewebeproben für die molekularbiologische Untersuchung entnommen (2.3.1). Eine
60-minütige Vorperiode vor jeder Infusion diente der Ermittlung der Basalwerte, und
die Infusion startete unmittelbar im Anschluss.
Die Probennahmefrequenz unterschied sich zwischen den Versuchen und den
beiden Tiergruppen. Bei den mit Propionat behandelten Tieren wurden
durchschnittlich 1,0 ml Blut in Intervallen von fünf Minuten entnommen. Um die
Belastung niedrig zu halten wurde bei den Tieren mit Kochsalzinfusion in
zehnminütigen Abständen entnommen. Glukose wurde in allen Blutproben
gemessen, so dass in beiden Versuchsabschnitten für die Propionatgruppe alle fünf
Minuten, in der Kontrollgruppe alle zehn Minuten ein Wert ermittelt wurde.
Leptin und Insulin wurde in der Propionatgruppe in den Vorversuchen in
fünfzehnminütigen Abständen, im Hauptversuch in zehnminütigen Abständen
gemessen, während in der Behandlungsgruppe alle zehn Minuten ermittelt wurde.
Das Serumprofil der freien Fettsäuren wurde durch hochfrequente
Probenuntersuchung zum Versuchsbeginn, beim Infusionsstart und am
Versuchsende charakterisiert. Zwischen der 60. – 210. Minute, wurde in
sechzigminütigen Abständen beprobt.
Die Infusionsgeschwindigkeit berechnet sich aus der Konzentration der Lösungen
und der Infusionsrate für Propionat von 96 µmol·kg-1·min-1. Die NaCl-Kontrolle wurde
entsprechend dem Körpergewicht mit einer äquivalenten Na-Konzentration und
Infusionsgeschwindigkeit appliziert.
In die Auswertung der Blutparameter wurden die fünf Infusionen der Vorversuche,
und neun des Hauptversuches einbezogen. Bei einem Tier wurde dieselbe Infusion
zweimal durchgeführt. Diese wurde über gemittelte Werte nur einmal in die
Auswertung miteinbezogen. Für die Blutparameter ergaben sich somit
Material und Methoden
37
Gruppengrößen von n=8 in der Propionatgruppe, und n=5 in der Kontrollgruppe. Für
die molekularbiologischen Analysen betrug die Gruppengröße für Propionat n=4, und
n=5 für die Kontrolle.
2.3.2.5 Statistische Auswertung
Für die statistische Auswertung kam das Statistikprogramm SAS® System 8e (SAS
Institute, Massachusettes, USA) zur Anwendung. Die Berechnung erfolgte mit dem
Algorithmus „Mixed Procedure“, um Veränderungen der Blutspiegel unter
Berücksichtigung der fixen Effekte Zeit, Behandlung und der Interaktionen
Zeit x Behandlung über den Versuchszeitraum zu untersuchen. Dabei werden
sowohl Effekte der Behandlung auf die Gruppen im gesamten Betrachtungszeitraum
als auch Einflüsse des Zeitverlaufs auf alle Tiere berücksichtigt. Die Probenfrequenz
wurde bei der statistischen Untersuchung mit dem mixed model (repeated
measurement) berücksichtigt.
Zudem können mögliche Effekte der Behandlung auf den zeitlichen Verlauf innerhalb
und zwischen den Gruppen anhand der Betrachtung von Einzelmessungen ermittelt
werden. Ein weiterer Vorteil diese Methode ist, dass sie die unterschiedliche Anzahl
von Messungen je Zeitpunkt berücksichtigt. Diese Voraussetzung ist aufgrund der
unterschiedlichen Probenintervalle bei den Versuchsgruppen und in den
Versuchsperioden notwendig (vgl. 2.3.2.4). Die Auswertung erfolgte nach Ermittlung
der Covarianzstruktur anhand des AIC (Akaike`s Information Criterion).
2.4 Untersuchung von Plasmaleptingehalt und Glukose-
stoffwechsel bei Ziegen peri partum
2.4.1 Versuchstiere
Die Versuchsgruppen setzten sich aus sechs Milchziegen der Rasse Weiße
Deutsche Edelziege zusammen. Die Tiere befanden sich durchschnittlich in der
vierten Trächtigkeit bzw. Laktationsnummer (zwei bis sechs Laktationen). Die
Behandlungen wurden im letzten Drittel der Trächtigkeit, durchschnittlich 23 Tage (21
bis 27 Tage) ante partum, sowie in der frühen Laktation um den 9. (8. – 11.) Tag post
partum vorgenommen. Das durchschnittliche Körpergewicht betrug zum Zeitpunkt
der Clamps 65,0 ± 5,7 kg (trächtig) und 65,8 ± 4,9 kg (laktierend; Mittelwert mit
Material und Methoden 38
SEM). Es wurde je Versuchstag ein Tier behandelt. Der Tierversuch wurde vom
Regierungsbezirk Köln unter dem Aktenzeichen 50.203.2-BN 13,28/02 genehmigt.
2.4.2 Hyperglykämischer Clamp und Euglykämisch/hyperinsulin-
ämischer Clamp
Die Glukose Clamp Technik wurde von DEFRONZO et al. (1979) beschrieben, um
die Sensitivität der Insulinsekretion und –aktivität bei Menschen zu messen. JANES
et al. (1985) wendete diese Methode bei Schafen zur Untersuchung des Einflusses
exogener und endogener Glukosegaben auf die Insulinsekretion an. Seitdem sind
vielerlei Anwendungen dieser Technik zur Untersuchung des Insulin- und
Glukosestoffwechsels und deren Beziehung zu diversen Stoffwechselwegen bei
verschiedenen Spezies beschrieben worden. Der hyperglykämische Clamp misst die
Sensitivität der pankreatischen ß – Zellen auf exogen zugeführte Glukose. Mit dem
euglykämisch/hyperinsulinämischen Clamp wird die Gewebesensitivität gegenüber
Insulin ermittelt. An den Tieren wurden beide Techniken angewandt. Am Morgen
wurde der hyperglykämische Clamp durchgeführt, nach einer mehrstündigen
Versuchspause folgte der euglykämisch/hyperinsulinämische Clamp.
Hyperglykämischer Clamp
Beim hyperglykämischen Clamp wird die basale Blutglukosekonzentration oder
physiologische Ausgangskonzentration durch eine intravenöse Glukoseinfusion um
einen vorher festgelegten Wert erhöht, und für einen bestimmten Zeitraum auf
diesem Niveau gehalten (Plateauphase). In diesem Versuch war die angestrebte
Erhöhung 2,22 mmol/l über der Ausgangskonzentration, die über 1 h gehalten
werden sollte. Das Versuchstier erhielt zwei Jugulariskatheter. Einer diente der
Blutentnahme, an den zweiten waren über ein T-Verbindungsstück die
Infusionslösungen angeschlossen. Die Versuchsvorbereitung, Katheterisierung und
Haltungsbedingungen sind unter 2.1.2 beschrieben.
Die Blutproben (ca. 1,5 ml) wurden in fünfminütigen Abständen entnommen. In
diesen Proben wurde mit dem Glukoseanalyzer direkt die Glukosekonzentration
bestimmt, zur Blutserumgewinnung aliquotiert und weiterverarbeitet (s. 2.2). Die
Werte der ersten beiden Proben wurden gemittelt und als basale Konzentration
definiert. Danach wurde die Infusion einer 20 %igen Glukoselösung (Braun
Melsungen AG, Melsungen) gestartet. Über die regelmäßigen Messungen wurde das
Material und Methoden
39
Erreichen des Sollwertes überwacht. Sobald dieser erreicht war, wurde die
Infusionsgeschwindigkeit gedrosselt, und der Glukosewert auf einem
gleichbleibenden Wert gehalten. Schwankungen des Wertes wurden gegebenenfalls
über eine Regulation der Infusionsgeschwindigkeit ausgeglichen. Die Versuchsdauer
eines hyperglykämischen Clamps betrug ungefähr 2 Stunden.
Euglykämisch/hyperinsulimämischer Clamp
Bei diesem Clampversuch wird der physiologische Insulinspiegel durch eine Infusion
künstlich erhöht. Gleichzeitig wird dem Abfall der Blutglukose durch eine
Glukoseinfusion entgegengewirkt. Wie beim hyperglykämischen Clamp erfolgte die
Blutentnahme und Glukosemessung in fünfminütigen Abständen, von denen die
ersten beiden Proben zur Festlegung des Ausgangswertes dienten. Die beiden
Infusionslösungen wurden über ein T-Verbindungsstück über einen der beiden
Katheter verabreicht, während der zweite Katheter der Blutentnahme diente.
Die Insulinlösung setzte sich aus bovinem Insulin (I5500, Sigma-Aldrich,Taufkirchen),
Kalium (KCl, ApplicChem, Darmstadt), tiereigenem Serum und 0,9 % NaCl - Lösung
(Braun Melsungen AG, Melsungen) zusammen. Zur Herstellung einer Stammlösung
von 1 mg/ml wurde Insulin in Essigsäure (1%; pH 2,0) gelöst, aliquotiert, bei
–20°C gelagert, und unmittelbar vor Versuchsbeginn unter sterilen Bedingungen
zusammen mit den anderen Komponenten in die physiologische Kochsalzlösung
verbracht. Diese Gebrauchslösung wurde in einer Infusionsgeschwindigkeit
verabreicht, die einer Insulinmenge von 50 ng · kg-1 Körpergewicht · min-1 entspricht.
Die Lösung enthielt außerdem 2 ml tiereigenes Serum auf 50 ml Lösung. Die Zugabe
tiereigenen Serums verhindert die Adsorption des Insulin an der Oberfläche der
Infusionsinstrumente, und puffert zusätzlich den sauren pH-Wert des gelösten
Insulins (JANES et al., 1985). KCl (20 g/l) wurde zur Vorbeugung einer Hypokaliämie
zugegeben (JANES et al., 1985; UNGEMACH, 1999).
Die Glukose wurde als 20 %ige Lösung (Braun Melsungen AG, Melsungen)
infundiert.
Zu Beginn dieses Versuchsteils wurden ebenfalls zwei Blutproben im fünfminütigen
Abstand als Basalwerte entnommen. Danach wurde unmittelbar die Infusion der
Insulinlösung gestartet. Mit Anstieg der Seruminsulinkonzentration folgte ein Abfall
des Blutglukosegehaltes. Dieser wurde durch Infusion von Glukose auf dem basalen
Material und Methoden 40
Niveau gehalten. Dem Abfall der Blutglukose wurde mit einer Erhöhung, einem
Anstieg mit einer Verminderung der Infusionsrate (GIR) gegengesteuert.
Nachdem das Plateau für sechzig Minuten erhalten wurde, konnte der Versuch
beendet werden. Die Infusionsdauer betrug ebenfalls ungefähr zwei Stunden.
2.4.3 Messgrößen
Es wurden Glukose, Insulin, Leptin und freie Fettsäuren (FFA) gemessen (s. 2.2).
Glukose, Insulin, Leptin und die Glukoseinfusionsrate (GIR) wurden für jeden
Messpunkt ermittelt. Die basale Konzentration von Insulin und Glukose im Blut wurde
aus dem arithmetischen Mittel der beiden ersten Werte bestimmt. Diese ist die
Grundlage für die Berechnung verschiedener Kenngrößen. Die GIR wurde anhand
der Infusionsgeschwindigkeit und der Glukosekonzentration der Infusionsrate
ermittelt. Sie bezeichnet die Menge an Glukose, die pro Zeiteinheit und Körpermasse
dem Tier eingegeben wird. Die GIR wird in der Plateauphase des Clamps bestimmt.
In dieser Phase der konstanten Blutglukosekonzentration entspricht die GIR
näherungsweise dem Verbrauch bzw. der Stoffwechselrate für Glukose (s.a. 2.4.5).
Für die FFA wurden je drei Proben vor Infusionsbeginn als Ausgangswerte, und die
drei letzten Proben gemessen.
Im Hyperglykämischen Clamp ist die Insulinsekretion der pankreatischen ß-Zellen
stimuliert, was zur Erhöhung der Glukoseaufnahme in die Zelle und Glykolyse führt.
In diesem Fall stellt die GIR ein Maß für die Glukoseaufnahme in die Zelle dar. Eine
hohe GIR entspricht einer hohen Aufnahmerate und umgekehrt.
Im euglykämisch/hyperinsulinämischen Clamp wird der Insulinspiegel festgesetzt.
Hier stellt die Menge verstoffwechselter Glukose ein Maß für die Sensitivität der
Körpergewebe auf exogenes Insulin dar. Eine hohe GIR weist in diesem Falle auf
eine hohe Stoffwechselrate der Körpergewebe hin bei gleicher Insulinrate, und ist
somit ein Maß für eine hohe Insulinsensitivität der Körperperipherie.
Zur weiteren Auswertung der Clamps wurden verschiedene Vergleichsgrößen
entwickelt.
2.4.4 Vergleichsgrößen
Gewebeinsulinsensitivität
Sie kennzeichnet die Ansprechbarkeit der Körpergewebe für Insulin, und errechnet
sich aus der GIR des hyperglykämischen Clamps pro Blutinsulinspiegel [mol · ml · kg-
Material und Methoden
41
1 · min-1 · ng-1] (DEFRONZO et al., 1979). Je höher dabei die verstoffwechselte
Menge Glukose, die durch die GIR gemessen wird, desto höher ist die
Gewebesensitivität. Sie setzt allerdings voraus, dass sich die zelluläre
Glukoseaufnahme unter hyperglykämischen Bedingungen nicht verändert.
Sens = GIRhyperglykämisch · (cInsulin)-1
Metabolische Clearance Rate (MCR)
Die MCR von Insulin charakterisiert das Verhältnis der pro Zeiteinheit
ausgeschiedenen oder metabolisierten Menge Insulin zur Niveauerhöhung der
Serumkonzentration durch Insulininfusion pro Zeiteinheit. Der Quotient wird nach
JANES et al. (1985) aus der mittleren Insulininfusionsrate im euglykämischen Clamp
und der Differenz von basaler und Insulinkonzentration im Plateau gebildet. Sie wird
in Volumen pro Zeiteinheit und Körpergewicht angegeben [ml · min-1· kg-1 ].
MCR = Insulininfusionsrate · (cPlateauinsulin - cbasales Insulin)-1
Systemic Delivery Rate (SDR)
Die SDR beschreibt die endogene systemische Sekretionsrate für Insulin, und
berechnet sich als Produkt aus MCR und Plateauinsulinwert des hyperglykämischen
Clamps (DEFRONZO et al., 1979). Sie ist ein Schätzwert für die sezernierte Menge
Insulin [ng · min-1 · kg-1].
SDR = MCR · cPlateauinsulin
2.4.5 Erfassung der Milchmenge und Laktosekonzentration
Mit Erfassung von Milchmenge und deren Laktosegehalt sollten mögliche Einflüsse
eines Glukoseverbrauchs durch Laktoseefflux über die Milch bei den laktierenden
Versuchstieren untersucht werden.
Die Milchmenge wurde eine Woche vor und nach der Clampstudie für jedes Tier mit
dem regelmäßigen Melken erfasst. Die Intervalle zwischen der morgendlichen und
abendlichen Milchentnahme waren unterschiedlich lang. Sie betrugen ca. 16 und 8
Stunden. Die Milchmenge wurde in ein Verhältnis zu den Zeitintervallen (h) gesetzt.
Material und Methoden 42
Am Versuchstag wurden aus beiden Gemelken jeweils Proben entnommen, und
deren Laktosegehalt bestimmt. Diese Untersuchung wurde vom
Landeskontrollverband Rheinland e.V. durchgeführt. Die Messung erfolgte per
Infrarotmessung mit dem Milko Scan 6000 (Foss-electric, Hillerød, Dänemark).
2.4.6 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Leptinserumkonzentration erfolgt mit der Mixed
Model Anwendung des Statistikprogramms SAS® System 8e (SAS Institute,
Massachusettes, USA). Für alle anderen Parameter wurde die Varianzanalyse nach
dem Allgemeinen Linearen Modell (GLM) desselben Statistikprogramms angewandt.
Wie bereits erwähnt wird die Auswertung der Clampstudien in der Phase konstanter
Infusionsbedingungen hyper- oder euglykämischer Bedingungen (Plateauphase)
vorgenommen. Um diese Zeitfenster zu ermitteln, wurde tierindividuell die Phase der
geringsten Schwankungen der Blutglukosekonzentrationen identifiziert. Die beiden
Untersuchungsgruppen T (trächtig) und L (laktierend) wurden daraufhin untersucht,
ob sich die Abweichungen der Blutglukosewerte signifikant voneinander
unterscheiden. Zur Auswertung wurde der t-Test für gepaarte Stichproben, bzw. der
Rangsummentest nach Mann und Whitney für nicht-normalverteilte Messreihen
angewandt. Sie wurden auf die Nullhypothese, dass keine Unterschiede zwischen
den Werten im vorgegebenen Zeitraum vorliegen für die Gruppen getestet. Bei
keinem der Tiere waren in dieser Phase signifikante Schwankungen der GIR-Werte
gegeben, und so konnte für alle Tiere eine Plateauphase angenommen werden.
Gleichzeitig wurde die Übereinstimmung der Blutwerte in der Vorperiode und die
Glukoseniveaus zwischen den Gruppen getestet (SigmaStat 2.03; Systat Software
Inc.).
Für die FFA wurden die Werte nach Tiergruppe, Clampart und Probenzeitpunkt
(Versuchsbeginn oder –ende) unterschieden.
Ebenso wurden die Veränderungen der Milchleistung nach dem allgemeinen linearen
Modell auf Veränderungen eine Woche vor und nach dem Versuch, sowie direkte
Veränderungen am Versuchstag und dem darauffolgenden Tag, untersucht.
Ergebnisse 43
3 Ergebnisse
3.1 Effekte intravenöser Propionatinfusionen auf verschiedene
Zielparameter
3.1.1 Beeinflussung der mRNA-Mengen in verschiedenen Geweben
3.1.1.1 Qualität der Gesamt-RNA
Die Gesamt-RNA wurde nach Integrität und Reinheit beurteilt. Die Integrität wurde
anhand der 28S und 18S-Bande bestimmt. Ein Verhältnis von 2 : 1 spricht für eine
undegradierte, intakte RNA (Ivell, 1998). Wie aus Abb. 4 ersichtlich ist, wurden diese
Anforderungen an die Qualität der Gesamt-RNA erfüllt. Bei deutlichen Abweichungen
von diesem Qualitätsmerkmale wurde die RNA verworfen, und eine äquivalente
Gewebeprobe extrahiert.
3.1.1.2 cDNA-Sequenz der langen Form des Leptinrezeptor und putativen G-
proteingekoppelten Rezeptor GPR41 bei der Ziege
Die analysierte partielle cDNA des Leptinrezeptors umfasst 383 Basenpaare
(s. Abb. 5), was auch durch die Sequenzierung bestätigt wird. Abzüglich der Primer
konnte somit ein 343 Basenpaare umfassendes Segment des langen Leptinrezeptors
unter der Accession number AY846770 (Capra hircus leptin receptor long form
mRNA, partial cds.) in Genbank veröffentlicht werden. Nukleotid 123 zeigte sowohl
bei der Sequenzierung des Plusstranges, als auch des komplementären Stranges
28S rRNA 18S rRNA
Abb. 4: Beispiel einer denaturierenden Gelelektrophorese (Formaldehyd/MOPS) von
Gesamt-RNA zur Kontrolle der Qualität nach Extraktion und DNasebehandlung.
Ergebnisse 44
ein uneindeutiges Signal, das für Cytidin oder Thymidin spricht. Der
Homologievergleich weist an dieser Stelle für Schaf (Ovis aries) und Rind (Bos
taurus) Cytidin aus.
Die Übereinstimmung zu diesen Wiederkäuern nach BLAST liegt bei 97 % (U62124)
und 94 % (NM001012285), die Sequenz des Schweines weist 83 % (AF036908)
Übereinstimmung auf. Die Sequenz stimmt zu 80 % mit jener von Homo sapiens
(NM_005304) überein (s. Abb. 7).
Das zu sequenzierende Fragment des GPR41 bestand aus 215 Nukleotiden (Abb.
5). Ohne Primer entspricht das 178 Nukleotiden, die unter der Accession number
AY885226 (Capra hircus putative G-protein coupled receptor 41 mRNA, partial cds.)
in Genbank veröffentlicht wurden.
Der Homologievergleich mit bereits bekannten Sequenzen zeigt eine
Übereinstimmung von 99 % mit der des Schafes (DQ361027), 97 % Rind
(XM_605910), und 88 % zur humanen Sequenz (NM_005304) (sh. Abb. 8).
3.1.1.3 Gelelektrophorese der real-time PCR-Amplifikate
In der beispielhaften Darstellung in Abb. 6 sind die amplifizierten Fragmente der real-
time RT-PCR-Assays gezeigt. Zum Vergleich der Fragmentlängen ist der
Größenmarker ΦX174 DNA/BsuRI (HaeIII) aufgetragen. Die Banden der kurzen
Markerfragmente sind in dieser Abbildung allerdings nicht darstellbar. Im Original
sind diese jedoch deutlich zu unterscheiden. Alle Banden der PCR-Produkte sind klar
abgegrenzt und ohne Schlieren.
Ergebnisse 45
1 2 3
1353
1078
872
692
310
281
271
234
194
118
72
383 bp
215 bp
1 2 3
1353
1078
872
692
310
281
271
234
194
118
72
383 bp
215 bp
Abb. 5: Darstellung der PCR-
Fragmente zur
Sequenzierung in einem
2%igen Agarosegel mit
Puffersystem TBE, gefärbt
mit Ethidiumbromid:
1: Marker ΦX174
DNA/BsuRI (HaeIII) (Banden
der kurzen Markerfragmente
sind in dieser Abbildung
nicht darstellbar, im Original
jedoch deutlich zu
unterscheiden); 2:
Leptinrezeptor; 3: G-
proteingekoppelter
Rezeptor 41 (GPR41).
Abb. 6: Darstellung der Fragmente von Zielgenen und interner Kontrolle aus der real-time
RT-PCR in einem 2%igen Agarosegel mit Puffersystem TBE, gefärbt mit
Ethidiumbromid.
1 u. 6: Marker ΦX174 DNA/BsuRI (HaeIII); 2: 18S rRNA; 3: Leptin; 4:
Leptinrezeptor; 5: G-proteingekoppelter Rezeptor 41 (GPR41).
1 2 3 4 5 6
183 bp
74 bp 89 bp 81 bp
1353
1078
872
692
310
281
271
234
194
118
72
1353
1078
872
692
310
281
271
234
194
118
72
Ergebnisse 46
cLEPR 1 TACATCATGGAAAAATAAAGATGAGATGGTGCCAACAACTACAGATGCTCTGCTTTT 57
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||
oLEPR 102 TACATCATGGAAAAATAAAGATGAGATGGTGCCAACAACTACAGATGCCCTGCTTTT 158
cLEPR 58 GACGACTCCAGATCTTGGAAAGGGTTCTATTTGTATTAGTGACCAGTGCAGCAGTGC 114
||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
oLEPR 159 GAC---TCCAGATCTTGGAAAGGGTTCTATTTGTATTAGTGACCAGTGCAGCAGTGC 212
cLEPR 115 TCAGTTCTYTGAGGCTGAGAGCACAGACATAACCTGTGAGGATGGAAGCAGGAGACA 171
| |||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
oLEPR 213 TGAGTTCTCTGAGGCTGAGAGCACAGACATAACCTGTGAGGATGGAAGCAGGAGACA 269
cLEPR 172 GCCCTCTGTTAAATATGCCACCCTGCTCGGCAGCTCTAAATCAGGTGAAGCCGAGGA 228
|||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||
oLEPR 270 GCCCTCTGTTAAATATGCCACCCTCGTCGGCAGCTCTAAATCAGGTGAAGCCGAGGA 326
cLEPR 229 GGAGCAAGGGCTTATAAACAGCTCAGCCAGCAAGTGCTTCTTGAGCAACCATTCTTC 385
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |
oLEPR 327 GGAGCAAGGGCTTATAAACAGCTCAGCCAGCAAGTGCTTCTTGAGCAACCATTCTCC 383
cLEPR 386 ACCAAAGGAGTCTTCCTCTAAGAGATCATGGGAAATAGAAACCCAGGCATTTTTTATA 343
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
oLEPR 384 ACCAAAGGAGTCTTCCTCTAAGAGATCATGGGAAATAGAAACCCAGGCATTTTTTATA 441
cLEPR 1 TACATCATGGAAAAATAAAGATGAGATGGTGCCAACAACTACAGATGCTCTGCTTTT 57
|||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||| |||||
bLEPR 2772 TACATCATGGAAAAATAAAGATGAGATGGTGCCAGCAACTACAGATGCTCTACTTTT 2828
cLEPR 58 GACGACTCCAGATCTTGGAAAGGGTTCTATTTGTATTAGTGACCAGTGCAGCAGTGC 114
||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||
bLEPR 2829 GACGACTCCAGATCTTGAAAAGGGTTCTATTTGTATTAGTGACCAATGCAGCAGTGC 28985
cLEPR 115 TCAGTTCTYTGAGGCTGAGAGCACAGACATAACCTGTGAGGATGGAAGCAGGAGACA 1871
||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||
bLEPR 2886 TCAATTCTCTGAGGCTGAGAGCACAGACATAACCTGTGAGGATGAGAGCAGGAGACA 2942
cLEPR 172 GCCCTCTGTTAAATATGCCACCCTGCTCGGCAGCTCTAAATCAGGTGAAGCCGAGGA 228
|||||||||||||||||||||||||||| ||| |||||||||||||||| | |||||
bLEPR 2943 GCCCTCTGTTAAATATGCCACCCTGCTCAGCAACTCTAAATCAGGTGAAACTGAGGA 2999
cLEPR 229 GGAGCAAGGGCTTATAAACAGCTCAGCCAGCAAGTGCTTCTTGAGCAACCATTCTTC 285
||||||||| |||||||| ||||||| |||||| ||||| ||||||||| ||||| |
bLEPR 3000 GGAGCAAGGACTTATAAATAGCTCAGTCAGCAAATGCTTTTTGAGCAACAATTCTCC 3056
cLEPR 286 ACCAAAGGAGTCTTCCTCTAAGAGATCATGGGAAATAGAAACCCAGGCATTTTTTATA 343
||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
bLEPR 3067 ACCAAAGGATTCTTCCTCTAAGAGATCATGGGAAATAGAAACCCAGGCATTTTTTATA 3114
Abb. 7: Vergleichende Darstellung der partiellen cDNA-Sequenzen der langen Form des
Leptinrezeptors mit ausgewählten Arten: AY846770 Capra hircus (cLEPR);
U62124 Ovis aries (oLEPR); NM001012285 Bos taurus (bLEPR), mit
Bindungsstellen der real-time PCR Primer (unterstrichen) und TaqMan-Sonde
(Fettdruck).
Quelle: PubMed, Basic local alignment search tool (BLAST) (ALTSCHUL et al.,
1990)
Ergebnisse 47
cGPR41: 1 ATCTTCGTGGGCAAGCTGCGGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCTTGCTAAAT 57
|||||||||||||||||||||||||||||| |||| ||||||||||||||||||||
bGPR41: 137 ATCTTCGTGGGCAAGCTGCGGCGCCGCCCGCTGGCTGTGGACGTGCTCTTGCTAAAC 193
cGPR41: 58 CTCACCCTCTCGGACCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCG 114
||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||
bGPR41: 194 CTCACCCTCTCGGATCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCA 250
cGPR41: 115 GCCAGTGCCATGCACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCCCTTCTCCAGGTTCCTC 171
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
bGPR41: 251 GCCAGTGCCATGCACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCCCTTCTCCAGGTTCCTC 307
cGPR41: 172 TTCTTCA 178
|||||||
bGPR41: 308 TTCTTCA 314
cGPR41: 14 AGCTGCGGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCTTGCTAAATCTCACCCTCTCGG 70
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||
oGPR41: 1 AGCTGCGGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCTTGCTAAACCTCACCCTCTCGG 57
cGPR41: 71 ACCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCGGCCAGTGCCATGC 127
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
oGPR41: 58 ACCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCGGCCAGTGCCATGC 114
cGPR41: 128 ACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCC 155
||||||||||||||||||||||||||||
oGPR41: 115 ACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCC 142
cGPR41: 2 TCTTCGTGGGCAAGCTGCGGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCTTGCTAAATC 58
|||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||| |||| || |
hGPR41: 123 TCTTCGTGGGCAAGCTGCAGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCCTGCTCAACC 179
cGPR41: 59 TCACCCTCTCGGACCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCGG 115
| ||| |||||||||| ||||| |||| |||||||| ||||||||||||||||| |
hGPR41: 180 TGACCGCCTCGGACCTGCTCCTGCTGCTGTTCCTGCCTTTCCGCATGGTGGAGGCAG 236
cGPR41: 116 CCAGTGCCATGCACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCC 155
|||| |||||||||||| ||||||||||| || |||||||
hGPR41: 237 CCAATGGCATGCACTGGCCCCTGCCCTTCATCCTCTGCCC 276
cGPR41: 2 TCTTCGTGGGCAAGCTGCGGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCTTGCTAAATC 58
|||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| |||| || |
hGPR42: 123 TCTTCGTGGGCAAGCTGCGGTGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCCTGCTCAACC 179
cGPR41: 59 TCACCCTCTCGGACCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCGG 115
| ||| |||||||||| ||||| |||| |||||||| ||||||||||||||||| |
hGPR42: 189 TGACCGCCTCGGACCTGCTCCTGCTGCTGTTCCTGCCTTTCCGCATGGTGGAGGCAG 236
cGPR41: 116 CCAGTGCCATGCACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCC 155
||| |||||||||||| ||||||||||| || |||||||
hGPR42: 237 CCAATGGCATGCACTGGCCCCTGCCCTTCATCCTCTGCCC 276
Abb. 8: Vergleichende Darstellung der partiellen cDNA-Sequenzen des GPR41 mit
ausgewählten Arten: AY885226 Capra hircus (cGPR41); XM_605910 Bos taurus
(bGPR41); DQ361027 Ovis aries (oGPR41); NM_005304 Homo sapiens FFA(3)R/
hGPR41,
Ergebnisse 48
3.1.1.4 Ergebnisse der mRNA-Quantifizierung
Die Ergebnisse der Standardkurvenvalidierung sind in Tab. 2 dargestellt. Die
Ergebnisse der relativen Quantifizierung sind im Anhang, sowie graphisch in Abb. 9
dargestellt (Mittelwerte ± SEM).
Der Variationskoeffizient der cDNA-Synthesen wurde anhand der
Quantifizierungsergebnisse (DNA-Menge) von 18S für die beiden cDNA-Proben
einer RNA-Präparation ermittelt. Er liegt für alle Reaktionen zwischen 5-84%. Nach
Geweben geordnet betragen diese 21-84% in Leber-, 5-45% in Muskelgewebe und
8-30% in Organ- bzw. Subkutanfettgewebe.
Der durchschnittliche Variationskoeffizient der Duplikate (DNA-Menge) in den PCR-
Assays beträgt 9-19% (18S rRNA), 9-14% (Leptin), 8-16% (Leptinrezeptor) und 10-
16% (putativer GPR41).
Tab. 2: Effizienz und Wiederholbarkeit der real time RT-PCR
Fragment Effizienz
(Mittelwert ± SEM)
Interassay -
Variationskoeffizient
Leptin 1,95 ± 0,02 (n = 8) 9,4% (n = 9)
Leptinrezeptor 2,05 ± 0,09 (n = 6) 11,8% (n = 5)
G-proteingekoppelter
Rezeptor
1,98 ± 0,04 (n = 5) 4,0% (n = 5)
18S rRNA 2,01 ± 0,05 (n = 5) 11,9% (n = 6)
3.1.1.4.1 Unterschiede der mRNA-Mengen in den Fettgeweben
Es bestanden keine signifikanten Unterschiede der mRNA-Menge von Leptin,
Leptinrezeptor und putativem GPR41 zwischen Subkutanfett und Perirenalfett.
Allerdings ist die mRNA von Leptin (p = 0,060) und des Leptinrezeptors (p = 0,095)
im Subkutanfett tendenziell höher exprimiert, als im Perirenalfett. Demgegenüber
mit Bindungsstellen der real-time PCR Primer (unterstrichen) und TaqMan-Sonde
(Fettdruck).
Quelle: PubMed, Basic local alignment search tool (BLAST) (ALTSCHUL et al.,
1990)
Ergebnisse 49
wird tendenziell mehr GPR41-mRNA im Perirenalfett als im Subkutanfett
nachgewiesen (p = 0,062).
3.1.1.4.2 Leptin
Die Propionatinfusion führt im perirenalen Fettgewebe zu einer tendenziellen
Erhöhung der Leptin-mRNA um das 3,2-fache (p = 0,081). Im subkutanen Fett ist der
Mittelwert etwas erhöht, erreichte jedoch kein signifikantes Niveau (1,9-fach,
p = 0,106).
3.1.1.4.3 Lange Form des Leptinrezeptors
Die Mittelwerte der ob-Rb-mRNA sind in allen vier untersuchten Gewebearten in der
Propionatgruppe geringer als in der Kontrollgruppe. Signifikante Unterschiede lassen
sich allerdings nur im perirenalen Fett nachweisen (4,2-fach; p= 0,042). Die
Absenkungen durch die Behandlung um das 4,5, 2,6 bzw. 1,7-fache im Unterhautfett,
Muskel- und Lebergewebe sind nicht signifikant (p = 0,286; p = 0,127 u. p = 0,338).
3.1.1.4.4 Putativer G-proteingekoppelter Rezeptor GPR41
Der Vergleich der GPR41-mRNA in den beiden Fettgewebsarten zeigt eine deutliche
Erhöhung in den subkutan entnommenen Proben bei der Propionatgruppe (12-fach;
p=0,029). In den perirenal entnommen Proben ist kein Unterschied zwischen den
beiden Gruppen zu verzeichnen (p = 0,756).
Ergebnisse 50
Rel
ativ
e G
ene
xpre
ssio
n [L
eptin
/ 1
8S r
RN
A] Perirenalfett
p < 0,1
Subkutan-fett
n.s.
0,01
0,008
0,006
0,004
0
0,002
Rel
ativ
e G
ene
xpre
ssio
n [L
eptin
reze
ptor
/ 18
S r
RN
A]
Muskel
n.s.
Leber
n.s.
10-3
10-4
10-5
10-6
Rel
ativ
e G
ene
xpre
ssio
n [G
PR
41 /
18S
rR
NA
] Perirenalfett
n.s.
Subkutanfett
p < 0,05
10-3
10-4
10-5
10-6
Rel
ativ
e G
ene
xpre
ssio
n [L
eptin
reze
ptor
/ 18
S r
RN
A]
Perirenalfett
p < 0,05
Subkutan-fett
n.s.
10-3
10-4
10-5
10-6
Kontrolle (n=5) Propionat (n=4)
Rel
ativ
e G
ene
xpre
ssio
n [L
eptin
/ 1
8S r
RN
A] Perirenalfett
p < 0,1
Subkutan-fett
n.s.
0,01
0,008
0,006
0,004
0
0,002
Rel
ativ
e G
ene
xpre
ssio
n [L
eptin
reze
ptor
/ 18
S r
RN
A]
Muskel
n.s.
Leber
n.s.
10-3
10-4
10-5
10-6
Rel
ativ
e G
ene
xpre
ssio
n [G
PR
41 /
18S
rR
NA
] Perirenalfett
n.s.
Subkutanfett
p < 0,05
10-3
10-4
10-5
10-6
Rel
ativ
e G
ene
xpre
ssio
n [L
eptin
reze
ptor
/ 18
S r
RN
A]
Perirenalfett
p < 0,05
Subkutan-fett
n.s.
10-3
10-4
10-5
10-6
Kontrolle (n=5) Propionat (n=4)
Rel
ativ
e G
ene
xpre
ssio
n [L
eptin
/ 1
8S r
RN
A] Perirenalfett
p < 0,1
Subkutan-fett
n.s.
0,01
0,008
0,006
0,004
0
0,002
Rel
ativ
e G
ene
xpre
ssio
n [L
eptin
reze
ptor
/ 18
S r
RN
A]
Muskel
n.s.
Leber
n.s.
10-3
10-4
10-5
10-6
Rel
ativ
e G
ene
xpre
ssio
n [G
PR
41 /
18S
rR
NA
] Perirenalfett
n.s.
Subkutanfett
p < 0,05
10-3
10-4
10-5
10-6
Rel
ativ
e G
ene
xpre
ssio
n [L
eptin
reze
ptor
/ 18
S r
RN
A]
Perirenalfett
p < 0,05
Subkutan-fett
n.s.
10-3
10-4
10-5
10-6
Kontrolle (n=5) Propionat (n=4)
Rel
ativ
e G
ene
xpre
ssio
n [L
eptin
/ 1
8S r
RN
A] Perirenalfett
p < 0,1
Subkutan-fett
n.s.
0,01
0,008
0,006
0,004
0
0,002
Rel
ativ
e G
ene
xpre
ssio
n [L
eptin
reze
ptor
/ 18
S r
RN
A]
Muskel
n.s.
Leber
n.s.
10-3
10-4
10-5
10-6
Rel
ativ
e G
ene
xpre
ssio
n [G
PR
41 /
18S
rR
NA
] Perirenalfett
n.s.
Subkutanfett
p < 0,05
10-3
10-4
10-5
10-6
Rel
ativ
e G
ene
xpre
ssio
n [L
eptin
reze
ptor
/ 18
S r
RN
A]
Perirenalfett
p < 0,05
Subkutan-fett
n.s.
10-3
10-4
10-5
10-6
Kontrolle (n=5) Propionat (n=4)
Abb. 9: Vergleich der mRNA-Expression zwischen Propionat- und Kontrollgruppe.
Die Darstellung zeigt die relative mRNA-Menge von Leptin, Leptinrezeptor und
GPR41 zu 18S rRNA in Leber, Muskel, perirenalem und subkutanem Fett
(Mittelwerte ± SEM).
NaCl-Kontrolle Propionat
Ergebnisse 51
3.1.2 Veränderungen spezifischer Blutparameter durch intravenöse
Propionatinfusion
3.1.2.1 Leptin
Aufgrund der geringen Tierzahlen, der unterschiedlichen Untersuchungsfrequenz
zwischen Vorversuch und Hauptversuch und der großen individuellen Variabilität der
Leptinkonzentrationen, wurden für die statistische Auswertung die Werte zu
Intervallen zusammengefasst. Die Größe dieser Intervalle wurde, nach der
geringsten durchgeführten Untersuchungsfrequenz, mit 15 Minuten festgelegt, und
umfasst alle Messpunkte des jeweiligen Zeitraumes. Eine Einschränkung dieses
Systems ergibt sich für das letzte Intervall. Bei konsequenter Anwendung fallen in
diesen Bewertungsabschnitt nur die Werte der letzten Blutentnahmen in der 260.
Minute, mit einer reduzierten Tierzahl. Dies kann allerdings vernachlässigt werden,
da eine veränderte Intervallbildung keinen Einfluss auf die statistischen Ergebnisse
hat (Daten nicht gezeigt).
Die Ausgangswerte der Serumleptinkonzentrationen in den beiden Tiergruppen
unterscheiden sich nicht, mit Beginn der Infusionen trennen sich jedoch die
Verlaufskurven von Propionat- und Kontrollgruppe. Es bestehen hochsignifikante
Interaktionen zwischen der Behandlung und dem Zeitverlauf (p ≤ 0,001). Der Graphik
(Abb. 10) ist zu entnehmen, dass die Werte in der Vorphase, bis zur 30.
Infusionsminute, keine relevanten Unterschiede aufweisen. Danach beginnen die
beiden Kurven zu divergieren, wobei die Kurve der Propionatgruppe oberhalb der
Kontrollgruppe verläuft. Über die Auswertung der Einzelwerte (vgl. 2.3.1.5) können
zudem in der Kontrollgruppe signifikant erniedrigte Werte zwischen der 75. und 90.
Minute, sowie zwischen der 105. und 150. Minute, gegenüber den Werten zu Beginn
des Versuches, beobachtet werden (p ≤ 0,01). In der Propionatgruppe hingegen lässt
sich ein signifikanter Anstieg von Leptin in den letzten beiden Zeitintervallen
gegenüber einzelnen Intervallen der Vorperiode und des ersten Drittels der
Behandlungsphase nachweisen (p ≤ 0,01).
3.1.2.2 Insulin
Bei Insulin zeigt sich ein hochsignifikanter Effekt der Interaktion BehandlungxZeit
(p ≤ 0,001; Abb. 10). Wie aus dem Schaubild ersichtlich, verläuft die Insulinkurve der
Ergebnisse 52
Kontrollgruppe auf einem Niveau, das über den gesamten Versuchszeitraum
beibehalten wird.
Dagegen zeigt die Behandlungsgruppe einen deutlichen Anstieg nach Beginn der
Infusion (Behandlung x Zeit p ≤ 0,001). Die Auswertung der einzelnen
Messzeitpunkte weist einen Spitzenwert zwischen 15 und 30 Minuten nach
(p ≤ 0,001). Die Kurve flacht zwischen der 45. und 60. Behandlungsminute ab. Sie
verläuft anschließend auf einem erhöhten Niveau. Die Auswertung der einzelnen
Messzeitpunkte weist ab der 225. Minute einen Anstieg gegenüber dem
davorliegenden Plateau nach (p ≤ 0,01).
3.1.2.3 Glukose
Auch die Glukose zeigt eine hochsignifikante Interaktion aus Behandlung und Zeit
(p ≤ 0,001; Abb. 10). Nach einem überlappenden Verlauf der beiden Kurven in der
Vorperiode kommt es zum Anstieg der Glukosekurve der Propionatgruppe nach Start
der Infusion, während die Kontrollgruppe bis zum Ende des Versuches keiner
Veränderung unterliegt. Der Anstieg ist zwischen der 10. und 30. Minute gegenüber
der Vorperiode signifikant erhöht (p ≤ 0,001), mit dem Höhepunkt um die 20. Minute
(4,84 mmol/l). Zwischen der 45. und der 80. Minute fallen die Werte auf das
Ausgangsniveau zurück, worauf wiederum ein signifikanter Anstieg folgt
(7,44 mmol/l), der bis zum Versuchsende anhält und den ersten Höhepunkt
übertrifft, während die Kurve allmählich abflacht (p ≤ 0,001).
3.1.2.4 Freie Fettsäuren
Die Propionatbehandlung der Ziegen führt im Vergleich zu den Kontrolltieren zu
signifikant unterschiedlichem Verlauf der freien Fettsäuren im Blutserum über den
Versuchszeitraum (Behandlung x Zeit p ≤ 0,01). Die Ausgangswerte unterscheiden
sich nicht zwischen den beiden Gruppen. Wenngleich sich keine Signifikanzen bei
Vergleich der Einzelwerte bilden, ist aus dem Schaubild ein Abfall der Werte nach
Start der Propionatinfusion zu verzeichnen, dessen Scheitelpunkt mit der Messspitze
bei Insulin und Glukose zusammenfällt. Im 2. Drittel der Infusionsphase gleichen sich
die Fettsäurenwerte der beiden Gruppen an, wobei sich die beiden Kurven
tendenziell reziprok verhalten. Während bei den Behandlungstieren gegen
Versuchsende die Fettsäurenwerte erneut abfallen, steigen diese bei den
Kontrolltieren steil an.
Ergebnisse 53
8,0
6,0
4,0
2,0
0
-60 -30 0 30 60 90 120 150 180 210 240 260
3,2
3,0
2,8
2,6
2,4
2,2
2,0
25
20
15
10
5
0
Glu
kose
(mm
ol/l)
Insu
lin (
ng/m
l)Le
ptin
(ng/
ml)
min
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Fre
ie F
etts
äure
n (m
mol
/l)
Behandlung x Zeit: p ≤ 0,01
Behandlung x Zeit: p ≤ 0,001
Behandlung x Zeit: p ≤ 0,001
Behandlung x Zeit: p ≤ 0,001
KontrollePropionat KontrollePropionat
8,0
6,0
4,0
2,0
0
-60 -30 0 30 60 90 120 150 180 210 240 260
3,2
3,0
2,8
2,6
2,4
2,2
2,0
25
20
15
10
5
0
Glu
kose
(mm
ol/l)
Insu
lin (
ng/m
l)Le
ptin
(ng/
ml)
min
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Fre
ie F
etts
äure
n (m
mol
/l)
Behandlung x Zeit: p ≤ 0,01
Behandlung x Zeit: p ≤ 0,001
Behandlung x Zeit: p ≤ 0,001
Behandlung x Zeit: p ≤ 0,001
KontrollePropionat KontrollePropionat
8,0
6,0
4,0
2,0
0
-60 -30 0 30 60 90 120 150 180 210 240 260
3,2
3,0
2,8
2,6
2,4
2,2
2,0
25
20
15
10
5
0
Glu
kose
(mm
ol/l)
Insu
lin (
ng/m
l)Le
ptin
(ng/
ml)
min
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Fre
ie F
etts
äure
n (m
mol
/l)
Behandlung x Zeit: p ≤ 0,01
Behandlung x Zeit: p ≤ 0,001
Behandlung x Zeit: p ≤ 0,001
Behandlung x Zeit: p ≤ 0,001
KontrollePropionat KontrollePropionat KontrollePropionat KontrollePropionat
8,0
6,0
4,0
2,0
0
-60 -30 0 30 60 90 120 150 180 210 240 260
3,2
3,0
2,8
2,6
2,4
2,2
2,0
25
20
15
10
5
0
Glu
kose
(mm
ol/l)
Insu
lin (
ng/m
l)Le
ptin
(ng/
ml)
min
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Fre
ie F
etts
äure
n (m
mol
/l)
Behandlung x Zeit: p ≤ 0,01
Behandlung x Zeit: p ≤ 0,001
Behandlung x Zeit: p ≤ 0,001
Behandlung x Zeit: p ≤ 0,001
KontrollePropionat KontrollePropionat
Abb. 10: Verlauf der Serumkonzentrationen von Leptin, Insulin und freien Fettsäuren, und
Glukosewerte im Vollblut, in Behandlungs- (n = 8) und Kontrollgruppe (n = 5)
(Mittelwerte ± SEM).
Ergebnisse 54
3.2 Veränderungen im Glukosestoffwechsel bei trächtigen und
bei laktierenden Ziegen
3.2.1 Hyperglykämischer Clamp
Die während des hyperglykämischen Clamps beobachteten Blutwerte und die
verschiedenen berechneten Infusionsparameter sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
In beiden Gruppen wurde eine Erhöhung der basalen Glukosewerte um 2,22 mM
erreicht, und über eine Phase von einer Stunde aufrechterhalten. Die Abweichungen
der Glukosewerte von den Mittelwerten der beiden Gruppen im
Untersuchungszeitraum sind normalverteilt, und zeigen keine signifikanten
Abweichungen. Somit kann in beiden Gruppen ein hyperglykämisches Plateau für
eine Stunde angenommen werden.
Die Glukoseinfusionsrate unterschied sich zwischen den beiden Gruppen. Bei den
laktierenden Tieren lag diese gegenüber den trächtigen Tieren annähernd doppelt so
hoch. Um das Glukoseplateau möglichst rasch zu erreichen, wurde die Behandlung
mit einer Sturzinfusion eingeleitet, die sich in der Kurve mit einem initialen Anstieg
darstellt (s. Abb. 11). Nach der Überwindung des Volumeneffektes, stellt sich dann
bei beiden Gruppen im Beobachtungszeitraum eine Phase der konstanten
Infusionsrate (Plateau) ein.
Wenngleich die Basiswerte von Insulin bei den trächtigen Tieren um ca. 20% höher
liegen als bei den laktierenden, unterschieden diese sich nicht signifikant. Mit Beginn
der Glukoseinfusion kommt es bei allen Tieren zu einem Anstieg. Nach 25 Minuten
flacht die Kurve bei beiden Gruppen ab, und beide verlaufen über den gesamten
Beobachtungszeitraum parallel zur x-Achse. In dieser Plateauphase sind die
Insulinwerte bei den trächtigen Tieren gegenüber den Ausgangswerten verdreifacht,
und damit signifikant höher als die der laktierenden Tiere, welche das zweifache
Niveau der Vorperiode aufweisen.
Die geschätzte endogene Sekretionsrate an Insulin (SDR) und die
Gewebesensitivität für Insulin ist bei den laktierenden Tieren signifikant erhöht.
Während die SDR jedoch nur mäßig erhöht ist, ist die Sensitivität bei den
laktierenden Tieren mehr als verdoppelt.
Dagegen ist der Glukosegehalt/GIR-Quotient bei den Tieren in der Gravidität erhöht.
Zum Erhalt derselben Blutglukosekonzentration muss weniger Glukose infundiert
werden.
Ergebnisse 55
Tab. 3: Vergleich der Blut- und Infusionsparameter im hyperglykämischen
Clamp (Mittelwerte ± SEM).
Trächtig Laktierend p-Wert
Glukoseerhöhung 2,19 ± 0,02 mM 2,23 ± 0,02 mM > 0,1
GIR 10,4 ± 0,3 mmol·kg-1·min-
1
19,6 ± 0,5 mmol·kg-1·min-1 ≤ 0,05
Insulin
(Basalwerte)
0,41 ± 0,04 ng/ml;
Gruppe 0,31 ± 0,04 ng/ml > 0,1
Insulin
(Plateauphase) 1,4 ± 0,09 ng/ml
0,8 ± 0,03 ng/ml). ≤ 0,05
SDR 15,6 ± 1,04 mol·ml·kg-
1·min-1·ng-1
20,0 ± 1,19 mol·ml·kg-
1·min-1·ng-1 ≤ 0,05
Sensitivität 10,1 ± 0,66 mg·min·g-1 26,9 ± 1,18 mg·min·g-1 ≤ 0,05
Glukose/GIR 0,46 ± 0,017 kg·min·l-1 0,24 ± 0,007 kg·min·l-1 ≤ 0,05
3.2.2 Euglykämisch/hyperinsulinämischer Clamp
Die während des euglykämisch/hyperinsulinämischen Clamps beobachteten
Blutwerte und die verschiedenen berechneten Infusionsparameter sind in Tabelle 4
zusammengefasst.
In den euglykämischen Clamps konnten ebenfalls zwischen den beiden Gruppen
keine signifikanten Unterschiede der Abweichungen der Glukosegehalte im
Untersuchungszeitraum nachgewiesen werden (s. Abb. 12). Somit wurde auch bei
dieser Anwendung die Bedingung einer euglykämischen Plateauphase erreicht. Im
Gegensatz zum hyperglykämischen Clamp unterschieden sich hier allerdings die
Basalwerte, und auch im weiteren Verlauf lagen die Glukosewerte der trächtigen
Tiere über denen der laktierenden. Die GIR der Gruppen unterscheiden sich nicht
signifikant voneinander, sie sind aber tendenziell höher bei den laktierenden Tieren.
Im Gegensatz zum hyperglykämischen Clamp sind die basalen Blutinsulinwerte beim
euglykämischen Clamp signifikant unterschiedlich. Mit Start der Insulininfusion
kommt es unmittelbar zu dem erwarteten Anstieg. Die Plateauphase ist ungefähr
nach 45 Minuten erreicht, in der die Kurven abflachen und wie auch im
Ergebnisse 56
hyperglykämischen Clamp parallel der x-Achse verlaufen. Auch hier sind die
Insulinwerte der trächtigen Gruppe höher als die der laktierenden. Betrachtet man die
metabolische Clearance Rate von Insulin (MCR), zeigt sich, dass diese bei
laktierenden Tieren erhöht ist. Das Verhältnis aus Glukosegehalt/GIR ist wiederum
bei den trächtigen Tieren erhöht.
3.2.3 Leptin
Die Leptinwerte wurden durch die Clamps geringgradig beeinflusst. Sowohl die
euglykämisch-hyperinsulinämische als auch die hyperglykämische Behandlung führt
bei den Serumleptinkurven zu keinem signifikanten Unterschied zwischen trächtigen
und laktierenden Ziegen. Vergleicht man allerdings die Leptinkonzentrationen der
beiden Clamps für jede Versuchsgruppe isoliert, können durchaus unterschiedliche
Einflüsse festgestellt werden. Bei den laktierenden Ziegen besteht dabei kein
Unterschied zwischen den Behandlungen wohingegen die trächtigen Tiere eine
Erhöhung der Leptinwerte beim euglykämisch-hyperinsulinämischen Clamp und ein
Absinken der Leptinwerte unter hyperglykämischen Bedingungen zeigen. Diese
Veränderungen konnten mit einem hochsignifikanten Effekt auf die Interaktion
Zeit x Behandlung bestätigt werden (p ≤ 0,001), und zeigt, dass die Regulation des
Glukosestoffwechsels und seine Beziehung zur Leptinsekretion um den Zeitpunkt der
Geburt eine Veränderung erfährt (s. Abb. 13).
Tab. 4: Vergleich der Blut- und Infusionsparameter im euglykämisch/hyperinsulinämischen
Clamp (Mittelwert ± SEM).
Trächtig Laktierend p-Wert
GIR 10,5 ± 0,78 mmol·kg-1·min-1 12,2 ± 0,39 mmol·kg-1·min-1 ≤ 0,06
Insulin
(Basalwerte) 0,39 ± 0,04 ng/ml 0,26 ± 0,16 ng/ml ≤ 0,05
Insulin
(Plateauphase) 4,9 ± 0,18 ng/ml 2,6 ± 0,09 ng/ml ≤ 0,05
MCR 12,2 ± 0,37 ml·kg-1·min-1 24,4 ± 1,11 ml·kg-1·min-1 ≤ 0,05
Glukose/GIR 0,28 ± 0,033 kg·min·l-1 0,16 ± 0,006 kg·min·l-1 ≤ 0,05
Ergebnisse 57
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
60
50
40
30
20
10
0
2,0
1,5
1,0
0,5
0
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
Glu
kose
(m
mol
/l)In
sulin
(ng/
ml)
GIR
(µm
ol/m
in)
min
Trächtig LaktierendTrächtig
p ≤ 0,05
n.s.
p ≤ 0,05
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
60
50
40
30
20
10
0
2,0
1,5
1,0
0,5
0
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
Glu
kose
(m
mol
/l)In
sulin
(ng/
ml)
GIR
(µm
ol/m
in)
min
Trächtig LaktierendTrächtig
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
60
50
40
30
20
10
0
2,0
1,5
1,0
0,5
0
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
Glu
kose
(m
mol
/l)In
sulin
(ng/
ml)
GIR
(µm
ol/m
in)
min
Trächtig LaktierendTrächtigTrächtig LaktierendTrächtig
p ≤ 0,05
n.s.
p ≤ 0,05
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
60
50
40
30
20
10
0
2,0
1,5
1,0
0,5
0
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
Glu
kose
(m
mol
/l)In
sulin
(ng/
ml)
GIR
(µm
ol/m
in)
min
Trächtig LaktierendTrächtig
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
60
50
40
30
20
10
0
2,0
1,5
1,0
0,5
0
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
Glu
kose
(m
mol
/l)In
sulin
(ng/
ml)
GIR
(µm
ol/m
in)
min
Trächtig LaktierendTrächtigTrächtig LaktierendTrächtig
p ≤ 0,05
n.s.
p ≤ 0,05
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
60
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0
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1,5
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0,5
0
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4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
Glu
kose
(m
mol
/l)In
sulin
(ng/
ml)
GIR
(µm
ol/m
in)
min
Trächtig LaktierendTrächtigTrächtig LaktierendTrächtig
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
60
50
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0
2,0
1,5
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0,5
0
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
Glu
kose
(m
mol
/l)In
sulin
(ng/
ml)
GIR
(µm
ol/m
in)
min
Trächtig LaktierendTrächtigTrächtig LaktierendTrächtig
p ≤ 0,05
n.s.
p ≤ 0,05
Abb.11: Verlauf der Glukoseinfusionsrate sowie Serumkonzentrationen von Insulin und
Glukose im hyperglykämischen Clamp (Mittelwert ± SEM; n=6).
Ergebnisse 58
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
18
15
12
9
6
3
0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0
Glu
kose
(m
mol
/l)In
sulin
(ng/
ml)
GIR
(µm
ol/m
in)
min
Trächtig LaktierendTrächtig
p ≤ 0,01
p ≤ 0,06
n.s.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
18
15
12
9
6
3
0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0
Glu
kose
(m
mol
/l)In
sulin
(ng/
ml)
GIR
(µm
ol/m
in)
min
Trächtig LaktierendTrächtig
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
18
15
12
9
6
3
0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0
Glu
kose
(m
mol
/l)In
sulin
(ng/
ml)
GIR
(µm
ol/m
in)
min
Trächtig LaktierendTrächtig
p ≤ 0,01
p ≤ 0,06
n.s.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
18
15
12
9
6
3
0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0
Glu
kose
(m
mol
/l)In
sulin
(ng/
ml)
GIR
(µm
ol/m
in)
min
Trächtig LaktierendTrächtig
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
18
15
12
9
6
3
0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0
Glu
kose
(m
mol
/l)In
sulin
(ng/
ml)
GIR
(µm
ol/m
in)
min
Trächtig LaktierendTrächtig
p ≤ 0,01
p ≤ 0,06
n.s.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
18
15
12
9
6
3
0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0
Glu
kose
(m
mol
/l)In
sulin
(ng/
ml)
GIR
(µm
ol/m
in)
min
Trächtig LaktierendTrächtig
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
18
15
12
9
6
3
0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0
Glu
kose
(m
mol
/l)In
sulin
(ng/
ml)
GIR
(µm
ol/m
in)
min
Trächtig LaktierendTrächtig
p ≤ 0,01
p ≤ 0,06
n.s.
Abb. 12: Verlauf der Glukoseinfusionsrate sowie Serumkonzentrationen von Insulin und
Glukose im euglykämisch-hyperinsulinämischen Clamp (Mittelwerte ± SEM; n=6).
Ergebnisse 59
3.2.4 Freie Fettsäuren
Die Basalkonzentrationen unterscheiden sich nicht (s. Anhang). Die Infusionen
führten dann in allen Fällen zu einem signifikanten Abfall der freien Fettsäuren im
Blutserum (s. Abb. 14). Während jedoch bei den trächtigen Tieren die FFA nach dem
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Lept
in (
ng/
ml)
Lept
in (
ng/
ml)
min
4,0
3,83,6
3,4
3,2
3,02,8
2,6
2,4
4,0
3,83,6
3,4
3,2
3,0
2,8
2,62,4
Trächtig LaktierendTrächtig
n.s.
n.s.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Lept
in (
ng/
ml)
Lept
in (
ng/
ml)
min
4,0
3,83,6
3,4
3,2
3,02,8
2,6
2,4
4,0
3,83,6
3,4
3,2
3,0
2,8
2,62,4
Trächtig LaktierendTrächtig
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Lept
in (
ng/
ml)
Lept
in (
ng/
ml)
min
4,0
3,83,6
3,4
3,2
3,02,8
2,6
2,4
4,0
3,83,6
3,4
3,2
3,0
2,8
2,62,4
Trächtig LaktierendTrächtigTrächtig LaktierendTrächtig
n.s.
n.s.
Zeit x Behandlung
p ≤ 0,001
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Lept
in (
ng/
ml)
Lept
in (
ng/
ml)
min
4,0
3,83,6
3,4
3,2
3,02,8
2,6
2,4
4,0
3,83,6
3,4
3,2
3,0
2,8
2,62,4
Trächtig LaktierendTrächtig
n.s.
n.s.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Lept
in (
ng/
ml)
Lept
in (
ng/
ml)
min
4,0
3,83,6
3,4
3,2
3,02,8
2,6
2,4
4,0
3,83,6
3,4
3,2
3,0
2,8
2,62,4
Trächtig LaktierendTrächtig
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Lept
in (
ng/
ml)
Lept
in (
ng/
ml)
min
4,0
3,83,6
3,4
3,2
3,02,8
2,6
2,4
4,0
3,83,6
3,4
3,2
3,0
2,8
2,62,4
Trächtig LaktierendTrächtigTrächtig LaktierendTrächtig
n.s.
n.s.
Zeit x Behandlung
p ≤ 0,001
Abb. 13: Unterschiedliches Verhalten der Serumleptinkonzentrationen bei trächtigen und
laktierenden Ziegen im hyperglykämischen Clamp (oben) und im euglykämisch/
hyperinsulinämischen Clamp (unten) (Mittelwerte ± SEM; n = 6).
Ergebnisse 60
hyperglykämischen Clamp zum Beginn des euglykämischen Clamps wieder auf das
Ausgangsniveau zurückgehen, sind die FFA-Werte bei den laktieren-
den Tieren zu Beginn des euglykämischen Clamps hochsignifikant gegenüber dem
hyperglykämischen Clamp erhöht. Gleichzeitig unterscheiden sie sich auch von den
Konzentrationen zu Beginn des euglykämischen Clamps bei den trächtigen Tieren.
Zudem ist ein höheres Signifikanzniveau bei den laktierenden Ziegen gegenüber der
Vergleichsgruppe zu verzeichnen.
Die Endwerte unterscheiden sich jedoch zwischen den Gruppen und Clamparten
nicht. Die Fettsäurenwerte fallen auf dasselbe Niveau.
Abb. 14: Unterschiedliche Veränderungen der Serumwerte von freien Fettsäuren durch die
Clamps bei trächtigen und laktierenden Ziegen. Die Messungen erfolgten bei
jedem Clamp jeweils in drei Proben zum Versuchsbeginn (Basalwerte B), und in
den letzten drei Blutproben (E) (Mittelwerte ± SEM; n=6; Hypglyk:
hyperglykämischer Clamp; Euglyk: euglykämisch/hyperinsulin-ämischer Clamp ∗
p ≤ 0,05, ∗∗ p ≤ 0,01 und ∗∗∗ p ≤ 0,001).
B E B E B E B E
Hypglyk Euglyk Hypglyk Euglyk
Trächtig Laktierend
Fre
ie F
etts
äure
n (m
M)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
***
** *** * *
***
n. s.
n. s. ***
B E B E B E B E
Hypglyk Euglyk Hypglyk Euglyk
Trächtig Laktierend
Fre
ie F
etts
äure
n (m
M)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
***
** *** * *
******
n. s.n. s.
n. s. ***
Ergebnisse 61
3.2.5 Einflüsse der Glukose- und Insulininfusionen auf die Milchleistung
Die Laktosegehalte in den gepaarten Milchproben zeigen keine Abweichungen
(morgens: 4,84 ± 0,04 %; abends: 4,84 ± 0,04 %).
Der Verlauf der Milchleistung im Beobachtungszeitraum wurde für das morgendliche
und abendliche Gemelk getrennt aufgenommen. Der Vergleich der beiden Kurven
zeigt geringere Veränderungen in den Abendgemelken als in den morgendlichen (sh.
Abb. 15). Die Morgenmilchleistung steigt allmählich an und ist in der ersten Hälfte
des Beobachtungszeitraumes (vor dem Versuch) niedriger als in der zweiten (nach
dem Versuch; p ≤ 0,05), Demgegenüber wird in der Abendmenge keine Steigerung
nachgewiesen.
Am Versuchstag kommt es zu keiner Beeinflussung der Milchleistung, resp. nicht in
der direkt dem Versuch folgenden Abendmelkung. Am darauffolgenden Morgen zeigt
der Graph augenscheinlich eine Verminderung der Milchmenge. Dieser Rückgang ist
jedoch nicht signifikant. Der Rückgang vollzieht sich insbesondere bei Tieren mit
hoher Milchleistung (Daten nicht dargestellt). Ebenso unverändert ist die Milchmenge
am Abend des Folgetages.
-8 -4 0 4 8
150
120
90
60
30
0
Milc
hmen
ge (
g/h)
Tage um Versuchszeitpunkt
morgens
abends
-8 -4 0 4 8
150
120
90
60
30
0
Milc
hmen
ge (
g/h)
Tage um Versuchszeitpunkt
morgens
abends
morgens
abends
Abb. 15: Verlauf der Milchleistung im Beobachtungszeitraum. Die Milchmenge ist als
Mittelwert der morgendlichen und abendlichen Gemelke mit Standardfehler (SEM)
dargestellt (n = 6). Die Laktationstage beziehen sich auf den Versuchszeitpunkt.
Diskussion 62
4 Diskussion
4.1 Quantifizierende real-time RT-PCR
Die real-time RT-PCR ist ein indirektes Verfahren zur Bestimmung der mRNA-
Masse. Für die Genauigkeit der quantifizierenden PCR ist neben der
Reaktionsoptimierung die Probenbearbeitung von Bedeutung. Die Messung ist zum
einen von der Qualität der Gesamt-RNA, zum anderen der cDNA-Synthese
abhängig.
Aufbereitung der Gesamt-RNA-Präparationen
Ein kritischer Punkt der RNA-Gewinnung ist die Dauer der Probennahme.
FITZPATRICK et al. (2002) untersuchten die Stabilität der RNA von Geweben des
bovinen Genitaltraktes bei der Probennahme, bevor sie durch Einfrieren vor dem
enzymatischen Abbau geschützt ist. Er zeigte an ribosomaler und messenger RNA,
dass sich innerhalb der ersten 24 h die Quantität nicht, und die Qualität nur in
geringem Maße verändert. Mit seinen Untersuchungen bestätigt er auch
Untersuchungen zum Abbau von RNA in verschiedenen humanen Geweben von
LARSEN et al. (1992). Um die Wahrscheinlichkeit eines RNA-Abbaus bei der
Probennahme gering zu halten, wurde die Probennahme bis zum Einfrieren in einem
Arbeitsschritt durchgeführt. Sie war spätestens nach 1,5 Stunden abgeschlossen,
und die Proben wurden bis zur RNA-Extraktion bei –80°C tiefgefroren gelagert. Bei
der Extraktion wurde zu Beginn das Gewebe in flüssigem Stickstoff mechanisch
zerkleinert, um die Ausbeute zu erhöhen, und um gleichzeitig die Integrität der RNA
zu erhalten (MCKENNA et al., 2000).
Bei guter RNA-Qualität ist die 28S-Bande doppelt so stark ausgeprägt wie die 18S
rRNA -Bande (IVELL, 1998). Weiter führt IVELL zur Beurteilung der Integrität aus,
dass RNase-abhängige Degradierung in einem Ethidiumbromidgel zu diskreten 18S
und 28S rRNA-Banden und einer Zunahme der dazwischenliegenden Fragmenten
führt. Bei diesen Fragmenten handelt es sich primär um einzelsträngige ribosomale
RNA, welche zuerst gespalten wird. Ein Vorkommen dieser Banden macht eine
Degradierung der einzelsträngigen mRNA wahrscheinlich. Eine partielle
Degradierung ist auch bei deutlich vorhandenen 18S und 28S-Banden nicht gänzlich
auszuschließen.
Diskussion 63
Auch SCHOOR et al. (2003) bestätigten, dass eine Beurteilung nur aufgrund des
18S/28S-Verhältnisses nicht ausreichend für eine Einschätzung der Qualität ist.
Neben der Verwendung des 28S/18S-Verhältnisses, ist immer auch die Menge der
durch Degradierung entstandenen RNA-Fragmente mit einzubeziehen. Kommen
zusätzliche Fragmente, die kleiner als 28S und 18S sind, nur gering vor, spricht dies
für eine intakte RNA.
Die gewonnenen Gewebeextrakte zeigen alle ein 28S/18S-Verhältnis von annähernd
2/1, und beinhalten die Hauptmasse der RNA. Fragmente zwischen diesen beiden
Banden und unterhalb der 18S-Bande sind nur in geringem Maße vorhanden. Nach
den beschriebenen Kriterien kann die RNA-Qualität als hoch eingeschätzt werden.
Auch bei eventuell vorhandener Degradierung können jedoch noch verlässliche
Ergebnisse in der Quantifizierung erreicht werden, wenn die 28S rRNA etwa 5% der
Gesamt-RNA ausmacht, und die RNA-Masse von Fragmenten kleiner als 18S 60%
der Gesamtmasse nicht übersteigt. Dies kann bedeuten, dass ein Verhältnis von
28S/18S = 1 bei einer Gesamt-RNA in einem denaturierenden Gel, noch als mäßig
degradiert eingeschätzt werden kann. Dies bestätigt die Einschätzung einiger
Autoren, wonach gleich stark ausgeprägte 18S und 28S rRNA-Banden noch für eine
hohe RNA-Qualität sprechen (CHOMCZYNSKI u. SACCHI, 1987; MCKENNA et al.,
2000). Neuere Untersuchungen von FLEIGE et al. und FLEIGE u. PFAFFL (beide
2006) wiesen allerdings nach, dass eine schlechte RNA-Qualität den CT, und damit
direkt die Ergebnisse der quantifizierenden real-time PCR, beeinflusst. Die Autoren
empfehlen zum einen eine Kontrolle der RNA-Integrität durch Kapillarelektrophorese.
In den eigenen Untersuchungen wurde diese Untersuchung nicht durchgeführt, und
somit ist, gemessen an diesen Untersuchungen, eine Degradierung der eigenen
Proben, trotz Kontrolle in einer Gelelektrophorese, nicht gänzlich auszuschließen.
Auf die Problematik wurde jedoch bereits bei der Probennahme und –bearbeitung
durch die beschriebenen Maßnahmen eingegangen. Die weitere Empfehlung der
Autoren, der Normalisierung gegen eine interne Kontrolle zur Generierung
verlässlicher Genexpressionsergebnisse erfolgte in den eigenen Untersuchungen, so
dass mögliche Einschränkungen der RNA für die Quantifizierung ausgeglichen
wurden.
Die Konstruktion möglichst kurzer PCR-Fragmente verringert ebenfalls die
Fehlerwahrscheinlichkeit, da bei kürzeren Abschnitten die Wahrscheinlichkeit eines
Strangbruches in diesem Abschnitt reduziert ist.
Diskussion 64
Zusammenfassend können die RNA-Qualität, und die ergriffenen Maßnahmen, als
ausreichend für die Auswertung quantitativer Expressionsunterschiede eingeschätzt
werden.
Selbst bei hoher Reinheit der Gewebeextrakte können noch Inhibitoren (z.B. Salze)
in den Präparationen enthalten sein, die sich negativ auf die Effizienz, und damit die
Verlässlichkeit der Quantifizierung auswirken (BUSTIN u. NOLAN, 2004; KUBISTA et
al., 2006). Die zusätzliche Reinigung über die Membransäule und anschließende
Lösung in einem niedermolekularen Puffer minimieren diese Einflüsse.
Einflüsse der cDNA-Synthese
Die Effizienz der cDNA-Synthese wird von der Art und Charge der Primer und der
RNA-Konzentration beeinflusst. Bei den Primern werden unspezifische und
spezifische Primer unterschieden. Die Auswahl des am besten geeigneten Priming
hängt vom jeweiligen Assaydesign ab.
Das im Versuch verwendete Random Hexamer-Priming bindet unspezifisch RNA. Da
die größte Masse der Gesamt-RNA ribosomalen Ursprungs ist (95%), kann die
Umschreibung mit Random Hexamers bei gering exprimierten Genen vermindert
sein. Ebenso ist die Überschätzung von mRNA bei Random-Priming beschrieben
(BUSTIN u. NOLAN, 2004; STÅHLBERG et al., 2004).
Ein Vorteil ist, dass der Fehler durch geringgradige Integritätsverluste bei der
Verwendung von Random Primers geringer ist, da hierbei die gesamte Sequenz,
auch fragmentierter Nukleotide, vollständig umgeschrieben wird. (SCHOOR et al.,
2003). Zudem ist dies das Mittel der Wahl bei Verwendung von 18S rRNA als
interner Kontrolle (KUBISTA et al., 2006).
Verdünnungsreihe, Standardkurve und Effizienz der real-time PCR
Die Verwendung einer Verdünnungsreihe eines spezifischen gereinigten PCR-
Produktes zur indirekten Ermittlung der Anzahl der Transkripte in einer Probe wird
von SCHMITTGEN et al. (2000) und ØVSTEBØ et al. (2003) beschrieben.
Über die logarithmische Darstellung der Standardverdünnungsreihe mit dem CT als
Funktion der Kopienanzahl, wird zum einen die Effizienz näherungsweise berechnet,
zum anderen, über das Bestimmtheitsmaß (R²), die Linearität der Messung direkt
nachgewiesen. Die Detektionsgrenze bildet jener Punkt, an dem die Beziehung von
CT und cDNA-Konzentration nicht mehr linear verläuft (SCHMITTGEN et al., 2000).
Diskussion 65
In allen Assays war diese Linearität über alle Konzentrationsstufen von 100 bis 105
(Zielgene), bzw. 103 bis 108 (18S rRNA) der Verdünnungsreihen gegeben
(R² > 0,98). Abweichend davon wurde die Linearität allerdings mit Verdünnungen von
PCR-Amplifikaten der Zielgene ermittelt.
Nach der PCR-Theorie bindet in jedem Zyklus ein Primer je Amplikon. Nach diesem
Modell ist die maximale Effizienz eine Verdopplung (E = 2). Aufgrund einer Vielzahl
von Faktoren erreicht die PCR-Effizienz diesen Wert nur näherungsweise. In den
Assays von Leptinrezeptor und 18S ist die Effizienz >2,0. Dies ist darauf
zurückzuführen, dass die Effizienzberechnung eine theoretische Annäherung für die
tatsächliche Effizienz bildet. Die Standardkurvenmethode ist eine geeignete
Methode, zur Schätzung der Effizienz, jedoch wird sie damit geringgradig
überschätzt (KUBISTA et al., 2006).
Der Vergleich von TaqMan und SybrGreen zeigt bei beiden Detektionssystemen
eine vergleichbare Sensitivität und dynamische Breite. Die Linearität zwischen CT
und Template ist bei SybrGreen allerdings größer als bei TaqMan-Sonden
(SCHMITTGEN et al., 2000). KUBISTA et al. (2006) schreibt beiden Systemen eine
vergleichbare Effektivität zu. Beide Systeme sind somit für den Versuchszweck
geeignet.
Sensitivität und Spezifität der real-time PCR
Die Spezifität der Produkte in der real-time PCR wurde stichprobenweise durch
Größenvergleich in einer Gelelektrophorese gezeigt. Zudem konnten keine
Primerdimere in den TaqMan- und SybrGreen- Proben nachgewiesen werden.
Die Unterscheidung unspezifischer Amplifikation, z.B. durch Primerdimere, von
spezifischer Amplifikation, spielt bei gering exprimierten Genen, wie dem GPR41 und
Ob-Rb in Fettgewebe, eine Rolle (BUSTIN u. NOLAN, 2004). Zur Abgrenzung geben
diese Autoren eine Differenz von 5 Zyklen gegenüber einem unspezifischen
Fluoreszenzsignal der NTC als Richtwert an. Die maximale Zyklusanzahl sollte nicht
45 überschreiten. Demgegenüber werteten STÅHLBERG et al. (2004) in ihren
Assays ein Signal, das nach mehr als 32 Zyklen gemessen wird, schon als
unspezifische Primerdimere. In ihren Untersuchungen entsprach dieser CT etwa 100
cDNA-Molekülen/µl, was als statistisch signifikante Detektionsgrenze festgelegt
wurde.
Diskussion 66
Die Konzentration der Zielsequenz beeinflusst die Reproduzierbarkeit der
Ergebnisse. Im unteren Messbereich kann eine statistisch verifizierbare
Quantifizierung einer unbekannten Probe, durch die Varianz der Probenvorbereitung
und mögliche Inhibition, beeinträchtigt sein. Nach RADONIĆ et al. (2004) ist die
Quantifizierung erst nach mehr als 40 Zyklen nicht mehr verlässlich, und die Effizienz
der PCR unzureichend. Die Sensitivität der eigenen Messungen in den
aufgereinigten Verdünnungsreihen entspricht dieser Nachweisgrenze. In den
eigenen Assays wurden 10² Moleküle/µl bereits nach 26 – 27 (Leptin), 30 - 31
(Leptinrezeptor) und 33 – 34 Zyklen (GPR41) erreicht. Ein CT über 40 wurde als
unspezifisch gewertet. Der CT der der niedrigsten Verdünnungsstufe (100) betrug
< 40. In den Negativkontrollen waren keine Signale detektierbar.
Varianz der real-Time RT-PCR
GORZELNIAK et al. (2001) berichten von einer zulässigen Varianz bei
Referenzgenen von ∆CT<0,5 als methodisch zulässige Abweichung. Dieser Wert ist
aber nicht statistisch abgesichert, sondern beruht auf Erfahrungswerten zur
Einschätzung einer zulässigen Abweichung der CT-Werte der internen Kontrolle, die
nicht einer Änderung der Genexpressionsrate zuzuschreiben ist. Differenzen des CT-
Wertes, die den Wert 1 überschreiten, werden als eindeutige Regulation gewertet.
Werte dazwischen, sind als mögliche Erhöhungen einzuschätzen. Ein ∆CT > 1
entspricht annähernd einem Unterschied von 100%.
Die Möglichkeit Mengenunterschiede zwischen zwei RNAs nachzuweisen, ist von der
Replikatanzahl und Varianz der cDNA-Proben abhängig. In Abhängigkeit von der
Replikatanzahl und dem p-Wert liegen die messbaren Mengenunterschiede
zwischen 40 und 100% (ØVSTEBØ et al., 2003).
Die Reverse Transkription selbst unterliegt Schwankungen, die die Genauigkeit der
PCR beeinflussen, und die Varianz der PCR-Reaktion übertreffen.
Zur Minimierung der Varianz der cDNA-Synthese wurden die Konzentrationen der
RNA-Proben vor der RT angeglichen. Für alle Proben wurden Random Hexamers
eingesetzt, und es wurden, wie auch in der PCR, nur Primeraliquote aus einer
Herstellungscharge verwendet. Jedes Aliquot wurde zudem nur dreimal aufgetaut,
um Qualitätsverluste gering zu halten. Auch die Trennung der RT- und PCR-
Reaktionen erhöht die Genauigkeit (ØVSTEBØ et al., 2003; STÅHLBERG et al.,
2004).
Diskussion 67
Der Wert des gesetzten Threshold ist nach KUBISTA et al. (2006) von geringer
Bedeutung, vorausgesetzt, es wird in allen Untersuchungen derselbe verwendet, und
die Amplifikationskurven verlaufen parallel. Dies wiederum setzt eine gute
Reaktionseffizienz voraus. Im vorliegenden Versuch wurde der Threshold in allen
Assays manuell auf 0,2, bei automatisch gesetzter Basislinie, festgelegt.
Entgegen dem CT-Vergleich von GORZELNIAK et al. (2001) erfolgte die Auswertung
der real-time PCR nach KUBISTA et al. (2006) über den Vergleich der Molekülanzahl
in der DNA-Standardkurve. Die Variationskoeffizienten zur Untersuchung von
Abweichungen sind dabei größer. Hierbei werden die Duplikate einzeln ausgewertet.
Die größte Variabilität erfolgt durch die cDNA-Synthese. Zur Reduktion der Variation
wurde jede RNA-Probe zweimal umgeschrieben, und mit der PCR ausgewertet
(ØVSTEBØ et al., 2003). Zum Ausgleich der Varianzen in der RT wurden, neben der
Normalisierung gegen eine Standardverdünnungsreihe, die ermittelten Ergebnisse
für das jeweilige Zielgen gegen 18S normalisiert. Diese Werte wiederum wurden
direkt zwischen den beiden Gruppen verglichen, und in einem gemeinsamen Assay
gemessen. Die signifikant und tendenziell nachgewiesenen
Konzentrationsunterschiede zwischen den beiden Versuchsgruppen übersteigen in
allen Fällen eine Verdopplung der mRNA-Mengen, wie sie von verschiedenen
Autoren für signifikante Ergebnisse gefordert wird (GPR41: 12-fach, Leptinrezeptor:
4,2-fach und Leptin: 3,2-fach).
Sowohl die Interassayvariationskoeffizienten, als auch die Varianzen der Replikate in
diesem Versuch, waren unter 0,15 beim Vergleich der CT, und damit deutlich unter
dem von GORZELNIAK et al. (2001) empfohlenen Wert von 0,5.
Trotz der Verwendung von Duplikaten in der PCR und cDNA-Synthese (4 Ansätze je
Probe), lagen die Variationskoeffizienten der cDNA-Synthese zwischen 5 und 84%
(Molekülanzahl). Bei einer Erhöhung der experimentellen Replikate auf drei oder vier,
würde der CV gesenkt. Eine Verminderung der cDNA-Variabilität ist möglicherweise
auch durch eine effektivere Transkriptase der neuesten Generation zu erreichen. In
eigenen Vorversuchen wurden durch verschiedene Enzyme unterschiedliche
Transkriptionsraten gemessen. Zum anderen dürfte eine Erhöhung der Tierzahlen zu
mehr signifikanten Effekten, und höheren p-Werten führen, da die zur Verfügung
stehende Tierzahl möglicherweise als Stichprobe zu klein war.
Die ermittelten RNA-Unterschiede sind als biologisch relevant einzuschätzen. Die
fehlende Signifikanz der Leptin-mRNA Menge zwischen den Fettgeweben und
Diskussion 68
zwischen den Versuchsgruppen ist möglicherweise den beschriebenen Effekten
zuzuschreiben.
Die Verwendung von 18S rRNA als interne Kontrolle
Zum Vergleich der mRNA-Menge in Geweben von verschiedenen Individuen ist die
Verwendung einer internen Kontrolle wichtig. Diese soll in allen untersuchten
Geweben und bei allen Individuen in gleicher Menge vorliegen, und nur einer
geringen Regulation unterliegen (IVELL, 1998).
In Gewebeproben kann dazu Gesamt-RNA, ribosomale RNA und mRNA von
sogenannten Haushaltsgenen verwendet werden. Als Haushaltsgene finden häufig
Strukturproteine wie z.B. ß-Actin, Tubuline oder Enzyme wie die GAPDH
(Glyceraldehyd 3-Phosphat Dehydrogenase) Verwendung (GORZELNIAK et al,
2001; RADONIÇ et al., 2004).
Nach TRICARICO et al. (2002) wird das Zielgen idealerweise ins Verhältnis zur
Gesamt-RNA gesetzt. Demgegenüber hält BUSTIN (2000) die Quantifizierung gegen
Gesamt-RNA aus Gewebeproben für ungenau, denn in der Praxis ist die Messung
Einschränkungen unterlegen. So differiert die Menge der Gesamt-RNA aus
unterschiedlichen Geweben, die Qualität der RNA entnommener Gewebeproben ist
uneinheitlich und die Quantifizierung der Gesamt-RNA ist meist unzureichend exakt.
Neben der Verwendung von Haushaltsgenen zur Quantifizierung ist auch der
Vergleich mit ribosomaler RNA möglich. GORZELNIAK et al. (2001) untersuchte die
Verwendung von 18S als Referenz in einer Adipozytenzellkultur. Er wies in der
Zelkultur bei 18S Unterschiede der CT-Werte zwischen reifen Fettzellen und
Vorläuferzellen von mehr als 0,5 nach. Die Schwankungsbreite ist vergleichbar mit
jener anderer Referenzgene, bzw. liegt noch darunter. Bei Erfahrung mit der
Quantifizierung mit 18S in einer Anwendung ist die Verwendung von 18S möglich.
Bei Unterschieden von ∆CT>0,5 ist ein Transkriptionsunterschied von ∆CT=1
darstellbar. Durch die Extraktion von Gesamt-RNA und der Reversen Transkription
mit Random hexamers ist 18S als interne Kontrolle Mittel der Wahl.
Nach THELLIN et al. (1999) eignet sich 18S gut als interne Kontrolle. Viele der
gebräuchlichen Haushaltsgene werden in situ nämlich unter bestimmten
Experimentalbedingungen reguliert. Zudem führt die Veränderung der
Genexpression, die möglicherweise eine Nettoerhöhung der mRNA-Synthese in der
Zelle bewirkt, zu einer Verschiebung des Verhältnisses von Ziel- und Referenzgen,
Diskussion 69
die aufgrund der Dominanz von 18S zu vernachlässigen ist. Zusammenfassend
schätzten THELLIN et al. (1999) diese Methode als robust und geeignet bei der
Verwendung von Gewebsproben, z.B. auch in der klinischen Anwendung, ein.
Ebenso bewerten BUSTIN u. NOLAN (2004) 18S rRNA als eine geeignete Referenz.
18S erreicht den CT sehr früh. Eine Problematik der Quantifizierung gegen 18S ist
die große Differenz zwischen den beiden CT-Werten von Zielgen und interner
Kontrolle. Vor allem bei sehr gering exprimierten Genen wie dem des GPR41 können
somit Probleme bei der Quantifizierung auftreten (GORZELNIAK et al. 2001).
Um den CT zu senken, waren die cDNA-Proben für 18S zehnfach höher verdünnt als
bei den Zielgenen.
4.2 Veränderungen durch Propionatinfusion und deren Einfluss
auf die Genexpression der untersuchten mRNA-Spezies
Einfluss von Propionat auf die Insulin- und Glukosekonzentration in Serum und Blut
FUHRMANN et al. (1989), SANO et al. (1993a; 1995) und HUSVETH et al. (1996)
zeigen beim Wiederkäuer, dass in Folge einer Propionatinfusion, Blutglukose und
Insulin unmittelbar nach Infusionsbeginn erhöht werden. Der Insulinpeak und der
Glukoseanstieg nach dem Start der Infusion treten erwartungsgemäß in zeitlicher
Nähe auf (DICOSTANZO et al., 1999; LEE u. HOSSNER, 2002). Die Insulinsekretion
erfolgt biphasisch. FUHRMANN et al. (1989) zeigen, dass dies nur bei Färsen der
Fall ist, nicht jedoch bei laktierenden Kühen. Die im Versuch verwendeten kastrierten
Ziegenböcke stehen in ihrer hormonellen Regulation den Färsen näher als den
laktierenden Kühen, und zeigen dementsprechend ähnliche Insulinverläufe. Nach der
ersten Sekretion von gespeichertem Insulin, folgt eine zweite Phase der chronischen
Insulinsynthese eine Stunde nach Behandlungsbeginn (FUHRMANN et al., 1989;
CUNNINGHAM, 2002). RUSTENBECK (2002) führt dies auf eine Desensibilisierung
der Insulinsekretion zurück. Die Sekretion in den ß-Zellen beim Menschen durch
einen anhaltenden Glukosestimulus beschreibt er folgendermaßen: nach einem
initialen Anstieg ist der Höhepunkt nach 15 Minuten erreicht. In einer zweiten Phase
steigt der Insulinspiegel langsam an, und erreicht sein Maximum nach 2-4 Stunden.
In einer dritten Phase verläuft die Insulinkonzentration auf einem Niveau von ca. 20%
des zweiten Peaks für 8-12 Stunden. Das Zeitintervall der ersten Phase stimmte
zwischen den Untersuchungen beim Menschen und denen der eigenen
Diskussion 70
Untersuchungen überein, wie auch von weiteren Autoren beim Wiederkäuer
beschrieben (FUHRMANN et al., 1989; SANO et al., 1993a, 1995; LEE u.
HOSSNER, 2002). Die zweite Phase fiel jedoch beim Wiederkäuer länger aus (4-5
Stunden). Nach FUHRMANN et al. (1989) ist dies sowohl nach Propionatinfusion, als
auch nach Glukose der Fall. Während jedoch bei FUHRMANN et al. (1989) und
CUNNINGHAM (2002) der Insulinanstieg wieder abfiel, war dieser in den eigenen
Untersuchungen kontinuierlich. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass
in den eigenen Versuchen der Peak nach 4 Stunden gerade erreicht wurde.
RUSTENBECK (2002) schreibt weiter, dass auch freie Fettsäuren, als
glukoseinduzierte Desensibilisierung, diese Effekte auslösen. Dem widersprechen
Untersuchungen von CHELIKANI et al. (2003b), die Effekte auf Blutparameter durch
Lipidinfusion nachwiesen, jedoch ohne dass die Insulinkonzentration verändert
wurde. Die genauen Zusammenhänge zwischen Propionat, Glukose und dem
Anstieg von Insulin sind noch nicht vollständig geklärt.
Einfluss der Propionatinfusion auf die Leptinsekretion
Die Leptinexpression unterscheidet sich zwischen verschiedenen Lokalisationen des
Fettgewebes, sowie zwischen verschiedenen Wiederkäuerspezies. Zudem kann bei
verschiedenen Spezies die Expression in den verschiedenen Fettdepots vom
energetischen und nutritiven Status beeinflusst werden. Bei der Ziege ist Leptin-
mRNA im subkutanen Depot höher als im perirenalen Fett exprimiert (zur Übersicht:
AHIMA, 2006; CHILLIARD et al., 2001). Die Leptin-mRNA wurde in subkutanem und
perirenalem Fettgewebe untersucht. Muskel- und intramuskuläres Fettgewebe
wurden nicht untersucht, da durch die Gewebshomogenisierung in der
Probenaufbereitung die beiden Gewebsarten nicht zu unterscheiden sind.
Untersuchungen mittels In situ-Hybridisierung und Immunhistologie wären hier für
weiterführende Untersuchungen geeignet.
Trotz eines Anstieges in den beiden untersuchten Fettdepots wurden keine
signifikanten Veränderungen der Leptin-mRNA-Konzentration durch
Propionatinfusion nachgewiesen, allerdings fand sich eine Tendenz im perirenalen
Fettgewebe.
Diese Unterschiede zwischen den beiden Fettdepots sind ein weiterer Hinweis, dass
den Fettgewebsarten unterschiedliche physiologische Bedeutung zugeschrieben
werden kann. Welche Bedeutung die einzelnen Fettdepots und die Höhe ihrer
Diskussion 71
Expressionsraten auf die Höhe des Serumleptingehaltes haben, ist unklar. KIM et al.
(2000) untersuchten die Expressionsraten in verschiedenen Fettdepots des Rindes.
Demnach ist bei dieser Tierart die mRNA in Perirenalfett am höchsten, mäßig
vorhanden in subkutanem und intermuskulärem Fett, und am geringsten im
intramuskulären Fett. Nach einer 48-stündigen Nahrungskarenz sank die mRNA-
Menge vor allem im subkutanen und intermuskulären Fettgewebe. In den beiden
anderen Geweben wurde die Transkription nicht verändert. Die Expressionsraten
unterscheiden sich zwischen verschiedenen Wiederkäuerspezies, so dass ein
Vergleich mit den eigenen Daten nicht sinnvoll ist. Dennoch bestätigt sich die
unterschiedliche Ansprechbarkeit der Fettdepots durch energetische Regulation.
Eine weitere mögliche Einflussgröße ist die Masse des Fettgewebes in den Depots.
Als Bildungsstätten für Leptin könnten diese für die mangelnde Signifikanz der
Leptin-mRNA-Erhöhung verantwortlich sein. Größere Depots könnten selbst bei
geringerer Expressionsrate so durch ihre absolute Masse zu einem Anstieg des
Proteinspiegels beitragen. DELAVAUD et al. (2002), GEARY et al. (2003) und
HIGASHIYAMA et al. (2003) untersuchten die Korrelation des Plasmaleptingehaltes
mit dem Körperfettanteil. GEARY et al. (2003) wiesen eine positive Korrelation von
Leptin mit der Fettschichtdicke in verschiedenen Depots und der
Fleischmarmorierung bei verschiedenen Fleischrinderrassen nach. Die
Marmorierung ist ein Maß für den Muskelfettanteil. HIGASHIYAMA et al. (2003)
verglichen die Fettmenge zwischen männlichen japanischen Fleischrindern mit
Rindern einer Milchrasse (Holstein Friesian). Die Gehalte an Unterhautfett und
viszeralem Fett unterschieden sich nicht zwischen den Rassen. Bei der Fleischrasse
waren jedoch der Muskelfettanteil (die Marmorierung des Fleisches), der
Plasmaleptingehalt und die Leptin-mRNA-Expression im Unterhautfett höher.
HIGASHIYAMA et al. (2003) untersuchten allerdings nicht die Expression im intra-
und intermuskulären Fett. Wie bereits nach KIM et al. (2000) beschrieben, ist die
Leptinexpression im inter- und intramuskluären Fett mäßig bis gering. Sie unterliegt
vor allem im Unterhautfett und im intermuskulären Anteil des Muskelfetts der
Regulation. Um zu unterscheiden, ob die höhere Expression im Unterhautfett die
höhere Gewichtung hat, oder ein möglicherweise höherer Anteil des Muskelfetts am
Gesamtkörperfettgehalt, ist eine genaue Quantifizierung des Muskelfettanteils nötig.
Allerdings weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass bei Rindern vor allem das
Unterhautfett und Teile des Muskelfetts verantwortlich für die Regulation der
Diskussion 72
Leptinsekretion sind. Dies passt auch zu den Untersuchungen nach DELAVAUD et
al. (2002), wonach bei Rindern der Plasmaleptingehalt mit der Fettzellgröße, also der
Höhe der adipösen Energiespeicherung, und dem BCS positiv korreliert.
LEE u. HOSSNER (2002) konnten nach intravenöser Verabreichung einer
Propionatlösung bereits einen Anstieg der Leptinexpression im Subkutanfett von
Schafen zeigen. Die Autoren erwähnen nicht, ob auch eine Erhöhung auf
Proteinebene im Fettgewebe oder im Blut erfolgt. In den eigenen Ergebnissen konnte
eine Erhöhung des Plasmaleptinspiegels nachgewiesen werden. Die propionat-
induzierten Veränderungen der Leptin-mRNA-Menge im Subkutanfett und
Perirenalfett erreichen jedoch kein signifikantes Niveau.
Demgegenüber fielen in der Kontrollgruppe die Plasmaleptinwerte ab.
Möglicherweise liegt hier ein Verdünnungseffekt durch das Volumen der NaCl-
Kontrolllösung vor. Der folgende Wiederanstieg könnte danach durch eine verzögerte
Verteilung des Infusionsvolumens in den Intrazellulärraum zu erklären sein. Bereits
1996 zeigten MALMSTRÖM et al. einen Abfall der Leptinwerte durch eine NaCl-
Infusion bei Menschen, der auf einen Volumeneffekt deutet.
LEE u. HOSSNER (2002) infundierten, wie SANO et al. (1993a; 1995) 64 µmol·kg-1
·min-1 Propionat für 30 Minuten. Die im eigenen Versuch verwendete
Propionatkonzentration betrug 96 µmol·kg-1·min-1. Möglicherweise ist die höhere
Konzentration ein Grund, dass die Leptinerhöhung in den eigenen Versuchen auch
auf Proteinebene zu messen war. BRADFORD et al. (2006) zeigen, dass eine
Bolusinfusion (8 Minuten; 1040 µmol·kg-1) keine Leptinerhöhung zur Folge hat,
während durch kontinuierliche intraruminale Infusion (18 Stunden) eine geringe
Erhöhung der Plasmaleptinkonzentration erreicht wird. Dies passt zu den
Ergebnissen nach KIM et al. (2005). In ihren Untersuchungen über den Einfluss von
Propylenglykol auf die Schlachtkörperzusammensetzung und die Veränderungen bei
damit in Beziehung stehenden Proteinen wiesen sie eine Erhöhung der Leptin-mRNA
im Muskelfett nach mehrtägiger Fütterung von Propylenglykol (1,2-Propandiol) nach.
Als glukoplastische Verbindung wird intraruminal Propionat erhöht, während die
Konzentration an Azetat abfällt (KIM et al., 2005).
Ein Vergleich der eigenen Studie und der dargestellten Arbeiten ist nur eingeschränkt
möglich, da keine vergleichbaren Messwerte der verschiedenen Versuche vorhanden
sind. Der Nachweis von erhöhten Propionatkonzentrationen nach Propylengabe im
Diskussion 73
Pansen und eine Erhöhung der Leptin-mRNA nach KIM et al., (2005) sind jedoch ein
Hinweis, dass Propionatkonzentrationen, die auch in vivo auftreten, bereits einen
Einfluss darauf haben können.
Die Ergebnisse der verschiedenen Autoren zur Erhöhung der Leptin-mRNA oder des
Plasmaleptinspiegels führen zu der Fragestellung, inwieweit ein linearer
Zusammenhang in der Translation besteht. Darauf gehen RAMSAY u. RICHARDS
(2004) ein. In ihren Untersuchungen an subkutanen Adipozyten von Schweinen in
einer Zellkultur zeigen sie, dass das Protein durch Dexamethason und Insulin
überproportional zur mRNA erhöht wird, was die Autoren auf mögliche
posttranslationale Regulation zurückführen. Ähnliche Ergebnisse zeigen auch RICCI
et al. (2005) und LEE et al. (2007) in humanem und in Rattenfettgewebe. Eine
fehlende Korrelation zwischen zirkulierendem Leptin und Leptin-mRNA im
Unterhautfettgewebe zeigen auch GARCIA et al. (2002) bei Wiederkäuern in vivo. In
ihren Untersuchungen der Leptinveränderungen um die Pubertät bei Färsen,
korrelieren mRNA und Proteinkonzentration nicht. GARCIA et al. (2002) führen das
auf die geringe Anzahl von Gewebeproben, im Gegensatz zu den Blutproben zurück.
Ein Bindungsprotein, welches möglicherweise die Messung im Blut beeinflusst,
können sie nicht nachweisen.
Zum Einfluss von Insulin auf die Leptinsynthese beschrieben RICCI et al. (2005) eine
insulinvermittelte Erhöhung der Leptinsekretion, und führten diese allein auf
posttranskriptionale Mechanismen zurück. Auch nach LEURY et al. (2003) werden
im hyperinsulinämischen Clamp die Plasmaleptinwerte erhöht. Bei verschiedenen
anderen Autoren wird der Plasmaleptingehalt beim Wiederkäuer durch eine
Insulininfusion nicht erhöht (KAUTER et al., 2000; GABAI et al., 2002; SOLIMAN et
al., 2002). Auf Einflüsse von Insulin wird zudem in Kapitel 4.3 eingegangen.
In den eigenen Versuchen zeigte sich durch die Propionatbehandlung in beiden
Fettdepots ein Anstieg der Varianz der Leptin-mRNA-Menge bei der
Propionatgruppe, im Gegensatz zur Kontrollgruppe. Im Perirenalfett besteht zudem
eine Tendenz einer Erhöhung. Es liegt nahe, dass mit größeren Tierzahlen auch die
Erhöhung der Leptin-mRNA nachzuweisen ist. Dennoch weisen die eigenen
Ergebnisse der RNA- und Proteinuntersuchungen zunächst daraufhin, dass die
Leptinsekretion bei der Ziege sowohl durch posttranskriptionale, als auch durch
posttranslationale Modifikation reguliert wird. Wie in diesem Versuch gezeigt wurde,
Diskussion 74
sollte in Studien zur Regulation von Leptin immer sowohl die mRNA, als auch das
Protein gemessen werden.
Neben der Abschätzung des Körperfettgehaltes durch die Klassifizierung des
Schlachtkörpers und Messung der Fettdicke an verschiedenen Lokalisationen
(GEARY et al., 2003; HIGASHIYAMA et al., 2003), könnte der Muskelfettanteil über
eine Impedanzmessung und Erfassung der Fettzellgrößen abgeschätzt werden.
Nachweis der mRNA des putativen GPR41 bei der Ziege
Die Gensequenz des GPR41 ist, ebenso wie die der verwandten Rezeptoren GPR40
und GPR43, speziesübergreifend konserviert, weshalb vergleichbare
Wirkungsmechanismen wahrscheinlich sind. Der GPR43 stimmt mit dem GPR41 in
42% der Aminosäurensequenz überein (LE POUL et al., 2003). Aufgrund der
Sequenzunterschiede ist eine Unterscheidung der mRNA dieser Rezeptoren durch
die PCR, und damit der Ausschluss unspezifischer Amplifikation in der PCR möglich.
Eine hohe Übereinstimmung der Sequenz des GPR41 besteht mit einem anderen
Genabschitt. Bei Nagetieren besteht zusätzlich eine Sequenz, deren Produkt als
GPR42 bezeichnet wird, und die BROWN et al. (2003) als eine Genduplikation ohne
biologische Funktion beschreiben. Nach BROWN et al. (2003 u. 2005) ist der
Funktionsverlust des GPR42 mit dem Austausch von Arginin 174 durch Tryptophan
174 der Aminosäuresequenz assoziiert. Zwei weitere heterologe Basen sind auf den
Basen 151 und 153 gelegen (Acc. Number NM_005303 und NM_005304) (BROWN
et al., 2003 u. 2005). Auch bei Menschen ist eine entsprechende Genduplikation
nachweisbar.
Beim Rind konnte eine orthologe Sequenz in überlappenden ESTs nachgewiesen
werden (BROWN et al., 2003). Die Anzahl der Homologien der bovinen DNA-
Sequenz liegt zwischen der des humanen GPR41 und GPR42, wobei mehr
Übereinstimmung mit dem GPR41 besteht. Bei Ziege, Schaf und Rind sind die
Sequenzen im untersuchten Genabschnitt homolog. Die drei Spezies unterscheiden
sich jedoch vom humanen GPR41 und GPR42 jeweils nur in einer der beiden Basen.
Das Vorkommen, und damit auch ein unspezifischer Nachweis des GPR42 bei der
Ziege, ist nicht gänzlich auszuschließen, wenngleich die Sequenzierung keine
uneindeutigen Ergebnisse in diesen Basen zeigt. Es muss darauf hingewiesen
werden, dass der in den eigenen Untersuchungen sequenzierte Genabschnitt für
eine abschließende Betrachtung zu kurz ist.
Diskussion 75
Um in den eigenen Untersuchungen eine möglichst optimale Reaktionsspezifität für
den sequenzierten Abschnitt des putativen GPR41 zu erhalten, bindet die Sonde des
entwickelten Taq-Man® Assays in einem Abschnitt der Sequenz mit zwei zur
Sequenz des GPR42 heterologen Basen (BROWN et al., 2003). Weitere
Untersuchungen zum GPR41 und orthologer Sequenzen bei der Ziege sind
erforderlich.
Rezeptoren der GPR40-Subfamilie
Der GPR41 gehört zur GPR40-Subfamilie der G-proteingekoppelten Rezeptoren. Die
Rezeptoren dieser Rezeptorsubfamilie werden durch die Carbonsäuregruppe
aktiviert (BROWN et al., 2005). Veresterte Fettsäuren sind inaktiv, und somit auch
Triacylglyzeride keine Agonisten.
Der GPR40 wird spezifisch in den pankreatischen ß-Zellen von Ratten und
Menschen exprimiert, und verstärkt dort die glukoseinduzierte Insulinsekretion. Der
GPR40 wird durch gesättigte und ungesättigte LCFA aktiviert. Die Liganden des
GPR40 unterscheiden sich von denen des GPR41 und GPR43. Eine
Überschneidung der Aktivität von GPR40 und GPR41 ist aufgrund der
unterschiedlichen Liganden, Lokalisation und Funktion nicht beschrieben, und somit
ist eine GPR40-vermittelte Aktivierung der Leptinsekretion unwahrscheinlich
(POITOUT, 2003; COVINGTON et al., 2006).
Der GPR43 hat wie GPR41 eine hohe Affinität für Azetat, Propionat und Butyrat. Er
hat eine geringere Affinität zu Pentanoat, was eine deutliche funktionelle Abgrenzung
dieser beiden Rezeptoren ermöglicht (BROWN et al., 2003 u. 2005; COVINGTON et
al., 2006). Exprimiert wird der GPR43 nach BROWN et al. (2005) in verschiedenen
Geweben, auch im Fettgewebe. Aufgrund der Überschneidung der Liganden ist eine
gleichzeitige Aktivierung des GPR41 und GPR43, vor allem im Fettgewebe,
wahrscheinlich. Im Fokus der Untersuchung steht jedoch die Wirkung des GPR41 im
Fettgewebe auf die Leptinsynthese im Fettgewebe.
BROWN et al. (2003), NILSSON et al. (2003), XIONG et al. (2004) und LE POUL et
al. (2003) wiesen den GPR41 in allen weißen Fettgeweben nach. HONG et al. (2005)
dagegen wiesen zwar die Erhöhung der Adipogenese und GPR43-Expression in
subkutanem, perirenalem, mesenterialem und epididymalem Fettgewebe sowie in
3T3-L1-Adipozytenzellkultur nach, konnten jedoch in den genannten Matrices keine
mRNA des GPR41 nachweisen.
Diskussion 76
In den eigenen Versuchen wurde erstmals der putative GPR41 bei der Ziege
nachgewiesen. Dieser konnte sowohl in den Kontrolltieren, als auch nach
Behandlung mit Propionat, in allen Fettgewebsproben nachgewiesen werden.
Im Vergleich der mRNA-Mengen zwischen den Fettgeweben, war der GPR41
tendenziell (p < 0,06) im Perirenalfett gegenüber dem Subkutanfett erhöht.
BRADFORD et al. (2006) untersuchten bei laktierenden Milchkühen die Wirkung von
Propionat auf Leptin. Durch intraruminale Propionatgabe erhöhte sich der
Plasmaleptinwert gering, und korrelierte mit dem Plasmapropionatgehalt. Diese
geringe Erhöhung erklären BRADFORD et al. (2006) mit der assoziierten
Insulinerhöhung. Insulin dagegen korreliert mit Propionat. Wenngleich die
Leptinwirkung nur gering ausgeprägt ist, kann jedoch eine G-proteinvermittelte
Wirkung auf die Leptinsekretion nicht ausgeschlossen werden, wie im Folgenden im
Detail diskutiert wird.
Zusammenhänge zwischen dem putativen GPR41 und der Leptinsynthese und
mögliche Einflüsse der LCFA in Folge einer Propionatinfusion
Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Erhöhung der GPR41-mRNA-Menge in
Folge einer Propionatinfusion im Subkutanfett. Perirenal war kein Unterschied
zwischen der Propionat- und der Kontrollgruppe zu beobachten. Die Leptin-mRNA
verhielt sich in beiden Geweben bei beiden Gruppen ähnlich. Sie war zwar nicht
signifikant erhöht, es war aber der Trend einer Erhöhung im Perirenalfett zu
verzeichnen.
Die Expression der GPR41-mRNA im Perirenalfett blieb durch die Propionatinfusion
unverändert. Beim Gewebevergleich der Kontrollgruppe wurde im Perirenalfett
tendenziell eine höhere mRNA-Menge verzeichnet als im Subkutanfett. Nach
Propionatinfusion überstieg dagegen der Wert für das Subkutanfett tendenziell die
Expression im Perirenalfett. Gleichzeitig zeigte sich, in diesem Versuch mit geringen
Tierzahlen, eine deutlichere Erhöhung der Leptin-mRNA im Perirenalfett als im
Subkutanfett. Unter Beachtung der tendenziellen mRNA-Veränderungen, gibt es
mehrere mögliche Erklärungsansätze.
Vorausgesetzt die Translation der GPR41-mRNA ist nicht verzögert, könnte das
etwas erhöhte Auftreten im Perirenalfett die Erklärung für die deutlichere Erhöhung
der Leptin-mRNA im Perirenalfett sein.
Diskussion 77
Zum anderen kann dies dafür sprechen, dass in den beiden Fettgeweben
unterschiedliche Mechanismen wirken, was gegen eine GPR41-vermittelte Erhöhung
der Leptin-mRNA in diesem Versuch spräche. Sowohl die Transkription, als auch die
Translation des Rezeptors können verzögert ablaufen, was sich durch
unterschiedliche mRNA-Mengen nach der 4,5-stündigen Infusion andeutet. Daten
über die Beeinflussung von GPR40-Familie durch spezifische Agonisten sind nicht
verfügbar. KIMURA et al. (2001) beschrieben für den GPR41, nach einer artifiziellen
Ischämie, eine Erhöhung der mRNA an H9c2-Zellen in vitro schon innerhalb von 2
Stunden, was als übliche Zeitspanne vom Zeitpunkt der Stimulation bis zur
messbaren mRNA-Erhöhung gewertet werden kann. Vergleichbare Daten über die
Zeitspanne, wann die GPR41-Expression in vivo messbar erhöht ist, sind bei
Monogastriern oder Wiederkäuern allerdings nicht bekannt.
Es bestehen deutliche Unterschiede zwischen den beiden Fettgeweben in der
Ansprechbarkeit der GPR41-mRNA Expression, der Effekt des GPR41 wird jedoch
direkt vermittelt. SOLIMAN et al. (2007) wiesen in einer bovinen
Primäradipozytenkultur eine direkte Stimulation von Leptin durch SCFA nach. Diese
Erhöhung ließ sich durch Pertussistoxin, das spezifisch die Funktion von Gi/0-
Proteinen aufhebt, unterdrücken. So vermuten die Autoren den Mechanismus eines
inhibitorischen G-proteingekoppelten Rezeptors. Die Nachweisbarkeit der
Rezeptorproteine oder der mRNA wurde in dieser Studie allerdings nicht untersucht.
Eine weitere Einflussgröße bildet in diesem Zusammenhang Insulin. XIONG et al.
(2004) konnten zeigen, dass Insulin die GPR41-Wirkung verstärkt. Schon
LEFEBRVRE et al. (1998) vermuten, dass die Insulinrezeptorbindung für
unterschiedliche Leptin-mRNA-Expression verantwortlich ist. Sie zeigten in humanen
Bioptaten des viszeralen und subkutanen Fetts, dass die Expression des
Insulinrezeptors im viszeralem Fett höher war, wiesen dort aber eine Splicevariante
des Insulinrezeptors nach. Mit fehlender Transkription von Exon 11 verfügt diese
Variante über eine verminderte Signaleffizienz. Diese verminderte Effizienz geben
die Autoren als mögliche Ursache der vermindeten Leptinexpression an. Die IRS-1-
Expression (Insulin Rezeptor Substrat) unterschied sich in dieser Studie nicht
zwischen den Geweben.
BENMANSOUR et al. (1991) untersuchten bereits die Bedeutung der Fettlokalisation
auf die Insulinwirkung in Fettzellen von Ebern. Danach war der antilipolytische Effekt
von Insulin in perirenalem Fett höher ausgeprägt als in Subkutanfett. Allerdings war
Diskussion 78
kein Unterschied der Insulinbindung nachzuweisen. Eine mögliche Erklärung bieten
die Untersuchungen von PERRINI et al. (2008). In Untersuchungen zu
unterschiedlicher Genexpression in humanen Adipozytenvorläuferzellkultur wiesen
die Autoren eine höhere Proteinexpression, und gleichzeitig eine höhere und
schnellere IRS-1-Phosphorylierung in perirenalen Zellen als in subkutanen Zellen
nach. Wenngleich diese Untersuchungen nicht direkt auf die eigenen
Untersuchungsergebnisse übertragbar sind, deuten diese an, dass auch Insulin eine
Bedeutung bei der GPR41-vermittelten Regulation der Leptinexpression spielen
könnte.
Die allein anhand der Genexpressionsstudien dargestellten Ergebnisse lassen keine
genauen Rückschlüsse auf Zusammenhänge zwischen GPR41- und
Leptinexpression zu. Zum einen wird eine enge Verknüpfung der GPR41-Menge mit
Propionat gezeigt. Andererseits erhärten die Ergebnisse aufgrund der
unterschiedlichen Expression des GPR41 in verschiedenen Fettgeweben die
Hypothese, dass eine unterschiedliche Ansprechbarkeit und damit auch Funktion als
Energiespeicher oder endokrines Organ in den Fettgewebsarten besteht (AHIMA et
al., 2006; PERRINI et al., 2008).
Zusammen mit den erhöhten Plasmaleptinwerten ist ein Zusammenhang zwischen
Rezeptorexpression und Leptinexpression wahrscheinlich. Auch wenn die Bedeutung
für eine physiologisch relevante Erhöhung des zirkulierenden Leptins durch
physiologische Propionatinfusionen noch unklar ist, bestehen deutliche Hinweise,
dass Propionat eine Rolle bei der hormonellen Steuerung in den Geweben, und auch
beim nutrient-partitioning beim Wiederkäuer zukommt.
Der Abfall der ungebundenen Fettsäuren durch Propionatbehandlung fällt zeitlich mit
den Peaks bei Glukose und Insulin zusammen. Auch der erneute Abfall am Ende fällt
entsprechend mit signifikant erhöhten Insulinwerten zusammen. Dieser Effekt stimmt
mit den Ergebnissen von DICOSTANZO et al. (1999) und LEE u. HOSSNER (2002)
überein. In den eigenen Versuchen verhielten sich die Plasma-LCFA bei den beiden
Versuchsgruppen unterschiedlich. Während bei der Kontrollgruppe die Werte
während der Infusion weitgehend unverändert blieben, sanken die LCFA in der
Propionatgruppe ab. SOLIMAN et al. (2007) unterstützten die These einer GPR41-
vermittelten Ansprechbarkeit der Leptinsynthese auf SCFA. In ihren Untersuchungen
in bovinen Adipozytenzellkulturen wurde die Leptinexpression durch Gabe von
Diskussion 79
Azetat, Propionat und Butyrat, sowie durch kombinierte Insulingabe, erhöht.
Demgegenüber hob die Gabe von LCFA diese Wirkung auf. Durch einen Einfluss der
LCFA auf die Wirkung der SCFA auf die Leptinexpression, wirken die LCFA indirekt
über den GPR41 auf die Leptinexpression (SOLIMAN et al., 2007). Möglicherweise
ist eine Umkehrung dieser Effekte, ein Abfall der LCFA durch die Propionatinfusion in
den eigenen Untersuchungen von Relevanz für die Leptinexpression. Dies spräche
dafür, dass auch die LCFA-Konzentration im Blutplasma von Bedeutung für die
Regulation der GPR-vermittelten Leptinsynthese in vivo ist.
Mögliche Bedeutung des GPR41 beim Wiederkäuer
Der GPR41 des Menschen wird synonym auch als FFA(3)R (engl: free fatty acid
receptor 3) (Genbank NM_005304) bezeichnet, analog der Nomenklatur, die für die
humanen G-proteingekoppelten Rezeptoren nach NILSSON et al. (2003) und
SALEHI et al. (2005) vorgeschlagen wurde. Danach wird der G-proteingekoppelte
Rezeptor 40 (GPR40) als FFA(1)R bezeichnet, und der GPR43 als FFA(2)R.
COVINGTON et al. (2006) verwenden jedoch die Bezeichnungen GPR40-43.
Bei Nagetieren ist die Aktivierung der FFAR weitgehend geklärt, und ihre Funktion,
insbesondere die Bedeutung des GPR41 für die Regulation von Leptin teilweise
bekannt. Inwieweit dies von praktischer bzw. physiologischer Bedeutung ist, muss
noch weiter untersucht werden. Bei den Wiederkäuern sind weitere Untersuchungen
über die Zusammenhänge von GPR-vermittelter Propionatwirkung auf die
Leptinexpression notwendig. Allerdings bestehen starke Hinweise für derartige
Zusamenhänge. In dieser Arbeit wird die Bezeichnung der Rezeptoren nach ihrer
Klassifikation als G-proteingekoppelte Rezeptoren beibehalten (BONINI et al., 1997;
SAWZDARGO et al., 1997). Ob der GPR41 bei der Ziege und möglicherweise
anderen Ruminantia von Bedeutung als FFAR ist, wie bei Monogastriern, ist bisher
noch unklar. Die Ergebnisse der Expressionsuntersuchung erhärten jedoch die
Hypothese, dass der GPR41 eine Rolle als „nutrient-sensing-receptor“, wie es von
KOTARSKY et al. (2003) für diese Rezeptorsubfamilie vorgeschlagen wurde, spielt.
Weitere Untersuchungen, insbesondere über die Wirkung bei physiologischen
Propionatkonzentrationen, die Variationen unterliegen, mit verschiedenen SCFAs
und über einen längeren Zeitraum sind dabei interessant. Der Energiemetabolismus
ist vollständig von der Pansenfermentation abhängig. Der GPR41 und insbesondere
der GPR43, welcher dieselben SCFA bindet, werden von verschiedenen Zellen des
Diskussion 80
Immunsystems exprimiert und aktivieren diese. Möglicherweise besteht hier ein
Bindeglied zwischen Futterration und Fermentationsprodukten auf der einen Seite,
sowie Leptinsekretion, Insulinresistenz und Immunsystem, auf der anderen Seite (LE
POUL et al., 2003; GOFF, 2006).
Nachweis der mRNA der langen Form des Leptinrezeptors (Ob-Rb) bei der Ziege
Während nach dem bisherigen Kenntnisstand die aktiven Rezeptorformen a und e
wichtig bei der Hormonbindung und dem –transport sind, ist die lange Form wichtig
für die Vermittlung der biologischen Wirkung des Leptins. Nur bei der langen Form
kommen die Strukturen vor, die für die Aktivierung des JAK/STAT-Mechanismus
benötigt werden (MAČAJOVA et al., 2004). Durch ihre Expression in einer Vielzahl
von Geweben ist diese Rezeptorform für die integrative Leptinwirkung in der
Regulation von Energiestoffwechsel und Endokrinium von großer Bedeutung.
Die verwendeten Primer zur Teilsequenzierung des caprinen ob-Rb sind von LIN et
al. (2000) entnommen, und sind von der Sequenz des langen Rezeptors des
Schweines abgeleitet (Genbank Acc. Number: AF369908). Damit wurde erstmals ein
Abschnitt der cDNA der langen Form des Leptinrezeptors bei der Ziege sequenziert
(AY846770).
Der Vergleich der mit diesen Primern ermittelten partiellen cDNA aus Geweben der
Ziege mit bekannten Basensequenzen zeigt eine hohe Übereinstimmung des cDNA-
Abschnittes der caprinen Sequenz mit der langen Form des Leptinrezeptors von
Schwein (83%), Rind und Schaf (94% und 97%).
Die enge Verwandtschaft der Isoformen zwischen verschiedenen Spezies zeigten
BARTHA et al. (2005). Wenngleich BARTHA et al. (2005) den ob-Rb der Ziege nicht
untersuchten, entsprechen die Größenordnungen der Basenübereinstimmungen
denen der eigenen Untersuchungen. Abweichungen können auch darin begründet
sein, dass BARTHA et al. (2005) die gesamten Gene verglichen, während die
eigenen Untersuchungen sich auf das sequenzierte Segment beschränken.
Gewebeverteilung und mögliche Beeinflussung der Ob-Rb-mRNA
Der Leptinrezeptor wurde in einer Vielzahl von Geweben nachgewiesen (CHILLIARD
et al., 2001; CHELIKANI et al., 2003a; ZABEAU et al., 2003, BARTHA et al., 2005).
In allen Geweben, die im Rahmen dieses Versuches untersucht wurden, konnte
Diskussion 81
seine Expression nachgewiesen werden, und somit die bei Monogastriern und
Wiederkäuern etablierten Ergebnisse bestätigt werden.
Die differenzierte Betrachtung der eigenen Ergebnisse zeigt, dass dieser Rezeptor
im Subkutanfett tendenziell mehr exprimiert ist als im Perirenalfett (p ≤ 0,01). Vor
allem ist jedoch interessant, dass erstmals eine Beeinflussung der ob-Rb-RNA durch
Propionatinfusion, im Perirenalfett, gezeigt wurde. Diese fällt durch die Behandlung
ab (p ≤ 0,05). Im Subkutanfett, sowie im Muskel und in der Leber besteht keine
signifikante Verringerung, wobei dies möglicherweise auf die geringe Tierzahl
zurückzuführen ist, da in den drei Geweben eine numerische Reduktion verzeichnet
wurde.
Während Untersuchungen zur Rezeptorverteilung, Rezeptoraktivierung und
Signaltransduktion vorhanden sind, gibt es nur wenige Daten über die Regulation der
Rezeptorexpression. Bereits GAVRILOVA et al. (1997) zeigten bei Mäusen, dass die
Leptinaktivität über die Regulation der Expression des löslichen Rezeptors (ob-Re)
gesteuert werden kann. YANG et al. (2004) bestätigten dies in humaner embryonaler
Nierenzellkultur. Dieses Bindungsprotein bindet freies Leptin, und vermindert
dadurch die Bindung von Leptin an den ob-Rb, es beeinflusst jedoch nicht die
Affinität des freien Leptins an diesen Rezeptor.
YONEKURA et al. (2003) beschreiben, dass die ob-Ra-Expression in boviner
Hypophysenzellkultur durch Butyrat gesenkt wird. Dieser Rezeptor aktiviert nicht den
JAK/STAT-Mechanismus. Seine Bedeutung im Hypothalamus ist wie beim ob-Re
ebenfalls der Transport sowie die Translokation des Leptin über die Blut-Hirn-
Schranke (MAČAJOVA et al., 2004). Somit ist bisher nachgewiesen, dass der
Transport des Leptins über Bindungsproteine durch SCFA reguliert wird. Über die
Regulation des aktiven ob-Rb Rezeptors und seiner Bindungskapazität ist dagegen
wenig bekannt. In den dargelegten Ergebnissen konnte an Ziegen die Regulation der
ob-Rb-RNA im Fettgewebe in vivo durch Propionat gezeigt werden. Eine
Verminderung der Leptinrezeptor-mRNA durch Insulin und Dexamethason
beschreiben RAMSAY u. RICHARDS (2004) in porziner Adipozytenzellkultur. Diese
Untersuchungen bekräftigen die eigenen Ergebnisse.
Grundsätzlich besteht der Verdacht, dass Insulin auch die Leptinrezeptorexpression
in vivo vermindert. Weitere Untersuchungen mit der ausschließlichen Infusion von
Insulin, können diese Hypothese abklären. Zudem zeigt dies, dass in der Regulation
Diskussion 82
des Leptinrezeptors grundsätzlich dieselben Verhältnisse zu finden sind, wie beim
Monogastrier.
Ein weiterer Punkt, der von Interesse ist, ist die Rolle von Leptin im Sinne einer
Autoregulation, da das weiße Fettgewebe zudem Hauptsyntheseort des Hormones,
und damit des Liganden des ob-Rb ist (WANG et al., 1999a).
4.3 Veränderungen von Leptin und Insulin, sowie Einflüsse der
Galaktopoese bei der Ziege peri partum
Vergleich der Insulinsensitivität zwischen Hochträchtigkeit und Frühlaktation
Um den Geburtszeitraum entsteht ein Ungleichgewicht zwischen Energieaufnahme
und Energiebedarf bei Rindern. Verschiedene Autoren führen dies darauf zurück,
dass die Milchsekretion zu einem massiven Anstieg des Energiebedarfs führt, bei
gleichzeitig unzureichendem Anstieg der Nahrungsaufnahme. Das hieraus
resultierende Energiedefizit führt dann zu einem Abfall von Leptin mRNA und -protein
(BLOCK et al., 2001). Eine große Bedeutung wurde dabei der Regulation durch
Insulin zugesprochen (BLOCK et al., 2003; LEURY et al., 2003).
Laktation und Milchleistung hängen mit einem niedrigen Insulinspiegel zusammen.
HAMMON et al. (2007) untersuchten inwieweit bei Kühen die Insulinkonzentration
und glukoseabhängige Insulinantwort von der Milchleistung, die in hohem Maße
genetisch determiniert ist, abhängig ist. Dabei zeigten sie, dass die Laktation, und
vor allem eine hohe Milchleistung, den Insulinspiegel und die glukoseabhängige
Insulinsekretion bestimmen.
CHELIKANI et al. (2003b) zeigten eine Erhöhung von Plasmaleptin durch
Glukoseinfusion bei spätlaktierenden Kühen, jedoch keinen Effekt bei
frühlaktierenden. Zudem zeigten sie einen Effekt durch eine Lipidlösung bei
spätlaktierenden Kühen, ohne dass sich der Plasmainsulingehalt verändert.
Die Blutglukosekonzentration wird in erster Linie von der Glukoseaufnahme in die
Skelettmuskulatur bestimmt. Diese wird durch den insulinabhägigen GLUT4
gesteuert (LOEFFLER, 1998b). Zur Untersuchung der Veränderungen in der
insulingesteuerten Glukoseverwertung der Körperperipherie wurden
Glukoseinfusionsstudien durchgeführt. Dabei war insbesondere der Vergleich der
Insulinwirkung in Trächtigkeit und Laktation von Interesse.
Diskussion 83
LOMAX et al. (1979) und SARTIN et al. (1985) zeigten bei Milchkühen, dass in der
Laktation sowohl die basale Insulinkonzentration geringer ist, als auch eine geringere
Insulinantwort auf einen Glukosestimulus erfolgte. In den eigenen Untersuchungen
unterschieden sich die Ausgangskonzentrationen von Insulin bei hochträchtigen
Ziegen und frühlaktierenden nicht. Gleichzeitig ist die Glukoseinfusionsrate bei den
Laktierenden höher und die GIR wie auch die berechnete Gewebesensitivität für
Insulin bei trächtigen Tieren niedriger. LOMAX et al. (1979) erklären dies damit, dass
trächtige Tiere den Glukosestimulus durch eine Erhöhung der Insulinkonzentration
ausgleicht, während in der Laktation die hepatische Glukoneogenese zum Ausgleich
gesenkt wird. Auf der Basis der Rechenparameter der Clamps ist nicht direkt auf die
Ansprechbarkeit der peripheren Körpergewebe für Insulin per se rückzuschließen.
Demgegenüber wurde allerdings bei Fleischrindern eine erhöhte Insulinantwort bei
laktierenden Tieren gezeigt (SANO et al., 1993a).
Der Rechenparameter der Insulinsensitivität war bei den trächtigen Tieren geringer,
was für eine verminderte Aufnahme von Glukose spricht. Dies zeigt sich an den
erhöhten Insulinwerten und den erhöhten Glukosewerten im hyperinsulinämischen
Clamp. Die erhöhten Quotienten von Glukose/Glukoseinfusionsrate bei den
trächtigen Ziegen verdeutlichen diese Beobachtung. Dies bedeutet, dass die
infundierte Glukose langsamer in die Zelle aufgenommen wird. Bestätigt wird dies
durch die weiteren Parameter, wie der erhöhten Clearancerate für Insulin (MCR) bei
den laktierenden Ziegen, und der höheren SDR der trächtigen Ziegen.
Auch in der Arbeit von HEINTGES (2003) zur Bedeutung von Leptin bei
Wiederkäuern untersuchte die Autorin die Wirkungen exogener Leptingabe und
aktiver Immunisierung gegen Leptin bei trächtigen und laktierenden Ziegen mit
hyperglykämischen und euglykämisch/hyperinsulinämischen Clamps. Im Gegensatz
zu den eigenen Ergebnissen, in denen die endogene Sekretionsrate an Insulin (SDR)
bei den laktierenden Ziegen erhöht war, unterschied sie sich bei HEINTGES (2003)
nicht zwischen laktierenden und trächtigen Tieren. Grund dafür kann die
unterschiedliche statistische Methode der Datenanalyse sein. Während HEINTGES
(2003) den t-Test verwandte, wurde in dieser Arbeit die Varianzanalyse nach dem
allgemeinen linearen Modell angewandt. Die Ergebnisse stimmen jedoch ansonsten
mit der vorangegangenen Arbeit überein und können deren Aussage noch erhärten.
DEBRAS et al. (1989) zeigten allerdings bei laktierende Ziegen erhöhte
Insulinspiegel. Insbesondere in der Frühlaktation war die MCR erhöht. Allerdings
Diskussion 84
verglichen sie die Werte mit trocken stehenden Ziegen und nicht mit trächtigen
Tieren. Die basale Blutglukosekonzentration ist bei laktierenden Ziegen gegenüber
trockenstehenden Ziegen dreifach erhöht. Gleichzeitig ist auch die insulinvermittelte
Glukoseverwertung, die in erster Linie im Muskelgewebe stattfindet, erhöht.
Die physiologische Insulinresistenz in der Trächtigkeit sichert die Versorgung des
Fetus, indem genügend Glukose zur Aufnahme über die Plazenta bereit steht. Um
die Versorgung der Milchdrüse zu gewährleisten, ist der gesamte
Glukosestoffwechsel erhöht, es muss jedoch die Glukoseaufnahme unabhängig von
der Blutglukosekonzentration stattfinden. Zudem scheint diese insulinunabhängig zu
sein (DEBRAS et al., 1989; ZHAO u. KEATING, 2007), da somit eine konstante
Versorgung auch in der Laktation gewährleistet werden kann.
Verhalten der Serumleptinkonzentrationen um den Geburtszeitpunkt
Das Verhalten der Plasmaleptinwerte um den Geburtszeitpunkt unterscheidet sich
zwischen den Wiederkäuerspezies. Bei Ziegen werden die Leptinwerte durch die
Laktation stark vermindert. Der Abfall beginnt noch im letzten Drittel der Trächtigkeit,
und erreicht um den Geburtszeitpunkt bereits den niedrigen Wert (zur Übersicht:
CHILLIARD et al., 2005; BONNET et al., 2005). Dies erklärt, dass im eigenen
Versuch keine Unterschiede der Leptinwerte zwischen den trächtigen und
laktierenden Ziegen bestanden, da die Leptinwerte bei Ziegen um den
Geburtszeitraum keinen gravierenden Veränderungen unterliegen. Erstmals wurde
bei trächtigen Ziegen jedoch eine Veränderlichkeit der Serumleptinkonzentration
durch Glukose und Insulin nachgewiesen. Danach erhöht der euglykämische Clamp
die Leptinwerte, während im hyperglykämischen Clamp Leptin abfällt. WANG et al.
(1998) zeigten bei Ratten, dass Leptin nicht durch Glukose per se, sondern
zusammen mit einem Insulinclamp erhöht werden kann. LEURY et al. (2003)
erreichten bei hochträchtigen und frühlaktierenden Kühen ebenfalls durch einen
euglykämisch-hyperinsulinämischen Clamp einen Anstieg der mRNA und
Proteinmenge von Leptin. Wie in der vorliegenden Studie gezeigt wurde, sind bei den
trächtigen Ziegen die provozierten Insulinwerte höher als bei laktierenden Ziegen.
Dies könnte einen Einfluss auf die Leptinsekretion haben. Allgemein gibt es mehr
Hinweise dafür, dass keine Beeinflussung durch das Insulin besteht (KAUTER et al.,
2000; GABAI et al., 2002; SOLIMAN et al., 2002), und wahrscheinlich ist der Einfluss
vom hormonellen Status abhängig (BLOCK et al., 2003, LEURY et al., 2003).
Diskussion 85
Insbesondere in der Trächtigkeit, ist die Erhöhung der Leptin-mRNA
insulinunabhängig (CHILLIARD et al., 2005; LIEFERS et al., 2005). Eine mögliche
Erklärung für die Veränderungen könnten in der Regulation des Bindungsproteins
liegen. Abschließende Erklärungsansätze bestehen jedoch zur Zeit noch nicht.
Regulation der LCFA
Die Zusammenhänge bei der Regulation der Fettsäurekonzentration im Blut sind
sehr komplex. Die Steuerung erfolgt über die Regulation der Triacylglyzeridsynthese,
der Fettsäuresynthese und der ß-Oxidation.
Um den Geburtszeitraum zeigten GABAI et al. (2002) bei Kühen, dass die freien
LCFA-Werte um die Spätträchtigkeit und Frühlaktation gegenüber der Spätlaktation
erhöht sind. Diese konnten nicht durch Glukose- oder Aminosäureinfusion beeinflusst
werden. Nach BLOCK et al. (2001) erhöhen sich die LCFA-Werte im Übergang vom
spätträchtigen ins frühlaktierende Stadium. Bei den frühlaktierenden Kühen können
diese Werte durch Insulininfusion gesenkt werden.
Nach SHIMABUKURO et al. (1997) senkt Leptin freie Fettsäuren bei Ratten durch
Erhöhung der ß-Oxidation. Dies wäre ein möglicher Erklärungsansatz für den Anstieg
der Fettsäuren bei BLOCK et al. (2001). Dieser steht allerdings im Widerspruch zu
den unveränderten Fettsäurekonzentrationen nach GABAI et al. (2002) um den
Geburtszeitraum. Sie bieten aber eine mögliche Erklärung des Abfalls der LCFA in
der Spätlaktation, wenn sich bei Milchkühen die Leptinwerte erhöhen.
Insulin senkt die Konzentration an LCFA durch Erhöhung der Fettsäureveresterung
(CUNNINGHAM, 2002). Bei FUHRMANN et al. (1989) besteht bei weiblichen
Rindern ein Unterschied zwischen laktierenden Kühen und Färsen. Bei Kühen sind
die LCFA-Ausgangswerte höher als bei den Färsen, und fallen dann durch
Glukoseinfusion sehr stark ab. Bei den Färsen sinken die LCFA-Konzentrationen nur
gering. Die Plasmainsulinkonzentration bei den Kühen ist niedriger als bei den
Färsen. Vergleichbare Verhältnisse sind auch bei Schafen zu finden (REGNAULT et
al., 2004). REGNAULT et al. (2004) führen dies auf die verminderte
Insulinfreisetzung in der Laktation zurück.
Das Dargelegte zeigt, dass die LCFA durch Glukose gesenkt wird. Während bei
trächtigen Tieren dies auf einen Anstieg von Insulin zurückzuführen ist, ist dieser bei
den laktierenden weniger stark ausgeprägt. Dabei ist der Abfall bei den laktierenden
Tieren noch deutlicher ausgeprägt. Somit scheint ein weiterer Zusammenhang der
Diskussion 86
Regulation zu bestehen, als jener über die Erhöhung von Insulin. Die im eigenen
Versuch bei den laktierenden Ziegen erhöhten Fettsäurewerte zu Beginn des
euglykämisch-hyperinsulinämischen Clamps, sowie der ausgeprägtere Abfall durch
die Behandlung, könnte auf eine höhere Insulinsensitivität zurückzuführen sein. Dem
widersprechen allerdings die Erkenntnisse nach LOMAX et al. (1979), der bei
Milchkühen eine verminderte Gewebesensitivität nachweisen konnte. REGNAULT et
al. (2004) verweisen auf unbekannte Faktoren als mögliche Einflussfaktoren.
Möglicherweise spielt hier Leptin eine Rolle, das in den beiden Clamps
unterschiedlich reguliert wurde.
Insulinsensitivität, Laktosegehalt der Milch und Milchleistung
Bei laktierenden Tieren ist der Glukoseumsatz höher als bei trächtigen Tieren. Nicht
bilanziert ist allerdings die renale Clearance, sowie die Ausscheidung mit der Milch.
Es ist nicht davon auszugehen, dass sich die Nierenschwelle bei laktierenden Tieren
senkt, und damit mehr Glukose mit dem Urin ausgeschieden wird. DEBRAS et al.
(1989) zeigten, dass die Plasmaglukosekonzentrationen zu verschiedenen
Laktationszeitpunkten nicht von jenen bei trocken stehenden Ziegen abweichen. In
den Clampstudien ist Insulin zwar von Bedeutung für den Erhalt der Laktation, es
spielt aber keine Rolle bei der Glukoseaufnahme, der initialen Reaktion der
Galaktopoese.
Die physiologischen Laktosegehalte in der Ziegenmilch werden von
unterschiedlichen Autoren mit 4,10 % bis 4,30 % angegeben (BOSTEDT u. DEDIE,
1996; GÜRTLER u. SCHWEIGERT, 2000). Demgegenüber stehen die mit
Infrarotmessungen von BEQUETTE et al. (2001), die mit 4,71 % bis 4,76 % unseren
Werten vergleichbar sind. Eine mögliche Erklärung der Abweichung der ermittelten
Ergebnisse von den Referenzwerten liegt in der angewandten Meßmethode. Die
Messung erfolgte mittels Infrarotmessung. In Ermangelung standardisierter
Ziegenmilch erfolgte die Kalibrierung in unserem Versuch mit Kuhmilch. Aufgrund
unterschiedlicher Fett-, Protein- und Elektrolytgehalte, sowie abweichender
Zusammensetzung der Bestandteile in der Milch, ist eine Abweichung der Werte
möglich. Der Vergleich des Zuckergehaltes in der Morgen- und Abendmilch, zeigten,
wie zu erwarten war, keine Abweichungen. Dieser Versuch kann somit die
Hypothese bestätigen, dass der Laktosegehalt in Milch nur geringen Abweichungen
unterliegt.
Diskussion 87
Laktose wird durch die Laktosesynthase in der Alveolarepithelzelle der Milchdrüse
aus Glukose und Galaktose gebildet. Dabei kommt der Glukose die bestimmende
Rolle in der Milchsynthese zu. Als Substrat zur Bildung von ATP und NADPH ist sie
wichtiger Energieträger für den Stoffwechsel der Alveolarepithelzelle. 60-70 % der
Glukose gehen jedoch, über die Bildung von Glukose-6-Phosphat und UDP-
Galaktose, als direkter Baustein in die Laktosesynthese beim Rind ein (ACCORSI et
al., 2005). Aufgrund der osmotischen Wirksamkeit von Laktose erfolgt die
Wassersekretion in das Lumen der Milchdrüse. Sie bildet den bestimmenden Faktor
der Milchmenge, und dadurch unterliegt die Laktosekonzentration der Milch nur
geringen Schwankungen. Die sezernierte Laktosemenge, resp. Glukosemenge, und
Milchmenge sind proportional (zur Übersicht: GÜRTLER u. SCHWEIGERT, 2000;
HOCQUETTE u. ABE, 2000).
Nach NIELSEN et al. (1993 u. 2001) unterliegt die Glukoseaufnahme, in
Abhängigkeit vom Zellmetabolismus in der kaprinen Milchdrüse, Schwankungen, die
jedoch unabhängig von der arteriellen Glukosekonzentration bzw. vom
Glukoseangebot und dem Insulinspiegel sind. Daraus schließen sie auf aktive
Translokation mittels eines insulinunabängigen Transporters, wie z.B. dem GLUT1.
Weitere Arbeiten bestätigen dies. BEQUETTE et al. (2001) untersuchten den
Einfluss von Insulin auf den Blutfluss in der Tarsal- und Eutervene, und die
Verteilung der Glukose. Nach einer fünftägigen Aminosäureninfusion wurde ein
zweieinhalbtägiger euglykämisch-hyperinsulinämischer Clamp durchgeführt, wobei
die Infusion beibehalten wurde. Unter diesen Bedingungen ergab die
Blutflussmessung eine Erhöhung der Euterdurchblutung, bei unveränderter
Durchblutung der Hintergliedmaße. Gleichzeitig wurde eine erhöhte
Glukoseaufnahme im Euter, und eine Zunahme der Milchmenge nachgewiesen.
Ebenso konnten RIGOUT et al. (2002) eine Erhöhung der Glukoseaufnahme und
Laktosesynthese zeigen. Auch in diesem Fall war dies mit einer erhöhten
Euterdurchblutung verbunden.
Untersuchungen von KOMATSU et al. (2005) zur Expression von GLUT1- und
GLUT4-mRNA in der Milchdrüse, Skelettmuskulatur und intestinalem Fettgewebe
bestätigen dies. So wurde im Drüsengewebe bei laktierenden Kühen die Expression
von GLUT1 nachgewiesen, wie auch im Fettgewebe von trocken stehenden und
spätlaktierenden Kühen. In diesem Gewebe wurde der GLUT1 in der Phase der
Hochlaktation, sowie in der Milchdrüse bei trocken stehenden Kühen, nicht
Diskussion 88
exprimiert. Dagegen konnte der GLUT4 in der Milchdrüse auch bei laktierenden
Kühen nicht nachgewiesen werden, und im Muskel- und Fettgewebe scheint die
GLUT4-Expression keiner Beeinflussung durch Laktation und Trockenstellen zu
unterliegen. Daraus sei zu schließen, dass dem GLUT4 keine Bedeutung bei der
Entwicklung der peripartalen Insulinresistenz beikommt.
Als weitere Glukosetransporter wurden in diversen Geweben der GLUT8, sowie
verschiedene Natrium-Glukose-Cotransporter (SGLT) identifiziert. Aus der Gruppe
der SGLTs konnten der SGLT1 und SGLT2 in bovinem Milchdrüsengewebe
nachgewiesen werden, wobei der SGLT nur eine geringe Affinität zu Glukose
aufweist. Bei allen drei Transportern erhöhen sich die Expressionsraten in der späten
Trächtigkeit und Frühlaktation um das vier- (SGLT1) bis zehnfache (SGLT1 und
GLUT8), was für eine mögliche Bedeutung dieser Transporter beim Nutrient-
partitioning im peripartalen Zeitraum spricht (ZHAO et al., 2004; ZHAO et al. 2005;
ZHAO u. KEATING, 2007).
Der GLUT8 ist zu Glukose hoch affin, und wird, ähnlich dem GLUT1, über Regulation
der Genexpression gesteuert. Da seine Wirkung insulinunabhängig vermittelt wird,
steht dies im Einklang mit dem Modell der insulinunabhängigen Glukoseaufnahme in
der Milchdrüse. Dagegen ist über den Wirkungsmechanismus der SGLTs im Euter
bisher nur wenig bekannt. Zusammenfassend bestehen deutliche Hinweise, dass die
Milchmenge in einem Zusammenhang mit der Blutglukosekonzentration steht, und
somit eine Beeinflussung der Glukoseinfusionsstudien nicht ausgeschlossen werden
kann. Als Mechanismen sind allerdings andere als Insulinabhängige wahrscheinlich.
Der Abgang von Glukose mit der Milch kann über die Milchmenge und die
Laktosekonzentration (4,84 %) annäherungsweise berechnet werden. Die
Milchmenge des Versuchstages betrug im Mittel 3070 g, die enthaltene Laktose
betrug damit ungefähr 149 g oder 0,43 mol Laktose (molare Masse: 342,3 g/mol).
Die Bildung von einem mol Laktose sind zwei mol Glukose nötig. Entsprechend
beträgt die Menge Glukose (molare Masse: 180,2 g/mol), die in die Milch
übergegangen ist 860 mmol. Wie bereits erwähnt, gehen 60-70% der in die
Milchdrüse aufgenommenen Glukose als Laktose in die Milch über (ACCORSI et al.,
2005), während der Rest der Energiegewinnung dient. Somit beträgt die, auf
Grundlage der Milchleistung berechnete Glukosemenge, die zur Milchbildung
benötigt wurde, ca. 1300 mmol pro 24h.
Diskussion 89
Um die Menge der in den Clamps infundierten Glukose abzuschätzen, kann die
Glukoseinfusionsrate und der Zeitraum (60 min) der Plateauphase herangezogen
werden. Danach wurden in der Plateauphase bei laktierenden Ziegen
durchschnittlich 77,4 mmol im hyperglykämischen Clamp und 48,2 mmol im
euglykämisch/ hyperinsulinämischen Clamp infundiert. Demgegenüber erhielten die
trächtigen Tiere 40,6 mmol (hyperglykämischer Clamp) und 40,0 mmol
(euglykämisch/ hyperinsulinämischen Clamp) Glukose.
Zur Quantifizierung applizierter Substanzen kann die area under the curve (AUC)
berechnet werden. Sie bildet das Integral einer Verlaufskurve von
Blutkonzentrationen (zur Übersicht: PIDGEN, 1992). Mit der Quantifizierung über die
GIR kann dies allerdings direkt abgeschätzt werden. Der Vergleich der infundierten
Glukose mit dem geschätzten Wert des Milcheffluxes macht deutlich, dass die
Menge Glukose, die in die Milch übergeht, bis zum deißigfachen der in diesem
Versuchsaufbau infundiblen Menge ist. Eine überschlagsmäßige Beurteilung über
die Quantifizierung in der Plateauphase kann dadurch ausreichend genau sein.
Der Faktor weist darauf hin, dass die Clamps die Milchmenge nur marginal
beeinflussen könnten, weshalb auch daraufhin ein Einfluss der Glukoseapplikation
auf Laktose- und Milchmenge unwahrscheinlich erscheint.
Die Laktationskurve bei Ziegen erreicht, in Abhängigkeit von der Ernährung, um den
29. Laktationstag (22. bis 44 Tag p.p.) ihren Höhepunkt (MIN et al., 2005). Der
Anstieg in der Milchleistung im eigenen Versuch entspricht dem physiologischen
Laktationsverlauf.
Die Milcheinbuße am Folgetag des Versuches ist wahrscheinlich auf den
karenzbedingten Energiemangel, und die Behandlung der Tiere am Vortag
zurückzuführen. Der Einbruch betraf in besonderem Maße Tiere mit hoher
Milchleistung. Da die Milchmenge in erster Linie vom Nahrungsangebot abhängt,
führt ein Nahrungsmangel zu einer geringeren Milchausbeute. Dies passt zu der
Beobachtung von SORENSEN et al (2002), wonach mit zunehmender Milchleistung
bis zum Tag 18, die Laktationsleistung nachmittags ansteigt. Was die Rolle des
Laktoseeffluxes angeht, so ist die Bildung von Laktose aus Glukose der
bestimmende Faktor der Milchsynthese, und steuert somit die Milchleistung, bzw. die
Milchmenge. Umgekehrt bedeutet dies, dass Glukoseefflux mit der Milch mit einer
Erhöhung der Milchleistung einhergeht. Die Tagesmilchmenge war unverändert, und
Diskussion 90
somit ist davon auszugehen, dass der Clamp keinen Einfluss auf den Laktoseeflux
hat.
Diese Versuche stehen mit der Hypothese einer insulinunabhängigen
Laktosesynthese in Einklang, und es konnten Zusammenhänge zwischen
Plasmaleptingehalt und Insulinresistenz um den Geburtszeitraum bei der Ziege
gezeigt werden. Zudem wurde eine veränderte Ansprechbarkeit für die Regulation
der Leptinsekretion peri partum gezeigt.
Mit der Entwicklung einer quantifizierenden PCR zum Nachweis der mRNA von
Leptin, Ob-Rb und putativem GPR41 konnte ein grundsätzlicher Zusammenhang
zwischen Propionatinfusion, der mRNA des propionatabhängigen putativen GPR41
und der Leptinsynthese bei Ziegen nachgewiesen werden. Wenngleich ein Einfluss
der G-proteingekoppelten Rezeptoren 40 und 43, und/oder eine gleichzeitige
Insulinwirkung nicht auszuschließen ist, führt dies zu weiteren Erkenntnissen einer
direkten peripheren Regulation der Leptinsynthese bei Wiederkäuern. Die genauere
Abgrenzung und Unterscheidung der Wirkungen, die parallel verlaufen, bietet
Ansatzpunkte für zusätzliche Studien.
Die Entwicklung verschiedener quantifizierender RT-PCR-Assays bietet das
Werkzeug für die Untersuchung der Expression wichtiger Faktoren, die die periphere
Regulation des Leptinsytems beeinflussen.
Die gewonnen Erkenntnisse untermauern den Bedarf für weiterführende
Untersuchungen. Von Interesse ist insbesondere die Untersuchung der
Mechanismen in der Zellkultur. Interessant ist zudem, wo die Leptinsekretion und
Regulation der Rezeptoren lokalisiert ist, und welche Gewebe, insbesondere welche
Fettdepots, bei der Regulation im Vordergrund stehen.
Durch gleichzeitige Untersuchung von Leptin in einem ELISA (SAUERWEIN et al.,
2004) konnte gezeigt werden, dass ein komplexes Zusammenspiel von
Leptinexpression und –synthese, sowie Expression der mRNA der aktiven Form des
Leptinrezeptors (ob-Rb) und des im Rahmen der vorliegenden Studie identifizierten
putativen GPR41 bei der Ziege, besteht, welches an der Steuerung dieser
Regulationsmechanismen beteiligt ist. Zudem wurde die Hypothese bestärkt, wonach
Leptin eine herausragende Bedeutung bei der Steuerung des Energiestoffwechsels,
des Nutrient-partitioning, beim Wiederkäuer zukommt.
Zusammenfassung 91
5 Zusammenfassung
Christoph Seybold: Untersuchungen zur energetischen Regulation des
Leptinsystems bei der Ziege
Von Leptin ist bekannt, dass es hormonell und durch die Nahrungszufuhr reguliert
wird. Bei Menschen und Nagetieren konnte nachgewiesen werden, dass kurzkettige
Fettsäuren (SCFA) die Leptinexpression verändern. Im Wiederkäuermetabolismus,
der von SCFA als Substrat für die hepatische Glukoneogenese abhängt, sind diese
Stoffwechselwege möglicherweise von großer Bedeutung. In dieser Studie sollte
untersucht werden, ob Propionat bei Ziegen die Leptinsynthese beeinflusst.
In einem weiteren Versuch sollte der Zusammenhang von Leptin und Insulin weiter
untersucht werden. Die Regulation dieser beiden Hormone ist eng miteinander
verbunden. Bei Monogastriern, wie auch bei Wiederkäuern, konnte gezeigt werden,
dass Leptin einen Einfluss auf die Insulinsekretion und –sensitivität hat.
Insbesondere im Wechsel von der Spätträchtigkeit zum Beginn der Laktation ändert
sich das Hormonmuster und die Insulinsenstivität. Mit Hilfe von hyperglykämischen
Clamps und euglykämisch-hyperinsulinämischen Clamps bei Milchziegen, sollte
dieser Wechsel weiter charakterisiert werden.
Im ersten Teil wurden 9 kastrierte Böcke mit einer Propionatlösung oder einer NaCl-
lösung äquimolarer Konzentration intravenös infundiert. Nach einer einstündigen
Vorperiode erfolgte die Infusion für bis zu 260 Minuten. In regelmäßigen Abständen
wurden Blutproben entnommen und die Glukosekonzentration gemessen. Als
weitere Parameter wurden Leptin, Insulin und langkettige Fettsäuren (LCFA)
untersucht. Mit Ende der Infusion wurden die Tiere euthanasiert, und Gewebeproben
aus M. semitendinosus, Leber, Subkutanfett und Perirenalfett entnommen .
In den Gewebeproben wurde die Genexpression untersucht. Dazu wurden real-time
RT-PCR-Assays für Leptin, Leptinrezeptor und für den putativen G-
proteingekoppelten Rezeptor (GPR) 41, sowie für 18S rRNA als internen Standard,
entwickelt und validiert.
Die Untersuchung ergab, dass die mRNA von Leptin und von Leptinrezeptor
tendenziell höher im Subkutanfett als im Perirenalfett exprimiert wird. Die Leptin-
mRNA stieg im Perirenalfett tendenziell um das 3,2-fache während der
Propionatinfusion. Die mRNA des Leptinrezeptors fiel signifikant um das 4,2-fache
Zusammenfassung 92
ab. Dies weist auf die bisher nur wenig untersuchte mögliche Bedeutung des
Leptinrezeptors für die periphere Leptinregulation hin. Es wurde eine höhere GPR41-
mRNA-Menge im Perirenalfett nachgewiesen. Durch den Nachweis einer
signifikanten Erhöhung im Subkutanfett um das 12-fache, konnte gezeigt werden,
dass der GPR41 bei Ziegen grundsätzlich im Zusammenhang mit einer Erhöhung
von Leptin nach einer Propionatinfusion steht. In den Serumproben konnten die
Konzentrationsverläufe der Hormone, Glukose und LCFA charakterisiert werden. Die
Erhöhung der Leptin-mRNA wurde durch einen Anstieg von Leptin in den Blutproben
bestätigt. Die Serumwerte von Insulin und Glukose unterschieden sich zwischen den
beiden Gruppen, wobei in der Behandlungsgruppe die Werte höher lagen. Die LCFA-
Werte unterschieden sich ebenfalls. Hier fielen allerdings die Werte in der
Propionatgruppe initial ab, und errreichten zum Ende wieder dasselbe Niveau.
Im zweiten Teil wurden an 6 Milchziegen ca. 25 Tage a.p. und 9 Tage p.p. die beiden
intravenösen Clamps durchgeführt. Die Blutproben wurden auf Glukose, Insulin,
LCFA und Leptin untersucht. Die Ergebnisse zeigten Unterschiede im
Glukosestoffwechsel zwischen trächtigen und laktierenden Ziegen. In der
Trächtigkeit ist die Insulinsekretion durch Glukoseinfusion höher, und die infundierte
Glukose wird langsamer verstoffwechselt. Entsprechend war bei den laktierenden
Ziegen die Gewebesensitivität und die metabolische Clearance Rate für Insulin
höher. Die LCFA-Konzentration war in der Laktation erhöht, und unterlag größeren
Schwankungen durch die Infusionen. Bei den trächtigen Ziegen wurde ein Einfluss
der Infusionen auf die Leptinsekretion nachgewiesen. Es konnte hingegen kein
signifikanter Effekt der Clamps während der Laktation nachgewiesen werden.
Es bestehen klare Hinweise, dass die mit der Propionatinfusion induzierten
metabolischen Veränderungen die Leptinsynthese bei Ziegen erhöhen, und dabei in
ein komplexes System der energetischen Regulation durch Energiesubstrate und
Hormone eingebettet ist. Das Verhältnis zwischen Leptin, Insulin- und
Glukosemetabolismus um die Geburt ist ebenso eng wie vielschichtig, und bestätigt
deren hervorragende Rolle im Ausgleich zwischen Insulinsensitivität und
Energieversorgung.
Summary 93
6 Summary
Christoph Seybold: Investigations on the energetic regulation of the leptin
system in goats
Leptin is known to be hormonally and nutritionally regulated. In human and rodents
there is evidence that SCFA (short-chained fatty acids) alter leptin expression. In
ruminant metabolism, depending on SCFA as fuel for the hepatic gluconeogenesis,
these metabolic pathways are potentially important. This study aimed to investigate
whether propionate influences leptin synthesis in goats.
In a following trial, the correlation between leptin and insulin was further assessed.
The regulation of these hormones is closely related. It was shown in monogastrics as
well as in ruminants that leptin influences insulin secretion and sensitivity. Particularly
between late pregnancy and the beginning of lactation, the pattern of hormones
secreted and insulin sensitivity change. This change ought to be further
characterised by means of hyperglycaemic and euglycemic-hyperinsulinemic clamps
in dairy goats.
In the first part, 9 castrated bucks were allocated to an intravenous infusion with
either a propionate solution or an equimolar NaCl solution. After a pre-period of one
hour, the following infusion started for up to 260 minutes. Frequent blood samples
were taken regularly and the concentration of glucose was measured immediately.
Further parameters were leptin, insulin and long-chained fatty acids (LCFA). Finally
the animals were euthanised and tissue samples were taken from M.
semitendinosus, liver, subcutaneous fat and perirenal fat.
In the tissue samples gene expression was investigated. Therefore real-time RT-
PCR assays for the assessment of leptin, leptin receptor, putative G-protein coupled
receptor (GPR) 41 and 18S rRNA as internal standard were designed and validated.
The investigation showed that mRNA of leptin and leptin receptor tended to be
expressed at a higher rate in subcutaneous fat than in perirenal fat. Leptin mRNA
was raised 3,2 fold by the propionate infusion in the perirenal fat. Leptin receptor
mRNA was reduced significantly 4,2 fold. This points out the potential importance of
leptin receptor in peripheral regulation of leptin that has only marginally been
investigated yet. GPR41 mRNA abundance was higher in perirenal fat. By detecting
a significant increase in subcutaneous fat, it could be shown that GPR41 is basically
Summary 94
correlated to an increase of leptin through propionate infusion in goats. In the serum
samples, the concentration profiles of hormones, glucose and LCFA were
characterised. The increase of leptin mRNA was confirmed by a raise of leptin in the
blood samples. Serum concentrations of insulin and glucose were different between
the two groups with higher levels in the treatment group. The concentrations of LCFA
were also different, but there was an initial decline in the propionate group. Finally
the concentration reached the base level again.
In the second part, the two intravenous clamps were performed in six dairy goats at
about 25 days a.p. and 9 days p.p. The blood samples were assessed for glucose,
insulin, LCFA and leptin. The results showed differences in glucose metabolism
between pregnant and lactating goats. In pregnancy, glucose infusion increased
insulin at a higher rate. The amount of glucose infused was metabolised more slowly.
Accordingly, tissue sensitivity and metabolic clearance rate of insulin in lactating
goats were higher. LCFA concentration was higher in lactation and was strongly
affected by the infusions. In pregnant goats, leptin was evidentially influenced by the
infusions, whereas there was no significant effect of the clamps during lactation.
There was strong evidence that changes in metabolism induced by propionate
infusion increased leptin synthesis in goats, embedded into a complex system of
energetic regulation by fuel and hormones. The relationship between leptin, insulin
metabolism and glucose metabolism around parturition is close and complex, thus
confirming a prominent role in balancing insulin sensitivity and energy supply.
Literaturverzeichnis 95
7 Literaturverzeichnis
AHIMA, R.S. (2006): Adipose tissue as an endocrine organ. Obesity (Silver Spring). 14 Suppl 5, 242S-249S ACCORSI, P.A., M. GAMBERONI, G. ISANI, N. GOVONI, R. VIGGANI, M. MONARI, M. de AMBROGI, A. MUNNO, C. TAMANINI u. E. SEREN (2005): Leptin does not seem to influence glucose uptake by bovine mammary explants. J. Physiol. Pharmacol. 56, 689-698 ALTSCHUL, S.F., W. GISH, W. MILLER, E.W. MYERS u. D.J. LIPMAN (1990): Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410 BARTHA, T., A. SAYED-AHMED, P. RUDAS (2005): Expression of leptin and its receptors in various tussues of ruminants. Domest. Anim. Endocrinol. 29, 193-202 BENMANSOUR, N.M., Y. DEMARNE, M.J. LECOURTIER u. C. LHUILLERY (1991) : Effects of dietary fat and adipose tissue location on insulin action in young boar adipocytes. Int. J. Biochem. 23, 499-506 BEQUETTE, B.J., C.E. KYLE, L.A. CROMPTON V. BUCHAN u. M.D. HANIGAN (2001): Insulin regulates milk production and mammary gland and hind-leg amino acid fluxes and blood flow in lactating goats. J. Dairy Sci. 84, 241-255 BLOCK, S.S., W.R. BUTLER, R.A. EHRHARDT, A.W. BELL, M.E. VAN AMBURGH u. Y.R. BOISCLAIR (2001): Decreased concentration of plasma leptin in periparturient dairy cows is caused by negative energy balance. J. Endocrinol. 171, 339-348 BLOCK, S.S., R.P. RHOADS, D.E. BAUMAN, R.A. EHRHARDT, M.A. MCGUIRE, B.A. CROOKER, J.M. GRIINARI, T.R. MACKLE, W.J. WEBER, M.E. VAN AMBURGH u. Y.R. BOISCLAIR (2003): Demonstration of a role for insulin in the regulation of leptin in lactating dairy cows. J. Dairy Sci. 86, 3508-3515 BONINI, J.A., S.M. ANDERSON u. D.F. STEINER (1997): Molecular cloning and tissue expression of a novel orphan G protein-coupled receptor from rat lung. Biochem. Biophys. Res. Commun. 234, 190-193
Literaturverzeichnis 96
BONNET, M., C. DELAVAUD, J. ROUEL u. Y. CHILLIARD (2005) : Pregnancy increases plasma leptin in nulliparous but not primiparous goats while lactation depresses it. Domest. Anim. Endocrinol. 28, 216-223 BOSCH, R.R., S.W. JANSSEN, P.N. SPAN, A. OLTHAAR, S.E. VAN ERNST-DE VRIES, P.H. WILLEMS, J.M.G. MARTENS, A.R. HERMUS u. C.C. SWEEP (2003): Exploring levels of hexosamine biosynthesis pathway intermediates and protein kinase C isoforms in muscle and fat tissue Diabetic Fatty rats. Endocrine 20, 247-252 BOSCH, R.R., M.J. POUWELS, P.N. SPAN, A.J. OLTHAAR, A.R. HERMUS u. C.G. SWEEP (2004): Hexosamines are unlikely to function as a nutrient-sensor in 3T3-L1 adipocytes: a comparison of UDP-hexosamine levels after glucose flux and glucosamine treatment. Endocrine 23, 17-24 BOSTEDT, H. u. K. DEDIE (1996): Schaf- und Ziegenkrankheiten. 2.Auflage, Ulmer-Verlag, Stuttgart, 441 BRADFORD, B.J., M. OBA, R.A. EHRHARDT, Y.R. BOISCLAIR u. M.S. ALLEN (2006): Propionate is not an important regulator of plasma leptin concentration in dairy cattle. Domest. Anim. Endocrinol. 30, 65-75 BREVES, G. (2000): Physiologie des Magen-Darm-Kanals. In: ENGELHARDT, W.v. u. G.BREVES (Hrsg.): Physiologie der Haustiere Enke-Verlag, Stuttgart, 348-350 BRISCOE, C.P., M. TADAYYON, J.L. ANDREWS, W.G. BENSON, j.K. CHAMBERS, M.M. EILERT, C. ELLIS, N.A. ELSHOURBAGY, A.S. GOETZ, D.T. MINNICK, P.R. MURDOCK, H.R. Jr. SAULS, U. SHABON, L.D. SPINAGE, J.C. STRUM, P.G. SZEKERES,K.B. TAN, J.W. WAY, D.M. IGNAR, S. WILSON u. A.I. MUIR (2003): The orphan G protein-coupled receptor GPR40 is activated by medium and long chain fatty acids. Trends Endocrinol. Metab. 14, 201-203 BROWN, A.J., S.M. GOLDSWORTHY, A.A. BARNES, M.M. EILERT, L. TCHEANG, D. DANIELS, A.I. MUIR, M.J. WIGGLESWORTH, I. KINGHORN, N.J. FRASER, N.B. PIKE, J.C. STRUM, K.M. STEPLEWSKI, P.R. MURDOCK, J.C. HOLDER, F.H. MARSHALL, P.G. SZEKERES, S. WILSON, D.M. IGNAR, S.M. FOORD, A. WISE u. S.J. DOWELL (2003): The Orphan G protein-coupled receptors GPR41 and GPR43 are activated by propionate and other short chain carboxylic acids. J. Biol. Chem. 278, 11312-11319 BROWN, A.J., S. JUPE und C.P. BRISCOE (2005): A family of fatty acid binding receptors. DNA Cell Biol. 24, 54-61
Literaturverzeichnis 97
BUSTIN, S.A. (2000): Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J. Mol. Endocrinol. 25, 169-193 BUSTIN, S.A. (2002): Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J. Mol. Endocrinol. 29, 23-29 BUSTIN, S.A. u. T. NOLAN (2004): Pitfalls of quantiative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. J. Biomol. Tech. 15, 155-166 CAMERON, R.E.B., P.B. DYK, T.H. HERDT, J.B. KANEENE, R. MILLER, H.F. BUCHOLTZ, J.S. LIESMAN, M.J. VANDEHAAR u. R.S. EMERY (1998): Dry cow diet, management, and energy balance as risk factors for displaced abomasum in high producing dairy herds. J. Dairy Sci. 81, 132-139 CEDDIA R.B., W.N. Jr. WILLIAM u. R. CURI (1999): Comparing effects of leptin and insulin on glucose metabolism in skeletal muscle: evidence for an effect of leptin on glucose uptake and decarboxylation. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 23, 75-82 CHELIKANI, P.K., D.R. GLIMM u. J.J. KENNELLY (2003a): Tissue distribution of leptin and leptin receptor mRNA in the bovine. J. Dairy Sci. 86, 2369-2372 CHELIKANI, P.K., D.H. KEISLER u. J.J. KENNELLY (2003b): Response of plasma leptin concentration to jugular infusion of glucose or lipid is dependent on the stage of lactation of holstein cows. J. Nutr. 133, 4163-4171 CHILLIARD, Y., M. BONNET, C. DELAVAUD, Y. FAULCONNIER; C. LEROUX, J. DJIANE u. F. BOCQUIER (2001): Leptin in ruminants. Gene expression in adipose tissue and mammary gland, and regulation of plasma concentration. Domest. Anim. Endocrinol. 21, 271-295 CHILLIARD, Y., C. DELAVAUD u. M. BONNET (2005): Leptin expression in ruminants: Nutritional and physiological regulations in relation with energy metabolism Domest. Anim. Endocrinol. 29, 3-22 CHOMCZYNSKI, P. u. K. MACKEY (1995): Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal. Biochem. 225, 163-164
Literaturverzeichnis 98
CHOMCZYNSKI, P., u. N. SACCHI (1987): Single-step method of RNA-isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159 CHRISTENSEN, J.O., R.R. GRUMMER, F.E. RASMUSSEN u. S.J. BERTICS (1997): Effect of method of delivery of propylene glycol on plasma metabolites of feed-restricted cattle. J. Dairy Sci. 80, 563-568 COHEN, P., M. MIYAZAKI, N.D. SOCCI, A. HAGGE-GREEBERG, W.LIEDTKE, A.A. SOUKAS, R. SHARMA, L.C. HUDGINS, J.M. NTAMBI u. J.M. FRIEDMAN (2002): Role for stearoyl-CoA desaturase-1 in leptin-mediated weight loss. Science. 297, 240-243 COHEN, P., J.M. FRIEDMAN (2004): Leptin and the control of metabolism: role for stearoyl-CoA desaturase-1 (SCD-1). J.Nutr. 134, 2455S-2463S CORPET, F. (1988): Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucl. Acids Res. 16, 10881-10890 COVINTON, D.K., C.A. BRISCOE, A.J. BROWN u. C.K. JAYAWICKREME (2006): The G-protein-coupled receptor 40 family (GPR40-43) and its role in nutrient sensing Biochem. Trans. Soc. 34, 770-773 CUNNINGHAM, I.G. (2002): Textbook of veterinary physiology. W.B. Saunders, 3/E, Philadelphia, 320, 361 DEBRAS, E. J. GRIZARD, E. AINA, S. TESSERAUD, C. CHAMPREDON u. M. ARNAL (1989): Insulin sensitivity and responsiveness during lactation and dry period in goats. Am. J. Physiol. 256, E295-E302 DEFRONZO, R.A., J.D. TOBIN, R. ANDRES (1979): Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance Am. J. Physiol. 237, E214-E223 DEINDL, E. (2001): 18S ribosomal RNA detection on Northern blot employing a specific oligonucleotide. Biotechniques 31, 1250,1252 DELAVAUD, C. F. BOCQUIER, Y. CHILLIARD, D.H. KEISLER, A. GERTLER u. G. KANN (2000): Plasma leptin determination in ruminants: effect of nutritional status and body fatness on plasma leptin concentration assessed by a specific RIA in sheep. J. Endocrinol. 165, 519-526
Literaturverzeichnis 99
DELAVAUD, C., A. FERLAY, Y. FAULCONNIER, F. BOCQUIER, G. KANN u. Y. CHILLIARD (2002): Plasma leptin concentration in adult cattle: effects of species, breed, adiposity, feeding level and meal intake. J. Anim. Sci. 80, 1317-1328 DICOSTANZO A., J.E. WILLIAMS u. D.H. KEISLER (1999): Effects of short- or long-term infusions of acetate or propionate on luteinizing hormone, insulin, and metabolite concentrations in beef heifers. J. Anim. Sci. 77, 3050-3056 DRACKLEY, J.K. (1999): Biology of dairy cows during the transition period: the final frontier? J. Dairy Sci. 82, 2259-2273 EHRHARDT, R.A., P.L. GREENWOOD, A.W. BELL u. Y.R. BOISCLAIR (2003): Plasma leptin is regulated predominantly by nutrition in preruminant lambs. J. Nutr. 133, 4196-4201 EMILSSON, V., J. O`DOWD, A.L. NOLAN u. M.A. CAWTHORNE (2001): Hexosamines and nutrient excess induce leptin production and leptin receptor activation in pancreatic islets and clonal beta-cells. Endocrinology 142, 4414-4419 FITZPATRICK, R., O.M. CASEY, D. MORRIS, T. SMITH, R. POWELL u. J.M. SREENAN (2002): Postmortem stability of RNA isolated from bovine reproductive tissue. Biochim. Biophys. Acta 1574, 10-14 FLEIGE, S. u. M.W. PFAFFL (2006): RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol. Aspects. Med. 27, 126-139 FLEIGE, S., V. WALF, S. HUCH, C. PRGOMET, J. SEHM u. M.W. PFAFFL (2006): Comparison of relative mRNA quantification models and the impact of RNA integrity in quantitative real-time PCR. Biotechnol. Lett. 28, 1601-1613 FÖRSTER, V.T. (1948): Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annals of Physics, Leipzig FRIEDMAN, J.M. u. J.L. HALAAS (1998): Leptin and the regulation of body weight in mammals. Nature 395, 763-770 FRUHBECK,G.A. (2006): Intracellular signalling pathways activated by leptin. Biochem. J. 393(Pt1), 7-20
Literaturverzeichnis 100
FUHRMANN, H., C. EULITZ-MEDER, H. GELDERMANN u. H.P. SALLMANN (1989): Zur Evaluierung von Hormon- und Metabolitprofilen nach Infusion von Glucose, Propionat und Butyrat beim Rind. Berl. Münch. Tierärztl. Wschr. 102, 188-193 GABAI, G., G. COZZI, F. ROSI, I. ANDRIGHETTO u. G. BONO (2002): Glucose or essential amino acid infusionsin late pregnant and early lactating Simmenthal cows failed to induce a leptin response. J. Vet. Med. A 49, 73-80 GARCIA, M.R., M. AMSTALDEN, S.W. WILLIAMS, R.L. STANKO, C.D. MORRISON, D.H. KEISLER, S.E. NIZIELSKI u. G.L. WILLIAMS (2002): Serum leptin and ist adipose gene expression during pubertal development, the estrous cycle, and different seasons in cattle. J. Anim. Sci. 80, 2158-2167 GAVRILOVA, O., V. BARR, B. MARCUS-SAMUELS u. M. REITMAN (1997) : Hyperleptinemia of pregnancy associated with the appearance of a circulating form of the leptin receptor. J. Biol. Chem. 48, 30546-30551 GEARY, T.W., E.L. MCFADIN, M.D. MACNEIL, E.E. GRINGS, R.E. SHORT, R.N. FUNSTON u. D.H. KEISLER (2003): Leptin as a predictor of carcass composition in beef cattle. J. Anim. Sci 81, 1-8 GELFAND, D.H. (1989): Current communications in molecular biology: polymerase chain reaction. In: H.A. EHRLICH, R. GIBBS, H.H. KAZAZIAN (Hrsg.). CSHL Cold Spring Harbor, NY 11-17 GERTLER, A., J. SIMMONS u. D.H. KEISLER (1998): Large-scale preparation of biologically active rcombinant ovine obese prtein (leptin).. FEBS Lett. 422, 137-140 GOFF, J.P. (2006): Major advances in our understanding of nutritional infuences on bovine health. J. Dairy Sci. 89, 1292-1301 GORZELNIAK, K., J. JANKE, S. ENGELI u. A.M. SHARMA (2001): Vaidation of endogenous controls for gene expression studies in human adipocytes and preadipocytes. Horm. Metab. Res. 33, 625-627 GÜRTLER, H. u. F.J. SCHWEIGERT (2000): Physiologie der Laktation. In: ENGELHARDT, W.v. u. G. BREVES (Hrsg.): Physiologie der Haustiere. Enke-Verlag, Stuttgart, 580-589
Literaturverzeichnis 101
HACHENBERG, S., C. WEINKAUF, S. HISS u. H. SAUERWEIN (2007): Evaluation of classification modes potentially suitable to identify metabolic stress in healthy dairy cows during the peripartal period. J. Anim. Sci. 85, 1923-1932 HAMMON, H.M., O. BELLMANN, J. VOIGT, F. SCHNEIDER u. C. KÜHN (2007): Glucose-dependent insulin response and milk production in heifers within a segregating resource family population. J. Dairy Sci. 90, 3247-3254 HEINTGES, U (2003): Untersuchungen zur Bedeutung von Leptin bei Wiederkäuern. Shaker Verlag, Aachen Bonn, Univ., Fachber. Agrarwiss. Diss. HENNIES, M., J.K. VOGLMAYR, E. DIETRICH, M. STOLLMANN, R. MOELLER u. W. HOLTZ (2001): Hormonal response of female goats to active immunization against a recombinant human inhibin alpha-subunit, and establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay for caprine follicle-stimulating hormone Reprod. Domest. Anim. 36, 65-71 HIGASHIYAMA, Y., H. ABE, M. HAYASHI u. K. HODATE (2003): The comparism of plasma level and mRNA expression of leptin from Japanese Black steers and Holstein steers. Livest. Prod. Sci. 81, 247-255 HOCQUETTE, J.F. u. H. ABE (2000): Facilitative glucose transporters in livestock species. Reprod. Nutr. Dev. 40, 517-533 HOLLAND, P.M., R.D. ABRAMSON, R. WATSON u. D.H. GELFAND (1991): Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5` 3` exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 7276-7280 HONG, Y.-H., Y. NISHIMURA, D. HISHIKAWA, H. TSUZUKI, H. MIYAHARA, C. GOTOH, K.-C. CHOI, D. D. FENG, C. CHEN, H.-G. LEE, K. KATOH, S.-G. ROH u. S. SASAKI (2005): Acetate and propionate short chain fatty acids stimulate adipogenesis via GPCR43. Endocrinology 146, 5092-5099 HOUSEKNECHT, K.L. u. C.P. PORTOCARRERO (1998): Leptin and its receptors: regulators of whole-body energy homeostasis. Domest. Anim. Endocrinol. 15, 457-475 HOUSEKNECHT, K.L., C.P. PORTOCARRERO, R. LEMENAGER u. M.E. SPURLOCK (2000): Growth hormone regulates leptin gene expression in bovine adipose tissue: correlation with adipose tissue IGF-1 expression. J. Endocrinol. 164, 51-57
Literaturverzeichnis 102
HUSVETH, F., S. SZEGLETI u. Z. NEOGRADY (1996): Infusion of various short chain acids causes different changes in the blood glucose and insulin concentrations in growing lambs deprived of food overnight. J. Vet Med. A 43, 437-444 INGVARTSEN, K.L. u. Y.R. BOISCLAIR (2001): Leptin and the regulation of food intake, energy homeostasis and immunity with special focus on periparturient ruminants. Domest. Anim. Endocrinol. 21, 215-250 ISHIGURO, T., J. SAITOH, H. YAWATA, H. YAMAGISHI, S. IWASAKI u. Y. MITOMA (1995): Homogeneous quantitative assay of hepatitis C virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercalater. Anal. Biochem. 229, 207-213 IVELL, R (1998): A question of faith – or the philosophy of RNA controls. J. Endocrinol. 159, 197-200 JANES, A.N., T.E.C. WEEKES, u. D.G. ARMSTRONG (1985): Insulin action and glucose metabolism in sheep fed on dried-grass or ground, maize-based diets. Br. J. Nutr. 54, 459-471 JI, S., G.M. WILLIS, R.R. SCOTT, M.E. SPURLOCK (1998): Partial cloning and expression of the bovine leptin gene. Biotechnol. 9, 1-14 KASHYAP, S.R. u. R.A. DEFRONZO (2007): The insulin resistance syndrome: physiological considerations. Diab. Vasc. Dis. Res. 4, 13-19 KATADA, T., H. KUROSU, T. OKADA, N. TSUJIMOTO, S. TAKASUGA, K. KONTANI, O. HAZEKI u. M. UI (1999): Synergistic activation of a family of phosphoinositice 3-kinase via G-protein coupled and tyrosine kinase-related receptors. Chem. Phys. Lipids 98, 79-86 KAUTER, K., M. BALL, P. KEARNEY, R. TELLAM u. J.R. MACFARLANE (2000): Adrenaline, insulin and glucagon do not have acute effects on plasma leptin levels in sheep: development and characterisation of an ovine leptin ELISA. J. Endocrinol. 166, 127-135 KIM, H., Y. CHI, K. CHUNG, K. KIM, Y. CHOI u. M. BAIK (2000): Differential response of obese gene expression from fasting on bovine adipose tissue. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 2240-2242
Literaturverzeichnis 103
KIM, Y.K., H. CHOI u. K.H. MYUNG (2005): Effects of propylene glycol on carcass traits and its related gene expression in korean native steers. J. Anim. Sci. 83, 344-349 KIMURA, M., Y. MIZUKAMI, T. MIURA, K. FUJIMOTO, S. KOBAYASHI u. M. MATSUZAKI (2001): Orphan G protein-coupled receptor, GPR41, induces apoptosis via a p53/Bax during ischemic hypoxia and reoxygenation. J. Biol. Chem. 276, 26453-26460 KISFALVI, K., O. REY, S.H. YOUNG, J. SINNETT-SMITH u. E. ROZENGURT (2007): Insulin potentiates Ca2+ signaling and phosphatidylinositol 4,5-biphosphate hydrolysis inducedby Gq protein-coupled receptor agonists through an mTOR-dependent pathway. Endocrinology 148, 3246-3257 KOMATSU, T., F. ITOH, S. KUSHIBIKI u. K. HODATE (2005): Changes in gene expression of glucose transporters in lactating and nonlactating cows. J. Anim. Sci. 83, 557-564 KOTARSKY, K., N.E. NILSSON, E. FLODGREN, C. OWMAN u. B. OLDE (2003): A human cell surface receptor activated by free fatty acids and thiazolidinedione drugs. Trends Endocrinol. Metab. 14, 201-203 KUBISTA, M., J.M. ANDRADE, M. BENGTSSON, A. FOROOTAN, J. JONAK, K. LIND, R. SINDELKA, R. SJÖBACK, B. SJÖGREEN, L. STRÖMBOM, A. STÅHLBERG u. N. ZORIC (2006): The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects Med. 27, 95-125 KUMAR, B., S.M. FRANCIS, J.M. SUTTIE u. M.P. THOMPSON (1998): Expression of obese mRNA in genetically lean and fat selection lines of sheep. Comp. Biochem. Physiol. Part B 120, 543-548 LARSEN, S., K. RYGAARD, S. ASNAES u. M. SPANG-THOMSEN (1992): Northern andSouthern blot analysis of human RNA and DNA in autopsy material. APMIS 100, 498-502 LEE, C.G., C.R. CONNELL u. W. BLOCH (1993): Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes. Nucl. Acids. Res. 21, 3761-3766 LEE, S. H. u. K.L. HOSSNER (2002): Coordinate regulation of ovine adipose tissue gene expression by propionate. J. Anim. Sci. 80, 2840-2849
Literaturverzeichnis 104
LEE, M.J., Y.WANG, M.R. RICCI, S. SULLIVAN, C.D. RUSSELL u.S.K. FRIED (2007): Acute and chronic regulation of leptin synthesis, storage, and secretion by insulin and dexamethasone in human adipose tissue. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 292, E858-864 LEFEBVRE, A.M., M. LAVILLE, N.VEGA, J.P. RIOU, L. VAN GAAL,J. AUWERX u. H. VIDAL (1998): Depot-specific differences in adipose tissue gene expresion in lean and obese subjects. Diabetes 47, 98-103 LE POUL, E., C. LOISON, S. STRUYF, J.Y. SPRINGAEL, V. LANNOY, M.-E. DECOBEQ, S. BREZILON, V. DUPRIEZ, G. VASSART, J.V. DAMME, M. PARMENTIER u. M. DETHEUX (2003): Functional characterization of human receptors for short chain fatty acids and their role in polymorphonuclear cell activation. J. Biol. Chem. 278, 25481-25489 LEURY, B.J., L.H. BAUMGARD, S.S. BLOCK, N. SEGOALE, R.A. EHRHARDT, R.P. RHOADS, D.E. BAUMAN, A.W. BELL u. BOISCLAIR (2003): Effect of insulin and growth hormone on plasma leptin in periparurient dairy cows. Am. J. Physiol Regul. Integr. Comp. Physiol. 285, R1107-R1115 LEWANDOWSKI, K., R. HORN, C.J. O`CALLAGHAN, D. DUNLOP, G.F. MEDLEY, P. O`HARE u. G. BRABANT (1999): Free leptin, bound leptin, and soluble leptin receptor in normal and diabetic pregnancies. J. Clin. Endocrinol. Metab. 84, 300-306 LIEFERS, S.C., R.F. VEERKAMP, M.F.W. TE PAS, Y. CHILLIARD u. T. VAN DER LENDE (2005): Genetics and physiology of leptin in periparturient dairy cows. Domest. Anim. Endocrinol. 29, 227-238 LIN, J., C.R. BARB, R.L. MATTERI, R.R. KRAELING, X. CHEN, R.J. MEINERSMANN u. G.B. RAMPACEK (2000): Long from leptin receptor mRNA expression in the brain, pituitary and other tissues in the pig. Domest. Anim. Endocrinol. 19, 53-61 LIVAK, K., S.J. FLOOD, J. MARMARO, W. GIUSTI u. K. DEETZ (1995): Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Met. And Applic. 4, 357-362 LOEFFLER, G. (1998a): Endokrine Gewebe I: Grundlagen der endokrinen Regulation von Lebensvorgängen. In: LOEFFLER G. u. P.E. PETRIDES (Hrsg.): Biochemie und Pathobiochemie (6. Aufl.) Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, NewYork, 761-787
Literaturverzeichnis 105
LOEFFLER, G. (1998b): Stoffwechsel der Kohlenhydrate. In: LOEFFLER G. u. P.E. PETRIDES (Hrsg.): Biochemie und Pathobiochemie (6. Aufl.) Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, NewYork, 378-423 LOLLMANN, B., S. GRUNIGER, A. STRICKER-KRONGRAD u. M. CHIESI (1997): Detection and quantification of the leptin receptor splce variants Ob-Ra, b, and,e in different mose tissues. Biochem. Biophys. Res. Commun. 241, 648-652 LOMAX, M.A., G.D. BAIRD, C.B. MALLINSON u. H.W. SYMONDS (1979): Differences between lactating and non-lactating dairy cows in concentration and secretion rate of insulin. Biochem. J. 180, 281-289 LOUVEAU, S., S. CHAUDHURI, u. D. ETHERTON (1991) : An improved method for isolating RNA from porcine adipose tissue. Anal. Biochem. 196, 308-310 MAČAJOVA, M., D. LAMOŠOVA u. M. ZEMAN (2004): Role of leptin in farm animals: a review. J. Vet. Med. A Physiol. Pathol. Clin. Med. 51, 157-166 MALMSTROM, R., M.R. TASKINEN, S.L. KARONEN u. H. YKI-JARVINEN (1996): Insulin increases plasma leptin concentrations in normal subjects and patients. Diabetologia 39, 993-998 MCKENNA, L.A., A. GEHRSITZ, S. SÖDER, W. EGER, T. KIRCHNER u. T. AIGNER (2000): Effective isolation of high-quality total RNA from human adult articular cartilage. Anal. Biochem. 286, 80-85 MENKE, K.-H. U. W. HUSS (1987): Tierernährung und Futtermittelkunde. 3. neubearb. Aufl., Ulmer, Stuttgart, 68, 69 MIN, B.R., S.P. HART, T. SAHLU u. L.D. SATTER (2005): The effect of diets on milk production and composition, and on lactation curves in pastured dairy goats. J. Dairy Sci. 88, 2604-2615 MINOKOSHI, Y., Y.B. KIM, O.D. PERONI, L.G. FRYER, C. MULLER, D. CARLING u. B.B. KAHN (2002): Leptin stimulates fatty-acid oxidation by activating AMP-activated proteinkinase. Nature 415, 268-269
Literaturverzeichnis 106
MIZUNO, T., H. BERGEN, S. KLEOPOULOS, W.A. BAUMAN u. C.V. MOBBS (1996): Effects of nutritional status and aging on leptin gene expression in mice: importance of glucose. Horm. Metab. Res. 28, 679-684 MOXHAM, C.M. u. C.C. MALBON (1996): Insulin action impaired by deficiency of the G-protein subunit Gialpha2. Nature 379, 840-844 MULLIS, K.B., F. FALOONA, S. SCHARF; R. SAIKI, u. H. EHRLICH (1986): Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biology 51, 263-267 NIELSEN, M.O. u. K. JACOBSEN ( 1993): Changes in mammary glucose and protein uptake inrelation to milk synthesis during lactation in high-yielding and low-yielding goats. Comp. Biochem. Physiol. Comp. Physiol. 106, 359-365 NIELSEN, M.O., T.G. MADSEN u. A.M. HEDEBOE (2001): Regulation of mammary glucose uptake in goats. role of mammary gland supply, insulin, IGF-1 and synthetic capacitiy. J. Dairy Res. 68, 337-349 NILSSON, N.E., K. KOTARSKY, C. OWMAN u. B. OLDE (2003): Identification of a free fatty acid receptor, FFA2R, expressed on leukocytes and activated by short-chain fatty acids. Biochem. Biophys. Res. Commun. 303, 1047-1052 OLIVER, M.H., J.E. HARDING, B.H. BREIER, P.C. EVANS, B.W. GALLAGHER u. P.D. GLUCKMAN (1995): The effects ovine placental lactogen infusion on metabolites, insulin – like growth factors and binding proteins in the fetal sheep. J. Endocrinol. 144, 333-338 ØVSTEBØ, R., K.B.F. HAUG, K. LANDE u. P. KIERULF (2003): PCR-based calibration curves for studies of quantitative gene expression in human monocytes: development and evaluation. Clin. Chem. 49, 425-432 PERRINI, S., L. LAVIOLA, A. CARELLI, M. MELCHIORRE, F. DE STFANO, C. CACCIOPPOLI, A. NATALICCHIO, M.R. ORLANDO, G. GARRUTI, M. DE FAZIO, G. CATALANO, V. MEMEO, R. GIORGIO u. F. GIORGIO (2008): Fat depot-related differences in gene expression, adiponectin secretion, and insulin action and signalling in human adipocytes differentiated in vitro from precursor stromal cells. Diabetologia 51, 155-164 PETERS, I.R., C.R. HELPS, E.J. HALL u. M.J. DAY (2004): Real-time PCR: considerations for efficient and sensitive assay design. J. Immunol. Methods 275, 213-222
Literaturverzeichnis 107
PIDGEN, A.W. (1992): Statistical aspects of bioequivalence – a review. Xenobiotica 22, 881-893 PLUM, L., B. F. BELGARDT u. J.C. BRÜNING (2006): Central insulin action in energy and glucose homeotasis. J. Clin. Invest. 116, 1761-1766 POITOUT, V. (2003): The ins and outs of fatty acids on the pancreatic ß cell. Trends Endocrinol. Metab. 14, 201-203 POUWELS, M.J., C.J. TACK, P.N. SPAN, A.J.OLTHAAR, C.G. SWEEP, F.C. HUVERS, J.A. LUTTERMAN u. A.R. HERMUS (2004): Role of hexosamines in insulin resistance and nutrient sensing in human adipose and muscle tissue. J. Clin. Endocrinol. Metab. 89, 5132-5137 RABINOWITZ, L., R.L. SARASON, C. TANASOVICH, V.E. MENDEL u. R.P. BROCKMAN (1984): Effects of glucagon, insulin, propionate, acetate, and HCO3 on K excretion in sheep. Am. J. Physiol. 246, R197-204 RADONIĆ, A., S. THULKE, I.M. MACKAY, O. LANDT, W. SIEGERT u. A. NITSCHE (2004): Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 313, 856-862 RAMSAY, T.G. u. M.P. RICHARDS (2004): Hormonal regulation of leptin and leptin receptor expression in porcine subcutaneous adipose tissue. J. Anim. Sci. 82, 3486-3492 RAPPOLEE, D.A., D. MARK, M.J. BANDA, u. Z. WERB (1991): Wound macrophages express TGF-α and other growth factors in vivo: analysis by mRNA phenotyping. Science 241, 708-712 REGNAULT, T.R., H.V. ODDY, C. NANCARROW, N. SRISKANDARAJAH u. R.J. SCARAMUZZI (2004): Glucose-stimulated insulin response in pregnant sheep following acute suppression of plasma non-esterified fatty acid concentrations. Reprod. Biol. Endocrinol. 2, 64-74 RIGOUT S., S. LEMOSQUET, A. BACH, J.W. BLUM u. H. RULQUIN (2002) : Duodenal infusion of glucose decreases milk fat production in grass silage-fed cows. J. Dairy Sci. 85, 2541-2550
Literaturverzeichnis 108
RICCI, M.R., C.D. RUSSELL, Y. WANG, S. SULLIVAN, S.H. SCHNEIDER, R.E. BROLIN u. S.K. FRIED (2005): Isoproterenol decreases leptin release from rat and human adipose tissue through posttranscriptional mechanisms. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 288, E798-804 RIRIE, K.M., R.P. RASMUSSEN u. C.T. WITTWER (1997): Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal. Biochem. 245, 194-204 ROZENGURT, E. (2007): Mitogenic signaling pathways induced by G protein-coupled receptors. J. Cell Physiol. 213, 589-602 RUSTENBECK, I. (2002): Desensitization of insulin secretion. Biochem. Pharmacol. 63, 1921-1935 SALEHI, A., E. FLODGREN, N.E. NILSSON, J. JIMENEZ-FELTSTROM, J. MIYAZAKI, C. OWMAN u. B. OLDE (2005): Free fatty acid receptor 1 (FFA(1)R/GPR40) and its involvement in fatty-acid-stimulated insulin secretion. Cell Tissue Res. 322, 207-215 SALLMANN, H.-P u. H. FUHRMANN (2000): Physiologische Aspekte der Leberfunktion. In: ENGELHARDT, W.v. u. G. BREVES (Hrsg.): Physiologie der Haustiere. Enke-Verlag, Stuttgart, 428-430 SANGER, F., S. NICKLEN u. A.R. COULSON (1977): DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 SANO, H., N. HATTORI, Y. TODOME, J. TSURUOKA, H. TAKAHASHI u. Y. TERASHIMA (1993a): Plasma insulin and glucagon responses to intravenous infusion of propionate and their autonomic control in sheep. J. Anim. Sci. 71, 3414-3422 SANO, H., S. NARAHARA, T. KONDO, A. TAKAHASHI u. Y. TERASHIMA (1993b): Insulin responsiveness to glucose and tissue responsiveness to insulin during lactation in dairy cows. Domest . Anim. Endocrinol. 10, 191-197 SANO, H., S. HAYAKAWA, H. TAKAHASHI u. Y. TERASHIMA (1995): Plasma insulin and glucagon responses to propionate infusion into femoral and mesenteric veins in sheep. J. Anim. Sci. 73, 191-197
Literaturverzeichnis 109
SARTIN, J.L., K.A. CUMMINS, R.J. KEMPPAINEN, D.N. MARPLE, C.H. RAHE u. J.C. WILLIAMS (1985): Glucagon, insulin and growth hormone responses to glucose infusion in latating dairy cows. Am. J. Physiol. 248, E108-E114 SAUERWEIN, H., U. HEINTGES, M. HENNIES, T. SELHORST, u. A. DAXENBERGER (2004): Growth hormone induced alterations of leptin serum concentrations in dairy cows as measured by a novel enzyme immunoassay. Livestock Production Science 87, 189-195 SAUERWEIN, H., U. HEINTGES, S.C: BRUHNS, M. HENNIES u. A. GERTLER (2006): Active immunization against leptin fails to affect reproduction and exerts only marginal effects on glucose metabolism in young female goats. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. (Berl). 90, 278-288 SAWZDARGO, M., S.R. GEORGE, T. NGUYEN, S. XU, L.F. KOLAKOWSKI u. B.F. O`DOWD (1997): A cluster of four novel human G protein-coupled receptor genes occurring in close proximity to CD22 gene on chromosome 19q13. Biochem. Biophys. Res. Commun. 239, 543-547 SCHMITTGEN, T.D., B.A. ZAKRAJSEK, A.G. MILLS, V. GORN, M.J. SINGER, M.W: REED (2000): Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction to study mRNA decay: comparison of endpoint and real-time methods. Anal. Biochem. 285, 194-204 SCHOOR, O., T. WEINSCHENK, J. HENNENLOTTER, S. CORVIN, A. STENZL, H.-G. RAMMENSEE u. S. STEFANOVIĆ (2003): Moderate degradation does not preclude microarray analysis of small amounts of RNA. Biotechniques 35, 1192-1201 SHIMABUKURO, M., K. KOYAMA, G. CHEN, M.Y. WANG, F. TRIEU, Y. LEE, C.B. NEWGARD u. R.H. UNGER (1997): Direct antidiabetic effect of leptin through triglyceride depletion of tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 4242-4245 SHIMUZU, S., Y. TANI, H. YAMADA, M. TABATA u. T. MURACHI (1980): Enzymatic determination of serum – free fatty acids: a colorimetric method. Anal. Biochem. 107, 193-198 SOLIMAN, M., K. ISHIOKA, C. OWMAN u. B. OLDE (2002): Plasma leptin responses to lipopolysaccharide and tumor necrosis factor-α in cows. Jpn. J. Vet. Res. 50, 107-114
Literaturverzeichnis 110
SOLIMAN, M., K. KIMURA, M. AHMED, D. YAMAJI, Y. MATSUSHITA, Y. OKAMATSU-OGURA, K. MAKONDO u. M. SAITO (2007). Inverse regulation of leptin mRNA expression byshort- and long-chain fatty acids in the cultured bovine adipocytes. Domest. Anim. Endocrinol. 33, 400-409 SORENSEN, A., C.L. ADAM, P.A. FINDLAY, M. MARIE, L. THOMAS, M.T. TRAVERS u. R. VERNON (2002): Leptin secretion and hypothalamic neuropeptide and receptor gene expression in sheep. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, R1227-1235 STÅHLBERG, A., J. HÅKANSSON, X. XIAN, H. SEMB u. M. KUBISTA (2004): Properties of the reverse transcription reaction in mRNA quantification. Clin. Chem. 50, 509-515 SWEENEY, G., J. KEEN, R. SOMWAR, D. KONRAD, R.GARG u. A. KLIP (2001): High leptin levels acutely inhibit insulin-stimulated glucose uptake without affecting glucose transporter 4 transocation in 16 rat skeletal muscle. Endocrinology. 142, 4806-4812 TARTAGLIA, L.A. (1997): The leptin receptor. J. Biol. Chem. 272, 6093-6096 THELLIN, O., W. ZORZI, B. LAKAYE, B. DE BORMAN, B. COUMANS, G. HENNEN, T. GRISAR, A. IGOUT u. E. HEINEN (1999) : Housekeeping genes as internal standards : use and limits. J. Biotechnol. 75, 291-295 TRICARICO, C., P.PINZANI, S: BIANCHI, M. PAGLIERANI, V. DISTANTE, M. PAZZAGLI, S.A. BUSTIN u. C. ORLANDO (2002): Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction: normalization to rRNA or single housekeeping genes is inappropriate for human tissue biopsies. Anal. Biochem. 309, 293-300 UNGEMACH, F.R. (1999): Wasser- und Elektrolythaushalt – Infusionstherapie. In: LÖSCHER, W., F.R. UNGEMACH u. R. KROKER: Pharmakotherapie bei Haus- und Nutztieren. Parey Buchverlag, Berlin, 159-161 UTRIAINEN, T., R. MALMSTRÖM, S. MÄKIMATTILA u. H. YKI-JÄRVINEN (1996): Supraphysiological hyperinsulinemia increases plasma leptin concentrations after 4 h in normal subjects. Diabetes 45, 1364-1366 VERNON, G. u. M. POND (1997): Adaptations of maternal adipose tissue to lactation. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 2, 231-241
Literaturverzeichnis 111
WANG, J., R. LIU, M. Hawkins, N. Barzilai u. L. Rossetti (1998): A nutrient-sensing pathway regulates leptin gene expression in muscle and fat. Nature 393, 684-688 WANG, J., R. LIU, L. LIU, R. CHOWDHURY, N. BARZILAI, J. TAN u.L.ROSSETTI (1999a): The effect of leptin on Lep expression is tissue-specific and nutritionally regulated. Nat. Med. 8, 895-899 WANG, J.L., N. CHINOOKOSWONG, S. SCULLY,M. QI u. Z.Q. SHI (1999b): Differential effects of leptin in regulation of tissue glucose utilization in vivo. Endocrinology. 140, 2117-2124 WILKINSON, M. (2000): Purification of RNA. in: T.A. BROWN (Hrsg.). Essential Molecular Biology - A Practical Approach Vol. 1, 2. Aufl. Oxford University Press, Oxford XIONG, Y., N. MIYAMOTO, K. SHIBATA, M.A. VALASEK, T. MOTOIKE, R.M. KEDZIERSKI u. M. YANAGISAWA (2004): Short-chain fatty acids stimulate leptin production in adipocytes through the G protein-coupled receptor GPR41. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 1045-1050 YANG, G., H. GE, A. BOUCHER, X. YU u. C. LI (2004): Modulation of direct leptin signaling by soluble leptin receptor. Mol. Endocrinol. 18, 1354-1362 YANNAKOULIA, M., N. YIANNAKOURIS, S. BLÜHER, A.-L. MATALAS, D. KLIMIS-ZACAS u. C.S. MANTZOROS (2003): Body fat mass and macronutrient intake in relation to circulating soluble leptin receptor, free leptin index, adiponectin, and resistin concentrations in healthy humans. J. Clin. Endocrinol.Metab. 88, 1730-1736 YONEKURA, S., T. SENOO, Y. KOBAYASHI, T. YONEZAWA, K. KATOH u. Y. OBARA (2003): Effects of acetate and butyrate on the expression of leptin and short-form leptin receptor in bovine and rat anterior pituitary cells Gen. Comp. Endocrinol. 133, 165-172 YU, S., A. CASTLE, M. CHEN, R. LEE, K. TAKEDA u. L.S. WEINSTEIN (2001): Increased insulin sensitivity in Gsalpha knockout mice. J. Biol. Chem. 276, 19994-19998
Literaturverzeichnis 112
YUEN, B.S., P.C. OWENS, J.R. MCFARLANE, M.E. SYMONDS, L.J. EDWARDS, K.G. KAUTER u. I.C. MCMILLEN (2002): Circulating leptin concentrations are positively related to leptin messenger RNA expression in the adipose tissue of fetal sheep in the pregnant ewe fed at or below maintenance energy requirements during late gestation. Biol. Reprod. 67, 911-916 ZABEAU, L., D. LAVENS, F. PEELMAN, S. E, J. VANDEKERCKHOVE u. J. TAVERNIER (2003). The ins and outs of leptin receptor activation. FEBS Lett. 546, 45-50 ZHANG, Y., R. PRCENCA, M. MAFFEI, M. BARONE, L. LEOPOLD u. J.M. FRIEDMAN (1994): Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature 372, 425-432 ZHANG, P., E.S. KLENK, M.A. LAZZARO, L.B. WILLIAMS u. R.V. CONSIDINE (2002): Hexosamines regulate leptin production in 3T3-L1 adipocytes through transcriptional mechanisms. Endocrinology 143, 99-106 ZHAO, F.Q., P.J. MILLER, E.H. WAL, Y.C. ZHENG, B. DONG, M.C. NEVILLE u. T.B. MCFADDEN (2004): Bovine glucose transporter GLUT8: cloning, expression, and developmental regulation in mammary gland. Biochim. Biophys. Acta 1680, 103-113 ZHAO, F.Q., Y.C. ZHENG, E.H. WALL u. T.B. MCFADDEN (2005): Cloning and expression of bovine sodium/glucose cotransporters. J. Dairy Sci. 88, 182-94 ZHAO, F.Q. u. A.F. KEATING (2007): Expression and regulation of glucose transporters in the bovine mammary gland. J. Dairy Sci. 90, E76-E86 ZIEBA, D.A., M. AMSTALDEN u. G.L. WILLIAMS (2005): Regulatory roles of leptin inreproduction and metabolism: A comparative review. Domest. Anim. Endocrinol. 29, 166-185
Literaturverzeichnis 113
8 Tabellenverzeichnis
Tab. 1 Sequenzen der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Primer und Sonden für die real-time RT-PCR Assays und die RT-PCR-Primer zur Herstellung der Verdünnungsreihen für die Ob-Rb- und GPR41-RNA 27
Tab. 2 Effizienz und Wiederholbarkeit der real-time RT-PCR 48 Tab. 3 Vergleich der Blut- und Infusionsparametern im hyper-
glykämischen Clamp 55 Tab. 4 Vergleich der Blut- und Infusionsparameter im euglykämisch/
hyperinsulinämischen Clamp 56 Tab. 5 Vergleichende Übersicht der Mittelwerte und Quotienten
aus der relativen RNA-Quantifizierung in den verschiedenen Geweben 125
Tab. 6 Freie Fettsäuren im Blutserum. Ergebnisse der Messungen in
jeweils den ersten und letzten drei Blutproben eines Versuchsteiles 125
Literaturverzeichnis 114
9 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 Schematische Darstelung der GPR41-Funktion 13 Abb. 2 Beispielhafte Darstellung einer Standardkurve 30 Abb. 3 Beispielhafte Darstellung von Schmelzkurven 33 Abb. 4 Beispiel einer denaturierenden Gelelektrophorese 43 Abb. 5 Darstellung der PCR-Fragmente zur Sequenzierung 45 Abb. 6 Darstellung der Real-time PCR-Fragmente 45 Abb. 7 Sequenzvergleich des Leptinrezeptors 46 Abb. 8 Sequenzvergleich des G-proteingekoppelten Rezeptors 41 47 Abb. 9 Vergleich der mRNA-Expression 50 Abb. 10 Verlauf der Serumkonzentrationen nach Propionatinfusion 53 Abb. 11 Serumwerte im hyperglykämischen Clamp 57 Abb. 12 Serumwerte im euglykämisch-hyperinsulinämischen Clamo 58 Abb. 13 Verlauf der Serumleptinwerte 59 Abb. 14 Verlauf der freien Fettsäuren 60 Abb. 15 Verlauf der Milchmenge im Versuchszeitraum 61
Anhang 115
10 Anhang
Reinstwasser
Wasser wurde über einen Ionenaustauscher, UV-Bestrahlung (185 nm) und
Ultrafiltration (0,2 µm) bis zu einem elektrischen Widerstand von 18,2 MΩ hoch
gereinigt, und vor Gebrauch autoklaviert (Elga Labwater, PureLab PlusTM UV/UF,
Celle).
Enzymimmuntest
Beschichtungspuffer
0,05 M NaHCO3 Roth, Karlsruhe
200 µl/l Proteaseninhibitor (Complete ) Roche, Mannheim
20 ml/l ProClin 150 (1 %) Supelco, Bellefonte, PA, USA
pH 9,6
Caseinlösung
0,05 M NaOH Roth, Karlsruhe
2,5 % Casein Sigma-Aldrich,Taufkirchen
1,5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) AppliChem, Darmstadt
200 µl/l Proteinaseinhibitor (Complete ) Roche, Mannheim
20 ml/l ProClin 150(1 %) Supelco, Bellefonte, PA, USA
pH 7,2
Testpuffer
0,12 M NaCl Roth, Karlsruhe
0,02 M Na2HPO4 Merck, Darmstadt
0,01 M EDTA AppliChem, Darmstadt
0,005 % Chlorhexidin Sigma-Aldrich, Taufkirchen
0,01 M Gelatine(Gelatin Hydrolysat) Sigma-Aldrich,Taufkirchen
0,05 % Tween 20 AppliChem, Darmstadt
0,002 % Phenolrot Sigma-Aldrich,Taufkirchen
200 µl/l Proteaseninhibitor (Complete ) Roche, Mannheim
20 ml/l ProClin 150(1 %) Supelco, Bellefonte, PA, USA
pH 7,2
Anhang 116
Waschpuffer (PBS)
0,136 M NaCl Roth, Karlsruhe
8,1 mM Na2HPO4 AppliChem, Darmstadt
2,7 mM KCl Roth, Karlsruhe
1,5 mM KH2PO4 Merck, Darmstadt
5,5 g/l Tween 20 AppliChem, Darmstadt
2,0 ml/l ProClin 150(1 %) Supelco, Bellefonte, PA, USA
pH 6,9
Substratpuffer
0,05 M Zitronensäure Roth, Karlsruhe
0,055 M Na2HPO4 Merck, Darmstadt
0,05 % Harnstoffperoxid Sigma-Aldrich,Taufkirchen
20 ml/l ProClin 150(1 %) Supelco, Bellefonte, PA, USA
pH 4,05
TMB-Stammlösung
12,5 mg TMB (3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin) AppliChem, Darmstadt
1 ml DMSO (Dimethylsulfoxid) Merck, Darmstadt
Substratlösung
17 ml Substratlösung sh. Substratpuffer
340 µl TMB – Lösung AppliChem, Darmstadt
Stoppreagenz
1 M Oxalsäure Roth, Karlsruhe
RNA-Extraktion
DEPC-Wasser
1,0 ml DEPC AppliChem, Darmstadt
999 ml Reinstwasser
autoklavieren
Anhang 117
0,75 M Na-Citrat-Lösung pH 7,0 AppliChem, Darmstadt
mit Reinstwasser auf 100ml auffüllen
autoklavieren
Denaturierungslösung („GTC-Lösung“)
4 M GTC (Guanidinthiocyanat) Roth, Karlsruhe
0,25 M Na-Citrat, pH 7,0
0,1 M 2-Mercaptoethanol Roth, Karlsruhe
0,5 % N-Lauroylsarcosin Sigma-Aldrich,Taufkirchen
2 M Natriumacetatstammlösung pH 4,0
2 M Na-Acetat (wasserfrei) AppliChem, Darmstadt
Einstellung von pH 4,0 mit Eisessig
mit Reinstwasser auf 100 ml auffüllen
autoklavieren
1-Brom-3-Chlorpropan AppliChem, Darmstadt
Isoamylalkohol (1:49) AppliChem, Darmstadt
Phenol, wassergesättigt, nicht stabilisiert Roth, Karlsruhe
Isopropanol (100%) Roth, Karlsruhe
Ethanol (70%) KMF Laborchemie Handels
GmbH, Lohmar
Anhang 118
Fließschema zur Lipidextraktion aus Fettgewebe in der RNA-Extraktion
(Durchführung der Arbeitsschritte auf Eis)
1. Einwaage und mechanische Homogenisierung des Gewebes mit Mörser und Pistill
in flüssigem Stickstoff
2. Zugabe von 5 ml GTC-Lösung
3. Zugabe von 5 ml Chloroform
4. Zentrifugation (20 min, 4°C, 5500g)
5. Isolierung der oberen wässerigen GTC-Phase mit der Pipette (Zellbestandteile)
Wiederholung der Schritte 2. bis 5.
Lagerung bei -80°C
Extraktion der Gesamt-RNA
Anhang 119
Fließschema zur Extraktion der Gesamt-RNA der Muskel-, Leber- oder
vorbehandelten Fettgewebsproben (Durchführung der Arbeitsschritte auf Eis)
Einwaage des Leber- und Lipidentfernung aus Fettgewebe /
Muskelgewebes mit zehnfachem Lagerung der Gewebsextrakte
Volumen GTC-Lösung bei -80°C
Mechanische Homogenisation
Zugabe von (je ml GTC-Lösung): 1 ml saures Phenol (wassergesättigt)
0,8 ml 1-Brom-3-Chlorpropan (1:49 Isoamylalkohol)
0,2 ml Na-Azetat (2M pH 4)
Zentrifugation (30 min, 4°C, 5000 g)
Isolierung der oberen wässerigen GTC-Phase mit der Pipette
Zugabe von 100% Isopropanol (1ml/ml GTC-Lösung)
Inkubation (5 min, -80°C)
Zentrifugation (30 min, 4°C, 5000 g); Überstand dekantieren
Zugabe von 100% Isopropanol (0,1ml/ml GTC-Lösung)
Inkubation (5 min, -80°C)
Zentrifugation (20 min, 4°C, 10000 g); Überstand dekantieren
Anhang 120
2malige Waschung des Pellets mit 70% Ethanol (Zentrifugation 15min, RT, 10000g)
Trocknung des Pellets
Lösen in DEPC-H2O
DNase-Verdau der Muskel-Gesamt-RNA (50 µµµµl-Ansatz)
5 µl DNase I Puffer 10X MBI Fermentas, St. Leon-Rot
0,5 µl DTT 0,1 M MBI Fermentas, St. Leon-Rot
10 U Ribonuclease Inhibitor MBI Fermentas, St. Leon-Rot
100 U DNase I MBI Fermentas, St. Leon-Rot
RNA-Stocklösung (entsprechend 50 µg RNA), DEPC-H2O ad 50 µl
Inkubation 30 min, 37°C
Inaktivierung 5 min, 75°C
Denaturierende (RNA)-Gelelektrophorese
10X Laufpuffer (MOPS-Puffer, pH 8,0)
0,2 M MOPS (3-N-Morphlino-Propansulfonsäure)
AppliChem, Darmstadt
50 mM Na-Acetat AppliChem, Darmstadt
1 mM EDTA AppliChem, Darmstadt
NaOH Roth, Karlsruhe
5X Ladepuffer
226 µl Bromphenolblau (gesättigt) Sigma-Aldrich,Taufkirchen
20 µl 500 mM EDTA pH 8,0 AppliChem, Darmstadt
12 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml) Eurobio, Les Ulis Cedex B,
Frankreich
500 µl Glycerin 100% Sigma-Aldrich,Taufkirchen
180 µl Formaldehyd 37% (pH >4, deionisiert) Roth, Karlsruhe
771µl Formamid (deionisiert) AppliChem, Darmstadt
1000 µl 10X MOPS-Puffer
Anhang 121
1,2% Formaldehydgel
1,4 g Agarose Invitrogen, Karlsruhe
11,7 ml 10X MOPS-Puffer
101,5 ml DEPC-Wasser
3,5 ml Formaldehyd (37%, pH>4, deionisiert) Roth, Karlsruhe
Native (DNA-)Gelelektrophorese
5X Ladepuffer
50 mg Orange G Chroma-Gesellschaft, Münster
2 ml Glycerin Roth, Karlsruhe
400 µl EDTA (0,5 M, pH 8,0) AppliChem, Darmstadt
auffüllen auf 10 ml mit Reinstwasser
Laufpuffer 10x TBE-Puffer
0,89 M Tris-Base (Tris-Hydroxymethylaminomethan)
AppliChem, Darmstadt
0,89 M Borsäure AppliChem, Darmstadt
0,02M EDTA (pH 8,0) AppliChem, Darmstadt
ad 1000 ml Reinstwasser
Gel
Es wurde ein 2%iges Agarose-Gel mit 30 µl Ethidiumbromid (1g/ml) (Eurobio, Les
Ulis Cedex, Frankreich) je 100 ml verwendet.
Marker
50 ng/µl ΦX174 DNA/BsuRI (HaeIII)Marker, 9 MBI Fermentas, St. Leon-Rot
Reverse Transkription
RT-Ansatz
RNA-Menge Äquivalent 1,8 µg
1 µl random hexamer (50 pmol) Invitrogen, Karlsruhe
4 µl 5X Puffer Invitrogen, Karlsruhe
Anhang 122
2 µl DTT (100 mM) MBI Fermentas, St. Leon-Rot
1 µl dNTP (je 500 µM) MBI Fermentas, St. Leon-Rot
0,5 µl RNAse Inhibitor (20 U) MBI Fermentas, St. Leon-Rot
0,5 µl Superscript IITM (100U) Invitrogen, Karlsruhe
ad 20 µl Reinstwasser
Cyclerprotokoll : 65°C 5 min Vorinkubation
(RNA und Primer)
27°C 10 min
42°C 60 min
99°C 60 s
PCR für Standardverdünnungsreihen
PCR-Ansatz
1,5 µl cDNA
17,25 µl Reinstwasser
2,5 µl 10X Puffer ((NH4)2 SO4) MBI Fermentas, St. Leon-Rot
2 µl MgCl2, 2,0 mM MBI Fermentas, St. Leon-Rot
0,25 µl dNTP's, je 100 µM MBI Fermentas, St. Leon-Rot
1 µl Primer FOR/REV je 20 pmol 1 / 1 Invitrogen, Karlsruhe
1 µl Taq-Polymerase 1,0 U MBI Fermentas, St. Leon-Rot
Leptin
Cyclerprotokoll: 95°C 1 min
(simplified hot start 72°C) 40 Zyklen
94°C 40 s
58°C 30 s
72°C 20 s
72°C 5 min
18S rRNA
Cyclerprotokoll: 95°C 1 min
(simplified hot start 72°C) 16 Zyklen
Anhang 123
94°C 40 s
52°C 40 s
72°C 30 s
72°C 5 min
Leptinrezeptor
Cyclerprotokoll: 95°C 1 min
(simplified hot start 72°C) 34 Zyklen
94°C 40 s
53°C 40 s
72°C 30 s
72°C 5 min
G-Protein gekoppelter Rezeptor 41
Cyclerprotokoll: 95°C 1 min
(simplified hot start 72°C) 40 Zyklen
94°C 40 s
55°C 30 s
72°C 20 s
72°C 5 min
Real-time PCR
PCR-Ansatz
Leptin: 4,0 µl cDNA (1:4)
3,8 µl Reinstwasser
18S rRNA: 2,0 µl cDNA (1:40)
5,8 µl Reinstwasser
10,0 µl SybrGreen JumpStartTM Sigma, Saint Louis,
Taq ReadyMixTM Missouri, USA
0,2 µl Referenzfarbstoff (ROX) Sigma, Saint Louis,
Missouri, USA
2,0 µl Primer FOR/REV: Invitrogen, Karlsruhe
je 2 pmol (1 / 1)
Anhang 124
Leptinrezeptor und G-Protein gekoppelter Rezeptor 41:
4,0 µl cDNA (1:4)
5,0 µl Reinstwasser
10,0 µl TaqManUniversal PCR Applied Biosystems,
Master Mix Foster CITY; CA, USA
1,0 µl Custom TaqMan Applied Biosystems,
Gene Expression Assay Foster CITY; CA, USA
Primer FOR/REV: je 18 pmol (1 / 1)
Sonde 5 pmol
Leptin:
Cyclerprotokoll: 50°C 1 s
95°C 10 min
40 Zyklen
95°C 15 s
60°C 40 s
Leptinrezeptor und G-proteingekoppelter Rezeptor 41:
Cyclerprotokoll: 50°C 1 s
95°C 10 min
40 Zyklen
95°C 15 s
60°C 60 s
18S rRNA:
Cyclerprotokoll: 50°C 1 s
95°C 10 min
28 Zyklen
95°C 15 s
60°C 60 s
Anhang 125
Tab. 5: Vergleichende Übersicht der Mittelwerte und Quotienten aus der relativen RNA-Quantifizierung in den verschiedenen Geweben (Mittelwerte ± SEM).
mRNA Gewebe
Mittelwert
Propionat-
gruppe
(MW ± SEM)
Mittelwert
Kontrollgruppe
(MW ± SEM)
MW
Propionat
/ MW
Kontrolle;
Faktor
(1/x)
p-
Wert
perirenales
Fett (5,50 ± 1,78) · 10-3 (1,71 ± 1,05) · 10-3 3,2 0,081
Leptin subkutanes
Fett (7,56 ± 2,07) · 10-3 (3,99 ± 0,47) · 10-3 1,9 0,106
perirenales
Fett (6,71 ± 2,09) · 10-6 (2,82 ± 0,76) · 10-5 4,2 0,042
subkutanes
Fett (5,94 ± 1,36) · 10-5 (2,65 ± 1,71) · 10-4 4,5 0,286
Leber (3,58 ± 1,71) · 10-4 (9,29 ± 2,55) · 10-4 0,38 (2,6) 0,127
Leptin-
rezeptor
(obRb)
Muskel (2,01 ± 1,08) · 10-5 (3,48 ± 1,01) · 10-5 0,57 (1,7) 0,338
perirenales
Fett (2,01 ± 0,83) · 10-5 (2,35 ± 0,84) · 10-5 0,85 (1,2) 0,756
GPR41 subkutanes
Fett (1,02 ± 0,39) · 10-4 (8,51 ± 1,59) · 10-6 12 0,029
Tab. 6: Freie Fettsäuren im Blutserum. Ergebnisse der Messungen in jeweils den ersten und letzten drei Blutproben eines Versuchsteiles (Miitelwert mit SEM; n=6)
Trächtig Laktierend
Hypergly-
kämischer
Clamp
Euglykämisch/
hyperinsulin-
ämischer Clamp
Hypergly-
kämischer
Clamp
Euglykämisch/
hyperinsulin-
ämischer Clamp
Versuchs-
beginn 0,52 ± 0,05 mM 0,52 ± 0,04 mM 0,57 ± 0,08 mM 0,98 ± 0,12 mM
Versuchs-
ende 0,21 ± 0,02 mM 0,25 ± 0,00 mM 0,23 ± 0,04 mM 0,31 ± 0,05 mM
Danksagung
Frau Prof. Dr. Dr. Helga Sauerwein danke ich ganz herzlich für die Überlassung des
Themas zur Anfertigung meiner Dissertation. Insbesondere bedanke ich mich für
ihren Rat und die Unterstützung, mit denen sie jederzeit zur Seite stand, sowie für
ihre Motivation, Geduld und Vertrauen in allen Phasen dieser Arbeit.
Herrn Prof. Dr. Gerhard Breves danke ich für die Übernahme des Referates.
Der H. Wilhelm Schaumann Stiftung danke ich für die finanzielle Unterstützung.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Manfred Mielenz für seine große Unterstützung
in allen inhaltlichen und methodischen Fragen. Mit unerschöpflicher Begeisterung
gab er mir in vielen fruchtbaren Diskussionen Anregungen und Ideen für meine
Studien.
Ich danke allen Mitarbeitern des Instituts für ihre enorme Mithilfe in Rat und Tat,
Hannelore Brüssel, Iris Gockel-Böhner, Barbara Heitkönig, Inga Hofs, Isabella Israel,
Birgit Mielenz, Ulrike Patzwaldt und Karin Strack, sowie den ehemaligen
Auszubildenden Pascal Paschenda, Daniela Wanzek, Ursula Daniels, Tanja Wiegel
und Jens Wohlmann für ihre Einsatzfreude auch bei Frost und Kälte.
Meinen Doktorandenkommilitoninnen Barbara, Claudia, Maria, Sabrina, Simone und
Ute danke ich für Zuspruch und offene Ohren bei freudvollen Zusammenkünften und
hilfreichen Diskussionen.
Außerdem möchte ich mich bei Herrn Jark, Frau Hieronymus und Herrn Hauser für
die moralische Unterstützung bedanken.
Meiner Familie und Freunden möchte ich danken, da jeder in seiner Art zum
Gelingen der Arbeit beigetragen hat, und vor allem Sybille, für ihre Liebe, Kraft und
Vertrauen.
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