Universität Hohenheim
Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen
Prof. Dr. Andreas Schaller
Die Oxophytodiensäure-Reduktase (OPR3) aus Tomate � molekulare und phänotypische Charakterisierung einer
RNAi-Pflanze
Diplomarbeit vorgelegt von Andreas Klemm
Hohenheim, Januar 2006 betreut von Dr. Annick Stintzi
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis.............................................................................................................................I
Zusammenfassung.........................................................................................................................IV
1. Einleitung ....................................................................................................................................1
1.1 Der Oktadekanoidweg...........................................................................................................3
1.2 Der Wundsignalweg � die Wundsignaltransduktion.............................................................7
1.3 Der Oktadekanoidweg während der Blütenentwicklung ....................................................10
1.4 Die Erkennung der Jasmonsäure .........................................................................................12
1.5 Durch Verwundung induzierbare Gene...............................................................................14
1.6 Idee und Ziel der Arbeit ......................................................................................................16
2 Material und Methoden ..............................................................................................................17
2.1 Organismen .........................................................................................................................17
2.1.1 Pflanzliches Material....................................................................................................17
2.2 Oligonukleotide...................................................................................................................17
2.3 Puffer und Lösungen ...........................................................................................................17
DNA-Extraktion ....................................................................................................................17
Gelelektrophorese..................................................................................................................18
Proteinextraktion ...................................................................................................................18
Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (DISK-PAGE) und Western-Blot ......19
RNA-Extraktion ....................................................................................................................21
Northern Blot.........................................................................................................................22
2.4 Sonstige Puffer, Lösungen, Materialien..............................................................................23
2.5 Medien und Stammlösungen...............................................................................................24
2.5.1 Stammlösungen Antibiotika.........................................................................................24
2.5.2 Medien..........................................................................................................................24
2.6 Enzyme................................................................................................................................25
2.7. Methoden............................................................................................................................25
2.7.1 DNA-Isolation aus Pflanzenmaterial ...........................................................................25
2.7.2 Polymerase Kettenreaktion (PCR) ...............................................................................25
2.7.3 Auftrennung und Sichtbarmachung der DNA..............................................................26
Zusammenfassung
II
2.7.4 Isolierung von Proteinen aus Blattmaterial von Tomaten............................................26
2.7.5 Entfernung sämtlicher Kontaminationen des Proteinextrakts......................................26
2.7.6 Antikörperaufreinigung aus Serum ..............................................................................27
2.7.7 Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (DISK-PAGE) und Western-Blot
...............................................................................................................................................27
2.7.8 RNA-Extraktion aus Blattmaterial ...............................................................................28
2.7.9 Northern Blot................................................................................................................30
2.7.10 Sterilisation der Samen und Anzucht der Keimlinge .................................................31
2.7.11 Emaskulation von Tomatenblüten..............................................................................31
2.7.12 Sammeln von Pollen und Bestäubung von emaskulierten Pflanzen ..........................32
2.7.13 In vitro-Pollenkeimung ..............................................................................................32
2.7.14 Ernte der Tomaten und Gewinnung der Samen .........................................................32
2.7.15 Präparation der Embryonen........................................................................................33
2.7.16 Fixierung und Einbettung von Samen in TechnoVit 7100.........................................33
2.7.17 Färbemethoden der Schnitte.......................................................................................34
2.7.18 Statistische Analysen..................................................................................................34
3. Ergebnisse .................................................................................................................................35
3.1 Phänotypische Charakterisierung der LeOPR3-RNAi-Tomaten-pflanzen .........................35
3.1.1 Das OPR3-RNAi-Konstrukt.........................................................................................35
3.1.2 Tragen die Pflanzen das RNAi-Konstrukt?..................................................................36
3.1.3 Ist die Expression von OPR3 unterdrückt? ..................................................................37
3.1.4 Phänotyp der opr3-Pflanzen.........................................................................................38
3.1.5 Pollenanalyse................................................................................................................39
3.1.6 Generierung von Früchten und Samen.........................................................................40
3.1.7 Rückgewinnung der Fertilität durch Jasmonsäure .......................................................47
3.1.8 Fruchtbildung ohne Befruchtung (Parthenocarpie)......................................................48
3.1.9 Luftwurzelähnliche Strukturen.....................................................................................49
3.2 Molekulare Charakterisierung der opr3-RNAi-Tomatenpflanzen......................................50
3.2.1 Akkumulieren Proteinaseinhibitoren nach Verwundung? ...........................................50
3.2.2 Ist OPDA oder Jasmonsäure das transportierte Signal.................................................52
4. Diskussion .................................................................................................................................57
4.1 Ist OPDA ein Wundsignal? .................................................................................................58
4.2 Einfluss von OPDA und JA auf die Entwicklung ...............................................................60
Zusammenfassung
III
4.3 Ausblick ..............................................................................................................................63
5 Verzeichnisse .............................................................................................................................64
5.1 Literatur...............................................................................................................................64
5.2 Abbildungen und Tabellen ..................................................................................................71
Abbildungen ..........................................................................................................................71
Tabellen.................................................................................................................................76
5.3 Erläuterungen und Abkürzungen ........................................................................................76
Erläuterungen ........................................................................................................................77
Abkürzungen .........................................................................................................................77
Eidesstattliche Erklärung...............................................................................................................81
Danksagung...................................................................................................................................82
Zusammenfassung
IV
Zusammenfassung
Mit Hilfe von RNA-Interferenz (RNAi) wurde in Tomatenpflanzen das Gen, welches für die 12-
Oxophytodiensäurereduktase (OPR3) kodiert ausgeschalten. Dieses Gen kodiert für ein Enzym
des Oktadekanoidwegs, welcher in Pflanzen zur Bildung von Jasmonaten führt. Zu den Jasmo-
naten werden Jasmonsäure (JA), Methyljasmonsäure (MeJA) und deren zyklische Vorstufen �
also auch OPDA � gezählt. OPR3 katalysiert unter Beteiligung von NADPH als Reduktionsmit-
tel die Umsetzung von (9S, 13S)-12-Oxophytodiensäure (OPDA) zu 3-oxo2(2�[Z]-Pentenyl)-
Cyclopentan-1-Oktansäure (OPC8:0). Für diese Arbeit standen 31 unabhängig transformierte
transgene Linien in der T1 Generation zur Verfügung. Keine der 31 transgenen Pflanzen bildeten
innerhalb von sechs Monaten Früchte. Westernblots von Proteinextrakten aus sechs zufällig aus-
gewählten Linien zeigten, dass das OPR3-Protein nicht nachzuweisen war, und auch nach Ver-
wundung nicht induziert wurde. Es wurde geschlossen, dass die Herabregulierung von OPR3
einen Einfluss auf die Fruchtentwicklung hat. Mit Hilfe von in vitro Pollenkeimungsversuchen
konnte gezeigt werden, dass das Herabregulieren von OPR3 in Tomate, wie auch in Arabidopsis
thaliana, zu einer männlichen Sterilität führt. Durch Rückkreuzungen mit Pollen, welcher von
Wildtyppflanzen auf opr3-Blüten und Pollen welcher von opr3-Pflanzen auf Wildtypblüten
übertragen wurde, konnte gezeigt werden, dass das Transgen einen Effekt auf die Entwicklung
des Embryos hat. In beiden Fällen zeigte ein Teil der Samen einen Entwicklungsdefekt, und
einen Arrest der Embryonalentwicklung im globulären Stadium. Über PCR konnte gezeigt
werden, dass diese Embryonen das Transgen enthielten, nicht jedoch die Kotyledonen normal
entwickelter Samen. Aus diesem Ergebnis wurde geschlossen, dass Jasmonsäure nicht nur auf
die Reifung und Freisetzung des Pollens, sondern auch auf die Entwicklung des Samens und
Embryos einen Einfluss ausübt. Acht Monate nach dem die opr3-Pflanzen in das Gewächshaus
gebracht wurden, bildeten einige parthenocarpische Früchte und Adventivwurzeln. Ein Grund
für diese Entwicklungen könnte eine virale Infektion der Pflanzen sein, die Einfluss auf den
Hormonhaushalt der Pflanzen nahm.
Verwundungen aktivieren den Oktadekanoidweg, dieser löst sowohl lokal als auch systemisch
die Bildung von Abwehrgenen aus. Obwohl bereits bekannt ist, dass Jasmonsäure ein Signalmo-
lekül der Wundreaktion darstellt, ist die opr3-Mutante in Tomate ein sehr gut geeignetes Werk-
zeug, um zu testen, ob OPDA � wie in Arabidopsis � die Bildung und Akkumulation von Ab-
wehrproteinen auslösen kann. Hierzu wurden Pfropfungen zwischen Wildtyppflanzen, opr3- und
aos-Pflanzen hergestellt. Diese Untersuchungen führten zu keinem klaren Ergebnis. Eine mögli-
Zusammenfassung
V
che Ursache dafür liegt in einer im Versuchszeitraum aufgetretenen viralen Infektion, die zu ei-
ner Beeinträchtigung der Wundreaktion geführt haben könnte.
1 Einleitung
1
1. Einleitung
Seit dem es auf diesem Planeten Lebewesen gibt, müssen sich diese an ihre Umwelt anpassen.
Jeder Organismus versucht sich seiner Umgebung so anzugleichen, dass er an die sich ihm bie-
tenden Umweltbedingungen optimal angepasst ist. Diese Anpassungen bedeuten Stress.
Hieraus ist zu erkennen, dass jeder Organismus, egal ob Mensch, Tier oder Pflanze verschiede-
nen Stressoren ausgesetzt ist. Stress ist also ein sehr weit gefasstes Phänomen, Menschen und
viele andere Tiere sind in der Lage den Stressoren physisch auszuweichen und flüchten, um ei-
nen anderen Standort zu wählen, an welchen sie ein Feind nicht verfolgen kann. Pflanzen sind �
von einigen Algen abgesehen � nicht in der Lage ihren Standort aktiv zu verändern, um zum
Beispiel an einen sonnigeren oder schattigeren Platz zu gelangen. Hat ein Same gekeimt, so
muss der Keimling mit den vor Ort vorhandenen Bedingungen zurecht kommen.
Aus diesem Grund haben Pflanzen im Laufe ihrer Entwicklung andere Strategien entwickeln
müssen, um sich zum Beispiel gegen Fraßfeinde zu wehren. Hierzu gehören zum einen morpho-
logische Anpassungen, wie z. B. die Brennhaare der Brennnessel, kein Kaninchen wird jemals
mehr Brennnesseln verzehren wollen, nachdem es von ihr genesselt wurde. Im Gegenzug wird es
auch keine Buntnesseln mehr fressen wollen, die in ihrer Gestalt der Brennnesseln ähnlich sind,
jedoch nicht nesseln.
Nicht nur in ihrer Gestalt sondern auch in ihrer molekularen Zusammensetzung sind Pflanzen in
der Lage sich gegen Fraßfeinde zu wehren. Zu diesen molekularen Zusammensetzungen zählt
die Jasmonsäure (JA Jasmonic acid) (Abb. 1).
Dieses Molekül reguliert vielerlei Abläufe und Prozesse in Pflanzen. Hierzu gehören eine Viel-
zahl von Regulationen im Wachstum und anderen Entwicklungsvorgängen. Darüber hinaus dient
Jasmonsäure als Signalmolekül bei verschiedensten Stressoren [Berger, 2002].
Nicht nur in Arabidopsis thaliana, einer allgemeinen Modellpflanze, aber auch in weiteren
Pflanzen ist das Vorkommen von Jasmonsäure belegt, in welchen sie die verschiedensten Pro-
Abb. 1: 3R,7S-Jasmonsäure (JA)
37
COOH
O
1 Einleitung
2
zesse reguliert [Creelman und Mullet, 1997]. So wirkt in hohen Dosen Jasmonsäure auf das
Wurzelwachstum, sowie auf das Wachstum der Pflanzen hemmend, des weiteren steuern sie
Fruchtbildung [Hause, et al., 2000; Devoto und Turner, 2003]. Außerdem haben Jasmonate eine
ausgesprochene Seneszenzwirkung auf Pflanzen [Koda, 1997].
Abbildung 2 zeigt die Wirkungen von Jasmonaten auf Stressoren (linker Teil des Bildes) und auf
die Entwicklung (rechter Teil des Bildes) der Pflanzen. Auf alle kann jedoch nicht näher einge-
gangen werden kann.
Am meisten ist von den Funktionen der Jasmonsäure über Mutanten in Arabidopsis bekannt,
welche über sogenannte loss-of-function Mutationen nicht mehr in der Lage sind Jasmonsäure zu
bilden oder zu erkennen.
In dieser Pflanze bewirkt Jasmonsäure die Entwicklung des männlichen Gametophyten. Dies
beinhaltet die Verlängerung der Filamente der Antheren, das Öffnen des Stomiums, so dass die
Pollen, welche ebenfalls mit Hilfe von Jasmonsäure zu ihrer trinuklearen reifen Form heranrei-
fen, auf den Stempel des weiblichen Gametophyten gelangen können. Wird dennoch Pollen frei-
gesetzt, so besitzt dieser eine stark verminderte Keimfähigkeit [McConn und Browse 1996; San-
ders et al., 2000; Stintzi und Browse 2000; Ishiguro et al., 2001; Park et al., 2002; von Malek et
Abb. 2: Die Wirkungen von Jasmonaten auf Stres-soren, und ihre Beteiligung an der pflanzlichen Ent-wicklung [aus Wasternack, 2005].
1 Einleitung
3
al., 2002]. Der Effekt der Sterilität kann durch Besprühen der Pflanzen, welche sich im Stadium
12 der Blütenentwicklung befinden, mit MeJA wieder rückgängig gemacht werden [Sanders et
al., 2000; Stintzi und Browse 2000].
Jasmonsäure reguliert die weiteren molekularen Abläufe nach Verwundung und abiotischen
Stress (Abb. 2), indem sie in die Genexpressionen eingreift, welche der Pathogen- und Insekten-
abwehr dienen.
1.1 Der Oktadekanoidweg
Die Synthese von Jasmonsäure wird über den Oktadekanoidweg bewerkstelligt. Die biologische
Funktion der einzelnen Enzyme des Oktadekanoidwegs konnte durch Mutationen der jeweiligen
Gene gezeigt werden. An der Bildung von JA sind die Enzyme LOX, AOS1, AOC, OPR3 sowie
Enzyme der β-Oxidation beteiligt.
Über den Oktadekanoidweg (Abb. 3) wird zunächst über das LOX-Enzym eine Peroxygruppe an
Position 13 gebildet, es entsteht 13-Hydroperoxylinolensäure. Diese wird mittels AOS zu einer
Epoxylgruppe umgewandelt, wobei Allenoxid entsteht. Dieses Allenoxid dient als Substrat für
AOC. AOC bildet den Pentanonring zwischen der Position 9 und 13 aus, wobei 12-
Oxophytodiensäure (OPDA) synthetisiert wird. OPR3 reduziert in einer NADPH-abhängigen
Reaktion die Doppelbindung an der Stelle 10 und 11.
Für die 12-Oxophytodiensäurereduktase gibt es je nach Pflanze unterschiedliche Anzahl der Iso-
formen, bislang sind im Reis dreizehn, in Arabidopsis fünf und in Tomate drei Typen bekannt
[Review: Schaller et al., 2005].
Die OPRs aus Tomate und OPR1,2,3 aus Arabidopsis thaliana katalysieren die Reduktion von
α,β-ungesättigten Kohlenstoffverbindungen [Schaller et al., 2000; Straßner et al., 1999]. Zu die-
ser Gruppe gehört auch die OPDA, welche das Substrat für die OPR3 ist, denn nur diese ist in
der Lage in vivo OPDA zu OPC8:0 umzusetzen [Stintzi and Browse., 2000]. Keine der anderen
Isoformen kann diese Reaktion im Oktadekanoidweg ersetzen.
Die Bedeutung der weiteren Isoformen der OPRs bleiben bislang unklar. OPR1 aus Tomate hin-
gegen ist in der Lage cis(-)-OPDA und verwandte Oxylipine umzusetzen [Strassner et al., 1999;
Breithaupt et al., 2001; Review: Schaller et al., 2005], jedoch scheint OPR3 besser in der Lage
zu sein, diese Aufgabe zu übernehmen, da sie eine breitere Öffnung zum aktiven Zentrum hat als
OPR1, so dass OPDA besser an dieses gelang. Dies würde auch erklären, warum LeOPR3 nicht
so wählerisch erscheint, was die beiden Enantiomere von OPDA angeht (cis(+) und cis(-)-
1 Einleitung
4
OPDA) [Review: Schaller et al., 2005]. Wird LeOPR3 auskristallisiert, so bildet sich ein soge-
nanntes Homodimer, wobei das Dimer als inaktive Form gilt, wobei jede das aktive Zentrum der
anderen blockiert [Breithaupt C, Clausen T, Macheroux P and Schaller A, unveröffentlicht]. Ob
diese Regulation der OPR3 jedoch
auch in der Natur (in vivo) Anwen-
dung findet bleibt indes unbekannt
[Review: Schaller et al., 2005].
Durch diese Reaktion wird OPC8:0
gebildet. Über drei Zyklen der der β-
Oxidation wird schließlich (+)-7-iso-
Jasmonsäure produziert. Diese fällt
in (-)-Jasmonsäure, welche chemisch
stabiler ist. Diese Form scheint aber
keine biologische Aktivität zu besit-
zen[Review: Schaller et al., 2005].
Die Synthese von Jasmonsäure fin-
det in verschiedenen Zellorg-anellen
statt. Bis zur Bildung von OPDA
verläuft der Oktadekanoid-weg in
den Plastiden ab (Abb. 4).
COOH
COOH
HOO
COOH
O
O
COOH
O
COOH
O
COOH
O
COOH
AOC
OPR3
AOS
LOX
3 Zyklen b-Oxidation
α-Linolensäure
13-Hydroperoxylinolensäure
(9S,13S)-12-Oxophytodiensäure (OPDA)
3-oxo-2(2'(Z)-Pentenyl)cyclopentenyl Oktansäure (OPC 8:0)
(+)-7-iso-Jasmonsäure (-)-Jasmonsäure
12,13-Epoxyoktatriensäure (Allenoxid)
3 Zyklen β-Oxidation
Abb. 3: Oktadekanoidweg nach Schaller et al., 2005
1 Einleitung
5
In Arabidopsis sind die Membranen mit Galakto-, Sulfo- und Phospholipiden besetzt. Aus ihnen
werden die primären Ausgangsstoffe Linolensäure und ihre verwandte Hexadecatriensäure
(16:3) durch Lipasen freigesetzt (Abb. 4). Somit dient als Vorstufe auch die Hexadecatriensäure
der LOX als Substrat. Bei dieser Reaktion entsteht 11-Hydroperoxy-Hexatriensäure. Die weite-
ren Schritte sind denen der zuvor beschrieben ähnlich, nur mit dem Unterschied, dass die Seiten-
kette zwei Kohlenstoffatome weniger besitzt. Aus diesem Weg entsteht dinor-OPDA (dnOPDA),
bei welcher nur noch zweimal die Seitenkettenverkürzung über die β-Oxidation ablaufen muss,
um Jasmonsäure zu bilden.
Abb. 4: Biosynthese der Jasmonsäure in ihren Zellorganellen, Farben, welche kräftig gedruckt sind experimentell nachgewiesene Daten, während die transpa-rente Hypothesen präsentieren. Die gepunkteten Pfeile weisen auf Hypotheti-schen Transporte weg hin. [aus Schaller, et al., 2005]
1 Einleitung
6
Wie auch aus Abb. 5 ersichtlich gibt es noch eine weitere Quelle von OPDA. So kann OPDA
auch aus dem, sich in den Membranen der Chloroplasten von Arabidopsis, befindlichen Mole-
küls Monogalaktosyldiacylglycerol (MGDG-O) (Abb. 5) abgespalten werden. MGDG-O ist an
der sn1-Stelle mit OPDA verestert, welche bei Bedarf ebenfalls freigesetzt werden kann. Stel-
mach et al. (2001) zeigten, dass durch eine sn1-spezifische Lipase, welche von einem pathoge-
nen Pilz stammt, OPDA direkt abgetrennt werden kann. Diese Lipase könnte somit ein Reporter
für Pilzbefall sein.
Über 18O-markiertes OPDA konnten Vick und Zimmermann 1983 zeigen [Review: Schaller et
al., 2005], dass die Bildung von Jasmonsäure über drei β-Oxidationsschritte laufen muss. Denn
sie fanden zwei markierte Zwischenstufen, diese bestanden aus 16 bzw. 14 Kohlenstoffatomen,
sie waren jeweils an der Acylkette um zwei bzw. vier Kohlenstoffatome verkürzt. An der β-
Oxidation in Peroxysomen sind drei Enzyme beteiligt: Acyl-CoA-Oxidase (ACX), das multi-
funktionale Protein (MFP) � dieses beinhaltet die l-3-Hydroxyacyl-CoA Hydrolyase, l-3-
Hydroxyacyl-dehydrogenase, d-3-Hydroxyacyl-CoA-Epimerase und die Delta(3), Delta(2)-
enoyl-CoA-Isomerase [Richmond und Bleecker 1999] � und das L-3-Ketoacyl-CoA-Thiolase
(KAT). Alle diese Enzyme katalysieren das Abschneiden von Acetatuntereinheiten von Acyl-
CoA-Gruppen. Alle Untereinheiten sind in Arabidopsis nachgewiesen [Review: Schaller et al.,
2005]. MFPs haben keine besondere Substratspezifität, im Gegensatz zu den vier in Arabidopsis
bekannten ACX-Untertypen.
Abb. 5: MGDG-O und OPDA
OH
OH
OH
OH
O
OH
CH2
CH
CH2 O C
O C
O
O
O COOH
O
OPDA
1 Einleitung
7
1.2 Der Wundsignalweg – die Wundsignaltransduktion
Bis heute sind mehr als hundert verschiedene Pflanzenarten bekannt, welche auf Verwundung
mit systemischen Signalen reagieren. Diese Signale sind von chemischer Natur. Sie werden als
Reaktion auf Verwundung in Blättern produziert und über den das pflanzliche System in den
gesamten Organismus transportiert [Karban und Baldwin, 1997]. Zu den Verwundungen zählen
nicht nur mechanische sondern vielmehr auch die, welche von herbivoren Insekten und manchen
Pathogenen ausgehen [Pautot et al., 1993; Staswick et al., 1999].
Mit am besten ist die Signalkaskade, welche sich nach einer Verwundung anschließt, in Solana-
ceen untersucht.
Wird eine Pflanze von Insekten attakiert und angefressen, so kommt es in Tomate zur Bildung
von Systemin, einem 18 Aminosäure langen Oligopeptid [Pearce et al., 1991]. Dieses wird von
seinem aus etwa 200 Aminosäuren bestehenden Vorläuferprotein �Prosystemin� abgespalten
[McGurl et al., 1992; Ryan 2000].
Systemin geht nach seiner Freisetzung eine Bindung mit seinem Membranrezeptor SR160
[Meindl et al., 1998; Scheer et al., 1999] ein und aktiviert somit in einem bis jetzt unbekannten
Prozess eine Lipase, welche zur Entlassung von α-Linolensäure aus der Zellmembran führt.
Abb. 6: Signalkaskade nach (herbivorer) Verwundung zur Bildung von Jasmonsäure und schließlich auch von Ab-wehrgenen. Mit Oktadekanoidweg, welcher zur Bildung von Jasmonsäure führt.
1 Einleitung
8
Durch den Oktadekanoidweg wird dann Jasmonsäure gebildet (Abb. 3 & 6), JA löst schließlich
die Induktion von Abwehrgenen aus (Abb. 6).
Die Tatsache, dass Systemin im Signalweg einer Verwundung eine Rolle spielt, wurde mit Hilfe
einer Pflanze gezeigt, bei welcher Prosystemin über einen Antisense-Ansatz ausgeschalten wur-
de. Diese Pflanzen waren nicht in der Lage, systemische Wundreaktionen auszulösen [McGurl et
al., 1992; Narvaez-Vasquez et al., 1994]. Wird aber die Regulation von Systemin unter einen
konstitutiven Promotor (z. B. der 35S-CaMV-Promotor) gestellt, so bilden diese Pflanzen stän-
dig PIs [McGurl et al., 1994].
Mittels Pfropfungsuntersuchungen wurde festgestellt, dass ein durch Verwundung induziertes
Signal sich über die gesamte Pflanze erstreckt und dieses zusätzlich durch die Pfropfungsstelle
hindurch geleitet wird. Bewiesen wurde dies durch die Feststellung, dass sich PIs, Polyphenol-
oxidasen (PPOs) und andere Oxidasegene im Pfröpfling bildeten [Ryan und Moura, 2002]
Interessant ist, dass Systemin ein transportiertes Signal sein könnte, denn wurde Systemin wel-
ches radioaktiv markiert wurde auf die Wunde aufgetragen, so fand man es kurze Zeit später im
Phloem wieder [Pearce et al., 1991; McGurl et al., 1992].
Systemin könnte aber auch nur an der Bildung eines mobilen Signals beteiligt sein, dies schließt
diesen Pfropfungsversuch nicht aus, bei welchem die Überexpression von Prosystemin im Wur-
zelstock lokalisiert war und der Wildtyppfröpfling eine erhöhte Menge an PIs zeigte, ohne dass
hier eine Verwundung stattgefunden hatte [McGurl et al., 1994].
Je nach Lage der Mutation im Oktadekanoidweg haben die sind die Pflanzen gegen Pathogene
und Insekten resistent. Zu diesen Mutanten gehören die Arabidopsis Triplemutante fad3, fad7
und fad8 (fad378) [McConn and Browse, 1996] und aus Tabak, Nicotiana atenuata, NaLOX
[Halitschke und Baldwin, 2003], und die Arabidopsis aos-Mutante [Stintzi, unveröffentlicht].
Die fad378-Mutante zeigt einen Defekt in der Bildung von Desaturasen. Diese sind nötig, um die
ungesättigten Fettsäuren 16:3 und 18:3 aus 16:2 und 18:2 zu produzieren. Diese gelten als Vor-
stufe in der Erzeugung von Jasmonsäure. Diese Mutante zeigt eine Anfälligkeit gegen Insekten-
fraß [McConn et al., 1997] sowie gegen Pilzbefall durch Pythium mastophorum [Vijayan et al.,
1998].
In Tomate ist lediglich eine Mutante (spr2) charakterisiert, welche mit der Triplemutante fad378
verwandt ist. Sie kodiert für die Fettsäuredesaturase LeFad7. Sie gehört zu den ω3-Fettsäurende-
saturasen, welche die Umsetzung von Dien- (zweifach ungesättigt) zu Trienfettsäuren (dreifach
ungesättigt) in Chloroplasten über den sogenannten prokaryotischen und den eukaryotischen
Weg katalysieren; [Browse und Somerville, 1991; Wallis und Browse, 2002; Li et al., 2003],
somit fehlt den Pflanzen ein wichtiger Ausgangsstoff für Jasmonate � nämlich die Fettsäuren
1 Einleitung
9
16:3 und 18:3. Wie die Dreifachmutante in Arabidopsis zeigt auch die LeFad7 eine Anfälligkeit
gegenüber Fraßfeinden (Manduca sexta). Im Vergleich zum Wildtyp war sie nicht in der Lage,
Proteinaseinhibitoren zu bilden [Li et al., 2003].
Die NaLox-Mutante war gegen den Fraß von Raupen des Tabakschwärmers (Manduca sexta)
anfällig und zeigte somit eine verminderte Resistenz [Halitschke und Baldwin, 2003].
Die aos-Mutante in Arabidopsis ist nicht in der Lage OPDA und Jasmonsäure nach Verwundung
zu bilden [Park et al., 2002]. Sie besitzt eine verminderte Resistenz gegen Insekten [A. Stintzi,
unveröffentlicht], AOS scheint darüber hinaus einen Einfluss auf die Induktion von Jasmonsäu-
re-abhängigen Genen zu haben [Park et al., 2002].
In Tomatenpflanzen wird Allenoxidcyclase (AOC) in Leitbündeln gebildet [Hause et al., 2003b;
Stenzel et al., 2003], wie AOS ist es ebenfalls wundinduzierbar. Nach exogener Gabe von JA
wird die Produktion von AOC � wie AOS � hochreguliert, dies bestätigt die Rückkopplung der
Jasmonsäure und ihre eigene Expression durch sich selbst. Dies dient der Pflanze der erhöhten
Bildung von Abwehrgenen [Ryan und Moura, 2002; Stenzel et al., 2003].
Die opr3-Mutante, welche in der Lage ist OPDA, jedoch nicht JA zu bilden, ist gegen die Larven
der Trauermücke (Bradysia impatiens) und dem Pilz Alternaria brassicicola resistent [Stintzi et
al., 2001]. Dies würde bedeuten, dass OPDA Jasmonsäure zu einem gewissen Maß in der Wund-
antwort/Pathogenabwehr ersetzen kann. So wurde herausgefunden, dass OPDA in der Lage ist
Gene zu aktivieren, welche für die JA-Antwort von Wichtigkeit sind [Stintzi et al., 2001; Mithö-
fer et al., 2005].
Eine mögliche Aufgabe von OPR1 und OPR2 könnte die Detoxifikation von Reaktiven Sauer-
stoffarten sein, so wurden eine Induktion der Bildung dieser beiden Untertypen nach entspre-
chender Behandlung in Arabidopsis nachgewiesen [Review: Schaller et al., 2005].
Die acx1-Mutante in Tomaten sind anfällig gegen Herbivorie. Diese Mutante synthetisiert den
ersten Schritt der β-Oxidation des Oktadekanoidwegs.
1 Einleitung
10
1.3 Der Oktadekanoidweg während der Blütenentwicklung
Die fad378-Mutante in Arabidopsis weist eine Infertilität auf, diese kann durch zuführen von α-
Linolensäure wieder hergestellt werden [McConn und Browse, 1996].
Wie bereits erwähnt hat der Oktadekanoidweg und JA einen Einfluss auf die Blütenentwicklung.
So konnte über AOS::uidA (uidA ist ein Reportergen, welches zur Lokalisation der Genexpressi-
on verwendet wird, indem man es mit dem entsprechenden Promotor (in diesem Fall für AOS),
fusioniert.) gezeigt werden, dass eine GUS-Expression von AOS in frühen Stadien der Karpelle-
nentwicklung, an der Basis der elongierten Antherenfilamente und im reifenden Pollen [Ku-
bigsteltig et al., 1999] zu finden war. Diese Expression zeigt auch, dass Jasmonsäure in der Blü-
tenentwicklung [Hause et al., 2000] benötigt wird.
In Tomaten ist AOS im Stroma der nach innen gefalteten Chloroplastenmembran lokalisiert
[Fröhlich et al., 2001]. AOS ist in vielen Pflanzen wundinduzierbar, des weiteren kann es durch
exogene Gabe von Jasmonsäure und OPDA hochreguliert werden. Dies bestätigt das Vorhanden-
sein einer positiven Rückmeldeschleife, welche die Bildung von Jasmonsäure nach Verwundung
steigert [Harms et al., 1998; Laudert und Weiler 1998; Maucher et al., 2000; Strassner et al.,
2002; Review: Schaller et al., 2005].
In Blüten konnte nicht die selbe Menge an JA bestimmt werden wie in anderen Geweben, daraus
wird geschlossen, dass Jasmonsäure in verschiedenen pflanzlichen Organen unterschiedlich re-
guliert wird [Review: Schaller et al., 2005].
wild type opr3wild typewild type opr3opr3
Abb. 7: Blüte von Arabidopsis im Stadium 13 der Blü-tenentwicklung (oben) und Pollenkeimung (unten), imVergleich von Wildtyp (links) zu opr3-Mutante (rechts).(Bilder freundlicher Weise von Annick Stintzi zur Ver-fügung gestellt)
1 Einleitung
11
Auf Jasmonsäure sprechen nur die Blütenknospen der opr3-Mutanten an, welche sich nicht wei-
ter als Stadium 12 entwickeln, bzw. in diesem arretiert sind. Die in situ-Analysen sowie die
Transkriptanalyse von OPR3 zeigte, dass das Gen im Stempel, den Kelchblättern und an der Ba-
sis der Filamente von Antheren zu finden war. Das Gen fand sich wesentlich früher als das für
die Filamentverlängerung notwendige Entwicklungsprogramm angeschalten wurde [Sanders et
al., 2000] (Abb. 7).
In Tomate hingegen zeigt sich kein Einfluss der Fertilität, bei einer Mutation in acx1. Jedoch
wurde beobachtet, dass die Keimfähigkeit der Samen sehr variabel war. Es wird vermutet, dass
acx1-Pflanzen in der Lage sind Jasmonsäure zu produzieren, so dass die Fertilität nicht beein-
trächtigt ist, dies würde bedeuteten, dass die anderen Isoformen von acx die Biosynthese von
Jasmonaten übernehmen können, so dass das Ausreifen der reproduktiven Gewebe stattfinden
kann [Li et al., 2005].
In Arabidopsis bewirkt Jasmonsäure die Entwicklung des männlichen Gametophyten. Dies be-
deutet, dass die Filamente der Antheren verlängert werden und das Stomium sich öffnet, so dass
die Pollen, welche ebenfalls mit Hilfe von Jasmonsäure zu ihrer trinuklearen reifen Form heran-
reifen, auf den Stempel gelangen können. Wird dennoch Pollen freigesetzt, so besitzt dieser eine
stark verminderte Keimfähigkeit [McConn und Browse 1996; Sanders et al., 2000; Stintzi und
Browse 2000; Ishiguro et al., 2001; Park et al., 2002; von Malek et al., 2002] (Abb. 7).
1 Einleitung
12
1.4 Die Erkennung der Jasmonsäure
In der JA-Signaltransduktionskaskade ist COI1 involviert.
Die coi1-Mutante in Arabidopsis ist nicht in der Lage auf Pathogenbefall zu reagieren, außerdem
lässt sich dieser Effekt durch exogene Gabe von Jasmonsäure bzw. Methyljasmonsäure nicht
rückgängig machen, da die coi1-Mutante gegen Jasmonsäure und � wie der Name sagt � Corona-
tin insensitiv ist. Coronatin ist ein Toxin aus Pseudomonas syringae und ein Strukturanalogon
von Jasmonsäure. Das Toxin hat eine chlorosesinduzierende Wirkung und hat zur Folge, dass
Anthocyane in der Pflanze akkumuliert werden. Wie opr3 zeigt auch coi1 in Arabidopsis eine
starke Beeinflussung der Antheren- und Pollenentwicklung [Feys et al., 1994].
Die Mutanten jin und jar1 (in Arabidopsis) sind ebenfalls Mutanten, welche wie coi1
downstream von Jasmonsäure ihren Defekt haben und zeigen bei einer erhöhten Gabe von MeJA
kein auffällig vermindertes Wachstum der Wurzeln im Vergleich zum Wildtyp [Berger et al.,
1996]. Dies bedeutet, dass die Perzeption von Jasmonsäure gehemmt ist. Interessant ist, dass
diese Mutanten keine Probleme mit der Fertilität haben. Dies bedeutet, dass der Signalweg von
Jasmonsäure in zwei verschiedene Wege aufgespalten sein muss, ein Weg führt zur Expression
von Stressgenen und ein weiterer in die der Fertilität [Xiao et al., 2004] (Abb. 8).
COI1 ist in Arabidopsis ein Protein, welches aus 592 Aminosäuren besteht, und am N-Terminus
eine F-Box und eine 16 Leucin-reiche-Region (LRR) hat. In Pflanzen bilden diese mit Cullin,
RBX1, den Skp1-like Proteinen ASK1 oder ASK2 (eine E3-Ubiquitinligase) einen Komplex,
welcher in seiner Gesamtheit SCFCOI1-Komplex genannt wird [Turner et al., 2002; Xu et al.,
2002, Xiao et al., 2004]. Der Komplex ist ein �Hilfsmittel� welches ermöglicht spezifisch be-
stimmte Substrate, z. B. negative Regulatoren zu ubiquitinylieren und schließlich über das 26S-
Abb. 8: Signaltransduktionskaskade von Jasmonsäure, im Wt (links) und coi1(rechts). Die beiden Substratgruppen (S1 und S2) werden durch das JA-Signal,welches den SCFCOI-Komplex aktiviert, ubiquitinyliert und schließlich über das26S-Proteasom abgebaut. Die beiden Antwortgene (G1 und G2) bilden schließlichdie entsprechenden Antworten (Response I und II) (aus Xiao et al., 2004)
1 Einleitung
13
Proteasom abzubauen. [Xu et al., 2002]. Coi1 ist nicht mehr in der Lage diesen Komplex zu bil-
den, dies hat zur Folge, dass negative Regulatoren über das 26S-Proteasom nicht mehr abgebaut
werden können. Im Modell der in Abbildung 8 gezeigten Signalkaskade könnten die Substrate
S1 und S2 die negativen Regulatoren darstellen. Dies hätte zur Folge, dass die Antwort auf Jas-
monsäure ausfällt [Turner et al., 2002; Xu et al., 2002]. Es wird angenommen, dass diese
Signaltransduktion einmal in Richtung der Fertilität, nämlich der Entwicklung des männlichen
Gametophyten und das zweite Mal die Antwort in Richtung der Wundantwort aufgespalten wird.
Die Annahme, es könnte zwei Substrate für COI1 geben, rührt daher, da über EMS-Mutation
eine Mutante gefunden wurde, welche ein Suppressor für coi1 (COS1) darstellt. Diese Mutante
reagiert auf exogene Gabe von Jasmonsäure oder Coronatin mit einem vermindertem Wurzel-
wachstum, was wiederum dem Wildtyp entspricht, jedoch männlich steril bleibt [Xiao et al.,
2004].
Das für Arabidopsis beschriebene Modell kann wohl auch � wenn auch nur zum Teil � auf To-
mate übertragen werden. So beschrieben Li et al., 2004 eine Mutante, welche Jasmonsäure in-
sensitiv (jai1) war. Diese Mutante wird als Homolog zur Arabidopsis-coi1-Mutante angesehen.
Die beschriebene Mutante zeigte, wie aus deren Namen bereits hervorgeht, genau wie coi1 in
Arabidopsis, keine Reaktion auf exogene Jasmonsäure. Ihr Wurzelwachstum entsprach dem des
Wildtyps ohne MeJA. Im Gegensatz zu Arabidopsis weist die jai1 Mutante in Tomate keine
männliche Sterilität auf, der Pollen keimt zwar etwas schlechter als im Wildtyp, doch trotz einer
verminderten Entwicklungsfähigkeit des Pollens, ist jai1 nicht männlich steril, der Defekt lag
vielmehr im weiblichen Gametophyten. Die reifen Früchte enthielten kleine Samen, welche un-
entwickelt waren und ein geringeres Gewicht als Wildtypsamen hatten. Dass der weibliche Ga-
metophyt einen Defekt zu haben scheint, wurde damit gezeigt, dass in den Blüten von jai1, im
Gegensatz zu Wildtypblüten, welche in einem ähnlichen Entwicklungsstand waren, keine Protei-
naseinhibitorbildung nachzuweisen waren. Mit Spinnmilben unternommene Versuche, bei wel-
chen sich die Tiere zwischen Blättern von Wildtyp und Mutantenpflanzen entscheiden mussten
zeigten, dass diese Tiere sich lieber auf die Blätter der mutierten Pflanze setzten.
Außerdem konnte in der jai1-Mutante keine Bildung von Monoterpenen in unreifen Früchten
nachgewiesen werden. Dies bestätigte die zuvor gemachte Beobachtung, dass Trichome, welche
im Wildtyp diese Terpene bilden, nicht vorhanden waren. Jai1 zeigt auch keine Induktion von
Genen, welche nach der Produktion von Jasmonsäure eine Rolle spielen (s. später) [Li et al.,
2004].
Das LeCOI-Protein wies wie das aus Arabidopsis und Reis eine N-Terminale F-Box und eine
LRR (Leucin Rich Repeat) auf, welche sich ebenfalls 16 mal wiederholte. Ein durch EMS krei-
ertes Allel von jai1 (jai1-2) wurde als Suppressor von jai1-1 erkannt. Es ist ebenfalls nicht in der
1 Einleitung
14
Lage auf JA zu reagieren, jedoch zeigt diese Mutante die Möglichkeit der Akkumulation von
Proteinaseinhibitoren [Li et al., 2004].
1.5 Durch Verwundung induzierbare Gene Strassner et al. zeigten 2002, mittels cDNA-Microarray-Analyse (Abb. 9) , welche Gene in To-
mate nach einer Verwundung angeschalten werden.
Nach Verwundung kommt es in den verwundeten Blättern zur Bildung und Akkumulation der
Transkripte, welche am Oktadekanoidweg beteiligt sind (LOXD, AOS1, AOC und OPR3) (Abb.
9 linke Seite). Werden systemische und verwundete Blätter einer Pflanze miteinander verglichen,
wird eine höhere Konzentration dieser Transkripte in den lokalen Blättern gefunden. Die
Konzentrationen der Abwehrgene ist jedoch in den systemischen und verwundeten Blättern
annähernd die Gleiche. Die Bildung von Jasmonsäure war lokal höher, als systemisch.
Hieraus wird geschlossen, dass Jasmonsäure ein transportiertes Signal der Wundreaktion ist.
Aromatische Aminosäuren spielen in der Stressreaktion ebenfalls eine Rolle, somit wurden auch
diese ebenfalls auf ihren Gehalt untersucht. Nach Verwundung zeigten diese jedoch sowohl im
Vergleich Verwundet/Kontrolle als auch im Vergleich Systemisch/Verwundet keine signifikante
Expressionsänderung.
1 Einleitung
15
Abb. 9: Microarray-Analyse. Links, Vergleich von verwundeten (W) und unverwunde-ten (C=Controle) Blättern (! W/C). Rechts, das Verhältnis von Systemischen (S) zuVerwundeten (W) Blättern. Der obere Teil zeigt das die Gene des Oxilipinstoffwechsels,der mittlere, die der Wundantwort und die der Pathogenabhänhigen Gene, im unterenTeil sind die Gene, welche an der Bildung von aromatischen Aminosäuren benötigtwerden gezeigt [aus Strassner et al., 2002].
1 Einleitung
16
1.6 Idee und Ziel der Arbeit
Von Arabidopsis wissen wir, dass alle Mutanten, welche am Biosyntheseweg der Jasmonsäure
beteiligt sind, männlich steril sind. Fehlt ihnen dazu noch OPDA, so sind sie gegen Insekten-
und Pathogenangriffe anfällig. OPDA ist somit ein Signalmolekül, welches Jasmonsäure in der
Wundantwort ersetzen kann, um Abwehrgene zu bilden.
Des weiteren ist bekannt, dass COI1 ein wichtiges Zwischenprodukt in der Signalkaskade für die
Entwicklung des männlichen Gametophyten, die Ausbildung von Wundantworten sowie für die
Zellelongation während des Wurzelwachstums ist.
Von Tomate wissen wir, dass eine Überexpression von Prosystemin zu einer erhöhten Resistenz
gegen Manduca sexta und zu einer konstitutiven Bildung von Abwehrgenen wie Proteinaseinhi-
bitoren führt.
Es wurde bereits nach Mutanten gesucht, welche nicht mehr in der Lage waren PIs als Folge
einer Verwundung zu bilden. Zu diesen Mutanten gehören die spr2-, acx- und die jai1-Mutante
[Li et al, 2002; Li et al., 2004; Li et al., 2005]. Alle drei Mutanten, einschließlich acx, welche ein
Defekt in der β-Oxidation hat, scheinen gegen Insektenattacken anfällig zu sein. Bezüglich des
Phänotyps sieht es in der Blütenentwicklung in Tomate etwas anders aus als in Arabidopsis tha-
liana, denn die acx-Mutante hat ihren Defekt in der Entwicklung des weiblichen Gametophyten;
und die jai1-Mutante, welche ein Ortholog zur coi1-Mutante in Arabidopsis darstellt ist im Ge-
gensatz zu dieser weiblich steril, und hat einen Defekt in der Trichomentwicklung. Und zu guter
letzt ist die spr2-Mutante fertil.
Eventuell gibt es in Tomate Isoformen dieser Gene, so dass die Jasmonsäuresynthese/-
Erkennung von diesen übernommen werden kann, was das Verständnis dieses Phänomens
schwierig gestaltet. Da bekannt ist, dass keine andere der Isoformen von OPR � außer der OPR3
� an der Bildung von Jasmonsäure beteiligt sind, wäre eine opr3-Mutante in Tomate sehr gut
geeignet, um die Wirkungen von OPDA, bzw. Jasmonsäure in Tomate zu charakterisieren. Der
Schritt von OPDA zu OPC8:0 kann eine opr3-RNAi-Pflanze nicht bewältigen, was zur Folge
hat, dass ihr schließlich Jasmonsäure fehlt.
Das Ziel der Arbeit ist somit die molekulare und phänotypische Charakterisierung einer Toma-
tenpflanze, welcher mittels RNA-Interferenz die 12-Oxophytodiensäurereduktase 3 (OPR3) still-
gelegt wurde.
2 Material und Methoden
17
2 Material und Methoden
2.1 Organismen
2.1.1 Pflanzliches Material
Lycopersicon esculentum cv. UC82B ROYAL SLUIS (Holland)
Lycopersicon esculentum cv. UC82B mit einem OPR3-RNAi-Konstrukt transformiert
2.2 Oligonukleotide
OPR3-Primer (69) cccgggggatccgaattctaatgcctgatggaactcatggg
FAD2.fw ctctcttgaatcgttaccac
FAD2.rev ggagtataagcagatctatc
2.3 Puffer und Lösungen
DNA-Extraktion
DEX-Puffer (Stammlösung) 0,14 M Sorbit
0,22 M Tris-HCl, pH 8,0
(Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan)
0,222 M EDTA
(Ethylendiamintetraessigsäure)
0,8 M NaCl
0,8 % CTAB
(Cetyltrimethylammoniumbromid)
1 % Sarcosine
zur Stammlösung werden 20µl β−Μercaptoethanol pro Milliliter DEX hinzugegeben (kurz vor
der Extraktion)
Phenol Roti®�Phenol (Redestilliertes, in TE-Puffer
2 Material und Methoden
18
äquilibriertes Phenol; Roth, Karlsruhe)
Chloroform/ Isoamylalkohol 24:1 (v/v)
PCR-Puffer (5 x) 15 mM MgCl2
100 mM (NH4)2SO4
0,08 % Triton
20 % DMSO
250 mM KCl
50 mM Tris/HCl pH 8,3
0,4 % Tween 20
mit H2 O auf 100 ml auffüllen
Gelelektrophorese
50 x TAE-Puffer 2M Tris HCl
57,1 ml Essigsäure
100 ml 0,5 M EDTA pH 8,0
mit H2O auf 1 l aufgefüllt
Nach dem verdünnen der 50x Lösung wurden 14µg/l
EtBr (Ethidiumbromid) hinzugegeben.
10 x Ladepuffer 50 % Glycerin
1 mM EDTA
1 Spatelspitze Bromphenolblau
autoklavieren (20 min), bei RT aufbewahren
1 % Agarosegel 2g Agarose in 200 ml 1 x TAE- Puffer
1 kB DNA Leiter : 0.5 µg/µl, 3-5 µl (Fermentas)
Proteinextraktion
Protein-Extraktionspuffer (5 x) 500 mM NaCl
250 mM Tris/HCl pH 7,5
2 Material und Methoden
19
2,5 % (v/v) Triton X-100
50 mM β-Mercaptoethanol
10 µl/ml Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma-
Aldrich, Steinheim), frisch zugesetzt
Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (DISK-PAGE) und Wes-tern-Blot
Trenngelpuffer (4 x) 1,5 M Tris/HCl pH 8,8
0,4 % (w/v) SDS (Sodiumdodecylsulfat)
Sammelgelpuffer (4 x) 0,5 M Tris/ HCl pH 6,8
0,4 % (w/v) SDS
APS 10 % 10 % (w/v) Ammoniumperoxidisulfat in H2O
Trenngel 12 %ig, für 2 Gele (1,5 mm) 5,4 ml Acrylamid-Stammlösung (rotiphorese®
Gel 40, Roth (Acrylamid : Bisacrylamid = 19 : 1))
4,5 ml Trenngelpuffer
8,1 ml H2O
60 µl APS 10 %
13,5 µl TEMED (Tetramethyläthylendiamin)
Komponenten mischen, ca. 2/3 hoch in
Gelkassetten gießen, mit H2O überschichten,
polymerisieren lassen (ca. 30 min)
Sammelgel 4,5 %ig, für 2 Gele (1,5 mm) 0,75 ml Acrylamid-Stammlösung
1,7 ml Sammelgelpuffer
4,25 ml H2O
20 µl APS 10 %
12 µl TEMED
Wasser von festem Trenngel entfernen,
2 Material und Methoden
20
Sammelgel auf Trenngel gießen, Taschenkamm
(10 oder 15 Taschen) einschieben,
polymerisieren lassen (ca. 30 min)
SDS PAGE-Puffer (Laufpuffer) 50 mM Tris/HCl pH 8,3
384 mM Glycin
0,1 % (w/v) SDS
SDS Probenpuffer (4 x) 200 mM Tris/HCl pH 6,8
400 mM Dithiothreit
8 % (w/v) SDS
0,4 % (w/v) Bromphenolblau
40 % (v/v) Glycerin
aufbewahrt bei -22°C
Kathodenlösung 40 mM 6-Aminohexansäure
20 % (v/v) Methanol
Anodenlösung 1 0,3 M Tris/HCl pH 10,4
20 % (v/v) Methanol
Anodenlösung 2 25 mM Tris/HCl pH 10,4
20 % (v/v) Methanol
TBS (Tris-Buffered Saline, 25 mM Tris) 137 mM NaCl
2,68 mM KCl
3 g Tris
in 800 ml H2O lösen, pH auf 7,4 einstellen,
mit H2 O auf 1 l auffüllen
(20x konzentriert hergestellt)
TBS/Tween 0,1 % (v/v) Tween® 20 in TBS
Blockierungslösung 6 % (w/v) Magermilchpulver in TBS Tween
Primärer Antikörper Anti-LeOPR3 Rabbit Polyklonaler Antikörper
2 Material und Methoden
21
sekundärer Antikörper Anti-Rabbit IgG, Heavy and Light Chain (Goat),
Peroxidase Conjugate (Calbiochem, Darmstadt)
ECL-Lösung SuperSignal® West Dura Extended Duration Sub-
strate (Pierce, Rockford)
RNA-Extraktion
Extraktionspuffer (Stammlösung) 5 M NaCl
1 M Tris-HCl pH 8.0
0,5 M EDTA
pro 25ml Stammlösung wird vor Extraktion 1,8 ml β-Mercaptoethanol
2,5 ml 10 % (w/v) SDS hinzugefügt
PCIphenol 50 ml Phenol
24 ml Chloroform
1 ml Isoamylalkohol
Spatelspitze 8-Hydroxychinolin
PCI 50 ml Phenol
48 ml Chloroform
2 ml Isoamylalkohol
Spatelspitze 8-Hydroxychinolin
außerdem 10 M LiCl
3 M Natriumacetat pH 4.8
2 Material und Methoden
22
Northern Blot
Gelpuffer
10x MOPS (500 ml) 0,4 M MOPS
(4-Morpholinpropansulfonsäure) 100 mM Natriumacetat
10 mM EDTA
mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt
autoklaviert
Ladepuffer (1 ml) 50 % Glycerin
1 mM EDTA
0,03 % Bromphenolblau
autoklaviert
20x SSC 3 M NaCl
(Salt-Sodium-Citrat) 0,3 M NaCitrat-Dihydtrat
800 ml ddH2O
mit 10M NaOH auf pH 7,0 eingestellt
Formaldehydgel 1,56 g Agarose (1,2 %)
93,6 ml ddH2O
erhitzt
13 ml 10x Gelpuffer
23,4 ml Formaldehyd
RNA-Proben 5,5 µl RNA + steriles ddH2O
1 µl 10x Gelpuffer
3,5 µl Formaldehyd
10 µl Formamid
für 15 min auf 65 °C erhitzt,
auf Eis abgeschreckt, zentrifugiert
2 µl Ladepuffer
0,2 µl EtBr
2 Material und Methoden
23
50 x Denhardt�s 5 g Ficoll
5 g Polyvinylpyrrolidon
5 g Rinderserumalbumin (BSA)
mit ddH20 auf 500 ml
Hybridisierungslösung 50 % Formamid
5x SSC
50 mM KPP pH 7.0
2x Denhardt�s
sss DNA 100 µg/ml
0,5 % SDS
Lösung 1 1x SSC
0,2 % SDS
Lösung 2 0,2 SSC
0,5 % SDS
2.4 Sonstige Puffer, Lösungen, Materialien
TechnoVit 7100 Firma Heraeus Kulzer GmbH & Co KG
2:1 Ethanol/TechnoVit 7100 (v/v)
1:1 Ethanol/TechnoVit 7100 (v/v)
1:2 Ethanol/TechnoVit 7100 (v/v)
Fuchsin-Safranin-Astrablaufärbung
(FSA-Verfahren) nach Etzold
Stammlösung 1: 1 g Astrablau in 50 ml ddH2O
Stammlösung 2: 1 g Safranin in 50 ml ddH2O
Stammlösung 3: 1 g basisches Fuchsin in 50 ml ddH2O
Endgültige gebrauchsfertige Lösung: 2 ml Eisessig in 100 ml ddH2O
2 Material und Methoden
24
5-10 ml der Stammlösungen 1-3 hinzugeben. in ei-
nem verschlossenen Gefäß ist diese Lösung mehrere
Jahre haltbar.
2.5 Medien und Stammlösungen
2.5.1 Stammlösungen Antibiotika
Kanamycin (Duchefa) 35/50/75/100 mg/ml in H2O, sterilfiltriert,
Lagerung -22°C
2.5.2 Medien
Antibiotika-Konzentrationen Kanamycin 50 µg/ml (LB-Medium)
35/50/100 µg/ml (Selektionsmed.)
75 µg/ml (NoverKan 3 % Sac)
MS-Medium 2,2 g/l MS (Murashige & Skoog Medium incl. Vitamins, Duchefa)
pH mit KOH auf 5,7 einstellen
3 % Saccharose
0,8 % Agar
autoklavieren (20 min)
Pollenkeimungsmedium 10 % Sacherose
100 mg/l Borsäure
300 mg/l Calciumnitrat
200 mg/l Magnesiumsulfat
100 mg/l Kaliumchlorid
0,6 % Agar
pH: 5.5
2 Material und Methoden
25
2.6 Enzyme
Taq-DNA-Polymerase peqlab, Erlangen
2.7. Methoden
2.7.1 DNA-Isolation aus Pflanzenmaterial
Etwa 10 mg Blattmaterial wird in einem beschrifteten Eppendorfgefäß in flüssigem Stickstoff
schockgefroren. Das gefrorene Material wird mit Hilfe eines zuvor kurz in Stickstoff gehaltenen
Plastikpistills zu einem feinen Puder zerkleinert. 100µl DEX+ 0,02µl β−Mercaptoethanol wer-
den dem Pulver hinzugeben und bis zum Tauen weitergemörsert. Anschließend wird 100µl
Chloroform hinzupipettiert und 10 Sekunden gemischt. Die Probe wird auf Eis gestellt, bis wei-
tere Proben hinzugekommen sind. Diese werden für 30 min bei 65°C inkubiert. Im Anschluss
wird abzentrifugiert und die obere wässrige Phase in ein frisches Eppendorfgefäß pipettiert. Die
DNA wird mit 100µl Isopropanol bei Raumtemperatur gefällt und wieder bei 15000 g für 5 min
zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das erhaltene Pellet mit 70 % Ethanol gewa-
schen. Der Alkohol wird abgenommen., das Pellet wird entweder im SpeedVac oder bei Raum-
temperatur getrocknet und anschließend in 30µl sterilem Wasser oder TE gelöst.
2.7.2 Polymerase Kettenreaktion (PCR)
Die PCR wurde in einem Gesamtvolumen von 25µl durchgeführt, die Template DNA wurde in
unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt, die Ansätze enthielten 1µl der gelösten DNA, 5µl
5X PCR-Puffer, 0,5µl dNTPs (10 mM), je 0,5µl forward und reverse Primer (10µM), 0,5 µl Taq-
DNA-Polymerase (5U/µl) und 16,5 µl sterilfiltriertem doppelt destillierten H2O. Die Zyklen des
PCR-Programms: zunächst 95°C für 5 min, anschließend 29 Zyklen mit 95°C für 30 s, 58°C für
50 s und 72°C für 1:30 min. Abschließend 72°C für 10 min und Abkühlung auf 10°C.
2 Material und Methoden
26
2.7.3 Auftrennung und Sichtbarmachung der DNA
Die DNA wurde mit einem 1 %igen TAE-Agarosegel, mit einem µl 1 % Ethidiumbromidlösung,
bei 80 bis 120V (je nach Größe des Gels) in TAE-Pufferlösung aufgetrennt.
Die Proben wurden vor dem Auftragen mit 10 % (v/v) 10x Ladepuffer versetzt. Als Größenstan-
dard wurden 2µg 1 kb DNA-Ladder (GeneRuler� DNA ladder, Fermentas) aufgetragen. Die
RNA wurde nach dem Auftrennen unter UV-Licht sichtbargemacht und durch Fotos dokumen-
tiert.
2.7.4 Isolierung von Proteinen aus Blattmaterial von Tomaten
Frisches oder in flüssigem Stickstoff schockgefrorenes Material wird in einem 1,5 ml Eppen-
dorfgefäß mit einem gekühlten Plastikpistill zu einem feinen Puder gemörsert. 300µl des kalten
Extraktionspuffers hinzugegeben. Zelluläre Bestandteile wurden durch Zentrifugation (15 000 g
bei 4°C 5 min) entfernt.
Für die Messung der Konzentration wurden 2µl des gewonnen Rohextrakts auf 800µl mit steril-
filtriertem ddH2O aufgefüllt und 200µl Protein Assay (Bradford Reagenz, Bio-Rad) versetzt und
15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proteinkonzentration wurde bei 595 nm gegen BSA
(Rinderserumalbumin Fraktion V, Roth Karlsruhe) als Standard ermittelt.
2.7.5 Entfernung sämtlicher Kontaminationen des Proteinextrakts
Diese Methode entfernt alle Kontaminationen im Proteinextrakt, wie Lipide der Membranen,
Detergenzien, etc. Nach der Behandlung verlieren die Proteine ihre Aktivität, können aber durch
diese Methode aufkonzentriert werden. Proteinextrakte, welche zuvor auf eine einheitliche Kon-
zentration eingestellt wurden, werden auf das gleiche Volumen aufgefüllt. Im Falle eines 200µl
Volumens wurden 480µl Methanol und 160µl Chloroform zu dieser Probe hinzugeben. Dieses
Gemisch wurde gründlich gemischt. Als nächstes wurde 640µl H2O dazupipettiert, wieder ver-
mischt abzentrifugiert und die obere Phase in ein neues Eppendorfgefäß überführt, danach wur-
den 480µl Methanol dazugegeben und abermals gemixt und 5 min abzentrifugiert. Das Pellet
wurde in 100µl 1x Proteinpuffer gelöst (Aufkonzentrierung)
2 Material und Methoden
27
2.7.6 Antikörperaufreinigung aus Serum
Um ein spezifisches Signal für OPR3 zu bekommen wurde der Serum mit Hilfe His6-tagged
OPR3 gereinigt. Hierzu wurde Nitrocellulose (WESTRAN CLEAR SIGNAL) in Methanol auf
eine Größe von 0,5 x 2 cm zugeschnitten und in Methanol angefeuchtet. Auf die Membran wur-
de im Überkopfschüttler bei 4°C 2,5 h, 2 ml OPR3 Protein-Lösung übertragen. Danach wurde
für eine Stunde mit Blockierungspuffer (6 % Milchpulver in TBS Tween) bei Raumtemperatur
blockiert. Nach dem Blockieren wurde die Membran 3 mal für 5 min mit TBS Tween bei Raum-
temperatur gewaschen. Im Anschluss wurde 200 µl Serum und 20 µl 1 M Tris/HCl pH 7.5 hin-
zugegeben und bei Raumtemperatur im Überkopfschüttler für 1,5 h inkubiert. Danach wurde
dreimal für drei Minuten mit TBS Tween gewaschen, anschließend noch einmal mit Wasser.
Nach dem Waschen folgte die Elution der gebundenen Antikörper mit 2 x 200 µl 100 mM Gly-
cin HCl pH 2.8 für jeweils eine Minute. Sofort im Anschluss wurde mit 1/10 Volumen 1M Tris-
HCl pH 9.0, welches in einen neuen Reaktionsgefäß vorgelegt wurde, neutralisiert. Danach wur-
de noch einmal eluiert. Die beiden Elutionen wurden vereinigt. Die aufgereinigten Antikörper
wurden in 1 mg/ml BSA (Rinderserumalbumin) und 0,02 Timerosal, das Serum mit 0,1 % NaN3
stabilisiert.
2.7.7 Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (DISK-PAGE) und Western-Blot
Die auf eine gleiche Konzentration eingestellten Proteinextrakte wurden 3:1 mit SDS Probenpuf-
fer versetzt und 10 min denaturiert. Die so behandelten Extrakte wurden mit Hilfe von Acryla-
midgelen (10 % bzw. 12 %) in SDS-PAGE-Puffer bei 100 V aufgetrennt. Als Größenstandard
wurden 3 µl �Pageruler� Prestained Protein Ladder� (Fermentas) aufgetragen.
Da dieser Ansatz zweimal angesetzt wurde, wurde ein Gel auf Blotting Membranen (Westran ®
Clear Signal, Schleicher & Schuell, Dassel Rellihausen), welche auf die Größe des Gels (9 x 5,5
cm) zugeschnitten wurden, übertragen.
Das ebenfalls auf 9 x 5,5 cm zugeschnittene Blotting-Papier (NOVABLOT Elektroden-Papier,
Amersham) wurde für 10 min in den entsprechenden Puffern eingeweicht (sechs Papiere in Ka-
thodenlösung, 3 Papiere in Anodenlösung I und sechs Papiere in Anodenlösung II). Die Graphit-
elektroden wurden etwa eine Stunde in deionisiertem Wasser gewässert und abgetrocknet. Die
2 Material und Methoden
28
Membran wurde in Methanol getaucht und schließlich in Anodenlösung I gewässert. Die Blot-
tingapparatur wurde wie in Abb. 10 gezeigt luftblasenfrei aufgebaut.
Der elektrophoretische Transfer wurde 1,5 Stunden bei 100 mA/Blot durchgeführt. Nach diesem
Transfer wurden die Membranen für mindestens eine Stunde in Blockierungspuffer (6 % Ma-
germilchpulver in TBS/Tween) unter Schütteln abgesättigt. Anschließend wurde mit dem aufge-
reinigten primären Antikörper (anti-LeOPR3 1:800 in Blockierungspuffer) über Nacht bei 4°C
auf dem Schüttler inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Membranen dreimal für 5 min mit
TBS-Tween gewaschen.
Im Anschluss folgte die Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit dem sekundären Anti-
körper (Anti-Rabbit IgG, Heavy and Light Chain (Goat) Peroxidase Conjugate (Calbiochem,
Darmstadt), welcher 1:10 000 in Blockierungspuffer verdünnt wurde. Nach dieser Stunde wurde
wieder dreimal 5 min mit TBS/Tween gewaschen und der Blot durch SuperSignal® West Dura
Extended Duration Substrate (Pierce, Rockford) entwickelt. Hierzu wurden die beiden Kompo-
nenten 1:1 (Endvolumen 700µl) miteinander vermischt und der Blot für 5 min damit inkubiert.
Der abgetropfte Blot wird in Folie eingewickelt und in der Dunkelkammer auf Röntgenfilme
(Hyperfilm�, Amersham) belichtet.
2.7.8 RNA-Extraktion aus Blattmaterial
Etwa 400 mg Blattmaterial wird in Aluminiumfolie eingewickelt und sofort in flüssigem Stick-
stoff gefroren und bis zur Verarbeitung bei -80°C gelagert. Das Blattmaterial wird in einen mit
Abb. 10: Schematischer Aufbau der Westernblotapparatur. Aus Diplomarbeit vonDirk Zimmermann
2 Material und Methoden
29
flüssigem Stickstoff gefüllten Mörser gegeben und mit einem gekühlten Pistill zu einem feinen
Pulver zerrieben. Dieses Verreiben wurde nach verdampfen des Stickstoffes zweimal wiederholt.
Das durch mörsern gewonnene Pulver wurde in 750µl Extraktionspuffer (plus 1,8 ml β-
Mercaptoethanol und 2,5 ml 10 % (w/v) SDS pro 25 ml Stammlösung) aufgetaut und gemischt.
Daraufhin wird das gleiche Volumen PCIphenol hinzugegeben und gemischt. Bis zur weiter
Verarbeitung kann die Probe auf Eis aufbewahrt werden. War dies der Fall, so wurde vor der
Zentrifugation bei 10.000g, 15 min noch einmal gleichmäßig vermischt. Nach der Zentrifugation
wurde die obere wässrige Phase in ein in der Zwischenzeit mit 750µl PCI vorbereitetes 2,0 ml
Eppendorfgefäß pipettiert und im Anschluss 10 min geschüttelt. Danach wurde abermals bei
10.000g 15 min zentrifugiert. In dieser Zeit wurden wieder 2 ml Eppendorfgefäße mit 750µl PCI
vorbereitet. In diese wurde die obere wässrige Phase überführt. Nach nochmaligen 10 Minuten
schütteln wurde ein weiteres Mal bei 10.000g für 15 min zentrifugiert. Als nächstes wurde die
wässrige Phase in mit 750µl Chloroform vorbereitetes Eppendorfgefäße überführt, wieder ge-
schüttelt und zentrifugiert. In dieser Zeit wurden 1,5 ml Eppendorfgefäße beschriftet. Das Volu-
men der wässrigen Phase wurde genau bestimmt und die RNA über Nacht bei 0°C nach Zugabe
¼ des bestimmten Volumens mit LiCl gefällt.
Die Proben wurden am nächsten Morgen bei 10.000g 20 min abzentrifugiert, das erhaltene Pellet
wurde in 70 % Ethanol gewaschen. Der Alkohol wurde vorsichtig abgetropft oder pipettiert und
die RNA in 400µl sterilem doppelt destilliertem Wasser resuspendiert. Nach dem lösen der RNA
wurde diese erneut mit Hilfe von 40µl 3M NaAc und 880µl absoluten Ethanols bei -20°C für 2-3
Stunden gefällt. Die RNA wurde bei 10.000g 10 min abzentrifugiert und das Pellet mit 70 %
Ethanol gewaschen. Der Alkohol wurde wieder vorsichtig abgekippt oder pipettiert und die RNA
entweder 30 min auf Eis oder im SpeedVac getrocknet und schließlich mit 30-50µl sterilem
ddH2O gelöst. Von der gelösten RNA wurden 2µl entnommen und zu 798µl sterilem ddH2O
hinzugegeben und am Eppendorf-Photometer (Biophotometer 6131) die Konzentration be-
stimmt. Ausgehend von der am geringsten konzentrierten RNA wurde überall die gleiche Kon-
zentration eingestellt.
Zur Auftrennung der RNA wurden Platte, Kamm und Kammer in Seifenwasser eingeweicht und
gründlich gereinigt. In einem sterilen Kolben mit Rührfisch wurde für ein 1 % (w/v) Agarosegel
Agarose abgewogen. 20 ml 50x TAE wurde in 980 ml sterilem ddH2O vermischt und darin unter
aufkochen die Agarose gelöst. 5µg RNA wurden mit sterilem ddH2O auf 18µl ergänzt und 2µl
Ladepuffer hinzugegeben, danach wurden die Proben für 15 min bei 65°C denaturiert, auf Eis
abgeschreckt und auf das Gel aufgetragen, um zu überprüfen ob die RNA degradiert war.
2 Material und Methoden
30
2.7.9 Northern Blot
Mit Hilfe des Northern Blots wurde Akkumulation von Proteinase-Inhibitor-II-Transkript unter-
sucht.
Die auf eine gleiche Konzentration eingestellt RNA-Proben wurden auf ein 1 % TAE-
Agarosegel aufgetragen, um zu überprüfen, ob die RNA degradiert war und ob die Konzentration
die in jedem Eppendorfgefäß die Gleiche ist. Dies wurde unter UV-Licht fotografiert. Alle benö-
tigten Materialien wurden autoklaviert beziehungsweise gereinigt. Die aufgetragene RNA wurde
über 5h bei 60 V in 1x Gelpuffer aufgetrennt. Nach dem Lauf wurde das Gel zweimal für 15 min
in sterilem ddH2O und danach für die gleiche Zeit in 10x SSC gewaschen.
Der Blot wird wie folgt aufgebaut: In eine Glasschale (Auflaufform) wird 10x SSC als Transfer-
puffer gegeben. Mit einer Glasplatte wird diese Schale zum Teil abgedeckt. Über diese Abde-
ckung werden zwei Lagen Whatman 3MM gelegt die in den Transferpuffer reichen. Auf diese
Brücke wird das Gel gelegt und ringsum mit Parafilm abgedichtet. Darauf folgt die Nitrocellulo-
semembran (Schleicher), welche zuvor in Wasser und dann in 10x SSC angefeuchtet wurde. Drei
Lagen Whatman 3MM Papier wurden in der Größe des Gels und der Nitrocellulose auf die Nit-
rocellulose gelegt und mit einer Vollpipette die Luftblasen �ausgewellt�. Auf diesen Aufbau
wurde noch ein Stapel Papiertücher (ebenfalls in der Größe des Gels) aufgelegt und mit einem
Gewicht von etwa 200 g beschwert. Der Transfer fand über Nacht statt.
Nach der Übertragung wurde der Blot in 2x SSC gewaschen und auf ein zuvor vorbereitetes
�Kuvert� aus Whatman 3MM gelegt. Die Nitrocellulose wurde leicht getrocknet und die RNA
mittels UV-Autocrosslink (Stratalinker) bei 1200J kovalent an die Membran gebunden.
Radioaktive Markierung der PI-II Sonde
Die Proteinase-Inhibitor-II (PI-II) -Sonde (25 ng) wurde mit [α32P]-dCTP radioaktiv markiert.
Zum Labeling wurde das RadPrime DNA Labeling System (Invitrogen-Kit) verwendet. Hierbei
lagern sich zufällige Primer (Oktamere) an eine denaturierte DNA-Vorlage und wird mit Hilfe
des Klenow-Fragments elongiert. Bei der Elongation wird [α32P]-dCTP eingebaut, was zu einer
hochspezifischen aktiven DNA führt, welche zur Detektion von RNA und DNA eingesetzt wer-
den kann. Der Einbau des [α32P]-dCTP wurde mit einem Bench-Count (DuPont) überprüft.
2 Material und Methoden
31
Hybridisierung
Die zu hybridisierende Membran wurde in Wasser angefeuchtet und schließlich kurz in 5x SSC
geschwenkt. Anschließend wurde die Membran zwischen Gazenetze gelegt und diese in Hybri-
disierungsröhren mindestens 2h bei 42°C in der Hybridisierungslösung vorinkubiert. Die Sonde
wurde anschließend im Heizblock bei 100°C 10 min aufgekocht und anschließend auf Eis abge-
schreckt und anschließend dazugegeben. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 42° C, 80
rpm im Hybridisierungsofen. Anschließend wurde der Blot mit steigender Stringenz in 1x SSC
mit 0,2 %SDS, im Anschluss daran mit 0,2x SSC + 0,5 % SDS, jeweils bei 60°C für 30 min ge-
waschen um die unspezifisch gebundene Sonde zu entfernen. Mit Hilfe eines Röntgenfilms der
auf den in Frischhaltefolie eingewickelten Blot gelegt wurde erfolgte eine Autoradiografie.
2.7.10 Sterilisation der Samen und Anzucht der Keimlinge
Tomatensamen (Lycopersicon esculentum cv. UC82B, LeOPR3 x UC82B und UC82B x Le-
OPR3) wurden in 2 ml-Reaktionsgefäßen 3 min mit 70 % EtOH behandelt und anschließend für
10 min mit 1,5 % Hypochlorid und 5 Tropfen Tween ® 20/100 ml sterilisiert. Nach viermaligem
Waschen mit sterilem Wasser wurden die Samen in Weckgläsern mit Keimungsmedium ausge-
legt und angezogen.
2.7.11 Emaskulation von Tomatenblüten
Zur Kreuzung von Tomaten wurde Pollen von Wildtyppflanzen auf opr3-Stigmen und opr3-
Pollen auf Wildtyp-Stigmen gebracht. Hierzu musste den jeweiligen Blüten die Antheren ent-
fernt werden (Emaskulation). Die Emaskulation wurde in einem Stadium vorgenommen, in wel-
chem die Kelchblätter sich leicht geöffnet aber die Kronblätter noch geschlossen waren. Die
Krone hat in diesem Stadium eine leicht gelbe Färbung. Um die Antheren zu entfernen wurden
zuvor die Kelchblätter abgeschnitten, der Antherenkegel wurde mit einer sehr spitzen zuvor in
70 % Ethanol sterilisierten Pinzette aufgeschlitzt. Die Antheren wurden vorsichtig mit der Pin-
zette entfernt ohne den weiblichen Gametophyt zu beschädigen.
2 Material und Methoden
32
2.7.12 Sammeln von Pollen und Bestäubung von emaskulierten Pflanzen
Zwei Tage nach der Emaskulation wurden �reife� Antheren von nicht emaskulierten Blüten ent-
nommen, der Pollen mit Hilfe einer Pinzette in ein Eppendorfgefäß geschüttelt und für 1,5 h bei
28°C im Heizblock getrocknet. Der Pollen wurde durch einführen der entmannten Blüte in das
Eppendorfgefäß auf das Stigma gebracht. Die bestäubten Blüten wurden mit Etiketten versehen
auf denen Datum und Herkunft des Pollens (z.B. wt oder die entsprechende Linie) notiert war.
Des weiteren wurde noch versucht Früchte durch pressen des Antherenkonus zu gewinnen.
2.7.13 In vitro-Pollenkeimung
Pollen von drei Wildtypblüten und von sechs opr3-Blüten wurde jeweils in einem Eppendorfge-
fäß gesammelt und auf mit Platten zur Pollenkeimung mit einem feinen Pinsel ausplattiert und
über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die prozentuale Pollenkeimungsrate wurde mikro-
skopisch bestimmt.
2.7.14 Ernte der Tomaten und Gewinnung der Samen
Die aus Kreuzungen oder Pressen des Antherenkonus gewonnenen Früchte wurden geerntet und
am Stielansatz aufgeschnitten, um eine Verletzung von Samen zu verhindern. Danach wurden
Schnitte geführt, welche das Kernhaus nicht beschädigten (Schutz der Samen). Das Kernhaus
wurde in ein Baumwolltuch überführt. Mit einem kleinen Löffel etwas verrieben, um sie vom
Kernhaus und der gallertartigen Schutzschicht zu befreien. Mit einer feinen Pinzette wurden die
Samen auf Whatman 3MM überführt über Nacht getrocknet und in einzelne Samentütchen, wel-
che mit der jeweiligen Kreuzungsrichtung versehen wurde überführt. In diesen wurden sie bis zu
weiteren Untersuchungen aufbewahrt.
2 Material und Methoden
33
2.7.15 Präparation der Embryonen
Embryonen wurden aus Tomatensamen herauspräpariert. Zur Präparation bot es sich an die Sa-
men auf ein mit destilliertem Wasser getränktes Filterpapier zu legen. Mit einer spitzen Skalpell-
klinge wurde der Same festgehalten und mit einer anderen ebenfalls spitzen Klinge der Embryo
unter dem Stereomikroskop (Zeiss, Oberkochen) freipräpariert. Pro Kreuzungsrichtung wurden
jeweils 15 auf diese Art gewonnenen Embryonen in einem 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt und
in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Bis zur weiteren Analyse wurden diese -80° C aufbe-
wahrt.
2.7.16 Fixierung und Einbettung von Samen in TechnoVit 7100
Die Samen wurden zunächst kurz in Wasser vorgequollen und zweimal für 30 min in AFE (80 %
Ethanol/Formaldehyd/Eisessig 90:5:5 (v:v:v)) im Vakuum bei etwa 200 mbar fixiert. Danach
wurde die Fixierlösung erneuert, und ebenfalls bei etwa 200 mbar infiltriert, um sicher zu gehen,
dass keine Lufteinschlüsse mehr vorhanden waren und entweder über Nacht im bei Raumtempe-
ratur im Überkopfschüttler oder über das Wochenende inkubiert. Nach der Fixierung in AFE
wurde dreimal mit 75 % Ethanol für 20 min gewaschen. Das zweite und dritte Mal wurde zusätz-
lich für 10 min bei etwa 200 mbar infiltriert. Nach der dritten Waschung wurde mit einer aufstei-
genden Alkoholreihe das Präparat entwässert. Zunächst mit 90 % Ethanol, dann mit 95 % Etha-
nol und schließlich absolutes Ethanol. Die ersten beiden Entwässerungsstufen wurden jeweils 6
Stunden durchgeführt und die letzte dreimal 2 Stunden. Um sicher zu sein, dass die Präparate
entwässert sind wurde noch ein weiterer Schritt mit absolutem Ethanol über Nacht gemacht. Im
Anschluss wurde unter Vakuum bei etwa 100-150 mbar für jeweils 3 Stunden das Ethanol durch
TechnoVit 7100 schrittweise ersetzt (Ethanol:TechnoVit 7100 2:1 (v/v), Ethanol:TechnoVit
7100 1:1 (v:v), Ethanol:TechnoVit 7100 1:2 (v/v)). Im Anschluss wurde TechnoVit Grundansatz
(TechnoVit 7100 + Härter I) unverdünnt infiltriert und über Nacht inkubiert. Am nächsten Mor-
gen wurde dieser Grundansatz ausgewechselt und noch einmal für drei Stunden bei 100 mbar
infiltriert. Daraufhin wurde TechnoVit 7100 Grundansatz + Härter II in Eppendorfhütchen pipet-
tiert, die Samen wurden entsprechend der Schnittführung (längs) darin ausgerichtet, bei 100
mbar infiltriert und im Kühlschrank auspolymerisieren gelassen. Im Anschluss daran folgte das
Aufblocken der Präparate auf Histoblöcke (Heraeus Kulzer GmbH & Co KG Germany). Nach
2 Material und Methoden
34
etwa einer Woche nach der Polymerisation wurden Schnitte mit einer Stärke von 4µm an einem
Rotationsmikrotom (Jung Germany) gefertigt. Auf einem 60°C warmen Wasserbad wurden die
Schnitte gestreckt und schließlich auf einen Objektträger aufgezogen.
2.7.17 Färbemethoden der Schnitte
Toluidinblau Färbung
Die Schnitte wurden für etwa 5 Minuten in Toluidinblaulösung (0,03 g Toluidinblau in 100 ml
Wasser pH 7.0) gefärbt für etwa 5 min und schließlich mit Wasser die nicht gebundene Farbe
ausgewaschen. Verkorkte und verholzte Zellwände erscheinen bei dieser Färbung grünblau,
während mit Cellulose imprägnierte Wandschichten sich kräftig rötlich färben.
�Etzold�-Färbung
Andere Schnitte, welche nicht mit Toluidinblaulösung gefärbt wurden, wurden nach Etzold ge-
färbt. Hierzu wurden die Schnitte mit dem Färbereagenz überschichtet, kurz aufgekocht und bei
Raumtemperatur 2-5 min einwirken gelassen. Danach wurden die restliche ungebundene Farbe
mit Wasser ausgespült und unter dem Mikroskop (Axioskop, Zeiss Oberkochen) betrachtet.
2.7.18 Statistische Analysen
Die Statistischen Analysen wurden mit Hilfe von Microsoft Excel 2000 ausgewertet. Verschie-
dene Grafiken wurden mit SigmaPlot2000 bearbeitet.
3 Ergebnisse
35
3. Ergebnisse
3.1 Phänotypische Charakterisierung der LeOPR3-RNAi-Tomaten-pflanzen
3.1.1 Das OPR3-RNAi-Konstrukt
Für die funktionelle Charakterisierung der OPR3 in Tomatenpflanzen standen transgene Pflan-
zen zur Verfügung, in denen die Expression der OPR3 durch RNA-Interferenz unterdrückt sein
sollte. Das OPR3-RNAi-Konstrukt, mit welchem die Pflanzen transformiert worden waren, be-
inhaltet ein 408 bp Fragement der OPR3
cDNA, das sich von Position 411-819 vom
Startcodon erstreckt. Dieser Teil hat auf
Ebene der Nukleotide eine 57 %ige Über-
einstimmung mit OPR1, welches mit OPR3
am nächsten verwandt ist. Diese Region
wurde in Sense und Antisense Orientierung
in den pRTL2-FAD2-Intron Vektor einge-
führt (Abb. 11). Dieses Konstrukt ist in der
Lage eine Haarnadelstruktur zu bilden. Es
steht unter Kontrolle des 35S-Promotor, der
eine stetige Expression des Konstruktes erlaubt.
Lycopersicon esculentum cv. UC82B ist im Vorfeld mit diesem Konstrukt mittels A. tumefaciens
transformiert. Für diese Arbeit wurden 30 möglicherweise transformierte Pflanzen im Alter von
7 Wochen zur Verfügung gestellt. Diese Pflanzen befanden sich in der T1-Generation. Der erste
Schritt in der Charakterisierung war also zu testen, ob die Pflanzen dieses Konstrukt auch tat-
sächlich enthielten.
Abb. 11: pRTL2-FAD2-Intron-Vektor mit OPR3 in Sense-und Antisense-Orientierung. Die Restriktionsschnittstellensind angegeben, wie auch die Left- und Right-Border (LBund RB) der T-DNA, die Position des 35S Promotors unddes Terminators (Term)
RB LB
3 Ergebnisse
36
3.1.2 Tragen die Pflanzen das RNAi-Konstrukt?
Um die Pflanzen auf Anwesenheit des RNAi-Konstruktes zu testen, wurde von Blättern 25 mög-
licher transgener Linien DNA extrahiert und je eine PCR mit der Primerkombination Primer 68
+ fad2fw sowie Primer 68 + fad2rev (Abb. 12 & 13) durchgeführt. Der Primer 68 bindet im Be-
reich der OPR-cDNA an Position 411-438, die
beiden fad2-Primer binden im Bereich des FAD-
Introns (s. Abb. 12). Wenn nun nach der PCR für
beide Primerkombinationen eine Bande von 510
bp zu erkennen ist, kann daraus geschlossen wer-
den, dass die Pflanzen das Konstrukt beinhalten.
In Abb. 13 wird gezeigt, dass alle
mir zur Verfügung gestellten und
im Laufe der Arbeit verwendeten
OPR3-RNAi-Linien das Konstrukt
tragen, außer Linie P20, welche nur
den Senseteil (fad2rev + 68) bein-
haltete. Die Linien P4, P4/2, sowie
J7, 7/2, 7/3 P8 und P8/2 stammen
jeweils von einem Kallus, stellen
also vermutlich keine unabhängi-
gen Transformationsereignisse dar.
Für die weiteren Untersuchungen
wurden aus diesen Serien nur die
Pflanzen 4/2, J7/2 und P8/2 einge-
setzt. Da alle anderen entstandenen
Linien von unterschiedlichen Kalli
abstammen, muss es sich auch um
unterschiedliche Transformationser-
eignisse handeln, weshalb auf einen
zur Bestimmung der Unabhängigkeit
sonst nötigen Southern Blot verzichtet wurde. Nachdem gezeigt wurde, dass die Pflanzen das
68 68fad2rev fad2fw
FAD2-Intron
Abb. 12: Primerkarte des RNAi-Konstrukts. Pfei-le deuten die Bindungsstellen der Primer an
Abb. 13: Nachweis des RNAi-Konstrukts in den transgenenPflanzen. 1 % Agarosegele, welche mit EtBr gefärbt wurden.Die jeweilige opr3-Linie, ist angegeben, ebenso sind dieSpuren mit gleichbehandelter wt DNA (wt), der Negativkon-trolle (Mastermix ohne DNA, MM), und der Positivkontrolle(+), wie auch die eingesetzten Primerkombinationen angege-ben.
3 Ergebnisse
37
Konstrukt tragen ist nun wichtig zu wissen, ob auch die Expression des OPR3 Gens in diesen
Pflanzen unterdrückt ist.
3.1.3 Ist die Expression von OPR3 unterdrückt?
Da OPR3 in verwundeten Pflanzen akkumuliert [Strassner et al., 2002] und ein Antikörper gegen
OPR3 vorhanden ist, wurde mittels DISK-PAGE und Western-Blot überprüft, ob OPR3 in den
opr3-RNAi-Linien ebenfalls nach verwundung akkumuliert oder nicht.
Bei LeOPR3 handelt es sich um ein
369 Aminosäuren langes Peptid,
welches eine molekulare Masse von
40,5 kDa besitzt.
Von jeder der untersuchten Linien
wurde vor wie auch zwei Stunden
nach der ersten Verwundung Protein
extrahiert und jeweils 15 µg wurden
analysiert
Um zu überprüfen, ob in jede Tasche
des Polyacrylamidgels die gleiche
Menge Protein aufgetragen wurde,
wurde ein dem Blot entsprechendes
Proteingel mit Coomassie Brilliant
Blau gefärbt. Abb. 14 zeigt, dass eine
gleichmässige Beladung nicht voll-
ständig gelungen ist. Alternativ wurde
die Nitrocellulosemembran nach Wes-
tern-Transfer der Proteine mit Pon-
ceau gefärbt. Hier zeigte sich eine
Bande gleicher Intensität in allen Spu-
ren. Bei dem gefärbten Protein handelt
es sich um die grosse Untereinheit der
RubisCO (Abb. 15). Die dazugehörigen Western-Blots (Abb. 14 & 15) zeigen eine Akkumulati-
on an OPR3 im Wildtyp nach Verwundung, es ist jedoch keine Akkumulation von OPR3 in den
a
b
Abb. 14: Westernblot (a) mit dazugehörigen Coomassie-gefärbten (b) Gel. Aufgetragen wurden Proteinextraktedreier verschiedener opr3-RNAi-Linien (Lines) und desWildtyps jeweils unverwundet (-) und verwundet (+) (15µg) sowie aufgereinigtes OPR3 (10 ng); Grössenstandard.
Abb. 15: Westernblot (a) mit dazugehörigen Ponceaugefärbten-Blot (b). Aufgetragen wurden Proteinextrakte dreier verschiede-ner opr3-RNAi-Linien (Lines), und des Wildtyps, jeweils un-verwundet (-) und verwundet (+) (15 µg) sowie aufgereinigte OPR3 (10 ng) und ein Grössenstandard.
a
b
3 Ergebnisse
38
Wildtyp opr3-Mutante
Abb. 16: Phänotyp der LeOPR3-RNAi-Pflanzen. Die Blüten von opr3-Pflanzen trocknen aus und fallen ab, während der Wildtyp Früchte bildet.
RNAi-Linien zu erkennen. Dass der Antikörper spezifisch ist, zeigt das aufgereinigte und zur
Kontrolle aufgetragene His6-OPR3-Protein und die Tatsache, dass nur eine Bande im Gesamt-
proteinextrakt mit dem Antikörper reagierte. Aus diesen beiden Abbildungen kann geschlossen
werden, dass in den ausgewählten LeOPR3-RNAi-Pflanzen die Expression des OPR3 Gens un-
terdrückt ist. Diese Linien werden im folgenden der Einfachheit halber als opr3-Pflanzen be-
zeichnet.
3.1.4 Phänotyp der opr3-Pflanzen
In der Wuchsform zeigten die opr3-Pflanzen keine Auffälligkeit im Vergleich zum Wildtyp.
Wurde jedoch die Blüten angesehen, so konnte festgestellt werden, dass diese austrockneten
(Abb. 16) und schließlich abfielen ohne Früchte zu bilden.
Das Fertilitätsproblem der Pflanzen könnte auf männlicher, weiblicher oder gar beider Sterilität
beruhen. Da man aber von der Arabidopsis opr3 Mutante weiß, dass diese männlich steril sind
[Stintzi und Browse, 2000], entschlossen wir uns zunächst die Pollenkeimungsrate zu bestim-
men.
3 Ergebnisse
39
3.1.5 Pollenanalyse
Sowohl die Arabidopsis thaliana opr3-Mutante [Stintzi und Browse, 2000], als auch die anderen
in der Biosynthese von Jasmonsäure beteiligten Mutanten (fad3/7/8 triple mutante, aos)
[McConn und Browse, 1996; Sanders et al., 2000; Stintzi und Browse 2000] und die downstream
von JA liegende coi1-Mutante sind männlich steril [Turner et al., 2002; Xu et al., 2002]. In To-
mate wurde bis jetzt lediglich die jai1 Mutante, die einen Defekt in dem zu COI1 orthologen
Jai1 Gen hat, charakterisiert [Li et al. 2004], welche keine männliche Sterilität zeigte. Dafür
wird aber das Jai1 Gen für die Kontrolle der Samenreifung durch den weiblichen Gametophyten
verantwortlich gemacht.
In den opr3-Pflanzen wurde eine
im Vergleich zum Wildtyp 20-fach
verminderte Pollenfreisetzung be-
obachtet, was vermutlich auf ein
nicht geöffnetes Stomium zurück
zuführen ist (Daten aus mangeln-
der statistischer Aussagekraft nicht
gezeigt). Durch die verminderte
Pollenfreisetzung allein lässt sich
aber die beobachtete Sterilität
nicht erklären. Daher wurde Pol-
len von sechs opr3-Blüten vier
verschiedener unabhängiger Li-
nien und dreier Wildtypblüten
gesammelt und auf Pollenkei-
Abb. 17: Pollenkeimungsrate von wt und vier verschiedenen opr3-Linien (J3, P10, J30 und J18). n(wt) = 1403, n(J3) = 406, n(P10) = 544, n(J30) = 1743, n(J18) = 1717
Pollenkeimung
Linien
wt J3 P10 J30 J18
% g
ekei
mte
Pol
len
024
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Abb. 18: Pollenkeimung in vitro: links oben, ist die Pollenkeimung von Wildtyp, in der Mitte und im rech-ten Bild die Pollenkeimung von zwei opr3-Mutanten (J3 und J30) zu sehen.
3 Ergebnisse
40
mungsmedium ausplattiert um die Keimungsfähigkeit des Pollens zu testen (Abb. 18). Das Er-
gebnis des Pollenkeimungsversuchs ist graphisch in Abbildung 17 dargestellt. Es ist ersichtlich,
dass die Pollenkeimungsrate im Wildtyp bei 48 % lag, während für die opr3-Mutanten nur zwi-
schen 0,5 % und 1,1 % des Pollens keimten. Vom Wildtyp wurden insgesamt 1403, von den Li-
nien J3 406, P10 544, J30 1743 und J18 1717 Pollenkörner ausgezählt. Aus diesem Ergebnis
kann auf eine männliche Sterilität, oder zumindest eine enorme Reduktion der männlichen Ferti-
lität, geschlossen werden. Die verminderte männliche Fertilität muss auf einen sporophytischen
Defekt zurückzuführen sein, da nicht nur 50 % sondern der gesamte Pollen der opr3-Pflanzen
betroffen war. Da sich die opr3-Pflanzen in der T1-Generation befinden, sind sie hemizygot für
das RNAi-Konstrukt. Solange jede der opr3-Linien nur eine Kopie des Konstruktes tragen (was
durch Southern Blot zu überprüfen wäre) erhalten während der Meiose 50 % der gebildeten
Sporen und damit auch der daraus entstehenden Gametophyten und Gameten das Konstrukt. Al-
so ist die OPR3 Expression in nur 50 % des gebildeten Pollens unterdrückt. Da aber die Kei-
mung des gesamten Pollens beeinträchtigt ist, muss die Elternpflanze (der Sporophyt) für den
Defekt verantwortlich sein.
Die transgenen RNAi-Linien bildeten über einen Zeitraum von sechs Monaten keinerlei Früchte.
Dies deutet darauf hin, dass die Keimung des Pollens nicht nur in vitro, sondern auch in vivo
beeinträchtigt war. Mit dem Ziel in die nächste Generation zu gelangen wurden reziproke Kreu-
zungen der �silencing�-Linien mit dem Wildtyp durchgeführt.
3.1.6 Generierung von Früchten und Samen
Für die Bestäubung von opr3-Pflanzen mit Wildtyppollen, wurde der Pollen in Eppendorfgefä-
ßen gesammelt, und im richtigen Stadium der Blütenentwicklung wurde der opr3-Stempel in den
Pollen eingetaucht. Im Falle der umgekehrten Kreuzung wurde die Wildtypblüte emaskuliert und
der gesammelte opr3 Pollen auf dieselbe aufgebracht.
Fruchtansatz und Samenbildung nach reziproker Kreuzung
Wurden opr3-Pflanzen wie oben beschrieben reziprok gekreuzt, kam es tatsächlich zum
Fruchtansatz und etwa drei Monate nach der Bestäubung waren die Früchte ausgereift und
konnten geerntet werden. Schon nach der Analyse weniger geernteter Früchte wurde eine
Verteilung der Samen in große, normal entwickelte sowie kleine Samen festgestellt (s. Abb. 19).
Die großen Samen hatten eine Länge von etwa 5 mm und eine Dicke von 1 mm (was der
normalen Samengrösse dieser Tomatensorte entspricht), während die kleinen Samen eine Länge
3 Ergebnisse
41
grösse dieser Tomatensorte entspricht),
während die kleinen Samen eine Länge von
lediglich 1-2 mm hatten und auch dement-
sprechend dünner waren.
Die Hälfte der Samenanlagen hatte sich also
nicht normal entwickelt, vermutlich auf-
grund des �silencing� von OPR3. Um fest-
zustellen, ob es sich bei den �kleinen Sa-
men� um unbefruchtete Samenanlagen han-
delt, oder aber ob es zur Befruchtung ge-
kommen ist und der Defekt in der Samen-
reifung und/oder Embryonalentwicklung zu
suchen ist, wurden die Samen mikrosko-
pisch untersucht.
Phänotyp der „kleinen“ Samen
Der reife Same von Capsicum annum (http://www.seedbiology.de/structure.asp), der sehr ähn-
lich wie der Tomatensamen gebaut ist, ist in
Abb. 20 zu sehen. Man erkennt den einge-
rollten Embryo mit den Kotyledonen (grün),
das Endosperm (grau) und die Testa (braun).
Vier opr3-Linien (J3, J18, J18, J5) wurden
mit Wildtyppollen bestäubt. Die entstande-
nen �kleinen Samen� wurden in TechnoVit
eingebettet und längs geschnitten. Die Sa-
men aller vier Linien zeigten ein sehr ähnli-
ches Erscheinungsbild. Klar waren Testa,
Endosperm und der Embryo zu erkennen,
doch war dieser im globulären Stadium arre-
tiert. (Abb. 21). Da dieser Phänotyp bei
beiden Kreuzungen zu beobachten war, ist
die Wirkung des �silencing�-Konstruktes
Abb. 19: Samenverteilung. Nach dem Ernten der Samen beider reziproker Kreuzungen wurde eine Verteilung der Samen in große, normal entwickelte und �kleine� Samen festgestellt
Abb. 20: Zeichnung basierend auf einer Elektronenmikro-skopischen Aufnahme eines reifen Samens von Capsicum annum. Die Struktur stimmt mit der des Tomatensamens überein. Quelle: http://www.seedbiology.de/structure.asp
3 Ergebnisse
42
offenbar nicht auf den Pollen beschränkt. �Kleine Samen� sind auch bei Bestäubung mit Wildtyp
Pollen zu beobachten. Das mag auf einen Defekt im weiblichen Gametophyten hindeuten. Es
wäre aber auch ein Einfluss des Sporophyten denkbar. Ein Teil des reifen Samens, die Testa,
stammt von sporophytischem Gewebe ab, das damit durchaus einem Einfluss auf die Samen-
und Embryonalentwicklung nimmt. Um hier weitere Hinweise zu erhalten war es zunächst wich-
tig festzustellen, ob das �silencing� Konstrukt sowohl in den normalen, als auch in den kleinen
Samen nachzuweisen ist.
J3xwt J30xwt
J5xwt
Abb. 21: Embryostruktur der kleinen Samen, welche durch Kreuzung mit Wildtyppollen generiert wurden. Die beiden linken Bilder zeigen gebleichte kleine Samen, die rechten Bilder 4µm dicke Längsschnitte. Das obere rechte Bild wurde mit Toluidinblau, das untere rechte Bild nach �Etzold� gefärbt. Die Größe der Embryonen betrug etwa 200 µm.
J18xwt
3 Ergebnisse
43
Welche Samen enthalten das Konstrukt?
Um diese Frage zu beantworten wurden normale Samen auf MS Medium gekeimt, DNA wurde
aus den Kotyledonen isoliert. Im Falle der kleinen Samen war eine Keimung nicht möglich.
DNA-Isolierung aus den Samen selbst würde es nicht erlauben, zwischen sporophytischem Ge-
webe und dem weiblichen Gametophyten zu unterscheiden. Die Testa nämlich ist stets materna-
les Gewebe, und enthält somit das Konstrukt im Falle einer Kreuzung bei der die opr3-
Tomatenpflanze als weiblicher Elter eingesetzt wird. Aus technischen Gründen wurden 15 Emb-
ryonen je Kreuzungsrichtung freipräpariert und aufgearbeitet.
Unabhängig von der Kreuzungsrichtung konnte das RNAi-Konstrukt nur in den Embryonen
nachgewiesen werden (Abb. 22) . Der Defekt in der Embryonalentwicklung ist also wahrschein-
lich auf die Gegenwart des �silencing�-Konstrukts im weiblichen Gametophyten, oder nach der
Befruchtung in der Zygote und im sich entwickelnden Embryo zurückzuführen. Weitere Auf-
schlüsse über die Relevanz der OPR3 im männlichen und weiblichen Gametophyten erhoffte
man sich aus einer Analyse der relativen Häufigkeit der �grossen� und �kleinen� Samen nach
reziproken Kreuzungen.
Abb. 22: Nachweis des RNAi-Konstrukts in den Embryonen (E) und Kotyledo-nen (K). 1 % Agarosegel, welches mit EtBr gefärbt wurde. Die jeweilige Kreu-zungsrichtung (♀ x ♂) ist angegeben, ebenso wie die Herkunft der DNA aus Embryonen (E) oder Kotyledonen (K), eine Positivkontrolle (+), die Negativkon-trolle (Mastermix ohne DNA, MM) und die jeweilige Primerkombination
3 Ergebnisse
44
Samenverteilung nach Bestäubung von opr3 mit Wildtyppollen (opr3 (♀) ! wt (♂))
Pflanzen, welche sich in der T1-Generation befinden sind, wie bereits erwähnt, hemizygot. Wei-
terhin wurde davon ausgegangen, dass das Transgen in nur einer Kopie vorliegt. Damit lässt sich
die Segregation des RNAi-Konstruktes nach den Mendel�schen Regeln wie in Tabelle 1 gezeigt
vorhersagen. Demzufolge sollte die Hälfte der gebildeten Samen das Transgen vom weiblichen
Gemetophyten erhalten. Sollte die Unterdrückung der OPR3-Expression in diesem Gewebe für
den Phänotyp �kleine Samen� verantwortlich sein, dann
sollten sie mit einer Häufigkeit von 50 Prozent auftreten.
Wenn andernfalls die OPR3-Expression im Sporophyt,
also dem Gewebe des weiblichen Elternteils entscheidend
sein, dann sollten alle Samen betroffen sein. Wie in
Abbildung 23 zu erkennen wurden 801 normal
entwickelte Samen und 808 kleine Samen ausgezählt. Mit
dem aus dem Kreuzungsschema (Tab. 1) stimmen diese
Zahlen soweit überein, dass es sich um eine 1:1
Verteilung handeln könnte. Um eine gewisse Sicherheit
in diese Analyse zu bekommen, berechneten wir die
Wahrscheinlichkeit dass die Verteilung tatsächlich 1:1
beträgt mit Hilfe der Pearson�schen relativen Verteilung. Pearson�schen relativen Verteilung. Wir berechneten eine Wahrscheinlichkeit von p > 90 %.
(χ2=((801-804,5)2/804,5)+((808-804,5)2/804,5) = 0,01523 ! p > 0,90) . Somit kann gesagt wer-
den, dass in mehr als 90 Prozent der Fälle sich das Konstrukt auf die kleinen Samen verteilt und
in mehr als 90 Prozent der Fälle, die Verteilung der Samen in �groß� und �klein� eintritt.
Wildtyp Wildtyp
Mutante Mutante Wildtyp
Mutante Wildtyp
Wildtyp Wildtyp Wildtyp
Wildtyp Wildtyp
Tab. 1: Kreuzungsschema opr3 weiblich (rot: weiblich; blau: männlich)
Samenverteilung
801 808
0
100
200
300
400
500
600
700
800
große Samen kleine Samen
Anz
ahl
Abb. 23: Samenverteilung in �gro� und �klein� nach Kreuzen von opr3-Pflanzen mit Wildtyppollen
3 Ergebnisse
45
Samenverteilung nach Bestäubung des Wildtyps mit opr3 Pollen (wt (♀) ! opr3 (♂))
Obwohl der opr3 Pollen in vitro eine geringe Keimungsrate zeigte wurde er gesammelt und auf
den Stempel zuvor emaskulierter Wildtypblüten aufgebracht. Abermals drei Monate nach Be-
stäubung waren die sich entwickelnden Früchte reif und konnten geerntet werden. Wieder fiel
eine Verteilung von �kleinen� und normal entwickelten Samen auf. Das vom Pollen in die Zygo-
te eingebrachte RNAi-Konstrukt hat also einen Einfluss auf die Embryonal- und Samenentwick-
lung, wobei nicht unterschieden werden kann, ob es das �silencing� von OPR3 im Endosperm
oder im Embryo ist, was diesen Effekt verursacht (dopplete Befruchtung).
Nach Mendel tragen 50 % des Pollens das RNAi-Konstrukt und bei gleicher Fertilität beider
Pollentypen wäre auch eine 50 % Häufigkeit der �kleinen� Samen zu erwarten (Tabelle 2). Statt-
dessen wurde bei dieser Kreuzung eine Verteilung von nahezu 2:1 erhalten. 112 der geernteten
Samen waren normal entwickelt, 49 Samen waren �klein� und arretiert in der Embryonalent-
wicklung. Die χ2 Berechnung zeigt, dass diese Vertei-
lung mit einer Wahrscheinlichkeit von p < 0,05 %
(χ2=((112-80,5)2/80,5) + ((49-80,5)2/80,5) = 24,6 ! p
< 0,05) verschieden von 1:1 ist. Offenbar hat der Wild-
typ- im Vergleich zu opr3 Pollen eine etwa doppelt so
hohe Erfolgsrate, die Samenanlagen zu befruchten. Zu-
sätzlich zu dem zuvor beobachteten Einfluss des Spo-
rophyten auf die Pollenkeimung in vitro (Abb. 17 & 18)
hat das �silencing� von OPR3 offenbar also auch eine
direkte Auswirkung im männlichen Gametophy-
ten, die sich in einer verminderten Fertilität des
Pollens äußert.
Wildtyp Wildtyp
Mutante Mutante Wildtyp
Mutante Wildtyp
Wildtyp Wildtyp Wildtyp
Wildtyp Wildtyp
Tab. 2: Kreuzungsschema opr3 männlich (rot: weiblich, blau männlich)
Samenverteilung
112
49
0
20
40
60
80
100
120
große Samen kleine Samen
Anz
ahl
Abb. 24: Samenverteilung in �gro� und �klein� nach Kreuzen von Wildtyppflanzen mit opr3-Pollen
3 Ergebnisse
46
Mutante Wildtyp Wildtyp
Mutante Mutante Mutante
Mutante Wildtyp
Mutante Wildtyp
Wildtyp Wildtyp Mutante
Wildtyp Wildtyp
Wildtyp Wildtyp
3.1.6.3 Homozygote Linien durch pressen des Antherenkonus
Wie bereits bei der phänotypische Analyse beobachtet, hatte opr3 ein Problem beim Öffnen des
Stomiums, was sich in einer verminderten Freisetzung des Pollens äußerte. Durch leichtes Pres-
sen des Antherenkegels wurde versucht, die Pollenkörner zu befreien, um eine Bestäubung zu
ermöglichen. Nach dem Pressen der Kegel bildeten sich Früchte. Diese enthielten ebenfalls Sa-
men, welche in �groß� und �klein� verteilt waren. Wie in Abb. 25 gezeigt, wurden 311 große
und 432 kleine Samen ausgezählt. Dies entspricht nahezu einem Verhältnis von 2:3. Vermutlich
ist diese Verteilung das Resultat einer
Kombination der im Zusammenhang der
mit den reziproken Kreuzungen beobachte-
ten Phänomene. Wie das in Tabelle 3 ge-
zeigte Kreuzungsschema zeigt, wäre eine
2:3 Verteilung zu erwarten, wenn man für
die homozygot das �silencing�-Konstrukt
tragende Zygote Lethalität annimmt. Dies
bleibt aber zu diesem Zeitpunkt noch sehr
spekulativ und muss durch die Analyse ei-
ner grösseren Anzahl von Samen bestätigt
werden.
Tab. 3: Kreuzungsschema für opr3 ! opr3 durch pressen der Antheren (rot = weiblich, blau = männlich)
Samenverteilung
311
432
050
100150200
250300350
400450
große Samen kleine Samen
Anz
ahl
Abb. 25: Samenverteilung in �gro� und �klein� nach pressen von opr3-Pflanzen.
3 Ergebnisse
47
3.1.7 Rückgewinnung der Fertilität durch Jasmonsäure
Von der Arabidopsis opr3-Mutante weiß man, dass die Ferti-
lität durch 0,03 % Jasmonsäure regeneriert werden kann
[Stintzi and Browse, 2000]. Aus diesem Grund wurde begon-
nen, die gesamten opr3-Tomatenpflanzen jeden zweiten Tag
mit dieser Konzentration zu besprühen. Jedoch zeigten die
Pflanzen keine Reaktion auf diese Behandlung, weshalb die
Konzentration auf 0,3 % Methyljasmonsäure erhöht wurde.
Bei dieser Konzentration trockneten die Blüten sogar noch
schneller aus als ohne Behandlung (Abb. 27), dieses
Phänomen könnte auf die Seneszenzwirkung von
MeJA zurückzuführen sein [Westernack, 2005].
Aus diesem Grund wurden die Pflanzen anschlies-
send mit nur 0,003 % Jasmonsäure besprüht. Nach
etwa vier Wochen Besprühung mit dieser Konzent-
ration bildeten die Pflanzen Früchte. Die Samen in
den Früchten waren flach, durchscheinend, und
hatten ein bräunliches, punktförmiges Gewebe im
Innern welches noch nicht näher identifiziert wer-
den konnte. Die Lage dieses Gewebes könnte dem
Abb. 27: Austrocknen der Blüten nach Besprü-hung mit 0,3 % MeJA. Die Blüten trockneten im Vergleich zu unbehandelten Pflanzen schneller ab
Abb. 26: Austrocknen der Blüten ohne MeJA-Behandlung.
Abb. 28: Samen nach Besprühen mit MeJA(0,003 %). Der Pfeil kennzeichnet das im Texterwähnte bräunliche Gewebe.
Abb. 29: Samen nach andauernder Behand-lung mit MeJA (0,003 %). Die Samen sind normal entwickelt und keimfähig.
3 Ergebnisse
48
Embryo entsprechen, was aber noch nicht verifiziert wurde (Abb. 28). Es scheint als wäre durch
exogene Behandlung mit MeJA nur eine partielle Aufhebung der in den opr3-Pflanzen beobach-
teten Defekte möglich geworden. Dies mag an einer beschränkten Zugänglichkeit der betroffe-
nen Gewebe für das von Aussen applizierte MeJA liegen. Darüber hinaus mag das Zeitfenster
der Behandlung mit MeJA nicht optimal gewesen sein. Für diese Möglichkeit spricht, dass nach
MeJA Behandlung über einen längeren Zeitraum die Entwicklung normaler, keimfähiger Samen
zu beobachten war (Abb. 29).
Da die Pflanzen über längere Zeit keine keimfähigen Samen bildeten wurden sie, um weitere
Untersuchungen zu ermöglichen, über Kopfstecklinge vermehrt.
3.1.8 Fruchtbildung ohne Befruchtung (Parthenocarpie)
Nachdem die opr3-Pflanzen etwa 10 Monate lang keinerlei Früchte ohne künstlicher Bestäubung
gebildet hatten, setzten plötzlich acht verschiedene Linien (P4.2, J5, P17, J30, J34, J36, J46 J50)
insgesamt 64 Früchte an, welche wie kleine Cocktailtomaten aussahen (Abb. 30). Beim Ernten
der Früchte stellte sich heraus, dass sie keinerlei Samen enthielten (Abb. 31). Anscheinend kam
es hier zur parthenocarpischen Fruchtbildung (Fruchtbildung ohne Befruchtung). Es ist bekannt,
dass Phytohormone, insbesondere Auxine und Gibberelline, als Auslöser der parthenocarpischen
Fruchtbildung wirken können [Review: Gorguet et al., 2005]. Für die Jasmonsäure ist noch keine
Funktion in diesem Zusammenhang beschrieben worden. Die parthenocarpische Fruchtbildung
in OPR3-defizienten Pflanzen deutet auf einen Antagonismus von JA auf der einen, und Auxinen
und Gibberellinen auf der anderen Seite. Das Fehlen von JA würde somit die parthenocarpische
Fruchtbildung befördern.
Abb. 30: Fruchtbildung nach 10 Monaten inopr3 (links). Die Größe der opr3-Tomatenwar mit Cherry- bzw. Cocktailtomaten ver-gleichbar. Rechts ist eine Wildtyptomate zusehen.
Abb. 31: Aufgeschnittene opr3-Tomate (links), wel-che keinerlei Samen enthielt und eine aufgeschnittene Wildtyptomate (rechts) in welcher deutlich die Samen zu erkennen sind.
3 Ergebnisse
49
3.1.9 Luftwurzelähnliche Strukturen
Etwa zur gleichen Zeit, wie die Tomaten diese kleinen Früchte ohne Samen bildeten, wurde die
Bildung von Luftwurzel-ähnlichen Strukturen an zehn Pflanzen beobachtet (Abb. 32). Diese ent-
standen nicht nur knapp oberhalb des Erdbodens, sondern auch an Ästen, welche etwa einen hal-
ben Meter über der gegossenen Erde waren. Eine Wurzelbildung aufgrund Wasserüberschusses
kann daher ausgeschlossen werden. Aus welchem Grund die Pflanzen plötzlich wurzelähnliche
Strukturen bildet, welche mikroskopisch näher auf ihre Identität hin untersucht werden sollten,
ist unbekannt. Die Bildung von Adventivwurzeln als Folge der Seneszenz ist in Tomaten nicht
unbekannt. Sollte die hier beobachtete Wurzelbildung ein Seneszenzphänomen sein, würden
opr3-Pflanzen schneller altern als Wildtyp. Dies scheint angesichts der seneszenzfördenden Wir-
kung von JA unwahrscheinlich. Andererseits ist bekannt, dass JA das Wurzelwachstum hemmt
[Koda et al., 1997; Devoto und Turner, 2003]. Eine verminderte JA-Konzentration in den opr3-
Pflanzen könnte sich damit fördernd auf die Wurzelentwicklung auswirken.
Abb. 32: Luftwurzelbildung in 10 Monate alten Pflanzen. Links: Wildtyp, Mitte: opr3-Pflanze am Boden sind Luftwurzeln zu erkennen. Rechts: Luftwurzelbildung an opr3-Mutante an einem Zweig, welcher etwa 50 cm über dem Boden war.
3 Ergebnisse
50
3.2 Molekulare Charakterisierung der opr3-RNAi-Tomatenpflanzen
3.2.1 Akkumulieren Proteinaseinhibitoren nach Verwundung?
Jasmonate stellen wichtige Signalmoleküle in der Wundreaktion von Pflanzen dar. Sie akkumu-
lieren transient nach Verwundung und induzieren die Expression von Abwehrgenen. In Solana-
ceen handelt es sich dabei vorwiegend um Gene für Proteinaseinhibitoren, die sich gegen die
Verdauungsenzyme der herbivoren Insekten richten. In opr3-Pflanzen ist die Expression der 12-
Oxophytodiensäurereduktase, eines zentralen Enzymes des Oktadecanoidweges für die Bi-
synthese von JA, unterdrückt. Die Pflanzen können also keine JA mehr herstellen, wohl aber die
Vorstufe OPDA. Durch die Analyse der Wundreaktion in opr3-Pflanzen wurden Aufschlüsse
über die jeweilige Rolle von OPDA und JA als Signalmoleküle der Wundreaktion erwartet.
Die Fiederblättchen eines Tomatenblattes wurden mit einem Hämostaten quer über die Mittel-
rippe gequetscht. Eine Stunde nach der ersten Verwundung wurde ein zweites Mal, mehr adaxial
verwundet, und neun Stunden nach der ersten Verwundung wurde sowohl lokal (verwundete
Stelle) als auch systemisch (oberhalb der Verwundung) Blattmaterial von etwa 400 mg zur RNA
Extraktion geerntet (Abb. 33). Mittels Northern Blots wurde die Expression des Proteinaseinhibi-
tors II (PI-II), eines Markerproteins der Wundantwort in Tomatenpflanzen, untersucht. Aus Ab-
bildung 34 geht hervor, dass in den systemi-
schen Blättern der opr3-Pflanzen nach Ver-
wundung der Pflanzen die Expression des
PI-II nicht induziert wurde. Das legt den
Schluss nahe, dass diese Pflanzen nicht
mehr zur Bildung des systemischen Wund-
signals in der Lage sind.
Leider ist diese Schlussfolgerung nicht ge-
rechtfertigt, denn auch der verwundete
Wildtyp zeigt keine Akkumulation von PI-II
mRNA. Dieses Experiment ist also miss-
lungen, was aber keine technischen Ursa-
chen hat: in den Kontrollspuren ist durchaus
ein Signal für PI-II erhalten worden (Abb.
34). Als Kontrolle wurden Pfropfungen ver-
wendet, welche auf einem anderen (nicht
Abb. 33: schematische Tomatenpflanze. Dunkelblaue Striche zeigen die Verwundung zum Zeitpunkt null, hellblaue Striche Verwundung zum Zeitpunkt +1, und Kreise markieren die Blättchen aus denen RNA extra-hiert wurde.
3 Ergebnisse
51
gezeigten) Blot bereits Signale auf PI-II gezeigt hatten. Die lokale Wundantwort ist in diesem
Experiment nicht untersucht worden. Bei Wiederholung des Experimentes wird sie mit einzube-
ziehen sein.
a
b
Abb. 34: Northern Blot (b) für die systemische Antwort, ob PI-II akkumuliert mit zugehö-rigem EtBr gefärbten 1 % Agarose Gel (a), Die untersuchten Linien, sowie ob Verwundet wurde oder nicht. Verwundet (+) unverwundet (-). Sowie Kontroll-RNA aus Pfropfungen.
3 Ergebnisse
52
3.2.2 Ist OPDA oder Jasmonsäure das transportierte Signal
Durch Pfropfungen lässt sich die Frage untersuchen, welches Signalmolekül für die systemische
Reaktion nach Verwundung verantwortlich ist. So konnten Li et al. [2002] durch reziproke
Pfropfungen von JA-Synthese- und JA-Perzeptions-Mutanten zeigen, dass die Synthese von JA
in der verwundeten Pfropfunterlage notwendig für die systemische Reaktion ist. Im unverwunde-
ten Pfropfreis dagegen ist keine JA-Synthese, wohl aber die Perzeption von JA erforderlich, um
die Expression der Abwehrgene zu induzieren. Dies legt den Schluß nahe, dass es sich beim sys-
temischen Signal um JA selbst, oder um eine seiner biosynthetischen Vorstufen handelt. Zur
gleichen Schlussfolgerung kamen auch Strassner et al. [2002] die zeigten, dass die JA in den
verwundeten Blättern von Tomatenpflanzen transient akkumuliert, nicht aber in den unverwun-
deten, systemischen Blättern. Für eine Rolle der biosynthetischen Vorstufe OPDA spricht der
Befund, dass die opr3 Mutante in Arabidopsis eine im Vergleich zum Wildtyp uneingeschränkte
Resistenz gegenüber Bradysia-Larven aufweist [Stintzi und Browse, 2000] Zudem konnte mit
Hilfe der Arabidopsis opr3 Mutante gezeigt werden, dass OPDA eine Abwehrgen-induzierende
Wirkung hat [Stintzi et al., 2001]. Gegen eine Rolle von OPDA als das systemische Wundsignal
sprechen Befunde von Li et al. [2005] die zeigten, dass die β-Oxidation zur Verkürzung der Ok-
tansäure-Seitenkette der OPDA notwendig für die systemische Wundantwort ist. Um in dieser
Abb. 35: Bilder einer gepfropften Pflanze. Das linke Bild zeigt die gesamte Pflanze, das rechte Bild die Pfrop-fung. Der Pfeil deutet auf die Pfropfstelle. In diesem Fall ist die Wildtyppflanze die Unterlage, welche später verwundet wurde, und der Spross einer opr3-Pflanze wurde als Pfropfreis eingesetzt.
3 Ergebnisse
53
noch offenen Frage, ob es sich nämlich bei dem systemischen Signal um JA oder um OPDA
handelt, Klarheit zu schaffen wurden hier Pfropfungen von Tomatenpflanzen des Wildtyps mit
opr3- und aos-RNAi-Linien hergestellt und auf ihre Fähigkeit zur systemischen Induktion der
PI-II Expression untersucht.
3.2.2.1 Pfropfungen Wildtyp mit opr3
Es wurden wie bei Li et al. (2002) beschrieben Pfropfungen von Wildtyppflanzen als Unterlage
und opr3-Pflanzen als Pfropfreis durchgeführt (Abb. 35). Die Pfropfunterlage wurde wie oben
beschrieben verwundet (Abb. 33) und neun Stunden nach der ersten Verwundung wurde Blatt-
material von etwa 400 mg jeweils von der Stockpflanze als auch vom Pfröpfling geerntet und
mittels Northern Blots auf die Expression von PI-II hin untersucht.
Für den Fall, dass OPDA das transportierte Signal ist, im systemischen Gewebe aber die Um-
wandlung zu JA erforderlich ist, um die Expression von Proteinaseinhibitoren zu induzieren,
dann sollte nach einer Verwundung der Wildtyp-Unterlage die Bildung des PI-II Transkriptes
lediglich im unteren � dem Wildtypteil � nachweisbar sein. Wenn jedoch OPDA ausreichend
sein sollte, dann müsste im opr3-Pfropfreis ebenfalls die mRNA des PI-II nachgewiesen werden
können. Im Falle der reziproken Pfropfung mit opr3 als Unterlage und dem Wildtyp als Pfropf-
reis wäre eine Induktion der PI-II mRNA im Pfropfreis nur dann zu erwarten, wenn OPDA als
systemisches Signal ausreicht. Ein Ausbleiben der systemischen Antwort würde in diesem Fall
auf die JA selbst, oder zumindest auf einen Stoff downstream von OPR3 als systemisches Signal
hindeuten.
Eine Pfropfung (dargestellt als �Unterlage/Pfropfreis�=wt/J6, bzw. J6/wt) wurde zunächst im
unverwundeten Zustand auf die Expression des PI-II getestet, um sicherzustellen, das der durch
die Pfropfung ausgeübte Wundstress abgeklungen war. In den unverwundeten Kontrollen J6/wt
und wt/J6 liess sich das Transkript des PI-II nicht nachweisen. Hieraus kann geschlossen werden,
dass die nach der Pfropfung erfolgte Wundreaktion bereits abgeklungen war, und dass diese
Pflanzen auch durch andere Umstände nicht verwundet waren (Abb. 36)
3 Ergebnisse
54
Bei Pfropfung der Linie J33 auf eine Wildtypunterlage (wt/J33) wurde nach Verwundung der
Unterlage eine lokale wie auch die systemische Akkumulation des PI-II Transkriptes beobachtet.
Offensichtlich ist in der Unterlage das systemische Signal gebildet worden, und im Pfropfreis ist
die OPR3 nicht erforderlich, um auf dieses Signal zu reagieren. In der reziproken Pfropfung
Abb. 36: Northern Blots (c) zum Nachweis von PI-II in Pfropfungen von Wildtyp (wt) mit ver-schiednen opr3-Linien. Es wurde jeweils die Pfropfunterlage verwundet, der fett dargestellte Teilder gepfropften Pflanze wurde in der jeweiligen Spur des Gels analysiert. (b): 1 % Agarosegelmit EtBr gefärbt wurde. Die Pfropfungen J6 mit wt wurden als unverwundete Kontrolle verwen-det.
J6 J6 wt wt J7 J7 wt wt J33 J33 wt wt
wt wt J6 J6 wt wt J7 J7 wt wt J33 J33
unverwundet
a
b
c
wt P2 P2 wt
P2 P2 wt wt a
b
c
Abb. 37: Northern Blots (c) zum Nachweis von PI-II in Pfropfungen von Wildtyp (wt) mit verschiednen opr3-Linien. Es wurde jeweils die Pfropfunterlage verwundet, der fett dargestellte Teil der gepfropften Pflanze wurde in der jeweiligen Spur des Gels analy-siert. (b): 1 % Agarosegel mit EtBr gefärbt wurde. Die Pfropfungen J6 mit wt wurden als unverwundete Kontrolle verwendet.
3 Ergebnisse
55
(J33/wt) war die lokale Wundreaktion der Unterlage sehr eingeschränkt, und eine systemische
Reaktion im Wildtyp Pfropfreis war nicht nachweisbar (Abb. 36). OPR3 ist also lokal für die
Bildung des systemischen Signals erforderlich. Ein ähnliches Ergebnis wurde für die Pfropfun-
gen wt/P2 und P2/wt erhalten, wenn auch hier die Wundreaktion in P2/wt nicht ganz so stark
unterdrückt war wie in J33/wt (Abb. 36). Ein abweichendes Bild ergaben die Pfropfungen mit
der Linie J7 hier erfolgte auch in der verwundeten Wildtyp-Unterlage keine Wundreaktion.
Da das beschrieben Pfropfexperiment kein einheitliches Ergebnis lieferte, wurde es mit neuen
Pfropfungen wiederholt. Das Ergebnis ist widersprüchlich und in Abb. 37 gezeigt. In einigen
Fällen war auch nach Verwundung der Wildtyp-Unterlage keine Induktion des PI-II Transkriptes
festzustellen. Offenbar war die Wundreaktion in diesen Pflanzen kompromittiert, weswegen aus
diesem Experiment keine weiteren Schlüsse auf die Natur des systemischen Wundsignals gezo-
gen werden sollten.
3.2.2.1 Pfropfungen Wildtyp mit aos
Auf die gleiche Weise wie zuvor wurden
auch Pfropfungen zwischen wt und aos-
RNAi-Tomatenpflanzen angefertigt, wel-
che ebenfalls am Institut vorhanden waren
und für diese Versuche zur Verfügung
gestellt wurden. Aus dieser Pfropfung
erhofften wir uns, herauszufinden, ob
OPDA das Signal zur Induktion von PI-II
ausreicht, denn bei dieser Mutante fehlt
bekanntlich das OPDA, somit ist dies eine
sehr gute Methode dies herauszufinden.
Abb. 38 zeigt den Northern Blot, auf wel-
chen RNA aufgetragen wurde, welche von
Pfropfungen zwischen wt und aos-RNAi-
Tomatenpflanzen stammte. Die unver-
wundete Kontrolle zeigt keine Bildung
von PI-II, weder im Unterteil noch im
Oberteil, egal ob diese Wildtyp oder aos
war. Allerdings blieb auch in verwundeten
Abb. 38: Northernblot (b) von Pfropfungen von wt und aos-Tomatenpflanzen. Unterstrichene und dickgedruckte Bezeichnungen geben die Herkunft der RNA an, der Strich stellt die Pfropfung dar. Auf dem linken Blot ist die RNA von unverwundeten Kontrollen und im rechten Blot die der verwundeten Pflanzen zu sehen. Verwundet wurde der untere Teil der Pfropfung. Auf das Gel wurde 2,5 µg RNA aufgetragen. (a) stellt die mit EtBr gefärbte Ladungskontrolle dar.
unverwundet
wt aos wt
wtaos wt
aos
aos
wt aos wt
wt aos wt
aos
aos
a
b
3 Ergebnisse
56
Wildtyp-Unterlagen die Induktion des PI-II Transkriptes aus. Offenbar war auch in diesen Pflan-
zen die Wundreaktion kompromittiert. Die Ergebnisse sind also nicht interpretierbar. Eine mög-
liche Ursache mag in einer Infektion der Pflanzen durch den Tomaten Mosaikvirus (ToMV) lie-
gen (s. Diskussion).
4 Diskussion
57
4. Diskussion
Ein zentrales Gen der JA-Biosynthese ist die OPR3. Sie katalysiert die Umsetzung von OPDA zu
OPC8:0 unter Verwendung von NADPH. Um nun zu überprüfen, welche Funktion OPR3 in
Tomate hat, beziehungsweise was geschieht, wenn keine Jasmonsäure gebildet werden kann,
wurden im Vorfeld dieser Arbeit Pflanzen mittels RNA-Interferenz generiert, bei welchen die
OPR3 herunterreguliert sein sollte.
Obwohl die Folgen des Funktionsverlustes von OPR3 in Arabidopsis detailliert untersucht wor-
den sind, müssen die Arbeiten auf Tomate ausgedehnt werden, da die Ergebnisse nicht unbedingt
auf Tomate übertragen werden können.Dies wird schon daran deutlich, dass die Mutanten in
Arabidopsis welche einen Defkt in entweder der Bildung oder der Erkennung von Jasmonaten
eine männliche Sterilität zeigen [Feys et al., 1994; McConn und Browse; 1996; Sanders et al.,
2000; Stintzi und Browse, 2000; Ishiguro et al., 2001; Park et al., 2002; von Malek et al., 2002].
In Tomate wurde kürzlich auch eine Mutante charakterisiert, welche nicht in der Lage war Jas-
monsäure (jai1 für JASMONATE INSENSITIVE), zu erkennen. Sie war im Gegensatz zu den
erwähnten Arabidopsis-Mutanten nicht männlich steril, sondern zeigte vielmehr ein Defekt an
der Kontrolle der Entwicklung des weiblichen Gametophyten [Li et al., 2004].
Des weiteren ist bekannt, dass Mutanten, welche an der Bildung und Erkennung von Jasmonaten
beteiligt sind, ein Defizit in der Pathogenantwort aufweisen. Mit einer bisher bekannten Aus-
nahme: die opr3-Mutante in Arabidopsis zeigt sich nicht beeinträchtigt in der Resistenz gegen
die Larven der Bradysia-Mücke und den pathogenen Pilz Alternaria brassicicola. Hierfür wird
OPDA als Signalmolekül verantwortlich gemacht, welches diese Resistenz hervorruft [Stintzi et
al., 2001]. In Tomate wurde bis jetzt nur gezeigt, dass eine Mutante, welche downstream von
OPR3 liegt (acx) keine derartige Möglichkeit der Reaktion auf Insektenlarven hat � sie ist anfäl-
lig gegen Larven des Tabakschwärmers (Manduca sexta) [Li et al., 2005]. Dies könnte ein Hin-
weis darauf sein, dass OPDA nicht in der Lage ist Jasmonsäure in Tomatenpflanzen zu ersetzen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Versuche unternommen, diese Hypothese zu bekräftigen oder
zu widerlegen.
4 Diskussion
58
4.1 Ist OPDA ein Wundsignal?
Viele Pflanzen reagieren auf Insektenfraß und mechanische Verwundung mit der Expression von
Genen, welche an der Wundheilung und Abwehr beteiligt sind. Sowohl an der Verwundungsstel-
le als auch im gesamten Organismus entfalten sie nach der Verwundung ihre Wirksamkeit
[Green und Ryan, 1972]. Von hier ab, entbrannte eine bis heute andauernde Diskussion über
das/die Signal/e, welche diese �Immunantwort� auslöst/en.
Pfropfungsexperimente zwischen spr2/LeFad7 und jai1-2 zeigten ganz klar, dass Jasmonate eine
Signalrolle in der Wundreaktion der Tomate spielen [Li et al., 2002] Spr2 ist nicht in der Lage
Fettsäuren, welche zweifach ungesättigt sind, in dreifach ungesättigte umzuwandeln. Dies hat
zur Folge, dass für die Bildung von Jasmonaten die mehrfach ungesättigten Fettsäuren Linolen-
säure und Hexatriensäure fehlen. Jai1-2 dagegn ist wie die Arabidopsis coi1-Mutante JA insensi-
tiv. Die gepfropften Pflanzen zeigten nach Verwundung keinerlei Reaktion in Bezug auf die
Bildung von Proteinaseinhibitoren, weder systemisch noch lokal. Proteinaseinhibitoren wurden
jedoch gebildet, wenn die Pflanzen mit Methyljasmonsäure besprüht wurden.
Weitere Pfropfungsexperimente zwischen der JA defizienten def1- und der JA-insensitiven jai1-
Mutante zeigten, dass für eine erfolgreiche Wundreaktion lokal die Synthese von Jasmonaten
erforderlich ist. In systemischen Geweben dagegen ist nicht die Synthese sondern die Perzeption
von Jasmonaten für die Induktion der Abwehrgene notwendig [Li et al., 2002]. Damit in Ein-
klang stehen auch die Befunde von Strassner et al. (2002), die zeigten, dass es nach Verwundung
von Tomatenpflanzen lokal aber nicht systemisch zu einem transienten Anstieg im JA Gehalt
kommt. Diese Arbeiten liefern keinen Aufschluss darüber, ob JA oder die biosynthetische Vor-
stufe OPDA als Signalmolekül in Frage kommen. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf
hin, dass OPDA nicht als systemisches Signal für eine Wundreaktion ausreichend ist, wohl aber
lokal.
Zu diesem Schluß gelangten auch Li et al., [2005], die ihre Ergebnisse veröffentlichten während
diese Arbeit erstellt wurde. Dort wurde eine Mutante vorgestellt, welche ihren Defekt
�downstream� von opr3 hatte. Dieser Defekt lag im ersten Schritt der β-Oxidation. Die Ergeb-
nisse von Pfropfungsexperimenten zeigten, dass für die systemische Wundreaktion die Verkür-
zung der Seitenkette von OPC8:0 notwendig ist. Die Fragestellung, ob Jasmonsäure oder OPDA
die transportierten Signale sind wurde im Rahmen dieser Arbeit erneut aufgegriffen, konnte aber
mit Hilfe der hier durchgeführten Pfropfungsexperimente zwischen Wildtyp, opr3 und aos nicht
abschließend geklärt werden. So wurden PIs nach Verwundung von opr3-Unterlagen in diesen
4 Diskussion
59
jedoch nicht im Wildtyp Pfropfreis gebildet. Dies würde darauf hin deuten, dass OPDA kein
transportiertes Signal ist. Vielmehr hat es den Anschein, dass JA ein transportiertes Signal dar-
stellt. Denn in der reziproken Pfropfung wurden sowohl in der Wildtyp-Unterlage als auch im
oberen opr3-Teil PIs nachgewiesen. Was allerdings etwas zu denken gab, war der Befund dass in
einigen Experimenten nach Verwundung der Wildtypunterlage keine Bildung von PIs im oberen
opr3-Teil zu finden war. Dies würde bedeuten, dass weder JA noch OPDA transportiert wird.
Dieses Ergebnis ist jedoch mit den zuvor gemachten Untersuchungen in keinen Konsens zu brin-
gen. Deshalb muss hier davon ausgegangen werden, dass die herbivorspezifische Wundabwehr
herunterreguliert sein muss. Dies kann zum Beispiel durch eine Virusinfektion geschehen.
Durch einen Zufall wurde das ToMV im Gewächshaus festgestellt. Die ToMV Infektion hat
eine sehr große Auswirkung auf die Pfropfungen und Wundantworten. Eine Infektion von Viren
führt bei Pflanzen zur Bildung von Salicylsäure. Preston und andere hatten 1999 gezeigt, dass
mit TMV (Tabakmosaikvirus) infizierte Tabakpflanzen, welche Salicylsäure bildeten und somit
auch die Systemisch Erworbene Resistenz (SAR = Systemic-acquired resistance) nicht in der
Lage waren, JA-abhängige Abwehrgene zu exprimieren. Dies ist auf die zur Jasmonsäure anta-
gonistische Wirkung der Salicylsäure zurückzuführen, welche über das regulatorische Protein
NPR1 vermittelt wird [Dong, 2001; Pieterse und van Loon, 2004]. Allem Anschein zur Folge,
muss NPR1 nicht in den Kern transportiert werden, um die Jasmonsäureantwort herunterzudros-
seln. Vielmehr scheint NPR1 im Cytosol dies zu bewerkstelligen. Die genaue Wirkung von
NPR1 auf die Expression von Jasmonsäure-abhängigen Genen ist unbekannt. Eine mögliche
Rolle könnte, der als negativer Regulator der Jasmonsäure-abhängigen Abwehrgenexpression
dienende SCFCOI1-Ubiquitin-Ligase-Komplex [Devoto et al., 2002; Xu et al., 2002] spielen. Über
eine gezielte Ubiquitinylierung und anschließenden Abbau der auf diese Weise markierten Prote-
ine durch das Proteasom, werden so die auf die Jasmonsäure folgenden Abwehrantworten ge-
steuert [Review: Pozo et al. 2005].
Abb. 39: Wechselwirkung verschiedener Signalmoleküle in pflanzlichen Abwehrreaktionen [Kunkel und Brooks,2002]
4 Diskussion
60
Abb. 39 zeigt die Wechselwirkungen verschiedener Signalmoleküle nach Pathogenbefall in
Pflanzen. In dieser Grafik sind drei Möglichkeiten der Pathogenerkennung herausgearbeitet, der
Ethylen-, der Salicylsäure- und der Jasmonsäureweg. Nach einer Verwundung durch Bakterien
wird der Ethylenstoffwechsel aktiviert, welcher zur Bildung von Ethylen und schließlich zur
Bildung von ROS (Reactive-Oxygen-Species) führt. Der Ethylenstoffwechsel kann durch den
Jasmonsäurestoffwechsel ebenfalls aktiviert werden und umgekehrt. Virale und andere bakteriel-
le Pathogene lösen hingegen eine Reaktion aus, welche in Richtung Salicylsäure wirkt. Eine
ToMV-Infektion der Versuchspflanzen könnte also zur Bildung von Salizylsäure geführt haben,
welche sich dann negativ auf die Induktion der JA-abhängigen Abwehrgene ausgewirkt haben
mag. Mit Hilfe eines polyklonalen, gegen das Hüllprotein des ToMV gerichteten Antikörpers,
(Geschenk von Prof. A. Pfitzner, Allgemeine Virologie, Uni Hohenheim) wurden die Versuchs-
pflanzen auf ein mögliche ToMV Infektion hin untersucht. Eine Dot-Blot Analyse zeigte, dass
viele opr3-Pflanzen, darunter auch die gepfropften Versuchspflanzen, mit ToMV infiziert waren
(Abb. 40).
4.2 Einfluss von OPDA und JA auf die Entwicklung
Wie bereits erwähnt, haben Jasmonate � als Phytohormone � einen Einfluss auf die Entwicklung
von Pflanzen [Wasternack, 2005]. So konnte gezeigt werden, dass Arabidopsis-Pflanzen, welche
ein Defizit in der Bildung und Erkennung von Jasmonaten haben, einen Defekt in der Ausbil-
Abb. 40: Dotblot-Analyse zum Test auf Tomatenmosaikvirusbefall (durchgeführt von Jutta Ba-bo).In der oberen Hälfte wurden Proteinextrakte von aos-Tomatenpflanzen, in der unteren von opr3-Tomatenpflanzen aufgetragen.
aosopr3
4 Diskussion
61
dung des männlichen Gametophyten haben [Feys et al., 1994; McConn und Browse; 1996; San-
ders et al., 2000; Stintzi und Browse, 2000; Ishiguro et al., 2001; Park et al., 2002; von Malek et
al., 2002]. Hause et al., [2000] zeigten indes, dass in Tomatenpflanzen die Bildung von Jasmona-
ten hauptsächlich in Blütenknospen, -stängeln und Wurzeln stattfindet. Dies deckt sich mit der
Erkenntnis, dass Jasmonate die Entwicklung des weiblichen Gametophyten regulieren [Li et al.,
2004], sie zeigten, dass jai1-Pflanzen nicht in der Lage waren auf Jasmonate zu reagieren und
auf die Entwicklung des weiblichen Gametophyten Einfluss nimmt. In Tomatenpflanzen dage-
gen führt JA-Insensitivität nach Li et al. (2004) zu einem Defekt in der Entwicklung des weibli-
chen Gametophyten. Der Phänotyp der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten opr3-Pflanzen
deutet dagegen auf eine Rolle von Jasmonsäure in der Embryonalentwicklung. So kam es bei
Bestäubung emaskulierter opr3-Pflanzen mit Wildtyppollen zur Bildung von �kleinen� Samen,
welche einen im globulären Stadium arretierten Embryo besaßen. Dieses Ergebnis wäre noch mit
einem Defekt im weiblichen Gametophyten oder sogar durch einen Einfluss des Sporophyten
erklärbar. Das gleiche Ergebnis wurde aber auch bei der reziproken Bestäubung von Wildtyp-
pflanzen mit mutantem Pollen gewonnen. Der Phänotyp wird also durch die Anwesenheit des
�silencing�-Konstruktes im sich entwickelnden Samen verursacht. Da bei der doppelten Befruch-
tung jeweils ein Spermakern mit dem Endospermkern und der Eizelle verschmilzt, kann nicht
unterschieden werden, ob es der OPR3 Funktionsverlust im Endosperm oder im Embryo ist, der
für den Phänotyp verantwortlich ist. Weiterhin wurde in opr3-Tomatenpflanzen beobachtet, dass
die Blüten austrockneten und von den Pflanzen abfielen, da es nicht zu einer Bestäubung kam.
Die Fertilität konnte wie in Arabidopsis durch die Gabe von MeJA wieder hergestellt werden.
Offenbar ermöglicht MeJA sowohl die Bestäubung, als auch die Komplementierung des defektes
in der Embryonalentwicklung. Das Zeitfenster der Wirksamkeit von MeJA scheint in opr3-
Tomaten wie auch in Arabidopsis eine wichtige Rolle zu spielen. Anfangs war nur eine partielle
Aufhebung der Defekte in opr3-Pflanzen zu beobachten: Es kam nach MeJA-Behandlung zur
Bildung von Früchten mit durchscheinenden, nicht keimfähigen Samen. das für MeJA gabe
kritische Stadium der Blütenentwicklung konnte in opr3-Tomaten noch nicht exakt bestimmt
werden. Es hat jedoch den Anschein, als würde Jasmonsäure in der frühen Blütenentwicklung
benötigt. Übereinstimmend konnten Hause et al., (2000) zeigen, dass es in gerade diesem Sta-
dium zur verstärkten Expression von AOC und zur Bildung von Oxylipinen kommt.
Letztlich wurden in opr3-Pflanzen noch zwei Veränderungen beobachtet, die traditionell eher
mit Auxinen als mit Jasmonaten in Verbindung gebracht werden: die parthenocarpische Frucht-
bildung und die Entwicklung von Adventivwurzeln. Es bleibt letztlich ungeklärt, ob diese Phä-
nomene auf das �silencing� von OPR3 zurückzuführen sind. Alternativ wäre denkbar, dass die
ToMV-Infektion indirekt zur Aktivierung Auxin-abhängiger Gene und damit zur Auslösung die-
4 Diskussion
62
ser Auxin-abhängigen Reaktionen geführt hat. Auxinabhängige Gene besitzen in ihren Promo-
toomren ein Element, welches sich AS1 (Activating Sequence) nennt [Niggeweg et al., 2000].
Das gleiche Element findet sich im 35S-Promotor des Blumenkohl Mosaikvirus (CaMV) und in
Promotoren, welche durch Salicylsäure aktiviert werden [Niggeweg et al., 2000]. Wenn infolge
der ToMV-Infektion die Konzentration an Salicylsäure steigt, hätte dies die Aktivierung aller
Gene zur Folge, die durch das AS1-Element reguliert werden, einschließlich der Gene der Au-
xin-Antwort [Niggeweg et al., 2000]. Das ToMV würde also indirekt eine Auxinreaktion auslö-
sen, hier die Bildung von Adventivwurzeln und die Parthenocarpie (Abb. 30-32)
Somit könnte das Modell der Wechselwirkung der verschiedenen Phytohormone wie folgt aus-
sehen: Unterschiedliche Umwelteinflüsse führen zur Bildung von Jasmonaten oder Auxinen.
Jasmonate führen zu der spezifischen Abwehrreaktion. Coi1 bzw. sein ortholog jai1 führen zur
Hemmung der Wurzelbildung. Da nun aber keine Jasmonsäure gebildet werden kann, welche
über COI1 oder JAI1 erkannt werden kann, wird das Wurzelwachstum auch nicht gehemmt. Da
nun noch zusätzlich eine virale Infektion auftrat, welche schließlich zur Bildung von Salicylsäure
führte, und diese die Auxinreaktion zusätzlich fördern könnte, führt dies zu einer erhöhten Wur-
zelbildung und zur Bildung samenloser Früchte (Abb. 41).
Abb. 41: Modell der Wechselwirkungen zwischen Jasmonaten, Auxinen und Salicyl-säure. Pfeile zeigen eine Stimulanz, Linien mit Querbalken eine Hemmung. Verän-dert nach Devoto und Turner, 2003
V ersch. Umwel teinflüsse
JA Auxine
Virus
Salicylsäure
Coi1/jai1
Abwehrreaktion Abwehrreaktionen Wurzelwachstum Parthenocarpie
4 Diskussion
63
4.3 Ausblick
Die Arbeiten an opr3 sind keines Falls abgeschlossen. Am interessantesten wäre zu wissen, ob
OPDA ein transportiertes Signal zur systemischen Wundreaktion ist oder nicht, da wegen der
Virusinfektion dies nicht eindeutig belegt werden, gibt es dennoch Hinweise hierauf.
In Bezug auf die phänotypische Charakterisierung ist noch wichtig zu überprüfen, ob der Pollen
tatsächlich wegen eines nicht geöffneten Stomiums freigesetzt wird. Um dies zu überprüfen
würden sich Querschnitte durch den Antherenkonus anbieten. Der Pollen sollte nicht nur auf
Keimfähigkeit sondern auch auf Vitalität in Bezug auf die Pollenkerne untersucht werden.
Die Virusinfektion � so schlecht sie für die Überprüfung von Wundreaktionen ist, könnte aber
auch ein interessantes �Hilfsmittel� sein, um noch mehr über das komplexe Zusammenspiel zwi-
schen den verschiedenen Phytohormonen bes. Auxinen zu erfahren.
Da in Cocktailtomaten stets sehr viele Samen enthalten sind, könnte die Parthenocarpie auch für
die Züchtung neuer Nutzarten ein gewisses Interesse beinhalten.
Die Regeneration durch Besprühen mit MeJA sollte eventuell etwas verfeinert werden, eventuell
entspricht die verwendete Konzentration nicht der gebrauchten Konzentration überein und man
könnte noch schneller in eine weitere Generation kommen, außerdem könnte versucht werden
zusätzlich zur Besprühung MeJA zu injizieren, denn es wurden Ergebnisse veröffentlicht wo-
nach Jasmonsäure hauptsächlich in Siebelementen gebildet wird [Hause et al., 2003a]. Durch
Injektion könnte man dieses Gewebe leichter erreichen.
Auch sollte der Gehalt an Jasmonaten in opr3-Pflanzen im Gegensatz zu Wildtyppflanzen getes-
tet werden für diese Untersuchungen würden sich Gaschromatographische Untersuchungen am
besten eignen.
Pfropfungen zwischen Wildtyp und opr3 könnten ebenfalls einen Aufschluss über die Fähigkeit
der Reaktion auf Herbivorie (z. B. durch Manduca sexta-Larven) ergeben. Außerdem wären
Versuche bezüglich des Unterschieds der Nahrungsaufnahme zwischen opr3 und wt-Pflanzen
sehr interessant, da diese Aufschluss über die Nahrungsverwertung geben könnte, wenn Protei-
naseinhibitoren durch das Ausschalten von OPR3 fehlen.
Die Überexpression von OPR3 könnte eine erhöhte Resistenz von Pflanzen gegen Insektenfraß
darstellen, und sollte ebenfalls getestet werden.
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Xu L, Liu F, Lechner E, Genschik P, Crosby WL, Ma H, Peng W, Huang D, Xie D. (2002)
The SCF(COI1) ubiquitin-ligase complexes are required for jasmonate response in Arabidopsis.
The Plant Cell 14: 1919-1935.
5.2 Abbildungen und Tabellen
Abbildungen
Abb. 1: 3R,7S-Jasmonsäure (JA)
Abb. 2: Die Wirkungen von Jasmonaten auf Stressoren, und ihre Beteiligung an der
pflanzlichen Entwicklung (aus Wasternack C. 2005, JPGR).
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Abb. 3: Oktadekanoidweg nach Schaller et al., 2005
Abb. 4: Biosynthese der Jasmonsäure in ihren Zellorganellen, Farben, welche kräftig
gedruckt sind experimentell nachgewiesene Daten, während die transparente
Hypothesen präsentieren. Die gepunkteten Pfeile weisen auf Hypothetischen
Transporte weg hin. [aus Schaller, et al., 2005]
Abb. 5: MGDG-O und OPDA
Abb. 6: Signalkaskade nach (herbivorer) Verwundung zur Bildung von Jasmonsäure
und schließlich auch von Abwehrgenen. Mit Oktadekanoidweg, welcher zur
Bildung von Jasmonsäure führt.
Abb. 7: Blüte von Arabidopsis im Stadium 13 der Blütenentwicklung (oben) und Pol-
lenkeimung (unten), im Vergleich von Wildtyp (links) zu opr3-Mutante
(rechts). (Bilder freundlicher Weise von Annick Stintzi zur Verfügung ge-
stellt)
Abb. 8: Signaltransduktionskaskade von Jasmonsäure, im Wt (links) und coi1 (rechts).
Die beiden Substratgruppen (S1 und S2) werden durch das JA-Signal, welches
den SCFCOI-Komplex aktiviert, ubiquitinyliert und schließlich über das 26S-
Proteasom abgebaut. Die beiden Antwortgene (G1 und G2) bilden schließlich
die entsprechenden Antworten (Response I und II) (aus Xiao et al., 2004)
Abb. 9: Microarray-Analyse. Links, Vergleich von verwundeten (W) und unverwun-
deten (C=Controle) Blättern (! W/C). Rechts, das Verhältnis von Systemi-
schen (S) zu Verwundeten (W) Blättern. Der obere Teil zeigt das die Gene des
Oxilipinstoffwechsels, der mittlere, die der Wundantwort und die der Patho-
genabhänhigen Gene, im unteren Teil sind die Gene, welche an der Bildung
von aromatischen Aminosäuren benötigt werden gezeigt [aus Strassner et al.,
2002].
Abb. 10: Schematischer Aufbau der Westernblotapparatur. Aus Diplomarbeit von Dirk
Zimmermann
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Abb. 11: pRTL2-FAD2-Intron-Vektor mit OPR3 in Sense- und Antisense-Orientierung.
Die Restriktionsschnittstellen sind angegeben, wie auch die Left- und Right-
Border (LB und RB) der T-DNA, die Position des 35S Promotors und des
Terminators (Term)
Abb. 12: Primerkarte des RNAi-Konstrukts. Pfeile deuten die Bindungsstellen der Pri-
mer an
Abb. 13: Nachweis des RNAi-Konstrukts in den transgenen Pflanzen. 1 % Agarosege-
le, welche mit EtBr gefärbt wurden. Die jeweilige opr3-Linie, ist angegeben,
ebsenso sind die Spuren mit gleichbehandelter wt DNA (wt), der Negativkon-
trolle (Mastermix ohne DNA, MM), und der Positivkontrolle (+), wie auch die
einegsetzten Primerkombinationen angegeben.
Abb. 14: Westernblot (a) mit dazugehörigen Coomassie-gefärbten (b) Gel. Aufgetragen
wurden Proteinextrakte dreier verschiedener opr3-RNAi-Linien (Lines) und
des Wildtyps jeweils unverwundet (-) und verwundet (+) (15 µg) sowie aufge-
reinigtes OPR3 (10 ng); Grössenstandard.
Abb. 15: Westernblot (a) mit dazugehörigen Ponceaugefärbten-Blot (b). Aufgetragen
wurden Proteinextrakte dreier verschiedener opr3-RNAi-Linien (Lines), und
des Wildtyps, jeweils unverwundet (-) und verwundet (+) (15 µg) sowie auf-
gereinigte OPR3 (10 ng) und ein Grössenstandard.
Abb. 16: Phänotyp der LeOPR3-RNAi-Pflanzen. Die Blüten von opr3-Pflanzen trock-
nen aus und fallen ab, während der Wildtyp Früchte bildet.
Abb. 17: Pollenkeimungsrate von wt und vier verschiedenen opr3-Linien (J3, P10, J30
und J18). n(wt) = 1403, n(J3) = 406, n(P10) = 544, n(J30) = 1743, n(J18) =
1717
Abb. 19: Samenverteilung. Nach dem Ernten der Samen beider reziproker Kreuzungen
wurde eine Verteilung der Samen in große, normal entwickelte und �kleine�
Samen festgestellt
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Abb. 20: Zeichnung basierend auf einer Elektronenmikroskopischen Aufnahme eines
reifen Samens von Capsicum annum. Die Struktur stimmt mit der des Toma-
tensamens überein. Quelle: http://www.seedbiology.de/structure.asp
Abb. 21: Embryostruktur der kleinen Samen, welche durch Kreuzung mit Wildtyppol-
len generiert wurden. Die beiden linken Bilder zeigen gebleichte kleine Sa-
men, die rechten Bilder 4µm dicke Längsschnitte. Das obere rechte Bild wur-
de mit Toluidinblau, das untere rechte Bild nach �Etzold� gefärbt. Die Größe
der Embryonen betrug etwa 200 µm.
Abb. 22: Nachweis des RNAi-Konstrukts in den Embryonen (E) und Kotyledonen (K).
1 % Agarosegel, welches mit EtBr gefärbt wurde. Die jeweilige Kreuzungs-
richtung (♀ x ♂) ist angegeben, ebenso wie die Herkunft der DNA aus Emb-
ryonen (E) oder Kotyledonen (K), eine Positivkontrolle (+), die Negativkon-
trolle (Mastermix ohne DNA, MM) und die jeweilige Primerkombination
Abb. 23: Samenverteilung in �gro� und �klein� nach Kreuzen von opr3-Pflanzen mit
Wildtyppollen
Abb. 24: Samenverteilung in �gro� und �klein� nach Kreuzen von Wildtyppflanzen
mit opr3-Pollen
Abb. 25: Samenverteilung in �gro� und �klein� nach pressen von opr3-Pflanzen.
Abb. 26: Austrocknen der Blüten ohne MeJA-Behandlung.
Abb. 27: Austrocknen der Blüten nach Besprühung mit 0,3 % MeJA. Die Blüten trock-
neten im Vergleich zu unbehandelten Pflanzen schneller ab
Abb. 28: Samen nach Besprühen mit MeJA (0,003 %). Der Pfeil kennzeichnet das im
Text erwähnte bräunliche Gewebe.
Abb. 29: Samen nach andauernder Behandlung mit MeJA (0,003 %). Die Samen sind
normal entwickelt und keimfähig.
5 Verzeichnisse
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Abb. 30: Fruchtbildung nach 10 Monaten in opr3 (links). Die Größe der opr3-Tomaten
war mit Cherry- bzw. Cocktailtomaten vergleichbar. Rechts ist eine Wildtyp-
tomate zu sehen.
Abb. 31: Aufgeschnittene opr3-Tomate (links), welche keinerlei Samen enthielt und
eine aufgeschnittene Wildtyptomate (rechts) in welcher deutlich die Samen zu
erkennen sind.
Abb. 32: Luftwurzelbildung in 10 Monate alten Pflanzen. Links: Wildtyp, Mitte: opr3-
Pflanze am Boden sind Luftwurzeln zu erkennen. Rechts: Luftwurzelbildung
an opr3-Mutante an einem Zweig, welcher etwa 50 cm über dem Boden war.
Abb. 33: schematische Tomatenpflanze. Dunkelblaue Striche zeigen die Verwundung
zum Zeitpunkt null, hellblaue Striche Verwundung zum Zeitpunkt +1, und
Kreise markieren die Blättchen aus denen RNA extrahiert wurde.
Abb. 34: Northern Blot (b) für die systemische Antwort, ob PI-II akkumuliert mit zu-
gehörigem EtBr gefärbten 1 % Agarose Gel (a), Die untersuchten Linien, so-
wie ob Verwundet wurde oder nicht. Verwundet (+) unverwundet (-). Sowie
Kontroll-RNA aus Pfropfungen.
Abb. 35: Bilder einer gepfropften Pflanze. Das linke Bild zeigt die gesamte Pflanze, das
rechte Bild die Pfropfung. Der Pfeil deutet auf die Pfropfstelle. In diesem Fall
ist die Wildtyppflanze die Unterlage, welche später verwundet wurde, und der
Spross einer opr3-Pflanze wurde als Pfropfreis eingesetzt.
Abb. 36: Northern Blots (c) zum Nachweis von PI-II in Pfropfungen von Wildtyp (wt)
mit verschiednen opr3-Linien. Es wurde jeweils die Pfropfunterlage verwun-
det, der fett dargestellte Teil der gepfropften Pflanze wurde in der jeweiligen
Spur des Gels analysiert. (b): 1 % Agarosegel mit EtBr gefärbt wurde. Die
Pfropfungen J6 mit wt wurden als unverwundete Kontrolle verwendet.
Abb. 37: Northern Blots (c) zum Nachweis von PI-II in Pfropfungen von Wildtyp (wt)
mit verschiednen opr3-Linien. Es wurde jeweils die Pfropfunterlage verwun-
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det, der fett dargestellte Teil der gepfropften Pflanze wurde in der jeweiligen
Spur des Gels analysiert. (b): 1 % Agarosegel mit EtBr gefärbt wurde. Die
Pfropfungen J6 mit wt wurden als unverwundete Kontrolle verwendet.
Abb. 38: Northernblot (b) von Pfropfungen von wt und aos-Tomatenpflanzen. Unter-
strichene und dickgedruckte Bezeichnungen geben die Herkunft der RNA an,
der Strich stellt die Pfropfung dar. Auf dem linken Blot ist die RNA von un-
verwundeten Kontrollen und im rechten Blot die der verwundeten Pflanzen zu
sehen. Verwundet wurde der untere Teil der Pfropfung. Auf das Gel wurde
2,5 µg RNA aufgetragen. (a) stellt die mit EtBr gefärbte Ladungskontrolle
dar.
Abb. 39: Wechselwirkung verschiedener Pathogene im Pflanzenreich [Kunkel und
Brooks, 2002]
Abb. 40: Dotblot zum Test gegen Tomatenmosaikvirusbefall, von Jutta Babo durchge-
führt, in der oberen Hälfte wurden Proteine von aos-Tomatenpflanzen in der
unteren von opr3-Tomatenpflanzen aufgetragen. Jeder Punkt entspricht einer
mit ToMV infizierter Pflanze.
Abb. 41: Modell der Wechselwirkungen zwischen Jasmonaten, Auxinen und Salicyl-
säure. Pfeile zeigen eine Stimulanz, Linien mit Querbalken eine Hemmung.
Verändert nach Devoto und Turner, 2003
Tabellen
Tab. 1: Kreuzungsschema opr3 weiblich (rot: weiblich; blau: männlich)
Tab. 2: Kreuzungsschema opr3 männlich (rot: weiblich, blau männlich)
Tab. 3: Kreuzungsschema für opr3 ! opr3 durch pressen der Antheren (rot = weib-
lich, blau = männlich)
5.3 Erläuterungen und Abkürzungen
5 Verzeichnisse
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Erläuterungen
Gemäß der Arabidopsis-Nomenklatur, wurden in dieser Arbeit Gene in Großbuchstaben und
kursiv gedruckt, kleine kursive Buchstaben bezeichnen das entsprechende mutierte Gen.
Großbuchstaben normal gedruckt deuten auf das � dem gedruckten Gen � entsprechende Protein
hin.
Abkürzungen
16:2 Hexadecadiensäure
16:3 Hexadecatriensäure
18:2 Oktadekadiensäure (Linolsäure)
18:3 Oktadekatriensäure (α-Linolensäure)
°C Grad Celsius
Abb. Abbildung(en)
ABC ATP-binding-Cassette
ACX Acyl-CoA-Oxidase
AOC Allenoxidcyklase
AOS Allenoxidsynthase
AS1 Activating Sequence
BSA Bovine-Serum-Albumin (Rinderserumalbumin)
CaMV Cauliflowermosaikvirus (Blumenkohlmosaikvirus)
c-DNA complementary DNA
Coi Coroantin insensitiv
CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid
CTS COMATOSE
Da Dalton
dd doppelt destilliert
DEX DNA-Extraktionspuffer
DISK-PAGE Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese
DNA Desoxyribonuclenic acid = DNS
dnOPDA dinor-Oxophytodiensäure
DNS Desoxyribonukleinsäure = DNA
E Embryo
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EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EMS Ethylmethansulfonat
et al. unter anderen
EtBr Ethidiumbromid
EtOH Ethanol
fad Fatty-acid-desaturase (Fettsäuredesaturase)
fw forward
g Gramm/Gravitationskraft
GUS β-Glucorinodase
h Stunde(n)
IgG Immunglobulin G
JA Jasmonate, Jasmonsäure
jai Jamonat Insensitiv
jar Jasmonate insensitive root growth mutant
k kilo (103)
K Kotyledonen
KAT L-3-Ketoacyl-CoA-Thiolase
l Liter
LB Leftborder
Le Lycopersicon esculentum
LOX Lipoxygenase
LRR Leucin-rich-repeat
µ Mikro (10-6)
m Milli (10-3)
M Molar
MeJA Methyljasmonsäure
MFP multifunktionale Protein
MGDG-O Monogalaktosyldiacylglycerol-12-Oxophytodiensäure
min Minute(n)
ml Milliliter
MM Mastermix
mm Millimeter
mRNA messanger-RNA
MS Murashige & Skoog Medium
n nano (10-9)
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Na Nictiana atenuata
NADH Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat
OPC4:0 3-oxo2(2�[Z]-Pentenyl)-Cyclopentan-1-Butansäure
OPC6:0 3-oxo2(2�[Z]-Pentenyl)-Cyclopentan-1-Hexansäure
OPC8:0 3-oxo2(2�[Z]-Pentenyl)-Cyclopentan-1-Oktansäure
OPDA 12-Oxophytodienicacid = (9S, 13S)-12-Oxophytodiensäure
OPR3 12-Oxophytodiensäurereduktase3 (Enzym)
OPR3 12-Oxophytodiensäurereduktase3 (Gen)
opr3 12-Oxophytodiensäurereduktase3 (mutiertes Gen)
PCR Polymerase-Chain-Reaction
PI(s) Proteinaseinhibitor(en)
PI-I Proteinaseinhibitor-I
PI-II Proteinaseinhibitor-II
PPOs Polyphenoloxidasen
RB Right border
rev Reverse
RNA Ribonucleinic acid = RNS
RNAi RNA-Interferenz
RNS Ribonukleinsäure
ROS Reactive-Oxygene-Species
S Swedberg
SAR Systemic-acquired resistance
SCF Skp1p-cullin-F-box protein
SDS Sodiumdodecylsulfat
spr suppressor of prosystemin-mediated responses
Tab. Tabelle
TAE Triacetat-EDTA
TBS Tris-buffered-Saline
TMV Tabakmosaikvirus
ToMV Tomatenmosaikvirus
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Tween20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat
U Units (Einheiten)
uidA GUS
UV Ultraviolett
5 Verzeichnisse
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v/v Volumen/Volumen
Versch. Verschieden/e
w/v weight/volume
wt Wildtyp
x mal/fach
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Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und unter ausschließlicher Verwen-
dung der angegebenen Hilfsmittel verfasst habe.
Diese Arbeit wurde bisher in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner anderen Prüfungsbehörde
vorgelegt und auch noch nicht veröffentlicht. Wörtlich oder inhaltlich übernommene Stellen wurden
von mir als solche gekennzeichnet.
_____________________________Hohenheim, 02. Februar 2006
Andreas Klemm
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Danksagung
Ich danke:
Allen bedrohten Tier- und Pflanzenarten dieser Welt,
Allen, die sich für den Erhalt dieser Geschöpfe einsetzen,
Orion, Volvox, Ceratium, Leptodora und allen Fossilien, die mein Interesse an der Biologie geweckt haben,
Meinen Eltern, die dieses Interesse entdeckt und gefördert haben,
Herrn Prof. Dr. Schaller dass er mich schwäbeln ließ und die Vergabe der Diplomarbeit,
Herrn Prof. Dr. Spring für die Zweitkorrektur,
Fr. Dr. Annick Stintzi, für die Anleitung und Betreuung,
Fr. Jutta Babo, für das zur Verfügung stellen ihrer �Kinder� und ihre Hilfestellungen,
Allen anderen Technischen Assistenten für die netten Kaffeepausen,
Allen Doktoranden und Mitdiplomanten, für die Gespräche innerhalb und außerhalb des Instituts,
Herrn Dirk Zimmermann für seine Amerikareise,
dem dynamischen König Klaus, für seinen Überblick über alle Chemikalienstandorte,
Den �Mädels� aus den Gewächshäusern, ohne die die Pflanzen nie so gut gediehen wären,
Herrn Thomas Colpan für die Unterstützung beim Pfropfen,
Fr. Annette Reif, für den Tomatenschnaps,
Den Sekretärinnen Monika Schneider und Silke Scholz für die Umsorgung Kuniberts,
Kurz allen 260ern, für das tolle Arbeitsklima,
Albert Einstein dessen Erkenntnis, �alles ist Relativ�, mir während des Studiums sehr geholfen hat,
Bob Marley, für �I Shot The Sheriff�,
Karl May und Winnetou, die mit dieser Arbeit überhaupt nichts zu tun haben,
Wolfgang Amadeus Mozart, für seine Musik, die zu Höchstleistungen treibt,
Riesenschnauzer Momo, die mich zwang meinen Kopf auszulüften,
Meiner Freundin für ihren sehr dicken Geduldsfaden,
Meinen Freunden, die ich in der Zeit des Schreibens leider etwas zu sehr vernachlässigt habe � gelobe Besserung!
Und allen anderen, die ich nicht genannt habe, aber hätte nennen müssen.
Um klar zu sehen, genügt oft ein Wechsel der Blickrichtung. Antoine de Saint-Exupery
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