Tierärztliche Hochschule Hannover
Genetische Charakterisierung von europäischen
Fledermaustollwutviren in Deutschland und
Untersuchungen zu ihrer spatiotemporalen Diversität
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Conrad Martin Freuling
Nauen
Hannover 2009
Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. I. Greiser-Wilke und Prof. Dr. Moennig,
Institut für Virologie an der Tierärztlichen Hochschule
Hannover
2. PD Dr. F-J. Conraths, Friedrich-Loeffler-Institut,
Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Institut für
Epidemiologie, Wusterhausen
1. Gutachter: Prof. Dr. Moennig
2. Gutachter: PD Dr. große Beilage
Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2009
Diese Arbeit wurde gefördert durch ein Stipendium der Akademie für Tiergesundheit e.V.
(AfT).
Für Christiane und meine Familie
Teile dieser Arbeit wurden vorab veröffentlicht:
Originalartikel:
Freuling, C.M, N. Johnson, D.A. Marston, T. Selhorst, L. Geue, A.R. Fooks, N. Tordo, T.
Müller (2008):
A random grid based molecular epidemiological study on EBLV isolates from Germany
Dev Biol (Basel).;131 :301-9.
Freuling, C.M, E.Grossmann, F. J. Conraths, A. Schameitat, J. Kliemt, E. Auer, I. Greiser-
Wilke, and T. Müller (2008). First Isolation of EBLV-2 in Germany.
Veterinary Microbiology 131:26-34.
Vortrag:
Freuling, C.M, N. Johnson, D.A. Marston, T. Selhorst, L. Geue, A.R. Fooks, N. Tordo, T.
Müller (2007):
A random grid based molecular epidemiological study on EBLV isolates from Germany
Joint OIE/WHO/EU International Conference “Towards the Elimination of Rabies in Eurasia”
Paris (OIE Headquarters), 27-30 May 2007
Poster:
Freuling, C.M. T. Selhorst, B. Hoffmann und T. Müller (2008):
New Aspects in Molecular Epidemiology of Bat Rabies in Germany
XIX International Conference on Rabies in the Americas (RITA)
September 28–October 3, 2008
Centers for Disease Control and Prevention
1600 Clifton Road, NE, Atlanta, GA
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS ......................................................................................................... 5
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .............................................................................................. 7
1 Einleitung ......................................................................................................................... 11
2 Literatur ............................................................................................................................ 13
2.1 Taxonomie ................................................................................................................. 13
2.2 Übertragung ............................................................................................................... 17
2.3 Morphologie .............................................................................................................. 19
2.4 Virusgenomstruktur ................................................................................................... 20
2.5 Virusproteine ............................................................................................................. 21
2.5.1 Das Nukleoprotein (N-Protein) .......................................................................... 21
2.5.2 Das Phosphoprotein (P-Protein) ......................................................................... 21
2.5.3 Das M-Protein .................................................................................................... 22
2.5.4 Das Glykoprotein (G-Protein) ............................................................................ 22
2.5.5 Der GL-nicht translatierte Bereich ..................................................................... 23
2.5.6 Das L-Protein ..................................................................................................... 23
2.6 Molekulare Differenzierung von Lyssaviren ............................................................. 24
2.6.1 Typisierung anhand antigener Eigenschaften .................................................... 24
2.6.2 Differenzierung basierend auf genetischen Eigenschaften ................................ 24
2.6.3 Grundlagen phylogenetischer Analysen ............................................................. 27
2.7 Fledermaustollwut ..................................................................................................... 29
2.7.1 Amerika .............................................................................................................. 29
2.7.2 Afrika ................................................................................................................. 30
2.7.3 Australien und Asien .......................................................................................... 32
2.7.4 Europa ................................................................................................................ 33
2.7.5 Charakterisierung und molekulare Epidemiologie von EBLV .......................... 38
3 Eigene Untersuchungen .................................................................................................... 42
3.1 Material und Methoden ............................................................................................. 42
3.1.1 Material .............................................................................................................. 42
3.1.2 Methoden ............................................................................................................ 44
3.1.3 Statistische Auswertung ..................................................................................... 59
3.2 Ergebnisse .................................................................................................................. 61
3.2.1 Auswahl der Isolate ............................................................................................ 61
3.2.2 RT-PCR .............................................................................................................. 63
3.2.3 Sequenzanalyse des N-Gens ............................................................................... 63
3.2.4 Alignment und Analyse der nicht-kodierenden NP-Region .............................. 80
3.2.5 Analyse der GL-nicht-kodierenden Region ....................................................... 82
3.2.6 Analyse der Aminosäuresequenz des N-Proteins ............................................... 87
3.2.7 Nachweis von EBLV-2 in Deutschland ............................................................. 89
4 Diskussion ........................................................................................................................ 93
4.1 Schlussfolgerungen .................................................................................................. 108
4.2 Ausblick ................................................................................................................... 109
5 Zusammenfassung .......................................................................................................... 111
6 Summary ........................................................................................................................ 113
7 Literaturverzeichnis ........................................................................................................ 115
8 Anhang ........................................................................................................................... 136
8.1 Verwendete Isolate .................................................................................................. 136
8.2 Software ................................................................................................................... 137
9 Danksagung .................................................................................................................... 138
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
A Adenosin, oder auch Ampere
ABLV Australian Bat Lyssavirus, Australisches
Fledermaustollwutvirus
APS Ammoniumpersulfat
Aqua bidest Aqua bidestillata, zweifach destilliertes Wasser
ARV Aravan Virus
AS Aminosäure
ATCC American Type Culture Collection
bp Basenpaare
bzw. beziehungsweise
C Cytosin
ca. circa
cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure
ddNTP Didesoxyribonukleotidtriphosphat
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA desoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat
DUVV Duvenhage Virus
EBLV European Bat Lyssavirus, Europäisches
Fledermaustollwutvirus
EDTA Ethylendiamintetraazetat
ELISA Enzym-linked-immunosorbent-assay
EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
g Gramm bzw. Erdbeschleunigung
G Guanin, auch Glykoprotein
GIS Geographische Informationssysteme
GT Genotyp
h hora, Stunde
ICTV International Committee on Virus Taxonomy
IFT Immunfluoreszenztest
IGR intergenische Regionen
IRD Infrared dye, Infrarotfarbstoff
kB Kilobasen
KHUV Khujand Virus
LBV Lagos bat Virus
mAK monoklonaler Antikörper
min Minute bzw. Minuten
mM Millimolar
MMLV-RT Moloney murine leukemia virus- reverse Transkriptase
MOKV Mokolavirus
N-J Neighbor-Joining-Methode
NRL Nationale Referenzlabor
Nt Nukleotide
OTU Operational taxonomic unit
PBS phosphat buffered saline, phosphatgepufferte Salzlösung
PCR polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion
pg Pikogramm
pH negativ dekadischer Logarithmus der
Wasserstoffionenkonzentration
pmol Pikomol
PRRSV Porzines Reproduktives und Respiratorisches Syndrom Virus
RABV Rabies Virus
RNA ribonucleic acid , Ribonukleinsäure
RNAse Ribonuklease
RNP Ribonukleoproteinkomplex
RT reverse Transkriptase
RTCIT Rapid Tissue Culture Infection Test
RT-PCR Polymerasekettenreaktion nach reverser Transkription
SAD-L16 Street Alabama Dufferin, modifizierter Impfstamm
SDS sodiumdodecylsulfate, Natriumdodecylsulfat
s Sekunden
spp. Spezies
T Thymin
Ta annealing temperature, Anlagerungstemperatur
Taq Thermus aquaticus (Bakterium)
TBE Tris-Borat-EDTA
Tm melting temperature, Schmelztemperatur
TSN Tierseuchennachrichtensystem
Tth Thermus thermophilus (Bakterium)
U allein Uracil, bei Enzymen Angabe der Aktivität in units
UpM Umdrehungen pro Minute
UTR/NTR untranslated region, nicht translatierte Region
UV ultraviolett
V Volt
W Watt
WCBV West Caucasian Bat Lyssavirus
WHO world health organisation, Weltgesundheitsorganisation
x fach / fache
z. B. zum Beispiel
11
1 EINLEITUNG
Die Tollwut ist eine der ältesten bekannten Zoonosen. Die klinische Manifestierung dieser
Krankheit mit einem in aller Regel tödlich endenden Verlauf hat die Menschen von jeher in
ihren Bann gezogen. Bereits aus dem Altertum gibt es Hinweise auf Tollwuterkrankungen. So
wird beispielsweise in der Eshunna, einem Gesetztestext aus Mesopotamien, verfasst ca. 2300
vor unserer Zeitrechnung (v.u.Z), der Besitzer eines Hundes zur Entschädigung verpflichtet,
wenn sein Tier den Tod eines Menschen verursacht. Auch aus China liegen historische
Berichte vor, welche Hinweise auf das Vorkommen von Tollwut bei Hunden Jahrhunderte
v.u.Z. liefern. Bereits in der Historia Animalum Aristotele aus dem vierten Jahrhundert v.u.Z.
wird geschildert, dass der Biss eines tollwütigen Hundes zur Übertragung der Krankheit auf
andere Tiere führt.
Erst in der Neuzeit konnten durch Tierversuche die Eigenschaften des ätiologischen Agens
näher beleuchtet werden. Es gelang Pasteur im Jahr 1896 zum ersten Male, einem jungen
Mann, der von einem tollwütigen Hund gebissen worden war, durch eine Impfung das Leben
zu retten (WILKINSON, 1988). Die Bekämpfung der urbanen Form der Tollwut in Europa
beinhaltete die Kontrolle, Quarantäne und gegebenenfalls die Tötung streunender Hunde.
Dann führte jedoch in der Mitte des 20sten Jahrhunderts eine Tollwutepidemie zur weiten
Verbreitung der sylvatischen Tollwut in Europa. Hierbei war der Rotfuchs (Vulpes vulpes)
Hauptüberträger. Durch die orale Immunisierung der Füchse, einem modernen Mittel der
Tierseuchenbekämpfung, ist es gelungen, die Tollwut in weiten Teilen Europas zu tilgen.
Dennoch hat diese Infektionskrankheit in vielen Entwicklungsländern Asiens und Afrikas
nichts von ihrem Schrecken verloren.
Wenig bekannt ist, dass neben der klassischen Tollwut, die durch das Rabies Virus
hervorgerufen wird, in Europa wie in den meisten Regionen der Welt Fledermaustollwut
vorkommt. Die in Europa isolierten Erreger sind zwar mit dem klassischen Tollwutvirus
verwandt, stellen aber ein separates Infektionsgeschehen dar und bilden als Europäische
Fledermaustollwutviren Typ 1 und 2 zwei separate Genotypen innerhalb des Genus
Lyssavirus. Fledermäuse sind somit das Reservoir von 6 der 7 klassifizierten
Lyssavirusgenotypen.
12
Der erste Nachweis von Fledermaustollwut in Europa wurde 1954 in Deutschland erbracht.
Seit dem wurden zunächst sporadisch, seit 1985 regelmäßig Fledermaustollwutfälle gemeldet.
Zwischen 1954 und 2007 ist in Deutschland insgesamt bei 201 Fledermäusen das
Tollwutvirus nachgewiesen worden. Die Tatsache, dass in Europa an beiden
Fledermaustollwutvarianten Menschen nach dem Biss tollwütiger Fledermäuse verstorben
sind, unterstreicht die Relevanz der Fledermaustollwut für den öffentlichen
Gesundheitsschutz.
Über die Fledermaustollwut in Europa und Deutschland ist wenig bekannt. Zwar hat
Deutschland im europäischen Vergleich eine relativ große Zahl von Nachweisen an
Fledermaustollwut, Untersuchungen an deutschen Fledermaustollwutisolaten beschränkten
sich bisher aber auf großräumige Analysen mit wenigen Isolaten.
Unter Verwendung eines Geographischen Informationssystems (GIS) und mit Hilfe eines
Raster-basierten Ansatzes wurden aus dem Virusarchiv am Nationalen Referenzlabor für
Tollwut Fledermaustollwutisolate zur weiteren genetischen Charakterisierung ausgewählt.
Um Erkenntnisse über die Diversität dieser Viren und deren spatiotemporale Verbreitung in
Deutschland zu gewinnen, wurden die Nukleotidsequenzen von drei Genomabschnitten
sequenziert und vergleichend analysiert. Die Untersuchungen wurden am nationalen
Referenzlabor für Tollwut am Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Epidemiologie, in
Wusterhausen, durchgeführt.
13
2 LITERATUR
2.1 Taxonomie
Die Erreger der Tollwut sind Einzelstrang-RNA-Viren negativer Polarität des Genus
Lyssavirus, welches zusammen mit weiteren Genera (Ephemerovirus, Vesiculovirus,
Novirhabdovirus, Cytorhabdovirus, Nucleorhabdovirus) die Familie der Rhabdoviridae in der
Ordnung Mononegavirales bildet. Innerhalb des Genus Lyssavirus werden laut dem
International Committee on Virus Taxonomy (ICTV) verschiedene Spezies unterschieden
(TORDO et al., 2004); im internationalen Schrifttum ist allerdings die Bezeichnung Genotyp
(GT) gebräuchlich. Bislang sind insgesamt 11 Lyssaviren bekannt, die aufgrund ihrer
antigenen Struktur und phylogenetischen (N-, G- und P-Gene) Eigenschaften in verschiedene
taxonomische Einheiten eingeteilt werden können (Tabelle 2-1).
GT I umfasst das Tollwutvirus (Rabies Virus, RABV), welches nahezu weltweit vorkommt
und Erreger der „klassischen Tollwut“ ist. Empfänglich für dieses Virus sind alle Säugetiere.
Reservoirspezies sind karnivore Haus- und Wildtiere sowie in Amerika auch Fledermäuse
(Anon., 2004). Das Lagos Bat Virus (LBV) repräsentiert den GT 2 und wurde aus frugivoren
und insektivoren Fledermäusen in verschiedenen Ländern Afrikas isoliert (MARKOTTER et
al., 2006a). Das Mokolavirus (MOKV) als Vertreter des GT 3 wurde aus Spitzmäusen
(Crocidura ssp.), Nagetieren, Hunden und Katzen isoliert. Daher wird vermutet, dass kleinere
terrestrische Tierarten Reservoirspezies für MOKV sind. Bisher konnte das MOKV nur auf
dem afrikanischen Kontinent nachgewiesen werden (SABETA et al., 2007). Auch GT 4
(Duvenhage Virus, DUVV) wurde bisher nur in Ländern des südlichen Afrikas gefunden.
Reservoirspezies für diesen GT sind insektivore Fledermäuse (PAWESKA et al., 2006).
Die europäische Fledermaustollwut wird durch zwei verschiedene Tollwutviren, dem
European Bat Lyssavirus-Typ 1 (EBLV-1) und 2 (EBLV-2), hervorgerufen, welche die
Genotypen 5 und 6 repräsentieren. Man geht derzeit davon aus, dass EBLV-1 und EBLV-2
vornehmlich mit Eptesicus- bzw. Myotis-Arten assoziiert sind (AMENGUAL et al., 1997).
Das Australian Bat Lyssavirus (ABLV) als Vertreter des GT 7 ist sowohl bei insektivoren
Fledermäusen als auch bei Flughunden (Pteroiden) auf dem australischen Festland
nachgewiesen worden (GUYATT et al., 2003; GOULD et al., 2002; GOULD et al., 1998).
14
Zwischen 1995 und 2005 wurden vier weitere Lyssavirusvarianten aus Fledermäusen in
verschiedenen Regionen Asiens isoliert: Aravan Virus (ARV), Khujand Virus (KHUV), Irkut
Virus (IRV) und West Caucasian Bat Virus (WCBV) (KUZMIN et al., 2005; ARAI et al.,
2003; KUZMIN et al., 2003; BOTVINKIN et al., 2003b). Eine Klassifizierung als neue
Genotypen steht noch aus. Fledermäuse sind Reservoir und Vektor für 6 der bislang 7
bekannten Genotypen.
0.05
LBV
MOKV
RABV
ABLV
EBLV-1
DUVV
IRKV ARAV
WCBV
KHUV EBLV-2
Phylogruppe IPhylogruppe IIWCBV
Abbildung 2-1: Phylogenetischer Baum der Lyssavirus-Genotypen basierend auf N-Gen-Sequenzen (modifiziert nach KUZMIN et al., 2005)
15
Basierend auf phylogenetischen Analysen in Kombination mit Untersuchungen zur
Immunogenität und Pathogenität können Lyssaviren in mindestens zwei verschiedene
Phylogruppen eingeteilt werden. Phylogruppe I umfasst die Genotypen 1, 4, 5, 6 und 7 sowie
die vorläufigen Genotypen ARV, KHUV und IRV, während die Genotypen 2 (LBV) und 3
(MOKV) zur Phylogruppe 2 zusammengefasst werden können (KUZMIN et al., 2005;
BADRANE et al., 2001). Das WCBV ist der bislang am meisten divergierende Vertreter
innerhalb des Genus Lyssavirus und keiner der beiden Phylogruppen zuzuordnen (Abb. 2-1).
KUZMIN (2005) wies nach, dass sich auch die molekularen Eigenschaften von WCBV von
denen der etablierten Phylogruppen unterscheiden.
16
Tabelle 2-1: Lyssavirus Klassifikation nach ICTV (mod. nach WHO Tech.Rep.Ser.; 918)
Virus Abkürzung Genotyp Wirtsspektrum Verbreitung
Rabies virus RABV I
Wild- und Haustiere, hämatophage und insektenfressende Fledermäuse (Nord-, Südamerika), Mensch
Europa, Asien, Amerika, Asien
Lagos bat virus LBV II fruchtfleischfressende Fledermäuse (Megachiroptera)
Afrika
Mokola virus MOKV III ? Afrika
Duvenhage virus DUVV IV insektenfressende Fledermäuse Afrika
European bat lyssavirus 1 EBLV 1 V
insektenfressende Fledermäuse (Eptesicus serotinus)
Europa
European bat lyssavirus EBLV 2 VI
insektenfressende Fledermäuse (Myotis ssp)
Europa
Australian bat lyssavirus ABLV VII
Flughunde und insektenfressende Fledermäuse (Mega/Microchiroptera)
Australien
Aravan virus ARAV ? insektenfressende Fledermäuse (isoliert aus Myotis blythi)
Zentralasien
Khujand virus KHUV ? insektenfressende Fledermäuse (isoliert aus Myotis mystacinus)
Zentralasien
Irkut virus IRKV ? insektenfressende Fledermäuse (isoliert aus Murina leucogaster)
Ostsibirien
West Causcasian bat virus WCBV ?
insektenfressende Fledermäuse (isoliert aus Miniopterus schreibersi)
Kaukasusregion
17
2.2 Übertragung
Die Übertragung von Tollwutvirus erfolgt in den meisten Fällen durch Bissverletzungen.
Tollwütige Tiere, welche vermehrungsfähiges Virus über den Speichel ausscheiden, führen
zur Verbreitung der Infektionskrankheit, indem sie das Virus über den Biss transdermal in
empfängliche Wirte inokulieren (WARRELL und WARRELL, 2004). Die Übertragung von
Tollwutvirus kann auch durch direkten Kontakt von Schleimhäuten (Mund- bzw.
Maulschleimhaut, Bindehaut) mit infektiösem Material (Speichel, Nervengewebe,
Cerebrospinalflüssigkeit) erfolgen. Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass die Tollwut-
Epidemie unter Kudu-Antilopen (Tragelaphos strepsiceros) in Namibia durch das
gegenseitige Belecken, einem charakteristischen Sozialverhalten dieser Tiere, hervorgerufen
wird (BARNARD et al., 1982).
Die unmittelbare Virusübertragung zwischen Fledermäusen ist noch wenig erforscht; man
nimmt jedoch an, dass die Übertragung ähnlich wie bei terrestrischen Säugern durch
Bissverletzung erfolgt (HUGHES et al., 2006). Auch eine Übertragung via Aerosol wird
diskutiert (GIBBONS, 2002).
Nach dem Eintritt des Virus in subkutane Gewebe kann in der quer gestreiften Muskulatur die
erste Virusreplikation stattfinden. Das Tollwut-Virus bindet an den nikotinergen Azetyl-
Cholin-Rezeptor (NAChR) der neuromuskulären Endplatte, von wo aus nachfolgend
Nervenzellen infiziert werden. SHANKAR (1991) und JACKSON (2002) konnten zeigen,
dass auch ein direkter Eintritt von Virus in die peripheren Nervenzellen möglich ist. Neben
dem Azetyl-Cholin-Rezeptor wurden noch zwei weitere Rezeptoren, ein Neuronen-
Adhäsionsmolekül (NCAM) und p75NTR, ein Rezeptor neurotropher Faktoren,
nachgewiesen. Da in vitro eine Reihe anderer Zelltypen mit Tollwut-Virus infizierbar sind,
müssen weitere ubiquitäre Rezeptoren vorhanden sein, an welche das Tollwutvirus binden
kann (FINKE und CONZELMANN, 2005). Trotz Abwesenheit von p75NTR konnten
neuronale Zellen mit Tollwut infiziert werden (TUFFEREAU et al., 2007).
Das Tollwutvirus der amerikanischen Silver-haired bats (SHBRV) hat offenbar eine höhere
Affinität zu Fibroblasten und epithelialen Zellen und repliziert auch bei geringeren
18
Temperaturen in vitro, was möglicherweise eine Adaptation des Virus an die spezifischen
Übertragungswege bei Fledermäusen nahe legt (MORIMOTO et al., 1996).
Ausgehend von der peripheren Inokulation wandert das Virus durch axonalen Transport
zentripetal zum Zentralnervensystem (TSIANG, 1979). Hierbei scheint das Phosphoprotein
eine Bindung mit einer leichten Kette des Dynein-Proteins (LC 8) einzugehen (JACOB et al.,
2000; RAUX et al., 2000). Neuere Untersuchungen zeigten, dass es bei Inokulation von
genetisch modifizierten Tollwutviren des Stammes SAD-L16, denen die Bindungsstelle zu
LC 8 fehlt, zu einer Verzögerung der Virusausbreitung kommt, die histologischen
Veränderungen bei Mäusen lassen sich jedoch nicht signifikant von denen nicht veränderter
SAD–L16 Virusvarianten unterscheiden (RASALINGAM et al., 2005).
Nach der Infektion des Rückenmarks erreicht das Virus über den bereits erwähnten axonalen
Transport, und durch direkte Ausbreitung das Gehirn und führt dort zu Veränderungen der
Nervenzellphysiologie (JACKSON, 2002). Innerhalb des Zentralnervensystems findet eine
rapide Virusvermehrung statt (HEMACHUDHA et al., 2002). Erneut ist es der transaxonale
Transport, der zur zentrifugalen Ausbreitung des Virus in periphere Gewebe genutzt wird. Mit
der Infektion der Speicheldrüsen und dem Ausscheiden von infektiösem Virus im Speichel
unmittelbar vor dem Auftreten der klinischen Symptome kann das Virus auf weitere Wirte
übertragen werden und somit einen Infektionszyklus aufrechterhalten.
Die pathophysiologischen Veränderungen, die sich im Verlauf der Meningoencephalitis im
Zentralnervensystem manifestieren, führen über eine Atemlähmung zum Tod (JACKSON,
2002).
19
2.3 Morphologie
Lyssavirus-Partikel sind geschoßartig geformt und starr. Sie sind ca. 180 nm lang und
besitzen einen Durchmesser von 75nm. Eine Lipid-Doppelschicht, die der Wirtszelle
entstammt, bildet die äußere Hülle. Glykoproteine (G-Proteine) formen so genannte „Spikes“
und bedecken, mit Ausnahme des stumpfen Endes, die gesamte Virionenoberfläche und
bilden auch das Hauptoberflächenantigen (TORDO und POCH, 1988). Über eine
Transmembrandomäne ist das G-Protein in der Membran verankert (Abb. 2-2).
Innerhalb der Hülle formen das RNA-Molekül, das Nukleoprotein und das Phosphoprotein
einen aktiven Ribunukleoproteinkomplex (RNP), der eine feste helikale Struktur mit 30-35
Schlaufen bildet. Zwischen dem RNP und der Virushülle befindet sich das Matrixprotein.
(WUNNER et al., 1988).
Abbildung 2-2: Schematischer Aufbau des Tollwutvirions (Le Mecier, URL http//www.virustaxonomyonline.com)
20
2.4 Virusgenomstruktur
Lyssaviren besitzen eine nicht-segmentierte, negativ-Strang-RNA mit einer Länge von rund
12 kb (MARSTON et al., 2007; CONZELMANN et al., 1989; TORDO et al., 1986b). Das
Genom kodiert eine kurze, nicht translatierte leader-Sequenz und fünf Strukturproteine: das
Nukleoprotein (N-Protein), das Phosphoprotein (P-Protein), das Matrixprotein (M-Protein),
das Glykoprotein (G-Protein) und die virale Polymerase (L-Protein). Zwischen den
kodierenden Genabschnitten liegen nicht-translatierte Regionen (untranslated regions, UTR)
unterschiedlicher Länge (MARSTON et al., 2007; TORDO et al., 1986). Innerhalb dieser
Bereiche befinden sich zwischen Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen
sogenannte intergenische Regionen (IGR). Im Genom der EBLVs beispielsweise umfasst die
IGR im N-P-Bereich 2 Nukleotide, im P-M- und im M-G-Bereich jeweils 5 Nukleotide. Die
GL-IGR ist die längste und besteht bei EBLV-1 aus 20 und bei EBLV-2 aus 18 Nukleotiden
(MARSTON et al., 2007).
Abbildung 2-3: Darstellung des Genomaufbaus von Lyssaviren am Beispiel EBLV-1. Unterhalb der Gene (Balken) ist die Größe in nt angegeben. Nicht-translatierte Regionen (Linien) sind ebenfalls dargestellt.
21
2.5 Virusproteine
2.5.1 Das Nukleoprotein (N-Protein)
Das phosphorylierte N-Protein besteht aus 450 Aminosäuren. N-Proteine sind eng mit der
viralen RNA assoziiert und bilden gemeinsam mit dem Phosphoprotein den RNP. Die
Assoziation der RNA mit dem N-Protein schützt die RNA vor Ribonukleasen und ist
vermutlich ein wichtiger Faktor bei der Transkription (TORDO et al., 1986a).
Das Nukleoprotein induziert nur eine geringe protektive Immunreaktion. Verschiedene
Epitope, sogenannte antigenic sites, sind für das N-Protein beschrieben worden. Diese
befinden sich an den Aminosäurepositionen 313-337, 358-367, 374-383 und 410-413 (GOTO
et al., 2000; WUNNER, 1991; ERTL et al., 1991; DIETZSCHOLD et al., 1988). Die
Phosphorylierung des N-Proteins erfolgt an einer Serin-Aminosäure an Position 389
(DIETZSCHOLD et al., 1987). Das Nukleoprotein spielt beim Nachweis von Tollwutviren
mittels direkten Immunfluoreszenztests (IFT) unter Verwendung von FITC-markierten,
polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern eine wichtige Rolle (DEAN et al., 1996).
2.5.2 Das Phosphoprotein (P-Protein)
Das multifunktionelle Phosphoprotein besteht aus 297 Aminosäuren und ist als wichtiger
Kofaktor mit der viralen Polymerase (L-Protein) und dem Nukleoprotein assoziiert (CHENIK
et al., 1994). Das Virion enthält ca. 950 phosphorylierte P-Proteine. Das P-Protein hat
Bedeutung beim axonalen Transport des Virions durch Bindung an die Dynein-Light-Chain
(LC8) (JACOB et al., 2000; RAUX et al., 2000). Als Bindungsstelle der LC8 an das
Phosphoprotein wurde die Aminosäureposition 139-151 identifiziert (MEBATSION, 2001).
Die Positionen 75-90, 83-172 und 191-206 sind als weitere lineare Epitope identifiziert
worden, deren Funktion noch weitgehend unbekannt ist (RAUX et al., 1997). Das P-Protein
ist auch an der Regulation der Immunantwort infizierter Zellen beteiligt (BRZOZKA, 2006).
22
2.5.3 Das M-Protein
Das M-Protein befindet sich auf der Innenseite der Virionhülle und ist mit der
zytoplasmatischen Domäne des G-Proteins und dem RNP verbunden. Neben der Eigenschaft
als Strukturprotein hat das M-Protein auch eine Bedeutung beim Virus-Budding und der
Regulation von Transkription und Replikation (FINKE et al., 2003; MEBATSION et al.,
1999). Das M-Protein scheint auch eine Hemmung der zellulären Translation in infizierten
Zellen zu induzieren, und somit die Virusreplikation zu begünstigen (KOMAROVA et al.,
2007).
2.5.4 Das Glykoprotein (G-Protein)
Das unreife virale G-Protein besteht aus 524 Aminosäuren. Es lässt sich in vier Abschnitte
einteilen: einem Signalpeptid, bestehend aus 19 hydrophoben Aminosäuren, der Endodomäne,
einem Transmembranabschnitt und einer Ektodomäne. Nach dem Transport des G-Proteins
zum rauhen Endoplasmatischen Retikulum erfolgt die Abspaltung des Signalpeptids, so dass
das reife virale G-Protein 504 Aminosäuren besitzt. G-Protein-Trimere bilden auf der
Virionoberfläche sogenannte Spikes, welche mit Zellrezeptoren interagieren und damit die
Internalisierung des Virions in die Zelle vermitteln (COLL, 1995). Das G-Protein hat eine
große Bedeutung beim „Budding“-Prozess, bei welchem die Zellmembran beim Verlassen der
Zelle als Hülle das Virion umschliesst (MEBATSION et al., 1996a).
Innerhalb der Ektodomäne des G-Protein befinden sich zwei wichtige Epitope, die als
antigenic sites II (AS 34-42 und 198-200) und III (AS 330-338) bezeichnet werden
(PREHAUD et al., 1988; DIETZSCHOLD et al., 1983; LAFON et al., 1983). Die antigenic
site III beinhaltet die Position 333, welche einen großen Einfluss auf die Pathogenität des
Virus hat. Mutationen von Arginin zu Lysin oder Isoleucin an dieser Position führten zu einer
deutlichen Reduzierung der Pathogenität von Tollwutviren (TUFFEREAU et al., 1989;
DIETZSCHOLD et al., 1983). Innerhalb der antigenic site III liegt auch die Position 330
(Lysin), die wichtig für die Bindung des Virions an Motoneuronen ist (COULON et al.,
1998). Im Gegensatz zu anderen untersuchten Lyssaviren sind sowohl Position 333 als auch
330 bei EBLV-1 und 2 konserviert (MARSTON et al., 2007).
23
Das G-Protein ist das einzige Protein des Tollwutvirus, welches virusneutralisierende
Antikörper (VNA) induzieren kann und ist daher für die Ausbildung der Immunantwort von
essentieller Bedeutung (WIKTOR et al., 1973).
2.5.5 Der GL-nicht translatierte Bereich
Lyssaviren besitzen zwischen dem G-Protein-Gen und dem L-Protein-Gen einen
Genomabschnitt, der als GL-nicht-translatierter Bereich bezeichnet wird. Die Länge dieses
Bereiches ist je nach Genotyp variabel, bei EBLV-1 ist dieser Abschnitt 560 bp groß
(MARSTON et al., 2007). Es wurde vermutet, dass dieser Bereich ein Überbleibsel eines
Gens darstellen könnte, da Vertreter verwandter Virusfamilien, wie das Vesiculäre Stomatitis
Virus (VSV) oder das Sendai Virus, eine für ein Protein kodierende Sequenz aufweisen und
entsprechende Start- und Stopsignale nachweisbar sind. Dementsprechend wurde dieser
Bereich lange Zeit als Pseudogen ψ (psi) bezeichnet und seine Bedeutung in der Evolution
unsegmentierter negativ-Strang-RNA Viren diskutiert (TORDO et al., 1986b). Neuere
Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass dieser Abschnitt einen 3’-nicht-translatierten
Bereich darstellt (RAVKOV et al., 1995). Die Funktion dieses Bereichs könnte die
Regulierung der Expression des L-Proteins sein (MARSTON et al., 2007).
2.5.6 Das L-Protein
Die RNA-abhängige RNA-Polymerase ist mit 2142 Aminosäuren das größte virale Protein
und wird demnach L (für "large" = groß) Protein genannt. Das L-Protein bildet zusammen mit
dem Phosphoprotein einen Enzymkomplex mit mehreren Funktionen: (i) RNA-abhängige
RNA-Polymerase, (ii) Guanylyl-Transferase und (iii) Poly-A-Synthetase (CHENIK et al.,
1998; CONZELMANN, 1998).
Das L-Protein ist mit ca. 25 Molekülen pro Virion das Protein mit der geringsten Häufigkeit.
Im Gegensatz dazu sind 1800 N-Protein-Moleküle im Virion vorhanden (WUNNER et al.,
1988).
24
2.6 Molekulare Differenzierung von Lyssaviren
2.6.1 Typisierung anhand antigener Eigenschaften
Die erste Differenzierung der Lyssaviren von anderen Rhabdoviren gelang mithilfe
serologischer Methoden wie dem Serumneutralisationstest, der Komplementbindungsreaktion
oder dem Hämagglutinationshemmtest. Innerhalb der Lyssaviren konnten
Kreuzneutralisationsversuche mit Versuchstieren die zuvor beobachteten Antigen-
Unterschiede grundsätzlich bestätigen. Die Untersuchungen mit polyklonalen Seren trugen
zur Unterscheidung von Tollwutvirus (RABV) und 5 Tollwut-ähnlichen Viren, Mokola-
Virus, Lagos-Bat-Virus, Duvenhage-Virus, Obodhiang-Virus und Kotonkan-Virus bei
(RUPPRECHT et al., 1991; KING und CRICK, 1988). Die beiden aus Insekten isolierten
Rhabdoviren, Obodhiang-Virus und Kotonkan-Virus, zeigten dabei Reaktionsmuster, die auf
eher entfernte Verwandtschaftsverhältnisse schließen ließen. Jüngste Untersuchungen
klassifizieren beide Viren als Mitglieder des Genus Ephemerovirus innerhalb der Familie
Rhabdoviridae (KUZMIN et al., 2006). Die Entwicklung monoklonaler Antikörper (mAK)
revolutionierte die Typisierung von Virusvarianten. Der Einsatz von mAK, die gegen das
Nukleokapsid oder gegen das Glykoprotein des Tollwutvirus gerichtet sind, führte zu einer
feineren Differenzierung, sowohl innerhalb der RABV (Sero-, Genotyp 1) als auch zwischen
den einzelnen Serotypen (siehe Tabelle 2-1).
2.6.2 Differenzierung basierend auf genetischen Eigenschaften
Die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction PCR) ermöglichte erstmals den
diagnostischen Nachweis von Tollwutvirus-spezifischer RNA und damit weitergehende
genetische Untersuchungen. Neben genotypspezifischen RT-PCR-Protokollen
(MARKOTTER et al., 2006a; EAST et al., 2001) wurden auch Pan-Lyssavirus PCR-
Protokolle entwickelt. Hierbei erfolgt die grobe Differenzierung der jeweiligen GT in einem
zweiten Amplifikationsschritt mit GT-spezifischeren Primern (HEATON et al., 1997). Eine
endgültige Klassifizierung nach diesem Schema ist jedoch nur über eine Southern-
25
Hybridisierung bzw. mithilfe eines PCR-ELISA möglich (BLACK et al., 2000). Die RT-PCR
kann auch zum Nachweis und zur Bestimmung von Tollwut-Varianten innerhalb eines
Genotyps genutzt werden (ITO et al., 2003; NADIN-DAVIS et al., 1996). Die
Weiterentwicklung der PCR zur realtime RT-PCR für Tollwut schaffte die Voraussetzung
zum schnellen, sensitiven und spezifischen Nachweis von Tollwutvirusgenom. Die realtime
RT-PCR wird vor allem als Bestätigungstest bei IFT fraglichen bzw. negativen Ergebnissen
mit Personenkontakt in der Tollwutdiagnostik eingesetzt. Dabei werden die zum Nachweis
der Spezifität eingesetzten Sonden genutzt, um zwischen einzelnen Genotypen zu
unterscheiden (WAKELEY et al., 2005). Eine weitere Möglichkeit ist, diese Sonden so zu
entwickeln, dass sie innerhalb eines GTs Virusvarianten selektiv erkennen, wie dies
beispielsweise für PRRSV-Stämme beschrieben ist (KLEIBOEKER et al., 2005). Der Einsatz
von markierten Sonden, die spezifisch für Virusvarianten sind, kann auch bei der in-situ-
Hybridisierung zur Differenzierung von Tollwutviren genutzt werden (NADIN-DAVIS et al.,
2003). Die Untersuchung von Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen (RFLP) ist
eine weitere Möglichkeit zur Differenzierung von Tollwutviren. Hirzu wird ein Teil des
RNA-Genoms mittles RT-PCR amplifiziert und mit Restriktionsenzym behandelt.
Sequenzunterschiede führen zu unterschiedlichen Schnittmustern. Diese Technik wird zur
Unterscheidung von Feld- und Impfvirusstämmen herangezogen. Bei epidemiologischen
Untersuchungen zur Tollwut dient die RFLP meist als Grobeinteilung für im Feld
vorkommende RABV-Varianten und wird häufig durch Typisierung mittels mAk oder
Sequenzanalysen untermauert (SCHAEFER et al., 2005; ITO et al., 2001).
Die gebräuchlichste Methode für molekulare Charakterisierungen bei Lyssaviren ist die
Sequenzanalyse (WU et al., 2007). Die molekulare Typisierung und der phylogenetische
Vergleich von Sequenzdaten sind wichtige Hilfsmittel für die Tollwutüberwachung,
Epidemiologie, Risikoanalyse und Pathogenese (BROOKES et al., 2004). Sequenzanalysen
des N-Gens bildeten zudem die Grundlage für die Einteilung der Lyssaviren in die derzeit
bekannten Genotypen (KISSI et al., 1995; BOURHY et al., 1993).
26
Tabelle 2-1: Genotypübergreifende phylogenetische Studien
Genotypen Genabschnitt Autor
1, 4, 5-6 N BOURHY et al., 1992
1-6 G TORDO et al., 1993
1-6 N BOURHY et al., 1993
1-6 N KISSI et al., 2001
1-7 G BADRANE et al., 2001
1-7 N, G JOHNSON et al., 2002
1-7 P NADIN-DAVIS et al 2003
1-7 G GYATT et al., 2003
1-7 N, GOULD et al., 2002
1-7 (9) N, P, G KUZMIN et al., 2005
1-7 (11) N, P, G KUZMIN et al., 2003
1-7 L BOURHY et al., 2005*
1-7 (11) N, P, G WU et al., 2007
* Das L-Gen verschiedener Rhabdoviren wurden vergleichend untersucht
Es wurde postuliert, dass aufgrund der funktionellen Verbindung der einzelnen Proteine auch
die Gene bei Lyssaviren nicht unabhängig voneinander evolvieren und folglich alle Gene für
phylogenetische Untersuchungen geeignet seien (WU et al., 2007). Sequenzanalysen
verschiedener Gene von Lyssaviren ergaben dabei vergleichbare phylogenetische Bäume. So
können zur Differenzierung zwischen Genotypen auch kurze Genabschnitte des N-Gens oder
des G-Gens eingesetzt werden (JOHNSON et al., 2002). Beispielsweise wurden für ihre
Untersuchungen zur evolutionären Entwicklung der Lyssaviren in Bezug zur Tollwut bei
terrestrischen Karnivoren und Fledermäusen Sequenzen verwendet, welche für die
Ektodomäne des G-Proteins kodieren (BADRANE et al., 2001). Eine Zusammenfassung
relevanter genoptyp-übergreifender Untersuchungen, bei denen das N-, P-, G- oder auch L-
Gen für Sequenzanalysen verwendet wurden, findet sich in Tabelle 2-2.
Bislang wird jedoch für molekularepidemiologische und phylogenetische Untersuchungen
vorwiegend das N-Gen verwendet. Es scheint aufgrund seines hohen Konservierungsgrades
27
dafür besonders geeignet. und sollte daher als verbindliches Einteilungskriterium von
Tollwutviren in Lyssavirus-Genotypen genutzt werden (KUZMIN et al., 2005). Ein effektives
Verfahren zur Charakterisierung von Tollwutviren bekannter Lyssavirusgenotypen basiert auf
der Amplifizierung und anschließenden direkten Sequenzierung eines 600 bp langen
Genomabschnittes im N-Gen (HEATON et al., 1997). Ein wichtiger Vorteil in der
Verwendung des N-Gens liegt in der Verfügbarkeit bereits vorhandener Sequenzen in
internationalen Gendatenbanken (GenBank, EMBL), die somit umfassende vergleichende
phylogenetische Untersuchungen möglich machen (BROOKES et al., 2004). Zudem können
die erzielten Ergebnisse direkt mit denen aus Studien zur Typisierung bzw. Differenzierung
von Lyssaviren mittels anti-Nukleokapsid-mAK in Beziehung gebracht und verglichen
werden. Die GL-nicht-kodierende Region gilt als sehr variabel (BADRANE et al., 2001;
TORDO et al., 1993; SACRAMENTO et al., 1991). Da dieser Bereich keinem starken
Selektionsdruck unterliegt, kann es hier gehäuft zur Akkumulation von Mutationen kommen.
Diese Veränderungen der Sequenzen im GL-Bereich können jedoch zur Differenzierung von
jüngeren phylogenetischen Gruppen genutzt werden (COETZEE und NEL, 2007; NEL et al.,
2005; SABETA et al., 2003).
2.6.3 Grundlagen phylogenetischer Analysen
Phylogenetische Analysen, die auf molekularen Daten beruhen, sind häufig ein wichtiger
Bestandteil von epidemiologischen Studien. Solche Analysen können beispielsweise dazu
dienen, Hypothesen über den Ursprung und Verlauf eines Seuchenausbruchs zu generieren,
die Klassifizierung von Spezies oder Genotypen zu ermöglichen oder den evolutionären
Ursprung von einzelnen Gruppen zu erklären. Sequenzdaten (Nukleotidsequenzen,
Aminosäuresequenzen) sind mittlerweile die am weitesten verbreitete Datengrundlage für die
phylogenetische Analyse. Dies ist in der wachsenden Automatisierung der Sequenzierung und
in der zunehmenden Rechenkapazität moderner Computer begründet.
Die zu vergleichenden Datensätze müssen zunächst in einer Form vorliegen, die eine Analyse
möglich macht. Anschließend kann ein Sequenzvergleich (Alignment) erfolgen.
Zur phylogenetischen Analyse der Sequenzdaten und Darstellung als Dendogramm (Baum)
können verschiedene Methoden angewendet werden, die nach SWOFFORD (1996) in zwei
28
grundsätzliche Herangehensweisen unterschieden werden: (i) einem definierten Algorithmus
folgend wird der Baum erstellt und (ii) nach definierten Kriterien werden alle möglichen
Bäume verglichen und bewertet. Die Distanz-Matrix-Methoden, wie UPGMA (Unweight
Pair-Group Method with Arithmetic Means) und die Neighbor-Joining-Methode (NJ),
gehören zur ersten Gruppe. Bei der UPGMA-Methode wird eine Cluster-Analyse der
Abstandsmatrix durchgeführt. Bei jedem Schritt werden die OTUs (operational taxonomic
units – Ausdruck für die eingegebenen Organismen, deren Eigenschaften verglichen werden)
mit den geringsten Abständen einer höheren Ebene zugeordnet, wobei die Distanz zwischen
zwei Clustern der Mittelwert der paarweisen Distanzen aller Objekte in beiden Clustern ist.
Im Gegensatz zum UPGMA-Verfahren geht der NJ-Algorithmus von einem sternförmigen
Baum ohne Hierarchie aus. Basierend auf einer Distanz-Matrix werden Nachbarn mit der
geringsten Distanz zu einem Knoten, also einem hypothetischen Vorläufer der OTUs,
verbunden. Iterativ wird die Distanz-Matrix neu berechnet und ein ungewurzelter, additiver
Baum konstruiert (SAITOU und NEI, 1987). Zu den charakterbasierten Methoden gehören
die Maximum Parsimony und die Maximum Likelyhood Algorithmen.
Wichtiger Bestandteil von phylogenetischen Analysen ist die statistische Absicherung der
Ergebnisse. Das am häufigsten zur Anwendung kommende Verfahren ist das Bootstrapping,
eine statistische Methode, die in die phylogenetische Analyse integriert wurde
(FELSENSTEIN, 1985). Durch das zufällige Kopieren und Ersetzten einzelner Datenbereiche
bei gleichzeitiger Konstanz der Gesamtdatenmenge wird aus dem Ausgangsdatensatz eine
Vielzahl neuer Datensätze generiert. Alle neuen Datensätze werden in die phylogenetische
Analyse integriert, die phylogenetischen Bäume miteinander verglichen und ein Konsensus-
Baum erstellt. Der Bootstrap-Wert gibt die Wahrscheinlichkeit an, mit welcher die Annahme
erfüllt wird, dass die im Konsensus-Baum gefundene Verzweigung auch bei den einzelnen
OTUs wiederzufinden ist.
Zur Auswertung von Sequenzdaten stehen verschiedene kommerziell erhältliche oder frei
verfügbare Software-Programme zur Verfügung. Die große Zahl der Programme kann unter
http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/software.html eingesehen werden.
29
2.7 Fledermaustollwut
Die Ordnung Chiroptera stellen mit mehr als 800 Arten die zweitgrößte Gruppe der
Säugetiere auf der Erde. Die Vertreter dieser Ordnung lassen sich morphologisch in die
Unterordnungen Megachiroptera (Flughunde) und Microchiroptera (Fledermäuse) einteilen.
Als sehr alte Säugetierordnung haben sich die Chiroptera fast jede ökologische Nische
erschlossen und kommen, mit Ausnahme der Antarktis, auf allen Kontinenten vor (KING et
al., 2004).
Neuere Untersuchungen zeigen, dass auch eine Einteilung der Chiroptera anhand des
Vorhandenseins von Echoortung in Yinchiroptera und Yangchiroptera möglich ist (TEELING
et al., 2005). Bei der Verwendung des Begriffes Fledermaustollwut wird im Weiteren nicht
zwischen Unterordnungen differenziert.
2.7.1 Amerika
Der amerikanische Kontinent ist die einzige Region auf der Welt, wo Fledermaustollwut
durch das RABV (GT1) hervorgerufen wird. Neben Fledermäusen als Reservoir zirkuliert das
RABV in karni- bzw. omnivoren Säugetierspezies, wie zum Beispiel Waschbären,
Polarfüchsen, Graufüchsen, Koyoten und Stinktieren sowie in verwilderten und streunenden
Hunden in Mittel- und Südamerika (BRASS, 1994). Amerika ist der einzige Kontinent der
Welt, auf dem mit RABV nur ein Lyssavirus GT vorkommt (CLIQUET und PICARD-
MEYER, 2004).
Die ersten Fälle von Fledermaustollwut wurden 1930 in der Karibik beschrieben. Es wurde
gezeigt, dass blutleckende (hämatophage) Fledermäuse, sogenannte Vampirfledermäuse der
Gattung Desmodus, an Ausbrüchen von Tollwut bei Rindern und beim Menschen beteiligt
waren (BRASS, 1994). Schätzungsweise bis zu 500.000 Weiderinder fallen in Mittel- und
Südamerika jährlich der Fledermaustollwut zum Opfer (MCCOLL et al., 2000). Darüber
hinaus sind bis Mitte der 1990er Jahre mehr als 500 Fälle von Tollwutübertragung auf
Menschen durch Fledermäuse aus Lateinamerika bekannt geworden (BRASS, 1994).
30
Im Jahr 1954 wurde in Florida, USA, erstmals Tollwut bei einer fruchtfleischfressenden
Fledermaus nachgewiesen. In den darauf folgenden Jahren wurde bei nahezu allen auf dem
nordamerikanischen Kontinent beheimateten Fledermausspezies (n = 38) Tollwut
diagnostiziert. Im Jahr 2006 wurden allein in den USA 1692 Tollwutfälle bei einheimischen
Fledermäusen gemeldet. Damit sind Fledermäuse diejenige Spezies in den Vereinigten
Staaten, die nach den Waschbären am häufigsten tollwutpositiv getestet wird (BLANTON et
al., 2007). Fledermaustollwutvarianten sind mittlerweile die häufigste Ursache für humane
Todesfälle in den USA, wobei im Einzelfall nicht immer ein direkter Kontakt zu infizierten
Fledermäusen nachgewiesen werden konnte (MESSENGER et al., 2002).
Phylogenetische Untersuchungen zur Fledermaustollwut auf dem amerikanischen Kontinent
konnten belegen, dass sich die RABV-Varianten bei Fledermäusen von denen terrestrischer
Säugetiere deutlich unterscheiden (DAVIS et al., 2006). Auch innerhalb der amerikanischen
Fledermauspopulationen werden Virusvarianten unterschieden. Diese Varianten scheinen mit
bestimmen Fledermausspezies assoziiert zu sein (NADIN-DAVIS et al., 2001). Mitunter
kommt es aber auch zu Nachweisen einzelner Fledermaus-spezifischer RABV-Varianten bei
anderen Tierarten (LESLIE et al., 2006). Diese als spill-over bezeichnete Virusübertragung
von Reservoirtieren zu anderen empfänglichen Tieren oder dem Menschen ist bei der durch
RABV verursachten Fledermaustollwut häufig. In den meisten Fällen führt eine spill over-
Infektion zu einer Sackgasse im Infektionszyklus. In Arizona, USA, konnten jedoch jüngst
bei Stinktieren über einen gewissen Zeitraum wiederholt Fledermaustollwut-Varianten in
einem eng begrenzten Gebiet nachgewiesen werden, die einen etablierten Speziesübergang
(sustained spill over) vermuten lassen (LESLIE et al., 2006; SMITH et al., 2001). Es wird
angenommen, dass ein historischer spill-over vor Tausenden von Jahren zum Übergang von
Fledermaustollwut auf terrestrische Reservoirspezies führte. Diese Überschreitung der
Artbarriere war der entscheidende Ausgangspunkt für die Entwicklung der klassischen Form
der Tollwut (BADRANE und TORDO, 2001).
2.7.2 Afrika
Der afrikanische Kontinent ist neben Asien von der klassischen Tollwut (RABV) am stärksten
betroffen. Zusätzlich zu RABV wurden in Afrika drei weitere Lyssavirusgenotypen
31
nachgewiesen - Lagos Bat Virus (LBV, GT 2), Mokola Virus (MOKV, GT3) und Duvenhage
Virus (DUVV, GT 4).
Eine Assoziation der Fledermaustollwut in Afrika ist bisher nur für LBV und DUVV
eindeutig belegt. Im Jahre 1954 wurde nach dem Bekanntwerden von Tollwut in insektivoren
Fledermäusen ein Virus aus einem Flughund (Eidolon spp.) aus Lagos, Nigeria, isoliert. Erst
1970 gelang die Charakterisierung als Rhabdovirus; spätere Untersuchungen zeigten
Unterschiede zum klassischen Tollwutvirus. Der Fundort spiegelte sich in der heutigen
Bezeichnung des Virus wider. Weitere Nachweise von LBV gab es in Zimbabwe, Kenia,
Senegal, Guinea, Ägypten, Äthiopien und Südafrika. Die Mehrzahl aller Isolate stammt aus
Fledermäusen; Spill-over-Infektionen wurden bei Katzen, Hunden und einer Manguste (Atilax
paludinosus) nachgewiesen (MARKOTTER et al., 2006a; MARKOTTER et al., 2006b;
BRASS, 1994). Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass LBV-Isolate eine sehr hohe
intragenotypische Variabilität besitzen. Würden die von KUZMIN et al. (2005)
vorgeschlagenen Kriterien zur Einteilung von Lyssavirusgenotypen berücksichtigt, müssten
einige Vertreter der LBV in einem neuen Genotyp zusammengefasst werden (MARKOTTER,
2007). Eine Entscheidung darüber steht noch aus.
Das zweite Fledermaus-assoziierte Lyssavirus wurde 1970 in Südafrika aus einem Menschen
isoliert, nachdem dieser von einer insektivoren Fledermaus gebissen worden war und an den
Folgen der tollwutähnlichen Infektion verstarb. Das isolierte Lyssavirus wurde als
Duvenhage-Typ bezeichnet. Das später als GT 4 klassifizierte Virus ist auch aus insektivoren
Fledermäusen in Zimbabwe und Südafrika isoliert worden und verursachte weitere Todesfälle
bei Menschen in Südafrika (PAWESKA et al., 2006) und bei einem Menschen in den
Niederlanden, nachdem er sich in Kenia infiziert hatte (VAN THIEL et al., 2008). Der einzige
Genotyp, dessen Assoziation zu Fledermäusen bisher nicht belegt wurde, ist das MOKV (GT
3). Es wurde bislang nur bei terrestrischen Tierarten in Afrika nachgewiesen (SABETA et al.,
2007). Da Fledermäuse Reservoir und Vektor für 6 der bislang 7 bekannten Genotypen sind,
liegt jedoch die Vermutung nahe, dass das Virusreservoir für MOKV ebenfalls Fledermäuse
sein könnten.
Lange wurde über ein Vorkommen von EBLV-1 auf dem afrikanischen Kontinent spekuliert.
Bisher ist das Virus dort nicht nachgewiesen worden; die Existenz ist angesichts der
Verbreitung der im Süden Spaniens EBLV-positiv getesteten Fledermäusspezies Eptesicus
32
serotinus isabellinus bis nach Nordafrika jedoch wahrscheinlich (VÁZQUEZ-MORÓN et al.,
2008). Auch kann das Vorkommen der in Zentralasien isolierten vorläufigen Genotypen
WCBV, ARAV und KHUV in Afrika nicht ausgeschlossen werden, da sich das
Verbreitungsgebiet der betroffenen Fledermausspezies auch über Teile des Mittelmeerraumes
erstreckt.
2.7.3 Australien und Asien
Lange Zeit galt Australien als tollwutfrei, bis 1996 im Rahmen der Surveillance von Hendra-
Virus in Flughunden ein Lyssavirus isoliert wurde, das nachfolgend als Australian bat
lyssavirus (ABLV) bezeichnet und als neuer Genotyp 7 klassifiziert wurde (GOULD et al.,
1998). Zudem konnten zwei humane Tollwutfälle aus demselben Jahr auf Infektionen mit
ABLV durch Kontakt zu Fledermäusen zurückgeführt werden. Seit dem ist ABLV aus
verschiedenen Flughundarten (Pteropus alecto, P. poliocephalus, P. scapulatus und P.
conspicillatus) und aus der frugivoren Fledermausart Saccolaimus flaviventris isoliert worden.
Phylogenetische Analysen zeigten, dass innerhalb der beiden Gruppen von endemisch
infizierten Fledermausspezies jeweils spezifische ABLV-Varianten unterschieden werden
können (GUYATT et al., 2003). Man vermutet, dass ABLV auch außerhalb Australiens
vorkommen könnte; Nachweise wurden bislang nicht erbracht. Serumproben aus
Fledermäusen auf den Phillipinen und Thailand konnten ABLV neutralisieren
(LUMLERTDACHA et al., 2005; ARGUIN et al., 2002). Allerdings können Seren auch
kreuzreaktive Eigenschaften gegenüber anderen Lyssavirus-GTs aufweisen.
Über das Vorkommen von Fledermaustollwut in Asien ist wenig bekannt. Es gibt einzelne
Fallberichte aus der Türkei, Indien und Thailand aus den vergangenen Jahrzehnten, jedoch
fehlen entscheidende Hintergrundinformationen (BRASS, 1994). Nach Angaben chinesischer
Wissenschaftler gibt es Hinweise auf die Zirkulation von RABV-Varianten in Fledermäusen
in China mit einem berichteten Todesfall (TANG et al., 2005). Diese Darstellung ist unter
Berücksichtigung des bislang bekannten geographischen Vorkommens von
Lyssavirusgenotpen bei Fledermäusen in der Fachwelt allerdings umstritten.
1991 und 2001 konnten in den zentralasiatischen Staaten Kirgisien und Tadschikistan zwei
Lyssaviren aus Fledermäusen isoliert werden, die als Aravan-Virus (ARV) und Khujand-
33
Virus (KHUV) bezeichnet wurden (KUZMIN et al., 2003). Im Jahr 2002 gelang die
Isolierung des Irkutsk-Virus (IRKV) aus Fledermäusen in Westsibirien, sowie des West
Caucasian bat virus (WCBV) aus der Spezies Minopterus schreibersii in der Kaukasusregion
(BOTVINKIN et al., 2003a). Weitere Nachweise dieser Lyssaviren sind bislang nicht erfolgt,
doch ergaben serologische Untersuchungen Hinweise auf eine weitreichende Zirkulation
dieser oder anderer genetisch verwandter Lyssaviren in Fledermäusen Asiens
(LUMLERTDACHA et al., 2005). Alle vier Lyssavirusisolate sind aufgrund ihrer genetischen
Eigenschaften vorläufige Genotypen, wobei das WCBV als das genetisch am weitesten
entfernt verwandte Virus im Genus Lyssavirus gilt und auch keiner der beiden Phylogruppen
zuzuordnen ist (vgl. Abschnitt 2.1). Der Umstand, dass es sich bei den Vertretern der
asiatischen Lyssaviren bislang nur um Einzelnachweise handelt, erschwert die Einordnung in
eigenständige Genotypen.
2.7.4 Europa
Im Jahr 1954 wurde in Hamburg der erste Fall einer Tollwutinfektion bei Fledermäusen in
Deutschland festgestellt (MOHR, 1957). Dies war auch der Erstnachweis von
Fledermaustollwut in Europa überhaupt. In den nachfolgenden Jahrzehnten ist in weiteren
Ländern Europas Tollwut bei Fledermäusen nachgewiesen worden (Tabelle 2-2).
Zwischen 1977 und 2006 wurden insgesamt 826 Fälle von Fledermaustollwut an das WHO
Collaborating Centre for Rabies Surveillance and Research, am Friedrich-Loeffler-Institut
(FLI) Wusterhausen berichtet (Abbildung 2-4). Die Mehrzahl der Fälle wurde aus den
Niederlanden (283), aus Dänemark (222) und Deutschland (192) gemeldet. Aber auch in
Polen, Frankreich und Spanien sind gehäuft Fledermaustollwutfälle nachgewiesen worden.
34
Tabelle 2-2: Erstnachweis von Fledermaustollwut in den verschiedenen europäischen Ländern, modifiziert nach KING et al., 2004
Jahr Land Spezies Bemerkung
1954 Deutschland (BRD) ?
1956 Jugoslawien Nyctalus noctula
1957 Türkei Rhinolophus ferrumequinum
1964 Ukraine Eptesicus serotinus
1969 Griechenland ?
1972 Polen Eptesicus serotinus
1984 Niederlande ? Pers. Mitt. B.KOOI
1985 UdSSR Human
1985 Finnland (Schweiz) Human EBLV-2
1985 Dänemark Eptesicus serotinus
1987 Spanien ?
1989 Frankreich Eptesicus serotinus
1989 Tschechoslovakei ?
1992 Schweiz Myotis daubentoni EBLV-2
1996 Vereinigtes Königreich Myotis daubentoni EBLV-2
1998 Slovakei ?
1999 Ungarn Eptesicus serotinus
Da die Zahl von Fledermäusen, die auf Tollwut untersucht wurden, zwischen den einzelnen
Ländern Europas stark schwankt, ist davon auszugehen, dass die Fledermaustollwut in ganz
Europa verbreitet ist. Wie BOURHY (1992) anhand von Restriktionsanalysen und
Sequenzvergleichen des N-Gens zeigte, konnten die beiden anfänglich als Biotypen
35
vermuteten Virusvarianten EBLV-1 und EBLV-2 genetisch deutlich voneinander
unterschieden und als weitere Genotypen identifiziert werden. Diese Ergebnisse wurden von
nachfolgenden Untersuchungen bestätigt (AMENGUAL et al., 1997).
Abbildung 2-4: Darstellung der Fledermaustollwutfälle in Europa zwischen 1977 und 2006 anhand der berichteten Fälle (Quelle: WHO Collaborating Centre for Rabies Surveillance and Research, FLI, Wusterhausen)
Die überwältigende Mehrheit der diagnostizierten Fledermaustollwutfälle in Europa waren
auf EBLV-1 zurückzuführen, lediglich 14 sind bislang als EBLV-2 charakterisiert worden.
Während die Breitflügelfledermaus (Eptesicus serotinus) das Reservoir für EBLV-1 zu sein
scheint (BOURHY et al., 1992), ist EBLV-2 bisher nur aus Fledermäusen des Genus Myotis
(Myotis daubentonii und Myotis dasycneme) in den Niederlanden, der Schweiz und dem
Vereinigten Königreich isoliert worden (VOS et al., 2007a; HARRIS et al., 2007; FOOKS et
al., 2003c). Weitere Hinweise auf die Zirkulation von EBLV-1 in europäischen
Fledermauspopulationen lieferten Untersuchungen aus Spanien (AMENGUAL et al., 2007;
36
SERRA-COBO et al., 2002; PEREZ-JORDA et al., 1995; VÁZQUEZ-MORÓN et al., 2008)
und dem Vereinigten Königreich (HARRIS et al., 2006). Interessanterweise konnte 1999 bei
einem Nilflughund (Rousettus aegyptiacus) aus dem Rotterdamer Zoo, der nach Dänemark
verbracht wurde, nach dem Verenden des Tieres EBLV-1a isoliert werden. Die Umstände,
unter denen es zu der Infektion mit dieser Virusvariante kam, konnten nicht geklärt werden
(VAN DER POEL et al., 2000).
In Deutschland gab es zwischen 1954 und 1985 nur vereinzelte Nachweise von
Fledermaustollwut (Tabelle 2-3). Zumeist handelte es sich um verhaltensauffällige
Fledermäuse mit Bisskontakt zu Menschen, welche nachfolgend positiv getestet wurden
(SCHNEIDER, 1982; HENTSCHKE und HELLMANN, 1975; WERSCHING und
SCHNEIDER, 1969; PITZSCHKE, 1965). Zu dieser Zeit konnten die verursachenden
Virusvarianten noch nicht von dem klassischen RABV unterschieden werden. Um daher die
Bedeutung der Fledermaustollwut für die Tollwutsituation in Deutschland abschätzen zu
können, wurden Mitte der 1950er Jahre von DENNIG (1958) umfangreichere
Untersuchungen durchgeführt, bei denen Seren von 295 Fledermäusen verschiedener Spezies
auf das Vorkommen neutralisierender Antikörper und 92 Fledermausgehirnsuspensionen im
Mausinokulationstest auf Tollwut getestet wurden. Weder Virus noch Antikörper konnten mit
Sicherheit nachgewiesen werden. Auch PITZSCHKE (1965) untersuchte 35 Fledermäuse mit
negativem Ergebnis. Eine positiv getestete Breitflügelfledermaus wurde von ihm als
Zufallsbefund betrachtet. Um nähere Informationen zur Fledermaustollwut zu erlangen,
wurden Infektionsversuche initiiert. Damit sollte die Empfänglichkeit einheimischer
Fledermäuse gegenüber Infektionen mit dem klassischen RABV untersucht werden
(SCHINDLER und DENNIG, 1958). Eine erste Charakterisierung von einem
Fledermaustollwutvirusisolat lieferten WERSCHING und SCHNEIDER (1969), die
Infektionsversuche mit einem aus einer Breitflügelfledermaus isolierten Virus durchführten,
und Unterschiede in der Pathogenität zu dem klassischen Tollwutvirus nachweisen konnten.
Sie gingen allerdings noch von der Fledermaus als Endglied der Infektionskette aus.
37
Tabelle 2-3: Auflistung der berichteten Fledermaustollwutfälle in Deutschland (BRD u. DDR) von 1954 bis 1985
Jahr Ort Spezies Referenz
1954 Hamburg ? MOHR (1957)
1963 Jena E. Serotinus PITZSCHKE (1964)
1968 Hamburg ? WERSCHING und SCHNEIDER (1969)
1970 Stade ? SCHNEIDER (1982)
1973 Berlin Myotis myotis HENTSCHKE und HELLMANN (1974)
Erst nach dem Auftreten von Fledermaustollwut 1985 im benachbarten Dänemark und einer
von der WHO und dem grünen Kreuz initiierten Tagung in Marburg zum Thema
Fledermaustollwut wurden vermehrt Fledermäuse zur Untersuchung an die zuständigen
Veterinäruntersuchungsämter eingesandt. Während 1985 Fledermaustollwut bei 3
Breitflügelfledermäusen in Norddeutschland festgestellt wurde, erhöhte sich diese Zahl auf 17
im Folgejahr. Niedersachsen initiierte als erstes Bundesland bereits 1986 eine systematische
Untersuchung zur Fledermaustollwut unter Leitung des Tierseuchenbekämpfungsdienstes und
der Fachbehörde für Naturschutz. Von 376 untersuchten Tieren aus den Fundjahren zwischen
1979 und 1989 waren 19 im Immunfluoreszenztest positiv (POTT-DÖRFER, 1991;
SEIDLER et al., 1987).
Von 1954 bis 2007 wurden in Deutschland innerhalb der Tollwutroutineuntersuchungen mehr
als 900 Fledermäuse untersucht. Die Mehrzahl der Einsendungen stammte aus den
Bundesländern Niedersachsen, Sachsen, Schleswig-Holstein, Brandenburg, Mecklenburg-
Vorpommern und Berlin. In den übrigen Bundesländern wurden im gleichen Zeitraum jeweils
weniger als 50, in einigen Bundesländern sogar weniger als 20 Fledermäuse untersucht
(MÜLLER et al., 2007).
Das Vorkommen von Fledermaustollwut in Deutschland ist hauptsächlich auf den Norden des
Landes beschränkt (Abbildung 3-1). Die meisten Fälle wurden in Niedersachsen, Schleswig-
Holstein und Berlin festgestellt. Im Nordwesten, insbesondere in Niedersachsen, ist ein
signifikant höheres Vorkommen von Feldermaustollwutfällen gegenüber anderen Regionen
38
Deutschlands zu verzeichnen, welche auf ein Endemiegebiet für Fledermaustollwut des Typs
EBLV-1 hinweisen. Vermutlich gibt es dort Bedingungen, welche die Persistenz von EBLV-1
in der Fledermauspopulation begünstigen, wie beispielsweise eine erhöhte Populationsdichte
der Reservoirspezies, der Breitflügelfledermaus (MÜLLER et al., 2007). Zwar kommt diese
Spezies in ganz Deutschland vor, der Verbreitungsschwerpunkt liegt aber im Norddeutschen
Tiefland (PETERSEN et al., 2004).
Mit mehr als 90 % aller Fledermaustollwutfälle, bei denen die Fledermausspezies bestimmt
wurde, ist die Breitflügelfledermaus die am häufigsten betroffene Art in Deutschland. Weitere
Nachweise von EBLV mittels direktem IFT erfolgten in Deutschland bei Myotis myotis,
Myotis daubentoni, Pipistrellus pipistrellus, Nyctalus noctula, Pipistrellus nathusii und
Plecotus auritus. Mittels der sensitiveren molekularbiologischen Nachweismethoden konnte
EBLV-Genom bei Myotis nattereri, Miniopterus schreibersii, Rhinolophus ferrumequinum
und Barbastella barbastellus nachgewiesen werden (MÜLLER et al., 2007).
2.7.5 Charakterisierung und molekulare Epidemiologie von EBLV
Fledermaustollwutviren aus Europa wurden ursprünglich als „Duvenhage–like“ eingestuft und
dem Serotyp 4 (Duvenhage, DUVV) zugeordnet, da sie bei der Antigentypisierung ein
ähnliches Reaktionsmuster zeigten (SCHNEIDER, 1982). Im Zuge weiterer diagnostischer
Untersuchungen wurden Hinweise auf Unterschiede zwischen Fledermaustollwutisolaten aus
Eptesicus serotinus und denen aus Myotis ssp. gefunden (KING et al., 2004). Spätere Studien
konnten dann mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern zeigen, dass sich die in Europa von
Fledermäusen isolierten Lyssaviren und ein nicht-klassifizierter humaner Tollwut-Fall aus
Finnland in zwei separate Antigenprofile einteilen ließen (MONTAÑO-HIROSE et al., 1990;
KING et al., 1990).
Die erste umfassendere molekulare Charakterisierung von EBLV beinhaltete die Typisierung
von neun EBLV-1 und zwei EBLV-2-Isolaten mittels RFLP, sowie deren Typisierung mit
mAk und Sequenzvergleichen des N-Gens (BOURHY et al., 1992). In dieser Studie konnten
frühere Ergebnisse, wonach Fledermaustollwutvirusisolate aus Deutschland, Polen und
Dänemark aufgrund unterschiedlicher Reaktionsmuster mit Anti-G-mAk in separate Gruppen
eingeteilt werden konnte (RUPPRECHT et al., 1991), nicht bestätigt werden. Sowohl mit
39
serologischen als auch mit RFLP- und Sequenzuntersuchungen konnten EBLV-1 und 2 als
eigene Genotypen charakterisiert werden (BOURHY et al., 1992).
AMENGUAL (1997) untersuchte 47 EBLV-Isolate mithilfe partieller Sequenzierung eines N-
terminalen 400 bp-Fragmentes des N-Gens, deren Ergebnisse zur Unterteilung der EBLV in
die Subtypen EBLV-1a und 1b, sowie EBLV-2a und 2b führte. Letztere Unterteilung wurde
durch umfangreichere Studien nicht bestätigt (DAVIS et al., 2005). Für EBLV-1a wurde eine
West-Ost-Verbreitung und für EBLV-1b eine Nord-Süd-Verbreitung in Europa postuliert.
Aufgrund der begrenzten Verbreitung wurde spekuliert, dass sich insbesondere EBLV-1b in
jüngerer Zeit aus Nordafrika kommend nach Europa ausgebreitet hat (AMENGUAL et al.,
1997).
Der Subtyp EBLV-1a wurde in der Ukraine, Polen, Tschechien, der Slowakei, Deutschland,
Dänemark und den Niederlanden (DAVIS et al., 2005). Während aus Spanien bisher nur
Nachweise von EBLV-1b vorliegen, wurden in Frankreich, den Niederlanden, Deutschland
und Polen beide Subtypen identifiziert (MÜLLER et al., 2007; SMRECZAK et al., 2007;
VAN DER POEL et al., 2005; PICARD-MEYER et al., 2004a, DAVIS et al., 2005).
Die Sequenzierung des kompletten Virusgenoms von EBLV-1 und 2 zeigte, dass EBLV-
Isolate im Vergleich zu RABV eine höhere Identität in den Aminosäure- und
Nukleotidsequenzen aufweisen. Im N-Gen liegt diese innerhalb des Genotyps EBLV-1
zwischen 97,8 und 100 % und bei EBLV-2 zwischen 97,3 und 98,8 % (MARSTON et al.,
2007). Vergleichende Sequenzanalysen von EBLV-Isolaten des N-Gens, G-Gens und der
nicht-kodierenden Regionen zeigten für EBLV-1 eine der geringsten Mutationsraten für
RNA-Viren (DAVIS et al., 2005). Beim Genotyp EBLV-1 unterscheiden sich die Subtypen a
und b dahingehend, dass EBLV-1b eine größere genetische Diversität aufweist als EBLV-1a.
DAVIS (2005) nutzte bei phylogeographischen Untersuchung der Fledermaustollwut in
Europa die Sequenzdaten des N-Gens, G-Gens und der genflankierenden Regionen. Die
phylogenetische Gruppierung der EBLV-Isolate war dabei konsistent, unabhängig davon,
welcher Genbereich für die Analyse verwendet wurde.
40
Tabelle 2-4: Genetische Charakterisierung von Fledermaustollwutvirusisolaten aus Europa. Mit * gekennzeichnete EBLV-1 Isolate stammen aus Deutschland
Autor Anzahl der Isolate
Gen FragmentgrößeEBLV-1 EBLV-2
BOURHY et al., 1992 9 4* 2 N 1531
AMENGUAL et al., 1997 40 13* 7 N 400
FOOKS et al., 2003 14 3* 8 N 400
JOHNSON et al., 2003 3 12 N 400
PICARD-MEYER et al., 2004 14 - - N 400
DAVIS et al., 2005 58 12* 6 N,G 1353
VAN DER POEL et al., 2005 45 - - N 396
MÜLLER et al., 2007 47 47* N, NP 331
MARSTON et al., 2007 1 1* 1 alle 11966
Aufgrund der hohen Identität von EBLV-1a-Sequenzen aus verschiedenen Regionen Europas
wurde über eine Virusübertragung über weite Distanzen für diese Variante spekuliert.
Dagegen lässt die Struktur des phylogenetischen Baumes von EBLV-1b eher auf eine
geringere Kontaktrate zwischen Fledermäusen schließen. Für beide Subtypen wurde eine
positive Korrelation zwischen geographischer und genetischer Distanz nachgewiesen (DAVIS
et al., 2005). Bei der phylogenetischen Analyse von EBLV-Sequenzen aus den Niederlanden
anhand eines 396 bp großen Fragments des N-Gens konnten verschiedene Cluster identifiziert
werden. Zwei dieser Cluster enthielten nur Isolate aus jeweils definierten geographischen
Regionen (VAN DER POEL et al., 2005).
EBLV-Isolate aus Deutschland, die von AMENGUAL (1997) und DAVIS (2005) untersucht
wurden, sind sämtlich als EBLV-1a charakterisiert worden. Die erste umfangreiche Studie zur
Epidemiologie der Fledermaustollwut in Deutschland beinhaltete auch phylogenetische
Analysen, wobei Gensequenzen einer Länge von 331 bp aus dem N-Gen und dem NP-Bereich
41
untersucht wurden (MÜLLER et al., 2007). Die große Mehrzahl der 47 sequenzierten Isolate
wurden als EBLV-1a identifiziert. Darüber hinaus konnte zum ersten Mal der Nachweis des
Subtyp EBLV-1b bei einem Isolat aus dem Saarland erbracht werden.
Die phylogenetische Analyse der partiellen N-Gen-Sequenzen mit dem Genotyp RABV als
Outgroup bestätigte frühere Aussagen, wonach innerhalb der beiden Subtypen 1a und 1b eine
geringe Variabilität zu erkennen ist (DAVIS et al., 2005), was sich in wenigen
Verzweigungen mit niedrigen Bootstrap-Werten manifestierte. Viele der Virusisolate hatten
in dem untersuchten Genabschnitt eine identische Sequenz (MÜLLER et al., 2007). Dennoch
konnten innerhalb von EBLV-1a zwei vermeintliche Cluster identifiziert werden. Während
Isolate des einen Clusters ausnahmslos aus Niedersachsen stammen, kommen Isolate des
zweiten Clusters nur in den Bundesländern Sachsen-Ahnhalt, Thüringen und Sachsen vor.
Allerdings konnte daraus der Einfluss der geographischen Herkunft auf die Phylogenie nicht
abgeleitet werden (MÜLLER et al., 2007). Neuere Sequenzanalysen im NP-Bereich von
weiteren Fledermaustolltwuvirusisolaten aus Deutschland bestätigten die Existenz von
EBLV-1b im Südwesten Deutschlands und konnten einen epidemiologische Zusammenhang
mit dem EBLV-1b-Vorkommen im benachbarten Frankreich nachweisen (JOHNSON et al.,
2007).
42
3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN
3.1 Material und Methoden
3.1.1 Material
3.1.1.1 Zellen
Zellen der Zelllinie Na 42/13 (murine Mausneuroblastomzellen, Katalognummer: 229,
Zellbank, Friedrich-Loeffler-Institut, Riems) wurden für die Anzucht und Isolierung von
EBLV eingesetzt.
3.1.1.2 Virusisolate
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Isolate von EBLV aus dem Tollwutvirusarchiv des
Nationalen Referenzlabors (NRL) für Tollwut am Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für
Epidemiologie, verwendet. Die EBLV stammten von im Immunfluoreszenztest (IFT) positiv
getestetem Probenmaterial tollwutverdächtiger Fledermäuse, die in den letzten 50 Jahren
(1954 bis 2007) in Deutschland im Rahmen der Tollwutroutinediagnostik an die zuständigen
Veterinäruntersuchungsämter der Länder eingesandt wurden. Auf Anfrage wurden das
positive Gehirnmaterial zur Bestätigung der Diagnose, zur Virusisolierung sowie zur weiteren
Identifizierung und Charakterisierung an das NRL übergeben und archiviert. Jedes Isolat ist
durch eine Labornummer eindeutig identifiziert. Darüber hinaus fanden weitere Isolate aus
retrospektiven Untersuchungen zur Fledermaustollwut der Jahre 1996-2007
Berücksichtigung, an denen sich 12 von 16 Bundesländern beteiligten (MÜLLER, 2007).
43
3.1.1.3 Sonstige Materialien
Puffer
0,5 M EDTA (pH 8,0) EDTA- Natriumsalz 186,2 g
bidest. Wasser ad 1000,0 ml
TE-Puffer 10 mM Tris pH 8,0
1mM EDTA
50x TAE-Puffer Tris 242,0 g
Essigsäure 1M 57,1 ml
0,5 M EDTA (pH 8,0) 100,0 ml
bidest. Wasser ad 1000,0 ml
5x TBE-Puffer Tris 54,0 g
Borsäure 27,5 g
0,5 M EDTA (pH 8,0) 20,0 ml
bidest. Wasser ad 1000,0 ml
APS-Lösung 10% (w/v) APS in bidest. Wasser
Orange G (Probenladepuffer) Orange G 0,125 g
Ficoll 400 15,0 g
5x TAE ad 100 ml
44
3.1.2 Methoden
3.1.2.1 Virusisolierung in der Zellkultur
Aufgrund der begrenzten Menge von Gehirnmaterial von Fledermäusen war in den meisten
Fällen eine Virusanzucht in der Zellkultur erforderlich. Für die Virusisolierung und -anzucht
diente der Rapid Tissue Culture Infection Test (RTCIT) unter Mitführung von Positiv- und
Negativkontrollen (WEBSTER und CASEY, 1996). Aus dem Gehirn IFT-positiver
Fledermäuse wurde eine 20%ige Suspension unter Verwendung von Minimum Essential
Medium (MEM) hergestellt, bei 4 °C für 30 min inkubiert, anschließend bei 600 x g für
10 min zentrifugiert und der Überstand separiert. Murine Neuroblastomazellen (Na42/13)
wurden in einer Konzentration von 2x106 Zellen/ml in Dextran-Gebrauchslösung
aufgenommen. Jeweils 0,5 ml Zellsuspension wurden mit 0,5 ml des Überstandes der
20%igen Gehirnsuspension gemischt und bei 37 °C und 3-5 % CO2 für 30 min im Brutschrank
inkubiert und dabei 2-3 Mal durchmischt. Nach Zentrifugation bei 600 x g für 10 min wurde
das Zellpellet in 10 ml Dulbeccos’s Minimum Essential Medium (DMEM, Biochrom, Berlin)
resuspendiert und anschließend 8ml in eine Gewebekulturflasche (T25) und 2 ml in 6- bzw.
24-Loch-Platten oder Petrischalen (35/10mm) ausgesät. Nach Inkubation der Virus-
Zellsuspension bei 37 °C und 3-5 % CO2-Gehalt für weitere 3-4 Tage erfolgte die Kontrolle
des Viruswachstums in den zeitgleich infizierten Petrischalen. Nach Absaugen des
Zellkulturmediums und 1x Spülung mit TW-Puffer wurden die Zellen mit 80%igem Aceton
für 30 min bei 4 oC fixiert und anschließend luftgetrocknet. Die Anfärbung von infizierten
Zellen erfolgte mit einem kommerziell erhältlichen, polyklonalen FITC-markiertem Anti-
Tollwut-Konjugat (SIFIN, Berlin) für 30 Minuten bei 37 °C in einer feuchten Kammer.
Abschließend wurden die Petrischalen zweimal mit TW-Puffer und Aqua Bidest gespült.
Die Auswertung erfolgte unter einem inversen Fluoreszensmikroskop bei ca. 300-facher
Vergrößerung unter Betrachtung des gesamten markierten Bereiches. Der Nachweis
tollwutspezifischer Fluoreszenzen in den Zellen galt als Indiz für eine erfolgreiche
Virusanzucht. Je nach EBLV-Isolat mussten die infizierten Zellkulturen solange passagiert
werden, bis mindestens 60 % der Zellen infiziert waren. Dazu wurde das Zellkulturmedium
verworfen, der Zellrasen mit 2 ml Trypsin überschichtet, für 1 min inkubiert und nachfolgend
45
wurde das Trypsin wieder abgeaugt. Die Zellen, die sich gelöst hatten, wurden in
Wachstumsmedium aufgenommen und in einem Verhältnis von 1:2 bis 1:3 erneut in
Gewebekulturflaschen bzw. Petrischalen ausgesät. Anschliessend wurde der
Zellkulturüberstand abgenommen, portioniert und bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung
gelagert.
3.1.2.2 Auswahl der Virusisolate
Zunächst wurde anhand der nationalen Tollwutdatenbank (MÜLLER et al., 1994) sowie des
Tierseuchennachrichtensystems (TSN) ein Abgleich der bestätigten Fledermaustollwutfälle in
Deutschland im Zeitraum 1954 – 2007 mit den im Virusarchiv vorhandenen EBLV-Isolaten
vorgenommen. Nach Auswertung der Daten wurden die für das Veterinärwesen zuständigen
Untersuchungsämter der Länder gebeten, weitere bzw. fehlende EBLV-Isolate aus den
Bundesländern zur Verfügung zu stellen, um eine möglichst flächendeckende geographische
Analyse zu ermöglichen. Für alle verfügbaren EBLV-Isolate wurden Angaben zur
geographischen Herkunft (Fundort), zum Funddatum oder dem Jahr der Isolierung und der
Spezies aus den Laborbüchern erhoben und gegebenenfalls mit den in den Datenbanken
vorhandenen Angaben abgeglichen.
Der Fundort der Tollwutfälle war für den Zeitraum 1954 – 1994 als Gemeinde (territorialer
Grundschlüssel) und für den Zeitraum 1994 – 2007 über die Funktionen innerhalb der
Tierseuchenmeldung für das TSN als genaue georeferenzierte Angabe oder Gemeinde
verfügbar. Mit Hilfe der GIS Software Kartenexplorer (FLI, Wusterhausen, Deutschland), die
am Institut für Epidemiologie des Friedrich-Loeffler-Institutes entwickelt wurde, erfolgte
zunächst eine kartographische Darstellung der Tollwutfälle und aller vorhandenen EBLV-
Isolate aus dem NRL Archiv. Für Fledermaustollwutfälle und EBLV-Isolate, für die nur die
Gemeinde als Fundort bekannt war, wurde jeweils ein beliebiger Punkt innerhalb der
Gemeinde für die kartographische Darstellung und weitere geographische Analysen
festgelegt.
Die Auswahl von EBLV-Isolaten für die anschließende Sequenz- und phylogentische Analyse
erfolgte unter folgenden Prämissen: die Stichprobe repräsentiert - a) die geographische
Herkunft aller verfügbaren EBLV-Isolate sowie - b) die räumliche und zeitliche
46
Tollwutsituation bei Fledermäusen im Zeitraum 1954-2007 in Deutschland. Dazu wurde mit
Hilfe des Kartenexplorers ein 30 km x 30 km großes Raster über die Fläche Deutschlands
gelegt und die Anzahl von Rasterzellen ermittelt, denen EBLV-Isolate zugeordnet werden
konnten. Aus jeder so ermittelten Rasterzelle wurde mindestens ein EBLV-Isolat ausgewählt.
In Rasterzellen, die mehr als ein EBLV-Isolat enthielten, fand eine Auswahl nach dem
Zufallsprinzip (random sampling) statt. Danach erfolgte eine weitere selektive Auswahl, um
die zeitliche Komponente (Zeitraum 1954 - 2007) zu berücksichtigen.
3.1.2.3 Isolation von Virus RNA
Zur Extraktion von Virus-RNA wurde der kommerziell erhältliche RNA-Extraktionskit
RNeasy© (Qiagen, Hilden, Deutschland) entsprechend den Instruktionen des Herstellers
verwendet. Silikat-Gel-Membranen in Säulen bilden dabei eine RNA-bindende Matrix. Je
nach Verfügbarkeit wurden entweder 200 µl Zellkulturüberstand oder 30 mg
Gehirnsuspension mit 350 µl Lösungspuffer RLT versetzt und gemischt. Nach Fällung der
RNA durch Zugabe von 1 Volumen 70%igen Ethanols wurde das Reaktionsgemisch auf eine
Säule aufgetragen und für 15 s bei 6608 x g zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Die
Säule wurde mit 700 µl Puffer RW1 überschichtet und erneut für 15 s bei 6608 x g
zentrifugiert. Anschließend erfolgten zwei Waschschritte mit je 500 µl Ethanolwaschpuffer
RPE, wobei nach der ersten Zentrifugation (15 s) und dem Verwerfen des Eluates im zweiten
Waschschritt die Säule für 2 min zentrifugiert wurde. Die Säule wurde nachfolgend in einem
neuen sterilen und wieder verschließbaren 1,5 ml Auffangbehältnis platziert. Nach Zugabe
von 30 µl RNase freiem H2O auf jede Säule erfolgte ein letzter Zentrifugationsschritt bei
6608 x g für 1 min. Die im Eluat gewonnene RNA wurde bei -80 °C gelagert oder bei
sofortiger Weiterverwendung in einen Kühlblock gestellt.
3.1.2.4 Diagnostische RT-PCR
Zur Bestätigung von IFT-positiven Proben sowie zur Differenzierung zwischen EBLV-1 und
EBLV-2 wurde eine diskriminatorische RT-PCR eingesetzt, die ein Fragment des
47
Nucleoprotein-Phosphoproteingens amplifiziert (VOS et al., 2004a). Dieses Fragment ist bei
der EBLV-1 und EBLV-2 spezifischen RT-PCR 370 nt bzw. 270 nt groß. Die Primer und
deren Positionen im Virusgenom sind in Tabelle 3-1 angegeben.
Tabelle 3-1: Darstellung der Primer für die diagnostische RT-PCR für EBLV-1 und EBLV-2 (mod. nach VOS et al., 2004)
Name Sequenz Länge Position bei
EF157976 Fragmentgröße
EBLV-1-fwd 5’-AAG AGC TAC AGG ATT ACG AGG-3’ 21 nt 1161–1181 370 nt
EBLV-1-rev 5’-GAC AAA GAT CTT GCT CAT GA-3’ 20 nt 1534–1515
EBLV-2-fwd 5’-TCA TGG TCA ATG GGG GAA AG-3’ 20 nt 1226–1245 270 nt
EBLV-2-rev 5’-TTG GGA TGG AGC AGG AAG AG-3’ 20 nt 1455–1436
3.1.2.4.1 RT-PCR
Für die RT-PCR kam ein kommerziell erhältliches Kit zum Einsatz (SuperScript™.III
Platinum®One-Step Quantitative RT-PCR System, Invitrogen, Carlsbad, USA), bei dem
beide Reaktionsschritte hintereinander in einem Ansatz ablaufen. Die Negativstrang-EBLV-
RNA wurde zunächst in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben: Random Primer
(Hexamere) banden bei ca. 45°C – 60 °C an die RNA und davon ausgehend wurde durch das
Enzym M-MLV (Murine Moloney Leukaemia Virus) Reverse Transkriptase die RNA in
cDNA umgeschrieben (KOTEWICZ et al., 1985). Bei der anschliessenden PCR fungieren die
beiden, den zu amplifizierenden Genabschnitt einschließenden Primer als Startsequenz für die
Taq-Polymerase. Die Amplifikation des Genbereichs erfolgt durch die zyklisch ablaufenden
Prozesse Denaturierung, Anlagerung und Kettenverlängerung (MULLIS et al., 1986).
Temperaturen von ca. 90 - 95°C führen bei der Denaturierung zur Trennung der beiden DNA-
Stränge. Durch eine Reduktion der Temperatur auf 45°C – 55 °C können sich die spezifischen
Oligonukleotide and den Matrizenstrang anlagern. Dieser Schritt wird als Annealing
bezeichnet. Anschließend wird, ausgehend von den Primern, der Strang durch die DNA-
abhängige DNA-Polymerase in Anwesenheit freier Desoxyribonukleotide (dNTP) bei 72 °C
verlängert (Elongation). Diese als Zyklus bezeichnete Reaktionsabfolge wird 25 bis 40 Mal
wiederholt.
48
Tabelle 3-2: Mastermix Reaktionsansatz je Probe für die RT-PCR
Reaktionssubstrate Volumen
Rnase freies Bidest 16µl
2x Reaction Mix 25µl
Vorwärts Primer (10 µM) 1µl
Rückwärts Primer (10µM) 1µl
SuperScript III RT/ Platinum Taq Mix 2µl
EBLV RNA 5µl
Gesamtvolumen 50 µl
Zunächst wurde in einem speziellen, nur dafür vorgesehenen Raum ein Master-Mix für die
RT-PCR hergestellt. Neben dem RT-PCR Kit wurden die entsprechenden Primer und RNAse
freies Aqua bidest. hinzugegeben, um je Gefäß 45 µl Reaktionsgemisch bereitzustellen. Die
EBLV-RNA wurde in einem anderen Raum unter Verwendung einer Sicherheitskabine dem
Reaktionsgemisch hinzugefügt. Die einzelnen Reaktionsgefäße wurden sofort danach in einen
Thermocycler (Bio-Rad, München) gegeben.
Die RT-PCR zur Detektion von EBLV-Genmaterial besitzt folgende Spezifikation: Der RT-
Schritt erfolgte bei 50 °C und einer Inkubationszeit von 30 min, gefolgt von einer initialen
Denaturierung der cDNA bei 95 °C für 15 min. Die Amplifikation umfasste 35 Zyklen von
94°C für 30 s, 54 °C für 30 s und 72 °C für 60 s. Für die abschließende Elongation wurde das
Reaktionsgemisch bei 72°C für 5 min inkubiert. Sämtliche Reaktionsmaterialen wurden in
Kühlblöcken gelagert, um vorzeitige unspezifische Reaktionen zu verhindern. Um
Kontaminationen zu vermeiden, wurden Vorsichtsmassnahmen eingehalten (KWOK und
HIGUCHI, 1989). Bei allen Reaktionsansätzen wurden positive und negative Kontrollen
mitgeführt.
3.1.2.4.2 Agarose-Gelelektrophorese
Bei der Amplifikation von Virus-RNA im Verlauf einer PCR entsteht eine große Anzahl von
DNA-Fragmenten gleicher und spezifischer Größe, die durch die Position der Primer
49
bestimmt wird. Der Nachweis dieser Fragmente wurde durch Gelelektrophorese erbracht.
Dazu wurde zunächst 1g Agarose (Gibco BRL Life Technologies, Paisley, Vereinigtes
Königreich) in 100 ml 1xTBE-Puffer aufgekocht, mit 1 μl Etidiumbromid pro 10 ml gemischt
und in eine Gelkammer gegossen. Diese wurde nach dem Erstarren in eine mit 0,5xTBE-
Puffer gefüllte Elektrophoresekammer überführt. Anschließend wurden 5 µl PCR-Produkt mit
1 µl Auftragepuffer (6x Bromphenolblau) gemischt und in die Kammern des Gels übertragen.
Zusätzlich wurden je nach erwarteter Fragmentgröße ein DNA Größenmarker (100 bp-Marker
oder 1 kb-Marker) mitgeführt. Die elektrophoretische Auftrennung der Fragmente erfolgte bei
einer Spannung von 120 mV für 1h. Als Indikator diente das Migrationsverhalten des
Probenauftragepuffers. Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden mittels eines UV-
Transilluminators sichtbar gemacht, wobei sich das im Gel befindliche Ethidiumbromid als
interkalierender Farbstoff in die DNA einlagerte, durch UV Licht (518 nm) angeregt wurde
und Licht der Wellenlänge 650 nm emitierte. Alle PCR-Ergebnisse wurden mithilfe eines
digitalen Bildbearbeitungssystems gespeichert.
50
3.1.2.5 Sequenzierung von EBLV-1
3.1.2.5.1 Design von Primern für die long-PCR
Basierend auf den vorhandenen Sequenzen eines EBLV-1-Isolates aus Hamburg aus dem Jahr
1968 (Genbank: EF 157976, MARSTON et al., 2007) wurden Oligonukleotide (Primer) für
die anschliessend zu sequenzierenden Genabschnitte ausgewählt. Unter Verwendung des
Programms PrimerSelect© aus dem Lasergene-Software-Paket (Lasergene 7.0, DNASTAR
Inc., Madison, USA) wurden Primer für den Bereich Nucleoprotein-Phosphoprotein und den
Glykoprotein-Polymerase-Gen (GL-nicht translatierter Bereich) generiert. Die Synthese der
Primer erfolgte durch die Firma MWG Biotech, Ebersbach. Das Primerpaar NP-fwd und NP-
rev umspannte einen Genabschnitt von 1600 nt, während die Primer GL-fwd und GL-rev ein
775 nt-großes Fragment einschließen (Tabelle 3-3).
Tabelle 3-3: Verwendete Primer für die long-PCR
Name PCR-Primer Sequenz Länge Tm Position* Fragmentgröße
NP-fwd 5'-GTAACACCCCTACAATGG-3' 18 nt 53.7°C 57-74 1574
NP-rev 5'-GGTGGGCTTGACTATCCT-3' 18 nt 56.0°C 1631-1614
GL-fwd 5'-CATGTTGCAAAAGGTTC-3' 17 nt 47.9°C 4749-4765 775
GL-rev 5'-AATTGCTTCTCAGGTCT-3' 17 nt 47.9°C 5524-5508
*bezogen auf Referenzisolat EF157976
Die RT-PCR zur Amplifikation der long-Fragmente erfolgte im Wesentlichen wie in Kapitel
RT-PCR (3.1.2.4.1) beschrieben. Die veränderten Temperaturprofile sind in Tabelle 3-4
dargestellt.
Tabelle 3-4: RT-PCR Temperaturprofil für die NP-Fragmente und GL-Fragmente. Die veränderte Extensionszeit für den GL-Bereich ist durch * gekennzeichnet
Reaktionsschritt Temperatur Zeit Zyklen
Reverse Transkription 50°C 30 min 1x
Denaturierung 94°C 2 min 1x
PCR Denaturierung 94°C 15s
}40x Anlagerung 54°C 30s
Extension 68°C 1,5 (1*) min
End-Extension 68°C 5 min 1x
51
3.1.2.5.2 Sequenzierung der PCR-Produkte
Die Sequenzierung der Genabschnitte erfolgte nach der Kettenabbruchmethode (SANGER et
al., 1977) mit floureszenz-markierten IRD800-Primern. Entsprechende Sequenzierprimer
wurden mit dem Programm PrimerSelect© ausgewählt. Die Primer wurden so ausgewählt,
dass jeder Abschnitt des Genombereiches mindestens von je einer vorwärts und einer reversen
Sequenz überlesen wurde.
Tabelle 3-5: Verwendete IRD800 markierte Sequenzierprimer
Primer Sequenz Position*
vorwärts 5'-GTAACACCCCTACAATGG-3' 57-74
5'-CCATAATCAGCTGGTCTCGGT-3' 100-120
5'-GGGACCCTACGACACCTGAACA-3' 459-480
5'-GGGTTCATCAAGCAAATC-3' 800-817
5'-AGCAGAAAGCACTAAGGTTGATGT-3' 1183-1206
rückwärts 5'-GGTGGGCTTGACTATCCT-3' 1631-1614
5'-TTTAATCTCCCTCCGTTCATCATA-3' 1320-1297
5'-AGACACCAACCCCGAACA-3' 793-776
5'-TGAGCCTATAAAGACAGAGA-3' 521-502
*bezogen auf Referenzisolat EF157976
Die Menge der PCR-Fragmente wurde entsprechend der Dicke der Banden im
Elektrophorese-Gel geschätzt, um sie anschließend im Verhältnis 1:10 bis 1:100 mit Aqua
dest. zu verdünnen. Im Regelfall wurden bei einer Verdünnung von 1:50 gute Ergebnisse
erzielt. Von dieser Verdünnung wurden 15 µl des DNA-Aliquots mit 5 µl IRD800-
Sequenzierprimer (3 pmol/µl) (Tabelle 3-5) zu einem DNA/Primer-Premix gemischt.
Anschließend wurden je 4 µl dieses Gemisches jeweils zu 1 μl A-, C-, G- bzw.T-Reagenz
eines kommerziell erhältlichen Sequenzierkits (DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing
Kit, GE Healthcare, NY, USA) hinzugegeben, abzentrifugiert (1000 UpM, 15 s), mit Chill-out
Liquid Wax (MJ Research, Cambridge, USA) überschichtet und in einen vorgeheizten
Thermocycler verbracht. Die Konditionen für die Sequenzierreaktionen sind in Tabelle 3-6
beschrieben.
52
Tabelle 3-6: Temperaturprofil für die Sequenzierreaktionen
Reaktionsschritt Temperatur Dauer
Anzahl der
Zyklen
Denaturierung 95°C 5 min 1x
Denaturierung 95°C 15 s
}30 Anlagerung 50°C 30 s
Extension 68°C 1 min
End- Extension 68°C 5 min 1x
Nach der Sequenzierung erfolgte ein Abbruch der Reaktion durch Zugabe von 4 µl
Formamid-Puffer (im Kit enthalten) und anschließende Denaturierung (70 °C, 1 min). Die
elekrophoretische Auftrennung der Proben und die Ermittlung der Sequenz erfolgten in einem
automatischen Sequenziergerät „LI-COR DNA Sequencer ReadIR 4200“ (MWG-Biotech,
Ebersberg, Deutschland).
Zunächst wurde dazu eine Gelmatrix gegossen. Zwei Glasplatten wurden mit 70%igem
Ethanol gründlich gereinigt, mithilfe eines Abstandhalters (0,25 mm) mit Schraubschienen
zusammengesetzt und gleichmäßig zusammengedrückt. Anschließend wurden 25 ml Sequagel
XR© mit 6,25 ml Sequagel Puffer, 0,33 ml DMSO und 0,25 ml 10 % APS gemischt und das
Gel unter Verwendung einer 10 ml-Pipette luftblasenfrei gegossen. Der Einsatz eines
Vorformer-Kamms ermöglichte eine glatte Gelkante für den späteren Einsatz des
Zahnkamms. Nach der Polymerisation des Gels wurde es in die Gerätekammer des
Sequenzierautomaten gehängt, die Pufferbehälter mit 0,5xTBE-Puffer gefüllt und nach
vorheriger Reinigung des Haifischzahn-Kammes in das Gel eingebracht. In jede Kammer
wurden ca. 1,5 µl Probe gefüllt. Die elektrophoretische Auftrennung der Proben erfolgte unter
folgenden Konditionen: Spannung 1500 V, Stromstärke 37,5 A, Leistung 50,0 W, Temperatur
50 °C, Rahmen 25. Die Basenabfolge wurde mithilfe des zum Sequenziergerät LICOR
gehörenden Softwarepakets BaseImageIR™ Version 02.31 mit den Komponenten Data
Collection und Image Analysis ermittelt.
53
3.1.2.6 Speziesbestimmung von Fledermäusen
Ein Genabschnitt des Cytochrom B wurde nach dem von HARRIS (2008) beschriebenen
Verfahren amplifiziert und anschließend sequenziert.
3.1.2.6.1 DNA-Extraktion
Die Extraktion von genomischer DNA erfolgte unter Verwendung des kommerziellen DNA
Extraktionskits NucleoSpin Tissue™ (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland). Von der
Fledermaus wurden 35 μg Organprobe (Niere) entnommen. Diese wurde homogenisiert, mit
180 μl Lösungspuffer T1 und 25 μl Proteinase K überschichtet, durchmischt und über Nacht
bei 56 °C inkubiert. Anschließend wurden dem Lysat 200 μl Puffer B3 hinzugefügt, gevortext
und bei 70 °C für 10 min inkubiert. Nach Zugabe von 210 μl Ethanol (96-100%ig) und
nachfolgender Durchmischung (Vortex, wurde das Reaktionsgemisch auf eine Säule
aufgetragen, für 1 min bei 11.000 UpM zentrifugiert und der Durchfluss verworfen.
Anschließend erfolgten zwei Waschschritte der Membran mit zunächst 500 µl Waschpuffer
BE und anschliessend 500 µl B5. Die Säule wurde jeweils für 1 min bei 11.000 UpM
zentrifugiert und das Eluat wurde verworfen. Die Trocknung der Säule erfolgte durch
Zentrifugation für 1 min bei 11.000 UpM. Die Säule wurde nachfolgend in einem neuen
sterilen wiederverschließbaren 1,5 ml Auffangbehältnis platziert. Nach Zugabe von 100 μl
vorgewärmtem (70 °C) Elutionpuffer BE auf die Säule erfolgte ein letzter
Zentrifugationsschritt bei 10.000 UpM für 1 min. Die im Eluat gewonnene DNA wurde bei -
80 °C gelagert oder bei sofortiger Weiterverwendung in einen Kühlblock gestellt.
3.1.2.6.2 Cytochrom B-PCR
Die PCR zur Amplifikation eines 900 nt großen Fragments des Cytochrom B-Gens erfolgte
unter Verwendung eines kommerziellen PCR Kits (Platinum® Taq DNA Polymerase,
Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland). Ein PCR-Mastermix mit folgenden Bestandteilen je
Reaktion wurde vorbereitet: 5 µl PCR Puffer (10x), 1 µl dNTPs (10 mM), 1.5 μl MgCl2 (50
mM), 1 µl Vorwärts-Primer Mix (Barb F1/BWF/WF) (0.2 µM), 1 µl of Rückwärts-Primer
(Barb R2/BWR/WR) (0.2 µM), and 2 µl of TaqPolymerase (0.5 U/ml) (HARRIS et al., 2008).
54
Tabelle 3-7 : Zur Amplifikation verwendete Primer und ihre Position im CytB-Gen. Die Primer BWF und BWR amplifizieren cytB von M. brandtii und M. mystacinus, die Primer WF und WR nur M. mystacinus (nach HARRIS et al., 2008)
Name Sequenz Position
BarbF1 5’ - CCT CAA ATA TTT CAT CAT GAT G – 3’ 71-92
BarbR2 5’ - GTC CTC CAA TTC ATG TTA GG – 3’ 1022-1002
BWF 5’ - GAC CAA CAT TCG AAA ATC – 3’ 3-20
BWR 5’ - GTG ATG CTG CGT TGT TTG – 3’ 930-947
WF 5’ – CCT GCC CCA TCA AAT ATC TC – 3’ 64-83
WR 5’ – GGA ATT GAT CGT AGG ATT GCG – 3’ 834-854
Das Reaktionsgemisch wurde mit Aqua bidest auf 45 µl je Reaktion aufgefüllt, auf
Reaktionsgefäße verteilt und 5 µl Fledermaus-DNA beziehungsweise eine Negativkontrolle
(H2O) hinzugefügt. Die Bedingungen für den Thermocycler sind Tabelle 3-8 beschrieben. Die
Visualisierung der PCR-Fragmente erfolgte mittels Gel-Elektrophorese analog zu der in
Kapitel 3.1.2.4.2 beschriebenen Verfahrensweise.
Tabelle 3-8: Temperaturprofil für die cytB-PCR (nach HARRIS et al., 2008)
Reaktionsschritt Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen
Denaturierung 95°C 15min 1x
Denaturierung 95°C 50 s
}37x Anlagerung 50°C 50 s
Extension 72°C 1 min
End- Extension 72°C 10 min 1x
3.1.2.6.3 Sequenzierung
Das durch die cytB-PCR gewonnene Amplifikat wurde anschließend nach der im Kapitel
3.1.2.5 geschilderten Vorgehensweise sequenziert. Hierzu wurden IRD800-markierte Primer
55
basierend auf BarbF1 und BarbR2 eingesetzt. Die Bedingungen der Sequenzier-PCR sind in
Tabelle 3-6 angegeben.
3.1.2.6.4 Vergleich mit Sequenzen aus GenBank
Die erhaltene Gensequenz wurde im FASTA-Format gespeichert und mit in der Genbank
veröffentlichten cytB-Gensequenzen anderer Fledermausspezies verglichen.
56
3.1.2.7 Analyse der Sequenzdaten der EBLV-1-Isolate
3.1.2.7.1 Aufbereitung der Rohdaten
Die Nukleotidsequenzen lagen nach dem ersten Kontrollschritt im Datenformat Sequence
Chromatogram File (SCF) vor. Hierbei handelt es sich um ein Speicherformat für
Sequenzdaten, das neben der eigentlichen Basenabfolge auch das Chromatogramm der
Fluoreszensmessung beinhaltet. Alle SCF Dateien eines Isolates wurden nach einem
Alignment im Programms SeqMan® verglichen. Nicht eindeutige Nukleotidpositionen wurden
im Chromatogramm und direkt am Sequenziergerät kontrolliert. Eine erneute
Sequenzierreaktion wurde durchgeführt, wenn keine eindeutige Abklärung der Fehler
erfolgen konnte. Die Konsensussequenz der zu einem Isolat gehörenden Einzelsequenzen
wurde als Datei im Lasergene-Format seqfile abgespeichert.
3.1.2.7.2 Alignment der Sequenzen
Die Trimmung der SEQ-Dateien erfolgte unter Verwendung des Programms. Basierend auf
bereits veröffentlichten Sequenzen wurden alle Sequenzen auf die entsprechende Länge der
Gensegmente gekürzt:
Nukleoprotein (kodierend): 1353 nt
Nukleoprotein-Phosphoprotein intergenetischer Bereich 90 nt
Glykoprotein L-Protein – intergenetischer Bereich 560 nt
Anschließend wurden die Einzelsequenzen der Isolate in Dateien im FASTA-Format
exportiert, um sie für weitere Anwendungen nutzbar zu machen. Das Alignment erfolgte mit
dem Programm MEGA Version 4.0 (TAMURA et al., 2007), in welchem ein Alignment-
Explorer implementiert ist. Das paarweise und multiple Alignment erfolgte unter Verwendung
von CLUSTAL W (THOMPSON et al., 1994).
57
3.1.2.7.3 Analyse der untersuchten Genabschnitte
Die 1353 nt langen Sequenzen für das N-Gen wurden vom Alignment-Explorer als MEGA-
Datei exportiert, um sie weiter im Data-Explorer des Programms MEGA© Version 4.0 zu
verwenden. Die Programmoberfläche bietet verschiedene Möglichkeiten und Verfahren, die
Sequenzdaten zu analysieren. Die Basenabfolgen für die NP- und GL-intergenetischen
Bereiche wurden analog erfasst.
Charakterisierung der Genabschnitte
Das Alignment der Sequenzen wurde im Data-Explorer auf das Vorkommen variabler
Nukleotidpositionen untersucht. Basierend auf ersten Ergebnissen wurden die Sequenzen in
Gruppen eingeteilt. Anschließend wurden die durchschnittliche Distanz aller Sequenzen
sowie die innerhalb einzelner Gruppen berechnet. Hierbei wurde die Distanz als p-Distanz
(Verhältnis der Anzahl von Nukleotidunterschieden zur Zahl der untersuchten Nukleotide) als
Maßstab gewählt (TAMURA et al., 2007).
Distanzberechnungen und Analyse der Aminosäuresequenz
Die Nukleotidsequenzen wurden durch das im Data-Explorer implementierte Programm zur
Berechnung der paarweisen Distanzen eingelesen und miteinander verglichen. Die Ausgabe
erfolgte in einer Abstandsmatrix, wobei als Kriterium die Anzahl der Nukleotidunterschiede
gewertet wurde. Die als Textdatei ausgegebene Matrix wurde in das
Tabellenkalkulationsprogramm Office-Excel (Microsoft©, Redmond, USA) exportiert. Die
Daten zu den einzelnen Isolaten, wie Jahr der Isolierung, geographischer Ursprung,
Labornummer, wurden mit den Daten aus den genetischen Analysen vervollständigt, um
weitere Berechnungen durchzuführen.
Die Nukleotidsequenzdaten wurden im Data-Explorer in Aminosäuresequenzen
umgeschrieben und auf das Auftreten von Aminosäureaustauschen untersucht.
58
Phylogenetische Analysen
Die phylogenetischen Analysen erfolgten unter Verwendung des im Programm MEGA©
Version 4.0 implementierten Neighbour-Joining-Verfahrens (SAITOU und NEI, 1987) mit
dem Substitutionsmodell für Nukleotide nach Jukes-Cantor (JUKES und CANTOR, 1969).
Zur Ermittlung von Konfidenzwerten wurde dieses mit einem Bootstrap-Verfahren gekoppelt,
wobei 1000 Wiederholungen durchgeführt wurden. Die Ausgabe der Informationen erfolgte
als phylogenetisches Baumdiagramm. Um Cluster zu identifizieren wurde der
phylogenetische Baum kondensiert, das heißt, nur Abzweigungen mit Bootstrap-Werten über
50 % wurden als repräsentativ gewertet. Alle Isolate eines Astes wurden einem Cluster
zugeordnet. Um Gruppen innerhalb des Data-Explorers zu bilden, wurde die Cluster-
Einteilung benutzt.
3.1.2.8 Kartographische Darstellung
Die kartographische Darstellung der Daten zur Fledermaustollwut, zur Auswahl der
sequenzierten Virusisolate sowie der entsprechend der phylogenetischen Analyse erhaltenen
Cluster von Virusisolaten erfolgte mit Hilfe des Kartenexplorers (Version.1.41).
3.1.2.9 Abstandsberechnungen zwischen den Fundorten
Für jedes EBLV-Isolat wurden mit Hilfe des Kartenexplorers des Tierseuchen
Nachrichtensystems (TSN) die Koordinaten für den geographischen Fundort im Gauss-
Krüger (PD) Format bestimmt. Anhand der ermittelten Rechtswerte und Hochwerte konnte
der Abstand zwischen zwei Fundorten A und B mittels folgender Formel berechnet werden:
²)()²Re(Re HochwertBHochwertAchstwertBchtswertAAB −+−=
59
Mithilfe dieser in das Tabellenkalkulationsprogramm Office-Excel© (Microsoft, Redmond,
USA) eingefügten Formel wurde eine Abstandsmatrix zwischen allen ausgewählten Isolaten
generiert.
3.1.3 Statistische Auswertung
3.1.3.1 Verhältnis von genetischer zu zeitlicher Distanz
Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die genetische Distanz zwischen den Isolaten im
Bezug zum Referenzisolat linear mit der zeitlichen Distanz zunimmt. Dabei wurde die
zeitliche Distanz als Abstand zwischen den Isolierungszeitpunkten in Jahren und die
genetische Distanz als Anzahl von Nukleotidunterschieden im N-Gen gemessen. DJ und DG
sind dabei Zufallsvariablen. Das lineare Regressionsmodell DGi,j=β0+β1DJ
i,j+εi,j wurde
aufgestellt (SOKAHL und ROHLF, 1994), um die HypotheseH0: β1≤0 gegen die
AlternativhypotheseH1: β1>0 mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von α = 0,05 zu testen.
Dabei sind DJ und DG die Distanz in Jahren bzw. die georaphische Distanz. Die Variable β0
ist der y-Achsenabschnitt; β1 stellt die Steigung der Regressiongeraden dar und εi,j ist der
Fehlerkoeffizient.
Zur Durchführung des Tests wurde das Statistikprogramm SAS 9.1 (SAS Institute Inc., Cary,
USA) verwendet.
3.1.3.2 Verhältnis von geographischer zu genetischer Distanz
Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die geographische Entfernung zwischen den Isolaten
für den untersuchten Wertebereich linear mit den genetischen Distanzen zunimmt. Dabei
wurde die geographische Distanz als Euklidische Distanz und die genetische Distanz als
Anzahl von Nukleotidunterschieden im N-Gen gemessen. DK und DG sind dabei
60
Zufallsvariablen. Das statistisches Modell DKi,j=β0+β1DG
i,j+εi,j basierend auf linearer
Regression wurde aufgestellt, um die Hypothese H0: β1≤ 0 gegen die Alternativhypothese H1:
β1>0 mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von α = 0,05 zu testen. Dabei sind DK und DG die
Euklidische Distanz bzw. die genetische Distanz. Die Variable β0 ist der y-Achsenabschnitt;
β1 stellt die Steigung der Regressiongeraden dar und εi,j ist der Fehlerkoeffizient.
Um die Modellparameter nicht zu verletzen, wurde die Quadratwurzel aus DK gezogen, so
dass folgende Formel angewandt wurde: +D+ =D ,ji,G
01ji,K
jiεββ
Zur Durchführung der Tests wurde das Statistikprogramm SAS 9.1 (SAS Institute Inc., Cary,
USA) verwendet.
61
3.2 Ergebnisse
3.2.1 Auswahl der Isolate
Zwischen 1954 und 2007 wurden 201 Fälle von Tollwut bei Fledermäusen an das Nationale
Referenzlabor für Tollwut gemeldet (Abbildung 3-1). Im Virusarchiv des NRL am FLI in
Wusterhausen befinden sich 112 Isolate (Stand Dezember 2007).
Abbildung 3-1: Darstellung der Fledermaustollwutfälle in Deutschland zwischen 1954 und 2007 (links) und der am NRL verfügbaren EBLV-1 Isolate (rechts)
Die Einteilung der Fläche Deutschlands in Rasterzellen einer Größe von 30 km x 30 km ergab
eine Anzahl von insgesamt 474 Rasterzellen. Tollwutpositive Fledermäuse aus dem Zeitraum
62
1954 - 2007 entfielen auf 86 verschiedene Rasterzellen, wobei aus 46 Zellen Virusisolate am
NRL zur Verfügung standen. In 26 dieser Rasterzellen war jeweils nur ein Isolat
georeferenziert und wurde entsprechend ausgewählt. Aus den übrigen Rasterzellen mit mehr
als einem Isolat (max. 6) fand eine Auswahl nach dem Zufallsprinzip statt (Abbildung 32).
Abbildung 3-2: Darstellung des 30km-Rasters mit verfügbaren EBLV-Isolaten (EBLV-1) (links) und selektierte Gridzellen mit entsprechenden Isolaten (rechts)
Insgesamt 25 Isolate wurden aus Breitflügelfledermäusen (Eptesicus serotinus) isoliert. Bei
20 Isolaten lagen keine Angaben zur Speziesbestimmung der jeweiligen Fledermaus vor. Um
einen möglichen Einfluss der Fledermausspezies auf die phylogenetische Diversität zu
analysieren, wurden die Isolate mit den Labor-Nummern 976, 5226 und 5250 selektiv in die
Untersuchung einbezogen, da diese Isolate von Fledermäusen der Arten Fransenfledermaus
(Pipistrellus nathusii, 976), Braunes Langohr (Plecotus auritus, 5226) und einer
Zwergfledermaus (Pipistrellus pipistrellus, 5250) stammen.
63
3.2.2 RT-PCR
Die ausgewählten Primer für die Amplifikation von Genfragmenten für das Nukleoprotein
und den GL-nicht-translatierten Bereich waren in der RT-PCR spezifisch für EBLV-1.
Die Amplifikate hatten eine Länge von 1574 bp für das N-Gen und den NP-nicht-
translatierten Bereich sowie 775 bp für den GL-nicht-translatierten Bereich bei allen
selektierten Isolaten. Dadurch konnten auch alle sich anschließenden Analyseschritte
durchgeführt werden.
3.2.3 Sequenzanalyse des N-Gens
Die 48 untersuchten EBLV-1-Isolate zeigten innerhalb des N-Gens eine durchschnittliche p-
Distanz von 0,00875, wobei 45 bzw. 3 Isolate entsprechend phylogenetischer Analysen
jeweils EBLV-1a oder EBLV-1b zugeordnet werden konnten (siehe Kapitel 3.2.3.2).
Abbildung 3-3: Anzahl der variablen Positionen in verschiedenen Abschnitten des N-Gens innerhalb der Gruppe EBLV-1a
0
1
2
3
4
5
6
7
1-60
61-1
20
121-
180
181-
240
241-
300
301-
360
361-
420
421-
480
481-
540
541-
600
601-
660
661-
720
721-
780
781-
840
841-
900
901-
960
961-
1020
1021
-108
0
1081
-114
0
1141
-120
0
1201
-126
0
1261
-132
0
1321
-135
6
Abschnitt im N-Gen
Anza
hl v
aria
bler
Pos
ition
en
64
Innerhalb der EBLV-1a Gruppe wurde eine mittlere p-Distanz von 0,0047 berechnet. Die
mittlere p-Distanz in der Gruppe EBLV-1b betrug 0,01553. Im gesamten N-Genabschnitt mit
1356 bp Länge wurden 114 variable Positionen gefunden, in denen sich die Isolate in
mindestens einem Nukleotid voneinander unterschieden.
Abbildung 3-4: Anzahl der variablen Positionen in verschiedenen Abschnitten des N-Gens innerhalb der Gruppe EBLV-1b
Innerhalb der Gruppe EBLV-1a (n=45) konnten 60 variable Stellen identifiziert werden,
wobei 31 jeweils nur bei einem Isolat einen Nukleotidaustausch zeigten. Die variablen Stellen
waren dabei ungleichmäßig im N-Gen verteilt (Abbildung 3-3). Während 37 (62%) der
variablen Positionen im ersten Genabschnitt bis Position 660 lagen, wies der Abschnitt von
661-1356 nur 23 (38%) Nukleotidaustausche auf. Die drei Isolate des Subtyps EBLV-1b
unterschieden sich in 31 Stellen. Die meisten Unterschiede gab es in dem Genabschnitt
zwischen Position 121 und 180. Wie in Abbildung 3-4 zu erkennen, häuften sich diese
Positionen im vorderen Genabschnitt. Der Vergleich der Konsensussequenzen von EBLV-1a
0
1
2
3
4
5
6
1-60
61-1
20
121-
180
181-
240
241-
300
301-
360
361-
420
421-
480
481-
540
541-
600
601-
660
661-
720
721-
780
781-
840
841-
900
901-
960
961-
1020
1021
-108
0
1081
-114
0
1141
-120
0
1201
-126
0
1261
-132
0
1321
-135
6
Abschnitt im N-Gen
Anza
hl v
aria
bler
Pos
ition
en
65
und 1b zeigt dagegen variable Positionen, und zwar gehäuft im vorderen und hinteren
Genbereich, wogegen der zentrale Genabschnitt weniger Unterschiede hatte (Abbildung 3-4).
Zwischen Position 1255 und 1342 ware alle Sequenzen beider Subtypen identisch. Dagegen
unterschieden sich EBLV-1a und EBLV-1b in den Positionen 333-337 in 4 von 5
Nukleotiden.
66
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
EBLV-1a ATGGATGTTAACAAGGTTGTTTTTAAGGTCCATAATCAGCTGGTCTCGGTAAGACCTGAGGTGATTTCTGATCAGTATGAGTATAAGTACCCTGCTATTA M D V N K V V F K V H N Q L V S V R P E V I S D Q Y E Y K Y P A I
EBLV-1b .............G.........................T............A..............................C..A........C..C. M D V N R V V F K V H N Q L V S V K P E V I S D Q Y E Y K Y P A I
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
EBLV-1a AAGACAAGAAGAAACCAAGCATCACTCTCGGAAAAGATCCCGATTTGAAAACAGCCTACAAGTCTATCTTGTCAGGGATGAATGCTGCTAAATTAGACCC K D K K K P S I T L G K D P D L K T A Y K S I L S G M N A A K L D P
EBLV-1b ................G..........................C..................................................G..T.. K D K K K P S I T L G K D P D L K T A Y K S I L S G M N A A K L D P
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
EBLV-1a AGATGACGTCTGCTCTTATTTAGCTGGAGCCATGGTCTTGTTTGAGGGCATCTGCCCGGAAGATTGGACTAGTTACGGAATCAACATTGCTAAGAAAGGT D D V C S Y L A G A M V L F E G I C P E D W T S Y G I N I A K K G
EBLV-1b ...................................................A...........C.................................... D D V C S Y L A G A M V L F E G I C P E D W T S Y G I N I A K K G
310 320 330 340 350 360 370 380 390 400....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
EBLV-1a GACAAGATAACACCTGCTACGTTAGTGGACATTCACAGGACGAACACTGAGGGCAACTGGGCTCAAACAGGAGGTCAAGATCTCACTCGGGACCCTACGA D K I T P A T L V D I H R T N T E G N W A Q T G G Q D L T R D P T
EBLV-1b ................................CA.TC............................................................... D K I T P A T L V D I N R T N T E G N W A Q T G G Q D L T R D P T
410 420 430 440 450 460 470 480 490 500....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
EBLV-1a CACCTGAACATGCATCTCTGGTTGGACTTCTTCTCTGTCTTTATAGGCTCAGTAAGATAGTAGGACAGAATACGGGGAACTATAAGACCAATGTGGCAGA T P E H A S L V G L L L C L Y R L S K I V G Q N T G N Y K T N V A D
EBLV-1b ..................................T.....C..C.....A.................................................. T P E H A S L V G L L L C L Y R L S K I V G Q N T G N Y K T N V A D
510 520 530 540 550 560 570 580 590 600....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
EBLV-1a TAGAATGGAACAGATCTTTGAGACTGCCCCATTTGTCAAGATTGTGGAACACCACACATTGATGACCACCCACAAGATGTGTGCCAACTGGAGCACTATA R M E Q I F E T A P F V K I V E H H T L M T T H K M C A N W S T I
EBLV-1b .................................C.................................................................. R M E Q I F E T A P F V K I V E H H T L M T T H K M C A N W S T I
610 620 630 640 650 660 670 680 690 700....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
EBLV-1a CCTAATTTTAGATTCTTGGCAGGGGCTTATGACATGTTTTTTGCCAGAATTGAGCACCTGTATTCTGCAATTCGGGTTGGGACAGTGGTTACTGCTTATG P N F R F L A G A Y D M F F A R I E H L Y S A I R V G T V V T A Y
EBLV-1b .................................................................................................... P N F R F L A G A Y D M F F A R I E H L Y S A I R V G T V V T A Y
710 720 730 740 750 760 770 780 790 800....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
EBLV-1a AGGATTGTTCGGGGTTGGTGTCTTTCACAGGGTTCATCAAGCAAATCAATTTGACAGCCAGGGAGGCCATATTATACTTCTTCCACAAGAACTTCGAGGA E D C S G L V S F T G F I K Q I N L T A R E A I L Y F F H K N F E E
EBLV-1b ..........A...........C...........................C....................C............................ E D C S G L V S F T G F I K Q I N L T A R E A I L Y F F H K N F E E
810 820 830 840 850 860 870 880 890 900....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
EBLV-1a AGAGATCAAGAGAATGTTTGAGCCAGGGCAAGAAACAGCTGTTCCGCACTCGTATTTCATCCACTTCAGATCACTTGGACTCAGTGGGAAGTCTCCTTAT E I K R M F E P G Q E T A V P H S Y F I H F R S L G L S G K S P Y
EBLV-1b ...................................................A.....................T.G.....T.................. E I K R M F E P G Q E T A V P H S Y F I H F R S L G L S G K S P Y
910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
EBLV-1a TCATCCAATGCGGTTGGGCATGTGTTTAACCTGATTCACTTTGTGGGTTGTTACATGGGCCAAATCAGATCTTTAAATGCCACTGTCATTCAGAGTTGTG S S N A V G H V F N L I H F V G C Y M G Q I R S L N A T V I Q S C
EBLV-1b ..............A......................................T..........................T................... S S N A V G H V F N L I H F V G C Y M G Q I R S L N A T V I Q S C
1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
EBLV-1a CACCCCATGAAATGTCAGTTTTGGGGGGTTATCTAGGGGAGGAGTTTTTCGGGAAGGGAACATTTGAGAGGCGGTTCTTCAGAGATGAGAAAGAGCTACA A P H E M S V L G G Y L G E E F F G K G T F E R R F F R D E K E L Q
EBLV-1b ...................C...........C..........................C........A.....A......C....C.........T.... A P H E M S V L G G Y L G E E F F G K G T F E R R F F R D E K E L Q
67
1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100.. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |.. ..| .. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |.. .. |.. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |
EBLV-1a CACCCCATGAAATGTCAGTTTTGGGGGGTTATCTAGGGGAGGAGTTTTTCGGGAAGGGAACATTTGAGAGGCGGTTCTTCAGAGATGAGAAAGAGCTACA A P H E M S V L G G Y L G E E F F G K G T F E R R F F R D E K E L Q
EBLV-1b ...................C...........C..........................C........A.....A......C....C.........T.... A P H E M S V L G G Y L G E E F F G K G T F E R R F F R D E K E L Q
1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200.. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |.. ..| .. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |.. .. |.. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |
EBLV-1a GGATTACGAGGCAGCAGAAAGCACTAAGGTTGATGTAGCATTGGCAGATGATGGGACAGTGAATTCGGATGATGAAGACTTCTTTTCGGGAGACACGAGA D Y E A A E S T K V D V A L A D D G T V N S D D E D F F S G D T R
EBLV-1b ........................C........C................................A................................. D Y E A A E S T K V D V A L A D D G T V N S D D E D F F S G D T R
1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300.. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |.. ..| .. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |.. .. |.. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |
EBLV-1a AGCCCAGAGGCAGTATACACCAGGATTATGATGAACGGAGGGAGATTAAAAAGGTCTCACATAAAGAGATATGTCTCAGTGAGTGCAAACCATCAGGCCA S P E A V Y T R I M M N G G R L K R S H I K R Y V S V S A N H Q A
EBLV-1b ...........T................................G....................................................... S P E A V Y T R I M M N G G R L K R S H I K R Y V S V S A N H Q A
1310 1320 1330 1340 1350.. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |.. ..| .. ..| ... .| ... .|. .. .|.
EBLV-1a GGCCTAATTCCTTTGCAGAGTTTCTCAACAAGACGTATTCTAGTGATCCCAGATAA R P N S F A E F L N K T Y S S D P R *
EBLV-1b ........................................................ R P N S F A E F L N K T Y S S D P R *
Abbildung 3-5: Alignment der Konsensus-Sequenzen von EBLV-1a und EBLV-1b und dieabgeleitete Aminosäuresequenzen. Bei Position 333-337 unterschieden sich die Subtypen in 4von 5 Nukleotiden.
68
3.2.3.1 Paarweise Distanzberechnung und Analyse
3.2.3.1.1 Abhängigkeit der genetischen Distanz vom Jahr der Isolierung
Die in MEGA implementierte Funktion der Distanzberechnug wurde genutzt, um eine
Distanzmatrix für alle untersuchten Isolate zu erstellen. In Verbindung mit den zu den
Isolaten zur Verfügung stehenden Informationen wie Jahr der Isolierung und Fundort wurden
die Distanzen analysiert. Abbildung 3-6 zeigt das Jahr der Isolierung und die genetische
Distanz bezogen auf das Referenzisolat Hamburg (1968). Die untersuchten Isolate
entstammen den Zeitraum 1970 - 2007, wobei der überwiegende Anteil zwischen 1985 und
2005 isoliert wurde.
0
10
20
30
40
50
60
1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010
Jahr der Isolierung
Anza
hl d
er N
ukle
otid
unte
rsch
iede
Abbildung 3-6: Darstellung der genetischen Distanz (Anzahl der Nukleotidunterschiede) und dem Jahr der Isolierung in Bezug zum Referenzisolat Hamburg (EF 157976) aus dem Jahr 1968. Die 3 Isolate mit mehr als 50 Nukleotidaustauschen sind Vertreter des Subtyps EBLV-1b.
Nur die Isolate 12868 (1970) und 12871 (1983) sind vor 1985 isoliert worden. Bezüglich des
Referenzisolates 12865 (Hamburg, 1968) wiesen alle untersuchten Isolate weniger als 10
Unterschiede innerhalb der 1356 Nukleotidsequenz des N-Gens auf. Ausnahmen bildeten die
69
drei Isolaten des Subtyps EBLV-1b, die sich innerhalb dieses Genabschnitts in mehr als 50
Nukleotiden von 12865 unterschieden.
Abbildung 3-7: Statistischer Zusammenhang zwischen der Anzahl der Nukleotidaustausche und der zeitlichen Distanz. Isolate des Subtyps EBLV-1b wurden nicht berücksichtigt
Eine statistische Auswertung des Subtyps EBLV-1b war aufgrund der geringen Anzahl der
Isolate nicht möglich.
Werden die Isolate des Subtyps EBLV-1a gesondert betrachtet (Abbildung 3-7), so ist in
Bezug auf das Referenzisolat Hamburg (1968) eine statistisch signifikante Zunahme (p<0,05)
der genetischen Unterschiede mit wachsendem zeitlichen Abstand nachweisbar. Die H0-
Hypothese wird abgelehnt; demzufolge nimmt die genetische Distanz mit zunehmender
zeitlicher Distanz für den untersuchten Wertebereich linear zu. Der Schätzer für den
Parameter ist β1= 0,199. Für die Regressionsgerade ergibt sich somit folgende Formel:
Anzahl der Nukleotidaustausche = 0,666 + 0,199 * Distanz in Jahren
70
3.2.3.1.2 Abhängigkeit der genetischen Distanz von der geographischen Distanz
Werden sämtliche geographischen und genetischen Distanzen der untersuchten Isolate in
Bezug zueinander gesetzt, können 3 Punktwolken unterschieden werden (Abbildung 3-8).
Vertreter des Subtyps EBLV-1a wiesen mit maximal 14 Nukleotidunterschieden eine
geographische Distanz von bis zu 500 km untereinander auf. Alle geographischen Distanzen,
die mit mehr als 40 Austauschen assoziiert waren, zeigten jeweils Beziehungen zwischen
Vertretern des Subtyps EBLV-1a und -1b. Da die drei EBLV-1b Isolate einen engeren
geographischen Ursprung (Saarland) haben, ist der Abstand zu den EBLV-1a Isolaten
zwischen 300 km und 700 km groß (Abbildung 3-8). Neben diesen beiden großen Gruppen
separieren sich zwei Werte mit einer genetischen Distanz von 20-30 Nukleotidunterschieden
und einem geographischen Abstand von <50 km. Diese Punkte stellen die Beziehung
innerhalb der EBLV-1b Gruppe zwischen den Isolaten 5006, 15571 und 13403 dar.
0
10
20
30
40
50
60
0 100 200 300 400 500 600 700
Abstand (in Kilometer)
Anza
hl d
er U
nter
schi
ede
Abbildung 3-8: Beziehung zwischen geographischer und genetischer Distanz (N-Gen) der untersuchten Isolate
71
Innerhalb des Subtyps EBLV-1a waren einige Isolate identisch und die maximale Differenz
betrug 13 Nukleotidunterschiede. Die mittlere Anzahl der Nukleotidunterschiede als Maß der
genetischen Distanz betrug 6,4.
Abbildung 3-9: Beziehung zwischen geographischer und genetischer Distanz der untersuchten Isolate des Subtyps EBLV-1a (N-Gen)
Es bestand ein signifikanter Zusammenhang zwischen geographischer und genetischer
Distanz der untersuchten deutschen EBLV-1a Isolate in Deutschland (p<0,05). Die
Quadratwurzel der geographischen Distanz nahm mit wachsender Anzahl von
Nukleotidaustauschen für den untersuchten Wertebereich zu (Parameterschätzer β1= 18,75).
Demzufolge wird die H0-Hypothese abgelehnt.
72
3.2.3.2 Phylogenetische Analyse mit den N-Gensequenzen
Die phylogenetische Analyse mit den Sequenzen der kompletten N-Gene der 48 Isolate von
Fledermaustollwutvirusisolaten aus Deutschland mit Hilfe der NJ-Methode bestätigte die
vorangegangenen Sequenzanalysen, wonach eine Unterteilung der Isolate in zwei separate
Untergruppen vorgenommen werden kann. Das Dendrogramm hat zwei Cluster und spiegelt
die Existenz der Subtypen EBLV-1a und -1b wider (Abbildung 3-10). Sämtliche Vertreter des
Subtyps EBLV-1a wurden im Norddeutschen Tiefland nachgewiesen. Dagegen stammten die
drei EBLV-1b Isolate aus dem Saarland und repräsentieren die bis dahin südlichsten
Nachweise von EBLV-1 in Deutschland. Die aus den Jahren 2000 (5006) und 2006 (15571)
stammenden Isolate des Subtyps EBLV-1b sind näher miteinander verwandt als mit dem
dritten Isolat (13403) aus dem Jahr 1986. Für diese Verzweigung wurde ein Bootstrap-Wert
von 99% ermittelt (Abbildung 3-10).
EBLV-1b
EBLV-1a
Abbildung 3-10: Räumliche Verteilung der beiden Sybtypen EBLV-1a und 1b
73
Im Vergleich zu EBLV-1b zeigten die EBLV-1a-Isolate eine homogenere Struktur mit
geringeren Astlängen innerhalb der Verzweigung des phylogenetischen Baumes. Die
Bootstrap-Werte für die einzelnen Verzweigungen lagen zwischen 15 und 96%. Um die
Isolate innerhalb der EBLV-1a-Phylogruppe in Cluster einzuteilen, erfolgte eine
Umwandlung des phylogenetischen Baumes in eine kondensierte Form, wobei nur
Verzweigungen mit einem Bootstrap-Wert von über 50 berücksichtigt wurden. Diese
Herangehensweise erlaubte die Unterteilung in fünf Cluster (A - E).
74
EBLV
-1b
EBLV
-1a
489557785782577631321345013452
67951554813394915
1164713323
12865
134154644
1341613414
1344552261340813406
134098624
1287113407
525429769923131
134185250976
13401134281343813453
1343915730
9335248
1092710924
1342213403
15571500699
64
67
96
77
74
59
58
50
68
70
63
38
57
65
80
76
65
33
60
99
59
52
64
41
30
19
36
15
65
0.005
489557785782577631321345013452
67951554813394915
1164713323
12865
134154644
1341613414
1344552261340813406
134098624
1287113407
525429769923131
134185250976
13401134281343813453
1343915730
9335248
1092710924
1342213403
15571500699
64
67
96
77
74
59
58
50
68
70
63
38
57
65
80
76
65
33
60
99
59
52
64
41
30
19
36
15
65
0.005
Abbildung 3-12: Phylogenetischer Baum der mit den Sequenzen des N-Gens erstelltwurde. Die Berechnung erfolgte mit der NJ-Methode. Die Bootstrap-Werte (1000Wiederholungen) der Verzweigungen sind angegeben.
75
Der Cluster A umfasste insgesamt 12 Isolate und konnte nochmals in die Untergruppen A1
und A2 unterteilt werden. Zur Gruppe A1 gehören 6 Isolate (4895, 5782, 5776, 5778, 3132
und 13450), von denen die Isolate 5782, 5776, 5778 und 3132 im N-Gen identische
Sequenzen hatten. Diese Isolate wurden zwischen 1999 und 2001 in Thüringen und Sachsen-
Anhalt erhalten, wobei entsprechend den Angaben zu den Fundorten die überwiegende
Mehrzahl aus einem eng begrenzten Gebiet im südlichen Sachsen-Anhalt und dem
angrenzenden Norden Thüringens stammte. Nur Isolat 13450 aus dieser Gruppe wurde aus
einer Fledermaus in Berlin isoliert. Die Untergruppe A2 setzte sich ebenfalls aus 6 Isolaten
(Labor-Nummer: 13452, 6795, 15548, 915, 11647 und 13394) zusammen, die fast alle ihren
Ursprung in den östlichen Bundesländern Sachsen, Brandenburg, Berlin und Mecklenburg-
Vorpommern hatten.
4895
5778
5782
5776
3132
13450
13452
6795
15548
13423
915
11647
0.0005
A1
A2
Abbildung 3-13: Cluster A: Geographischer Ursprung der Isolate und phylogenetischer Baum (Ausschnitt)
76
Die beiden südlichsten Isolate 6795 und 13452 unterschieden sich dabei von den restlichen
Mitgliedern dieser Gruppe. Die Ausnahme für den gesamten Cluster A stellt lediglich Isolat
915 dar, welches aus Niedersachsen stammte (Abbildung 3-13).
Fünf Isolate aus den nördlichen Bundesländern Schleswig-Holstein (Labor-Nummer: 13423,
13415, 13416), Hamburg (12865) und Mecklenburg-Vorpommern (4644) bildeten den
Cluster B. Innerhalb dieses Clusters waren die Isolate 13415, 13416 und 4644 enger
assoziiert. Die Darstellung der Herkunft der Isolate zeigt, dass diese drei Isolate auch
geographisch dicht beieinander liegen (Abbildung 3-14). Mit Isolat 12865 enthält dieser
Cluster das älteste aus Deutschland zur Verfügung stehende Isolat, welches im Jahr 1968 in
Hamburg aus einer infizierten Fledermaus isoliert wurde (WERSCHING und SCHNEIDER,
1969). Dieses Isolat ist identisch mit der VLA-Archivnummer RV9 (9395GER) und die
komplette Sequenz des Genoms ist unter der Zugangsnummer EF157976 in internationalen
Genbanken hinterlegt (MARSTON et al., 2007).
13394
12865
13415
4644
13416
0,0005
13394
12865
13415
4644
13416
0,0005
Abbildung 3-14 Cluster B: Geographischer Ursprung der Isolate und phylogenetischer Baum (Ausschnitt)
Der Cluster C setzt sich aus 12 Isolaten zusammen. Die Isolate 5226, 8624, 12871, 13406,
13407, 13408 und 13409 sind im Verhältnis zu den anderen Vertretern dieses Clusters
77
homogener und gruppieren sich unmittelbar nach der Verzweigung. Sie sind in den Jahren
zwischen 1983 (12871) und 2003 (8624) isoliert worden. Die restlichen Isolate dieses
Clusters stammen aus den Jahren 1998 bis 2000. Alle Isolate dieses Clusters stammen aus
dem Land Niedersachsen, wobei innerhalb dieses Bundeslandes eine regionale Häufung nicht
beobachtet werden konnte (Abbildung 3-15). Das Isolat 5226 ist das einzige bekannte EBLV-
Isolat aus einem Braunen Langohr (Plecotus auritus).
Abbildung 3-15: Cluster C: Geographischer Ursprung der Isolate und phylogenetischer Baum (Ausschnitt)
78
13418
5250
976
1340113428
13438
0,0002
Abbildung 3-16: Cluster D: Geographischer Ursprung der Isolate und phylogenetischer Baum (Ausschnitt)
Der Cluster D setzt sich aus 6 Isolaten aus den Bundesländern Schleswig-Holstein,
Niedersachsen und Nordrhein-Westfalen zusammen. Die Isolate stammen aus den Jahren
1986 (13418) und 1994 (5250). Während die Isolate 976, 13401, 13418 und 13428
geographisch mit der Nähe zur Nordseeküste assoziiert zu sein scheinen, stammen die beiden
anderen Isolate dieses Clusters eher aus im Süden Niedersachsens bzw aus dem Norden von
Nordrhein-Westfalen. Diese geographische Verteilung spiegelte sich allerdings nicht im
phylogenetischen Baum wider (Abbildung 3-16). Innerhalb dieses Clusters befinden zwei
Isolate, die aus einer Zwergfledermaus (Pipistrellus pipistrellus, Isolat 5250) und einer
79
Fransenfledermaus (Pipistrellus nathusii, Isolat 976) stammten. Beide Isolate liegen im
phylogenetischen Baum sehr dicht beieinander.
15730
933
5248
10927
10924
0,0005
Abbildung 3-17: Cluster E: Geographischer Ursprung der Isolate und phylogenetischer Baum (Ausschnitt)
Die Isolate 933, 5248, 10924, 10927 und 15730 bilden den Cluster E. Das Isolat 15730
befindet sich am ersten Ast innerhalb dieses Clusters mit einem Bootstrap-Wert von 52%.
Dieses Isolat stammt aus einer Breitflügelfledermaus aus Hartmannsdorf, Landkreis Dahme-
Spree, Brandenburg. Die Isolate 10924 und 10927 sind im phylogenetischen Baum eng
verwandt. Sie wurden im Jahr 2004 aus Fledermäusen im Nordosten Niedersachsens
(Landkreis Leer) isoliert. Bei den beiden weiteren Vertretern dieses Clusters handelt es um
Isolate aus Bremen (933) und aus dem Landkreis Stade (5248) aus den Jahren 2000
beziehungsweise 1993.
80
3.2.4 Alignment und Analyse der nicht-kodierenden NP-Region
Der nicht-kodierende Bereich zwischen N- und P-Gen umfaßt 90 Nukleotide. Bei zwei
Isolaten (3132, 5778) besteht dieser Abschnitt aus 91, bei zwei weiteren (5006, 15771) aus 95
Nukleotiden. Die zusätzlichen Nukleotide sind Insertionen in der Transkriptions-
Termination/Polyadenylationssignalsequenz (TTP) (Abbildung 3-18).
EF157976 AATTGGAAAGAAAAA------AA-CTAACACCACT5776 AATTGGAAAGAAAAA------AAACTAACACCACT3132 AATTGGAAAGAAAAA------AAACTAACACCACT5006 AATTGAAAAGAAAAAGAAAAAAA-CTAACACCACT 15571 AATTGAAAAGAAAAAGAAAAAAA-CTAACACCACT
Transkriptions-Terminations/
Polyadenylationssignalsequenz (TPP)Intergenische Region
Initiationssignalsequenz
Abbildung 3-18: Alignment von ausgewählten Isolaten in der NP-Region mit dem Isolat Sequenz des Hamburger Isolates (GenBank EF157976) als Referenz. Die Transkriptions-Termination/Polyadenylationssignalsequenz (TPP) und die Initiationsequenz für die Transkription des nachfolgenden P-Gens sind grau hinterlegt. Zwischen diesen beiden Motiven befindet sich die intergenische Region (IGR).
Innerhalb des Subtyps EBLV-1a wurde als Maß der genetischen Distanz eine mittlere p-
Distanz von 0,0041 berechnet. Von 6 variablen Positionen lagen 5 N-terminal, während sich
nur eine einzige variable Position P-terminal befand. Die mittlere p-Distanz innerhalb des
Subtyps EBLV-1b betrug 0,0222, wobei die 4 ermittelten variablen Positionen alle innerhalb
des N-terminalen Bereiches lagen. Die Analyse mittels der NJ-Methode zeigte wie im N-Gen
ebenfalls eine Auftrennung der Isolate in die zwei Subtypen EBLV-1a und EBLV-1b. Die
Sequenzen der Isolate 5782, 5778, 5776 und 3132 sowie das Isolat 4895 wurden innerhalb des
Subtyps EBLV-1a getrennt gruppiert (Abbildung 3-19). Die Isolate 15571 und 5006 des
Subtyps EBLV-1b sind in diesem Abschnitt identisch, unterscheiden sich aber von Isolat
13403.
81
Abbildung 3-19: Phylogenetischer Baum berechnet mit NJ-Methode mit Sequenzen der NP-Region (90nt). Schwarzes Dreieck: übrige Vertreter (N=40) des Subtyps EBLV-1a mit identischen Sequenzen. Die Bootstrap-Werte (1000 Wiederholungen) sind an den entsprechenden Ästen aufgeführt.
5782 5776 5778 3132
4895
EBLV-1a
13403 15571 5006
EBLV-1b
66
9844
52
42
0.005
82
3.2.5 Analyse der GL-nicht-kodierenden Region
Mit Ausnahme eines Isolates umfasst der GL-nicht-kodierende Bereich bei allen untersuchten
EBLV-1 Isolaten 560 bp. Nur bei Isolat 5782 aus einer Fledermaus (Spezies unbekannt) aus
der Gemeinde Horburg-Maßlau, Kreis Merseburg-Querfurt, Sachsen-Anhalt besitzt dieser
Bereich eine Länge von 525 bp, die die Folge einer Deletion von 35 Nukleotiden an Position
5319-5353 des Genoms ist (Abbildung 3-20).
Abbildung 3-20: Alignment ausgewählter Sequenzen eines Bereiches der GL nicht-kodierenden Region. Die 35 nt-Deletion in der Sequenz von Isolat 5782 ist hervorgehoben und die Position in Bezug zur Sequenz EF157976 angegeben.
Innerhalb der EBLV-1a Gruppe gab es in diesem Abschnitt 52 variable Positionen. Die
berechnete mittlere genetische Distanz (p-Distanz) war 0.0095. Die drei Isolate der EBLV-1b
Gruppe unterschieden sich in 27 Positionen mit einer durchschnittlichen p-Distanz von
0.0333. Die Verteilung dieser Positionen in diesem Bereich war nicht gleichmäßig, sondern
ein Bereich mit wenigen Austauschen im Zentrum ist flankiert von Abschnitten mit deutlich
mehr Austauschen (Abbildung 3-21). Mit Ausnahme des ersten Abschnitts und des Abschnitts
von Position 421-480 unterschieden sich die beiden Subtypen 1a und 1b kaum in der
Verteilung.
83
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1-60 61-120 121-180 181-240 241-300 301-360 361-420 421-480 481-540 541-560
Abschnitt im GL-Bereich
Anza
hl v
aria
bler
Pos
ition
en
EBLV1aEBLV1b
Abbildung 3-21: Vergleich der Anzahl variabler Positionen in verschiedenen Abschnitten des GL-Bereiches zwischen EBLV-1a und EBLV-1b
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
0,04
N NP GL
Untersuchte Genabschnitte
p-W
erte
(Dur
chsc
hnitt
)
EBLV-1aEBLV-1b
Abbildung 3-22: Vergleich der durchschnittlichen p-Distanzen der untersuchten Genabschnitte der Subtypen EBLV-1a und 1b. Die Ergebnisse basieren auf dem paarweisen Vergleich der Sequenzen (500 Wiederholungen)unter Verwendung von Jukes-Kantor-Algorithmen. Die jeweiligen Konfidenzgrenzen sind angegeben.
84
3.2.5.1 Phylogenetische Analyse der Sequenzen des GL-Bereichs und Vergleich mit dem N-Gen
Die phylogenetische Analyse der Sequenzen des GL-Bereichs der untersuchten EBLV-Isolate
führte zur einer Topologie, die in Abbildung 3-23 dargestellt ist. Auffällig ist die Struktur des
phylogenetischen Baumes, der eine Zweiteilung aufweist und auch hier die Unterscheidung in
die Subtypen EBLV-1a und -1b zulässt. Innerhalb des Subtyps EBLV-1b sind die Isolate
5006 und 15571 näher verwandt als das dritte existierende Isolat 13403. Der Subtyp EBLV-1a
zeigte einen homogenen Aufbau mit wenigen Abzweigungen. Die größte separate Gruppe
innerhalb dieses Subtyps stellten Isolate dar, welche mehrheitlich in der Analyse des N-Gens
als Cluster A klassifiziert wurden. Mit dem Isolat 3131 gruppierte sich allerdings auch ein
Vertreter des Clusters C in diesen Hauptast. Die Unterteilung in die Untergruppen A1 und A2
war bei beiden Bäumen (N-Gen und GL-Bereich) vergleichbar. Eine weitere Gruppe von
Isolaten, die sich abgrenzten, sind die als Cluster B identifizierten Isolate. Vom Hauptast
dieser Gruppe zweigte das Isolat 933 ab, welches in der Gruppierung im N-Gen zum E-
Cluster gerechnet wurde.
Von den 6 Isolaten, welche als Cluster D identifiziert wurden, stellten nur 4 (976, 5250,
13401 und 13428) einen separaten Ast innerhalb des phylogenetischen Baumes dar. Die
beiden anderen Isolate positionieren sich entweder separat (13438) oder sind identisch mit
einem anderen, nicht klassifizierten Isolat (13418 mit 13439). Die drei Isolate 10924, 10927
und 15730 bilden einen separaten Ast und entsprechen dem Cluster E. Als weiteres Isolat
dieses Clusters im N-Gen stellte Isolat 933 insofern eine Ausnahme dar, als dass es näher mit
Cluster B assoziert schien. Die übrigen Isolate, die entweder nicht klassifiziert wurden oder
dem Cluster C oder D zugehörig sind, können anhand der Topologie des GL-Baumes nicht
gruppiert werden.
Die phylogenetische Analyse sowohl der N-Gensequenz, der NP-Region als auch des GL-
Bereiches lässt eine Differenzierung in die Subtypen EBLV-1a und -1b zu. Die Etablierung
von Clustern, wie sie anhand der Analyse des N-Gens erfolgte, kann im Wesentlichen im GL-
Bereich bestätigt werden. Größte Übereinstimmungen gibt es dabei in der als Cluster A
85
bezeichneten Gruppe von Isolaten. Auch die Einteilung in die Untergruppen A1 und A2 ist
zwischen den beiden Genabschnitten konsistent. Allerdings gibt es einige Isolate, die mit den
Sequenzen im GL-Bereich anders gruppiert werden als mit denen des N-Gens.
86
Abbildung 3-23: Phylogenetischer Baum mit den Sequenzen des GL-NTR mittels NJ-Methode. Bootstrap-Werte (1000 Wiederholungen) sind angegeben. Die Beschriftung der Isolate bezieht sich auf die Einteilung anhand des N-Gens.
915 15548 11647 7695 13423 13452
A 2
13445C 3131
3132 4895
5778 5782
A 1
A 1 5776A 1 13450
C 12871 E 933
4644 13415. 13416
13394 12865
B
C 8624 976 5250 13401
13428
D
C 5185C 13409
13453C 5254
D 13438C13407
13414C13406
13422D13418
13439C 13408
C5226C 2976
1092410927
15730E
E5248E10925
13403500615571 EBLV-1b99
23
19
88
64
87
91
67
463662
83
87
4399
65
50
45
44
66
65
39
8
27
0.005
87
3.2.6 Analyse der Aminosäuresequenz des N-Proteins
Die aus den Sequenzdaten abgeleitete Aminosäuresequenz des Nukleoproteins zeigte nur
geringe Unterschiede zwischen den Isolaten. Die Positionen der Austausche und Isolate sind
in Tabelle 3-9 dargestellt. Im Vergleich zur Sequenz des Referenzisolates Hamburg (1968)
haben 11 Vertreter des Subtyps von EBLV-1a Aminosäureaustausche. Die Isolate 13428 und
13438 zeigen an zwei unterschiedlichen Positionen Austausche, während die übrigen Isolate
nur einen Austausch aufweisen. Zwischen der Referenzsequenz und den drei Vertretern des
Subtyps EBLV-1b sind 7 Aminosäureaustausche im N-Gen nachweisbar, wobei die Isolate
auch innerhalb des Subtyps an fünf Positionen Unterschiede zeigen.
Tabelle 3-9: Aminosäureaustausche im Vergleich zu Referenzisolat Hamburg (1968, EF157976). Grau hinterlegte Isolate entstammen dem Subtyp 1b
Position Aminosäure Isolat-Nr.
5 K>R 15571, 5006
18 R>K 15571, 5006, 13403
51 T>S 13403
67 S>P 13423
87 E>K 13438, 13428
111 I>V 15571
112 H>N 15571, 5006,13403
131 D>E 13403
132 P>S 13403
175 T>I 8624
176 A>P 13415
262 H>Q 2976
418 R>S 992, 3131
448 S>N 5250, 13428, 13438, 13401, 976
88
Mit den AS-Sequenzen des N-Proteins wurde eine phylogenetische Analyse durchgeführt. Für
die Berechnung des NJ-Baumes wurde bei identischen Sequenzen nur eine ausgewählt
(12865). Wie in Abbildung 3-24 zu erkennen, sind die beiden Subtypen EBLV-1a und 1b mit
einem Bootstrap-Wert von 87 deutlich voneinander zu unterscheiden. Vom Hauptast zweigt
innerhalb des Subtyps EBLV-1a ein weiterer Ast mit den Isolaten 976, 5250 und 13401
(Niedersachsen). Die Isolate 13428 (Aurich, NI) und 13438 (Harsewinkel, NW) scheinen
innerhalb dieses Subtyps am weitesten phylogenetisch von den übrigen Isolaten entfernt zu
sein.
Abbildung 3-24: Phylogenetischer Baum, der mit den Aminosäresequenzen den N-Proteins erstellt wurde. Die Berechnung erfolgte mittels NJ-Methode. Die Bootstrap-Werte (1000 Wiederholungen) der Verzweigungen sind angegeben.
13428
13438
13401
976
5250
12865
2976
13394
8624
EBLV-1a
13403
15571
5006
EBLV-1b
0.001
71
67
87
72
89
3.2.7 Nachweis von EBLV-2 in Deutschland
3.2.7.1 RT-PCR- Ergebnis und Sequenzvergleich
Eine am 24.08.2007 an das NRL übersandte Hirnprobe (Lab. Nr.16618) einer mittels IFT
positiv auf Tollwut getesteten Fledermaus aus Bad Buchau, Landkreis Biberach, Baden-
Württemberg, ergab in der diagnostischen RT-PCR ein Amplifikat, das auf das Vorliegen
einer Infektion mit EBLV-2 schließen ließ.
Abbildung 3-25: Elektropherogramm der RT-PCR für EBLV-2 (links) und EBLV-1 (rechts) der Probe 16618. Ein 270 nt großes Fragment spezifisch für EBLV-2 wurde amplifiziert.
Um das Ergebnis der RT-PCR zu bestätigen, wurden die ersten 400 nt des N-Gens
sequenziert (nach JOHNSON et al., 2003) und mit Sequenzen von Lyssavirusisolaten anderer
Genotypen verglichen. Dabei konnte eine Übereinstimmung von 72,7 % mit Sequenzen von
klassischen Tollwutviren (GT 1) (Fuchsvariante, Deutschland), beziehungsweise von 73,0 %
(SAD B19) festgestellt werden. Der Sequenzvergleich mit einem EBLV-1 Isolat (GT 5) aus
Deutschland ergab eine Identität von 72,2 %, während ein EBLV-2 Isolat (GT 6) aus der
Schweiz zu 97,2 % übereinstimmte (Abbildung 3-26).
90
Abbildung 3-26: Alignment des Isolates 16618_Ger mit EBLV-2 (N9337_SWI, Gen Bank: AY863407 ), EBLV-1 (RV9_GER, Genbank: EF 157976), einem Impfvirusstamm für die orale Immunisierung (SAD B19, Genbank: EF206709 ) und einer Fuchsvariante aus Deutschland (RV313_GER, Genbank: AY062070)
Die phylogenetische Untersuchung basierend auf einem Vergleich der 400 nt langen Sequenz
mit bereits veröffentlichten EBLV-Sequenzen zeigte, dass sich das Isolat 16618_GER
innerhalb des GT 6 (EBLV-2) gruppiert, während GT 5 (EBLV-1) als Outgroup fungiert
(Abbildung 3-27).
91
Die EBLV-2-Sequenzen erschienen als heterogene Gruppe, wobei die Isolate aus den
Niederlanden (9018HOL, 94112HOL, 9375HOL) sowie ein Isolat aus Finnland (N9007FIN)
separate Untergruppen darstellten.
Abbildung 3-27: Phylogenetischer Baum berecht mit NJ-Methode mit Sequenzen eines 400 nt Fragmentes des N-Gens. EBLV-1 RV9 GER fungiert als Outgroup. Bootstrap-Werte sind angegeben.
Isolat Genotyp Land Ort Spezies GenBank
16618 GER EBLV-2 Deutschland Bad Buchau M. daubentonii
02053 SWI EBLV-2 Schweiz NA ? AY863408
RV 1333 EBLV-2 VK Angus Human AY247650
9337 SWI EBLV-2 Schweiz Versoix M. daubentonii AY863407
9375 HOL EBLV-2 Niederlande Roden M. dasycneme AY863404
94112 HOL EBLV-2 Niederlande Andijk M. dasycneme AY863405
9018 HOL EBLV-2 Niederlande Wommels M. dasycneme AY863403
9007 FIN EBLV-2 Finnland Helsinki Human AY863406
RV 9 GER EBLV-1 Deutschland Hamburg ? EF 157976
92
3.2.7.2 Speziesbestimmung der EBLV-2 positiven Fledermaus
Die zur Untersuchung gelangte Fledermaus wurde von Fledermaussachverständigen aufgrund
morphologischer Kriterien als Wasserfledermaus identifiziert (DIETZ und VON
HELVERSEN, 2004). Der Sequenzvergleich eines 705 nt großen Fragments des
CytochromB-Gens der EBLV-2 positiven Fledermaus (Labornummer 16626) mit einer in
GenBank veröffentlichten Sequenz von Myotis daubentonii (EU153125.1) ergab eine
Übereinstimmung von über 99 %. 10 20 30 40 50 60 70
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |ACATCAGACaCCGCAACAGCCTTTAACTCAGTCACCCATATTTGTCGAGACGTAAACTACCGCTGAATTC 16626............................................................G.......CT EU153125
80 90 100 110 120 130 140. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |TACGCTACCTACATGCAAACGGAGCCTCCATATTTTTAATTTGCCTATACCTCCATGTAGGACGAGGTCT 16626.....................................T................................ EU153125
150 160 170 180 190 200 210. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |TTATTATGGCTCCTACCTATATACAGAAACTtGAAACGTTGGAGTtATCCTGCTAaTTGCTGTAATAGCT 16626.......................................................T.............. EU153125
220 230 240 250 260 270 280. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |ACAGCCTTTATAGGATACGTACTTCCATGAGGCCAAATATCCTTCTGAGgAGCaACTGTAAtTACTaATC 16626...................................................................... EU153125
290 300 310 320 330 340 350. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |TcCTATCTGCaATcCCATATATTgGCACAGACCTTGTAGAATGAATTTGAGGCGGCTTTTCCGtTGATAA 16626..T................................................................... EU153125
360 370 380 390 400 410 420. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |GGCCACCCTAACTCGATTTTtCGCCTTCCACTTTCTACTGCCATTCATCAtTGCAGCTATAGTTATAGTA 16626...................................................................... EU153125
430 440 450 460 470 480 490. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |CATCTCTTAtTTCTTCATGAAACAGGATCTAACAACCCAATAGGAATTCCCTCTGACACAGATATAATTC 16626...................................................................... EU153125
500 510 520 530 540 550 560. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |CATTCCACCCTTACTACACAATTAAAGACATTCTTGGCCTTCTACTAATAATTATAGCACTACTATTATT 16626...................................................................... EU153125
570 580 590 600 610 620 630. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |AGTACTATTCTCCCCCGATATACTGGgAGACCCCGATAATTACACACCAGCAAATCCACTAAATACCCCA 16626...................................................................... EU153125
640 650 660 670 680 690 700. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |CCTCATATTAAACCAGAATGATATTTTCTATTCGCATACGCAATCCTACGATCAATTCCAAATAAATTAG 16626...................................................................... EU153125
Abbildung 3-28: Alignment der partiellen CytochromB-Sequenz der Fledermaus (Lab.-Nr.16626) mit der entsprechenden Sequenz einer Myotis daubentonii veröffentlicht in der Genbank (EU153125.1)
93
4 DISKUSSION
Mit 120 Isolaten verfügt das Virusarchiv des NRL über eine beachtliche Sammlung von
EBLV-Isolaten. Wichtige Voraussetzung zur Selektion einer repräsentativen Auswahl von
Fledermaustollwutvirusisolaten waren die Verfügbarkeit von Daten, wie Jahr der Isolierung,
die Spezies und der geographische Ursprung. Diese Daten sind für die Darstellung der
Tollwutfälle mithilfe geographischer Informationssysteme notwendig. Die hier gewählte
Herangehensweise zur Auswahl der Isolatel mit Hilfe des Raster-basierten Verfahrens
gewährleistete, dass die räumliche Verteilung aller verfügbaren Isolate berücksichtigt wurde,
und somit auch die real zirkulierenden Virusvarianten widerspiegelte. Ein Random sampling,
bei dem aus der Anzahl der zur Verfügung stehenden Isolate eine Menge beliebig ausgewählt
wird, wäre bei der vorliegenden EBLV-Isolatesammlung nicht sinnvoll gewesen, da wichtige
Informationen, wie die zum geographischen Ursprung, unberücksichtigt geblieben wären.
Wäre die Auswahl nach dem Kriterium der Zugehörigkeit in administrative Einheiten erfolgt,
so hätte dies zu einer Vorselektion geführt. Würden beispielsweise nur 5 Isolate pro
Bundesland ausgewählt, wäre zwar gewährleistet, dass in Bundesländern mit geringer Anzahl
von Isolaten diese berücksichtigt worden wären, jedoch würden dann in Flächenländern mit
einer größeren Anzahl von Isolaten, wie Niedersachsen, alle Isolate möglicherweise nur aus
einer begrenzten Region stammen.
Die Sequenzierung und die anschließende phylogenetische Analyse der gewonnenen Daten
sind ein Beitrag zur Charakterisierung und Differenzierung von
Fledermaustollwutvirusisolaten aus Europa. Die Typisierung mittels monoklonaler Antikörper
und RFLP konnten EBLV-Isolate bislang nur grob in die Genotypen 5 und 6 einteilen. Zudem
sind die Ergebnisse auf der Basis von mAKs, die gegen das Glykoprotein gerichtet sind, nicht
konsistent (BOURHY et al., 1992; RUPPRECHT et al., 1991).
Wie im Abschnitt 2.6.2 beschrieben, wurden bisher zur genetischen Charakterisierung von
EBLVs verschiedene Genabschnitte verwendet. Um einen zukünftigen Vergleich mit
veröffentlichten Sequenzen in der Genbank zu gewährleisten, wurde zunächst der in
phylogenetischen Studien bei Lyssaviren am häufigsten verwendete Genabschnitt, das N-Gen,
untersucht. Zusätzlich wurde auch der N-P Übergangsbereich untersucht, da die am NRL für
94
Tollwut etablierte, diskriminierende diagnostische RT-PCR für EBLV-1 und -2 ebenfalls
diesen Bereich als Zielsequenz nutzt und Sequenzdaten vorliegen (MÜLLER et al., 2007;
VOS et al., 2004b). Dementsprechend wurden das komplette N-Gen und der
Übergangsbereich zum Phosphoproteingen zur Sequenzierung ausgewählt. Das N-Gen gilt
genotypübergreifend als besonders konserviert (MARSTON et al., 2007; KUZMIN et al.,
2005), wogegen der GL- nicht-translatierte Bereich bei GT1 variabler ist (SACRAMENTO et
al., 1992). Da diese Region bisher nicht Bestandteil phylogenetischer Studien mit EBLVs,
sondern nur bei RABV (GT1) war (vgl. Abschnitt 2.6.2), wurde dieser Bereich herangezogen,
um zu überprüfen, ob er für eine weitere Feindifferenzierung von EBLV-Isolaten geeignet ist.
Die Sequenzanalyse des N-Gens der EBLV-1-Isolate aus Deutschland bestätigte
vorangegangene Studien (MÜLLER et al., 2007; DAVIS et al., 2005; AMENGUAL et al.,
1997), wonach dieser Bereich eine hohe Sequenzidentität und genetische Stabilität aufweist.
Dennoch konnten geringe genetische Unterschiede festgestellt werden, die eine eindeutige
Unterscheidung in die Subtypen EBLV-1a und -1b erlauben. Isolate des Subtyps EBLV-1b
wiesen eine mehr als fünffach größere Variabilität auf, als die des Subtyps EBLV-1a. Damit
werden Ergebnisse von DAVIS (2005) bestätigt. Bei beiden Gruppen war eine Häufung der
variablen Positionen innerhalb des N-terminalen Abschnitts des N-Gens feststellbar
(Abbildung 3-3 und 3-4). Bezogen auf die Aminosäuresequenzunterschiede bestätigte sich
diese Beobachtung für alle untersuchten EBLV-1-Isolate (Tabelle 3-9). Somit entsprechen die
Ergebnisse weitestgehend denen einer anderen Studie, die Lyssaviren aus sechs
verschiedenen Genotypen im N-Gen vergleichend untersuchte, und zeigte, dass der mittlere
Abschnitt eher konserviert ist. Die für die amino- und karboxyterminalen Enden des für das
N-Protein kodierenden Genabschnittes sind dagegen variabler (KISSI et al., 1995).
Beim Vergleich der N-Gen-Sequenzen von EBLV-1a und -1b ist ein variabler Bereich
interessant, der sich als Marker für die Differenzierung beider Subtypen eignen könnte
(Abbildung 3-5). Die Sequenzunterschiede um Position 335 des N-Gens könnten Zielsequenz
von Subtyp-spezifischen Primern einer differenzierenden RT-PCR sein. Weiterhin wäre es
möglich, ein Restriktionsenzym so auszuwählen, das es an dieser Position spezifisch nur das
Genom eines Subtyps schneidet und so zur Unterscheidung mittels RFLP herangezogen
werden könnte. Diese Region könnte auch als Zielsequenz für eine Subtyp-spezifische Sonde
95
bei der Etablierung eines differenzierenden realtime-RT-PCR-Assays genutzt werden. Vorteil
einer solchen Herangehensweise wäre die unmittelbare Diagnose von EBLV-1 und zudem die
Unterscheidung der Subtypen 1a oder 1b.
Die phylogenetische Analyse basierend auf den kompletten N-Gen-Sequenzen zeigte, dass
weitere EBLV-1b-Varianten in Deutschland vorkommen. Auch die Abgrenzung der beiden
Subtypen EBLV-1a und -1b voneinander wurde bestätigt. Es wurde postuliert, , dass die
Virusübertragung bzw. der Austausch von Virusvarianten zwischen Fledermauspopulationen
innerhalb Europas über weite Strecken erfolgt (DAVIS et al., 2005). Die in dieser Arbeit
gefundene Gruppierung von EBLV-Isolaten in die Cluster A - E und deren eindeutige
geographische Zuordnung lieferte jedoch Indizien, dass die Existenz charakteristischer
genetischer EBLV-Varianten mit deren Vorkommen in bestimmten geographischen Regionen
innerhalb Deutschlands assoziiert ist (Abbildung 3-1). Ähnliche Beobachtungen wurden in
den Niederlanden gemacht (VAN DER POEL et al., 2005). Da die genetische Distanz in
direktem Zusammenhang zur geographischen Entfernung der EBLV-1-Isolate untereinander
stand (Abbildung 3-7), könnte dies darauf hindeuten, dass die Virustransmission innerhalb der
Breitflügel- bzw. anderer Fledermauspopulationen viel engräumiger, d. h. innerhalb geringer
Entfernungen abläuft, als bisher angenommen wurde. Ausnahmen von dieser Beobachtung
bilden die Isolate 915 und 15730 aus den beiden Clustern A und E im Osten beziehungsweise
Nordwesten Deutschlands, deren Ursprung jeweils weit von den restlichen EBLV-Isolaten
dieser Cluster entfernt ist. Eine mögliche Erklärung für diese Abweichung könnte das
Migrationsverhalten der Reservoirspezies Eptesicus serotinus liefern. Breitflügelfledermäuse
werden generell als sehr ortstreu eingeschätzt (PETERSEN et al., 2004). Auswertungen von
Beringungsaktionen in Deutschland zeigten, dass Tiere dieser Spezies nur einen sehr geringen
Aktivitätsradius haben. In seltenen Fällen sind wurden aus Brandenburg stammenden
Breitflügelfledermäuse in Niedersachsen gefunden (HUTTERER et al., 2005).
Die Untersuchungsergebnisse belegen weiterhin einen statistisch gesicherten Zusammenhang
zwischen der Nukleotidsequenzdivergenz und dem Zeitraum, der zwischen der Isolierung
einzelner Isolate von EBLV-1a liegt (Abbildung 3-7). Allerdings weisen alle untersuchten
Isolate weniger als 10 Unterschiede innerhalb der 1356 bp der Nukleotidsequenz des N-Gens
auf, so dass zwar von einem Zusammenhang ausgegangen werden kann, die Relevanz für die
Divergenz aber als gering einzuschätzen ist. Bei ähnlichen Untersuchungen konnte
96
AMENGUAL (1997) bei Isolaten aus Deutschland und den Niederlanden keinen linearen
Zusammenhang zwischen dem Zeitpunkt der Isolierung und der Zahl an Substitutionen
herstellen.
Da die Evolution unter dem Einfluss der Zeit steht, wird die molekulare Uhr („molecular
clock theory“) auf viele phylogenetische Datensätze angewandt, obwohl die Grundannahme,
dass die Mutationsrate identisch für alle untersuchten Individuen ist, gar nicht erfüllt wird
(HOLDER und LEWIS, 2003). So ist gerade die Validität solcher auf dieser Theorie
basierenden Modelle für RNA-Viren umstritten (HOLMES, 2003). Auch reicht die zeitliche
Spanne, welche die vorliegende Studie innerhalb der Virusevolution von EBLV-1
repräsentiert, kaum aus, um Ableitungen über den Zeitpunkt der Aufspaltung bestimmter
Subtypen zu machen.
Die große Sequenzidentität innerhalb der EBLV-1a-Gruppe birgt die Gefahr in sich, dass
schon geringfügig fehlerhafte Sequenzen zu falschen Schlussfolgerungen hinsichtlich der
phylogenetischen Verwandtschaft zwischen den Isolaten führen können (CLARK und
WHITTAM, 1992). Obwohl die Sequenzierung von Virusgenom aus Originalmaterial
erstrebenswert ist, da die Wahrscheinlichkeit sehr hoch ist, dass durch die Amplifizierung
mittels RT-PCR und anschließender Sequenzierung vorrangig die Konsensussequenz der
dominanten Quasispezies nachgewiesen wird, konnte dies nur in wenigen Ausnahmen
durchgeführt werden. Im Allgemeinen wird davon ausgegangen, dass RNA-Viren aufgrund
von hohen Mutationsraten und einer fehlenden Fehlerkorrekturfunktion (proofreading) der
Polymerase als heterogene Populationen auftreten (DOMINGO und HOLLAND, 1997;
DRAKE, 1993). Diese sogenannten Quasispezies bestehen unter konstanten
Umweltbedingungen aus einem Pool von Viren mit verwandten aber teilweise oft hohen
heterologen Genomen, wobei eine stabile Spezies hiervon dominant auftritt (KISSI et al.,
1999; MORIMOTO et al., 1998). Eine Adaptation an neue Umweltbedingungen kann somit
schnell erfolgen, da lediglich jeweils angepasste Mutanten selektiert werden müssen
(MORIMOTO et al., 1998). Durch die Zellkultur-Passage der Original-Gehirnsuspension
könnte ein genetischer Flaschenhals („genetic bottleneck“) auftreten, wodurch diejenige
Subpopulationen einen Selektionsvorteil erlangen, die am besten an das Wachstum in der
ausgewählten Zellkultur adaptiert ist und sich demzufolge in der Nukleotidsequenz von der
dominanten Linie unterscheiden (LI und ROOSSINCK, 2004).
97
Für die Existenz derartiger Quasispezies und den Einfluss der Passagierung auf die Sequenz
des Genoms gibt es für EBLV-1 kaum Belege, zumal EBLV-1 innerhalb der RNA-Viren eine
niedrige Mutationsrate aufweisen (DAVIS et al., 2005). Indiz für die Stabilität ist auch die
Tatsache, dass Isolate, die mit dem Isolat 12865 aus Hamburg aus dem Jahr 1968 identisch
sind, in verschiedenen Instituten (Institut Pasteur, Paris, Frankreich; AY062082 und VLA,
Weybridge, Vereinigtes Königreich, AY863348) unabhängig voneinander in Zellkulturen
und/oder Mäusen angezüchtet und später sequenziert worden sind, ohne dass Mutationen zu
erkennen waren. Lediglich bei Sequenzanalysen von Fledermaustollwutvirusisolaten aus
Frankreich wies ein in der Zellkultur passagiertes EBLV-1-Isolat eine durch wenige
Mutationen charakterisierte unterschiedliche Nukleotidsequenz im Vergleich zum Virus aus
dem Hirnmaterial auf (PICARD-MEYER et al., 2004a).
Die Anzucht und Passage hatte auch bei GT1 scheinbar keinen Einfluss auf die
Nukleotidsequenz. So konnte KISSI (1999) keine Mutationen nach serieller Passage eines
Fuchsvirusisolates (RABV) in Mäusen nachweisen. Auch für Zellkultur-adaptierte RABV-
Stämme ist eine ähnlich hohe genetische Stabilität nach mehreren Passagen nachgewiesen
worden (BECKERT et al., 2008; MEBATSION et al., 1996b).
Die Virusisolierung und –vermehrung von EBLVs in der Zellkultur ist zudem für die
Archivierung sowie für weitere wissenschaftliche Studien unerlässlich, da das zur Verfügung
stehende Gehirn der europäischen Fledermäuse nur ein geringes Volumen besitzt. Durch
Wiederholungs bzw. Bestätigungstests in der Routinediagnostik kann oft das gesamte
Hirnmaterial aufgebraucht sein, so dass für weiterführende Untersuchungen kaum
Möglichkeiten bestehen. Da auch die längerfristige Aufbewahrung von extrahierter Virus-
RNA durch physikalische und chemische Prozesse negativ beeinträchtigt werden kann, ist die
Virusisolierung und –vermehrung in der Zellkultur durch keine andere Methode ersetzbar.
Auch die intrakraniale Inokulation von Mäusen (Mausinokulationstest, MIT), birgt
hinsichtlich des Selektionsdruckes die gleichen Risiken und stellt nicht zuletzt aus Gründen
des Tierschutzes keine sinnvolle Alternative dar (ANON., 2008).
Die RT-PCR kann für fehlerhafte Sequenzen eine Ursache darstellen, da die verwendeten
Enzyme MMLV-reverse Transkriptase und die Taq-Polymerase eine gewisse Fehlerrate
aufweisen (BRACHO et al., 1998). Dementsprechend wird für die Sequenzierung von RNA-
98
Viren und deren Quasispezies eine DNA-Polymerase mit Fehlerkorrekturfunktion
(Proofreading) empfohlen (MALET et al., 2003). Die in dieser Studie eingesetzte
Platinum®Taq-DNA-Polymerase entspricht dieser Forderung, denn sie ist ein Gemisch
mehrerer Polymerasen, wobei die Pyrococcus-GB-D-Polymerase eine Proofreading-Funktion
besitzt. Fehler sind durch diesen Amplifikationsschritt folglich kaum zu erwarten. Durch die
direkte Sequenzierung von PCR-Produkten ohne vorheriges Klonieren wurde zudem
vermieden, dass etwaige Polymerasefehler doch zu fehlerhaften Sequenzen führen.
Eine weitere Quelle für inkorrekte Sequenzen könnte das Einlesen der Nukleotidsequenzen in
der Sequenziermaschine sein. Alle untersuchten Genabschnitte eines Isolates werden daher
sowohl vorwärts als auch rückwärts überlappend sequenziert und eingelesen, um Lesefehler
zu erkennen. Dabei werden die Nukleotidsequenzen fortlaufend mit einer Referenzsequenz
verglichen und variable Positionen gesondert notiert. Vor dem Fertigstellen wurden alle
Teilsequenzen eines Isolates zusammengeführt und verglichen, wobei bei auftretenden
Unstimmigkeiten die Sequenzierung wiederholt wurde. Gegebenenfalls wurde ein neues RT-
PCR-Produkt hergestellt, um die Sequenzierung zu optimieren. Trotz aller
Vorsichtsmassnahmen ist das Auftreten von Sequenzierfehlern nicht gänzlich auszuschließen,
kann aber bei sorgfältiger Arbeit auf etwa 1/10000 Nukleotide herabgesetzt werden, wodurch
der Einfluss dieser Fehler auf die Analyseergebnisse nicht mehr relevant ist (CLARK und
WHITTAM, 1992).
Ein Beleg für die Genauigkeit der Sequenzen ist der statistisch signifikante Zusammenhang
zwischen geographischer und genetischer Distanz der untersuchten EBLV-1 Isolate
(Abbildung 3-7 Abbildung 3-8). Beim zufälligen Auftreten von Sequenzierfehlern, die zu
falschen Nukleotidaustauschen geführt hätten, wäre eine statistisch belegte Abhängigkeit
nicht mehr nachweisbar gewesen.
Für die phylogenetische Analyse der Sequenzdaten stehen eine Vielzahl von Methoden und
Programmen zur Verfügung. Da die Neighbour-Joining-Methode bei wenigen variablen
Merkmalen Vorteile besitzt und zudem eine sehr schnelle Datenverarbeitung erlaubt
(HOLDER und LEWIS, 2003), wurde sie in diesem Fall ausgewählt. Andere Algorithmen
wurden in dieser Arbeit nicht berücksichtigt, da bei verschiedenen Studien zur Phylogenie bei
Lyssaviren festgestellt worden ist, dass sich die Topologie der phylogenetischen Bäume
99
zwischen den verwendeten Methoden nicht unterschied (METLIN et al., 2007; FRANKA et
al., 2006).
Die hohe Identität der Nukleotidsequenzen im N-Gen spiegelt sich bei den abgeleiteten
Aminosäuresequenzen wider. Innerhalb des Subtyps EBLV-1a und -1b konnten verglichen
mit dem Referenzisolat 12865 jeweils 7 variable Positionen ermittelt werden (Tabelle 3-9).
Das Clustering, welches mit den AS-Sequenzen des N-Gens gefunden wurde, korreliert mit
der Einteilung auf Basis der N-Gen-Sequenzen nur bedingt (Abbildung 3-24). Während die
Isolate 976, 5250, 13401, 13428 und 13438 aus dem Cluster E einen gemeinsamen
Aminosäureaustausch aufweisen und eine Extragruppe darstellen, ist die abgeleitete AS-
Sequenz der Mehrzahl der EBLV-1a-Isolate im Vergleich zur Referenzsequenz (Isolat 12865)
identisch. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass es innerhalb der zirkulierenden EBLV-1a-
Viruspopulation zwar zu Mutationen kommt, die sich in der Nukleotidsequenz und somit
auch in der Phylogenie manifestieren und geographisch zugeordnet werden können, allerdings
meist aus stillen Mutationen bestehen.
Vielmehr deutet die relativ geringe Rate von nicht-synonymen Mutationen darauf hin, dass
die Proteine einem starken Selektionsdruck ausgesetzt sind. Zudem befinden sich die
Aminsäureaustausche ausnahmslos an Positionen (Tabelle 3-9), bei denen ein Einfluss auf die
antigenen Eigenschaften bisher nicht nachgewiesen wurden (Siehe Absatz 2.5.1). Folglich
dürften sich die EBLV-1a Isolate der Cluster A-E kaum in ihren biologischen Eigenschaften
unterscheiden.
Vergleichende Studien an RABV-Isolaten zeigten, dass der N-P-nicht-translatierte Bereich im
Gegensatz zum N-Gen variabler ist (KISSI et al., 1995). In der vorliegenden Arbeit konnten
jedoch bei den untersuchten Isolten nur wenige Sequenzunterschiede in diesem Bereich
identifiziert werden. Zwar war die Analyse dieses Genabschnittes ausreichend, um zwischen
den Subtypen EBLV-1a und -1b zu differenzieren, jedoch erlaubte die phylogenetische
Analyse mit den 90 nt-langen Sequenzen nicht die Differenzierung in die Cluster A-E wie bei
Verwendung der Sequenzen des N-Gens (Abbildung 3-19). Innerhalb des Subtyps-1a konnten
mit den Sequenzen des N-P-nicht-translatierten Bereiches nur wenige Isolate in separate
Cluster eingeordnet werden. Diese entstammen ausnahmslos dem mit den N-Gensequenzen
indentifizierten A1-Cluster.
100
Auch in der phylogenetischen Analyse mit Sequenzen des G-L-nicht-translatierten Bereiches
konnte kein so feines Clustering gefunden werden wie mit den eher konservierten N-
Gensequenzen. Die Ergebnisse widersprechen damit den Erwartungen, wonach dieser
Genabschnitt besonders für phylogenetische Untersuchungen bei geringen
Sequenzvariationen, wie für das RABV gezeigt (COETZEE und NEL, 2007; NEL et al.,
2005; PAEZ et al., 2003), geeignet sei. Ein Vorteil der GL-Region gegenüber anderen
Genabschnitten für phylogenetische Studien kann somit für Lyssaviren des Genotyps EBLV-1
nicht bestätigt werden. Dieser Bereich ist als Pseudogen ψ (psi) bezeichnet worden, da beim
Pasteur-Virusstamm Strukturen entdeckt worden waren, welche auf frühere Start- und
Stopsignale hindeuteten (TORDO et al., 1986b). Neueren Untersuchungen zufolge handelt es
sich aber hierbei um einen 3’-nicht-kodierenden Bereich (RAVKOV et al., 1995).
Die Ursache für die geringere Variabilität der G-L-Region bei EBLV-1 könnte darin
begründet liegen, dass die virale RNA in diesem Bereich, obwohl nicht kodierend, doch über
die Bildung von Sekundärstrukturen Einfluss auf die Transkription und Translation des
nachfolgenden Polymerasegens hat, oder als Bindungsstelle für zelluläre Signalpeptide
fungiert, wie dies für andere codierende Genbereiche bereits beschrieben wurde (BLONDEL
et al., 2002; RAUX et al., 2000). Bisher ist für diesen Abschnitt nur nachgewiesen, dass die
relativ große IGR die Transkription des nachfolgenden Polymerasegens dahingehend
herabreguliert, dass die Polymerase das am wenigsten transkribierte Protein des Virus
darstellt (FINKE et al., 2000). Die Tatsache, dass die Transkriptionsprozesse bei Lyssaviren
nicht unabhängig voneinander ablaufen, sondern sich gegenseitig beeinflussen und
aufeinander aufbauen, hat zur Folge, dass Mutationen eines einzelnen Motivs Veränderungen
in der Virustranskription und –replikation sowie der Pathogenität nach sich zieht (WU et al.,
2007). Da Mutationen in diesem Abschnitt somit auch die Eigenschaften des Virus
beeinflussen, wäre eine unabhängige Evolution dieses Abschnitts nicht möglich und er verhält
sich ähnlich stabil wie die anderen untersuchten Abschnitte. Die große Stabilität des EBLV-1-
Genoms lässt darauf schliessen, dass das Virus optimal an die Zirkulation innerhalb der
Reservoirspezies angepasst ist und die meisten Mutationen, die auftreten, negativ selektiert
werden (VOS et al., 2007).
101
Während es für andere Viren, wie beispielsweise für das der Klassischen Schweinepest
(KSPV), festlegte Konventionen gibt, um Isolate eindeutig mittels Sequenzanalyse
bestimmter Genomabschnitte zu typisieren (GREISER-WILKE et al., 2006), ist eine
Standardisierung bei Lyssaviren bisher nicht erfolgt. Einen Quasi-Standard für Lyssaviren
stellt die Sequenzierung des Genomabschnittes dar, der für die ersten 400 nt des N-Proteins
kodiert (BROOKES et al., 2004). Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden konnte, ist
eine Differenzierung zwischen den Subtypen 1a und 1b mit jedem untersuchten Genabschnitt
möglich. Aufgrund der relativ großen Unterschiede zwischen den Subtypen könnten auch sehr
kurze Genabschnitte und vermutlich sogar eine subtypspezifische Sonde bei der realtime-RT-
PCR für eine solche Unterscheidung ausreichen.
Um epidemiologische Zusammenhänge zur Fledermaustollwut in Deutschland und Europa
herauszustellen, könnte die Analyse des gesamten N-Gens wertvolle Ergebnisse liefern. So
war bei der phylogenetischen Analyse mit einem nur 331 nt großen Fragment eine
geographische Clusterung deutscher Isolate vermutet worden, konnte jedoch nicht eindeutig
belegt werden (MÜLLER et al., 2007). Zu ähnlichen Ergebnissen führte eine Studie auf der
Basis eines 400 nt Fragments des N-Gens (JOHNSON et al., 2002), die lediglich eine
Unterscheidung in die Subtypen 1a und 1b ermöglichte. Auch durch die Analyse der
Sequenzen des kompletten Glykoprotein-Gens war keine weitere Differenzierung möglich
(DAVIS et al., 2005). Möglicherweise sind auch die Sequenzen anderer Genabschnitte zur
Charakterisierung nicht besser geeignet (WU et al., 2007). Wie aber die vorliegende Studie
zeigt, können Untersuchungen einzelner, relativ langer Genabschnitte wichtige Beiträge zur
Erreger-Wirt-Infektionskette leisten.
Die bestätigte große Stabilität des N-Gens innerhalb der EBLV-1-Isolate hat zur Konsequenz,
dass phylogenetische Analysen nur geringe Konfidenzwerte (Bootstrap-Werte) liefern. Die
Verzweigungen stellen aber trotzdem die verwandtschaftlichen Verhältnisse repräsentativ dar,
da schon wenige Nukleotidaustausche einen Entwicklungsschritt ausmachen können.
Der nicht-translatierte Bereich zwischen N- und P-Gen besteht aus ca. 90 Nukleotiden. Bei
insgesamt vier Isolaten wurden Abweichungen in Form von Insertionen in diesem Bereich
festgestellt. Die zusätzlichen Nukleotide sind Insertionen im Bereich des Transkriptions-
Termination/Polyadenylationssignals (Abbildung 3-20). Die Isolate 3132 und 5778 aus der
EBLV-1a-Gruppe wiesen eine singuläre A-Insertion auf. Beide Isolate entstammen
102
phylogenetisch dem Cluster A1 und besitzen im N-Gen identische Sequenzen.
Interessanterweise fehlte bei den weiteren Mitgliedern dieses Clusters A1 (5782, 5776) diese
Insertion. Im Gegensatz dazu hatten die Isolate 5006 und 15771 aus der EBLV-1b-Gruppe
eine 6-nt-Insertion auf (Abbildung 3-18). Diese 6-nt-Insertion war auch bei einem EBLV-1b
Isolat aus Frankreich vorhanden (JOHNSON et al., 2007). Die drei Isolate, die diese Insertion
aufwiesen, wurden in räumlicher Nähe zueinander gefunden, was eine Zirkulation dieser
Virusvariante in einem räumlich abgegrenzten Gebiet im Grenzbereich zwischen Frankreich
und Deutschland nahelegt. Die Tatsache, dass diese Insertion bei in einem dritten EBLV-1b-
Isolat aus dem Saarland (13403) aus dem Jahr 1987 nicht nachgewiesen werden konnte, weist
auf eine relativ junge Veränderung des Genoms, da zwischen der ersten Isolierung (1989) und
dem letzten Nachweis (2006) einer solchen Variante 17 Jahre vergangen sind (JOHNSON et
al., 2007). Die Entstehung dieser Insertionen ist ungeklärt. Möglicherweise spielt ein so
genannter „Stotter-Mechanismus" der RNA-abhängigen RNA-Polymerase bei der
Polyadenylation viraler mRNA-Moleküle dabei eine wichtige Rolle (KOLAKOFSKY et al.,
2005). Obwohl dieses „Stottern“ normalerweise nur bei der Transkription auftritt, ist es
möglich, dass dies auch bei der Virusreplikation durch die RNA-abhängige RNA-Polymerase
erfolgte.
Der GL-nicht-translatierte Bereich umfasste bei allen untersuchten EBLV-1-Isolaten 560 nt
und entsprach damit dem von MARSTON (2007) angegebenen Werten. Eine Ausnahme
bildete Isolat 5782, bei dem dieser Bereich nur 525 nt hatte. Dies ist auf eine Deletion von
35 nt zurückzuführen, zwischen Positionen 5319-5353 des Genoms (Abbildung 3-20). Auch
diese Deletion konnte bei anderen Isolaten, die ansonsten identische Nukleotidsequenzen
hatten, nicht nachgewiesen werden.
Derart auffällige Sequenzunterschiede sind bisher, mit Ausnahme der 6 nt-Insertion im N-P-
Bereich (JOHNSON et al., 2007), bei Lyssaviren nicht beschrieben worden. Über die
Bedeutung kann nur spekuliert werden. Dass diese Veränderungen keinen negativen Einfluss
auf die Fitness des Virus haben, wird dadurch unterstützt, dass Isolate mit dieser Insertion im
N-P-Bereich mindestens 17 Jahre in der Wirtspopulation zirkulierten. Simulationen zur
dreidimensionalen Struktur dieses Abschnitts mit und ohne Insertion zeigten, dass beide stem-
loop-Strukturen ausbilden, die typisch für virale Polyadenylationssignale sind. Die Position
der Insertionen an der Polyadenylierungsstelle des N-Gens könnte ein Hinweis auf eine
103
mögliche Beeinflussung der Transkription des N-Gens sein, die Folgen für die virale
Eigenschaften, die Virus-Wirt-Interaktion oder die Virulenz der EBLV-Isolate haben könnte.
Gleiches gilt für die Deletion im GL-nicht-translierten Bereich. Die Länge des nicht-
translatierten Abschnitts kann die Transkription des nachfolgenden L-Gens beeinflussen
(FINKE et al., 2000). Je länger dieser Abschnitt ist, desto mehr wird die Transkription des L-
Gens reduziert, was wiederum eine verringerte Expression und erhöhte Pathogenität zur Folge
hat (MARSTON et al., 2007). Demnach könnte die Verkürzung des GL-nicht-translatierter
Bereich um 35 nt die Pathogenität des betreffenden EBLV-Isolates herabsetzen. Bei
Flaviviren beispielsweise war ein Dengue-Virusstammes durch eine 30 nt-Deletion in der 3’-
nicht-translatierten Region attenuiert (TROYER et al., 2001). Eine geringere Pathogenität von
EBLVs könnte bei Fledermäusen, die möglicherweise anders als bei anderen Säugetieren eher
geringe Kontaktraten zwischen infizierten und empfänglichen Tieren aufweisen, die
Persistenz derartiger Virusvarianten innerhalb der Population fördern und somit vorteilhaft für
deren Verbreitung sein.
Um einen möglichen Einfluss der beobachteten Insertionen bzw. Deletionen auf die
Viruseigenschaften zu untersuchen, könnten zunächst in vitro-Versuche durchgeführt werden.
Die Wachstumskinetik von Virusvarianten mit und ohne Insertionen in Zellkulturen könnte
vergleichend untersucht werden. Darüber hinaus eröffnet die Methode der „reverse genetics“
die Möglichkeit, die Insertionen bzw Deletionen in bereits bestehende Genome von „back
bone“ Stämmen wie beispielsweise von SAD-L16-Stamm an den entsprechenden Stellen zu
inkorporieren (FINKE et al., 2000), und so die Auswirkungen auf die Transkription und
Translation in Zellkulturen genauer zu untersuchen (FABER et al., 2004). Eine anschließende
Studie mit auf diese Weise genetisch veränderten Viren in Mäusen könnte Hinweise auf eine
mögliche Auswirkung der genetischen Veränderungen in Form der Insertionen bzw.
Deletionen auf die Pathogenität liefern (MORIMOTO et al., 2000). Die Mutationen könnten
auch als spezifische Marker herangezogen werden, um die Zirkulation und
Ausbreitungstendenz von bestimmten EBLV-Virusvarianten in der Fledermauspopulation zu
verfolgen.
Von den mehr als 32 verschiedenen Fledermausspezies Europas kommen 24 in Deutschland
vor (DIETZ et al., 2007). Auf die Breitflügelfledermaus (E. serotinus) entfallen dabei 92.5 %
104
aller Fledermaustollwutfälle in Deutschland, bei denen eine Artbestimmung des Wirtes
vorgenommen wurde (MÜLLER et al., 2007). In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals
Virusisolate, die im Rahmen einer retrospektiven Studie am NRL aus dem Braunen Langohr
(Plecotus auritus), der Fransenfledermaus (Pipistrellus nathusii) und der Zwergfledermaus
(Pipistrellus pipistrellus) isoliert wurden, näher untersucht. Zwar sind auch in anderen
europäischen Ländern EBLV-Infektionen bei anderen Fledermausspezies nachgewiesen
worden (KING et al., 2004), waren mit Ausnahme weniger Isolate aber nicht Bestandteil von
molekularbiologischen Charakterisierungen. Bei einer tollwutpositiven Zwergfledermaus aus
Frankreich war eine RABV-Variante nachgewiesen worden, was höchstwahrscheinlich eine
Laborkontamination war (PICARD-MEYER et al., 2004b). Die im Rahmen dieser Arbeit
gefundene große Übereinstimmung dieser Sequenzen zu denen anderer Isolate, welche aus
Breitflügelfledermäusen (Eptesicus serotinus) oder aus nicht identifizierten Fledermäusen
isoliert wurden, und die Eingruppierung in die geographischen Cluster sind Indizien dafür,
dass es sich in diesen Fällen um spill-over-Infektionen aus der Reservoirspezies handelt. So
können beispielsweise die Isolate aus der Fransen- und der Zwergfledermaus dem Cluster C
zugeordnet werden (Abbildung 3-16). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass in
Deutschland keine Fledermausspezies-spezifische EBLV-1-Varianten vorkommen. Obwohl
etliche andere Spezies im Rahmen der Routineuntersuchung untersucht worden sind, ist die
Spezies oftmals nicht bestimmt oder das Ergebnis nicht übermittelt worden, was eine
Bestätigung dieser Hypothese erschwert.
Aufgrund ihres seltenen Vorkommens und ihrer ökologischen Bedeutung stehen alle
Fledermausarten in Deutschland und Europa unter besonderem Schutz (ANON. 2005), so
dass sich die Tollwutsurveillance bei Fledermäusen nur auf wenige frischtot gefundene Tiere
beschränkt. Dadurch bleibt der Nachweis von EBLV-Infektionen häufig ein Zufallsbefund.
Im Gegensatz zur Tatsache, dass die zwei in Europa vorkommenden
Fledermaustollwutviusspezies auf wenige Reservoirspezies, Eptesicus serotinus (EBLV-1)
und Myotis daubentonii und Myotis dasycneme (EBLV-2) beschränkt zu sein scheinen, ist bei
allen in Nordamerika beheimateten Fledermausarten Tollwut nachgewiesen worden (DAVIS
et al., 2006). Phylogenetische Untersuchungen von Tollwutviren, die auf dem
nordamerikanischen Kontinent vorkommen, konnten zudem belegen, dass die RABV-
105
Varianten bei Fledermäusen nicht nur von denen terrestrischer Säugetiere deutlich
abzugrenzen sind (DAVIS et al., 2006), sondern dass sie sich auch bei verschiedener
Fledermausarten unterscheiden (NADIN-DAVIS et al., 2001). Aber auch dort sind spill-over
Infektionen von Varianten des RABV zwischen verschiedenen Fledermausarten beobachtet
worden (NADIN-DAVIS et al., 2001). Ein weiterer signifikanter Unterschied zwischen
Nordamerika und Europa ist die Zahl der festgestellten Fledermaustollwutfälle. Während in
Europa im Jahr 2006 nur bei 34 Fledermäusen Tollwut nachgewiesen wurden (ANON.,
2006), waren es im gleichen Jahr allein 1692 Fledermäuse in den Vereinigten Staaten
(BLANTON et al., 2007). Ursache hierfür könnten die Unterschiede in der
Fledermaustollwutuntersuchung, die Verbreitung und Dichte der verschiedenen
Fledermausarten und nicht zuletzt die unterschiedlichen Eigenschaften der verschiedenen
Lyssavirusgenotypen sein. Das seltene Auftreten von EBLV in Europa ist vermutlich auf die
Anpassung des Virus an seine Reservoirspezies zurückzuführen, die sowohl die Virulenz als
auch die Fähigkeit zur Übertragung auf andere Spezies vermindert (VOS et al., 2007a).
EBLV-2 wurde erstmals 1984 in Finnland nachgewiesen, nachdem ein schweizer Biologe an
einer Tollwutinfektion verstarb (LUMIO et al., 1986). Es gibt allerdings keine weiteren
Hinweise auf Fledermaustollwut in diesem Land, so dass davon ausgegangen wird, dass der
Biologe durch einen Fledermausbiss in der Schweiz infiziert wurde (KING et al., 2004).
Bisher ist EBLV-2 bei Fledermäusen nur in der Schweiz, den Niederlanden und dem
Vereinigten Königreich nachgewiesen worden (HARRIS et al., 2007). Die Niederlande waren
dabei bislang das einzige Land, in welchem sowohl EBLV-1 als auch EBLV-2-Infektionen in
der Fledermauspopulation festgestellt werden konnten (VAN DER POEL et al., 2005).
Das im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Virusisolat aus einer Wasserfledermaus (Myotis
daubentonii) aus dem Kreis Biberach stellt den Erstnachweis dieses Genotyps (GT6) in
Deutschland dar. Entsprechend war aus epidemiologischer Sicht die Notwendigkeit gegeben,
die morphologische Artbestimmung der Wirtsspezies genetisch eindeutig zu verifizieren.
Frühere Berichte, wonach bereits 1986 eine Wasserfledermaus (Myotis daubentonii) aus
Lüneburg mit EBLV-2 ifiziert war (JOHNSON et al., 2003), können durch Nachverfolgung
der Dokumentation am NRL nicht bestätigt werden. Bei einer in der Genbank veröffentlichten
Sequenz eines EBLV-2-Isolates (AY212117) mit der zusätzlichen Information, dass das
106
Ursprungsland Deutschland ist, handelt es sich offensichtlich um ein Isolat aus dem Archiv in
Tübingen, welches zur weiteren Charakterisierung an andere Labore übersandt wurde.
Fälschlicherweise ist dann dem Isolat Deutschland als Ursprungsland zugeordnet worden.
Leider ist für Lyssavirusisolate keine einheitliche Nomenklatur etabliert, so dass identische
Isolate in verschiedenen Tollwutlabors unter anderen Labornummern vorliegen, und eine
Identifizierung und die Zuordnung epidemiologisch relevanter Daten, wie der geographische
Ursprung, im Einzelfall schwierig sein kann.
Dass EBLV-2 in Deutschland nicht bereits früher nachgewiesen wurde, obwohl in den
Nachbarländern Schweiz und den Niederlanden EBLV-2-Fälle auftraten, war bereits
Gegenstand von Diskussionen (MÜLLER et al., 2007; VOS et al., 2007b). Die geographische
Nähe des Fundortes zur Schweiz (ca. 60 km) und der Zusammenhang zu dem dortigen
Vorkommen von EBLV-2 wird durch die phylogenetische Analyse untermauert, die zeigt,
dass das deutsche EBLV-2-Isolat die höchste Identität zu schweizer Isolaten aufweist.
Obwohl genaue Daten über die Verbreitung und Migration von Wasserfledermäusen in dieser
Region fehlen, scheinen Kontaktmöglichkeiten zwischen Fledermäusen aus dem
süddeutschen Raum und der benachbarten Schweiz gegeben zu sein. Zwischen ihren
Sommer- und Winterquartieren legen Wasserfledermäuse Entfernungen zwischen in der
Regel 100 - 150 km zurück (HUTTERER et al., 2005).
Eine Ursache für die unterschiedlichen Fallzahlen von EBLV-1 und 2 in Europa könnten die
verschiedenen Reservoirspezies für diese beiden Genotypen sein. Die Breitflügelfledermaus
(Eptesicus serotinus) ist weit verbreitet und eine Fledermausart, die häufig in der Nähe von
Siedlungen angetroffen wird. EBLV-2 dagegen scheint mehr mit der Wasserfledermaus bzw.
der Teichfledermaus (Myotis daubentonii und Myotis dascyneme) assoziiert zu sein (FOOKS
et al., 2003).
Obwohl die Wasserfledermaus in Deutschland zu den häufigeren Arten zählt (PETERSEN et
al., 2004), sind bisher nur wenige Tiere auf Tollwut untersucht worden. In einer
retrospektiven Studie zur Fledermaustollwut in Deutschland wurden zwischen 1997 und 2007
mehr als 1800 Fledermäuse untersucht. Davon waren 45 Wasserfledermäuse. Lediglich eine
107
Teichfledermaus ist bisher untersucht worden. Alle Ergebnisse in diesem Zeitraum waren
negativ1.
Studien aus dem Vereinigten Königreich zeigten, dass ca. 2 % der Wasserfledermäuse
neutralisierende Antikörper gegen EBLV-2 besitzen und von 113 untersuchten Tieren sechs
EBLV-2 positiv waren (HARRIS et al., 2006). Dagegen wurden nach 1997 bei der
Fledermaustollwutüberwachung in den Niederlanden keine weiteren Fälle von EBLV-2
festgestellt (VAN DER POEL et al., 2005). Interessanterweise wurden alle Fledermäuse in
den Niederlanden, die EBLV-2 positiv waren, als Teichfledermäuse (Myotis dasycneme)
identifiziert, wogegen die restlichen EBLV-2 Fälle in Europa bei Wasserfledermäusen
(Myotis daubentonii) oder bei spill-over-Infektionen im Menschen gefunden wurden.
Phylogenetisch stellen die aus Myotis dasycneme isolierten Viren eine separate Untergruppe
dar. Aufgrund der begrenzten Anzahl der positiven Fälle und den wenigen Isolaten kann
weder die Fledermausspezies, noch der geographische Ursprung als Ursache für diese
Gruppierung bestätigt oder ausgeschlossen werden. Weiterhin wurde vermutet, dass die
Adaptation an die Reservoirspezies die Virulenz von EBLV vermindern könnte, so dass
weniger Fälle beobachtet werden (VOS et al., 2007b; VAN DER POEL et al., 2005). Vor dem
Hintergrund der Untersuchungszahlen und der geringen Inzidenz von EBLV-2 kann eine
weitaus größere Verbreitung für EBLV-2 in Europa angenommen werden.
1 Persönliche Mitteilung Dr. T. Müller, am 03.03.2008
108
4.1 Schlussfolgerungen
Die partielle Sequenzierung von Genomfragmenten ist eine geeignete Methode um EBLV
Isolate näher zu charakterisieren. Die zuvor bei EBLV-1 beobachtete hohe Sequenzidentität
konnte in dieser Arbeit bei Isolaten aus Deutschland bestätigt werden. Durch die
phylogenetische Analyse des kompletten N-Gens in Kombination mit Daten zum
geographischen Ursprung wurden Isolate Clustern zugeordnet, die teilweise abgegrenzte
Gebiete umfassen. Dies wird als Hinweis darauf gewertet, dass die Virustransmission zumeist
innerhalb eines begrenzten Gebietes erfolgt und mit der Populations- und Migrationsbiologie
der Reservoirspezies Eptesicus serotinus im Zusammenhang steht.
Neben der Sequenzierung und dem Vergleich des N-Gens führten auch Analysen der nicht-
translatierten Genabschnitte im N-P und G-L Übergangsbereich zu einer Unterscheidung der
EBLV-Isolate aus Deutschland in die beiden Subtypen 1a und 1b. Zudem zeigten diese
Abschnitte bisher bei EBLV nicht beobachtete Variationen Länge des Genoms. So konnten
bei einzelnen Isolaten Insertionen in NP-Bereich bzw. eine 35 nt-Deletion im GL-Bereich
nachgewiesen werden.
Der Erstnachweis von EBLV-2 in Deutschland zeigt, dass Aufgrund der geringen
Untersuchungszahlen kaum Aussagen über das wirkliche Verbreitungsgebiet dieses Genotyps
in Deutschland und in Europa gemacht werden können.
109
4.2 Ausblick
Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern Hinweise auf das Auftreten regionaler Varianten
innerhalb der EBLV-1a Population. Um dies zu bestätigen, sollten alle EBLV-Isolate des
Virusarchivs am NRL nach diesem Schema typisiert und analysiert werden. Um
epidemiologische Auswertungen zu machen und um die Anforderungen der Konvention
EUROBATS zu erfüllen (ANON. 2006), sind detaillierte Angaben zum Fundort, Jahr der
Isolierung und betroffene Spezies unerlässlich. Auch könnten vergleichend zusätzliche Isolate
aus den europäischen Nachbarländern hinzugezogen werden. Obwohl sich das N-Gen als
geeignet gezeigt hat, die EBLV-1 Isolate zu typisieren, sollten weitere Genabschnitte in
gleicher Weise untersucht werden. So könnten Untersuchung des P-Gens und des G-Gens im
Vergleich zu RABVwichtige Hinweise auf Pathogenitätsmarker liefern.
Eine Schwierigkeit bei der Interpretation der Ergebnisse ist die Tatsache, dass in der
Mehrzahl positiv untersuchter Fledermäuse die genaue Spezies nicht bestimmt wurde
(MÜLLER et al., 2007). Somit sind Aussagen zum Vorkommen von EBLV-1 in bestimmten
Spezies vorsichtig zu machen. Eine Möglichkeit, dies in Zukunft zu verbessern, stellt die
Speziesbestimmung mittels partieller Sequenzierung des Cytochrom B-Gens, wie für den
EBLV-2 Fall beschrieben, dar (HARRIS et al., 2008). Die Differenzierung der Spezies durch
genetische Analyse stellt hier ein modernes Instrument dar, diese Informationen zu
generieren, auch wenn beispielesweise der Tierkörper für weitere Untersuchungen nicht mehr
zur Verfügbar steht. Mit der zunehmenden Zahl von in internationalen Genbanken
eingestellten Sequenzen von Wirtstieren kann es zukünftig möglich sein, die Phylogenie von
EBLV-1 und -2 mit denen der Fledermäuse zu vergleichen. Dies könnte weitere Hinweise auf
die Mechanismen der Transmission von EBLV in Fledermauspopulationen liefern.
Die epidemiologische Aussagekraft der phylogenetischen Untersuchungen kann durch die
Einbeziehung weiterer Daten, wie detaillierte Verbreitungskarten von Fledermausspezies,
untermauert werden. Über die genaue Verbreitung der einzelnen Fledermausspezies in
Deutschland liegen bisweilen nur fragmentierte Daten vor. In Kooperation mit den
Fledermaussachverständigen könnten Häufungen bei Fledermaustollwut mit dem
110
Vorhandensein von Wochenstubenkolonien und Winterquartieren im Zusammenhang
analysiert werden.
Welche Rolle die Variabilität der nicht-translatierten Bereiche auf die Eigenschaften des
Virus hat, ist nicht geklärt. Um dies näher zu beleuchten, könnte die Wachstumskinetik in
Zellkulturen vergleichend untersucht werden. Auch ist es möglich, über reverse genetics
spezifische Virusmutanten zu erzeugen und in Versuchen deren Eigenschaften zu studieren.
Die große Anzahl der Sequenzen für das N-Gen wird es zukünftig erlauben, auf dieser Basis
real-time RT-PCR-Assays für EBLV-1 zu entwickeln, um die Diagnostik sowohl in Bezug
auf Sensitivität als auch auf Spezifität zu verbessern.
111
5 ZUSAMMENFASSUNG
Conrad Martin Freuling: Genetische Charakterisierung von
Fledermaustollwutvirusisolaten aus Deutschland
Bisherige Untersuchungen von deutschen Fledermaustollwutvirusisolaten wiesen
ausnahmslos European Bat Lyssavirus Typ 1 (EBLV-1) nach. Mithilfe eines Raster-basierten
Ansatzes wurden 48 Fledermaustollwutvirusisolate aus Deutschland repräsentativ ausgewählt
und durch die direkte Sequenzierung des N-Gens, und der nicht-translatierte Bereiche
zwischen dem N und P-Gen (NP-NTR) bzw. dem G und L-Gen (GL-NTR) vergleichend
charakterisiert. Die Ergebnisse bestätigten vorangegangene Studien an EBLV-1 Isolaten,
wonach die Sequenzen innerhalb dieses Genotyps eine hohe Identität aufweisen, was auf eine
große Stabilität des Genoms bei der Viruszirkulation schliessen lässt. Es konnte jedoch
erstmals gezeigt werden, dass bestimmte genetische Cluster der EBLV-1 Viruspopulation in
Deutschland auch räumlich gehäuft auftreten. Alle drei untersuchten Genabschnitte konnten
dabei zur Unterscheidung in die beiden zirkulierenden Subtypen 1a und 1b genutzt werden.
Die größtmögliche Differenzierung wurde bei Verwendung der N-Gensequenzen erreicht.
Anders als von RABV erwartet, war die Variabilität der GL-NTR nicht ausreichend für
detaillierte phylogenetische Analysen. Interessanterweise konnten im NP-NTR bei zwei
Isolaten eine 6 nt-Insertion bzw. bei einem Isolat eine 2 nt-Insertion nachgewiesen werden.
Zudem wurde bei einem Isolat eine Deletion von 35 nt im GL-NTR festgestellt. Die Folgen
dieser Mutationen auf virale Eigenschaften sind Gegenstand weiterer Untersuchungen, da
diese bei Lyssaviren zuvor noch nicht beschrieben worden waren.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals der Nachweis von EBLV-2 bei einer
Wasserfledermaus im Süden Deutschland erbracht. Der Vergleich der Sequenzen von 400 nt
des N-Gens zeigt hohe Identität mit Isolaten aus der angrenzenden Schweiz und gibt
Hinweise auf einen epidemiologischen Zusammenhang im Infektionsgeschehen. Um die
betroffene Fledermausspezies eindeutig identifizieren zu können, wurde eine partielle
Sequenzierung des cytochrom-B-Gens durchgeführt, und in die Fledermaustollwutdiagnostik
am NRL etabliert.
112
113
6 SUMMARY
Conrad Martin Freuling: Genetic characterization of bat lyssaviruses isolates from
Germany
Previous studies on German EBLV isolates confirmed the presence of EBLV-1, and a
preliminary epidemiological study indicated a distinct geographical distribution of EBLV-1 in
Germany. Using a random grid sampling procedure based on GIS, 48 isolates were selected to
further investigate the spatial and temporal distribution of EBLV-1 variants in Germany. The
nucleoprotein-gene (N), the nucleoprotein-phosphoprotein spanning untranslated region (NP-
UTR) and the UTR between G and L-gene of each isolate were sequenced using direct cycle
sequencing. Results of the subsequent phylogenetic analysis of the N-gene confirmed
previous studies on European EBLVs, showing a high sequence identity among German
EBLV-1a isolates. This indicates genomic stability of the virus during the transmission cycle.
However, when combining the data sets for geographic origin and phylogeny, clustering of
isolates became evident.
The gene fragments studied were shown to be suitable for distinguishing between the
circulating EBLV subtypes 1a and 1b. The best differentiation, however, was seen when
analysing sequences of the complete N-gene. The variability of the GL-region was not
sufficient for the discrimination of clusters, an unexpected finding in respect to studies on
RABV. Interestingly, 6 bp insertions in two isolates as well as a single nucleotide insertion in
a different isolate were detected in the N-P UTR. Within the UTR between G and L-gene one
isolate showed a 35 pb deletion. The effect of those changes on viral properties remains
elusive as such mutations had not been described for lyssaviruses before.
For the first time the presence of EBLV-2 was confirmed in a daubenton’s bat from the South
of Germany. Partial sequencing of the N-gene revealed a high degree of identity with other
EBLV-2 isolates from Switzerland, suggesting epidemiological association. To identify the
species of the bat involved, sequencing of the partial cytB-gene proved very effective , and
the method was established in the NRL.
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136
8 ANHANG
8.1 Verwendete Isolate Labornummer Jahr Spezies Ort Kreis Bundesland
915 1996 E. serotinus Osnabrück Osnabrück Niedersachsen 933 1993 E. serotinus Oldendorf Stade Niedersachsen 976 1992 P. nathusii Marienhafen Aurich Niedersachsen 992 1998 E. serotinus Moordorf/Südbrookmer Aurich Niedersachsen
2976 1999 ? Hassbergen Nienburg a.d. Wese Niedersachsen 3131 1999 ? Winsen (Luhe) Harburg Niedersachsen 3132 1999 E. serotinus Jena,Stadt/THÜ Jena Stadt Thüringen 4644 1997 ? Plate Schwerin Meck-Vorpommern 4895 2000 ? Freyburg Burgenlandkreis Sachsen-Anhalt 5006 2000 ? Wadgassen Saarlouis Saarland 5185 2000 E. serotinus Hitzhausen Osnabrück Niedersachsen 5226 1996 P. auritus Lingen Emsland Niedersachsen 5248 2000 E. serotinus Bremen Grohn Bremen Bremen 5250 1994 P. pipistrellus Ricklinger Holz Hannover Niedersachsen 5254 2000 E. serotinus Osterode Osterode Niedersachsen 5776 2001 ? Halle/Saale,St. Halle, Stadt Sachsen-Anhalt 5778 2001 ? Bernburg (Saale Leipziger Land Sachsen-Anhalt 5782 2001 ? Horburg-Maßlau Merseburg-Querfurt Sachsen-Anhalt 6795 2002 E. serotinus Luckenwalde Teltow-Fläming Brandenburg 8624 2003 E. serotinus Osterholz-Schar Osterholz Niedersachsen 10924 2004 ? Ostrhauderfehn Leer Niedersachsen 10925 2004 ? Emden,Stadt Leer Niedersachsen 10927 2004 ? Hesel/NDS Leer Niedersachsen 11647 2005 E. serotinus Kyritz Ostprignitz-Ruppin Brandenburg 12865 1968 ? Hamburg Hamburg Hamburg 12868 1970 ? Stade Stade Niedersachsen 12871 1983 ? Bremerhaven Bremerhaven Bremen 13394 1978 ? Klixbüll Nordfriesland Schleswig-Holstein 13401 1986 ? Cuxhaven Cuxhaven Niedersachsen 13403 1986 ? Neunkirchen Neunkirchen Saarland 13406 1985 E. serotinus Nienburg Nienburg Niedersachsen 13407 1985 E. serotinus Rodenberg/Deister Grafschaft Schaumb Niedersachsen 13408 1986 E. serotinus Langwedel-Etelsen Verden Niedersachsen 13409 1986 E. serotinus Negenborn Holzminden Niedersachsen 13414 1988 E. serotinus Bad Bramstedt Segeberg Schleswig-Holstein 13415 1988 E. serotinus Gleschendorf Ostholstein Schleswig-Holstein 13416 1988 E. serotinus Lübeck Stadt Lübeck Schleswig-Holstein 13418 1988 E. serotinus Tetenhusen Schleswig-Flensbur Schleswig-Holstein 13422 1989 ? Reher Steinburg Schleswig-Holstein 13423 1989 E. serotinus Berlin Sadt Berlin Berlin 13428 1990 ? Aurich Aurich Niedersachsen 13438 1990 ? Harsewinkel Gütersloh Nordrhein-Westfalen 13439 1990 ? Itzehoe Steinburg Schleswig-Holstein 13445 1996 E. serotinus Hinte Aurich Niedersachsen 13450 1998 E. serotinus Berlin Steglitz Berlin Berlin 13452 1999 E. serotinus Borna Borna Sachsen 13453 1999 E. serotinus Riepsdorf Ostholstein Schleswig-Holstein 15548 2006 E. serotinus Rostock Rostock Mecklenburg-Vorpommern 15571 2006 E. serotinus Wadern Merzig Saarland 15730 2004 E. serotinus Hartmannsdorf Oberspreewald-Laus Brandenburg
137
8.2 Software
BaseImageIR™Version 02.31, (MWG, Ebersberg, Deutschland)
Lasergene 6.0 package (DNA Star, Madison, USA) mit den Programmen SeqMan, MegAlign,
PrimerSelect, EditSeq
MEGA: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Software Version 4.0
Internet: http://www.megasoftware.net/
Kartenexplorer: GIS-Software basierend auf ESRI-Modulen [MapObjects® LT und
MOLegend (ESRITM , Environmental Systems Research Institute, Inc., Redlands, USA)].
entwickelt am Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit,
Institut für Epidemiologie
Internet: http://www.bfav.de/kartenexplorer/
138
9 DANKSAGUNG
An erster Stelle sei Frau Professorin Greiser-Wilke und Herrn Professor Moennig vom Institut
für Virologie der Stiftung Tierärztlichen Hochschule und Herrn PD Conraths vom Institut für
Epidemiologie des Friedrich-Loeffler-Instituts herzlichst gedankt für die Übernahme und
Betreuung meiner thematischen Fragestellung.
Ferner gilt mein ganz besonderer persönlicher Dank Herrn Dr. Thomas Müller vom
Nationalen Referenzlabor für Tollwut am FLI, der mich während der gesamten Zeit
unterstützte, motivierte, förderte und forderte und bei allen Fragen ein offenes Ohr hatte.
Ein großes Dankeschön auch für die Unterstützung bei der Einarbeitung in die
molekularbiologischen Techniken an Dr. Geue und an Susann Schares und Aline Beckert für
die gemeinsame Zeit beim Sequenzieren und die Unterstützung.
Für die kreativen Diskussionen und fachlichen Hinweise, insbesondere für die Statistik,
bedanke ich mich bei PD Thomas Selhorst. Zum Schluss sei meiner Frau Christiane für die
Geduld, Unterstützung und Aufmunterung während der gesamten Zeit gedankt. Ebenso sei
allen denen ein Dankeschön ausgesprochen, die nicht namentlich Erwähnung fanden, aber
zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
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