UNIVERSITATEA “ALEXANDRU I. CUZA” IAŞI
FACULTATEA DE FIZICĂ
STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI
AI MEMBRANELOR PE MODELE
NATURALE SI ARTIFICIALE, PRIN
METODE SPECTRALE
Rezumatul tezei de doctorat
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC:
PROF. UNIV. DR. DANA ORTANSA DOROHOI
DOCTORAND,
Ion Hurjui
2013
În atenţia:
.................................................................................................................
Vă facem cunoscut că în data de 5 iulie 2013, ora 11:00, în Amfiteatrul IV 13,
domnul Hurjui Ion va susţine, în şedinţă publică, teza de doctorat cu titlul:
"Studiul unor parametri biofizici ai membranelor pe modele naturale şi
artificiale, prin metode spectrale"
în vederea obţinerii titlului ştiinţific de doctor în domeniul fundamental Ştiinţe
Exacte - Fizică.
Comisia de doctorat are următoarea componenţă:
Preşedinte: Prof. univ. dr. Diana Mardare
Director al Şcolii Doctorale, Facultatea de Fizică Universitatea „Alexandru Ioan Cuza”, Iaşi
Conducător ştiinţific: Prof. univ. dr. Dana Ortansa Dorohoi
Facultatea de Fizică Universitatea „Alexandru Ioan Cuza”, Iaşi
Referenţi: Prof. univ. dr. Simion Aştilean
Universitatea “Babeş- Bolyai ”, Cluj Napoca
Prof. univ. dr. Dorina Creangă
Universitatea „Alexandru Ioan Cuza”, Iaşi Prof. univ. dr. Livia Vicenţa Gheorghieş
Universitatea “Dunărea de Jos”, Galaţi
Vă invităm pe această cale să participaţi la şedinţa publică de susţinere a tezei.
C U P R I N S U L T E Z E I
CAP. I. Membrane naturale şi artificiale 8
I. 1. Modelul mozaicului fluid 8
Proprietăţi biochimice ale lipidelor membranare 1 4
I. 2. Parametrii biofizici ai membranelor 2 4
CAP. II. Principalele metode de studiu ale parametrilor biofizici ai membranelor 3 2
II. 1.B. 1. Spectrometria electronică de absorbţie şi emisie 3 7
Spectrometria FT-IR şi Raman 5 3
CAP. III. Influenţa temperaturii, concentraţiei şi a câmpurilor electromagnetice asupra
gradului de ordonare al structurilor de tip membranar
6 5
III. 1. Influenţa temperaturii asupra unor structuri de tip membranar 6 5
III. 2 Studiul tranziţiilor de fază termotropice în cristale lichide 7 6
III. 3 Studiul influenţei câmpurilor electromagnetice de înaltă frecvenţă şi microunde asupra
bistraturilor de DPPC, prin metode de simulare structurală
8 1
CAP. IV. 1,6-difenil-1,3,5,-hexatriena (dph) - marker fluorescent utilizat în evaluarea
fluidităţii structurilor de tip membranar
1 0 9
IV. 2. Influenţa solventului asupra spectrelor electronice de absorbţie şi emisie ale DPH 1 2 7
IV.3. Evaluarea HyperChem a DPH 1 3 5
IV.4. Efectul solvenţilor asupra SEA ale DPH 1 3 8
Spectre electronice de fluorescenţă ale DPH în soluţii 1 4 5
IV. 5. Caracteristici remarcabile ale spectrelor electronice ale DPH în funcţie de natura
solventului
1 4 9
CAP.V. Interacţiunea probelor fluorescente (DPH) cu membranele fosfolipidice nesaturate -
studiu de dinamică moleculară
1 6 2
CAP. VI. Contribuţii la optimizarea reacţiilor de obţinere a unor compuşi cu acţiune
tuberculostatică (derivaţi ai tiosemicarbazidei) sau antitumorală (derivaţi ai L-glutaminei)
1 7 8
VI. A.1. Reacţia de obţinere a derivaţilor 1-acil- 4-aril-tiosemicarbazidei (II-VII) 1 8 1
VI. A.2. Caracterizarea spectrală a disubstituienţilor tiosemicarbazidici 1 8 1
VI. A.3. Rezultate obţinute în urma procesului de optimizare 1 8 4
VI. A.4. Testarea activitaţii tuberculostatice 1 8 4
VI. B.1. Reacţia de obţinere a derivaţilor (I-IV) ai N-[p-(R)-benzoil]-L-glutaminei 1 8 7
VI. B.2. Caracterizarea spectrală a derivaţilor glutaminei 1 8 9
VI. B.3. Rezultate obţinute în urma procesului de optimizare 1 9 0
VI. B.4. Testarea activităţii derivaţilor L-glutaminei asupra enzimelor digestive 1 9 7
CAP. VII. Concluzii finale 2 0 2
ANEXA
1
Introducere
Tema tezei de doctorat: „Studiul unor parametri biofizici ai membranelor pe modele
naturale şi artificiale, prin metode spectrale” a fost aleasă datorită importanţei deosebite pe
care o prezintă cunoaşterea proprietăţilor fizico-chimice ale structurilor de tip membranar în
organizarea şi funcţionarea acestora.
Teza este structurată pe şase capitole, în care sunt prezentate noţiuni teoretice şi
contribuţiile proprii ce constau în rezultatele obţinute experimental şi teoretic.
Primul capitol intitulat „Membrane naturale şi artificiale” prezintă argumentele structurale şi
funcţionale ce susţin modelul mozaicului fluid al membranei, utilizat şi în prezent.
În cel de-al doilea capitol numit „Principalele metode de studiu ale parametrilor biofizici ai
membranelor” sunt prezentate succint metodele de studiu ale ordonării moleculelor
constituente ale membranelor si cele de evaluare a dinamicii lor, insistând asupra principiilor
metodelor spectrale (spectrometria în IR cu transformată Fourier, spectrometrie UV-vis de
absorbţie şi emisie) utilizate în obţinerea datelor experimentale conţinute în teză.
Capitolul al treilea „Influenţa temperaturii, concentraţiei şi a câmpurilor
electromagnetice asupra gradului de ordonare al structurilor de tip membranar” este la
rândul său, structurat în trei subcapitole: primul este axat pe utilizarea spectrometriei FTIR
pentru atribuirea centrilor activi din structura poliamidei 6 anionice (Nylon 6) în vederea
utilizării acestui polimer ca substrat pentru substanţe cu proprietăţi biocidale. S-a urmărit
efectul temperaturii asupra benzilor de absorbţie ale grupărilor amidice. Modificările spectrale
apărute au fost corelate cu morfologia de suprafaţă a polimerului, determinată folosind SEM.
Scopul studiului din cel de-al doilea subcapitol este evidenţierea influenţei temperaturii asupra
echilibrului între fazele de ordine şi dezordine ale esterulului poli-(fenil-metacrilic) al acidului
cetiloxibenzoic (PPMAECOBA) în tetraclorometan (TCM) prin tehnica FTIR. Au fost
determinate coordonatele tranziţiei principale de fază ale cristalului lichid liotropic. În cel de-
al treilea studiu am reconstruit, prin metode de simulare, modul de organizare al structurii
multilamelare a dipalmitoilfosfatidilcolinei (DPPC) în scopul stabilirii influenţei unor factori
interni şi externi (concentraţiile constituenţilor în soluţie, ionii tampon, temperatura,
câmpurile electromagnetice) asupra acesteia.
Scopul celui de-al patrulea capitol „1,6-difenil-1,3,5,-hexatriena (DPH) - marker
fluorescent utilizat în evaluarea fluidităţii structurilor de tip membranar” este de a analiza
interacţiunile intermoleculare ale DPH cu un număr mare de solvenţi pe baza spectrelor
electronice de absorbţie şi emisie ale soluţiilor ternare de tip DPH + THF + solvent, pentru a
obţine informaţii cu privire la comportamentul acestui marker fluorescent, utilizat ca senzor în
evaluarea fluidităţii membranelor. Datele spectrale au fost corelate cu proprietăţile structurale
şi electro-optice rezultate din calculele de mecanică cuantică. Sunt prezentate rezultatele
simularii dinamicii moleculare ale amestecului DPH+THF în apă şi etanol, pentru obţinere de
informaţii privind structurarea unui solvent în jurul moleculei de DPH, în prezenţa de THF.
Capitolul V intitulat „Interacţiunea probelor fluorescente (DPH) cu membranele
fosfolipidice” are drept obiectiv aducerea de noi date privind localizarea şi orientarea
preferenţială a moleculei de DPH în bistratul puternic nesaturat format din DOPC, utilizând
simulări de dinamică moleculară (MD).
Scopului studiului prezentat în capitolul VI a fost optimizarea reacţiilor şi stabilirea
randamentului maxim (folosind un experiment de tip 32 factorial) pentru reacţiile de obţinere
a unor tiosemicarbazide şi derivaţi glutaminici - noi compuşi cu acţiune farmacologică.
Lucrarea se încheie prin sublinierea contribuţiilor proprii şi a celor mai importante
concluzii la care am ajuns ca urmare a studiilor experimentale şi teoretice efectuate. În anexa
este prezentată activitatea ştiinţifică: 6 articole publicate în reviste ştiinţifice cotate ISI, o
lucrare acceptată spre publicare, o lucrare aflată într-un avansat proces de analiză, 2 lucrări în
reviste cotate B+ şi alte 2 în reviste recunoscute CNCSIS, de categorie C şi D.
2
CAP. I. MEMBRANE NATURALE ŞI ARTIFICIALE
I. 1. MODELUL MOZAICULUI FLUID
Modelul de organizare a moleculelor membranare elaborat de Singer şi Nicholson în
1972 şi denumit modelul mozaicului fluid a devenit în prezent acceptat de întreaga comunitate
ştiinţifică deoarece [1]:
- Există numeroase date experimentale structurale şi funcţionale care susţin ipoteza
celor doi cercetători.
- Modelul permite explicarea majorităţii funcţiilor membranare şi imaginarea unor
noi tipuri de interacţiuni între molecule.
După cum este deja bine cunoscut, imaginea actuală a membranei celulare este cea a
unui bistrat fosfolipidic, între care se găsesc şi molecule de colesterol, iar din loc în loc sunt
inserate proteine. Proteinele pot fi integrale sau periferice şi pot avea diferite funcţii: enzime,
transportori, canale, pompe, receptori, etc [2]. Moleculele sunt libere să prezinte mişcări în
planul membranei (deci membrana are un caracter fluid) datorită faptului că între componente
se stabilesc forţe de interacţiune fizice (atracţii/respingeri electrostatice, forţe de tip Van der
Waals, interacţiuni hidrofobe) şi nu apar legături chimice puternice (ex.: legături covalente).
În continuare sunt prezentate tehnicile structurale şi funcţionale ce au permis acumularea de
dovezi în sprijinul modelului mozaicului fluid.
I. 1. A. PROPRIETĂŢI BIOCHIMICE ALE LIPIDELOR MEMBRANARE
Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli.
Ele reprezintă aproximativ 50% din componenţii membranari, restul fiind reprezentat de
proteine. Există o serie de membrane mai active metabolic (ex.: membrana mitocondrială
internă) care au un conţinut mai mare de proteine (peste 70%), în timp ce unele membrane
specializate (ex.: mielina, cu rol izolator faţa de trecerea impulsului nervos) sunt formate
predominant din lipide (peste 75%). În cadrul unui anumit tip de membrană, proporţia
cantitativă fosfolipide : colesterol : glicolipide este 75 : 25 : 5. De remarcat este distribuţia
asimetrică a diferitelor tipuri de lipide între cele două monostraturi ale membranei. Datorită
celor două regiuni care apar în aceste molecule – capul polar şi regiunea hidrofobă a lanţurilor
de acizi graşi – fosfolipidele au proprietatea de a se autoorganiza în prezenţa apei: capetele
polare se vor dispune la exterior, în contact cu moleculele de apă, iar zonele hidrofobe vor
veni în contact unele cu altele, realizând clasica distribuţie în bistrat [3]. Aceste proprietăţi
stau la baza obţinerii membranelor artificiale (lipozomi, straturi bilipidice plane).
I. 1. B. PROPRIETĂŢI BIOFIZICE ALE LIPIDELOR MEMBRANARE
Acestea sunt determinate de caracterul amfifil al fosfolipidelor care face ca partile polare să
rămână în contact cu apa intra- şi extracelulară, iar lanţurile hidrocarbonate să se plaseze spre
interior, departe de interacţiunile nefavorabile energetic cu moleculele de apă.
Caracteristicile interfeţei lipide-apă stau la originea proprietăţilor funcţionale numite
“de contact” ale membranelor (activarea enzimelor, fenomene de recunoaştere etc.). De
cealaltă parte, regiunile hidrocarbonate nepolare contribuie la proprietăţile de suport şi de
barieră, dar şi de “fluiditate”, care contribuie la reglarea funcţiilor membranelor. Structura şi
caracteristicile interfeţei depind de ionizarea grupărilor polare şi de starea lor de hidratare.
Tranziţii de fază în sisteme de fosfolipide: sistemele de fosfolipide îşi pot modifica
starea de organizare prin variaţia temperaturii. Astfel, fosfolipidele anhidre realizează un
fenomen de topire, trecând dintr-o stare de gel în care moleculele sunt foarte puţin mobile şi
dispuse ordonat, într-o stare de cristal lichid, caracterizat printr-o mobilitate mare şi o aranjare
dezordonată a moleculelor. Această proprietate este denumită mezomorfism termotropic.
Datorită faptului că principalul mod de organizare al fosfolipidelor la nivelul membranelor
biologice este faza lamelară, cea mai studiată tranziţie de fază este în prezent trecerea din
faza de gel în faza de cristal lichid. Ea a primit denumirea de tranziţie principală de fază şi a
fost studiată atât din punct de vedere experimental, cât şi teoretic, mai ales pe sisteme model
3
de fosfolipide. Alegerea unui sistem model format dintr-un singur tip de fosfolipid sau din cel
mult 2-3 componente este absolut necesară pentru a înţelege fenomenele care au loc în
decursul tranziţiei principale de fază, deoarece membranele biologice sunt sisteme mult prea
complexe, alcătuite din numeroase tipuri de fosfolipide şi proteine. În cazul membranelor
model (lipozomi multilamelari) alcătuite dintr-un singur tip de fosfolipid, s-a constatat
experimental că tranziţia are loc într-un interval extrem de îngust de temperatură.
Pentru diferite tipuri de fosfatidilcoline, studiile calorimetrice au arătat că temperatura
la care are loc tranziţia de fază este cu atât mai mare cu cât lungimea lanţului de acizi graşi
saturaţi este mai mare [4, 5]. Explicaţia acestui fenomen ar consta în faptul că faza de gel
implică o orientare ordonată a lanţului de acizi graşi la temperatură scăzută, deoarece
mişcarea de agitaţie termică este foarte redusă. În acest caz, lanţurile sunt dispuse în aşa
numita conformaţie all-trans. Creşterea temperaturii duce la creşterea mişcării de agitaţie
termică. Astfel, creşte posibilitatea apariţiei unor rotaţii gauche ale atomilor de carbon
implicaţi într-o legătură simplă; aceste rotaţii gauche necesită o energie de aprox. 0,5
kcal/mol. Rezultă în acest mod o dispunere dezordonată a lanţurilor de acizi graşi, care
caracterizează starea de cristal lichid [4].
Tehnicile de măsurare a anizotropiei fluorescenţei permite de asemenea evaluarea
stării de gel şi a stării de cristal lichid prin calcularea unui parametru de anizotropie
II IIr (I I ) /(I 2I ) , a cărui valoare scade cu creşterea temperaturii.
I. 2. PARAMETRII BIOFIZICI AI MEMBRANELOR
I. 2.1.A. DINAMICĂ ŞI ORDINE MOLECULARĂ LA NIVELUL BIOMEMBRANELOR
Starea de cristal lichid arată faptul că, în membrane, moleculele sunt poziţionate într-
o manieră relativ ordonată, asemănător cu dispunerea atomilor într-un cristal. Ordinea este
menţinută de interacţiunile dintre constituenţi (hidrofile şi hidrofobe) şi de interacţiunile cu
moleculele din mediu (predominant hidrofile). Ele au posibilitatea de a realiza mişcări, ce pot
fi grupate în două mari categorii: mişcări intramoleculare si mişcări de deplasare [2, 6].
Toate aceste mişcări ale componentelor membranare sunt posibile deoarece la baza
organizării lor stau forţe de interacţiune de natură fizică: legături Van der Waals, interacţiuni
hidrofobe, electrostatice, legături de hidrogen şi nu legături chimice puternice (covalente).
Ca urmare a mişcărilor descrise, membrana capătă caractere specifice stării lichide.
I. 2. 1. B. CONCEPTELE BIOFIZICE DE ORDINE, FLUIDITATE, MICROVISCOZITATE
Mişcările componentelor intramembranare pot fi evaluate folosind o serie de tehnici
fizice-biofizice care permit măsurarea mai multor parametri. Astfel, se pot defini: un
parametru de ordine S - un parametru statistic descriptiv, care se exprimă sub forma unui
raport între organizarea spaţială teoretică maximă şi organizarea reală a unui sistem. Pentru o
moleculă de lipid, se poate considera un segment al lanţului hidrocarbonat încadrat într-un
sistem de coordonate tridimensional. Unghiul dintre aceste axe locale (1, 2, 3) şi axa de
referinţă din laborator, 0z (considerată normală la suprafaţa bistratului) este notat cu . Se
poate defini un parametru de ordine S [7, 8]:
132
1 2 iS cos , i = 1, 2, 3
Fig. 13 Tipuri de mişcări
posibile ale constituenţilor
membranari
4
În acest caz, termenul i23cos reprezintă media în timp a fluctuaţiilor de direcţie ale
coordonatei i. Parametrul de ordine poate fi determinat prin: spectrometrie RMN, RES [9],
depolarizarea în timp a fluorescenţei [10], metode de simulare a dinamicii moleculare [11].
Fluiditatea reprezină o proprietate globală a membranelor celulare, care este
consecinţa legăturilor slabe dintre moleculele componente ale membranei (interacţiuni
hidrofile-hidrofobe) ce permit mişcări permanente ale moleculelor, în condiţiile în care se
păstrează o ordonare a acestora (ordine în două dimensiuni ce determină starea de cristal
lichid a membranei). Inversul fluidităţii se numeşte microvâscozitate a biomembranelor,
având în mod normal valoarea de circa 10-3
Ns/m2, adică de circa 100 de ori mai mare decât a
apei, care este de 0,1Ns/m2 (0,1 Ns/m
2 = 1 poise) [6, 12].
I. 2. 2. PARAMETRI CARE INFLUENŢEAZĂ FLUIDITATEA MEMBRANARĂ.
Factorii fizici ce influentează fluiditatea membranară sunt: temperatura, stresul osmotic si
potenţialul transmembranar. Pricipalii factori chimici care influenţează fluiditatea
membranară sunt: gradul de nesaturare şi lungimea lanţurilor hidrocarbonate [2, 6], raportul
colesterol/ fosfolipide [2, 6]; raportul sfingomielină/ fosfatidilcolina (SM/PC) [6, 13, 14];
raportul proteine/ lipide [3, 15-18].
CAP. II. PRINCIPALELE METODE DE STUDIU ALE PARAMETRILOR
BIOFIZICI AI MEMBRANELOR
Gruparea metodelor de studiu a biomembranelor trebuie făcută plecând de la modelul
acceptat în prezent cu privire la organizarea tridimensională a acestor structuri – modelul
mozaicului fluid [2]. Acesta presupune pe de o parte o anumită ordonare a moleculelor
componente ale unei membrane (ex.: dispunerea fosfolipidelor în dublu strat), dar fără ca
această dipunere să fie strict rigidă, fiind permise diferite mişcări, deci o anumită dinamică a
componentelor. Pentru punerea lor în evidenţă sunt necesare tehnici care se bazează pe
fenomene fizice care se produc pe aceeaşi scală de timp (ps-s) sau de distanţă (Å-m) cu
mişcările moleculelor.
Metode spectrale de evaluare a dinamicii moleculelor membranare
Spectrometria electronică de absorbţie (SEA). La absorbţia radiaţiei electromagnetice de
către molecule, aceasta interacţionează prin componenta sa electrică. Pentru ca radiaţia să
poată fi absorbită, ea trebuie să aibă energia egală cu diferenţa între două niveluri energetice
ale moleculei şi în plus, tranziţia moleculară trebuie să fie însoţită de o modificare a poziţiei
momentului de dipol. O teorie clasică a influenţei mediului asupra frecvenţei tranziţiilor
electronice ce se datorează interacţiunilor dipolare între molecula solvită şi moleculele
solventului a fost elaborată de către N. G. Bakhshiev [19, 20]. Această teorie ţine cont de
modificările caracteristicilor electrice ale moleculelor unei substanţe la trecerea ei din starea
gazoasă în starea lichidă şi consideră că momentele dipolare permanente ale moleculei în
starea fundamentală şi starea excitată nu sunt paralele. Se consideră că în soluţii, interacţiunile
intermoleculare pot fi clasificate în interacţiuni de orientare, interacţiuni de inducţie,
interacţiuni dinamice şi interacţiuni de dispersie. Energiile corespunzătoare sunt exprimate
prin intermediul momentului dipolar al moleculei în starea respectivă şi prin intensitatea
câmpului local determinat de prezenţa moleculelor solventului. În subcapitolul IV.2 este
extinsă teoria privind influenţa solventului asupra spectrelor electronice de absorbţie.
Spectrometria electronică de fluorescenţa (SEF) se bazeaza pe fenomenul prin care
anumite molecule emit radiaţii cu o lungime de undă mai mare decât cea absorbită. Pentru ca
o moleculă să absoarbă o radiaţie electromagnetică, este necesar ca această radiaţie să aibă o
anumită energie (sau lungime de undă), iar momentul dipolar al moleculei să fie paralel cu
vectorul electric al câmpului electromagnetic.
5
Pentru determinări de polarizare şi anizotropie a fluorescenţei este necesară lumina vertical
polarizata (vectorul electric este paralel cu axa 0z) pentru excitare şi măsurarea intensităţii
fluorescenţei emise cu un polarizor orientat paralel şi apoi perpendicular pe primul [21].
Anizotropia unei surse de lumină este definită ca raportul dintre intensitatea componentei
polarizate şi intensitatea totală. Dacă lumina este polarizată după direcţia 0z, ea este simetrică
după 0x şi 0y, deci Ix = Iy. Excitarea unui fluorofor cu lumină polarizată este de asemenea
polarizată, ca urmare a fenomenului de fotoselecţie a moleculelor orientate paralel cu direcţia
de polarizare a luminii incidente. Lumina emisă poate fi depolarizată printr-o serie de
fenomene, dintre care unul din cele mai importante se datorează difuziunii rotaţionale a
fluoroforului. Măsurătorile de polarizare sau de anizotropie estimează unghiul cu care se
roteşte molecula pe durata timpului de viaţă al stării excitate. Mişcările efectuate de fluorofor
depind de vâscozitatea solventului, de dimensiunile şi forma moleculei fluorescente. În
consecinţă, modificările vâscozităţii determină modificări ale anizotropiei fluorescenţei.
Aceste proprietăţi ale fluoroforilor sunt aplicate în cadrul tehnicilor de determinare a
microvâscozităţii (sau inversul ei – fluidităţii) membranelor celulare.
Spectrometria în infraroșu cu transformată Fourier (FT-IR) Energia totală a unei molecule constă din contribuţiile energiilor de vibraţie, rotaţie,
spin electronic şi electromagnetic. Ea este aproximată ca sumă a acestor contribuţii, orice
interacţiune fiind considerată ca o perturbare. Separarea mişcării electronice de cea nucleară
este cunoscută sub denumirea de aproximaţia Born-Oppenheimer şi depinde de diferenţa de
masă dintre electroni şi nuclee. Deoarece primii sunt mult mai uşori, ei au viteze relativ mari,
de aceea se presupune că nucleele au poziţii fixe. Oscilaţii nucleare mici (comparativ cu
distanţa interatomică) au loc într-o distribuţie medie a electronilor. Variaţia energiei acestor
vibraţii nucleare, în urma interacţiunii cu radiaţia la frecvenţe corespunzătoare, este originea
spectrelor de vibraţie [22]. O radiaţie care trece printr-un material este absorbită numai dacă
frecvenţele acesteia corespund cu modurile normale de vibraţie (tranziţii permise în infraroşu)
[23]. Absorbţia radiaţiilor este determinată de apariţia sau variaţia momentului dipolar al
moleculei în timpul tranziţiei dintre nivelurile energetice. Moleculele heteronucleare îşi
modifică momentul de dipol, în timp ce moleculele homonucleare (exemplu: O2) sunt inactive
în spectroscopia IR, datorită simetriei moleculare. Există însă posibilitatea investigării
moleculelor homonucleare prin dispersie Raman a radiaţiilor IR, aceasta măsurând variaţia de
polarizabilitate moleculară [24, 25]. Nivelurile de energie de vibraţie pot fi calculate utilizând
analiza coordonatelor normale, cu ajutorul căreia s-au stabilit factorii ce influenţează
spectrele, şi anume: tăria legăturii, masa atomică, geometria şi interacţiunea cu legăturile
chimice învecinate.
Modurile normale de vibraţie şi analiza coordonatelor normale
Într-o moleculă, poziţiile relative ale atomilor variază în permanenţă, existând un
număr mare de moduri de vibraţie si de rotaţie în jurul legăturilor din moleculă. Pot exista
foarte multe moduri de vibraţie chiar pentru molecule simple, dar ele pot fi reduse - prin
însumare (sau diferenţă) - la un număr mai mic şi vor fi denumite moduri normale de vibraţie
ale anumitor atomi. Numărul de moduri normale de vibraţie ale unei molecule depinde de
numărul de atomi pe care-l conţine şi, deci, de gradele de libertate [26, 27]. Vibraţiile
fundamentale se împart în: vibraţii de valenţă sau de alungire (se modifică distanţa
interatomică în direcţia legăturii) şi vibraţii de deformare unghiulară (se modifică unghiul
de legătură). Există patru tipuri de astfel de vibraţii, şi anume: de forfecare, de rotaţie, de
balansare (oscilaţie, intercalată), de torsiune.
Spectrometria de reflexie totală atenuată cu transformată Fourier (FTIR-ATR) este una
dintre cele mai puternice metode utilizate pentru înregistrarea de spectre în infraroşu ale
membranelor biologice [28]. Această metodă permite obţinerea de informaţii asupra orientării
diferitelor părţi ale moleculelor. Structura secundară a majorităţii proteinelor poate fi
6
clarificată prin spectrometria în infraroşu [22]. Conformaţia moleculelor poate fi studiată în
funcţie de temperatură, presiune şi pH, precum şi în prezenţa unor liganzi specifici. O
posibilitate a studiului IR în cazul membranelor artificiale este acela referitor la tranziţiile de
fază şi modificările de conformaţie ale bistratului lipidic. Banda de absorbţie pentru alungirea
simetrică a grupării CH2 care se găseşte în jurul valorii de 2850 cm-1
poate fi o probă a valorii
gradului de ordine sau dezordine, cu creşterea acestei valori odată cu creşterea dezordinii. Se
poate monitoriza modul în care mediul şi compoziţia membranei influenţează proprietăţile
bistratului (influenţa lipidelor nesaturate, proporţia de colesterol, pH-ul, cationii sau
temperatura). Absorbţia ce apare în cazul legăturii C=O (vibraţii de întindere) ne oferă
informaţii despre gradul de hidratare al membranei (implicare în realizarea de legături de H).
Studiile pentru mixuri de lipide pot oferi informaţii despre tranziţiile de fază
(organizarea în domenii membranare) şi comportamentul termotropic al fiecărei faze. Lipidele
predeuterate sunt preferate pentru astfel de studii, ceea ce duce la scăderea numărului de undă
a grupării CH2 cu aproximativ 800 cm-1
de la banda normală (2950-2850 cm-1
) ajungând la
2000-2200 cm-1
[29].
CAP. III. INFLUENŢA TEMPERATURII ŞI CONCENTRAŢIEI ASUPRA GRADULUI DE
ORDONARE AL STRUCTURILOR DE TIP MEMBRANAR
Datorită structurii primare (legăturile polipeptidice formate de AA) şi modalităţilor de
organizare conformaţională (spaţială) caracteristice proteinelor, acestea pot fi considerate
polimeri naturali. Între forma nativă (activă biologic) si forma denaturată a proteinelor există
diferenţe majore (modificări ale structurilor secundare, terţiare şi cuaternare). Pentru unele
proteine nedenaturate banda corespunzătoare amidei I este simetrică şi are un maxim în
apropiere de 1650 cm-1
(corespunzător structurii helix). În cazul, proteinelor denaturate
aceasta prezintă deplasări spre intervalul 1620-1640 cm-1
, datorită creşterii ponderii
structurilor -pliat şi în apropiere de 1680 cm-1
, corespunzând structurii dezordonate.
Spectroscopia FT-IR oferă o cale foarte bună spre caracterizarea structurală şi morfologică a
filmelor poliamidice. Scopul studiului s-a axat pe utilizarea tehnicii de spectrometrie FTIR
pentru atribuirea centrilor activi din structura poliamidei 6 anionice (Nylon 6) folosită ca
substrat pentru materiale cu proprietăţi biocidale.
Materiale şi metode
Poliamida 6 a fost preparată folosind deschiderea prin polimerizare a inelului anionic
al -caprolactam conform datelor din literatură. Filmele de polimeri au fost obţinute prin
tratare cu soluţie de acid formic poliamidic (10%). Compuşii cu greutate moleculară mică au
fost indepărtaţi prin extracţie Soxhlet. Spectrele IR (FTIR) au fost inregistrate cu un
spectrometru Jasco FT/IR-670 utilizând intervalul de 400-4000 cm-1
, o rezoluţie de 4 cm-1
şi
o co-adiţie de 100 scanări. Influenţa temperaturii asupra benzii de absorbţie amidice A (3294-
3305 cm-1
), amidice I (1645-1650 cm-1
) şi amidice II (1536-1547 cm-1
), a fost urmărită cu
ajutorul Fourier Self Decumvolution folosind Jasco Spectra Manager Software (Jasco Corp)
[30] în intervalul 20-180 C. Morfologia de suprafaţă a filmelor poliamidice 6 a fost
determinată folosind SEM ( TESLA BS 300). Imaginile SEM au fost marite de 1500-3000 ori
folosind o diferenţă de potenţial de 6kV. Filmul polimeric a fost fixat pe un suport metalic cu
grafit coloidal şi acoperit cu două straturi de Ag prin vaporizare catodică la o diferenţă de
potenţial de 1.4 kV.
Rezultate şi discuţii
Polimerizarea anionică a fost aleasă deoarece este un proces mai rapid ajungând la o
conversie de echilibru în doar câteva minute, comparativ cu polimerizarea hidrolitică clasică.
7
Fig. 1 a,b Spectre FTIR caracteristice ale poliamidei 6 [31]
Elementul structural esenţial al poliamidei 6, grupul amidic secundar (CO-NH) este o unitate
vibraţională complexă în intervalul IR şi implică vibraţii de întindere şi deformare. Pentru a
studia influenţa diferiţilor factori asupra structurii poliamidei 6 este foarte importantă
identificarea benzilor de absorbţie caracteristice. Între grupările amidice scundare (NHCO) se
formează legături puternice de hidrogen în poliamida 6. A fost identificată o relaţie directă
între aranjarea legăturilor de hidrogen şi modurile vibraţionale respective atribuite în IR
comparativ cu spectre ale Nylon 6 date în literatură [32-34]. Poliamida 6 posedă trei benzi
intense de absorbţie în IR la aproximativ 3294 cm-1
(amida A, vibraţia de întindere NH = N-
H), 1645 cm-1
(amida I, =C=O) şi 1545 cm-1
(amida II, deformaţia =N-H) (Figura 1 a,b), care
pot fi influenţate de interacţiunea legăturilor de hidrogen. Ultimele două benzi amidice rezultă
din cuplarea electronică a modurilor C=O şi C=N, cuplarea mecanică a C=N în plan şi a
modului δNH. Aceasta înseamnă că la frecvenţa cea mai joasă a amidei I, apare cea mai
puternică legătură de hidrogen ce implică banda amidică C=O şi cea mai mică densitate
electronică de-a lungul C=O. Pe de altă parte maximul benzii amidice II se deplasează spre
frecvenţe mari când hidrogenul se leagă puternic. De asemenea cele trei forme cristaline
predominante ale poliamidei 6, pot fi distinse la temperatura camerei, prin analiza spectrelor
lor în IR. Câteva benzi caracteristice asociate cu formele mezomorfe [35], -cristaline şi γ-
cristaline, ale filmelor polimerice sunt înregistrate în Tabelul I.
Tabel I Atribuirea benzilor în poliamida 6 [31]
Numere de
undă
(cm-1
)
Forma Atribuire
Numere de
undă
(cm-1
)
Forma Atribuire
1170 mezomorfă (m) CH2 -răsucire 1645 - Cristalină Amida I
1199 - Cristalină CH2 2864 - Cristalină CH2 întindere
sim.
1264 , - Cristalină CH2 -forfecare 2934 - Cristalină CH2 întindere
asim.
1462 - Cristalină CH2 - forfecare 3071 - Cristalină Asoc. N - H
1476 - Cristalină CH2 - forfecare 3294 - Cristalină N – H
întindere
1545 , - Cristalină Amida II 3303 - Cristalină N – H
întindere
8
Fig. 2.a (stanga) Deplasări spectrale ale maximelor de absorbţie ale poly(ε-caprolactam) în timpul procesului de
încălzire. Deplasările ale structurii -crys corespund mişcărilor de forfecare ale grupării CH2 [31].
Fig. 2.b (dreapta) Spectrul FTIR al Poliamidei în funcţie de temperatură. O intensă bandă de absorbţie apare la
170 şi 180 °C.
Banda corespunzătoare legăturii de hidrogen N-H cu vibraţia de întindere la 3307 cm-1
în faza
γ a poliamidei, este mai slabă decât cea asociată fazei deoarece legătura de hidrogen N-H
este modificată. Alte benzi atribuite grupurilor amidice şi secvenţelor etilenice au fost după
cum urmează: 3083 cm-1
(întinderea NH), 2934 şi 2868 cm-1
(întindere CH2 asimetrică şi
simetrică), 1305 cm-1
(balansarea CH2), 1265 cm-1
(îndoire N-H şi întindere CN), 1170 cm-1
(mişcarea vibraţională a scheletului CO-NH). Benzile 929 şi 1201 cm-1
au fost atribuite fazei
-cristaline, în timp ce banda 973 cm-1
a fost atribuită fazei γ-cristaline. Este cunoscut că sub
influenţa căldurii majoritatea compuşilor de nailon prezintă o tranziţie cristal-cristal. Spectrul
IR luat ca funcţie de temperatură pentru poliamida 6 în regiunea frecvenţelor 1433-1504 cm-1
şi 777-805 cm-1
sunt reprezentate în Figura 2-a,b. În urma tratamentului termic a apărut o
nouă bandă la 795 cm-1
iar în intervalul 1433-1500 cm-1
s-a observat o creştere a
absorbanţelor (Figura 2a). Acest lucru indică o mişcare conformaţională datorată creşterii
temperaturii asociată cu modificări în interiorul cristalului [36, 37]. Nu este clară originea
maximului de la 795 cm-1
(Figura 2b), prezent în spectru la 170-180 C, şi nu poate fi atribuită
benzii de balansare CH2.
Fig. 6 a,b Imagini tipice ale filmului poliamidic 6. Imaginile au fost mărite de 1500 respectiv 3000 de ori. Din
aceste figuri rezultă faptul că structura polimerului include ambele regiuni, amorfă şi cristalină
1485cm-1
180°C
1470 cm-1
40°C
9
Concluzii
Spectrul FTIR al poliamidei 6 anionice a ilustrat benzi caracteristice ale grupurilor
NH-CO, formelor şi γ-cristaline ale polimerului şi prezenţa legăturilor intermoleculare de
hidrogen. Tratamentul termic influenţează poziţia şi intensitatea benzilor de absorbţie ale
poliamidei 6 datorită modificării cristalinităţii sale. Aceste observaţii sunt utile pentru
caracterizarea poliamidelor ca suport pentru materiale biocide. Centrul activ NH este
important pentru ataşarea compuşilor bioactivi în lanţul poliamidic prin tratarea suprafeţei sau
prin modificări chimice ale polimerului.
III. 2 Studiul tranziţiilor de fază termotropice în cristale lichide
Lipidele amfifile prezintă un comportament denumit termotrop, care se explică prin
diferenţa mare de energie de interacţiune dintre lanţurile hidrocarbonate, pe de o parte, şi
capetele polare, pe de altă parte. Când temperatura creşte, interacţiunile dintre lanţuri se rup
înaintea celor dintre capetele polare. De fapt, nu există o unică trecere din starea „solidă” în
cea lichidă, ci un interval mai larg de tranziţie.
Fosfolipidele se pot organiza diferit în funcţie de cantitatea de apă din sistem
(mezomorfism liotropic). Deasemenea îşi pot modifica starea de organizare şi prin creşterea
temperaturii, trecând dintr-o stare de gel în care moleculele sunt foarte puţin mobile şi dispuse
ordonat, într-o stare de cristal lichid, care se caracterizează printr-o mobilitate mare şi o
aranjare dezordonată a moleculelor (mezomorfism termotropic). Trebuie de remarcat că şi
fazele liotropice prezintă un mezomorfism termotropic, astfel încât o anumită fază obţinută
depinde atât de cantitatea de apă din sistem, cât şi de temperatură. [38, 39].
Şi unii polimeri, cum ar fi esterul Poli-(fenil-metacrilic) al acidului cetiloxibenzoic
(PPMAECOBA) în tetraclorometan (TCM) prezintă aceleaşi proprietăţi. Influenţa
temperaturii asupra echilibrului între fazele de ordine şi dezordine ale (PPMAECOBA) în
tetraclorometan (TCM) poate fi evidenţiată prin analiza spectrelor FTIR ale lanţurilor alchil
din compuşii amfiliofilici.
Mezofaza liotropică apare prin solvirea unui mesogen amfiliofilic într-un lichid care
nu solvă compusul amfifilic în condiţii adecvate de concentraţie şi temperatură [40, 41].
Echilibrul între faza de ordine şi dezordine în cristale lichide liotropice este influenţat de
temperatură. Mişcarea termică coroborată cu prezenţa impurităţilor poate determina tranziţii
între de gel şi faza cristalină lichidă. Faza de gel este caracterizată de un grad înalt de ordine,
în timp ce în faza cristalină lichidă lanţurile laterale lungi ar putea fi dezordonate secvenţial.
Esterul Poli-(fenil-metacrilic) acidului cetiloxibenzoic (PPMAECOBA) în
tetraclorometan (TCM) este un cristal lichid liotropic polimeric prin lanţurile sale secundare,
pentru o concentraţie a polimerului de aproximativ 10-2
g/cm3
[33, 34, 42]. Acest cristal lichid
liotropic este constituit de către interacţiuni dipolare colective între lanţuri polimerice
secundare lungi [37]. Particularităţile structurale chimice ale radicalilor catenelor lungi
secundare, conţinând un grup atomic capabil să formeze un cristal, determină un timp de
relaxare crescut. Acest timp depăşeşte cu cinci sau şase ordine de mărime valorile
corespunzătoare polimerilor cu catena flexibilă [37]. Proprietăţile anizotropice ale
PPMAECOBA în TCM sunt determinate de supraordonarea moleculară a catenelor laterale
ale macromoleculelor.
Apariţia organizării supramoleculare, în amestecul de PPMAECOBA cu TCM se datorează în
Fig.7 Formula chimică a
PPMAECOBA
10
mare parte interacţiunilor dipolare dintre grupările laterale, nu doar la nivelul unei molecule ci
mai ales, la nivelul tuturor moleculelor. Direcţia catenei principale nu este determinată de
forţele interne, astfel încât acestea formează „ghemuri” din care ies catenele laterale orientate
prin forţe dipolare.
Aceste sisteme sunt similare cu cele formate în modelele membranare sau în
membranele biologice [23, 43-45]. Ele sunt influenţate de temperatura. Agitaţia termică poate
dezorganiza alinierea catenelor laterale prin interacţiuni colective. Gradul de ordine este
influenţat de asemenea de impurităţi.
Materiale şi metode
Cristalul lichid liotropic este păstrat într-o celulă specială de CaCl2 (Figura 8) [23, 37]
care poate fi încălzită până la 70 °C. Influenţa temperaturii asupra gradului de ordine este
evidenţiată de vibraţiile de valenţă ale grupării CH2 din intervalul 2800-3000 cm-1
al spectrului
FTIR. Peretele intern al celulei a fost acoperit cu un strat de orientare moleculară obţinut
dintr-o soluţie de 5% lecitină în apă. Distanţele dintre feţele laterale ale celulei au fost de 12
µm grosime. Aşadar, stratul de lichid prezintă o anizotropie intrinsecă dată de orientarea prin
interacţiuni colective şi de o orientare suplimentară indusă de stratul de lecitină.
Spectrul FTIR a fost înregistrat cu un dispozitiv FTIR BOMEM BM 157. S-a folosit
un dispozitiv de monitorizare a temperaturii Unicam Specac Temperature Controller [46].
Spectrele FTIR au fost în medie de la 100 scanări. Influenţa solventului a fost eliminată prin
extracţia benzilor IR corespunzătoare acestuia din spectrul FTIR al cristalului lichid liotropic.
În Tabelul IV sunt redate deplasările spectrale în intervalul 2800-3000 cm-1
pentru intervale
diferite de temperatură [47].
Fig. 9. Spectrul FT-IR
corespunzător vibraţiilor
de întindere ale lanţurilor
alchil ale PPMAECOBA
Fig. 8. Celula utilizată pentru cristalul lichid;
1-Fascicul IR,
2-CaCl2 ,
3-orientarea stratului de lecitină,
4-spaţiatoare,
5-stratul de cristal lichid
11
Tabel IV. Deplasările spectrale ale vibraţiilor de întindere simetrice şi asimetrice (în cm-1) ale grupării CH2 în
funcţie variaţia temperaturii (°C)
Valorile cu indice 0, reprezintă valorile iniţiale.. Indicii s şi as se referă la vibraţiile de
valenţă simetrice şi asimetrice în grupările CH2. Din Tabelul IV rezultă o creştere a
deplasărilor spectrale cu temperatura, pentru benzile FTIR atribuite vibraţiilor de valenţă
simetrice şi asimetrice. În Figura 10 sunt reprezentate dependenţa numerelor de undă
corespunzătoare vibraţiilor de valenţă simetrice, iar în Figura 11 cu vibraţiile de valenţă
asimetrice de variaţia temperaturii. Pentru 15 ºC deplasarea spectrală este aproape nulă. Un
număr de undă de undă mare apare la 20 ºC aşa cum se observă în Figura 10 şi 11. Tranziţia
este foarte rapidă iar numărul de undă devine aproape constant.
Fig. 10. (stanga) Deplasările spectrale ale vibraţiei simetrice ale ale grupării CH2 vs. temperatură
Fig. 11. (dreapta) Deplasările spectrale ale vibraţiei asimetrice ale grupării CH2 vs. temperatură
Rezultate şi discuţii
Din Tabelul IV, Figura 10 şi Figura 11 rezultă că se înregistrează o tranziţie principală
de fază prin creşterea temperaturii. Această tranziţie de la faza de gel la cea de cristal lichid
apare în intervalul de temperatură corespunzător unui salt al numărului de undă în graficele
din Figura 10 şi Figura 11. Coordonatele mijlocului saltului pentru numărul de undă în Figura
10 şi 11 determină coordonatele tranziţiei principale de fază:
Din Figura 10 şi 11 reiese faptul că tranziţia principală de fază are loc la 45,7 ºC. Se produce
o creştere a dezordinii în lanţurile secundare lungi. Valorile tranziţiei principale de fază sunt:
;C.tm 745 ;cm.m,s172870 1082942 cm.m,as .
Concluzii
Temperatura poate dezorganiza stratul cristalin lichid realizat de PPMAECOBA în
TCM. Spectrometria FT-IR oferă posibilitatea de a determina coordonatele tranziţiei
principale de fază ale cristalului lichid liotropic. Pentru cristalul lichid liotropic
(PPMAECOBA) în tetraclorometan (TCM) a fost evidenţiată o tranziţie principală de fază la
45,7 ºC.
12
III. 3 Studiul influenţei câmpurilor electromagnetice de înaltă frecvenţă şi microunde
asupra bistraturilor de dipalmitoilfosfatidilcolină (DPPC). Controlul
parametric al permitivităţii electrice pentru faza Lα a DPPC, evidenţiată prin
metode de simulare.
În acest studiu [48] am realizat o simulare pentru determinarea componentelor
tensorului permitivitate electrică al dipalmitoilfosfatidilcolinei (DPPC) hidratate în fază de
cristal lichid (LC), Lα. Comportamentul complex al bistraturilor ordonate smectic în structura
multilamelară a acestui lipid biologic a fost analizat prin metode de simulare structurală
folosindu-se programul HFFS (high frequency structural simulator, program de simulare
structurală 3D, tehnologie Ansoft - reproduce structura 3D la nivel micoscopic şi îi testează
comportarea în câmpuri electromagnetice de înaltă frecvență şi microunde).
Rezultatele obţinute ilustrează o variaţie semnificativă a valorilor permitivităţii relative
paralel εr║ (30 - 96) de-a lungul structurii multistrat, atât în interiorul cât şi în afara
bistraturilor. Studiul materialului prin simulare ne oferă posibilitatea modificării diverşilor
parametri fizici şi geometrici la nivelul structurii (concentraţiile constituenţilor în soluţie, ionii
tampon, temperatura) prin care se pot controla variaţiile permitivităţii electrice la scară
microscopică şi implicit permitivitatea efectivă a cristalului lichid la scară macroscopică.
Factorul temperatură se impune ca un factor foarte important care trebuie considerat
pentru determinarea valorilor corecte ale permitivităţii electrice, datorită faptului că în
intervalul de temperatură între 21 şi 42 °C au loc mai multe transformări de fază în DPPC, de
la gel la cristal lichid, fiecare fază prezentând ordine internă diferită şi parametri caracteristici.
Metoda de simulare dezvoltată de noi ne-a permis modificarea parametrilor de control
la nivelul structurii şi precum şi monitorizarea efectelor cu o precizie satisfăcătoare (mai puţin
de 4 % eroare relativă la determinarea parametrilor fizici caracteristici structurii).
Printre parametrii fizici caracteristici structurii moleculare consideraţi la simulare enumerăm:
masa molară de 734.038862 g/mol; polarizabilitatea moleculară: 82.39 a.u. = 13.584·10-40
C·m2/V, aria suprafeţei polare: 121 Å
2, aria suprafeţei accesibile pentru solvent (aria de
solvatare): 1403.77 Å2; momentul dipolar efectiv ale DPPC: 1.564 · 10
-30 C·m (DPPC se
prezintă ca un dipol vertical negativ datorat poziţionării relative a unui grup fosfat încărcat
negativ şi a grupului trimetilamoniu încărcat pozitiv); lungimea legăturii OH: rOH = 0.9572 Å;
unghiul legăturii HOH: θHOH = 104.52° [49-51].
În cadrul simulărilor, modelul de difuzie anizotropic rotaţional care descrie reorientarea
moleculelor sau a segmentelor moleculare în bistraturile de lipid a fost înlocuit cu un model
colectiv pentru reorientări moleculare lente în bistraturi, în concordanţă cu rezultatele
prezentate în literatură [54, 55]. Au fost urmărite în detaliu modificările structurale ale
membranei ce survin odată cu varierea temperaturii, lucrând la presiune atmosferică normală.
Odată cu creşterea temperaturii, membrana bistratificată de DPPC suferă trei tipuri de
modificări structurale: subtranziţia din faza de subgel (faza Lc) în faza de gel lamelar (faza Lβ')
la 21.2 °C (datorată scăderii gradului de ordonare a lanţurilor alcanice şi hidratării capurilor
polare), pre-tranziţia spre faza de gel - bistrat în formă de undă, dezordonat (ripple gel phase -
Fig. 21 Structura moleculară a
dipalmitoilfosfatidilcolinei
(C40H80NO8P).
(polar head = cap polar; 2 tails (alkane
chains) = 2 cozi (lanţuri alcanice)
13
faza Pβ') la 34.3 °C, şi în final tranziţia principală de fază către structura de cristal lichid
(Figura 22) (faza Lα) la Tm = 42.0 °C [52, 53]:
LPLL CCC
c 000 423.342.21 '' .
Cu ajutorul metodei de simulare, au fost reprezentate atât fazele "ordonate" (Lc, Lβ',
Pβ'), care se transformă din una în alta, cât şi faza "dezordonată" Lα. În cazul tranziţiei
principale de fază au fost considerate: ΔH = 7.4 ± 0.4 kcal/mol; ΔG(H2O) = 6.57 ± 0.3
kcal/mol; Ea = 50.34 ± 5.46 kcal/mol. Simularea efectuată a scos în evidenţă un fapt
important şi anume faptul că diferite faze pot coexista, iar pentru comportarea complexă a
structurii cu temperatura este specifică o diagramă de fază. Ca un extradomeniu pe diagrama
de fază, trebuie menţionat că în condiţii speciale poate apare o structură interdigitată, care nu
este o structură bistrat, formată într-un domeniu de temperatură finit, la presiuni înalte de
peste ca. 1000 atm [52].
Faza care captează cel mai mult atenţia în cazul soluţiilor apoase de DPPC este faza de cristal
lichid, care prezintă o organizare şi o dinamică interesante. Ca şi mecanism, apa poate
pătrunde adânc în interiorul bistraturilor de lipid, aproape până la capătul lanţurilor alifatice
[54]. Moleculele de apă penetrează prin vecinătatea grupului N(CH3)3 aparţinând capului
polar şi pot forma legături de hidrogen cu oxigenul carbonil prezent în interiorul bistratului
[61, 62]. Efectul pătrunderii apei în interiorul bistratului este creşterea gradului de dezordine
al cozilor (lanţurilor alcanice) în faza Lα a DPPC (la temperaturi mai mari decât Tm), cu cozile
lipidice mişcându-se aleator. Odată cu creşterea temperaturii, gradul de întrepătrundere al
lanţurilor alchil din cele două monostraturi vecine creşte, dar structura de bistrat se păstrează.
În final (peste Tm şi în stare staţionară) a fost găsită experimental o ordonare internă
care aminteşte de un cristal lichid smectic [55] şi care a fost reprodusă în studiul de faţă cu
ajutorul metodei noastre de simulare, structură în care distanţa dintre straturile duble de
molecule aglomerate este relativ constantă (Figura 23). Substanţele tampon şi aditivii, cum ar
fi Na2HPO4, sau NaCl, ionii de Ca [50, 55], etc., pot ajuta la controlul acestei distanţe în
scopul obţinerii de structuri CL cu diferiţi parametri macroscopici.
Permitivitatea electrică a membranei de lipid în exces de apă poate fi exprimată în
formă tensorială, considerând formula pentru inducţia electrică în interiorul structurii de
cristal lichid:
Fig. 23 Structura de cristal lichid
lamelar a DPPC-ului cu exces de apă
(plus aditivi).
Fig. 22 Transformările de fază
induse de temperatură în
membrana bistratificată de DPPC
în prezenţa excesului de apă.
(ripple gel = gel dezordonat,
bistrat în formă de undă - „val”)
14
ED II
II
r
r
r
00
00
00
, cu "j' IIIIII rrr , "' rrr j (1)
Mărimile IIr şi r reprezintă permitivităţile paralelă, respectiv transversală, calculate în
cazul în care direcţia de propagare a câmpului de test este paralelă, respectiv perpendiculară
pe axele moleculare lungi, de-a lungul cărora se defineşte versorul n . Componentele
tensorului permitivitate au fost calculate pe baza unui algoritm fizic conceput în cazul
probelor de cristal lichid expuse câmpului de microunde al unei antene horn. Modul de
expunere al probelor şi setarea câmpului de test au fost stabilite cu ajutorul programului
HFFS.
Algoritmul fizic folosit implică calcularea variaţiilor densităţii de energie la
propagarea câmpului de test prin probele materiale. A fost folosită teorema Poynting în formă
integrală:
V VPoynting dVEJAdSdVw
t (2)
unde HES Poynting reprezintă vectorul Poynting, w reprezintă densitatea de energie, w =
we + wm; J este densitatea de curent şi V este suprafaţa care include volumul probei V.
Variaţia densităţii de energie, dwe, este legată de componentele tensorului susceptibilitate
electrică:
dEEEdEPdEdw eee 00 (3)
Pentru determinarea susceptibilităţii au fost calculate variaţiile dwe la trecerea câmpului prin
probe, folosindu-se datele furnizate de simulatorul 3D (HFSS).
III. 3. c. Rezultate obţinute pentru permitivitatea cristalelor lichide
Am considerat un sistem bistraturi - apă stabil, cu un raport molecular apă/DPPC de
40:1, la presiune atmosferică normală. Odată cu creşterea temperaturii, sistemul trece prin mai
multe faze şi evoluează către un sistem multilamelar. O celulă de test include 10 bistraturi cu
128 x 2 lipide per bistrat (128 per strat din componenţa bistratului). Aria proiectată a
membranei A = L x×L y ("umbra" lăsată de membrană când cade lumina pe aceasta)
corespunde unei arii per lipid de 64.3 Å2; volumele lipidelor sunt de ca. (12 ± 1)·10
2 Å
3/lipid,
valori apropiate de cele considerate în determinările experimentale raportate în literatură [56].
Sub influenţa creşterii temperaturii, începând cu valori situate sub temperatura primei
transformări de fază, lanţurile alcanice ordonate, întinse, înclinate la 33°, încep să se
distanţeze şi să se încovoaie, capurile moleculare polare pierd puţin din ordinea lor planară
regulată, în timp ce moleculele de apă încep să penetreze adânc straturile de molecule
aglomerate. Se formează legături de hidrogen apă - apă sau cap fosfolipidic - apă, grupurile
−PO2- şi −CO fiind capabile să formeze legături de hidrogen cu moleculele de apă [50]. În
jurul tranziţiei principale de fază au loc rearanjări structurale majore în bistraturi, ca şi cum
lanţurile hidrocarbonice ar începe să se "topească".
Determinarea permitivităţilor IIr , r a fost realizată prin simulări pentru membrana
de DPPC hidratată în fază Lα. A fost considerată o constantă de periodicitate lamelară în apă
pură dl ≈ 65 Å (Figura 23). A fost luat în consideraţie faptul că dispersia multilamelară a
DPPC-ului în fază de cristal lichid (care descrie reorientarea segmentelor sau a moleculelor în
bistraturile lipidice) depinde de temperatură şi frecvenţă [57]. Temperatura operaţională în
cazul membranei pentru care au fost reprezentate grafic rezultatele a fost de 49 ºC, situată
15
peste Tm (temperatura principalei tranziţii de fază spre faza Lα). Rezultatele au fost obţinute
pentru câmpuri aplicate cu frecvenţe în domeniul:0.915-2.45 - 5.8 GHz. Valorile permitivităţii
relative, calculate pentru un câmp aplicat E care se propagă paralel cu axa lungă a dipolilor
moleculari, evoluează de-a lungul direcţiei de propagare trecând prin maximile specifice
corespunzătoare regiunilor capurilor polare ale moleculelor, scăzând apoi către valorile mai
mici, corespunzătoare miezurilor bistraturilor cu lanţurile hidrocarbonice (alcanice) şi scăzând
în continuare către valorile minime din zona apoasă dintre bistraturi. Datorită excesului de
hidratare, lanţurile alchil au suficient spaţiu şi libertate de mişcare, pentru a permite dipolilor
moleculari paraleli cu axele moleculare lungi să se alinieze după direcţia câmpului aplicat. Un
capăt dipolar este relativ stabil şi blocat în zona capurilor polare aglomerate, zonă în care
permitivitatea paralelă este ridicată, în timp ce celălalt capăt al dipolilor este relativ liber să se
mişte în miezul hidratat rarefiat (cu permitivitate scăzută) şi este orientat de către câmp.
Metoda de simulare a pus în evidenţă înaltul grad de neuniformitate al valorilor permitivităţii
paralele, determinate de-a lungul structurii multilamelare, valori urmărite pe direcţie
perpendiculară pe bistraturile de DPPC în soluţie apoasă (Oz).
Fig. 24 (stânga) Variaţia componentei paralele a lui r pentru faza Lα de cristal lichid a DPPC-ului în soluţie
apoasă, raport molecular 1:40, reprezentată pe direcţie perpendiculară pe bistraturi (fo = 2.45 GHz, T =
49 ºC). Valorile permitivităţii raporate în literatură pentru zona capurilor polare, în miezurile
hidrocarbonice ale bistraturilor, respectiv în mediul apos intermediar au fost indicate prin linii roşii.
Fig. 25 (dreapta) Variaţia componentei transversale a lui r pentru faza Lα de cristal lichid a DPPC-ului în soluţie
apoasă, raport molecular 1:40, reprezentată pe direcţie paralelă cu bistraturile (fo = 2.45 GHz, T = 49
°C). Au fost considerate pentru reprezentare trei planuri xOy: la nivelul capurilor moleculare polare (B-
B), în miezul hidrocarbonic din interiorul bistratului (A-A), respectiv în mediul apos intermediar (C-C).
Fiecare subgrup molecular prezintă o puternică individualitate (capurile polare,
lanţurile alcanice), iar tranziţia valorilor parametrilor de material corespunzători este abruptă.
Maximele permitivităţii corespunzătoare zonelor cu capuri polare ale moleculelor de DPPC
evidenţiază proprietăţi de bun izolator în zonele respective, zone care se comportă ca o barieră
de conductivitate a membranei apoase. Acesta poate constitui un efect de interes pentru
aplicaţii în domeniul nanotehnologiilor. Zonele relativ extinse de permitivitate scăzută
corespunzătoare miezurilor hidrocarbonice din interiorul bistraturilor de lipid indică faptul că
proprietăţile dielectrice nu sunt atât de bune în interiorul bistraturilor. Permitivitatea electrică
16
din mediul apos din zonele dintre bistraturi scade chiar mai mult faţă de valorile mici din
interiorul bistraturilor; zona apoasă neutră fiind mai uşor polarizabilă şi aflându-se sub
influenţa interacţiunii bistraturilor vecine (valorile permitivităţii nu sunt cele din apa pură).
Fig. 26 Dispersia cu frecvenţa a permitivităţii electrice pentru faza Lα de cristal lichid a DPPC-ului în soluţie
apoasă, raport molecular 1:40, pentru trei frecvenţe de operare ISM: 0.915; 2.45 şi 5.8 GHz . Au fost
reprezentate benzile de fluctuaţie ale permitivităţii transversale în diverse plane xOy (a se vedea Figura
25) la frecvenţele ISM [48].
Procesul de autostructurare a membranei în apă este condiţionat de o concentraţie de
prag a apei în agentul tensioactiv pulmonar pe bază de DPPC. La valori mai mari ale acestei
concentraţii structura de tip bistraturi poate să dispară. Metoda de simulare ne-a indicat că
moleculele de apă trebuie să fie într-un raport de 30:1 până la 100:1 faţă de moleculele de
DPPC, în soluţiile de fosfolipid în care lipozomii sau bistraturile pot să apară în mod spontan.
Rezultatele obţinute prin simulare sunt confirmate de rezultatele experimentale [50]. Prin
simulare am găsit de asemenea că la un raport molecular de peste 120:1 (apă:DPPC), apa în
exces începe să rupă bistratul şi are loc defragmentarea acestora. În acelaşi timp, a fost
determinată o valoare de prag a raportului molecular apă: DPPC de cca. 82:1, care a fost
găsită ca fiind critică pentru ca structura să prezinte ordonare de cristal lichid cu periodicitate
lamelară relativ constantă.
CAP. IV. 1,6-DIFENIL-1,3,5,-HEXATRIENA (DPH) - MARKER FLUORESCENT
UTILIZAT ÎN EVALUAREA FLUIDITĂŢII STRUCTURILOR DE TIP
MEMBRANAR
Cea mai utilizată moleculă pentru studii de polarizare a fluorescenţei este 1,6-DIFENIL-
1,3,5,-HEXATRIENA (DPH). A fost si prima moleculă utilizată de Shinitzky şi Barenholz
(1974, 1978) pentru punerea la punct a teoriei şi principiului tehnicii de polarizare a
fluorescenţei aplicată la descrierea fluidităţii/microvâscozităţii membranelor.
Molecula este o hidrocarbură de tip polienă, cu duble legături în configuraţie all-trans
(care este de altfel şi configuraţia în care molecula este fluorescentă), cu formă alungită de
bastonaş, având lungimea de 13 Å. DPH se încorporează spontan în bistratul lipidic, având un
coeficient de partiţie lipide/apă mare (1,3x106).
Fig. 2. Structura 1,6-difenil-1,3,5-hexatrienei (DPH) construită cu GAMESS-US code at HF/6-31G* level.
17
Studiul influenţei naturii solventului asupra SEA ale DPH
DPH [58] este o polienă nepolară, dar polarizabilă cu o structură alungită, care poate fi
uşor obţinută şi purificată. DPH prezintă spectre electronice intense de absorbţie şi emisie
[24-27]. Spectrele de fluorescenţă ale polienelor ne pot oferi informaţii legate de fluiditatea
membranei din cauza schimbării importante în randamentul fluorescenţei în prezenţa
moleculelor de apă, în comparaţie cu alţi solvenţi [59, 60]. Schimbările din intensitatea
fluorescenţei unor molecule (cum ar fi DPH) pot oferi informaţii despre fluiditatea membranei
sau despre concentraţiile micelare critice în sisteme coloidale [61, 62].
Structura moleculei DPH permite orientarea acesteia de-a lungul lanţurilor de
hidrocarburi ale fosfolipidelor din membranele biologice. În această poziţie, DPH este
fluorescentă, însă aproape de capul hidrofil fosfolipidic fluorescenţa DPH este redusă.
Anularea fluorescenţei DPH în apă şi, de asemenea, sensibilitatea sa la mediu (în special la
natura solventului), recomandă DPH ca senzor pentru alinierea lanţurilor de acizi graşi. În
absorbţie DPH prezintă două benzi electronice [63], în intervalele de 220-240 nm şi 330-380
nm numite B-band şi respectiv, A-band. Maximele vibronice ale A-band DPH sunt
asemănătoare cu cele observate la derivaţii de stilben [64]. Rezultate suplimentare în ceea ce
priveşte influenţa solventului asupra SEA ar putea îmbogăţi datele experimentale şi ar
contribui la obţinerea de informaţii în plus cu privire la fenomenele care determină stingerea
fluorescenţei DPH în diferiți solvenţi (apă, metanol, diclormetan), şi, de asemenea, în ceea ce
priveşte interacţiunile intermoleculare ale DPH în soluţii.
Scopul acestui studiu este de a analiza interacţiunile intermoleculare ale DPH cu un
număr mare de solvenţi pe baza spectrelor de absorbţie electronică ale soluţiilor ternare de tip
DPH + THF + solvent. Totodată, o analiză de mecanică cuantică a proprietăţilor structurale şi
electro-optice ale DPH realizate cu HyperChem 8.0.6 a fost corelată cu datele spectrale.
Toţi cei 34 de solvenţii utilizaţi au fost de puritate spectroscopică şi, prin urmare, nu
au necesitat purificare suplimentară. Solvenţii au fost testaţi şi confirmaţi prin spectroscopie
de absorbţie la lungimile de undă de interes. Soluţia stoc de DPH 1mM în THF fost pregătită
şi păstrată la temperatura de 2°C la întuneric. 150 µL de soluţie stoc DPH a fost adaugată în
1850 µL a fiecărui solvent într-o cuvă de cuarţ cu ajutorul unor micropipete calibrate şi proba
a fost omogenizată. În acest fel, fiecare soluţie ternară conţine DPH + THF şi unul dintre cei
34 de solvenți utilizați. Protocolul pentru obţinerea soluţiilor ternare este frecvent folosit [65,
66], în procedura de marcare a membrane celulare prin măsurători fluorescente. Prezenţa de
THF, în procent de aproximativ 7,5% în soluţiile studiate nu influenţează într-o mare măsură
valorile indicelui de refracţie. De exemplu: pentru Clorbenzen n = 1,511 şi pentru Clorbenzen
+ 7,5% THF n = 1,518; pentru Metanol n = 1,328 şi pentru metanol + 7,5% THF, n = 1,334.
IV. 2. b. 3. Calcule de mecanică cuantică
După parametrizarea şi construcţia moleculei DPH, optimizarea geometriei moleculare a fost
realizată cu ajutorul unui gradient RMS = 0,01 kcal / (mol Å) şi algoritmul Polak Ribiere.
Tabel III (stanga) Parametrii moleculari ai DPH calculaţi cu programul HyperChem 8.0.6.
Tabel IV (dreapta) Parametrii energetiici ai DPH calculaţi cu HyperChem 8.0.6.
În acest context, unele proprietăţi fizico-chimice ale moleculei DPH au fost stabilite
cu HyperChem 8.0.6 [67]. Astfel au fost calculate: momentul dipolar, polarizabilitatea,
18
energiile celui mai de jos orbital molecular neocupat (LUMO) şi celui mai înalt ocupat orbital
molecular (HOMO), tăria chimică (eV), indicele electrofil (eV), caracteristicile
energetice. O mică diferenţă ELUMO - EHOMO indică o structură moleculară cu polarizabilitate
apreciabilă şi valori mici ale energie de excitaţie [68-70]. Aceste proprietăţi moleculare sunt
corelate cu reactivitatea şi activitatea biologică a unei structuri chimice (unele dintre aceste
valori sunt incluse în ecuaţii MLR- Multiple Linear Regression, legate de activitatea
biologică).Valorile energetice din Tabelul IV indică un potenţial de ionizare relativ scăzut şi
afinitate electronică a moleculei de DPH. Orbitalii HOMO (Figura 10) şi LUMO (Figura 11)
în HyperChem arată redistribuirea sarcinii electronice, urmată de o torsiune moleculara [71],
evidenţiată, de asemenea şi în alte lucrări [71, 72]. Distribuţia electronică în orbitalii HOMO
şi LUMO demonstrează posibilitatea unei torsiuni moleculare, inducând posibilitatea unei
tranziţii între stările excitate S1 S2, care ar putea determina stingerea fluorescenţei.
IV. 2. c. 2. Efectul solvenţilor asupra spectrelor electronice de absorbţie (SEA) ale DPH
În spectrul de absorbţie UV-Vis al DPH apar două benzi [63]:
- banda A a DPH constă din trei componente de vibraţie şi doi umeri observaţi la 330-
380nm.
- banda B a DPH este observată la 220-240 nm.
Numerele de undă ale maximelor vibronice ale benzii A depind de natura solventului aşa cum
rezultă din Figura 13.
Fig. 13 SEA al benzii A pentru DPH în solvenţi diferiţi (Tabelul VII.)
Un studiu preliminar [73] a arătat că deplasările spectrale nu depind de permitivitatea
electrică a solventului; acest fapt ar putea fi explicat prin valoarea foarte mică a momentului
de dipol electric (calculat prin HyperChem 8.0.6; D0004.0 ).
Fig. 10 Orbitalii HOMO Fig.11 Orbitalii LUMO
19
Dependenţa 3,2,1;1 icmi de funcţia de dispersie a solventului nf este ilustrată în
Figura 15 a:
Tabel VII Numerele de undă )cm(,,1
321 în maximele benzilor vibronice de absorbţie ale DPH in diferiţi
solvenţi (n – indice de refracţie, ε – permitivitate electrică) [73].
No. Solvent n ε ν1 (cm-1
) ν2 (cm-1
) ν3 (cm-1
)
1 n-Hexan 1.375 1.89 27064 28490 29940
2 n-Heptan 1.387 1.92 26954 28409 29851
3 Ciclohexan 1.426 2.02 26810 28249 29762
4 1,4 Dioxan 1.422 2.22 26596 28090 29499
5 Carbon Tetraclorid 1.407 2.24 26525 27933 29586
6 Benzen 1.501 2.28 26110 27548 29762
7 Clorobenzen 1.525 5.6 26316 27778 29155
8 Toluen 1.497 2.34 26455 27933 29326
9 Cloroform 1.446 4.86 26525 28011 29412
10 Diclorometan 1.424 9.08 26596 28090 29412
11 Dicloroetan 1.445 10.42 26560 28011 29499
12 Tricloretilen 1.478 3.38 26490 27972 29499
13 o - Xylen 1.494 2.28 26420 27894 29369
14 m - Xylen 1.497 2.37 26490 27972 29412
15 Tetrahidrofuran THF 1.404 7.52 26667 28169 29499
16 Acetona 1.359 20.7 26954 28409 29762
17 Metil Etil Cetona 1.379 18 27064 28329 29499
18 Etil acetat 1.372 6.2 26882 28409 29851
19 Etanol 1.361 24.55 26954 28409 29851
20 Metanol 1.328 33 27100 28571 29851
21 Glicerol 1.475 42.5 26385 27855 29326
22 Octanol 1.430 9.8 26667 28169 29499
23 1 - Propanol 1.386 20.33 26954 28490 30030
24 2 - Propanol 1.377 18.3 27027 28490 29851
25 n - Butanol 1.399 17.51 26810 28289 29718
26 iso - Butanol 1.396 17.93 26918 28289 29806
27 Acid Acetic 1.372 6.15 26954 28409 29851
28 Acid Propionic 1.394 3.34 26846 28329 29586
29 Dimetil sulfoxid DMSO 1.479 54 26247 27778 29155
30 Dimetilformamida DMF 1.430 37.6 26525 28011 29412
31 Piridina 1.510 12.3 26247 27701 29070
32 Apa 1.332 81 26455 27894 29455
33 Acetonitril 1.344 37.5 27027 28409 29940
34 Eter etilic 1.353 4.34 27064 28490 29985
În figura 16 a sunt ilustrate dependenţele liniare dintre valorile calculate şi cele măsurate ale
frecvenţelor în maximele benzilor vibronice ale DPH [73]. Rezultă o foarte bună corelare
(după prima bisectoare a figurilor) dintre valorile calculate şi cele experimentale.
Fig. 15a )cm( 11
vs. nf pentru
benzile vibronice din regiunea
26240 - 27070 cm−1
a spectrului
de absorbţie al DPH. Solvenţii
corespunzători poziţiilor 5, 6, 29
şi 32 din Tabelul VII au fost
eliminaţi din cauza abaterii
punctelor corespunzătoare lor în
reprezentarea 1 vs. nf .
20
Acest studiu demonstrează faptul că momentul de dipol al DPH nu este modificat prin
excitare, dar polarizabilitatea electrică creşte cu valori apropiate în cele trei benzi vibronice.
IV. 3. Spectre electronice de fluorescenţă ale DPH în soluţii
Urmând acelaşi protocol de preparare a probelor am urmărit influenţa naturii solventului în
spectrele de fluorescenţă ale DPH.
IV. 3. a. Materiale şi metode
Pentru prepararea soluţiilor ternare am utilizat o soluţie stoc conţinând DPH şi THF în
aceleaşi proporţii ca în şi cazul protocolului de lucru folosit la înregistrarea spectrelor
electronice de absorbţie. Spectrele de excitaţie şi fluorescenţă au fost inregistrate cu un
spectrofluorometru Horiba Fluoromax 4 (Horiba Jobin Yvon) în cuve de cuarţ de 10 mm.
Lungimea de undă de excitare a fost 350 nm (1.7 nm bandpass), iar spectrul de emisie a fost
înregistrat în domeniul 365 - 600 nm. Spectrele au fost înregistrate la temperatura camerei.
Datele au fost prelucrate cu FluorEssence® (Scientific, 2009)
şi Portable Origin software.
IV. 3. b. Rezultate şi discuţii
Spectrele electronice ale DPH sunt prezentate în Figurile 17a şi 17b pentru absorbţie,
repectiv fluorescenţă. În Figurile 18 a,b şi c este evidenţiată dependenţa numerelor de undă
ale maximului de absorbţie (a), fluorescenţă (b) şi cele corespunzătoare traziţiei electronice
pure de funcţia de dispersie. În cazul spectrelor de absorbţie dependenţa este liniară, deoarece
în soluţiile DPH predomină interacţiunile de dispersie (Figura 18 a). Abateri mari de la o
dependenţă liniară au fost evidenţiate (Figura 18 b) pentru spectrele de emisie, în care
deplasările spectrale sunt mai puţin sensible la natura solventului.
Fig. 18 . Numerele de undă ale
celor mai intense benzi de
absorbţie vs. f(n);
Fig. 16a 1calc cu relaţia (22)
vs. 1exp pentru prima bandă
vibronică a DPH
21
Fig 17a) SEA ale DPH şi b) spectre de fluorescenţă ale DPH în câţiva solvenţi din Tabelul X
Tabel X Numerele de undă ale maximurilor de absorbţie, fluorescenţă şi ale tranziţiei electronice 0-0 ale DPH în
diferiţi solvenţi
No. Solvent n ε νa (cm
-1) νfl (cm
-1) ν00 (cm
-1)
1 Metanol 1,328 33 28571 23641 26106
2 Apă bidistilată 1,332 81 27894 23202 25548
3 Eter etilic 1,353 4,34 28490 23474 25982
4 Acetonă 1,359 20,7 28409 23529 25969
5 Etanol 1,361 24,55 28409 23529 25969
6 Acetat de etil 1,372 6,2 28409 23529 25969
7 n-Hexan 1,375 1,89 28490 23474 25982
8 1 - Propanol 1,386 20,33 28490 23810 26150
9 Acid Propionic 1,394 3,34 28329 23529 25929
10 iso - Butanol 1,396 17,93 28329 23529 25929
11 Tetrahidrofuran 1,404 7,52 28169 24155 26162
12 Diclormetan 1,424 9,1 28090 24096 26093
13 Dicloretan 1,445 10,42 28011 23310 25661
14 Acetil Acetonă 1,452 25 27548 23256 25402
15 Tricloretilenă 1,478 3,38 27972 24096 26034
16 Dimetil sulfoxid 1,479 54 27778 23310 25544
17 o - Xilen 1,494 2,28 27894 23310 25602
18 Toluen 1,497 2,34 27933 23310 25621
19 m - Xilen 1,497 2,37 27972 23364 25668
20 Benzen 1,501 2,28 27548 23310 25429
În apă, aspectul spectrului de fluorescenţă se modifică în comparaţie cu spectrul celorlalţi
solvenţi, iar punctul corespunzător (2) este un punct aberant.
IV. 4. Concluzii
1. Numerele de undă în maximele benzilor vibronice ale DPH depind de natura
solventului prin funcţia de dispersie. Acest fapt arată că forţele de orientare-inducţie şi
polarizare sunt mai mici decât cele dispersive în soluţiile cu DPH.
2. Din dependenţa deplasării spectrale de funcţia de dispersie, a fost estimată
polarizabilitatea electrică în starea excitată a DPH. Datele din Tabelul IX reflectă faptul că
polarizabilitatea electrică a molecule de DPH creşte prin excitare.
3. Numerele de undă în maximele benzilor vibronice ale DPH nu depind de natura
solventului în special în cazul solvenţilor
22
4. Numerele de undă corespunzătoare tranziţiei 0-0 depind numai de funcţia de
dispersie a solvenţilor.
În aceste studii a fost relevată prevalenţa forţelor de dispersie în soluţiile ternare ale DPH.
IV. 5. CARACTERISTICI REMARCABILE ALE SPECTRELOR ELECTRONICE ALE
DPH ÎN FUNCŢIE DE NATURA SOLVENTULUI
Unele soluţii standard de DPH realizate prin utilizarea protocolului pentru urmărirea
fluidităţii membranei celulare au fost analizate în scopul de a explica deplasarea remarcabilă
observată în spectrele electronice (absorbţie şi fluorescenţă) în diferiţi solvenţi. Rezultatele au
fost corelate cu cele obţinute în simulări de dinamică moleculară în soluţii multicomponente
în care au fost evidenţiate regiuni micelare în jurul moleculelor de DPH [74].
În solvenţi aprotici, DPH prezintă un spectru electronic intens şi structurat, atât în absorbţie
cât şi în fluorescenţă. În unii solvenţi, spectrele de absorbţie şi de emisie ale DPH posedă
simetrie în oglindă, păstrându-se structura vibronică. În diclormetan (DCM), benzile de
fluorescenţă au simetrie de oglindă cu cele de absorbţie [75]. În apă şi tetrahidrofuran (THF)
şi DCM structura vibronică a spectrelor electronice dispare. Există solvenţi în care se menţine
structura vibronică, dar simetria în oglindă este perturbată datorită modificărilor ce apar în
componentele de vibraţie [76]. Din aceste motive, polarizarea fluorescenţei poate evidenţia
orientarea moleculelor de DPH de-a lungul lanţurilor acil a fosfolipidelor [77, 78] şi
localizarea acestora în bistraturile membranelor celulare şi artificiale [77, 79-81].
Structura DPH în stare electronică fundamentală este ilustrată în Figura 19a.
Momentul de dipol al conformaţiei all-trans este nul. Deci, această moleculă prezintă doar
niveluri simetrice g(gerade) şi asimetrice u(ungerade) pentru toate stările electronice.
Fig. 19 a) conformerul DPH all-trans, b) rotamerul Cs al DPH - [74]
Deoarece DPH este puţin solubilă în apă, în protocoalele de marcare fluorescentă ale
membranelor biologice este utilizat ca solvent THF. Şi alţi solvenţi pot solva DPH, devenind
astfel utilizabilă în studiile membranare. Tinând cont că spectrele de absorbţie şi de
fluorescenţă ale DPH sunt influenţate de natura solventului, poate prezenta interes găsirea
unor alternative pentru realizarea soluţiilor stoc ale DPH, cu utilizare ulterioară în tehnicile de
marcare fluorescentă a membranelor. In acest studiu sunt prezentate caracteristicile unor
soluţii stoc ale DPH. Prepararea acestor soluţii s-a făcut în două etape: iniţial s-a dizolvat
DPH în THF şi apoi, soluţia stoc obţinută a fost amestecată cu diferiţi solvenţi (apă, etanol,
DCM, benzen şi acetonă).
Pentru a înţelege modul în care solvenţii influenţează spectrele de absorbţie/emisie ale
DPH, am realizat un studiu de dinamică moleculară. Simulările de dinamică moleculară au
urmărit comportamentul amestecului DPH + THF în apă şi în etanol. Datele obţinute au fost
analizate în vederea studierii modului de structurare a solventului în jurul moleculei de
difenilhexatrienă.
Detalii referitoare la simularile de dinamică moleculară
Metodele şi abordările computaţionale utilizate în studiul de faţă constau în simulări
de dinamică moleculară ale amestecului DPH + THF dizolvat atât în apă (WAT) cât şi în
etanol (ETH). Sistemele conţinând DPH+THF+WAT şi DPH+THF+ETH au fost obţinute,
după cum urmează: printr-o faţetă laterală a celulelor de simulare preechilibrate conţinând apă
şi etanol, au fost adăugate câte o moleculă DPH şi 150 molecule THF. Pentru a reflecta în
23
mod corespunzător concentraţiile utilizate în experimentele de marcare fluorescentă a
biomembranelor, doar o singură moleculă de DPH a fost adăugată în celula de simulare care
conţine solventul. Pentru a îmbunătăţi eficienţa statistică, intervalul de timp utilizat în
simulare a fost de ordinul zecilor de nanosecunde. Sistemele astfel obţinute au fost simulate
pentru 10 ns pentru a asigura amestecarea componentelor, în acelaşi timp monitorizând
variaţia de timp a energiilor de interacţiune între perechile de constituenţi. Când aceste energii
rămân constante în timp, sistemul poate fi considerat ca fiind echilibrat. Apoi alte 10 ns de
simulare au fost efectuate în fiecare caz, ceea ce s-a luat în considerare când s-au făcut
prelucrările ulterioare de date. Simulările au fost efectuate cu software ul GROMACS 4.5 [82]
utilizând un sistem de calcul Dell PowerEdge 1950 cluster cu 64 de nuclee.
IV. 5. c. Rezultate şi discuţii
Spectrele de absorbţie şi fluorescenţă ale soluţiilor DPH+THF+solvent în etanol, apă,
diclormetan, benzen şi acetonă şi ale soluţiilor DPH+THF sunt prezentate în Fig. 21a - f.
Fig. 21 Spectrele electronice de absorbţie (SEA) şi spectrele electronice de fluorescenţă (SEF) pentru: a) DPH +
THF; b) DPH + THF + WAT; c) DPH + THF + ETH; d) DPH + THF + DCM; e) DPH + THF + benzen;
f) DPH + THF + acetonă [74].
24
În Fig. 21 a sunt ilustrate spectrele electronice de absorbţie (SEA) şi de fluorescenţă
(SEF) ale soluţiei binare DPH + THF [74]. Nu pot fi observate structura vibronică şi simetria
de oglindă. Spectrele electronice ale DPH+THF+WAT pentru soluţiile cu conţinut mare de
apă sunt asemănătoare cu cele obţinute în THF (Fig. 21a, b). Pierderea structurii vibronice,
dar păstrarea simetriei de oglindă poate fi observată în Fig. 21d, unde sunt prezentate
spectrele electronice ale soluţiei DPH+THF+DCM. În spectrele electronice ale soluţiilor
ternare de tipul DPH+THF+solvent (etanol, benzen şi acetonă) pot fi observate modificările
apărute în structura vibronică. Spectrele de fluorescenţă ale ultimelor trei soluţii prezintă o
lărgire a benzilor spectrale comparativ cu spectrele de absorbţie (Fig. 21 c, e, f), observându-
se în aceste cazuri pierderea simetriei de oglindă. Datorită solubilităţii scăzute a DPH în apă
[83], o practică comună este dizolvarea ei iniţială în THF (înainte de utilizarea sa ca o
fluorofor în mediu biologic apos) [84, 85]. În consecinţă, THF rămâne în sistem şi poate
interacţiona cu DPH într-o manieră dependentă de solvent.
Atingerea echilibrului a fost evaluată urmărind convergenţa către o valoare constantă a
energiilor de interacţiune între perechile de constituenţi ale sistemelor. Figurile 22 prezintă
evoluţia în timp a energiilor de interacţiune electrostatice şi van der Waals între THF-WAT
(Figura 22 a) şi respectiv THF-ETH (Figura 22 b).
Fig. 22 a,b Evoluţia în timp a energiilor de interacţiune electrostatică (Coul-SR) şi van der Waals (LJ-SR) în
cursul echilibrării, între: a) THF-WAT şi b) THF-ETH [74].
Se poate observa că pentru ambele sisteme se atinge o valoare constantă în intervalul
de timp de 10 ns ales pentru echilibrare. Amestecul etanolului cu moleculele de THF este
destul de rapid, atingerea echilibrului realizându-se în mai puţin de 1 ns. Pe de altă parte,
atingerea echilibrului în cazul apei este mai lentă - până la 4 ns - care exprimă, aşa cum va
deveni evident din inspecţia vizuală a traiectoriilor, un proces de organizare structurală a THF
în jurul DPH. Acest lucru este susţinut şi de diferenţele mici de energie ale interacţiunilor
electrostatice şi van der Waals dintre THF - WAT, comparativ cu THF - ETH. Având în
vedere că interacţiunile van der Waals au rază de acţiune limitată comparativ cu cele
electrostatice, această diferenţă mică poate fi explicată prin faptul că moleculele de THF au
tendinţa de a veni în contact unele cu celelalte, în principal în apă. În etanol, THF fiind
dizolvat complet, componenta van der Waals devine dominantă.
Examinarea vizuală a traiectoriilor de dinamică moleculară a arătat, că în cazul
sistemului DPH + THF + WAT moleculele de THF formează spontan un agregat în jurul
moleculei de DPH, obstrucţionând într-o anumită măsură interacţiunea directă cu apa. O mică
parte dintre moleculele de THF este dispersată în apă, neintrând în contact cu DPH (Fig. 23a).
Dimpotrivă, în cazul sistemului DPH +THF+ETH, moleculele de THF sunt complet dizolvate
în etanol fără să prezinte o aparentă structuralizare în jurul moleculelor de DPH (Fig. 23b)
Rezultatele obţinute în simulările de dinamică moleculară sunt în concordanţă cu
spectrele electronice din Fig. 21 a, b şi c.
25
Fig. 23. Configuraţii instantanee ale sistemelor (a) DPH+THF+WAT şi (b) DPH+THF+ETH la sfârşitul celor 10
ns de simulare [74]. Pentru o bună vizualizare a moleculei de DPH şi pentru o apreciere directă a
modului de distribuţie a componentelor conţinute (apă, etanol şi tetrahidrofuran), celulele de simulare
au fost reprezentate şi în secţiune. (a) - imaginea de sus prezintă celula de simulare cu jumătate din
moleculele de apă eliminate şi rotită pentru a evidenţia agregatul format de THF. (b) - în cazul
sistemului DPH+THF+ETH moleculele de etanol nu au fost reprezentate pentru a releva distribuţia
moleculelor de THF.
Agregatele formate de THF în jurul moleculei de DPH, explică asemănările dintre
spectrele electronice obţinute în cazul soluţiilor formate de DPH cu THF şi în soluţiile DPH +
THF + WAT, la concentraţii mari de apă. Etanolul dispersează moleculele de THF,
determinând pătrunderea moleculelor de ETH în prima sferă de solvatare a DPH (Fig. 23b),
fapt ce are drept consecinţă modificarea spectrelor electronice ale DPH.
IV. 5. d. Concluzii
Măsurătorile spectrale şi simulările de dinamică moleculară au evidenţiat apariţia unor
fenomene de agregare în soluţiile DPH + THF + WAT cu formarea de micele în jurul
moleculelor de DPH. În spectrele electronice ale DPH, simetria de oglindă şi structura
vibronică sunt puternic influenţate de natura solventului. Datele obţinute în acest studiu
sugerează că soluţiile multicomponent de tipul DPH + THF + apă, frecvent utilizate în
protocoalele de marcare fluorescentă ale membranelor biologice, nu sunt omogene.
CAP.V. INTERACŢIUNEA PROBELOR FLUORESCENTE (DPH) CU MEMBRANELE
FOSFOLIPIDICE NESATURATE: STUDIU DE DINAMICĂ MOLECULARĂ
V. 1. Introducere. Obiectivul studiului.
Comportamentul moleculelor DPH inserate în membrane reflectă îndeaproape
proprietăţile mediului local, ca microvîscozitatea şi gradul de ordonare a lanţurilor alchil [86].
Prin urmare, pentru o interpretare riguroasă a datelor experimentale, este necesară cunoaşterea
localizării preferenţiale a acestei probe fluorescente.
După cunoştinţele noastre nu s-a mai realizat nici un studiu de simulare privind
localizarea DPH în interiorul bistraturilor fosfolipidice dinesaturate. Acest lucru este oarecum
neaşteptat având în vedere că majoritatea tipurilor de fosfolipide ce alcătuiesc membranele
biologice sunt sn-1-saturate, sn-2-nesaturate. Lipidele cu ambele lanţuri alchil nesaturate
constituie componente principale în majoritatea membranelor celulare.
26
Obiectivul acestui studiu a fost de a aduce noi date privind localizarea şi orientarea
preferenţială a moleculei de DPH în bistratul puternic nesaturat format din DOPC, utilizând
simulări de dinamică moleculară (MD).
V. 2. Detalii referitoare la simularile de dinamică moleculară
Au fost efectuate simulări de dinamică moleculară pe două sisteme membranare.
Primul a fost compus dintr-un bistrat complet hidratat de DOPC pur şi al doilea compus dintr-
un bistrat DOPC în care au fost introduse 7 molecule de DPH. Simularea bistratului DOPC
pur a fost realizată pentru comparaţie. Numărul de molecule DPH în sistemul fluorofor /
membrană a fost ales pentru a reflecta condiţiile experimentale care plasează de obicei
raportul DPH / lipide în interiorul unui interval de la 1:500 la 1:100 [87, 88]. Acest studiu este
destinat unui regim de concentraţie mare şi, astfel, a fost stabilită o concentraţie a DPH de
2,43 mol% (7:288) aproape de limita superioară. Pentru a îmbunătăţi eficienţa statistică
limitată de timpul de simulare, a fost ales un raport mare DPH / lipide [86]. După o etapă de
echilibrare de 20 de ns, bistratul pur de DOPC a fost simulat pentru încă 50 ns şi această din
urmă simulare a fost cea luată în considerare atunci când am realizat prelucrările ulterioare de
date. Sistemul DPH + DOPC a fost simulat pentru încă 250 ns pentru a asigura o evaluare
statistică eficientă a mişcărilor de difuzie şi de tip flip-flop ale DPH în interiorul bistratului.
V. 3. Rezultate şi discuţii
Datele rezultate din simulările de dinamică moleculară, au fost analizate având în
vedere următorii parametrii: aria per lipid în prezenţa şi absenţa DPH, profilele de densitate,
parametrii de ordine şi funcţia de distribuţie orientaţională a DPH.
Fig. 2 Reprezentarea bidimensională a energiei libere în planul (z, θ) care dă dependenţa unghiului format de axa
moleculară lungă a DPH, definită ca linia care uneşte centrele de masă ale celor două cicluri benzenice,
şi normala la bistrat a fost obţinută din distribuţia stărilor sistemului în planul (z, θ) [11].
Iniţial, densitatea de stări (histograma stărilor) a fost calculată şi apoi transformată în
conformitate cu formula Boltzmann în variaţii de energie liberă Gibbs:
(1)
în care ΔG este diferenţa de energie liberă Gibbs, kB este constanta Boltzmann, T este
temperatura absolută Pi, j este frecvenţa corespunzătoare intervalului i, j în planul (z, θ) şi
Pmax este frecvenţa maximă pe întregul domeniu al variabilelor z şi θ.
În timpul simulării s-a evaluat aria per lipid (AL) pentru a verifica atingerea stării de echilibru
şi pentru a urmări efectul produs de adăugarea de DPH asupra expansiunii laterale a
membranei (Figura 3).
27
Fig. 3 Evoluţia ariei per lipid în decursul simulărilor de dinamică moleculară pentru DOPC şi DPH+DOPC [11].
Se poate observa din Figura 3 că aria per lipid nu variază esenţial pe durata simulării,
oscilând în jurul unor valori comparabile pentru ambele sisteme DOPC pur şi DPH+DOPC.
Evaluarea statistică a datelor oferă pentru AL valorile 76,0 Å2/lipid (σ = 1.05, σ este abaterea
standard) pentru DOPC pur şi 76,2 Å2/lipid (σ = 1.2) pentru sistemele DPH + DOPC. Aceste
valori au fost obţinute în simulările la 37 °C (310K) şi se corelează bine cu aria per lipid
determinată experimental, care creşte odată cu temperatura de la 72,4 Å2/lipid la 30 °C la 75,5
Å2/lipid la 45 °C [89]. Abaterea faţă de experiment este sub 3% pentru sistemul DOPC pur,
considerând că AL variază liniar cu temperatura între 30 °C şi 45 °C.
Adăugarea de DPH nu induce alte variaţii vizibile ale ariei/lipid sugerând că efectul
fluoroforului asupra gradului de ordonare ale lanţurilor alchil este minimă la concentraţia
folosită în simulare. Este posibil ca DPH să ocupe cu uşurinţă golurile tranzitorii formate între
lanţurile alchil steric incapabile să se organizeze local datorită prezenţei celor două legături
duble ale DOPC în conformaţia "cis", şi datorită dezordonării inerente a lipidelor nesaturate la
temperatura de simulare de 37 °C, care este cu mult peste temperatura de tranziţie din faza de
gel a DOPC la cristal lichid (-20°C) [90].
Profilul densităţii de masă pentru mai multe componente diferite din bistratul modelat
sunt prezentate în Figura 4. S-a ales pentru DPH reprezentarea funcţiei de distribuţie a
probabilităţii pentru centrul de masă şi nu profilul densităţii masice, datorită dependenţei
acestuia din urmă de orientarea preferenţială a acestei molecule în interiorul bistratului [11].
Maximul densităţii de masă a DOPC se află la 1,27 nm faţă de centrul bistratului. Grupurile
atomice C = C şi COO ale DOPC prezintă densităţi de masă maxime la 0,53 nm şi respectiv
1,34 nm. Maximul probabilitaţii funcţiei P(z) pentru centrul de masă al DPH se află situat la
Fig. 4 Profilul densităţii de masă de-a
lungul normalei la bistratul
fosfolipidic pentru DOPC, apă
şi unele componente
importante ale moleculelor
fosfolipidice. Probabilitatea
funcţiei de distribuţie P(z) a
centrului de masă al
moleculelor DPH relativ la
normala la bistrat si profilurile
de densitate; „z” reprezintă
distanţa faţă de centrul
bistratului .
28
0,94 nm faţă de jumătatea distanţei dintre grupurile atomice C = C şi COO ale DOPC. Acest
fapt este în concordanţă cu rezultatele experimentale ale lui Kaiser şi London [91] obţinute în
studii de stingere a fluorescenţei ale DPH, care plasează centrul moleculei DPH în intervalul
0,6 şi 1,2 nm faţă de centrul bistratului, în funcţie de metoda de analiză folosită.
Chiar dacă maximum pentru P(z) este situat la o anumită distanţă de centrul
bistratului, probabilitatea de a găsi fluoroforul în spaţiul dintre cele monostraturi ale
membranei este semnificativă. Din Figura 4 rezultă că moleculele de apă pot penetra adânc
bistratul până la nivelul grupării COO, unde pot interacţiona cu moleculele de DPH. De
asemenea, este clar din aceste curbe că DPH ajunge rareori în preajma capetelor polare ale
fosfolipidelor. Orientarea axei moleculare lungi a DPH este un alt parametru important care
poate fi legat de experimentele de fluorescenţă. Acest aspect a fost monitorizat în cursul
simulării şi analizat în cele ce urmează.
Densitatea de probabilitate P(θ) pentru unghiul de înclinare dintre axa lungă a DPH şi
normala la bistrat a fost obţinută din histograma corespunzătoare unghiului θ calculată pe
întreaga durată a simulării şi mediată pe toate moleculele de DPH. Curba obţinută a fost
normalizată utilizând condiţia:
(2)
Două maxime sunt evidente în Figura 5a: unul secundar slab definit la 45º şi celălalt
principal la 90º. Densitatea de probabilitate P (θ) este frecvent exprimată prin funcţia de
distribuţie orientaţională f (θ) prin relaţia:
(3)
Fig. 5 a) Densitatea de probabilitate P(θ) obţinută din simulările de dinamică moleculară şi b) funcţia de
distribuţie orientaţională f(θ) dedusă din ecuaţia (3). În b) datele de simulare (simboluri cerc deschis) au fost
aproximate prin curbe de regresie de tip polinoame Legendre f2(θ), f4(θ), ..., f10(θ) (ecuaţia 4), utilizând modelul
brownian de difuzie rotaţională.
Pentru a compara rezultatele de simulare cu datele experimentale de anizotropie a
fluorescenţei disponibile pentru DOPC, a fost aplicat modelul brownian de difuziune
rotaţională (BRD) [86, 92-95]. S-a urmărit obţinerea parametrilor de ordine <P2> şi <P4>.
Funcţia de distribuţie orientaţională f(θ) a fost calculată din relaţia sa cu P(θ) (relaţia 3).
Datele obţinute din simulare au fost aproximate printr-un proces de regresie neliniară cu
polinoame de tip Legendre de diferite ordine:
29
(4)
unde k şi n sunt pare. Au fost folosite seriile cu n = 2, 4, ..., 10 termeni, care dau o acurateţe
ce creşte treptat (Figura 5b).
Parametrii de ordine determinaţi <P2> şi <P4> sunt prezentaţi în Tabelul II şi
comparaţi cu valorile experimentale din literatura de specialitate [96].
Tabel II Parametrii de ordine <P2> şi <P4> calculaţi la diferite niveluri de aproximare în urma regresiei cu
polinoame Legendre a funcţiei de distribuţie orientaţională obţinută din procesul de simulare f(θ).
f4(θ) f6(θ) f8(θ) f10(θ) Experimental [96]
<P2> 0.005 0.004 0.003 0.004 0.0
<P4> 0.126 0.153 0.150 0.151 0.15
Se poate observa o corespondenţă bună între predicţia dată de simulare şi experiment.
Aceasta sugerează faptul că orientarea moleculelor DPH în interiorul bistratului de DOPC în
timpul simulării poate reproduce îndeaproape comportamentul real al fluoroforului într-o
membrană nesaturată de DOPC.
Trei bazine, notate cu "P", "S" şi "M", pot fi identificate în acest grafic [11], fiecare
corespunzând unei stări preferenţiale ale DPH în interiorul regiunii lanţurilor alchil. Cel mai
populat dintre ele, "P", este definit de minimul global de energie liberă şi se caracterizează
printr-un unghi de înclinare θ ≈ 90°. Profunzimea medie a centrului de masă a DPH pentru
această populaţie este de aproximativ 1,2 nm de la centrul bistratului, în apropierea şi sub
maximul densităţii grupărilor COO fosfolipidice. O altă populaţie mai puţin reprezentată dar
importantă, este situată în centrul bistratului şi a fost notată cu "M" în Figura 6. Caracteristica
sa specifică este distribuţia largă în evantai a unghiului de înclinare într-un interval cuprins
între aproximativ 20° şi 90°. Unghiul de înclinare la z = 0 a fost găsit a avea valoarea cea mai
probabilă de θ ≈ 50° (simbolul "*" pe suprafaţa de energie liberă).
Cu toate acestea, în centrul bistratului diferenţele de energie liberă în interiorul
domeniului de mai sus depăşesc rareori 1,3 kJ / mol (valoarea fiind extrasă din datele
numerice ale suprafeţei energiei libere) care, la temperaturi normale este sub energia de
agitaţie termică (1 RT = 2,5 kJ / mol; R este constanta universală a gazelor; T este
Fig. 6 Relaţia dintre distanţa de la centrul bistratului
(z) şi unghiul de înclinare θ a DPH în
membrana DOPC, exprimată sub formă de
hartă a energiei libere Gibbs în subspaţiul
definit de (z, θ). Deasupra graficului s-a
reprezentat una dintre foiţele bistratului
pentru o localizare vizuală mai facilă a
minimelor de energie liberă în corelaţie cu
diferitele regiuni ale membranei. (a)
reprezintă intervalul ocupat de regiunea
capului lipidic polar, definită ca lăţimea
curbei de distribuţie a densităţii masice
însumate pentru atomii de fosfor ‘P’ şi azot
‘N’ la jumătate din valoarea maximă (vezi
Figura 4); săgeţile în partea superioară a
figurii marchează maximele profilelor de
densitate pentru grupările C = C şi COO ale
DOPC.
30
temperatura absolută). Astfel, unghiul de orientare a DPH prezintă variaţii cu diferenţe mici
de probabilitate în intervalul 20° şi 90°. O uşoară preferinţă pentru valoarea de 50° în mijlocul
bistratului şi nu de 90° (paralelă cu planul membranei), indică faptul că interacţiunile van der
Waals sunt suficient de puternice pentru a „menţine” moleculele DPH în apropierea lanţurilor
alchil, având efect opus fenomenelor entropice care ar favoriza partiţionarea în regiunea cu
cel mai mare volum liber. Acest comportament a fost de asemenea observat în studiile de
simulare ale membranelor saturate de DPPC marcate cu DPH [86].
Implicaţiile care ar putea rezulta din datele prezentate mai sus sunt, în principal că
moleculele DPH care sunt orientate paralel cu membrana explorează cu precădere regiunea
lanţurilor alchil în apropierea grupărilor COO ale fosfolipidelor, şi mai puţin centrul
bistratului (deşi ele pot fi încă prezente la acest nivel, dar în cantităţi mai mici). Această
ipoteză trebuie să fie luată în considerare atunci când se interpretează datele experimentale de
fluorescentă a DPH în membranele nesaturate.
Un alt aspect de importanţă practică este faptul că în regiunea apropiată grupărilor
COO ale DOPC, moleculele de DPH pot intra în contact cu apa, care poate pătrunde mai
adânc în stratul hidrofob al lanţurilor alchil în lipidele nesaturate, datorită conformaţiei lor
mai puţin ordonate. Apa este prezentă la această adâncime în interiorul bistratului arătând o
densitate de aproape zece ori mai mică decât în faza volumică, fapt dovedit de profilurile de
densitate din Fig. 4. Preferinţa DPH pentru această regiune poate constitui o explicaţie pentru
stingerea fluorescenţei observată experimental ca fiind mai intensă odată cu creşterea gradului
de nesaturare al fosfolipidelor [96].
Un bazin secundar, notat cu "S" în Fig. 6, poate fi observat în graficul bidimensional
FEL. Aceast minim secundar corespunde unei populaţii de DPH situată la aproximativ 0,8 nm
de la centrul bistratului imediat deasupra legăturii duble C = C. În această regiune unghiul de
înclinare θ în raport cu normala la membrană are o valoare preferenţială de θ ≈ 40 ° şi poate fi
corelată cu profilul P (θ), ca o contribuţie la maximul "S" din Figura 5a. Acest bazin poate fi
asociat cu populaţia de molecule de DPH paralele cu normala bistratului, orientare întâlnită de
obicei când DPH se inseră în membrane lipidice saturate. În cazul acestora din urmă unghiul θ
este de aproximativ 25° [86] datorită lanţurilor alchil mai ordonate ale acestor fosfolipide.
V. 4. Concluzii
Scopul acestui studiu a fost de a descrie interacţiunea probei fluorescente de DPH cu
membranele fosfolipidice nesaturate (DOPC) folosind simulări de dinamică moleculară.
Deşi există în literatură numeroase informaţii provenite din studii de simulare şi
referitoare la interacţiunea DPH cu membrane lipidice saturate [97], în ceea ce priveşte
interacţia cu membranele înalt nesaturate datele sunt încă contradictorii şi supuse dezbaterilor.
Simulările de dinamică moleculară pot aduce lămuriri în special asupra localizării şi orientării
DPH în interiorul matricei lipidice cu rezoluţie spaţială şi temporală imposibil de atins în
tehnicile experimentale curente. Parametrii calculaţi ai bistratului cum ar fi aria/lipid şi în
cazul bistratului cu fluorofor (DOPC+DPH) parametrii de ordine P2 şi P4 au prezentat o bună
concordanţă cu valorile experimentale cunoscute care validează modelele folosite aici. O
populaţie reprezentativă de molecule DPH a fost localizată în regiunea lanţurilor alchil a
bistratului imediat sub interfaţa DOPC/APĂ, având un unghi de înclinare de aproximativ 90
grade faţă de normala bistratului. Acest lucru poate da o explicaţie pentru stingerea
fluorescenţei observată pentru membrane lipidice nesaturate.
Concluziile care se desprind din acest studiu de simulare sunt folositoare pentru
interpretarea datelor experimentale de anizotropie a fluorescenţei şi pentru studii viitoare de
modelare moleculară.
31
CAP. VI. CONTRIBUŢII LA OPTIMIZAREA REACŢIILOR DE OBŢINERE A UNOR
COMPUŞI : A. cu activitate tuberculostatică (Tiosemicarbazide); B. cu acţiune antitumorală
(derivaţi Glutaminici)
Obiectivele Studiului
Optimizarea reacţiilor şi stabilirea randamentului maxim pentru reacţiile de obţinere a
patru noi 1,4-disubstituienţi tiosemicarbazidici şi a derivaţilor N-[p-(R)-benzoil]-L-
glutaminici (I-IV). Structura chimică a compuşilor obţinuţi a fost analizată prin metode
spectrale (FTIR, 1H-RMN,
13C-RMN, SM) şi chimice.
Procese de optimizare - experiment „32
factorial”
Atunci când sunt preparaţi compuşii tiosemicarbazidici (II-VII) şi derivaţii N-[p-(R)-
benzoil]-L-glutaminici (I-IV), timpul de reacţie şi temperatura sunt factori care influenţează
major randamentul reacţiei. În aceste condiţii randamentul reacţiei a fost considerat ca fiind
indicator de optimizare, iar timpul de reacţie X1 = T (exprimat în ore pentru reacţiile de
obţinere ale compuşilor tiosemicarbazidici respectiv minute, pentru reacţiiile de obţinere ale
derivaţilor glutaminici) şi temperatura X2 = T (exprimată în oC) au fost considerate variabile
relevante. Trei valori ale fiecărui sistem de variabile au fost considerate într-un experiment 32
factorial [98-102] cu scopul de a determina cele mai bune condiţii de desfăşurare ale reacţiilor
studiate. În titlul experimentului factorial, 3 este numărul nivelelor de variaţie pentru fiecare
variabilă relevantă a sistemului iar 2 reprezintă numărul variabilelor relevante luate în
considerare în aceste studii. Programul factorial permite evitarea unor experimente laborioase
şi de durată pentru determinarea coeficienţilor de modelare a0, ai (i=1,2) şi aij (i, j=1,2) , din
relaţia (1), numiţi în general coeficienţi de regresie. Relaţia (1) trebuie aplicată fiecărui
compus studiat ţinând cont de datele experimentale:
21122222
211122110 xxaxaxaxaxaa (1)
Pentru a obţine termenii pătratici ortogonali randamentul reacţiei în cele 9N experimente a
fost mediat:
N
N
ii
1
(2)
Folosind relaţia (1), condiţiile de ortogonalitate şi valorile coeficienţilor de regresie
0a , ;a i,i 21,i,i şi ;a j,i 21,j,i , media randamentelor reacţiilor poate fi scrisă ca [98, 101]:
221103
2aaa (3)
Din (1) şi (3), obţinem:
3
2
3
2 2222
211121122211 xaxaxxaxaxa (4)
În relaţia (1), 1x şi 2x sunt variabile adimensionale pentru timpul de reacţie (i = 1) şi
pentru temperatura reacţiei (i = 2). Ele sunt definite prin:
2,1
i
X
XXx
i
iii (5)
Variabilele adimensionale pot fi convertite în variabile reale folosind relaţia:
2,1 iXxXX iiii (6)
În relaţiile (2) and (3), au fost făcute următoarele notaţii:
32
2
minmax iii
XXX
(7)
pentru mijlocul domeniului variabilelor, şi
minmax2 iii XXX (8)
pentru lungimea domeniului de variaţie.
Variabilele adimensionale 1x 2x sunt în general definite pentru a facilita optimizarea.
Pentru variabilele reale ale sistemului, tX 1 şi TX 2 , care pot lua valori în intervalul:
max1min11 , XXX şi max2min22 , XXX , (9)
variabilele relevante adimensionale 1x şi 2x prezintă valori limită corespondente:
2,1;1; minmin
min
ix
X
XXx i
i
iii (10)
2,1;1; maxmax
max
ix
X
XXx i
i
iii (11)
După determinarea experimentală a masei, mexp, randamentul reacţiei poate fi aproximat
folosind relaţia (12):
.
.exp
calcm
m (12)
În (12) mcalc este masa calculată a compusului corespondent pentru aceeaşi cantitate a
precursorului iniţial ca în experiment.
Coeficienţii de regresie a0, ai( i=1,2) şi aij(i, j=1,2) pot fi evaluaţi prin metoda celor
mai mici pătrate [98, 101, 103]. Valorile coeficienţilor de regresie pot indica gradul influenţei
parametrului corespunzător, iar semnul lor indică o creştere (+) sau descreştere (-) a
randamentului reacţiei determinat de către parametrul corespunzător (sau de influenţa
conjugată a doi parametri).
VI. A. 3. Rezultate obţinute în urma procesului de optimizare al reacţiilor de obţinere
ale derivaţilor tiosemicarbazidici
Valoarea medie a randamentului reacţiei în centrul domeniului de variaţie a fost
calculată cu formula (2) şi este prezentată pe ultima coloană a Tabelului III.
Tabel III Randamentul reacţiei in centrul domeniului de variaţie, media randamentului; abaterea medie pătratică
şi precizia.
Compusul 1 2 3 S P
II 81.16 81.75 81.50 0.0026 0.017 81.47
III 86.90 87.05 87.20 0.0225 0.050 87.05
IV 79.01 79.50 79.20 0.0025 0.017 79.24
V 80.50 80.69 80.92 0.0623 0.083 80.70
VI 79.56 79.80 79.98 0.0444 0.070 79.78
VII 80.10 80.15 80.80 0.1325 0.121 80.35
33
Fig.6 a),b) Reprezentarea tridimensională a randamentelor reacţiilor de obţinere a compuşilor a) IV şi b) VII, vs.
variabilele adimensionale timp şi temperatură [104].
Tabel V Valorile extreme ale variabilelor adimensionale relevante şi radamentele reacţiilor
Compusul x1extrem x2extrem ηextrem
II 0.116 0.084 81.482
III 0.186 0.117 87.127
IV 0.027 -0.029 78.962
V 0.084 -0.077 80.569
VI 0.010 -0.021 79.810
VII 0.003 0.029 80.081
Cea mai mare valoare pentru randamentul reacţiei a fost obţinută pentru compusul IV, cel mai
activ din punct de vedere al acţiunii tuberculostatice.
VI. A. 5. Concluzii
A fost folosit experimentul 32 factorial în studii pentru obţinerea celor mai eficiente
condiţii de reacţie pentru compuşii II-VI urmăriţi în această lucrare. Cea mai mare valoare a
randamentului reacţiei s-a obţinut pentru compusul IV care este cel mai activ împotriva
Mycobacterium tuberculosis [104]. Putem concluziona că substanţele chimice prezentate în
acest studiu sunt precursori promiţători pentru medicaţia antituberculoasă.
VI. B. 3. Rezultate obţinute în urma procesului de optimizare al reacţiilor de obţinere
ale derivaţilor N-[p-(R)-benzoil]-L-glutaminici (I-IV)
Tabel XIII. Valorile extreme ale randamentului reacţiei );( ,2,1 ee xx şi coordonatele adimensionale
corespunzătoare );( ,2,1 ee xx
Compusul ex ,1 ex ,2 );( ,2,1 ee xx
I 0.1 -0.02 57.46
II 0.04 0 79.58
III 0.06 0.09 59.29
IV 0.06 0 76.13
a) b)
34
Dependenţa randamentului reacţiei de variabilele adimensionale este ilustrată în
Figurile 10 a) şi b) pentru compuşii II şi IV (pentru care s-au obţinut cele mai mari valori ale
randamentului) [105].
VI. B. 5. Concluzii
Unele studii preliminare relevat influenţa temperaturii şi a timpului de reacţie asupra
randamentului reacţiei pentru obţinerea compuşilor I-IV. Folosind procesele de optimizare am
obţinut compuşii studiaţi cu un randament convenabil. Acest studiu poate fi de folos în
obţinerea derivaţilor biologic activi ai N-[p-(R)-benzoil]-L-glutaminei în cele mai bune
condiţii. Studiul biologic a demonstrat faptul că derivaţii I-IV nu influenţează activitatea
lipazei şi amilazei. Tripsina este uşor influenţată în activitatea sa. Compuşii I-IV nu prezintă o
influenţă negativă asupra activităţii enzimelor testate. Prin urmare, face posibilă administrarea
lor pe cale orală. Importanţa farmacologică a compuşilor studiaţi impune stabilirea condiţiilor
optime pentru sinteza lor în procesul de microproducţie.
VII. Concluzii generale
Contribuţii proprii. Elemente de originalitate.
Rezultatele obţinute în teza de doctorat suţin faptul că metodele spectrale şi metodele de
simulare reprezintă instrumente complexe de analiză la nivel molecular şi submolecular, ce
pot oferi informaţii cu sensibilitate crescută asupra parametrilor fizici şi biofizici caracteristici
structurilor de tip membranar.
Cap. III. Influenţa temperaturii şi concentraţiei asupra gradului de ordonare al
structurilor de tip membranar
III. 1. Influenţa temperaturii asupra unor structuri de tip membranar
Scopul studiului prezentat în subcapitolul III.1 s-a axat pe utilizarea tehnicii de
spectrometrie FTIR pentru atribuirea centrilor activi din structura poliamidei 6 anionice
(Nylon 6) în vederea utilizării acestui polimer ca substrat pentru substanţe cu proprietăţi
biocidale. Datorită structurii primare (legăturile polipeptidice formate de AA) şi modalităţilor
de organizare conformaţională (spaţială) caracteristice proteinelor, acestea pot fi considerate
polimeri naturali.
a) b)
35
Am urmărit influenţa temperaturii asupra benzilor de absorbţie a amidei A, amidei I şi
amidei II în intervalul 20-180C. Aceste trei benzi intense de absorbţie în IR ale poliamidei
6 sunt influenţate de interacţiunea legăturilor de hidrogen.
Am identificat o relaţie directă între aranjarea legăturilor de hidrogen şi modurile
vibraţionale respective atribuite în IR comparativ cu spectre ale Nylon 6 date în literatură.
La frecvenţa cea mai joasă a amidei I, apare cea mai puternică legătură de hidrogen ce
implică banda amidică C=O şi cea mai mică densitate electronică de-a lungul C=O.
Maximul benzii amidice II se deplasează spre frecvenţe mari când hidrogenul se leagă
puternic.
Am fost evidenţiate benzile caracteristice care sunt asociate cu formele mezomorfe - şi γ-
cristaline ale filmelor polimerice. Banda corespunzătoare legăturii de hidrogen N-H cu
vibraţia de întindere la 3307 cm-1
în faza γ a poliamidei, este mai slabă decât cea asociată
fazei deoarece legătura de hidrogen N-H este modificată.
În urma tratamentului termic a apărut o nouă bandă la 795 cm-1
iar în intervalul 1433-1500
cm-1
s-a observat o creştere a absorbanţelor. Acest fapt indică o mişcare conformaţională
datorată creşterii temperaturii asociată cu modificări în interiorul polimerului.
Am corelat modificările apărute în spectrele FTIR cu morfologia de suprafaţă a filmelor
poliamidice 6, determinată folosind SEM. Imaginile SEM confirmă faptul că structura
polimerului include atât regiuni amorfe cât şi cristaline.
Nu am putut stabili originea maximului de la 795 cm-1
prezent în spectrul FTIR la 170-180 C, dar acesta nu poate fi atribuit benzii de balansare CH2.
Spectrul FTIR a ilustrat benzi caracteristice ale grupurilor NH-CO şi ale formelor şi γ-
cristaline ale polimerului.
Tratamentul termic influenţează poziţia şi intensitatea benzilor de absorbţie ale poliamidei
6 datorită modificării cristalinităţii sale.
Rezultatele obţinute sunt utile pentru caracterizarea poliamidelor ca suport pentru materiale
biocide. Centrul activ NH este important pentru ataşarea compuşilor bioactivi în lanţul
poliamidic prin tratarea suprafeţei sau prin modificări chimice ale polimerului.
III. 2 Studiul tranziţiilor de fază termotropice în cristale lichide
Obiectivul studiului din subcapitolul III.2 a fost evidenţierea influenţei temperaturii
asupra echilibrului între fazele de ordine şi dezordine ale esterului poli-(fenil-metacrilic) al
acidului cetiloxibenzoic (PPMAECOBA) în tetraclorometan (TCM) prin analiza spectrelor
FTIR ale lanţurilor alchil din compuşii amfiliofilici.
Au fost determinate proprietăţile anizotropice ale PPMAECOBA în TCM care depind de
supraordonarea moleculară a catenelor laterale ale macromoleculelor.
Apariţia organizării supramoleculare, în amestecul de PPMAECOBA cu TCM se datorează
în mare parte interacţiunilor dipolare dintre grupările laterale. Direcţia catenei principale
nu este determinată de forţele interne, astfel încât acestea formează „ghemuri” din care ies
catenele laterale orientate prin forţe dipolare. Agitaţia termică poate dezorganiza alinierea
catenelor laterale prin interacţiuni colective. Aceste sisteme sunt similare cu cele formate
în modelele membranare sau în membranele biologice.
Influenţa temperaturii asupra gradului de ordine a fost evidenţiată de vibraţiile de valenţă
ale grupării CH2 din intervalul 2800-3000 cm-1
al spectrului FTIR.
Pentru cristalul lichid liotropic PPMAECOBA în TCM a fost evidenţiată o tranziţie
principală de fază însoţită de o creştere a dezordinii în lanţurile secundare lungi.
Au fost stabilite valorile corespunzătoare tranziţiei principale de fază.
Spectrometria FT-IR oferă posibilitatea de a determina coordonatele tranziţiei principale de
fază ale cristalului lichid liotropic.
36
III. 3 Studiul influenţei concentraţiei şi a câmpurilor electromagnetice asupra
bistraturilor de dipalmitoilfosfatidilcolină (DPPC).
În acest subcapitol am dezvoltat şi utilizat o nouă strategie de simulare structurală, prin
reproducerea structurii interne a DPPC la nivel macroscopic, luând în considerare
interacţiunile dintre microcomponente şi cele cu câmpurile interne şi externe (de test). În
cadrul acestui studiu dinamic, am reconstruit modul de organizare al structurii care parcurge
mai multe transformări de fază odată cu creşterea temperaturii (18 - 52 °C), în scopul stabilirii
influenţei diverşilor parametri interni şi externi.
Prin simulare (utilizând programul HFFS) am determinat componentele tensorului
permitivitate electrică al dipalmitoilfosfatidilcolinei (DPPC) hidratate în fază de cristal
lichid.
Am analizat comportamentul complex în câmpuri electromagnetice de înaltă frecvenţă (ÎF)
şi microunde al bistraturilor ordonate smectic ale acestui lipid biologic.
Studiul materialului prin simulare a oferit posibilitatea modificării diverşilor parametri
fizici şi geometrici la nivelul structurii (concentraţiile constituenţilor în soluţie, ionii
tampon, temperatura) prin care putem controla variaţiile permitivităţii electrice la scară
microscopică şi implicit permitivitatea efectivă a cristalului lichid biologic la scară
macroscopică.
Temperatura influenţează permitivitatea electrică, deorece în intervalul de temperatură 21
şi 42 °C au loc mai multe transformări de fază în DPPC, fiecare fază prezentând ordine
internă diferită.
Procesul de autostructurare al membranei în apă este condiţionat de o concentraţie de prag
a apei în DPPC. La valori mai mari ale acestei concentraţii structura de tip bistraturi poate
să dispară. La un raport molecular de peste 120:1 (apă:DPPC), apa în exces are ca efect
ruperea bistratului.
Faza de cristal lichid a soluţiei de DPPC în apă, întâlnită la temperaturi de peste 42 °C şi
pentru un raport molecular apă/DPPC de ca. 30:1 - 100:1, prezintă o structură
multilamelară relativ periodică care aminteşte de un cristal lichid smectic, dar unul atipic.
Valoarea de prag a raportului molecular apă/ DPPC pentru ca structura să prezinte
ordonare de cristal lichid cu periodicitate lamelară relativ constantă este de 82:1.
Metoda de simulare a pus în evidenţă înaltul grad de neuniformitate al valorilor
permitivităţii paralele, determinate de-a lungul structurii multilamelare, valori urmărite pe
direcţie perpendiculară pe bistraturile de DPPC în soluţie apoasă (Oz). Fiecare subgrup
molecular prezintă o puternică individualitate (capurile polare, lanţurile alcanice), iar
tranziţia valorilor parametrilor de material corespunzători este abruptă. Maximele
permitivităţii corespunzătoare zonelor cu capuri polare ale moleculelor de DPPC
evidenţiază proprietăţi de bun izolator în zonele respective, zone care se comportă ca o
barieră de conductivitate a membranei apoase. Zonele relativ extinse de permitivitate
scăzută corespunzătoare miezurilor hidrocarbonice din interiorul bistraturilor de lipid
indică faptul că proprietăţile dielectrice nu sunt atât de bune în interiorul bistraturilor.
Permitivitatea transversală, calculată după o direcţie paralelă cu bistraturile, prezintă
fluctuaţii aleatorii în jurul unei valori medii caracteristice pentru fiecare plan paralel cu
bistraturile. Fluctuaţiile sunt mai puternice în zona din mijlocul miezurilor hidrocarbonice
din interiorul bistraturilor, acolo unde "dezordinea" cozilor alcanice este mai pronunţată.
Posibilitatea modificării simultane a parametrilor interni şi externi, recomandă metoda de
simulare pentru analiza în timp real a structurilor de tip membranar.
Rezultatele obţinute permit stabilirea unor direcţii de studiu viitoare, privind ordonarea
structurală a DPPC în timpul tranziţiilor de fază şi anizotropia dinamică (datorată mişcării
cozilor hidrocarbonice), folosind metoda de simulare pusă la punct în acest studiu.
37
Cap. IV. 1,6-difenil-1,3,5,-hexatriena (DPH) - marker fluorescent utilizat în evaluarea
fluidităţii structurilor de tip membranar
Studiul influenţei naturii solventului asupra SEA ale DPH
Scopul acestui studiu este de a analiza interacţiunile intermoleculare ale DPH cu un
număr mare de solvenţi pe baza spectrelor de absorbţie electronică ale soluţiilor ternare de tip
DPH + THF + solvent. Structura moleculei de 1,6-difenil-1,3,5,-hexatrienă (DPH) permite
orientarea acesteia de-a lungul lanţurilor de hidrocarburi ale fosfolipidelor din membranele
biologice. În această poziţie, DPH este fluorescentă, însă aproape de capul hidrofil
fosfolipidic fluorescenţa DPH este redusă. Anularea fluorescenţei DPH în apă şi sensibilitatea
sa la mediu (în special la natura solventului), recomandă DPH ca senzor pentru alinierea
lanţurilor de acizi graşi.
Am utilizat programul HyperChem pentru:
- construcţia moleculei DPH, parametrizarea şi optimizarea geometriei moleculare;
- calculul parametrilor moleculari şi electro-optici ai DPH (momentul dipolar,
polarizabilitatea, energiile celui mai de jos orbital molecular neocupat (LUMO) şi celui
mai înalt ocupat orbital molecular (HOMO), tăria chimică (eV), indicele electrofil
(eV), caracteristicile energetice)
Din aceasta analiză a rezultat că:
- DPH este o moleculă nepolară, dar cu o valoare apreciabilă a polarizabilităţii în starea
electronică fundamentală;
- parametrii moleculari indică un potenţial de ionizare relativ scăzut a DPH;
- distribuţia electronică în orbitalii HOMO şi LUMO demonstrează posibilitatea unei
torsiuni moleculare, inducând posibilitatea unei tranziţii între stările excitate S1 şi S2, care
ar putea determina stingerea fluorescenţei.
Calculele de mecanică cuantică ale proprietăţilor structurale şi electro-optice ale DPH
realizate cu HyperChem 8.0.6 au fost corelate cu datele spectrale.
Am înregistrat SEA şi am stabilit numerele de undă în maximele benzilor vibronice de
absorbţie ale DPH în 34 de solvenţi. Din analiza datelor obţinute rezultă că:
numerele de undă ale maximelor vibronice ale benzii A ale DPH depind de natura
solventului producând deplasari spectrale;
deplasările spectrale nu depind de permitivitatea electrică a solventului; acest fapt fiind
explicat prin valoarea foarte mică a momentului de dipol electric şi dovedeşte că, prin
excitaţie, momentul de dipol electric al DPH nu se modifică semnificativ;
polarizabilitatea moleculară este crescută de excitaţie şi scade odată cu numărul de
vibraţii ale nivelului electronic excitat.
Din reprezentările grafice ale frecvenţelor în maximele benzilor vibronice ale DPH a rezultat
o foarte bună corelare (după prima bisectoare a figurilor) între valorile calculate şi cele
experimentale.
Spectre electronice de fluorescenţă (SEF) ale DPH în soluţii
Urmând acelaşi protocol de preparare a probelor am urmărit influenţa naturii
solventului în spectrele de fluorescenţă ale DPH.
Am înregistrat SEA şi SEF stabilind numerele de undă ale maximurilor de absorbţie,
fluorescenţă şi ale tranziţiei electronice 0-0 ale DPH în 20 de solvenţi diferiţi. În cazul
spectrelor de absorbţie dependenţa este liniară, deoarece în soluţiile DPH predomină
interacţiunile de dispersie. Abateri mari de la o dependenţă liniară au fost evidenţiate pentru
spectrele de emisie, în care deplasările spectrale sunt mai puţin sensible la natura solventului.
- Numerele de undă în maximele benzilor vibronice ale DPH depind de natura solventului
prin funcţia de dispersie. Acest fapt arată că forţele de orientare-inducţie şi polarizare sunt
mai mici decât cele dispersive în soluţiile cu DPH.
38
- Din dependenţa deplasării spectrale de funcţia de dispersie, a fost estimată
polarizabilitatea electrică în starea excitată a DPH. Rezultă faptul că polarizabilitatea
electrică a molecule de DPH creşte prin excitare.
- Numerele de undă corespunzătoare tranziţiei 0-0 depind numai de funcţia de dispersie a
solvenţilor.
În aceste studii a fost relevată prevalenţa forţelor de dispersie în soluţiile ternare ale DPH.
Caracteristici remarcabile ale spectrelor electronice ale DPH în funcţie de natura
solventului
În acest subcapitol sunt prezentate caracteristicile unor soluţii standard de DPH
realizate prin utilizarea protocolului pentru urmărirea fluidităţii membranei celulare. Acestea
au fost analizate în scopul de a explica deplasarea remarcabilă observată în spectrele
electronice (absorbţie şi fluorescenţă) ale DPH în diferiţi solvenţi. Soluţiile ternare DPH +
THF + solvent, au fost evaluate spectroscopic (absorbţie şi fluorescenţă) şi pot constitui
alternative în experimentele de marcare fluorescentă ale membranelor. Simulările de dinamică
moleculară ale amestecului DPH + THF în apă şi în etanol au fost efectuate cu scopul de a
obţine imagini la scală atomică, referitoare la modul de structurare a solventului în jurul
moleculei de DPH, în prezenţa de THF.
Rezultatele obţinute permit desprinderea următoarelor concluzii:
- În cazul sistemului DPH + THF + apă moleculele de THF formează spontan un agregat în
jurul moleculei de DPH, obstrucţionând interacţiunea directă cu apa. O mică parte dintre
moleculele de THF este dispersată în apă, neintrând în contact cu DPH.
- Agregatele formate de THF în jurul moleculei de DPH, explică asemănările dintre
spectrele electronice obţinute în cazul soluţiilor formate de DPH cu THF şi în soluţiile
DPH + THF + apă, la concentraţii mari de apă.
- Etanolul dispersează moleculele de THF, determinând pătrunderea moleculelor de ETH în
prima sferă de solvatare a DPH, fapt ce are drept consecinţă modificarea spectrelor
electronice ale DPH.
- În spectrele electronice ale DPH, simetria de oglindă şi structura vibronică sunt puternic
influenţate de natura solventului.
- Datele obţinute în acest subcapitol sugerează că soluţiile multicomponent de tipul DPH +
THF + apă, frecvent utilizate în protocoalele de marcare fluorescentă ale membranelor
biologice, nu sunt omogene.
Cap.V. Interacţiunea probelor fluorescente (DPH) cu membranele fosfolipidice
Obiectivul acestui studiu a fost de a aduce noi date privind localizarea şi orientarea
preferenţială a moleculei de DPH în bistratul puternic nesaturat format din DOPC, utilizând
simulări de dinamică moleculară (MD). După cunoştinţele noastre nu s-a mai realizat nici un
studiu de simulare privind localizarea DPH în interiorul bistraturilor fosfolipidice binesaturate.
Acest lucru este oarecum neaşteptat având în vedere că majoritatea tipurilor de fosfolipide ce
alcătuiesc membranele biologice sunt sn-1-saturate, sn-2-nesaturate. Comportamentul
moleculelor DPH inserate în membrane reflectă îndeaproape proprietăţile mediului local, ca
microvîscozitatea şi gradul de ordonare a lanţurilor alchil. Datele rezultate din simulările de
dinamică moleculară, au fost analizate având în vedere următorii parametrii: aria per lipid în
prezenţa şi absenţa DPH, profilele de densitate, parametrii de ordine şi funcţia de distribuţie
orientaţională a DPH. În timpul simulării am evaluat aria per lipid (AL) pentru a verifica
atingerea stării de echilibru şi pentru a urmări efectul produs de adăugarea de DPH asupra
expansiunii laterale a membranei. Rezultatele obţinute susţin următoarele concluzii:
- Evaluarea statistică a AL pentru DOPC pur şi pentru sistemele DPH + DOPC şi se
corelează bine cu aria per lipid determinată experimental. Abaterea faţă de experiment
este sub 3% pentru sistemul DOPC pur.
39
- Adăugarea de DPH nu induce alte variaţii vizibile ale ariei per lipid sugerând că efectul
fluoroforului asupra gradului de ordonare ale lanţurilor alchil este minimă la concentraţia
folosită în simulare.
- Am ales pentru DPH reprezentarea probabilităţii funcţiei de distribuţie pentru centrul de
masă şi nu profilul densităţii masice, datorită dependenţei acestuia din urmă de orientarea
preferenţială a acestei molecule în interiorul bistratului.
- Din reprezentarile P(z) rezultă că moleculele de apă pot penetra adânc bistratul până la
nivelul grupării COO, unde pot interacţiona cu moleculele de DPH şi că DPH ajunge
rareori în preajma capetelor polare ale fosfolipidelor.
- Corespondenţa bună între predicţia dată de simulare şi experiment, sugerează faptul că
orientarea moleculelor de DPH în timpul simulării reproduce comportamentul real al
acestora într-o membrană nesaturată de DOPC şi validează modelele folosite.
- Rezultatele prezentate aici susţin dependenţa orientării DPH în funcţie de regiunea
specifică a lanţurilor alchil explorată de fluorofor.
- Moleculele de DPH care sunt orientate paralel cu membrana explorează cu precădere
regiunea lanţurilor alchil în apropierea grupărilor COO ale fosfolipidelor, şi mai puţin
centrul bistratului (deşi ele pot fi încă prezente la acest nivel, dar în cantităţi mai mici).
- O populaţie reprezentativă de molecule DPH a fost localizată în regiunea lanţurilor alchil
a bistratului imediat sub interfaţa DOPC/apă, având un unghi de înclinare de aproximativ
90 grade faţă de normala bistratului. Acest lucru poate da o explicaţie pentru stingerea
fluorescenţei observată pentru membrane lipidice nesaturate.
Concluziile care se desprind din acest studiu de simulare sunt folositoare pentru
interpretarea datelor experimentale de anizotropie a fluorescenţei şi pentru studii viitoare de
modelare moleculară.
CAP. VI. Contribuţii la optimizarea reacţiilor de obţinere a unor compuşi:
A. cu activitate tuberculostatică (Tiosemicarbazide)
În cadrul experimentelor s-a constatat faptul că randamentul reacţiilor de obţinere a
compuşilor depinde de durata reacţiei şi de temperatura la care are loc aceasta.
- În modelul model matematic ales a fost propusă o dependenţă a randamentului reacţiei de
variabilele adimensionale.
- Au fost stabilite dependenţele randamentului reacţiilor studiate ca funcţie de durata şi
temperatura reacţiilor.
- Au fost reprezentate graficele tridimensionale ale randamentului în funcţie de cei doi
parametri semnificativi: durata reacţiei şi temperatura.
- Cea mai mare valoare a randamentului reacţiei s-a obţinut pentru compusul IV care este
cel mai activ împotriva Mycobacterium tuberculosis. Putem concluziona că substanţele
analizate în acest subcapitol sunt precursori promiţători pentru medicaţia
antituberculoasă.
B. cu acţiune antitumorală (derivaţi Glutaminici)
- Cele mai mari valori ale randamentului reacţiei s-au obţinut pentru compuşii II şi IV.
- A fost studiată influenţa derivaţilor glutaminici I-IV asupra enzimelor digestive tripsina,
lipaza şi amilaza în cazul administrării lor pe cale orală.
- Studiul biologic a demonstrat faptul că derivaţii I-IV nu influenţează activitatea lipazei şi
amilazei. Tripsina este uşor influenţată în activitatea sa.
- Compuşii I-IV nu prezintă o influenţă negativă asupra activităţii enzimelor testate. Prin
urmare, face posibilă administrarea lor pe cale orală. Importanţa farmacologică a
compuşilor studiaţi impune stabilirea condiţiilor optime pentru sinteza lor în procesul de
microproducţie.
Bibliografie selectivă
1. Singer, S.J., Nicolson, G.L., The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science, 1972.
175(4023): p. 720-31.
2. Engelman, D.M., Membranes are more mosaic than fluid. Nature, 2005. 438(7068): p. 578-80.
3. Marrink, S.J., de Vries, A.H., Tieleman, D.P., Lipids on the move: simulations of membrane pores,
domains, stalks and curves. Biochim Biophys Acta, 2009. 1788(1): p. 149-68.
4. Nagle, J.F., Theory of lipid monolayer and bilayer chain-melting phase transitions. Faraday Discuss Chem
Soc, 1986(81): p. 151-62.
5. Sun, W.J., Tristram-Nagle, S., Suter, R.M., Nagle, J.F., Structure of the ripple phase in lecithin bilayers.
Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93(14): p. 7008-12.
6. Rusu, V., Baran, T., Brănişteanu, D.D., Biomembrane şi patologie. Vol. I 1988, Bucureşti: Ed. Medicală.
27-62, 144-175, 176-178, 402-407.
7. Marguet, D., Lenne, P.F., Rigneault, H., He, H.T., Dynamics in the plasma membrane: how to combine
fluidity and order. EMBO J, 2006. 25(15): p. 3446-57.
8. Lenaz, G., Fato, R., Baracca, A., Solaini, G., Parenti Castelli, G., Rabbi, A., Dynamics of biological
membranes. Ann Ist Super Sanita, 1988. 24(1): p. 9-21.
9. Mainali, L., Feix, J.B., Hyde, J.S., Subczynski, W.K., Membrane fluidity profiles as deduced by
saturation-recovery EPR measurements of spin-lattice relaxation times of spin labels. Journal of Magnetic
Resonance, 2011. 212(2): p. 418-425.
10. Sorensen, E.B., Fluorescence Polarization to Evaluate the Fluidity of Natural and Reconstituted
Membranes, in Fluorescence Studies on Biological Membranes, H.J. Hilderson, Editor. 1988, Springer
US. p. 159-191.
11. Hurjui, I., Neamțu, A., Dorohoi, D.O., The interaction of fluorescent DPH probes with unsaturated
phospholipid membranes: A molecular dynamics study. Journal of Molecular Structure, 2013. 1044(0): p.
134-139.
12. Eisinger, J., Membrane Fluidity and Diffusive Transport, in Fluorescent Biomolecules, D. Jameson, and G.
Reinhart, Editors. 1989, Springer US. p. 151-171.
13. de Almeida, R.F.M., Fedorov, A., Prieto, M., Sphingomyelin/Phosphatidylcholine/Cholesterol Phase
Diagram: Boundaries and Composition of Lipid Rafts. Biophysical Journal, 2003. 85(4): p. 2406-2416.
14. Lonnfors, M., Doux, J.P.F., Killian, J.A., Nyholm, T.K.M., Slotte, P., Sterols Have Higher Affinity for
Sphingomyelin than for Phosphatidylcholine Bilayers even at Equal Acyl-Chain Order. Biophysical
Journal, 2011. 100(11): p. 2633-2641.
15. Feigenson, G.W., Phase diagrams and lipid domains in multicomponent lipid bilayer mixtures.
Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes, 2009. 1788(1): p. 47-52.
16. Marguet, D., Lenne, P.F., Rigneault, H., He, H.T., Dynamics in the plasma membrane: how to combine
fluidity and order. Embo Journal, 2006. 25(15): p. 3446-3457.
17. Visser, N.V., Hink, M.A., Borst, J.W., van der Krogt, G.N.M., Visser, A.J.W.G., Circular dichroism
spectroscopy of fluorescent proteins. Febs Letters, 2002. 521(1-3): p. 31-35.
18. Marrink, S.J., Lindahl, E., Edholm, O., Mark, A.E., Simulation of the spontaneous aggregation of
phospholipids into bilayers. Journal of the American Chemical Society, 2001. 123(35): p. 8638-8639.
19. Bakhshiev, N., Opt. i Spektroskopiya 10, 717 (1961). Opt. Spectry, 1961. 10: p. 379.
20. Bakhshiev, N., Universal intermolecular interactions and their effect on the position of the electronic
spectra of molecules in two-component solutions. VII. Theory (general case of an isotropic solution).
Optics and Spectroscopy, 1964. 16: p. 446.
21. Lakowicz, J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy: CD-ROM. 2006, Springer.
22. Siebert, F., Hildebrandt, P., Introduction, in Vibrational Spectroscopy in Life Science. 2007, Wiley-VCH
Verlag GmbH & Co. KGaA. p. 1-10.
23. Dorohoi, D.O., Elemente de Fizică şi Biofizică. 2003, Iaşi: Ed. Tehnică, Știinţifică şi Didactică.
24. Schaeberle, M.D., Levin, I.W., Lewis, E.N., in Infrared and raman spectroscopy of biological materials,
H.-U. Gremlich, and B. Yan, Editors. 2001, Marcel Dekker: New York; Basel. p. 231.
25. Dorohoi, D., Optica: teorie, experimente, probleme rezolvate. Editura Ștefan Procopiu, Iași, 1995: p. 97-
120.
26. Jackson, M., Mantsch, H.H., Medical Science Applications of IR, in Encyclopedia of Spectroscopy and
Spectrometry, C.L. Editor-in-Chief: John, Editor. 1999, Elsevier: Oxford. p. 1271-1281.
27. Steele, D., Theory of vibrational spectroscopy. 1971: Saunders.
28. Durig, J.R., Chemical, biological and industrial applications of infrared spectroscopy. 1985, New York:
John Wiley and Sons.
29. Valiyaveetil, F.I., Zhou, Y., MacKinnon, R., Lipids in the structure, folding, and function of the KcsA K+
channel. Biochemistry, 2002. 41(35): p. 10771-7.
30. http://www.jascoinc.com/products/spectroscopy/ft-ir-spectrometers/ft-ir-670-series.
31. Rusu, E., Dorohoi, D., Rusu, G., Hurjui, I., Poly(ε-caprolactam) as support for some biocidal polymers. I.
Structural characterization by FT-IR spectroscopy. Mater. Plast., 2005. 42: p. 252-257.
32. Danielsson, I., Lyotropic Mesomorphism, in Lyotropic Liquid Crystals. 1976, American Chemical Society.
p. 13-27.
33. Dorohoi, D.O., Nasta, L., Cotleţ, M., Frunză, S., Tonitza, O., An. Univ. "Al. I. Cuza" Iaşi s. Chimie, 1999.
VII(nr. 1).
34. Dorohoi, D., Postolache, M., Postolache, M., Birefringence dispersion of poly (phenyl methacrylic) ester
of cetyloxybenzoic acid in tetrachloromethane, determined from channeled spectra. Journal of
Macromolecular Science, Part B, 2001. 40(2): p. 239-249.
35. Larsson, K., Lundstrom, I., Liquid Crystalline Phases in Biological Model Systems, in Lyotropic Liquid
Crystals. 1976, American Chemical Society. p. 43-70.
36. Ganicz, T., Stańczyk, W., Side-chain Liquid Crystal Polymers (SCLCP): Methods and Materials. An
Overview. Materials, 2009. 2(1): p. 95-128.
37. McArdle, C.B., Side chain liquid crystal polymers. Vol. XIV. 1989, Glasgow, New York: Blackie:
Chapman and Hall.
38. Jacobson, K., Dietrich, C., Looking at lipid rafts? Trends Cell Biol, 1999. 9(3): p. 87-91.
39. Mouritsen, O.G., Theoretical models of phospholipid phase transitions. Chem Phys Lipids, 1991. 57(2-3):
p. 179-94.
40. Friberg, S., Lyotropic Liquid Crystals, Copyright, Advances in Chemistry Series,, in Lyotropic Liquid
Crystals, F. Gould Robert, Editor. 1976, American Chemical Society.
41. Winsor, P.A., Liquid crystals and Plastic Crystals, G.W. Gray, P.A. Winsor, and E. Horwood, Editors.
1974: Chichester. p. 199-221.
42. Bata, L., Liquid Crystal Conference of Socialist, C., Advances in liquid crystal research and applications :
proceedings. 1981, Oxford; New York; Paris; Budapest: Pergamon press ; Akademiai Kiado.
43. Mărgineanu, D.G., Biofizică. 1985, Bucureşti: Editura Ştiinţifică şi Enciclopedică.
44. Tonnelat, J., Biophysique. 1974, Paris: Masson.
45. Stan, C., Cristescu, C.P., Severcan, F., Dorohoi, D., Rev. Roum. Chim., 2004. 49(9): p. 777-782.
46. Severcan, F., Dorohoi, D.O., Creangă, D., Ultrasound Propagation Through Biological Tissues. Studia
Universitatis Babeş-Bolyai, Physica, 2001. 1(Special Issue): p. 169-175.
47. Roşu, L., Albu, R., Necula, A.M., Hurjui, I., Dorohoi, D., Order-disorder in lyotropic liquid cristals
induced by temperature. Revista Ştiinţifica "V. Adamachi", “Al. I. Cuza” University, 2005(iunie 2005): p.
120 - 123.
48. Ionescu, D., Dorohoi, D.O., Hurjui, I., Parametrical Control of the electrical permittivity for the Lα phase
of the Dipalmitoylphosphatidylcholine, determined by simulation methods, . Digest Journal of
Nanomaterials and Biostructures, 2013. 8(2): p. 691 - 698.
49. Hallinen, K.M., Tristram-Nagle, S., Nagle, J.F., Volumetric stability of lipid bilayers. Phys Chem Chem
Phys, 2012. 14(44): p. 15452-7.
50. Korkmaz, F., Severcan, F., Aflori, M., Dorohoi, D.O., Temperature influence on the
dipalmitoylphosphatidylcholyne - Model membranes studied by FTIR,. Digest Journal of Nanomaterials
and Biostructures, 2008. 3: p. 55-61.
51. Leekumjorn, S., Sum, A.K., Molecular studies of the gel to liquid-crystalline phase transition for fully
hydrated DPPC and DPPE bilayers. Biochim Biophys Acta, 2007. 1768(2): p. 354-65.
52. Izumikawa, T., Nambu, Y., Fujishige, K., Goto, M., Tamai, N., Matsuki, H., Kaneshina, S., Volume
behaviour of dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membrane: Pressure perturbation calorimetry and
densitometry. Journal of Physics: Conference Series, 2010. 215(1): p. 012163.
53. Severcan, F., Agheorghiesei, C., Dorohoi, D.O., Temperature dependence of the phospholipids bilayers
stability, studied by FTIR spectroscopy. Revista de Chimie (Bucharest), 2008. 59: p. 356-359.
54. Pandey, P.R., Roy, S., Headgroup mediated water insertion into the DPPC bilayer: a molecular dynamics
study. J Phys Chem B, 2011. 115(12): p. 3155-63.
55. Schneck, E., Generic and Specific Roles of Saccharides at Cell and Bacteria Surfaces. 2011:
Springerverlag Berlin Heidelberg.
56. Sonne, J., Jensen, M.O., Hansen, F.Y., Hemmingsen, L., Peters, G.H., Reparameterization of all-atom
dipalmitoylphosphatidylcholine lipid parameters enables simulation of fluid bilayers at zero tension.
Biophys J, 2007. 92(12): p. 4157-67.
57. Carrozzino, J.M., Drug partitioning and solvation environments in lipid bilayers, dissertation, in
Chemistry. 2004, North Carolina State University.
58. Cehelnik, E.D., Cundall, R.B., Lockwood, J.R., Palmer, T.F., Solvent and temperature effects on the
fluorescence of all-trans-1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene. Journal of Physical Chemistry, 1975. 79(14): p.
1369-1376.
59. Bachilo, S.M., Bachilo, E.V., Gillbro, T., Spectral shape of diphenylpolyene fluorescence and mixing of
the S1 and S2 states. Chemical Physics, 1998. 229(1): p. 75-91.
60. Pistolis, G., Malliaris, A., Effect of substituents on the spectroscopic properties of all-trans-1,6-diphenyl-
1,3,5-hexatriene. Chemical Physics, 1998. 226(1-2): p. 83-99.
61. Parasassi, T., De Stasio, G., Rusch, R.M., Gratton, E., A photophysical model for diphenylhexatriene
fluorescence decay in solvents and in phospholipid vesicles. Biophysical Journal, 1991. 59(2 I): p. 466-
475.
62. Saldanha, C., Santos, N.C., Martins-Silva, J., Fluorescent probes DPH, TMA-DPH and C17-HC induce
erythrocyte exovesiculation. Journal of Membrane Biology, 2002. 190(1): p. 75-82.
63. Dupuy, B., Montagu, M., Spectral properties of a fluorescent probe, all-trans-1,6-diphenyl-1,3,5-
hexatriene. Solvent and temperature effects. Analyst, 1997. 122(8): p. 783-786.
64. Dyck, R.H., McClure, D.S., J. Chem. Phys., 1962. 36: p. 2325-2326.
65. Shinitzky, M., Membrane Fluidity and Cellular Functions, Physiology of Membrane Fluidity. Physiology
of Membrane Fluidity, ed. M. Shinitzky. 1984, Boca Raton: CRC Press. 1-184.
66. Shinitzky, M., Inbar, M., Difference in microviscosity induced by different cholesterol levels in the surface
membrane lipid layer of normal lymphocytes and malignant lymphoma cells. Journal of Molecular
Biology, 1974. 85(4): p. 603-615.
67. Hyperchem 8.0.6., in Molecular Visualization and Simulation Program Package. 2007, Hypercube Inc.:
Gainesville.
68. Pérez, P., Domingo, L.R., Aurell, M.J., Contreras, R., Quantitative characterization of the global
electrophilicity pattern of some reagents involved in 1,3-dipolar cycloaddition reactions. Tetrahedron,
2003. 59(17): p. 3117-3125.
69. Van Vlaardingen, P.L.A., Steinhoff, W.J., De Voogt, P., Admiraal, W.A., Property-toxicity relationships
of azaarenes to the green alga Scenedesmus acuminatus. Environmental Toxicology and Chemistry, 1996.
15(11): p. 2035-2042.
70. Winfield, L.L., Inniss, T.R., Smith, D.M., Structure activity relationship of antiproliferative agents using
multiple linear regression. Chemical Biology and Drug Design, 2009. 74(3): p. 309-316.
71. Schlick, T., Molecular modeling and simulation, An Interdisciplinary Guide. Molecular Modeling and
Simulation: An Interdisciplinary Guide. 2002, New York Springer-Verlag.
72. Holtje, H.D., Sippl, W., Rognan, D., Folkers, G., Molecular modeling,. Molecular Modeling. 2003,
Dussedorf-Zurich, New York,: John Wiley - VCH Gmbh and Co.
73. Hurjui, I., Ivan, L.-M., Dorohoi, D.O., Solvent influence on the electronic absorption spectra (EAS) of
1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH). Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular
Spectroscopy, 2013. 102: p. 219-225.
74. Hurjui, I., Neamţu, A., Harabagiu, V., Dorohoi, D.O., Hurjui, L., Striking features of DPH spectra as
function of solvent nature in Revista de Chimie (Bucharest) - accepted paper. 2013. p. xxx-xx.
75. Vijan, L.E., Rev. Chim. (Bucuresti), 2009. Nr. 9: p. 921.
76. Hurjui, I., Ivan, L.M., Dorohoi, D.O., Solvent influence on the electronic absorption spectra (EAS) of 1,6-
diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH). Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 2013. 102: p. 219-25.
77. Plasek, J., Jarolim, P., Interaction of the fluorescent probe 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene with
biomembranes. Gen Physiol Biophys, 1987. 6(5): p. 425-37.
78. Wang, S., Beechem, J.M., Gratton, E., Glaser, M., Orientational distribution of 1,6-diphenyl-1,3,5-
hexatriene in phospholipid vesicles as determined by global analysis of frequency domain fluorimetry
data. Biochemistry, 1991. 30(22): p. 5565-5572.
79. Shinitzky, M., Barenholz, Y., Fluidity parameters of lipid regions determined by fluorescence
polarization. Biochim Biophys Acta, 1978. 515(4): p. 367-94.
80. Thulborn, K.R., Tilley, L.M., Sawyer, W.H., Treloar, F.E., The use of n-(9-anthroyloxy) fatty acids to
determine fluidity and polarity gradients in phospholipid bilayers. Biochim Biophys Acta, 1979. 558(2): p.
166-78.
81. van Hoeven, R.P., van Blitterswijk, W.J., Emmelot, P., Fluorescence polarization measurements on
normal and tumour cells and their corresponding plasma membranes. Biochim Biophys Acta, 1979.
551(1): p. 44-54.
82. Hess, B., Kutzner, C., van der Spoel, D., Lindahl, E., GROMACS 4: Algorithms for Highly Efficient,
Load-Balanced, and Scalable Molecular Simulation. Journal of Chemical Theory and Computation, 2008.
4(3): p. 435-447.
83. Lakowicz, J.R., ed. Quenching of Fluorescence. 3 ed. Principles of Fluorescence Spectroscopy, ed. J.R.
Lakowicz. 2006, Springer US. p. 301.
84. Pap, E.H., ter Horst, J.J., van Hoek, A., Visser, A.J., Fluorescence dynamics of diphenyl-1,3,5-hexatriene-
labeled phospholipids in bilayer membranes. Biophys Chem, 1994. 48(3): p. 337-51.
85. Johnson, S.M., Nicolau, C., The distribution of 1,6 diphenyl hexatriene fluorescence in normal human
lymphocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1977. 76(3): p. 869-874.
86. Repáková, J., Capková, P., Holopainen, J.M., Vattulainen, I., Distribution, orientation, and dynamics of
DPH probes in DPPC bilayer. The Journal of Physical Chemistry B, 2004. 108(35): p. 13438-13448.
87. Holopainen, J.M., Subramanian, M., Kinnunen, P.K., Sphingomyelinase induces lipid microdomain
formation in a fluid phosphatidylcholine/sphingomyelin membrane. Biochemistry, 1998. 37(50): p. 17562-
17570.
88. Troup, G.M., Wrenn, S.P., Apel-Paz, M., Doncel, G.F., Vanderlick, T.K., A time-resolved fluorescence
diphenylhexatriene (DPH) anisotropy characterization of a series of model lipid constructs for the sperm
plasma membrane. Industrial & engineering chemistry research, 2006. 45(21): p. 6939-6945.
89. Pan, J., Tristram-Nagle, S., Kučerka, N., Nagle, J.F., Temperature dependence of structure, bending
rigidity, and bilayer interactions of dioleoylphosphatidylcholine bilayers. Biophysical Journal, 2008.
94(1): p. 117-124.
90. Silvius, J.R., Thermotropic phase transitions of pure lipids in model membranes and their modifications
by membrane proteins. Lipid-protein interactions, ed. P.C. Jost, and O.H. Griffith. Vol. 2. 1982, New
York: John Wiley and Sons.
91. Kaiser, R.D., London, E., Location of diphenylhexatriene (DPH) and its derivatives within membranes:
comparison of different fluorescence quenching analyses of membrane depth. Biochemistry, 1998. 37(22):
p. 8180-8190.
92. Lentz, B.R., Use of fluorescent probes to monitor molecular order and motions within liposome bilayers.
Chemistry and Physics of Lipids, 1993. 64(1): p. 99-116.
93. Mitchell, D.C., Litman, B.J., Molecular order and dynamics in bilayers consisting of highly
polyunsaturated phospholipids. Biophysical Journal, 1998. 74(2): p. 879-891.
94. Pink, D.A., Perturbing probes and the study of lipid-protein bilayer membranes. Chemistry and Physics of
Lipids, 1989. 50(3): p. 213-236.
95. van der Heide, U.A., Levine, Y.K., A computer simulation study of the relation between lipid and probe
behaviour in bilayer systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1994. 1195(1): p. 1-
10.
96. Muller, J.M., van Ginkel, G., van Faassen, E.E., Effect of lipid molecular structure and gramicidin A on
the core of lipid vesicle bilayers. A time-resolved fluorescence depolarization study. Biochemistry, 1996.
35(2): p. 488-497.
97. Hurjui, I., Dorohoi, D.O., Solvent Influence on the electronic spectra of 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene in
ternary solutions, in 31st European Congress on Molecular Spectroscopy, K. Nagy-Pora, V. Chiş, S.
Aştilean, and O. Cozar, Editors. 26 - 31 August 2012, Publishing House Napoca Star: Cluj-Napoca,
Romania. p. 186.
98. Moise, M., Sunel, V., Dulcescu, M.M., Dorohoi, D.O., Mathematic Modelling to Optimize the Obtaining
Process of New Thiosemicarbazides Derived from N-(P-Nitrobenzoyl)-D,L-Phenylalanine. Rev. Chim.
(Bucharest) 2010. 61(8).
99. Azzouz, A., Leontie, M., Dorohoi, D.O., Gheorghieş, C., Elemente de strategie în design industrial. 1998,
Bacău: Ed. Plumb.
100. Fiksel, J., Fiksel, J.R., Design for environment: creating eco-efficient products and processes. 1996, New
York: McGraw-Hill.
101. Diaconescu, R., Oniscu, C., Cernatescu, C., Ocanu, A., Bibere, C., Vornicu, N., Analiza de sensibilitate şi
modelarea statistică pentru condensarea acizilor R1–6–cloro–7fluoro–1,4–dihidro–4–oxochinolin–3–
carboxilici cu 4–metilpiperidină. Bul. IPI Iaşi, seria Matematică, Mecanică Teoretică, Fizică, fasc. 2,
2009. LV(LIX ): p. 93 -105.
102. Mazilu, C., Radu, D., Rotiu, E., Ionescu, L., Proiectarea optimală şi caracterizarea unei vitroceramici
bioactive utilizată în medicina modernă reparatorie. Rev. Chim. (Bucharest), 2007. 58(1): p. 88-91.
103. Moise, M., Sunel, V., Profire, L., Popa, M., Desbrieres, J., Peptu, C., Synthesis and biological activity of
some new 1,3,4-thiadiazole and 1,2,4-triazole compounds containing a phenylalanine moiety. Molecules,
2009. 14(7): p. 2621-31.
104. Hurjui, I., Cheptea, C., Dascalu, C.F., Hurjui, L., Peptu, C., Şunel, V., Dorohoi, D.O., Optimization
reaction of some 1, 4-disubstituted thiosemicarbazides with tuberculostatic activity. Digest Journal of
Nanomaterials and Biostructures, 2012. 7(4): p. 1447-1756.
105. Grebinişan, D., Burlea, M., Cheptea, C., Lionte, C., Dorohoi, D.O., Şunel, V., Popa, M., Hurjui, I.,
Optimization Reaction for Obtaining some N-[p-(R)-Benzoyl]-L-Glutamine Derivatives with
Pharmaceutical Action. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, 2013. 8 (2): p. 777 - 785.
ANEXA
I. LISTA DE PUBLICAŢII
Lucrări ştiinţifice publicate în reviste cotate ISI:
1. Rusu, E., Dorohoi, D., Rusu, G., Hurjui, I., Poly(ε-caprolactam) as support for some biocidal polymers. I.
Structural characterization by FT-IR spectroscopy. Mater. Plast., 2005. 42: p. 252-257.
2. Hurjui, I., Cheptea, C., Dascălu, C.F., Hurjui, L., Peptu, C., Şunel, V., Dorohoi, D.O., Optimization
reaction of some 1, 4-disubstituted thiosemicarbazides with tuberculostatic activity. Digest Journal of
Nanomaterials and Biostructures, 2012. 7(4): p. 1447-1756.
3. Hurjui, I., Ivan, L.-M., Dorohoi, D.O., Solvent influence on the electronic absorption spectra (EAS) of
1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH). Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular
Spectroscopy, 2013. 102: p. 219-225.
4. Hurjui, I., Neamtu, A., Dorohoi, D.O., The interaction of fluorescent DPH probes with unsaturated
phospholipid membranes: A molecular dynamics study. Journal of Molecular Structure, 2013. 1044(0): p.
134-139.
5. Ionescu, D., Dorohoi, D.O., Hurjui, I., Parametrical Control of the electrical permittivity for the Lα phase
of the Dipalmitoylphosphatidylcholine, determined by simulation methods. Digest Journal of
Nanomaterials and Biostructures, 2013. 8(2): p. 691 - 698.
6. Grebinişan, D., Burlea, M., Cheptea, C., Lionte, C., Dorohoi, D.O., Şunel, V., Popa, M., Hurjui, I.,
Optimization Reaction for Obtaining some N-[p-(R)-Benzoyl]-L-Glutamine Derivatives with
Pharmaceutical Action. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, 2013. 8(2): p. 777 - 785.
Lucrări ştiinţifice acceptate spre publicare în reviste ştiinţifice cotate ISI
7. Hurjui, I., Neamţu, A., Harabagiu, V., Dorohoi, D.O., Hurjui, L., Striking features of DPH spectra as
function of solvent nature, Revista de Chimie (Bucharest), 2013. (accepted paper)
Lucrări ştiinţifice trimise spre publicare în reviste ştiinţifice cotate ISI
8. Hurjui, I., Neamţu, A., Dorohoi, D.O., Computational and spectral studies of DPH multicomponent
solutions, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2013.
Lucrări publicate în reviste ştiinţifice categoria B+
1. Ştefănescu, C., Rusu, V., Azoicăi, D., Hurjui, I., 99mTc isonitrils biophysical aspects in pulmonary
tuberculosis. Part II. In vitro evaluation of 99mTc MIBI cellular uptake mechanism. Revista medico-
chirurgicală a Societăţii de Medici şi Naturalişti din Iaşi, 2007. 111(1): p. 210-216.
2. Hurjui, L., Şerban, I.L., Oprişa, C., Tucaliuc, E.S., Hogaş, M.M., Tucaliuc, D., Hurjui, I., Luca, V.,
Şerban, D.N., The importance of EDHF in endothelium-dependent relaxation increases distally in
mesenteric arteries depending upon the contracting agent. Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iaşi, 2011.
115(1): p. 168-70.
Lucrări publicate în reviste ştiinţifice din categoria C şi D
1. Roşu, L., Albu, R., Necula, A.M., Hurjui, I., Dorohoi, D., Order-disorder in lyotropic liquid cristals
induced by temperature. Revista Ştiinţifică "V. Adamachi", “Al. I. Cuza” University, 2005. p:120-122.
2. Albu, E., Filip, C., Hurjui, I., Lupaşcu, D., Testarea degranulării mastocitelor peritoneale de şobolan –
posibilă metoda de screening a moleculelor farmacologic active, Revista de Medicină şi Farmacie U.M.F.
Tg Mureş, 2007 (53), p. 185-188.
II. PARTICIPĂRI LA CONFERINŢE ŞTIINŢIFICE NAŢIONALE ŞI INTERNAŢIONALE:
1. Hurjui, I., Morar, A., Morar, S., Dorohoi, D.O., Intermolecular interaction in some homogeneous solutions
of 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene, poster, 12th National Conference on Biophysics“CNB 2013” – Biophysics
for Health, with International Participation, 13-16 june 2013 Iași, Romania, Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat.
Iaşi, 2013. 117(1) supl.: p. 100-01.
2. Hurjui, I., Ivan, L.-M., Dorohoi, D.O., Changes in polarizability of 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH)
excitation in some homogeneous solutions, poster, National Conference of applied physics CNFA 2013, 23-
24 mai, Iași, Romania
3. Hurjui, I., Dorohoi, D.O., Solvent Influence on the electronic spectra of 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene in
ternary solutions, poster, 31st European Congress on Molecular Spectroscopy, K. Nagy-Pora, V. Chiş, S.
Aştilean, and O. Cozar, Editors. 26 - 31 August 2012, Publishing House Napoca Star: Cluj-Napoca,
Romania. p. 186.
4. Hurjui, I., Neamţu, A., Dorohoi, D.O., Concentration influence of fluorescence DPH probe on the structure
and mobility POPC model membranes: a molecular dinamics study, poster, 31st European Congress on
Molecular Spectroscopy, K. Nagy-Pora, V. Chiş, S. Aştilean, and O. Cozar, Editors. 26 - 31 August 2012,
Publishing House Napoca Star: Cluj-Napoca, Romania. p. 187.
5. Hurjui L.L., Şerban, I.L., Hurjui, I., Oprişa, C., Hogaş, M.M., Şerban. D.N. Blood levels of homocysteine,
vitamin B12 and folic acid in patients with type II diabetes mellitus: possible correlation with endothelial
dysfunction, poster, „Advances and Controversies in B-Vitamins and Choline“- 5-8 March 2012-Leipzig-
Germany, abstract, Clin Chem Lab Med. 2012; 50(2), p. A24.
6. Hurjui, L.L., Serban, I.L., Hurjui, I., Oprişa, C., Hogaş, M.M., Serban, D.N., Endothelial dysfunction in
type 2 diabetes may be related to the blood levels of homocysteine, vitamin B12 and folic acid, poster, in
Zilele Medicamentului, Ed. XXI, 2012, abstract, Ed UMF GR. T. POPA, IASI, p. 98, ISSN 1843-1038
7. Hurjui, L.L., Serban, I. L., Hurjui, I., Oprisa, C., Hogas, M.M., Serban, D.N. ,Influence of pravastatin on
endothelium dependent relaxation of rat resistance arteries affected by homocysteine exposure, in The 11th
National Congress of the Romanian Society of Physiological Sciences, XXIst Century Physiology-from
Genotype to Phenotype, Timisoara, 10-12 may 2012, abstract, Fiziologia suppl. p. 50, ISSN 1223-2076
8. Hurjui, L., Şerban, I.L., Oprişa, C., Tucaliuc, E.S., Hogaş, M.M., Hurjui I., Luca, V., Şerban, D.N. The link
of homocysteine to atherosclerotic vascular disease, endothelial dysfunction, lipid peroxidation and
inflammation markers in type 2 diabetic patients, Zilele Medicamentului Ed. A XX-a, abstract, in: Mungiu
OC (ed), Pain and Drug Research, 2011, Ed. UMF „Gr. T. Popa”, Iaşi, p.128.
9. Hurjui, L., Şerban, I.L., Luca, V., Şotropa, M., Neamţu, A., Tiţu, G., Hurjui I., Şerban, D. N., Correlation
between plasma total homocysteine levels with other biochemical parameters in a group of patients with
type 2 diabetes, Zilele Medicamentului Ed. A XIX-a abstract, Pain and Drug Research, 2010, Ed UMF „Gr.
T. Popa”, Iaşi, p. 197.
10. Hurjui, L., Hurjui I., Şerban, I.L., Gheorghiţă, N., Luca, V., Serban, D. N., Progrese privind
hiperhomocisteinemia asociată cu sindromul metabolic, Medicina Modernă, Revista Colegiului Medicilor
din Municipiul Bucureşti, vol.XVI, supl. Nr. 1, p. 201, Zilele Medicamentului Ed. A XVIII-a, Iasi, mai
2009.
11. Hurjui, L., Hurjui, I., Şerban, L.I., Bădescu, M., Iancu, R., Diaconu Sotropa, M., Colev Luca, V., Corelaţii
ale homocisteinei cu alţi parametri serici la pacienţi diagnosticaţi cu diabet zaharat tip II, poster, aVIIa
Conferinţă Naţională a Societăţii Române de Fiziopatologie, Oct. 2009, Oradea, Romania.
12. Hurjui, I., Dorohoi, D., Rusu, V., Antochi, A., Comparative study of FTIR spectra for some acetic acid
derivatives, poster, The 8th
International Conference on Physics of Advanced Materials (ICPAM-8),
Universitatea "Alexandru Ioan Cuza" Iaşi, 4 – 7 iunie 2008.
13. Hurjui, L., Şerban, L.I., Hurjui, I., Ciurea, E., Gheorghiţă, N., Scripcar, L., Luca, V., Mecanisme
moleculare ale hiperhomocisteinemiei asociate aterosclerozei, poster, Zilele Facultăţii de Medicină
Dentară, UMF „Gr. T. Popa”, Iaşi, martie 2008.
14. Hurjui, L., Hurjui, I., Titu, G., Homocisteina – marker si metabolit activ in patologie, poster, Zilele
Spitalului de Recuperare, aprilie 2006, Iaşi.
15. Hurjui, L., Hurjui, I., Frunza, F.G., Titu, G., Colev-Luca, V., Influenţa statusului vitaminelor din grupul B
asupra homocisteinei plasmatice, poster, Ziua Medicamentului, Iaşi, mai 2006.
16. Hurjui, I., Ştefănescu, C., Miron, S., Rusu, V., Fluidity evaluation of the Mycobacterium Tuberculosis wall,
prezentare orală, Sesiune ştiinţifică, Zilele Universităţii de Medicină, UMF „Gr. T. Popa”, Iaşi, nov. 2005.
17. Roşu, L., Albu, R., Necula, A.M., Hurjui, I., Dorohoi, D., Order-disorder in lyotropic liquid cristals
induced by temperature, poster, a XXXIVa Conferinţă Natională “Fizica şi Tehnologiile Educaţionale
Moderne”, Facultatea de Fizică, Universitatea "Alexandru Ioan Cuza" Iaşi, 18-19 mai 2005.
Top Related