ABSTRACT
A new high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry method
(LC/MS/MS) for quantification of nicotine from tobacco was elaborated. It was utilized an
Atlantis HILIC, 100 mm x 3.0 mm i.d., 3 μm column with a mobile phase containing
acetonitrile/ solution 0.2% formic acid in water. The ionization was optimized using ESI(+) and
enhanced selectivity was achieved using tandem mass spectrometric analysis. The precursor to
product ion transitions of m/z 163 > (105.8, 131.8) were used to measure the nicotine
concentrations.
The quantification was made using the external standard method. The calibration curves
were made on range 0.044 μg/ml. Nicotine content was determined in 40 brands of cigarettes
available in Romania. With our methodology, we obtained values of nicotine in tobacco between
7.5 and 17.6 mg/g.
INTRODUCTION
Tobacco has been smoked for at least the last three thousand years. Christopher
Columbus found it when he landed in the Americas in 1492, but ancient temple carvings show
tobacco being smoked in Central America as long ago as 1,000 BC. Nicotine,
(S)3( 1methyl2pyrrolidinyl) pyridine, is the most abundant of the volatile alkaloids in the
tobacco leaf. The primary commercial source of nicotine is by extraction from the plant
Nicotinia tabacum and Nicotinia rustica. Nicotine acts on nicotinic cholinergic receptors, affects
most organ systems in the body and is a highly addictive drug [1]. Nicotine normally makes up
about 5 percent of a tobacco plant, by weight. Cigarettes contain 8 to 20 milligrams (mg) of
nicotine (depending on the brand), but only approximately 1 mg is actually absorbed in the
human body. Approximately 70% of smokers who want to quit smoking cannot and about 83%
of smokers smoke every day [2]. A study done by the Center for Health Policies and Services in
Romania showed that 39.9 percent of Romanians smoke daily.
The amount of information regarding nicotine content in cigarettes is slight and only a
few studies have been done to bring light to this subject [3]. There were described HPLC
methods for the determination of nicotine from pharmaceutical formulations [4] and HPLC
tandem mass spectrometry methods for determination from biological samples [5,6]. The aim of
our study was to elaborate a rapid and simple LC/MS/MS method suitable for quantification of
nicotine in a large number of tobacco samples.
MATERIALS AND METHOD
Chemicals
Nicotine was purchased from SigmaAldrich (Germany). Acetonitrile and formic acid
98% were from Merck KGaA (Darmstadt, Germany). Apparatus and chromatographic conditions
An Agilent 1100 Series (Agilent, USA) chromatographic system was used (binary pump, online
degasser, autosampler, thermostat set at 35 °C and 1100 LC/MSD Ion Trap detector). Analytical
column: Altantis HILIC, 100 mm x 3.0 mm i.d., 3.0 μm, (Waters, USA). The mobile phase was a
mixture 80:20 (v/v) of acetonitrile: 0.2% formic acid in water. The flow rate was 1 ml/min and
the injection volume of 5 μl. The mass analyser operated with an ESI source, ion mode: positive,
Vcap: 7000V, nebulizer: 70 psi, drying flow gas: 12 l/min, drying gas temperature: 325 °C, max
accumulation time: 100 ms, ion target: 25000, scan range: 70170 m/z. The precursor to product
ion transitions of m/z 163 > (105.8, 131.8) were used for nicotine quantification.
Standard solutions
Stock solution of nicotine (20 mg/ml) was obtained in acetonitrile. Seven standard solutions
(0.044 μg/ml) were obtained by diluting appropriate volumes of stock solution with acetonitrile /
0.2 % formic acid 80/20 (v/v).
Sample preparation
About 50 mg tobacco were accurately weighted and introduced in a 15 ml centrifuge
tube. 2 ml of H2SO4 0.1M solution were added and the mixture kept in ultrasonic bath for 10
seconds. Then, the centrifuge tube was introduced in a water bath at 70 °C for 10 minutes. In a 2
ml Eppendorf tube, 50 μl of extract were diluted to 1 ml with acetonitrile. The tube was
centrifuged for 6 min at 5000 rpm and 50 μl of supernatant was diluted to 1 ml with mobile
phase. 5 μl from final solution were injected in chromatographic system.
RESULTS AND DISCUSSIONS
It is well known that ESILC/ MS/MS detection is a very selective and sensitive analytical
technique for quantification of easily ionisable organic compounds. In EIMS technique, the
compound is ionized after impact with high determination of nicotine from tobacco by
LCMSMS energy electrons and the M+ ion is first obtained and immediately fragmented into
daughter ions. Almost any organic structure can be analyzed in this way. However, in case of
ESIMS analysis, the processes are very different. First, only compounds that are ionisable in
solution can be detected. The ionisation occurs easily when the compound of interest has either
basic or acidic functions and the pH of media is adjusted properly. Second, the ions formed in
solutions are always adducts like (M+H)+ or (MH).
These ions can be isolated by mass spectrometer and then fragmented by “s haking” them
at high vacuum, in presence of argon, using a voltage specific for m/z value of the ion. Multiple
steps of solation fragmentation can be done, that allow obtaining socalled MSn spectra (n=2…
5 ), which are often more informative than classical EIMS spectra. The MS2 spectrum of
nicotine obtained after isolation and fragmentation of m/z 162.9 is shown in Fig. 1. The most
abundant ions, 105.8 and 131.8 were chosen for quantification.
CONCLUSION
The aim of this study was to elaborate a rapid and simple LC/MS/MS method for
quantification of nicotine in tobacco. Chromatographic, detection and extraction parameters were
optimized in order to obtain high selectivity and a short runtime. The procedure of sample
processing method was also simplified, allowing preparation of a great number of samples in a
short time.
ABSTRAK
Sebuah kromatografi cair kinerja tinggi baru ditambah dengan metode spektrometri
massa (LC/MS/MS) untuk kuantifikasi nikotin dari tembakau diuraikan . Hal itu dimanfaatkan
sebagai Atlantis HILIC, 100 mm x 3,0 mm id , 3 m kolom dengan fase gerak asetonitril yang
mengandung / larutan 0,2 % asam format dalam air . Ionisasi ini dioptimalkan menggunakan ESI
( + ) dan meningkatkan selektivitas dicapai dengan menggunakan analisis spektrometri massa
tandem . Prekursor untuk transisi ion produk m / z 163 > ( 105,8 , 131,8 ) yang digunakan untuk
mengukur konsentrasi nikotin .
Kuantifikasi ini dibuat dengan menggunakan metode standar eksternal . Kurva kalibrasi
dibuat pada kisaran 0,044 mg / ml . Nikotin konten ditentukan dalam 40 merek rokok yang
tersedia di Rumania . Dengan metodologi kami, kami memperoleh nilai nikotin dalam tembakau
antara 7,5 dan 17,6 mg / g .
PENDAHULUAN
Tembakau telah merokok selama setidaknya tiga ribu tahun terakhir . Christopher
Columbus menemukannya ketika ia mendarat di Amerika pada tahun 1492 , tetapi ukiran candi
kuno menunjukkan tembakau yang merokok di Amerika Tengah sejak tahun 1.000 SM .
Nikotin , ( S ) 3 ( 1methyl2pyrrolidinyl ) piridin , adalah yang paling berlimpah alkaloid atsiri
dalam daun tembakau . Sumber komersial utama dari nikotin adalah dengan ekstraksi dari
tanaman Nicotinia tabacum dan Nicotinia rustica . Nikotin bertindak pada reseptor kolinergik
nikotinat, mempengaruhi sebagian besar sistem organ dalam tubuh dan merupakan obat yang
sangat adiktif [ 1 ] . Nikotin biasanya membuat naik sekitar 5 persen dari tanaman tembakau ,
berat . Rokok mengandung 8 sampai 20 miligram ( mg ) nikotin ( tergantung merek ) , tetapi
hanya sekitar 1 mg sebenarnya diserap dalam tubuh manusia . Sekitar 70 % dari perokok yang
ingin berhenti merokok tidak bisa dan sekitar 83 % dari perokok merokok setiap hari [ 2 ] .
Sebuah studi yang dilakukan oleh Pusat Kebijakan Kesehatan dan Jasa di Rumania menunjukkan
bahwa 39,9 persen dari Rumania merokok setiap hari .
Jumlah informasi mengenai konten nikotin dalam rokok adalah sedikit dan hanya
beberapa studi telah dilakukan untuk membawa cahaya untuk subjek ini [ 3 ] . Ada digambarkan
metode HPLC untuk penentuan nikotin dari formulasi farmasi [ 4 ] dan HPLC tandem metode
spektrometri massa untuk penentuan dari sampel biologis [ 5,6 ] . Tujuan dari studi kami adalah
untuk menguraikan metode LC / MS / MS cepat dan sederhana cocok untuk kuantifikasi nikotin
dalam sejumlah besar sampel tembakau .
BAHAN DAN METODE
Bahan Kimia
Nikotin dibeli dari SigmaAldrich ( Jerman ) . Asetonitril dan asam formiat 98 % berasal
dari Merck KGaA ( Darmstadt , Jerman ) . Aparatur dan kondisi kromatografi Sebuah Agilent
1100 Series ( Agilent , USA ) sistem kromatografi digunakan ( pompa biner , degasser online,
autosampler , termostat ditetapkan pada 35 ° C dan 1100 LC / MSD Ion Perangkap detector ) .
Kolom analitik : Altantis HILIC , 100 mm x 3,0 mm id , 3,0 m , ( Waters , USA ) . Fase gerak
adalah campuran 80:20 ( v / v ) asetonitril : 0,2 % asam format dalam air . Laju aliran adalah 1
ml / menit dan volume injeksi dari 5 ml . Analyzer massa dioperasikan dengan sumber ESI ,
modus ion : positif , VCAP : 7000V , nebulizer : 70 psi , gas aliran pengeringan : 12 l / min ,
suhu pengeringan gas : 325 ° C , waktu akumulasi max : 100 ms , Target ion : 25000 , kisaran
scan: 70.170 m / z . Prekursor untuk transisi ion produk m / z 163 > ( 105,8 , 131,8 ) yang
digunakan untuk kuantifikasi nikotin .
Larutan Standar
Larutan stok nikotin ( 20 mg / ml ) diperoleh dalam asetonitril . Tujuh solusi standar
( 0,044 mg / ml ) diperoleh dengan cara pengenceran volume yang tepat larutan stok dengan
asetonitril / 0,2 % asam format 80/20 ( v / v ) .
Preparasi Sampel
Sekitar 50 mg tembakau akurat ditimbang dan diperkenalkan dalam centrifuge tube 15 ml
. 2 ml larutan H2SO4 0,1 M ditambahkan dan campuran disimpan di bath ultrasonik selama 10
detik . Kemudian , tabung centrifuge diperkenalkan dalam bak air pada 70 ° C selama 10 menit .
Dalam tabung 2 ml Eppendorf , 50 ml ekstrak diencerkan dengan 1 ml dengan asetonitril .
Tabung disentrifugasi selama 6 menit pada 5000 rpm dan 50 ml supernatan terdilusi menjadi 1
ml dengan fase gerak . 5 ml dari solusi akhir yang disuntikkan dalam sistem kromatografi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hal ini juga diketahui bahwa deteksi ESILC / MS / MS adalah teknik analisis yang sangat
selektif dan sensitif untuk kuantifikasi senyawa organik mudah terionisasi . Dalam teknik EIMS ,
senyawa terionisasi setelah dampak dengan determinasi tinggi nikotin dari tembakau oleh
LCMSMS elektron energi dan M + ion pertama diperoleh dan segera terpecah menjadi ion putri .
Hampir setiap struktur organik dapat dianalisis dengan cara ini . Namun, dalam kasus analisis
ESIMS , proses sangat berbeda . Pertama, hanya senyawa yang dapat terionisasi dalam larutan
dapat dideteksi . Ionisasi terjadi dengan mudah ketika senyawa bunga memiliki baik fungsi dasar
atau asam dan pH media disesuaikan dengan benar. Kedua , ion-ion yang terbentuk dalam
larutan selalu aduk seperti ( M + H ) + atau ( MH ) .
Ion ini dapat diisolasi dengan spektrometer massa dan kemudian terfragmentasi oleh " s
haking " mereka di vakum tinggi , di hadapan argon , menggunakan tegangan tertentu untuk nilai
m / z dari ion . Beberapa langkah dari solation fragmentasi bisa dilakukan , yang memungkinkan
memperoleh socalled MSN spektrum ( n = 2 ... 5 ) , yang sering lebih informatif daripada
spektrum EIMS klasik . The MS2 spektrum nikotin diperoleh setelah isolasi dan fragmentasi m /
z 162,9 ditunjukkan pada Gambar . 1 . Ion-ion yang paling melimpah , 105,8 dan 131,8 dipilih
untuk kuantifikasi .
KESIMPULAN
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menjelaskan metode cepat dan sederhana LC /
MS / MS untuk kuantifikasi nikotin dalam tembakau . Kromatografi , deteksi dan ekstraksi
parameter yang dioptimalkan untuk mendapatkan selektivitas tinggi dan runtime pendek .
Prosedur metode pengolahan sampel juga disederhanakan , sehingga persiapan sejumlah besar
sampel dalam waktu singkat .
TINJAUAN PUSTAKA
LIQUID CROMATHOGRAPY – MASS SPECTROSCOPY WITH ELECTROSPRAY IONIZATION METHODE (LC-MS-ESI)
Liquid Chromatograpy – mass spectroscopy adalah dua alat yang digabungkan menjadi satu, dimana berfungsi untuk memisahkan beberapa senyawa atau campuran senyawa berdasarkan kepolarannya (prinsip kerja kromatograpi), dimana setelah campuran senyawa tersebut terpisah, maka senyawa yang murni tersebut akan diidentifikasi berat moleculnya. Berbeda dengan Gas Chromatograpy – mass spectroscopy, LC-MS pada output datanya sangat jarang sekali terjadi pola fragmentasi, dikarenakan tidak ada proses fragmentasi. Sehingga yang didapatkan adalah berat molekul ditambah beberapa muatan ditambah lagi berat molekul pelarut (terkadang).ESI adalah salah satu methode untuk mendapatkan berat molekul yang digunakan dalam LC-MS dimana jika pada metode biasanya (lupa-red) menggunakan fragmentasi (pemecahan molekul), maka pada metode ESI menggunakan spray (Penyemprotan). AKibatnya tidak akan ditemukan fragmen –fragmen dari molekul tersebut.Adapun cara kerja liquid chromatograpi adalah sama dengan HPLC atau liquid chromatograpy lain pada umumnya. Sedangkan kerja Mass spectroscopy metode ESI adalah sebagai berikut :
Gambar 1. Proses pemisahan analite pada Liquid Chromatograpy sampai dengan sprayer
(penyemprotan oleh spray needle tip)1. Analyte bersama dengan eluent dari syringe pump atau LC masuk ke dalam cappilary.Di dalam kappilary terdapat anoda (kutup negatif) pada taylor cone dan katoda (kutup negatif) didekat masukkan analyte dan eluent. Kutup ini berfungsi agar muatan yang berkumpul pada taylor cone adalah muatan positif sehingga nantinya saat terjadi penyemprotan dan terbentuk droplet (tetes – tetes) tidak bergabung – gabung menjadi droplet yang lebih besar lagi.2. Analylet dan solven(eluent) di semprotkan (spray) melalui taylor cone.Akan terbentuk droplet – droplet dimana droplet – droplet itu akan mengalami tahap evaporasi solven untuk mengurangi solven yang menempel di analyte. Karena suatu saat , apabila terjadi evaporasi secara terus menerus maka solven yang meliputi analyte terkungkung dalam muatan positif yang berlebih, dalam bahasa inggris tahap seperti ini disebut the ‘rayleigh’ limit is reached, maka akan terjadi explosion yang disebut coulombic explosion dimana akan terjadi pemecahan droplet (tetesan) tadi. Ada beberapa kemungkinan yang terjadi pada droplet – droplet tersebut .a. Yang pertama analyte akan tertambahi satu muatan positifb. yang kedua analyte akan tertambahi beberapa muatan positifc. yang ketiga analyte akan tertambahi satu muatan positif dan satu molekul solvend. yang keempat analyte akan tertambahi satu muatan positif dan beberapa molekul solvene. yang kelima analyte akant tertambahi beberapa muatan positif dan beberapa molekul solven.
Gambar 3.Proses Setelah analite dipisahkan oleh Liquid Cromatography3. Droplet yang mengalami coulombic exsploison tersebut akan masuk ke dalam cone dimana di sisi kiri dan kanannya sudah mengalir gas Nitrogen (N2). Gas ini berfungsi agar analyte yang terjadi tadi stabil dalam bentuknya dan tidak terganggu oleh pengaruh gas oksigen. Droplet masuk ke dalam cappilary transfer lalu akan di analisis melalui mass spectrometer.
Gambar 3. Proses Droplet berubah menjadi analyte yang siap untuk di mass spectroscopy
gambar 4. Penjelasan datangnya muatan positif pada droplet – droplet LC-MS
Gambar 5. Penjelasan kenapa pada LC-MS solven harus di buat muatan positif
gambar 6. Penjelasan kenapa bukan ion negatif yang digunakan
gambar 7. Penjelasan ion molekul semu apa saja yang terjadi /yang bisa muncul pada output data LC-MS
gambar8. Contoh spektra dan hasil
Gambar 9. Kerugian yang dihasilkan dibandingkan dengan LC-MS
Gambar 10. Kesimpulan , diambil dari presented Jessica & Gilement, 2002.DAFTAR PUSTAKA
Adamovics, & John.A, 1997, Chromatographic Analysis of Pharmaceutical, Marcel dekker Inc, New York.
Ardrey, R. E., 2003, Liquid chromatography-mass spectrometry: an introduction, 185, John Wiley & Sons, New York.
De Hoffmann, E., & Stroobant, V.,2007, Mass spectrometry: principles and applications, 226-227, Wiley-Interscience, New York.
Jesicca & Gilment, 2002, Electrospray ionization Mass Spectrometry, Presented at 17 september 2002.