MARCADORES
MOLECULARES
Genética
•Melhoramento na agricultura até séc. XIX
“arte” e seleção inconsciente
•1900s - Descoberta dos princípios genéticos
•1920-50 - Melhoramento genético científico
•1970-80 - Utilização de marcadores genéticos
moleculares
•Marcadores genéticos são unidades herdáveis
simples
• Polimorfismo de DNA resulta acúmulo de
mutações
– pontual ou inserção/deleção
– macro-rearranjos: translocações, inversões,
deleções
• Obj: identificar polimorfismo diretamente do
DNA e associar a genes de grande ou
pequenos efeitos no fenótipo
marcadorescromossomo
Aplicações
• Genética de populações
• Análise de fluxo gênico
• Variação genética
• Seleção Natural
• Relações filogenéticas
• Mapeamento cromossômico
•Seleção assistida
•Conservação de recursos genéticos
•Importância agronômica
Histórico de Marcadores
• Hunter & Markert (1957) - marcas bioquímicas
desenvolveram isozimas em gel de amido
• RFLP por Botstein et al. (1980)
• PCR por Mullis & Faloona (1987)
• RAPD por Rafalski et al. (1990)
• SSR por Akkaya et al. (1992)
• ISSR por Zietkiewicz et al. (1994)
Isozimas
As isozimas têm sido usadas em pesquisas de
biologia evolutiva principalmente através do
estudo detalhado de um loco e as suas
variantes alélicas (alozimas) e a utilização de
muitos locos para estudos populacionais.
• herança mendeliana simples.
• codominância, penetrância completa
• ausência de pleiotropia e de interações epistáticas
• disponíveis na população apresentando grande
diversidade
• nível de polimorfismo genético detectável em
cada loco é limitado
Vantagens e desvantagens
Restriction Fragment LengthPolymorphism - RFLP
•RFLP examina diferença em tamanho de
fragmentos de restrição de DNA específicos
•Polimorfismo deriva de mutação pontual,
inserção, deleção
•Utiliza-se DNA celular total
•Requer DNA puro de alto peso molecular
Sítios de restrição
Vantagens e desvantagens
•Reprodutível
•Marcadores co-dominantes
•Simples
•Trabalhoso
•Caro
MINI-SATÉLITE OU VNTR
• Variable number of tandem repeats
•Sequências repetidas de 15 a 100pb, repetidos 50X
•Utilizado: identificação de variedades, cultivares
clones
análise de diversidade genética
paternidade
DNA Fingerprint
•VNTR – variable number of tandem repeats
DNA
Fingerprint
Teste de Paternidade
Teste de paternidade
DNA Fingerprint
RAPD
(Random Amplified Polymorphic
DNA)
Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD
•Amplifica sequências anônimas de DNAusando primers arbitrários
--10 bases com >50% G+C
•PCR com um único primer
•Método rápido para detecção de polimorfismos
•Marcador dominante
•Problemas de reprodutibilidade
Vantagens e desvantagens
•Rápido
•Simples
•Baixo custo
•Sem uso de radio-isótopos
•Marcador dominante
•Problemas de reprodutibilidade
•Problemas de interpretação
Microssatélites (SSR)
•Sequence-Tagged Microsatelites (STMS)
• também conhecido como microssatélite ou
Simple Sequence Repeat (SSR)
•Normalmente locus simples e multi-alélico
•Co-dominante
•Sequências de 2 a 10pb repetidas
MARCADORES MOLECULARES
DE MICROSATÉLITES (SSR)
Microsatélites• SSR – Simple Sequence Repeats
– Pequenas sequências (“sequence motif”) com 1 a 4 nucleotídeos
repetidos em tandem - Amplificados via PCR
– Classe de marcadores moleculares mais polimórficos
Sinonimias
SSR (Simple Sequence Repeats);
STMS (Sequence Tagged Microsatellites);
SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);
Onde são encontrados ???
Mamíferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma)
Plantas: (AT)n
Mitocôndrias
Consistem de pequenas sequências (“sequence
motif ”) com 1 a 4 nucelotídeos de comprimento,
repetidas em tandem.
Mononucleotídeos TGCATTGAAAAAAAAAAAAAAACTGGATC
Dinucleotídeos TGCATTGTATATATATATATATACTGGATC
Trinucleotídeos TGCATTGTGATGATGATGATGACTGGATC
Tetranucleotídeos TGCATTGTGACTGACTGACTGACCTGGATC
Características: Altamente polimórficos e codominantes (ambos os alelos
de um indivíduo heterozigoto são visualizados)
Detecção de locos SSR (PCR)
CACACA
GTGTGT
CACACA
GTGTGT
(CA)3
(CA)3
Amostra 1 Amostra 3Amostra 2
•Mapeamento genético
•Diagnóstico de doenças
•Investigação forense
•Análise populacional
•Estudos ecológicos
•Paternidade
•Biologia da conservação
Aplicações dos Microsatélites
Como os microsatélites são formados ?
Modelos para explicar os processos mutacionais
envolvidos na formação das repetições
•Escorregões da DNA polimerase
•Crossing over desigual
Fita nascente
Fita molde
Replicação
+1 repeat -1 repeat
Slippage
Misalignment
•Altamente reprodutível e informativo
• detecção por PCR
•distribuição homogênea no genoma
•Custo e trabalho envolvidos no desenvolvimento dosprimers
•Construção de bibliotecas genômica
• sequenciamento
•Triagem dos melhores primers
Vantagens e desvantagens
AFLP
(Amplified Fragment Length
Polymorfism)