UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
SELEÇÃO E OTIMIZAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA DETECÇÃO DE Histoplasma capsulatum var. capsulatum POR REAÇÃO EM CADEIA DA
POLIMERASE (PCR)
IVANETE DE LIMA SAMPAIO
MANAUS 2010
ii
IVANETE DE LIMA SAMPAIO
SELEÇÃO E OTIMIZAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA DETECÇÃO DE Histoplasma capsulatum var. capsulatum POR REAÇÃO EM CADEIA DA
POLIMERASE (PCR)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientador : Prof. Dr. João Vicente Braga de Souza
MANAUS 2010
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
Sampaio, Ivanete de Lima
Seleção e otimização de protocolos para detecção de Histoplasma capsulatum var. capsulatum por reação em cadeia da polimerase. Ivanete de Lima Sampaio. - Manaus, 2010. xiii, 59 fls.
Dissertação de Mestrado - Universidade do Estado do Amazonas. Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical.
Título em inglês: Selection and optimization of protocols for detection of Histoplasma capsulatum var capsulatum by polymerase chain reaction.
1.Histoplasmose. 2. PCR 3. Diagnóstico
iv
FOLHA DE JULGAMENTO
SELEÇÃO E OTIMIZAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA DETECÇÃO DE Histoplasma capsulatum var. capsulatum POR REAÇÃO EM CADEIA DA
POLIMERASE (PCR)
IVANETE DE LIMA SAMPAIO
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas”.
Banca Julgadora:
______________________________________
João Vicente Braga de Souza Dr. Presidente
______________________________________
Aya Sadahiro Dra. Membro
______________________________________
Cíntia Mara da Costa Oliveira Dra. Membro
vi
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus e seu filho Jesus Cristo, por demonstrar tamanho amor por mim
através do milagre da vida, por estar ao meu lado nos momentos bons e ruins, por
ser tão bom comigo e com todos que eu amo, por ter me dado chances de trilhar
caminhos com tanta luz, sorte, oportunidades e, principalmente, por ter semeado
esses caminhos com pessoas tão especiais.
Minha mãe Maria, pelo amor incondicional, tudo que sou devo a você.
Adrian, por todo amor, carinho, compreensão e dedicação, você é um anjo bom na
minha vida.
Ao meu querido mestre e amigo, Dr. João Vicente, pela constante orientação,
competência, paciência, persistência e companheirismo, por cada um de seus
ensinamentos brilhantes, por todo esse período de convivência e, principalmente,
por ter acreditado em mim. Agradeço por cada momento, desde o mais difícil ao
mais descontraído, por nunca ter me abandonado durante esta caminhada. Por fazer
parte da minha história para meu crescimento pessoal e profissional. Aqui,
demonstro toda minha gratidão, admiração, respeito e sincero afeto.
Dra. Érica Souza, pelo apoio, amizade e compreensão, pelos momentos que
abdicou da companhia de seu esposo Dr. João Vicente, para que fosse possível a
realização deste trabalho, pelo apoio logístico na compra do material, pela
oportunidade de desfrutar da convivência e amizade da família Souza... Obrigada.
Erick Andrei, com sua colaboração carinho e dedicação tornou mais fácil a
realização deste trabalho.
Mirlane, pela colaboração em diversas fases deste trabalho com sugestões e
conhecimentos, pela amizade e apoio nas horas de necessidade
Ana Karla, pelas horas de trabalho e companheirismo no Laboratório do Instituto de
Pesquisas da Amazônia.
vii
Rayka, pelo apoio e compreensão, pelas palavras de consolo e encorajamento nos
momentos mais difíceis, por tudo que passamos juntas desde que Deus me
presenteou com sua amizade.
As funcionárias do Laboratório de Micologia da Fundação de Medicina Tropical do
Amazonas, Antonieta, Telma e Luiza pelo apoio e colaboração.
A Bioquímica Carla Silvana, por permitir o uso das linhagens dependências e
equipamentos do Laboratório de Micologia da Fundação de Medicina Tropical do
Amazonas.
Ao Bioquímico Mauricio Ogusku, por suas colocações brilhantes, sugestões e
colaboração no decorrer deste trabalho
Dra. Aya Sadahiro, por toda sua competência, amizade, palavras de apoio,
colaboração e sugestões.
Samira, doutoranda do Instituto de Pesquisas da Amazônia por estar sempre
disposta a ajudar.
Eliane e Ana Cristina, pela colaboração em todos nos momentos de necessidade no
Laboratório de Micologia do Instituto de Pesquisas da Amazônia.
Senhores Francisco, Raimundo e Rosalvo auxiliares do laboratório de
Micobacteriologia do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
Aos Colegas citopatologistas do Laboratório Municipal de Citopatologia Prof.
Sebastião Ferreira Marinho: Ana Lúcia, Antônio, Ileinisa, Lilia Célia, Alisson, Bruno,
Márcia, Rita, Ruth. Aos técnicos James e Samantha, e especialmente ao Diretor
Edson Gomes pela compreensão e colaboração para que a realização deste
trabalho fosse possível.
Todos os amigos e colegas, farmacêuticos, bioquímicos, médicos, biólogos e
enfermeiros com quem dividi horas de estudos, descontração e amizade na
graduação, especialização e mestrado.
viii
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, ao Departamento de Bacteriologia na
pessoa da Bioquímica Rossicleia Lins Monte. Departamento de Virologia na pessoa
da Dra. Cíntia Oliveira, Michele e Márcia pela oportunidade, pela acolhida nos
laboratórios e empréstimo de equipamentos, que muito contribuíram para o
desenvolvimento desta pesquisa.
Corpo docente do Curso de Pós Graduação em Medicina Tropical da Universidade
do Estado do Amazonas, especialmente á Dra. Graça Barbosa por todos os
ensinamentos e sugestões.
Funcionários da secretária do Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical da
Universidade do Estado do Amazonas, Marcos, Conceição, Bruno e Rayssa.
CNPq, SUFRAMA, CAPES, FMURAKI e FAPEAM pelo apoio financeiro.
Todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram para o desenvolvimento
e conclusão deste trabalho.
ix
RESUMO
O diagnóstico laboratorial da Histoplasmose apresenta problemas de
sensibilidade, especificidade e tempo de execução. Por este motivo, o presente
estudo teve como objetivo selecionar e otimizar três protocolos para detecção de
Histoplasma capsulatum var. capsulatum pela reação em cadeia da polimerase
(PCR). Foram avaliadas três metodos de extração de DNA e três métodos de PCR.
O método de extração de DNA que demonstrou as melhores razões de pureza foi o
que utilizou membranas de sílica (QIAamp Tissue and Blood- (Qiagen) e o método
de amplificação que demonstrou a maior capacidade de detecção foi o que tinha
como gene alvo “a proteína de 100 kDa”. A PCR selecionada teve a concentração
dos seus reagentes otimizada e foi determinada sua co-positividade e co-
negatividade frente a amostras de sangue inoculadas com células de H. capsulatum.
A otimização da concentração dos componentes da PCR demonstrou que a reação
suportou variações significativas na concentração destes e o ensaio para
determinação da co-positividade e co-negatividade demonstrou que a PCR
apresentou capacidade de detecção maior de H. capsulatum (10 pg de DNA) do que
a cultura.
Palavras chave: Histoplasma capsulatum, Histoplasmose, Diagnóstico, PCR
x
ABSTRACT
The conventional diagnosis of Histoplasmosis presents problems of sensitivity,
specificity and runtime. For that reason, the aim of this work was to select and
optimize methods for detection of Histoplasma capsulatum var. capsulatum by
polymerase chain reaction (PCR). Three methods of DNA extraction and three
methods of PCR were evaluated. The method of DNA extraction that presented the
best purity ratio was the methodology that used the silica membrane (QIAamp Blood
and Tissue-(Qiagen) and the amplification method that used the “protein of 100 kDa”
as target gene presented the best detection capacity. The selected PCR had the
concentration of its components optimized and it was determined its sensitivity and
specificity using samples of blood with H. capsulatum cells. The optimization of PCR
components demonstrated that the present reaction supported significant variations
in the components concentration and the assay that was used for the determination
sensitivity and specificity showed that PCR was better detection of H. capsulatum (10
pg of DNA) than cultures.
Key words: Histoplasma capsulatum, Histoplasmosis, Diagnose, PCR
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Fluxograma das atividades da dissertação...................................................... 12
Figura 1A Produtos de amplificação de H. capsulatum obtidos pelas metodologias
descritas por Bialek , Guedes e Bracca..........................................................
25
Figura 2 A Influência das concentrações dos reagentes nos produtos PCR obtidos nos
experimentos de otimização.............................................................................
25
Figura 3 A Produtos de PCR obtidos na detecção das diferentes concentrações de
células H. capsulatum em sangue...................................................................
26
LISTA DETABELAS
Tabela 1 Protocolos de PCR investigados...................................................................... 16
Tabela 1 A Concentração e razão de pureza do DNA de H. capsulatum obtido pelos
métodos de extração avaliados........................................................................
24
Tabela 2 A Resultados da PCR e da hemocultura frente às diferentes amostras............. 26
Tabela 3 A Co positividade e co negatividade da PCR com a hemocultura ...................... 27
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
Aids - Aquired immune deficiency syndrome (Síndrome da Imunodeficiência
Adquirida)
CTAB - Brometo de cetiltrimetilamônio
DNA - Ácido desoxirribonucléico
dNTP - Desoxirribonucleotídeos trifosfatados
EDTA - Ácido etileno diamino tetracético
HE - Hematoxilina-Eosina
HIV - Human Imunodeficience Virus (Vírus da Imunodeficiência Humana)
ITS - Internal Transcribed Spacer (Espaço de Transcrição Interna)
Kb - Quilo base (1000 pares de bases)
kDa - Quilo dalton
pb - Pares de bases
PCR- Reação em Cadeia da Polimerase
rDNA - DNA ribossomal
RNA - Ácido ribonucleico
RNAse -Ribonuclease
RPM - Rotações por minuto
Tris - Tris-(hidroximetil)-aminometano
Μm - Micrômetro
var - Variedade
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SUMÀRIO
1 Introdução....................................................................................................... 1
1.1 O fungo Histoplasma capsulatum var. capsulatum ....................................... 1
1.2 Diagnóstico convencional da Histoplasmose................................................. 4
1.3 Diagnóstico molecular: técnicas baseadas na Reação de Cadeia da Polimerase
(PCR)............................................................................................
5
1.4 Comparação entre o diagnóstico convencional e o diagnóstico molecular..... 8
2.0 Objetivos........................................................................................................... 10
2.1 Geral................................................................................................................. 10
2.2 Específicos........................................................................................................ 10
3.0 Material e Métodos........................................................................................... 11
3.1 Avaliação da metodologia de extração de DNA ............................................. 13
3.2 Seleção de protocolo de PCR......................................................................... 15
3.3 Otimização dos reagentes da PCR.................................................................. 17
3.4 Determinação da co-positividade e co-negatividade da reação de PCR........ 18
4.0 Resultados: Artigo - Seleção e otimização de métodos para detecção de
Histoplasma capsulatum var. capsulatum por reação em cadeia da
polimerase(PCR)..........................................................................................................
19
5.0 Conclusões...................................................................................................... 33
6.0 Referências Bibliográficas................................................................................ 34
7.0 Anexos............................................................................................................. 43
1
1. INTRODUÇÃO 1.1 O fungo Histoplasma capsulatum var. capsulatum
Ecologicamente o Histoplasma capsulatum é um fungo termodimórfico,
saprobionte, encontrado de forma ubíqua na natureza, disseminado pelo solo e
poeira ricos em nitrogênio e ambientes contaminados por excrementos de
aves, morcegos e outros mamíferos infectados 22. Desde seu isolamento, por
Darling em 1906, o H. capsulatum tem sido documentado como o agente
etiológico da histoplasmose e sua forma teleomórfica é denominada
Ajellomyces capsulatus43, 45,53. Taxonomicamente, o H. capsulatum, é um
Eucarioto, do reino Fungi, encontra-se na divisão (filo) Ascomycota, subdivisão
(subfilo) Ascomycotina, classe Ascomycetes, ordem Onygenales, família
Onygenaceae, gênero Histoplasma (Ajellomyces), espécie Histoplasma
capsulatum; sendo que esta apresenta três variedades: H. capsulatum var.
capsulatum, H. capsulatum var. duboisii e H. capsulatum var. farciminosum 37,55. Tais variedades do fungo são evolutivamente, ecologicamente e
biologicamente diferentes, e cada uma responsável por uma forma da doença,
43,45. Na natureza e em cultivo a temperatura ambiente apresenta-se em sua
forma filamentosa, de hifas delicadas, hialinas, septadas e ramificadas, que
carreiam macro-conídios tuberculados, de 8 a14mm de diâmetro, e micro-
conídios, com diâmetros de 2 a 5 mm, representam a forma infectante do
fungo26. Em cultivo a 37 ͦ C e nos tecidos do homem e de animais infectados
apresentam-se na forma parasitária como elementos leveduriformes
unibrotantes2, 64.
O fungo infecta os humanos e outros mamíferos quando é inalado na
forma de conídios ou fragmentos de hifas em suspensão no ar21 A infecção
primária conhecida como primo infecção ocorre no pulmão. Durante a primo
infecção, o fungo modifica sua morfologia filamentosa para leveduriforme, que
invade e multiplica-se dentro de macrófagos66 35. Atividades e ocupações que
envolvem a exposição a dejetos de aves e de morcegos aumentam o risco de
infecção22, 25.
A histoplasmose é uma micose profunda causada pelo Histoplasma
capsulatum var. capsulatum. A doença ganhou renovada importância, dada sua
2
maior freqüência e por seu comportamento oportunista em paciente
imunodeprimidos tais como pacientes com Aids. É um problema de saúde
pública mundial devido ao seu caráter de endemia que foi estabelecido com a
Aids. A partir de 1985, a ocorrência de infecção disseminada por H. capsulatum
em indivíduos com sorologia positiva para o vírus da imunodeficiência humana
(HIV) é considerada como um critério maior no diagnóstico da Aids11. Segundo
dados do Ministério da Saúde, no período de 1980-2000, 0,7% dos pacientes
com Aids e idade > 13 anos apresentavam histoplasmose disseminada no
momento da notificação do caso de Aids4.
A histoplasmose é endêmica no meio-oeste dos Estados Unidos e na
América Latina45 53 61. Entre 1981 e 1998, 56 casos de histoplasmose
disseminada haviam sido descritos no Hospital Cayenne (Guiana Francesa). A
partir de 1998, o número de pacientes aumentou a cada ano. Em 2004, 21
novos casos foram diagnosticados, neste mesmo hospital 42. É uma das micoses sistêmicas mais freqüentes no Brasil, com alta
prevalência em nossa população, principalmente no Rio Grande do Sul,
Sudeste e Norte22.
A maioria das infecções são sub-clínicas sendo freqüentemente
limitadas pela resposta imunológica do hospedeiro. No entanto, em 5% dos
casos, falhas no sistema imunológico podem permitir o desenvolvimento da
infecção pulmonar (aguda ou crônica) ou disseminada37. Indivíduos
imunocomprometidos, particularmente os com Aids avançada, são acometidos
pela histoplasmose disseminada66.
As manifestações clínicas podem ser didaticamente classificadas como:
1) assintomáticas; 2) pulmonar aguda; 3) pulmonar crônica e 4) disseminada60.
A forma assintomática compreende aproximadamente 90-95% dos
casos de histoplasmose e nesses pacientes não é observada nenhuma
sintomatologia clínica. O único dado observado está relacionado a uma reação
positiva do teste intradérmico à histoplasmose. Apesar desses pacientes não
revelarem nenhuma sintomatologia clínica, em 1/3 dos casos podem ser
observados focos de calcificação nos pulmões e em órgãos componentes do
3
sistema retículo-endotelial, como baço e gânglios linfáticos. Esses pacientes
são a prova da cura espontânea da histoplasmose17.
Entretanto, 5% dos pacientes que entram em contato, por via
respiratória, com a forma infectante do H. capsulatum, desenvolvem uma
primo infecção com sintomatologia, que em muitos casos lembra um processo
gripal causado pelo vírus da influenza. Dessa forma, podem ser observados
suores noturnos, tosse, febre, perda de peso, eritema multiforme e eritema
nodoso. Esses sinais e sintomas podem ser mais ou menos intensos, na
dependência do inoculo aspirado pelo paciente e na sua habilidade
imunológica, culminando na maioria dos casos em cura espontânea64.
Em alguns pacientes, entretanto, a cura espontânea não ocorre, e
observa-se então uma persistência da tosse, perda de peso, expectoração
muco purulenta com laivos de sangue, hemoptise, dispnéia de esforço, e febre
baixa ao entardecer. Este quadro clínico, caracterizado como a forma crônica
da histoplasmose pulmonar, reflete uma cópia fiel da tuberculose pulmonar.
Acredita-se que os pacientes que evoluem para essa forma possuem, em sua
maioria, problemas no parênquima pulmonar, problema esse que de uma forma
ou outra interfere com a resposta imune do hospedeiro43.
A histoplasmose disseminada é mais comumente observada em
pacientes com Aids, crianças na primeira infância (< 2 anos) ou, ainda,
pessoas com outras formas de imunossupressão, como linfomas e leucemias.
A reativação de conídios inalados previamente é o principal precursor da
doença em sua forma disseminada30. O fungo multiplica-se dentro dos
macrófagos. Estas células cheias de leveduras permeiam a medula óssea,
baço, fígado e pulmão. A mortalidade nos imunossuprimidos chega a 90 %,
sendo observada entre outros sintomas, febre, perda de peso, hepatomegalia,
esplenomegalia, enterite, lesões na pele, meningite, corneoretinite34, 41,57. A
doença é fulminante devido a várias conseqüências, entre elas: insuficiência
respiratória, hemorragias gastrointestinais, e uma síndrome que lembra sepse
bacteriana com choque, insuficiência hepática, renal e coagulação intravascular
disseminada, são descrita em 10 a 20% dos pacientes com Aids e
histoplasmose64. De elevada letalidade, esta síndrome parece representar uma
manifestação tardia da histoplasmose, em casos nos quais a confirmação do
4
diagnóstico é demorada e o inicio do tratamento postergado, sem tratamento, a
forma disseminada é 100% fatal60.
1.2 Diagnóstico convencional da histoplasmose
O diagnóstico convencional da histoplasmose é baseado na detecção de
antígenos, testes sorológicos, microscopia direta e cultura53.
A pesquisa de antígenos de Histoplasma em urina ou soro através de
radioimunoensaio, ou métodos enzimáticos possui variada sensibilidade
dependendo do tempo de desenvolvimento da infecção, dos sítios acometidos
e do estado clínico do acometido24. A sensibilidade do teste de detecção de
antígenos de Histoplasma é de 95% na urina, e 86% no soro de pacientes com
Aids e histoplasmose disseminada 65,66, no entanto, variam entre 20 a 81 % em
pacientes não-imunocomprometidos com histoplasmose pulmonar24, 63,67,
reações cruzadas com outros fungos patogênicos podem ocorrer30 46.
Testes sorológicos como imunodifusão e fixação do complemento
podem ser úteis. Na imunodifusão, a presença de banda de preciptina H
relacionada com infecção ativa, é vista ocasionalmente, enquanto a banda M
pode manter-se presente por anos 25,26. Falsos negativos ocorrem em 20 a
50% dos pacientes imunocomprometidos que não são capazes de produzir
anticorpos de resposta27, 65,66. Falsos positivos têm sido observados em
pacientes com outras micoses disseminadas como a Paracoccidiodomicose50.
Testes sorológicos de precipitação para detectar anticorpos contra antígenos
específicos (como o antígeno M) podem ser utilizados na identificação da
infecção29,32,47,69,70,71. No entanto, estes têm apresentado as mesmas
dificuldades já descritas68,36.
A análise microscópica direta de material biológico é muito difícil, pode
ser útil desde que: 1) a amostra seja adequada, 2) o observador possua
experiência e 3) os corantes histoquímicos/citológicos sejam adequados.
Infelizmente, H. capsulatum pode ser confundido devido a sua semelhança
morfológica com as espécies de Cândida e Sporothrix schenckii. Colorações
como May-Grunwald-Giemsa e Hematoxilina Eosina revelam células
leveduriformes ovais fagocitadas por histiócitos2. Outras colorações podem ser
utilizadas, no entanto os achados micro morfológicos são ainda menos
5
específicos. A sensibilidade da técnica gira em torno de 50%. Técnicas de
imunoistoquímica têm sido utilizadas e avaliadas. No entanto, elas apresentam
a baixa sensibilidade da microscopia convencional e a falta de especificidade
da utilização de anticorpos35.
Outro método convencional e bem difundido é a cultura, considerada o
padrão ouro para detecção do H. capsulatum. O fungo pode ser cultivado a
partir de sangue, medula óssea, biópsias, secreções respiratórias e lesões da
pele. Mieloculturas e hemoculturas são positivas entre 70% a 90% dos casos,
enquanto que, em culturas de material do trato respiratório a sensibilidade é
menor (50-70%)17, 36, 37, 43, 73. Infelizmente, a consistente identificação da cultura
do fungo demora de duas a seis semanas. Devido à existência de fungos que
mimetiza a fase filamentosa do Histoplasma capsulatum, existe a necessidade
de testes confirmatórios como, testes para detecção de exoantígenos e
conversão micélio-levedura induzidos pela temperatura14, 28, 55. Este tempo
necessário para identificação do fungo representa um considerável atraso no
diagnóstico e terapia. Outro problema é a manipulação das culturas em
laboratório. As culturas de H. capsulatum apresentam risco para os
laboratoristas, exigindo grande preocupação com a biossegurança. Os
procedimentos de diagnósticos são numerosos e bem descritos, no entanto,
suas deficiências justificam novas pesquisas68.
1.3 Diagnóstico molecular: técnicas baseadas na Reação de Cadeia da Polimerase (PCR)
O desenvolvimento da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR) na década de 80 revolucionou a análise baseada em ácidos nucléicos,
permitindo a amplificação “in vitro” de seqüências específicas de DNA44.
Protocolos baseados em PCR têm sido descritos para o estudo de uma
variedade de fungos clinicamente importantes incluindo Cryptococcus
neoformans, espécies de Aspergillus, espécies de Cândida e H. capsulatum31.
Eles podem ser especialmente úteis em laboratórios inadequados para
realização de culturas ou com inexperiência no isolamento de H. capsulatum e
apresentam potencial para ser uma metodologia definitiva de diagnóstico
devido a sua velocidade, sensibilidade e especificidade51.
6
Numerosos métodos moleculares têm sido desenvolvidos para identificar
rapidamente fungos isolados e cultivados em meio sólido40 59, e diretamente de
hemoculturas6 13 58. Os alvos moleculares para a amplificação e detecção pelo
PCR são usualmente regiões conservadas com informação filogenética como
os genes do RNAr. RNA genes são também alvo de seqüenciamento para
identificação dos fungos 15 28 33 49.
A PCR simples com primers específicos para H. capsulatum é bem
descrita. Culturas deste fungo podem ser identificadas com alta especificidade
pelo uso desta metodologia39 42. No entanto, a detecção de H. capsulatum em
amostras biológicas é uma tarefa difícil devido à baixa concentração e
qualidade do DNA fúngico extraído de tecidos 9. Por outro lado, a PCR seguida
de seqüenciamento, além de sofrer os mesmos problemas de sensibilidade que
a PCR simples é uma técnica de difícil execução em rotina laboratorial, devido
à necessidade de pessoal qualificado40 54.
Várias pesquisas foram realizadas com genes que possuem uma única
cópia no genoma ou ainda com genes ribossomais. O ensaio da PCR tendo
como alvo genes do RNAr demonstrou sensibilidade. No entanto, a natureza
conservada dos genes do RNAr, comum a outros microorganismos causa
amplificações não específicas, levando os pesquisadores a buscarem novos
alvos para amplificação. Os trabalhos a seguir apresentam a evolução
cronológica destes estudos48 62 8.
Reid e colaboradores 52 detectaram pequenos números de esporos de
H. capsulatum em solo utilizando PCR, tendo como alvo a região ITS 5·8S do
RNAr. Os resultados sugeriram que o método pode ser aplicado em locais
conhecidamente contaminados por aves e morcegos.
Bialek e colaboradores5 realizaram um trabalho que pode ser
considerado como pioneiro e de referência para os demais. Eles realizaram
uma PCR tendo como alvo uma pequena subunidade do RNAr 18s e avaliaram
a infecção em cobaias. Os resultados promissores deste trabalho estimularam
uma seqüência de outros.
O próximo passo foi utilizar regiões de genes mais específicos de H.
capsulatum a fim de aumentar a especificidade das reações. Bialek e
colaboradores5 desenvolveram uma PCR tendo como alvo genes codificadores
de uma proteína de 100 KDa. Esta proteína é específica e essencial para a
7
sobrevivência de H. capsulatum em células humanas. O estudo demonstrou
uma maior especificidade desta região alvo quando comparada com as
reações que utilizaram a região 18S do RNAr como alvo para detecção da
espécie em 100 amostras biológicas.
Guedes e colaboradores27 desenharam quatro seqüências de
oligonucleotídeos para serem utilizados na PCR para detecção de Histoplasma
capsulatum var capsulatum. Estas utilizam como alvo o antígeno M. Produtos
de PCR de 111 e 279 bp foram amplificados com os primers denominados de
Msp1F-Msp1R e Msp2F-Msp2R, respectivamente. A PCR identificou
corretamente todas as 31 linhagens de H. capsulatum isoladas de humanos,
animais e solo. A especificidade dos primers foi confirmada pela ausência de
amplificação de produto genômico de Paracoccidiodes brasiliensis, Cândida
spp., Sporothrix schenckii, Cryptococcus neoformans, Blastomyces
dermatitidis, Coccidioides immitis, Aspergillus niger e Aspergillus fumigatus.
Bracca e colaboradores3 desenvolveram uma PCR para o diagnóstico
da histoplasmose utilizando como alvo o gene do antígeno H do H. capsulatum.
O ensaio demonstrou-se sensível e específico. Foi capaz de detectar material
correspondente a menos de 10 células leveduriformes sem apresentar reação
cruzada com o DNA de fungos e bactérias patógenas (Aspergillus flavus,
Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Geotrichum sp., Cryptococcus
neoformans, Cândida albicans, Trichosporon sp., P. brasiliensis, Nocardia
asteroides, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella sp.,
Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium bovis, e M. tuberculosis).
Maubon e colaboradores42 avaliaram a PCR utilizando a metodologia
descrita por Bialek e colaboradores5 em 40 amostras de pacientes com
suspeita de histoplasmose disseminada. Todas as amostras com reação de
PCR positivas também tiveram culturas positivas. A PCR permitiu a obtenção
do resultado final em 48 horas, enquanto a microscopia permitiu a detecção
imediata do microrganismo somente em 38% dos pacientes. Os demais
pacientes tiveram que esperar, em média, 28 dias para o diagnóstico definitivo
da cultura. Este resultado veloz implicou na diminuição dos custos de
hospitalização, em um número menor de exames invasivos e, eventualmente,
em tratamentos incorretos. Quando foi avaliada a especificidade, a reação
amplificou apenas o DNA de H. capsulatum.
8
1.4 Comparação entre o diagnóstico convencional e o diagnóstico molecular
O diagnóstico molecular baseado na PCR não é utilizado rotineiramente
em laboratórios de patologia e micologia. Alguns laboratórios desenvolveram
protocolos próprios para detecção de toxoplasmose, leishmaniose e malária.
No entanto, estes não são amplamente utilizados. Em micologia médica
existem poucos protocolos bem conhecidos para diagnóstico. Um estudo
recente utilizando PCR em Tempo Real acoplada a extração automatizada de
DNA de sítios de Aspergilose mostrou baixa sensibilidade em relação à
detecção de antígenos em soro por ELISA16. O DNA de Pneumocystis jiroveci
demonstrou ser adequadamente detectado por um método utilizando PCR
recentemente descrito, no entanto, este protocolo ainda não se difundiu19.
Ensaios de PCR multiplex têm sido desenvolvidos para identificação de fungos
patogênicos oriundos de culturas, no entanto, estudos mais amplos ainda não
têm sido realizados para provar a aplicabilidade destes métodos em amostras
clínicas40. Recentemente um ensaio de PCR em Tempo Real foi descrito para
detectar com adequada sensibilidade e especificidade C. albicans em soro e
urina com a possibilidade de quantificar e controlar a evolução da doença
durante a terapia1.
Maubon e colaboradores42 têm sido pioneiros na utilização da Nested-
PCR para a detecção de fungemias na rotina laboratorial. De uma forma geral,
a maioria dos protocolos de PCR ainda não é satisfatória para o diagnóstico de
rotina em laboratórios de micologia 7.
Alguns trabalhos têm sido realizados comparando as técnicas
convencionais com metodologias baseadas em PCR. Entre estes, deve-se citar
o trabalho pioneiro realizado por Bialek e colaboradores5 O objetivo deste
estudo foi comparar a PCR com os métodos de coloração-exame direto a fim
de apresentar alternativas para a detecção de histoplasmose em tecido. PCR
foi a mais sensível das 5 metodologias aplicadas para detectar H. capsulatum
nas biopsias parafinadas de ratos infectados experimentalmente. Outro
trabalho que deve ser citado foi realizado por Bracca e colaboradores3. Estes
avaliaram a PCR (usando como alvo os genes do antígeno H) comparando-a
9
aos resultados obtidos de cultura e exames diretos. Quatro das 24 amostras de
sangue foram consideradas positivas na PCR, sendo que, duas destas
amostras tinham sido consideradas negativas pela cultura e exame direto. Uma
perfeita relação foi observada entre as três metodologias em quatro biopsias de
pele obtidas de pacientes com HIV e manifestações cutâneas.
Devido o exposto, a PCR é considerada uma ferramenta útil para o
diagnóstico da histoplasmose.
10
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Selecionar e otimizar protocolos para detecção de Histoplasma
capsulatum var. capsulatum por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
2.2 Específicos
• Avaliar qual é a metodologia mais adequada para extração do DNA do
fungo H. capsulatum var. capsulatum. • Determinar entre as regiões de genes descritas na literatura ( Antígeno
H, Antígeno M e Proteína de 100 KDa), qual a mais sensível para a detecção
de H. capsulatum var capsulatum por PCR.
• Definir quais as condições ótimas para a reação de PCR . • Avaliar a co-positividade e co-negatividade da PCR em relação á
detecção pelo padrão ouro (cultura).
11
3. MATERIAL E MÉTODOS
Os procedimentos experimentais desta dissertação foram divididos em quatro
itens que serão descritos a seguir:
Avaliação da metodologia de extração. Três metodologias de extração para
obtenção do DNA de H.capsulatum var. capsulatum foram avaliadas. Para
definir a metodologia mais adequada os parâmetros de concentração e
qualidade do DNA extraído foram utilizados.
Seleção de metodologia de PCR. Foram avaliadas três metodologias de
reação de PCR. Foi considerada a mais apropriada a reação que gerou
produtos de PCR com as menores concentrações de DNA
Otimização das condições para a realização da PCR. A metodologia de
PCR selecionada como a mais sensível na detecção do DNA de H. capsulatum
var. capsulatum foi otimizada a fim de determinar as condições ideais para
visualização em eletroforese.
Determinação da co-positividade e co-negatividade entre PCR e Hemocultura. A metodologia de extração selecionada, e a reação de PCR
selecionada e otimizada foram utilizadas frente a amostras contaminadas
experimentalmente para determinar a co-positividade e co-negatividade entre
PCR e Hemocultura na detecção de H. capsulatum. A Figura 1 apresenta o
fluxograma das atividades da dissertação.
12
.
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Hem
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Extração Fenol-Cloroformio
Extração Precipitação por Sais
Extração Membrana de Sílica
Proteina 100 kDa (Bialek cols; 2002)
Quantificação do DNA 260/280nm
Micélio (90mg)
DNA diluído (25; 0,5; 1x10-1; 2x10– 3; 4x10-5; 8x10-8 ng)
Antígeno M (Guedes cols;
Antígeno H (Bracca cols; 2003)
PCR
DNA (50 ng)
MgCl2 (0,5; 1,18; 1,84; 2,5; 3,16; 3,82 e 4,5 mM)
dNTPs (50; 100; 150; 200 ; 250; 300 e 350 µM)
Primers HcIII e HcIV (0,1; 0,4; 0,7; 1,0; 1,3;1,6 e 1,9 µM)
Taq DNA polimerase (0,5; 0,84; 0,7;1,0;1,3;1,6;1,9 U/reação )
Temperatura de hibridização (56; 59; 62; 65; 68; 71oC)
Eletroforese
Eletroforese
Amostras de sangue contendo ou não células leveduriformes de H. capsulatum
(7x106, 7x105, 7x104, 7x103 e 7x102 células/mL)
Hemocultura
PCR selecionada
Resultados
Co-positividade
13
3.1 Avaliação da metodologia de extração de DNA
Três metodologias de extração de DNA foram comparadas: a) extração
baseada na utilização de membrana de sílica (Kit QIAamp Tissue and Blood,
Qiagen, Hilden, Germany), b) extração baseada na utilização de precipitação
por sais (Kit MasterPure™ DNA Purification Kit for Blood Version II, Epicentre-
USA) e c) extração de DNA por fracionamento por polaridade em Fenol-
Clorofórmio (Sambrook e Russel 56).
Amostras Foram utilizados neste estudo os isolados de H. capsulatum FMTAM
3242, FMTAM 3417 e FMTAM 3378, provenientes da coleção de fungos do
Laboratório de Micologia da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas –
FMTAM. Estes vinham sendo conservados por repique contínuo há
aproximadamente seis meses, e foram reativados60. Os fungos foram repicados
em meios de cultura Agar Sabouraud, Agar Infusão de Cérebro/Coração e Agar
Mycosel e incubados a temperatura ambiente (obtenção da fase filamentosa)
em estufa a 37°C (obtenção da fase leveduriforme).
O presente estudo foi parte integrante das atividades de investigação
científica do projeto intitulado “Aspectos referentes à
implantação/implementação, na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas,
de Diagnóstico Molecular para identificação de agentes causadores de
fungemias em pacientes com AIDS”. A utilização das culturas esteve em
conformidade com os preceitos da ética em pesquisa envolvendo seres
humanos (CNS 196/96) e complementares. Sendo que este projeto foi
aprovado no comitê de ética em pesquisa (CEP) da FMTAM (folha de rosto FR-
128939/2007).
Metodologia que utilizou membrana de sílica (QIAamp Tissue and Blood – Qiagen) A metodologia foi realizada como descrita pelo fabricante. Biomassa de
H. capsulatum (90 mg) foi retirada dos meios de cultura e adicionada em
Co-negatividade
Figura 1- Fluxograma das atividades da dissertação
14
microtubos (1,5 mL) contendo 180 μL de tampão ATL (Tissue Lysis Buffer) e 20
μL de proteinase K (20 mg/mL). A mistura foi incubada por 30 minutos a 56 oC
e o micélio residual macerado até se obter uma massa homogênea. Foi
adicionado 200 μL de tampão AL (Lysis Buffer) e incubado a 70 oC durante 10
minutos. Após adição de 200 μL de etanol a mistura foi transferida para um
microtubo contendo a coluna de sílica. O conjunto foi centrifugado a 8.000 G
por um minuto e a coluna foi lavada com 500 µL das soluções AW1 (8.000 G
por 1 min) e AW2 (12.000 g por 3 min). O DNA foi eluído pela adição de 100 μL
de tampão AE (Elution buffer).
Extração baseada na utilização de precipitação por sais (MasterPure™ DNA Purification Kit for Blood Version II, Epicentre-USA) A metodologia foi realizada como descrito pelo fabricante. Biomassa de
H. capsulatum (90 mg) foi incubada (30 minutos a 56 oC) em um microtubo
(1,5 mL) contendo 300 μL de Tissue and Cell Lysis Solution e 20 μL de
Proteinase K. Em seguida, a mistura foi macerada até apresentar-se
homogênea. Após 5 minutos em gelo, foram adicionados 175 μL de MPC
(Protein Precipitation Reagent) e centrifugado por 10 minutos a 12000 G. O
sobrenadante foi transferido para um microtubo (1,5 mL) contendo 500 μL de
isopropanol. O pellet de DNA, obtido após centrifugação (12 000 G por 10
minutos, 4oC ), foi lavado com 500 μL de etanol (70%), seco a temperatura
ambiente e solubilizado em 100 μL de Tampão TE (Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM
EDTA).
Metodologia de fracionamento por polaridade (Extração Fenol-Clorofórmio) A metodologia de extração Fenol-Clorofórmio foi realizada a partir de
uma modificação na metodologia descrita por Sambrook e Russel 56. Biomassa
de H. capsulatum (90 mg) foi transferida para um microtubo (1,5 mL) contendo
300 μL de tampão CTAB e 90 mg de pérolas de vidro (0,45 mm). O micélio foi
macerado até obtenção de uma mistura homogênea. Tampão CTAB (200 μL)
foi acrescentado à mistura e, em seguida, incubada a 65°C por 10 minutos.
15
Uma mistura de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) foi adicionada (500
μL), as fases formadas foram homogeneizadas (agitador magnético por 5
minutos) e, em seguida, separadas por centrifugação (7 minutos, 10000 G,
15°C). A fase superior foi transferida para outro microtubo (1,5 mL) contendo
clorofórmio (500 μL) e foi repetido o processo de homogeneização e separação
das fases. Por fim, a fase superior foi transferida para outro microtubo (1,5 mL)
contendo álcool isopropílico (500 μL) e o DNA foi precipitado por centrifugação
(7 minutos, 10000 G, 15°C). O “pellet” de DNA foi lavado com 500 μL de etanol
(70%), após secar a temperatura ambiente foi solubilizado em 100 μl de
Tampão TE (Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA).
Quantificação do DNA A concentração do DNA genômico foi verificada através de leitura em
espectrofotômetro GE (GeneQuant) no comprimento de onda de 260 nm,
assumiu-se que uma unidade de absorbância correspondeu a 50 µg/ml de
DNA38. Foram realizadas também leituras em comprimento de onda 280 nm, e
calculada a razão entre as absobâncias 260/280 para determinação do grau de
pureza do DNA. O protocolo que extraiu a maior quantidade de DNA, com a
maior pureza, foi considerado o mais adequado.
3.2 Seleção de protocolo de PCR
O DNA, obtido com o protocolo de extração que mostrou melhor
desempenho quanto à concentração e grau de pureza, foi utilizado a fim de
determinar qual a região gênica mais adequada para a detecção de DNA do H.
capsulatum var capsulatum. A amostra foi diluída nas concentrações (25; 0,5;
1x10-1; 2x10– 3; 4x10-5; 8x10-8 ng) e submetida à amplificação usando os três
protocolos de PCR descritos na Tabela 1. O protocolo que produziu banda
visível em gel de eletroforese com a menor concentração de DNA foi
considerado o mais adequado.
16
Tabela 1- Protocolos de PCR investigados Autor/Região alvo Condições da reação
Bialek cols 5
Proteina de 100
KDa
Primers: HcIII ((5-GAG ATC TAG TCG CGG CCA GGT TCA-3)
HcIV (5-AGG AGA GAA CTG TAT CGG TGG CTT G-3 ) Tamanho do produto: 210 -bp
[DNTP´s]: 100 µM
[Taq]: 1,5 U
[MgCl2]: 2,5 mM
[Primers]: 1 µM
[Amplificação]: 94°C por 5 min; 35 vezes 94°C por 30 s, 65°C por 30 s e 72°C
por 1 min e uma extensão final de 72°C for 5 min.
Bracca cols 3
Antígeno H
Primers: Hc2 (5-GCGGGGTTGGCTCTGCTCT-3)
Hc3 (5-TTGGAAACCCCGGGCTTG-3)
Tamanho do produto: 439-bp
[DNTP´s]: 200 µM
[Taq]: 1U
[MgCl2]: 2 mM
[Primers]: 0.4 µM
[Amplificação]: 96°C for 6 min; 35 cycles of 94°C for 1 min, 59°C por 1min, e
72°C por 1 min, extensão final de 72°C por 10 min.
Guedes27
Antígeno M
Primers: Msp2F (CGG GCC GCG TTT AAC AGC GCC)
Msp2R (ACC AGC GGC CAT AAG GAC GTC)
Tamanho do produto: 279-bp
[DNTP´s]: 200 μM
[Taq]: 2,5 U
[MgCl2]: 1,5 mM
[Primers]: 20 pmol
[Amplificação]: 95°C por 5 min, 35 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min a 70°C e 1
min a 72°C seguidos de uma extensão final de 72°C por 5 min.
17
Eletroforese
A eletroforese foi realizada como descrita por Bialek5. Os produtos de
PCR foram corados (SYBR™ Safe DNA, Invitrogen-USA) e submetidos à
eletroforese em gel de agarose 1,5 % (preparado em tampão Tris-Bórico-
EDTA, 0,1 M Tris, 0,09 M ácido bórico, 0,001 M EDTA, pH 8.4). A eletroforese
foi conduzida a 120 V por 60 min. O marcador O'RangeRuler™50bp DNA
Ladder (Fermentas) foi utilizado para determinação do tamanho dos produtos
de PCR. As bandas foram visualizadas em transluminador de luz Azul Safe
Imager™ Invitrogen.
3.3 Otimização dos reagentes da PCR O protocolo descrito por Bialek e cols5, selecionada no item anterior foi
otimizada de forma univariada. Os componentes e concentrações avaliados
são apresentados a seguir: 1) MgCl2 (0,5; 1,18; 1,84; 2,5; 3,16; 3,82 e 4,5 mM);
2) dNTPs (50; 100; 150; 200 ; 250; 300 e 350 µM); 3) Primers HcIII e HcIV (0,1;
0,4; 0,7; 1,0; 1,3;1,6 e 1,9 µM); 4) Taq DNA polimerase (0,5; 0,84; 0,7 ; 1,0 ;
1,3, 1,6; e 1,9 U/reação ) e 5) temperatura de hibridização (56; 59; 62; 65; 68
e 71 oC). Foram utilizados 5 μL do DNA molde (50 ng) para cada reação de
volume total de 25 μL.
3.4 Determinação da co-positividadee co-negatividade da reação de PCR.
Amostras Foram utilizadas trinta alíquotas de 1,0 ml de sangue periférico de um
doador saudável. Quinze destas foram contaminadas por concentrações
conhecidas de células leveduriformes de H. capsulatum (7x106, 7x105, 7x104,
7x103 e 7x102 células/mL) originadas de três isolados diferentes (FMT3417,
FMT3378 e FMT3342). Todas as amostras foram submetidas à detecção de H.
capsulatum por PCR (metodologias selecionadas e otimizadas nos itens
anteriormente descritos) e por hemocultura.
18
Hemocultura As amostras foram processadas de modo convencional como descrito
por Sidrim cols60. Inicialmente, as trinta alíquotas de 1,0 mL de sangue foram
transferidos para frasco de hemocultura contendo 5,0 mL de caldo de Infusão
de cérebro e coração. Após 15 dias de incubação (25oC), 200 µL da
hemocultura foi transferido para tubos contendo meios Ágar Sabouraud, Ágar
Infusão de Cérebro/Coração e Ágar Micosel. As culturas desenvolvidas foram
caracterizadas fenotipicamente37.
Determinação da co-positividade e co-negatividade da técnica A comparação entre o diagnóstico convencional e o diagnóstico
molecular foi feita como descrito por Bialek cols5. A cultura foi considerada
positiva quando foi observada pelo menos uma colônia com características
morfológicas típicas de H. capsulatum. A PCR foi considerada positiva quando
foi observado um produto do tamanho esperado em eletroforese.
Diante dos resultados da PCR e das Hemoculturas (padrão ouro) foi
calculada a co positividade e co negatividade da metodologia proposta.
Co-positividade= VP / (VP + FN) x 100
Co-negatividade = VN / (FP + VN) x 100
Valor Preditivo Positivo = VP / (VP + FP) x 100
Valor Preditivo Negativo = VN / (FN + VN) x 100
Onde:
(VP) = Resultado Verdadeiro Positivo, quando o teste é positivo e o indivíduo
tem a doença
(FP) = Resultado Falso Positivo, quando o teste é positivo e o indivíduo não
tem a doença.
(FN) = Resultado Falso Negativo, quando o teste é negativo e o indivíduo tem
a doença.
(VN = Resultado Verdadeiro Negativo, quando o teste é negativo e o indivíduo
não tem a doença.
19
4.2 ARTIGO 2- Seleção e otimização de protocolos para detecção de Histoplasma capsulatum var. capsulatum por reação em cadeia da polimerase (PCR)
Referência SAMPAIO, Ivanete de Lima; SANTOS, Mirlane Silva dos; FREIRE, Ana Karla
Lima; OGUSKU, Mauricio Morishi; SOUZA, João Vicente Braga de. Seleção e
otimização de protocolos para detecção de Histoplasma capsulatum var.
capsulatum por reação em cadeia da polimerase (PCR) Revista
iberoamericana de Micologia, v. xx, p. xx-xx, xxxx.
Artigo:
22
5.0 CONCLUSÕES
• O método de extração de DNA que demonstrou as melhores razões de
pureza foi o que utilizou membranas de sílica.
• O método de amplificação que demonstrou a maior capacidade de
detecção foi o que tinha como gene alvo “a proteína de 100 KDa”.
• A otimização da concentração dos componentes da PCR demonstrou
que a reação suportou variações significativas na concentração destes.
• O ensaio para determinação da co-positividade e co-negatividade
demonstrou que a PCR selecionada apresentou capacidade de
detecção maior de H. capsulatum var. capsulatum (10 pg de DNA) do
que a cultura.
23
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32
7. ANEXOS Tabela 1- Protocolos de PCR investigados Autor/Região alvo Condições da reação
Bialek cols 5
Proteina de 100
KDa
Primers: HcIII ((5-GAG ATC TAG TCG CGG CCA GGT TCA-3)
HcIV (5-AGG AGA GAA CTG TAT CGG TGG CTT G-3 ) Tamanho do produto: 210 -bp
[DNTP´s]: 100 µM
[Taq]: 1,5 U
[MgCl2]: 2,5 mM
[Primers]: 1 µM
[Amplificação]: 94°C por 5 min; 35 vezes 94°C por 30 s, 65°C por 30 s e 72°C
por 1 min e uma extensão final de 72°C for 5 min.
Bracca cols 3
Antígeno H
Primers: Hc2 (5-GCGGGGTTGGCTCTGCTCT-3)
Hc3 (5-TTGGAAACCCCGGGCTTG-3)
Tamanho do produto: 439-bp
[DNTP´s]: 200 µM
[Taq]: 1U
[MgCl2]: 2 mM
[Primers]: 0.4 µM
[Amplificação]: 96°C for 6 min; 35 cycles of 94°C for 1 min, 59°C por 1min, e
72°C por 1 min, extensão final de 72°C por 10 min.
Guedes27
Antígeno M
Primers: Msp2F (CGG GCC GCG TTT AAC AGC GCC)
Msp2R (ACC AGC GGC CAT AAG GAC GTC)
Tamanho do produto: 279-bp
[DNTP´s]: 200 μM
[Taq]: 2,5 U
[MgCl2]: 1,5 mM
[Primers]: 20 pmol
[Amplificação]: 95°C por 5 min, 35 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min a 70°C e 1
min a 72°C seguidos de uma extensão final de 72°C por 5 min.
33
Tabela 2- Concentração e grau de pureza do DNA de H. capsulatum utilizando diferentes metodologias de extração.
ISOLADO/ MORFOLOGI
A
Membrana de Sílica (QIAGEN)
CTAB + Fenol Clorofórmio (SAMBROOK ET AL 2001
modif.)
Precipitaçao de Sais
(EPICENTRE)
DNA (ng/μl) Abs 260/ Abs 280 DNA (ng/μl) Abs 260/ Abs 280 DNA (ng/μl) Abs 260/ Abs 280
3417/Micélio 112 ± 54,1 1,94 ± 0,21 200 ±110,3 2,03± 0,11 246 ± 24,3 1,99 ± 0,02
3417/Levedura 108 ± 48,3 2,01 ± 0,09 197 ± 23,6 1,28± 0,19 146 ± 24,7 1,26 ± 0,28
3378/Micélio 106 ± 33,1 2,09 ± 0,05 163 ± 42,1 1,87± 0,24 133 ±8,9 1,19 ± 0,01
3342/Micélio 95 ± 21,3 2,02 ± 0,02 77 ± 10,3 2,11± 0,40 97± 6,5 1,30 ± 0,13
3342/Levedura 102 ± 3,1 2,02 ± 0,06 138 ± 64,7 1,6± 0,27 109±40,8 1,31 ± 0,04
Tabela 3- Detecção de H. capsulatum var capsulatum pela Reação em Cadeia de Polimerase. Método Amostra contaminada
n=15 Amostra não- contaminada
n=15 Total
PCR positiva 15 3 18 PCR negativa 0 12 12 Total 15 15 30 Tabela 4- Detecção de H. capsulatum var capsulatum pela Cultura Método Amostra contaminada
n=15 Amostra não- contaminada
n=15 Total
Cultura positiva 03 0 03 Cultura negativa 12 15 27 Total 15 15 30 Tabela 5 – Dados comparativos entre os resultados obtidos na detecção do H. capsulatum pela PCR e pela Cultura Método Cultura positiva
n= 15 Cultura negativa
n=15 Total
PCR positiva 03 15 18 PCR negativa 0 12 12 Total 03 27 30
34
Tabela 6—Valores de Co-positividade e Co-negatividade, VPP e VPN para PCR e Cultura utilizando 30 amostras de sangue contaminadas e não contaminadas experimentalmente por leveduras viáveis de H.capsulatum .
Método Co-positividade* %
Co-negatividade** %
VPP %
VPN %
PCR 100 80 83,3 100 Cultura 20 50 100 55,6
*A Co-positividade foi calculada segundo a fórmula: A/ (A+C)x100, sendo A o número de infectados detectados pelo teste e (A+C) o total de doentes.
**A Co-negatividade foi calculada segundo a fórmula: B/ (B+D)x100, sendo B o número de negativos detectados no teste e (B+D) o total de não doentes.
Tabela 7- Resultados da PCR e da hemocultura frente as diferentes amostras
Amostra
Isolado n de células Cultura PCR Amostra
Isolado n de células Cultura PCR 1 0 - - 16 FMT3342 7x104 + + 2 FMT3417 7x106 + + 17 0 - - 3 0 - - 18 FMT3342 7x103 + + 4 FMT3417 7x105 + + 19 0 - - 5 0 - - 20 FMT3342 7x102 - + 6 FMT3417 7x104 + + 21 0 - + 7 0 - - 22 FMT3378 7x106 + + 8 FMT3417 7x103 + + 23 0 - - 9 0 - - 24 FMT3378 7x105 + +
10 FMT3417 7x102 - + 25 0 - - 11 0 - - 26 FMT3378 7x104 + + 12 FMT3342 7x106 + + 27 0 - - 13 0 - + 28 FMT3378 7x103 - + 14 FMT3342 7x105 + + 29 0 - + 15 0 - - 30 FMT3378 7x102 - +
35
A [MgCl2 ] mM 0,5 1,18 1,84 2,5 3,16 3,82 4,5
B [DNTPs] μM
50 100 150 200 250 300 350
C [Primers HcIII e HcIV] μM
0,1 0,4 0,7 1,0 1,3 1,6 1,9
D [Taq Polimerase] UI
0,5 0,84 0,7 1,0 1,3 1,6 1,9
E [Temperatura de anelamento] oC
56 59 62 65 68 71
M
200 pb
Figura 3- Produtos de PCR obtidos utilizando diferentes concentrações de células de H. capsulatum em sangue. (M) Marcador, (1) 7x106, (2) 7x105, (3) 7x104, (4) 7x10, (5) 7x102células/ml de sangue.
Figura 2- Influência das concentrações dos reagentes nos produtos de PCR obtidos nos
experimentos de otimização para o protocolo de Bialek cols, 2002.
36
ARTIGO 1- Diagnóstico Laboratorial da Histoplasmose Disseminada: um desafio para a Tecnologia da Reação de Cadeia de Polimerase?
Referência SOUZA, João Vicente Braga de ; SAMPAIO, Ivanete de Lima; TALHARI, C. ;
TALHARI, S. . Diagnóstico Laboratorial da Histoplasmose Disseminada: um
desafio para a tecnologia da Reação de Cadeia de Polimerase?. NewsLab, v.
91, p. 68-91, 2008.
46
Equipe Científica de Apoio ao Desenvolvimento do Projeto de Dissertação
Nome Formação (Titulação) Instituição de trabalho
Atividadades no projeto
João Vicente Braga de Souza Farmaceutico,Dr. INPA Orientador
Mauricio Morishi Ogusko Bioquimico,Msc. INPA Co-Orientador
Mirlane Silva dos Santos Acadêmica de Biologia UNINORTE Auxilio nas atividades relativas a PCR
Ana Karla Lima Freire Bioquimica. UFAM Auxilio na preparação de meios e reagentes
Érika Simplicio de Souza Engenheira Quimica,Dra. UEA Apoio logístico ,compra de material
Antonieta 2 ° Grau completo FMTAM Auxilio na esterilização dos meios de cultura.
Erick Andrei Sampaio 2° Grau completo INPA Auxilio nas atividades relativas a PCR.
47
Cronograma de Execução Física: INÍCIO: 03/2008 TÉRMINO: 03/ 2010 DURAÇÃO EM MESES = 24 meses
ATIVIDADES MESES 1º. ano mar abr mai jun jul ago set out nov dez jan fev
01 Créditos X X X X X X X X X X X X
02 Revisão Bibliográfica visando atualização das informações sobre o assunto
X X X X X X X X X X
03 Treinamento nas atividades de preparo de meios e reagentes , iniciação na técnica da PCR ,e manutenção das linhagens.
X X X X X X X X X X X
X
ATIVIDADES MESES 2º. ano mar abr mai jun jul ago set out nov dez jan fev
01 Revisão Bibliográfica visando atualização das informações sobre o assunto
X X X X X X X X X X X
02 Elaboração do Projeto X X X X X X X
03 Aula de qualificação X
04 Manutenção da linhagens, experimentos de extração, experimentos de PCR
X X X X X X X X X X X
X
05 Análise dos dados X X X X X X X X X X
06 Apresentação dados parciais X
07 Redação do artigo X X X X X X X X X X X X
08 Defesa da Dissertação X
48
Orçamento detalhado
ITEM QTD Descrição (somente 1 linha para cada item) Valor Unit.R$
Valor Totaldos Bens
R$1 6 Papel (resma) R$ 15,00 R$90,002 6 Tinta para impressora (cartucho) R$ 60,00 R$360,003 4 Agar Sabouraud (500g) R$ 390,00 R$1.560,004 4 Agar Mycosel (500 g) R$ 380,00 R$1.520,005 4 Agar BHI (500 g) R$ 410,00 R$1.640,006 4 Agar Casitose (500 g) R$ 430,00 R$1.720,007 8 Agar RPMI 1640 ( 1000 mL) R$ 300,00 R$2.400,008 4 Agar Niger (500 g) R$ 300,00 R$1.200,009 12 Kits comerciais para extração de DNA (100 reações) R$ 1.800,00 R$21.600,00
10 1 Fenol (250 g) R$ 200,00 R$200,00
11 1 Clorofórmio (1000 mL) R$ 110,00 R$110,0012 1 Isopropanol (1000 mL) R$ 120,00 R$120,0013 2 Etanol (1000 mL) R$ 50,00 R$100,00
14 6 Proteinase K (500 U) R$ 153,00 R$918,0015 6 Lyticase (200 U) R$ 200,00 R$1.200,0016 1 Microesferas de vidro (200 g) R$ 150,00 R$150,0017 1 Tris ((HOCH2)3CNH2 (250 g) R$ 200,00 R$200,0018 1 NaCl (250 g) R$ 30,00 R$30,0019 1 EDTA (250 g) R$ 110,00 R$110,0020 1 Ribonuclease A (500 U) R$ 210,00 R$210,00
21 12 Kits comerciais para reação de PCR (100 reações) R$ 427,00 R$5.124,0022 6 Taq polimerase ( 150 U) R$ 1.100,00 R$6.600,0023 6 Nucleotídeos (100 mM) R$ 300,00 R$1.800,0024 1 MgCl2 (100 g) R$ 150,00 R$150,0025 48 Primers ( 1mL-100 mM) R$ 150,00 R$7.200,0026 6 Agarose (200 g) R$ 593,00 R$3.558,0027 6 Tampão TEB 10x (1000ml) R$ 250,00 R$1.500,0028 6 Tampão TAE 50x (1000 ml) R$ 462,00 R$2.772,00
29 1 Brometo de etídio (1 g) R$ 340,00 R$340,0030 6 Corantes de DNA (1ml) R$ 165,00 R$990,0031 12 Marcadores para eletroforese (200 uL) R$ 302,00 R$3.624,0032 12 KIts comerciais para PCR em Tempo Real (50 reações) R$ 647,00 R$7.764,0033 12 SYBR Green (1g) R$ 230,00 R$2.760,0034 12 Taq-polimerase para PCR em Tempo Real (150 U) R$ 1.400,00 R$16.800,0035 12 Nucleotídeos para PCR em Tempo Real (100 mM) R$ 670,00 R$8.040,0036 3 Kit comercial para extração de DNA de gel de eletroforese (100 reações) R$ 1.100,00 R$3.300,0037 6 Microtubos (0,2; 0,5;1,5 mL) 1000 unid R$ 700,00 R$4.200,0038 6 Ponteiras (0-10, 20-300, 100-1000 uL) 1000 unid R$ 900,00 R$5.400,0039 12 Microplascas (20 unid) R$ 240,00 R$2.880,0040 1 Kit de coloração de Giensa R$ 60,00 R$60,00
Total R$120.300,00
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