Ruhr-Universität BochumProf. Dr. med. Stephan Schneider
Dienstort: St. Vinzenz-Hospital in Köln-NippesAbteilung Innere Medizin II Endokrinologie und Diabetologie
Entwicklung und Analyse eines β-Zell-spezifischen Kontrastmittels auf Basis der Phage-Display-Technologie
Inaugural-Dissertationzur
Erlangung des Doktorgrades der Medizineiner
Hohen Medizinischen Fakultätder Ruhr-Universität Bochum
Vorgelegt vonGeorg Dennis Ziegler
Aus Mannheim2013
Dekan: Prof. Dr. med. K. ÜberlaReferent: Prof. Dr. med. S. SchneiderKorreferent: Prof. Dr. rer. nat. Katrin Marcus
Tag der Mündlichen Prüfung: 06.11.2014
Abstract
Ziegler
Georg Dennis
Entwicklung und Analyse eines β-Zell-spezifischen Kontrastmittels auf Basis der Phage-
Display-Technologie
Problem: Mit der Möglichkeit die aktive BZM (β-Zell-Masse) in vivo über den Verlauf
der Erkrankung des Diabetes darzustellen, wird erhofft, dass neue Kenntnisse über die
Pathogenese des Diabetes erlangt werden können. Trotz hoher Sensitivität von
radiologischen Methoden scheitert die Darstellung von β-Zellen des Pankreas in vivo
bisher am Fehlen eines geeigneten Kontrastmittels. Aufgrund der Tatsache, dass das
Massenverhältnis der β- zu nicht β-Zellen sehr ungünstig ist, sind sehr hohe
Anforderungen an das Kontrastmittel zu stellen.
Methode: Eine auf Phagen basierende Single-Chain-Antikörper (SCA) -Bibliothek wurde
in Ratten in vivo und an einer β-Zelllinie in vitro selektiert. Mit Hilfe der selektierten
Phagenklone wurden inselspezifische SCA hergestellt. Diese SCA wurden dann in vitro
charakterisiert.
Ergebnis: Es konnten zwei SCA (SCAB1 und SCAB7) aus dem in vivo Ansatz isoliert
werden. Nur einer davon ist bis dahin unbekannt gewesen (SCAB7), der SCAB1 ist bereits
in der Literatur beschrieben. Der SCAB7 bindet in vivo an den β-Zellen des Pankreas wie
immunhistochemische Färbungen zeigen. Der SCAB7 zeigt auch ein deutliches
Hintergrundsignal im exokrinen Pankreas, aber kein Bindung an extrapankreatisch
gelegenen Organen und Geweben.
Des Weiteren wurde der SCAB5 von S. Überberg (2009a, 2010b) charakterisiert. Dieser
zeigte, dass seine Bindungsspezifität gegenüber der INS-1- und Beta TC6-Zelllinie ein
450-faches größer ist als zu der AR42J-Zelllinie. Außerdem konnte mittels
Radioaktivitätsversuchen und Aufnahmen mittels konfokalem Lasermikroskop gezeigt
werden, dass der SCAB5 aktiv internalisiert wird.
Diskussion: Mit Hilfe der Phage-Display-Methode lassen sich β-Zell-spezifische
Antikörper entwickeln. Ein neuer SCA konnte dadurch entwickelt werden. In dieser Arbeit
war es außerdem möglich, die bisherigen Ergebnisse des SCAB1 zu bestätigen und anhand
des SCAB5 eine Internalisierung nachzuweisen. Dadurch scheint es, dass der SCAB5 nur
an gesunden β-Zellen bindet. Die weiterführende Untersuchung des SCAB5 auf Toxizität
und Elimination aus dem pankreatischen Gewebe steht noch offen.
1
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung...........................................................................................................................7
1.1 Diabetes mellitus..............................................................................................................7
1.2 Pankreasaufbau und –funktion.....................................................................................8
1.3 Bisherige Versuche der non-invasive BZM-Bestimmung in vivo.............................10
1.3.1 Anforderung an ein β-Zell-Kontrastmittel ..........................................................10
1.3.2 Evaluierte β-Zell-spezifische Kontrastmittel ......................................................11
1.4 Phage-Display-Technologie.......................................................................................11
1.4.1 M13-Phagen........................................................................................................12
1.5 Antikörper ..................................................................................................................13
1.5.1 Antikörper Phage-Display ..................................................................................15
1.6 Humane SCA-Bibliothek I (Tomlinsen)....................................................................16
1.6.1 Selektionsverfahren ............................................................................................16
1.7 Bestimmung der CDR (Kabat, et al., 1991)...............................................................17
2. Zielsetzung.......................................................................................................................19
3. Material und Methoden....................................................................................................20
3.1 Material ......................................................................................................................20
3.1.1 Chemikalien ........................................................................................................20
3.1.2 Antibiotika ..........................................................................................................21
3.1.3 Zellkultur-Medien und Zusätze ..........................................................................21
3.1.4 Verbrauchsmaterialien ........................................................................................22
3.1.5 Bakterien.............................................................................................................22
3.1.6 Zelllinien .............................................................................................................22
3.1.7 Antikörper ...........................................................................................................22
3.1.8 Oligonukleotide ..................................................................................................23
3.1.9 Reagenzsysteme..................................................................................................23
3.1.10 Größenstandard und Enzyme............................................................................23
3.1.11 Radioaktivität....................................................................................................23
3.1.12 Medien und Lösungen für Arbeiten mit der Tomlinson-Bibliothek.................24
3.1.13 Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese ........................................................25
3.1.14 Puffer für die Histologie ...................................................................................25
3.1.15 Puffer und Lösungen für den Westernblot........................................................25
3.1.16 Geräte................................................................................................................26
2
3.2 Methoden ...................................................................................................................28
3.2.1 Zellkultur ............................................................................................................28
3.2.1.1 Kultivierung von eukaryonten Zellen ..............................................................28
3.2.1.2 Kryokonservierung ..........................................................................................28
3.2.1.3 Auftauen von eukaryonten Zellen....................................................................28
3.2.1.4 Passagieren von Zellen ....................................................................................29
3.2.3 Molekularbiologischen Methoden ......................................................................29
3.2.3.1 Analytische Plasmidisolierung ........................................................................29
3.2.3.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR, polymerase-chain-reaction) ...................29
3.2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese .............................................................................30
3.2.3.4 DNA-Extraktion nach Agarose-Gelelektrophorese .........................................30
3.2.3.5 DNA-Aufreinigung und -Konzentrierung .......................................................30
3.2.3.6 Konzentrationsbestimmung der DNA .............................................................31
3.2.3.7 Sequenzierung..................................................................................................31
3.2.4 Insel-spezifischer-Phagenklon (ISPC) Herstellung ............................................31
3.2.4.1 Herstellung und Titern des M13-Helferphagenstocks .....................................31
3.2.4.2 Amplifizieren und Titern der gewünschten Phagen ........................................32
3.2.5 Proteinbiochemische Methoden..........................................................................33
3.2.5.1 Herstellung von löslichen Antikörperfragmenten (SCA) ................................33
3.2.5.2 Präparation und Aufreinigung von SCA aus Bakterien...................................34
3.2.5.3 Proteinbestimmung nach Bradford ..................................................................34
3.2.5.4 Denaturierende SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ...................................35
3.2.5.4.1 SCA-Aufreinigungsnachweis mittels Coomassie-Brilliantblau Färbung .....35
3.2.5.4.2 Westernblot ...................................................................................................36
3.2.6 Charakterisierung der ISPC und SCA ................................................................36
3.2.6.1 Zellbasierter Bindungsassay ............................................................................36
3.2.6.2 Immunhistochemische Färbungen an Paraffin-Schnitten ................................37
3.2.6.3 Chloramin-T Methode .....................................................................................38
3.2.6.4 In vitro Analysen des Bindungsverhaltens vom SCA .....................................38
3.2.6.4.1 Charakterisierung der SCA mittels konfokalem Lasermikroskop ................38
3.2.6.4.2 In vitro Radioaktivitäts-Bindungsassay ........................................................39
4. Ergebnisse ........................................................................................................................40
4.1 Bestimmung β-Zell-spezifischer SCA aus der Phage-Display-Technologie.............40
4.2 In vitro Bestimmung der β-Zell-Spezifität des ISPC.................................................42
3
4.3 SCA-Herstellung........................................................................................................42
4.4 In vivo Bestimmung der β-Zell-Spezifität der ISPC .................................................43
4.5 In vivo Bestimmung der Spezifität des SCAB7 ........................................................45
4.6 In vitro Bestimmung der β-Zell-Spezifität des SCA .................................................46
4.7 Charakterisierung des Bindeverhaltens des SCAB5 mittels konfokalem
Lasermikroskop .......................................................................................................47
5. Diskussion........................................................................................................................49
5.1 Hintergrund zur humanen BZM-Darstellung ............................................................49
5.2 Antikörper als β-Zell-spezifischer Marker ................................................................50
5.3 Entwicklung β-Zell-spezifischer SCA.......................................................................51
5.4 Bestimmung der β-Zell-Spezifität in vitro und in vivo..............................................52
5.5 Bindungsverhalten von markierten SCA in vitro ......................................................54
5.6 Ausblick .....................................................................................................................56
6. Literaturverzeichnis .........................................................................................................59
Danksagung .............................................................................................................................
Lebenslauf................................................................................................................................
4
Abkürzungsverzeichnis
A.dest. Aqua destillatum
BRASIL Biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands
BZM β-Zell-Masse
CAR cell associated radioactivity (Zell assoziierte Radioaktivität)
CDR complimentary determining regions
DAPI 4’,6-diamdino-2-phenylindole, dihydrochloride
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DPP4 Dipeptidyl Peptidase-4
GLP-1 Glukagon-Like-Peptide-1
IMAC immobilized metal ion affinity chromatography (immobilisierte Metall-
Ionen-Affinitätschromatographie)
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
ISPC isle specific phage-clone (Insel-spezifischer Phagenklon)
OD optische Dichte
PCR polymerase chain reaction (Polymerase Ketten Reaktion)
PEG Polyethylene glycol 6000
PET Positronen-Emissions-Tomographie
pfu/ml plaque forming unit/ml
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
RPMI Roswell Park Memorial Institute
SCA Single-Chain-Antibody
SDS Sodium Dodecyl Sulfate (Natriumdodecylsulfat)
U/min Umdrehung pro Minute
VMAT2 Vesicular Monoamin Transporter 2
[11C]DTBZ Dihydroterabenazin
5
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Zusammensetzung der Zellkulturmedien ...........................................................28
Tabelle 2: Zusammensetzung von Sammel- und Trenn-Gel ...............................................35
6
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schematischer Aufbau des humanen Pankreas mit benachbarten Strukturen .9
Abbildung 2: Schematische Darstellung einer Langerhans´schen Insel..............................10
Abbildung 3: Schematische Darstellung eines M13-Bakteriophagen .................................13
Abbildung 4: Schematische Darstellung eines Antikörpers ................................................14
Abbildung 5: Vektorkarte von pIT2 ....................................................................................16
Abbildung 6: Schematische Darstellung des Phage-Display Screenings ............................17
Abbildung 7: Sequenzen des ISPC1 und ISPC8..................................................................41
Abbildung 8: In vitro Bestimmung der β-Zell-Spezifität ....................................................42
Abbildung 9: SCA-Aufreinigung aus HB2151 Bakterien und Westernblot........................43
Abbildung 10: In vivo Lokalisation der ISPC .....................................................................44
Abbildung 11: In vivo Lokalisation des SCAB7 im Pankreas ............................................45
Abbildung 12: In vivo Lokalisation des SCAB7 in den Kontrollorganen...........................46
Abbildung 13: in vitro Bindungsverhalten von [125I]-markiertem SCAB5 für endokrine
und exokrine Zelllinien ................................................................................................47
Abbildung 14: Bindeanalyse mittels konfokalem Lasermikroskops ...................................48
7
1. Einleitung
Für die Entstehung des Typ-1-Diabetes spielen autoimmun bedingte Prozesse beim Verlust
der Insulin produzierenden β-Zellen eine zentrale Rolle. Auch beim Typ-2-Diabetes
kommt es im weiteren Erkrankungsverlauf zur Verminderung der β-Zellen. Hierbei scheint
es aber, durch eine erhöhte Apoptoserate bedingt zu sein (Butler, et al., 2003, Weir, et al.,
1990). Daraus folgernd ist es ersichtlich, dass alle Typ-1-Diabetiker und viele Typ-2-
Diabetiker bei Fortschreiten der Krankheit eine Insulintherapie benötigen. Bis jetzt ist es
noch nicht gelungen, diesen Zellverlust dauerhaft aufzuhalten (Schneider, 2008). In
Tierversuchen konnten Hinweise gefunden werden, dass gewisse Antidiabetika z.B. DPP4-
Hemmer (Dipeptidyl Peptidase-4), GLP-1 Analoga (Glukagon-Like Peptide-1) etc. die
Reduktion der β-Zell-Masse (BZM) verhindern (Meier, 2008, Mu, et al., 2006, Stoffers, et
al., 2000). Die Komplexität der pathophysiologischen Mechanismen hat dazu geführt, dass
die Notwendigkeit besteht, die BZM beim Menschen nicht-invasiv in vivo zu bestimmen.
Um die Wirkung dieser Therapien auf die menschlichen β-Zellen untersuchen zu können,
sowie weitere Erkenntnisse über die BZM, β-Zellfunktion und Glukosestoffwechsel zu
erlangen, wäre eine nicht-invasiv Methode von Nutzen. Doch steht leider bis jetzt ein
solches Verfahren nicht zur Verfügung (Schneider, 2008).
Um eine adäquate Auflösung zur Bestimmung der BZM des Menschen zu erreichen, ist
ein hoch sensitives Verfahren notwendig. Dafür bietet sich die Radionukleid-Bildgebung
an, da ihre Sensitivität im Pikomol-Bereich liegt (Cassidy and Radda, 2005). Bis jetzt fehlt
für eine radiologische Aufnahme, um exokrinem von endokrinem Anteil abgrenzen zu
können, ein β-Zell-spezifisches Kontrastmittel.
1.1 Diabetes mellitus
Der Diabetes mellitus (kurz Diabetes) ist eine der häufigsten Zivilisationskrankheiten in
den Industrienationen und eine weitere Zunahme wird erwartet. Im Jahr 2000 waren ca.
171 Millionen Menschen an Diabetes erkrankt, welches ca. 2,8 % der Weltbevölkerung
über alle Altersgruppen entspricht. Im Jahr 2011 waren es schon ca. 8,3% der
Weltbevölkerung (366 Millionen Menschen) und für das Jahr 2030 wird ein
Bevölkerungswachstum auf ca. 9,9 % erwartet. Dies entsprächen ca. 552 Millionen
(Whiting, et al., 2011, Wild, et al., 2004). Mit der Außnahme von Afrika können im Jahr
8
2011 ca. 10% der Todesfälle in der Altersgruppe zwischen 20-79 Jahren auf den Diabetes
zurückgeführt werden (IDF, 2013). Der Diabetes basiert auf einer chronischen
Hyperglykämie, die durch einen Fehler in der Insulinsekretion, Insulinwirkung oder aber
sogar durch eine Kombination von beiden bedingt ist. Der Diabetes wird aufgrund von
unterschiedlicher Ursache und Verlauf in verschiedene Gruppen unterteilt. Eine
Klassifikation wurde erstmals 1997 von der American Diabetes Association nach Ursache
und nicht nach Art der Behandlung eingeführt. Es wird vorwiegend zwischen Typ-1 und
Typ-2-Diabetes unterschieden (Kerner, 2011, Mehnert, 1999).
Der Typ-1-Diabetes ist der seltenere und liegt in ca. 5-7% der Fälle vor (Wild, et al., 2004).
Als Ursache wird von einer Autoimmunreaktion ausgegangen, die zum Untergang der β-
Zellen führt. Diese Reaktion beginnt meist schon im Kindesalter und mündet in einem
Totalausfall der Insulinproduktion (Weir, et al., 1990). Aufgrund der fehlenden
Insulinproduktion besteht die einzige Therapiemöglichkeit in einer lebenslangen exogenen
Zufuhr von Insulin.
Der viel häufigere Typ-2 Diabetes liegt in ca. 85 % der Fälle vor (Wild, et al., 2004).
Hierbei wird angenommen, dass es durch verschiedene Mechanismen zu einem Verlust der
β-Zellfunktion kommt und darauf folgend zu einem schleichenden Untergang der BZM,
der bis jetzt noch nicht vollständig verstanden wurde (Butler, et al., 2003, Marchetti, et al.,
2004). In den Leitlinien der Deutsche Diabetes Gesellschaft wird hierfür ein
Therapieschema empfohlen, in dem zunächst eine Ernährungs- und Bewegungstherapie
versucht wird. Ist keine adäquate Reduktion des Blutglukosespiegels zu erreichen, wird
eine medikamentöse Therapie eingeleitet. Wenn dies ebenfalls nicht ausreichen sollte,
wird zusätzlich mit einer Insulintherapie begonnen (Matthaei, et al., 2009).
1.2 Pankreasaufbau und –funktion
Das Pankreas ist eine sekundär retroperitoneal liegendes Organ. Es liegt s-förmig im
Oberbauch. Es ist ca.14-18 cm lang und ca 60-100 Gramm schwer. Es wird unterteilt in
Caput, Corpus und Cauda (vgl. Abb. 1). Das Caput pancreaticus wird hufeisenförmig vom
Duodenum umgeben, während die Cauda bis zur Milz hinreicht. Histologisch besteht das
Pankreas aus einem exokrinen und einem endokrinen Teil. Im exokrinen Teil werden
verschiedene Enzyme produziert. Dazu gehören amylolytische, lipolytische, proteolytische
Enzyme, die alle eine Verdauungsfunktion haben. Diese werden über einen ca. 2 mm
9
großen Ausführungsgang, Ductus pancreaticus, sezerniert. Dieser mündet zusammen mit
dem Ductus choledochus über die Papilla Vateri im Duodenum (Welsch, 2006).
Abbildung 1: Schematischer Aufbau des humanen Pankreas mit benachbarten Strukturen
Das Pankreas wird in drei Teile, Caput, Corpus und Schwanz unterteilt (modifiziert nach Steffens, 2013).
Der endokrine Anteil besteht aus den Langerhans-Inseln. Sie machen ca. 1-3 % des
Pankreas aus und kommen hauptsächlich im Cauda-Bereich vor. Die Hauptaufgabe der
Langerhans-Inseln ist die Regulation des Blutglukosespiegels mit Hilfe der Hormone
Insulin und Glukagon.
Die Langerhans-Inseln sind ca. 100-200 µm groß und bestehen aus etwa 2000-3000
endokrin-aktiven unterschiedlichen Zelltypen (vgl. Abb. 2). Es werden dabei vier Typen
unterschieden. Die Glukagon produzierenden α-Zellen, die zu ca. 20 % vorzufinden sind
und eher am Rand angelagert sind. Des Weiteren die Insulin produzierenden β-Zellen, die
ca. 70 % der Insel umfassen, sowie die ca. 10 % δ-zellen, die für die Produktion von
Somatostatin verantwortlich sind. Der vierte Typ sind die γ-Zellen, die das pankreatische
Polypeptid (PP) produzieren, welche nur 1-2 % ausmachen (Weir, et al., 1990, Welsch,
2006).
10
Abbildung 2: Schematische Darstellung einer Langerhans´schen Insel
Die Langerhans´schen Insel setzt sich aus vier Zelltypen zusammen, wobei die Insulin produzierenden β-Zellen die Mehrzahl und den Kern der Insel bilden. Am Rand liegen die Glukagon produzierenden α-Zellen,Somatostatin produzierende δ-Zellen und die Pankreatisches Polypeptid produzierenden γ-Zellen(modifiziert nach Mansouri, 2006).
Insulin und Glukagon sind Gegenspieler innerhalb des Glukosestoffwechsels. Insulin senkt
den Blutglukosespiegel, indem es die Aufnahme und Verwertung von Glukose in Muskel-,
Fett- und Leberzellen steigert. Ebenso beeinflusst es den Aufbau von Proteinen und wirkt
wachstumsfördernd. Glukagon wirkt antagonistisch zum Insulin. Es erhöht den
Blutglukosespiegel durch Förderung des Glykogenabbaus, aber es steigert auch die
Insulinsekretion (Welsch, 2006).
1.3 Bisherige Versuche der non-invasive BZM-Bestimmung in vivo
1.3.1 Anforderung an ein β-Zell-Kontrastmittel
Die β-Zellen sind diffus verteilt und machen nur ca. 1-3 % der Gesamtmasse des Pankreas
aus (Welsch, 2006). Im Verlauf des Diabetes nimmt ihre Masse noch weiter ab. Außerdem
unterscheiden sich die β-Zellen vom exokrinen Gewebe nur wenig anhand der Dichte oder
Echogenität (Schneider, 2008). Daher ist es von immenser Wichtigkeit, dass ein
Kontrastmittel entwickelt wird, das spezifisch genug ist, um die β-Zellen darzustellen. In
einer Arbeit von Sweet et al. (2004b) wurde berechnet, dass ein Kontrastmittel mindestens
eine Spezifität von 100:1 β-Zellen zu nicht-β-Zellen haben muss, um in vivo ein
entsprechendes Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erreichen. In einer weiteren Arbeit
veranschlagten die Autoren das Verhältnis auf 1000:1, damit das Kontrastmittel klinisch
einsetzbar wird (Sweet, et al., 2004a). Für die klinische Einsetzbarkeit wurden in einer
Übersichtsarbeit von Schneider (2008) weitere Eigenschaften definiert. Das Kontrastmittel
11
muss eine hohe Bindungsaffinität vorweisen, die gekoppelt ist mit vielen Bindungsstellen
pro Zelle. Zusätzlich ist es wichtig, dass eine schnelle Elimination aus dem Gefäßsystem,
alternativ sogar eine Internalisierung von der β-Zelle erreicht werden kann. Als weitere
Ziele wurden beschrieben, dass das Kontrastmittel proportional zur BZM bindet und es
keine Toxizität besitzt.
1.3.2 Evaluierte β-Zell-spezifische Kontrastmittel
Bis jetzt gab es schon viele Versuche ein spezifisches Kontrastmittel zu entwickeln, doch
bis jetzt konnte keins die oben genannten Bedingungen erfüllen (Malaisse, 2001, Moore, et
al., 2001, Schirrmacher, et al., 2002, Schneider, 2008, Sweet, et al., 2004aa, Sweet, et al.,
2004bb, Wangler, et al., 2004a, Wangler, et al., 2004b). Am vielversprechendsten war ein
PET-Kontrastmittel [11C]DTBZ (Dihydroterabenazin), das den Vesicular Monoamin
Transporter 2 (VMAT2) auf den β-Zellen erkannte (Simpson, et al., 2006, Souza, et al.,
2006). Leider haben danach veröffentlichte Daten gezeigt, dass DTBZ kein geeignetes
Kontrastmittel ist, um die menschliche BZM zu bestimmen. Es konnte kein Unterschied
bei der Aufnahme vom [11C]DTBZ in das Pankreas von Typ-1-Diabetikern und gesunden
Kontrollen festgestellt werden (Liu, et al., 2007). Da nur wenig über die
Oberflächenstrukturen der β-Zellen bekannt ist, gestaltet sich die Entwicklung von neuen
spezifischen Kontrastmitteln schwierig. Mittels der Phage-Display-Technologie soll diese
Problematik umgangen werden.
1.4 Phage-Display-Technologie
Eine weit verbreitete Technik, um Polypeptid-Binder gegen Target-Zellen zu selektieren,
auch ohne spezielle Kenntnisse der Oberflächenstrukturen, ist die Phage-Display-
Technologie. Damit ist es möglich, diese unbekannten Polypeptide zu identifizieren und
dann im Weiteren zu charakterisieren (Amstutz, et al., 2001, de Wildt, et al., 2000). In der
Phage-Display-Technologie werden am häufigsten filamentöse Phagen als Vektoren
genutzt. Dafür werden DNA-Sequenzen für verschiedene Proteine in den Phagen kloniert,
damit sie mit einem Phagen eigenen Oberflächenprotein fusionieren und exprimiert
werden (O'Brien and Aitken, 2002). Nach Selektions- und Amplifikationsrunden kann auf
Grund der Phenotyp-Genotyp-Kopplung die DNA-Sequenz aus Bakterien ermittelt werden.
12
1990 wurde erstmals durch McCafferty gezeigt, dass durch die Fusion von variablen
Antikörper-Genen mit dem Phagen-Hüllprotein-Gen diese Antikörper auf der Oberfläche
der filamentösen Phagen exprimiert wurden (McCafferty, et al., 1990). Aber auch andere
Proteine wie Enzyme können auf Phagen exprimiert werden. Dafür wird dann
entsprechend die Gensequenz vom Enzym mit dem Hüllprotein fusioniert (O'Brien and
Aitken, 2002).
Durch die Entwicklung des Phagmid-Vektors ist die Selektion von rekombinanten
Proteinen erst möglich geworden. Dieser Vektor erlaubt es, dass Plasmid- und Phagen-
Merkmale kombiniert werden. Dieses aus beiden Teilen bestehende Phagmid enthält zwei
Replikationsursprünge, jeweils eins vom Bakterium und eins vom Phagen, ein Phagen-
Verpackungssignal und für die Selektion notwendige Antibiotika Resistenzen. Alle
anderen Phagen-Gene fehlen dem Phagmid. Daher ist es zur Vermehrung auf
Helferphagen angewiesen (z.B. M13-Phagen). Bei der Replikation wird aber nur das
Phagmid vermehrt (Hoogenboom, et al., 1991).
1.4.1 M13-Phagen
M13-Phagen sind E.coli spezifische filamentöse Bakteriophagen und gehören zu den Ff-
Phagen (F-Pili, filamentös). Sie sind ca. 10 µm lang und ihr Durchmesser ist ca. 7 nm.
Diese Phagen bestehen aus einer zirkulären Einzelstrang-DNA, die von einer Proteinhülle
umgeben ist, die einen flexiblen Protein-Zylinder bilden (vgl. Abb. 3). Der Zylinder
besteht aus ungefähr 2800 identischen Molekülen (gp8). An den jeweiligen Enden bilden
ca. je 5 Moleküle die Kappen des Zylinders. Auf der einen Seite bilden gp7 und gp9 und
auf der Anderen gp3 und gp6 die Kappe (Ploss and Kuhn, 2010, Sachdev S, 2001, Stopar,
et al., 2003).
13
Abbildung 3: Schematische Darstellung eines M13-Bakteriophagen
Dargestellt sind die verschiedenen Hüllproteine und die zirkuläre, einzelsträngige DNA des M13 Phagen(modifiziert nach Ploss and Kuhn, 2010).
M13 Phagen können sich nur in E.coli vermehren, da der für die Infektion erforderliche F-
Pilus nur bei diesen Bakterien vorhanden ist. Eine weitere Besonderheit ist, dass die M13-
Phagen nicht zur Lyse der Wirtszelle führen. Das bedeutet, dass einmal infizierte Zellen
konstant neue Virionen produzieren (Marvin and Hohn, 1969, Russel, 1991).
1.5 Antikörper
Antikörper, international auch Immunglobuline genannt, gehören der Klasse der Globine
an. Sie bestehen aus zwei Peptidketten, einerseits aus der schweren Kette (H für heavy)
und andererseits aus der leichten Kette (L für light). Die schwere Kette ist ca. 50 kDa und
die leichte ca. 25 kDa groß. Die Antikörper bestehen aus jeweils zwei identischen leichten
und zwei schweren Ketten. Diese Ketten sind über Disulfidbrücken miteinander verbunden.
Jeweils eine leichte und eine schwere Kette bilden eine Antigen-Bindungs-Domäne. Dieser
Aufbau verleiht dem Antikörper eine Y-förmige Struktur (vgl. Abb. 4).
14
Abbildung 4: Schematische Darstellung eines Antikörpers
a) IgG Antikörper mit CDRs (complimentary determining regions),Fab-Fragment(variabler Teil), Fc-Fragment(kristaliner Teil), VH (variable schwere Kette) und VL(variable leichte Kette). b-e) verschiedenemolekularbiologisch herstellbare Antikörperformate (modifiziert nach Barbas, et al., 2001).
15
Nun kann der Antikörper in verschiedene Fragmente aufgeteilt werden. Der Fc-Teil (F=
Fragment, c= crystaline) besteht aus den carboxyterminalen Abschnitten beider schweren
Ketten. Der Fab-Teil (ab= antigenbinding) besteht entsprechend aus dem aminoterminalen
Abschnitt der schweren Ketten und zusätzlich der kompletten leichten Ketten. Jedes Fab
hat eine Antigenbindungstelle. Diese Stellen sind besonders Variabel und stehen
schleifenförmig aus der Struktur heraus und werden complimentary determining regions
(CDR) genannt (Janeway, et al., 2012).
Der Antikörper kann durch verschiede Enzyme in seine Bestandteile gespalten werden.
Durch molekularbiologische Methoden können vollständige IgGs oder Fragmente davon
künstlich hergestellt werden. Dazu gehören Fab2-Fragmente, Fab-Fragmente, Fv-Fragmente
(Fragment Variabel) und die Single-chain-Antibody (SCA) Fragmente (vgl. Abb. 4). Bei
den SCA handelt sich ausschließlich um die variablen Bereiche der schweren (VH) und
leichten Kette (VL), die durch einen synthetischen Abstandshalter verbunden sind. Der
große Vorteil von SCA-Fragmenten in einer Bibliothek beruht auf ihrer geringen Größe.
Durch die geringe Größe sind sie genetisch stabiler und somit leichter in Bakterien zu
exprimieren. Dennoch besteht die Gefahr, dass sich Dimere bilden. Durch Vergrößerung
des Abstandshalters kann die Bildung von Dimeren reduziert werden (Holliger, et al., 1993,
Janeway, et al., 2012).
1.5.1 Antikörper Phage-Display
Beim Antikörper Phage-Display werden Antikörperfragment-Bibliotheken verwendet. Die
Fab oder SCA-Fragmente werden auf der Oberfläche von den Phagen exprimiert (Griffiths,
et al., 1994, Hoogenboom and Winter, 1992, Nissim, et al., 1994). In dieser Arbeit wurde
eine humane SCA- Bibliothek (von Tomlinsen) verwendet, um mit Hilfe der Phage-
Display-Technologie ein β-Zell-spezifischen SCA-Fragment zu finden. Dazu wurden die
SCA-Fragmente in M13-Phagen kodiert.
16
1.6 Humane SCA-Bibliothek I (Tomlinsen)
Die verwendete Bibliothek stammt von Tomlinsen und besteht aus 1,47 x 108
verschiedenen Klonen von humanen SCA-Fragmenten, die auf der Oberfläche von M13-
Phagen exprimiert werden. Die SCA wurden in einen Ampicillin resistenten Phagmid-
Vektor pIT2 kloniert, der zusätzlich ein Myc-Tag und His-Tag besitzt (siehe Abb.5)
Die Artenvielfalt der Bibliothek basiert hauptsächlich auf den variierten Bereichen der
schweren und leichten Ketten: H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97,
H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 and L96
(http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf)
Abbildung 5: Vektorkarte von pIT2
Das klonierte SCA-Gen liegt zwischen den Schnittstellen NcoI und NotI. Es wird von einer SignalsequenzpelB und einem Myc-Tag flankiert. Ein lacZ Promotor (lac promotor) und eine Ribosomen Bindestelle (RBS)sind vorgeschaltet. Ein amber-Stopcodon trennt das Myc-tag vom gp3 Phagenhüllprotein-Gen. Zusätzlichsind Replikationsursprüunge für E.coli (coliE1 ori) und M13-Phagen (M13 ori) vorhanden sowie eineAmpicillinresistenz (amp)(modifiziert nach http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
1.6.1 Selektionsverfahren
Über die Jahre wurden verschiedene Selektionsmethoden entwickelt. Zunächst wurden die
Bibliotheken mit Antigen beschichteten Immuno-Röhrchen selektiert (Hoogenboom and
Winter, 1992, Marks, et al., 1991, McCafferty, et al., 1990, Nissim, et al., 1994, Winter, et
al., 1994). Später wurden weitere Selektionsmethoden entwickelt. Eine beruht auf dem
17
Panning der Bibliothek in vitro an Zelllinien, eine andere auf intravenöse Injektion in ein
Lebewesen in vivo (de Kruif, et al., 1995, Siegel, et al., 1997). Es werden immer mehrere
Selektionsrunden gefahren, um eine höhere Spezifität zu erlangen. Dafür werden nach
jeder Runde alle nicht bindenden Phagen entnommen und die, die an dem gewünschten
Molekül oder Zelle binden, werden wieder amplifiziert und dann einer weiteren
Selektionsrunde zugeführt. Normalerweise sind fünf Selektionsrunden nötig, um eine
entsprechend hohe Spezifität zu erhalten. Nach der Selektion werden die gefundenen
Phagenklone per Sequenzanalyse ausgewertet.
Abbildung 6: Schematische Darstellung des Phage-Display Screenings
Schematische Darstellung des Screenings für die in dieser Arbeit untersuchten Phagenklone.Die Phagen-Bibliothek wird in vivo dem Versuchstier (Ratte) injiziert, anschließend werden die gebundenPhagen isoliert und amplifiziert. Diese Selektionsrunde wird fünf-mal wiederholt und anschließendsequenziert und analysiert (modifiziert nach O'Brien and Aitken, 2002).
1.7 Bestimmung der CDR (Kabat, et al., 1991)
Die beiden Ketten der Antikörper haben einen konstanten Fc-Teil und einen variablen Fab-
Teil. Der variable Teil (VH und VL) weisen drei Bereiche auf, die die besonders hohe
Variabilität bedingen. Kabat schrieb 1970, dass diese hypervariablen Bereiche die Stellen
sind, die die Antigene binden. Des Weiteren wird die Spezifität der Antikörper durch die
Aminosäurereste an diesen Stellen, auch CDR genannt, bestimmt. Für die Bestimmung der
CDRs nach Kabat et al. (1991) gelten folgende Regeln:
Die CDR-L1 beginnt nach 24. Aminosäure. Sie ist 11-17 Aminosäuren lang.
Die CDR-L2 ist 7 Aminosäuren lang und beginnt 15 Aminosäuren nach der CDR-L1.
18
Die CDR-L3 ist 9-15 Aminosäuren lang und fängt 31 Aminosäuren nach Ende der CDR-
L2 an.
Die CDR-H1 startet nach ca. 30 Aminosäuren und ist 5-7 Aminosäuren lang.
Die CDR-H2 fängt 14 Aminosäuren nach dem Ende von CDR-H1 an, sie ist 16-19
Aminosäuren lang.
Die CDR H3 beginnt 29-32 Aminosäuren nach dem Ende von CDR-H2 und ist 8-19
Aminosäuren lang.
19
2. Zielsetzung
Im Rahmen dieser Arbeit soll ein β-Zell-spezifisches Kontrastmittel entwickelt werden.
Hierfür wurde sich der SCA-Technologie zugewendet. Da aber über die
Oberflächenstruktur der β-Zellen wenig bekannt ist, wird die Phage-Display-Technologie
verwendet, um die SCAs zu entwickeln. Im Weiteren sollen die entwickelten SCAs näher
charakterisiert werden:
1. In vitro Evaluation der SCA auf Spezifität (endokrin vs. exokrin), Bindungsaffinität und
Bindungsstelle.
2. In vivo Evaluation der SCA auf Spezifität (endokrin vs. exokrin) und Affinität zu extra-
pankreatischen Organen.
20
3. Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Chemikalien
Aceton Roth (Karlsruhe, Deutschland)
Agar ApliChem (Darmstadt, Deutschland)
Albumin (Fraktion V) ApliChem (Darmstadt, Deutschland)
Chloramin-T Trihydrat ACROS (Geel, Belgien)
Chloroform Roth (Karlsruhe, Deutschland)
Coomassie® Brilliantblau R-250 ApliChem (Darmstadt, Deutschland)
DAPI (4’,6-diamdino-2-phenylindole,
dihydrochloride) ApliChem (Darmstadt, Deutschland)
Dimethylsulfoxid (DMSO) ApliChem (Darmstadt, Deutschland)
Essigsäure Sigma (München, Deutschland)
Ethidiumbromid Lösung Sigma (München, Deutschland)
D(+)-Glukose wasserfrei ApliChem (Darmstadt, Deutschland)
Glycerin 87% ApliChem (Darmstadt, Deutschland)
Hefeextrakt ApliChem (Darmstadt, Deutschland)
Imidazol ApliChem (Darmstadt, Deutschland)
Isopopyl β-D-thiogalactopyranosid(IPTG) ApliChem (Darmstadt, Deutschland)
Methanol Roth (Karlsruhe, Deutschland)
Natriumchlorid ApliChem (Darmstadt, Deutschland)
Natriummetabisulfit Lancaster (Morecambe, England)
Nickel(II)-chlorid-Hexahydrat ApliChem (Darmstadt, Deutschland)
PBS(1x) PAA (Pasching, Österreich)
Phenylmethylsulfonylfluorid(PMSF) ApliChem (Darmstadt, Deutschland)
Polyethylenglycol 6000 (PEG) ApliChem (Darmstadt, Deutschland)
Roti®-Load 1 Roth (Karlsruhe, Deutschland)
Trypton ApliChem (Darmstadt, Deutschland)
Xylol Roth (Karlsruhe, Deutschland)
21
Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat
(mono-basisch) NaH2PO4 ApliChem (Darmstadt, Deutschland)
di-Natriumhydrogenphosphat
(di-basisch) Na2HPO4 ApliChem (Darmstadt, Deutschland)
Alle hier nicht genannten Chemikalien wurden von den Firmen ApliChem (Darmstadt,
Deutschland), Sigma (Münschen, Deutschland) und Roth (Karlsruhe, Deutschland)
bezogen.
3.1.2 Antibiotika
Ampicillin (ApliChem; Darmstadt, Deutschland)
Stammlösung: 100 mg/ml
Gebrauchslösung: 100 µg/ml
Kanamycin (Sigma; Münschen, Deutschland)
Stammlösung: 30 mg/ml
Gebrauchslösung: 50 µg/ml
Penicillin/Streptomycin (PAA; Paschingen, Österreich)
Stammlösung: 100x
Gebrauchslösung 1x
3.1.3 Zellkultur-Medien und Zusätze
Die in der Arbeit verwendeten Medien und Zusätze wie FCS, L-Glutamin 200 mM (100x),
MEM Vitamine, PBS, essentielle Aminosäuren und Trypsin EDTA wurden von der Firma
PAA (Paschingen, Österreich) bezogen.
22
3.1.4 Verbrauchsmaterialien
Die in der Arbeit verwendeten Plastikwaren wie Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße und
Zellkulturflaschen wurden von der Firma Peske (Aindling-Arnhofen, Deutschland)
bezogen.
3.1.5 Bakterien
E.coli TG1
K12.(lac-proAB) supE thi hsdD5/F’ traD36proA+B lacIq lacZ .M15
E.coli HB2151
K12 ara .(lac-proAB) thi/F’ proA+B lacIq lacZ .M15
3.1.6 Zelllinien
INS-1 (Hr. C.B. Wollheim; Genf, Schweiz)
AR42J (ATCC; Manassas, USA)
Beta-TC-6 (ATCC; Manassas, USA)
3.1.7 Antikörper
Anti-Myc (monoklonal Maus; Cell Signaling/New England Biolab, Frankfurt, Deutschland)
Anti-Insulin (polyklonal Meerschweinchen; Dako, Golstrup, Dänemark)
Anti-Glukagon (monoklonal Maus; Affinity BioReagents, Golden, USA)
Biotinylierter anti-Maus IgG (Linearis, Wertheim, Deutschland)
Cy™3-konjugierter Ziege-anti-Meerschweinchen (Jackson Immunoresearch Laberatories,
Suffolk, UK)
Cy™2-konjugiertes Streptavidin (Jackson Immunoresearch Laberatories, Suffolk, UK)
DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) (Invitrogen; Karslruhe,
Deutschland)
23
3.1.8 Oligonukleotide
Die Synthese der verwendeten Oligonukleotide (Primer) wurde bei der Firma Metabion
(Martinsried, Deutschland) in Auftrag gegeben.
Für die Tomlinson Bibliothek I wurde mit folgenden Primern gearbeitet:
PCR (Polymerase Ketten-Reaktion)-Primer für die Selektion:
pHEN seq CTA TGC GGC CCC ATT CA
LMB3 CAG GAA ACA GCT ATG AC
Sequenzierprimer:
pHEN seq CTA TGC GGC CCC ATT CA
3.1.9 Reagenzsysteme
GenElute™ Agarose Spin Column (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)
Pierce®BCA™ Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, Rockford, USA)
Pierce®ECL Western Blotting Substrate (Pierce Biotechnology, Rockford, USA)
ProPur™ IMAC (Nunc/Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland)
QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland)
QIAprep® Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland)
Slide-A-Lyzer® Dialyse Cassette 10,000 MWCO (Pierce Biotechnology, Rockford, USA)
3.1.10 Größenstandard und Enzyme
Die in dieser Arbeit verwendete 1 kb DNA-Marker bzw. Protein-Marker (Page-ruler)
wurden von der Firma Fermentas (St. Leon Rot, Deutschland) und die taq-Polymerase von
Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) bezogen.
3.1.11 Radioaktivität
125Iod (Hartmann Analytic, Braunschweig, Deutschland)
24
3.1.12 Medien und Lösungen für Arbeiten mit der Tomlinson-Bibliothek
Zum Ansetzen aller Medien und Lösungen wurde, soweit nicht anders angegeben,
demineralisiertes Wasser aus der Reinstwasseranlage Milli-Q Plus der Firma Millipore
verwendet. Danach wurden sie autoklaviert und, wenn nicht anders angegeben, bei
Raumtemperatur gelagert.
H-Top Agar 16 g/l Tryptone
10 g/l Hefeextrakt
5 g/l NaCl
7 g/l Bacto-Agar
PEG/NaCl 20 % PEG
2,5 M NaCl
Trypsin 50 mM Tris HCl, pH 7,4
1 mM CaCl2
bei -20°C lagern
TY(2x) 16 g/l Tryptone
10 g/l Hefeextrakt
5 g/l NaCl
2x TY (1%Glukose) 16 g/l Tryptone
10 g/l Hefeextrakt
5 g/l NaCl
1 % Glukose
2xTY (0,1% Glukose) 16 g/l Tryptone
10 g/l Hefeextrakt
5 g/l NaCl
0,1 % Glukose
25
TYE 10 g/l Tryptone
5 g/l Hefeextrakt
8 g/l NaCl
15 g/l Bacto-Agar
TYE (1% Glukose) 10 g/l Tryptone
5 g/l Hefeextrakt
8 g/l NaCl
15 g/l Bacto-Agar
1 % Glukose
3.1.13 Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese
TAE 50x 242 g/l Tris-Base
57,1 ml/l Eisessig
3.1.14 Puffer für die Histologie
Antigen Unmasking Solution (Vector Laboratories, Burlinghame, USA)
Aurion BSA-c (Aurion, Wageningen, Niederlande)
Fluorescent Mounting Medium (Dako, Golstrup, Dänemark)
3.1.15 Puffer und Lösungen für den Westernblot
Zum Ansetzen aller Medien und Lösungen wurde, soweit nicht anders angegeben,
demineralisiertes Wasser aus der Reinstwasseranlage Milli-Q Plus der Firma Millipore
verwendet.
Annonden-Puffer (10x); pH 8,9 242,2 g/l Tris-Base
26
Coomassie 1 Gramm Comassie Blau
450 ml Methanol
450 ml A. Dest.
100 ml Eisessig
Entfärber 100 ml Methanol
100 ml Eisessig
800 ml A.dest. (Aqua destillatum)
Kathoden-Puffer 10 g/l SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)
121,1 g/l Tris-Base
179,2 g/l Tricin
NTBPF 4,45 g/l NaCl
6,1 g/l Na Pyrophosphat
4,2 g/l NaF
1 g/l Na-Methylhydroxybenzoat
PBS-T PBS
0,1 % Tween 20
Transfer-Puffer (10x) 58 g/l Tris-Base
29,3 g/l Glycine
4,0 g/l SDS
3.1.16 Geräte
Analysewaage BL600 (Sartotius)
Biophotometer (Eppendorf)
Blot-Gel-Kammer (Hoefer Scientific Instruments)
CASY 1 cell counter (Innovatis)
CO2 Inkubator (Heraeus)
Dampfsterilisator Varioklav (Thermo Scientific)
Einbettautomat Reichert Lynx (Leica)
27
Eismaschine (Ziegra)
Elektrophorese Power Supply B6 (Biometra)
Feinwaage RC210D (Sartorius)
Gelelektrophoresekammer (EASY-CAST™)
Magnetrührer (IKA®Works, Inc)
Mastercycler Gradient (Eppendorf)
Mikroskope
ZEISS Axioplan Mikroskop (Zeiss)
ZEISS Axiovert 25 (Zeiss)
ZEISS LSM 510 Laser Module, Axiovert 100M (Zeiss)
Minishaker (IKA®Works, Inc.)
Pipettierhilfe Pipetus® (Hirschmann)
Reinstwasseraufbereitungssystem MilliQ Plus (Millipore)
Schüttelapparat/Inkubator 1000 (Heidolph)
Sterilbank (Heraeus)
Thermocycler (Labtech)
Wasserbad (Köttermann)
Westernblot-Apparatur Semi Phor™ (Hoefer Scientific Instruments)
Gamma-Zähler (Packard Instrument Company)
Zentrifugen
Biofuge (Heraus)
GR2022 (Jouan)
Alle hier nicht aufgeführten Geräte entsprechen dem allgemeinen Laborstandard.
28
3.2 Methoden
3.2.1 Zellkultur
3.2.1.1 Kultivierung von eukaryonten Zellen
Die Zelllinien werden bei 37°C und 5 % CO2-Gehalt im Brutschrank kultiviert. Die INS-1-
Linie wird in RPMI-Kulturmedium (Roswell Park Memorial Institute) und die AR42J- und
TC6-Linie in DMEM-Kulturmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium) mit
entsprechenden Zusätzen kultiviert (vgl. Tabelle 1).
Tabelle 1: Zusammensetzung der Zellkulturmedien
Zusätze DMEM high glucose RPMI
Fetal Calf Serum AR42J 10% / TC615% 10%
Penecillin/Streptomycin √ √
MEM-Vitamine √ √
3.2.1.2 Kryokonservierung
Wenn die Zelllinien länger gelagert werden sollen, können sie im flüssigen Stickstoff
aufbewahrt werden. Hierzu werden die in einer Zellkulturflasche gezüchteten Zellen mit
3 ml Trypsin EDTA abtrypsiniert, in 10 ml Medium aufgenommen und für 5 min bei 1300
g zentrifugiert. Das Pellet wird in 10 % DMSO-haltigem Medium resuspendiert und dann
in flüssigem Stickstoff eingefroren.
3.2.1.3 Auftauen von eukaryonten Zellen
Die tiefgefrorenen Zellen werden für 30-60 Sekunden im Wasserbad bei 37°C aufgetaut
und im entsprechenden Kulturmedium aufgenommen. Um das Zelltoxische DMSO zu
entfernen, werden die Zellen kurz abzentrifugiert und in frischem Kulturmedium
resuspendiert, um sie dann in eine neue Zellkulturflasche anzuziehen.
29
3.2.1.4 Passagieren von Zellen
Alle 2-5 Tage müssen die Zellen bei einer Konfluenz von ca. 80 % passagiert werden.
Dazu wird das Kulturmedium aus der Kulturflasche genommen, die Zellen mit PBS
gespült und mit 3 ml Trypsin EDTA abtrypsiniert. Dann werden die Zellen in 10 ml
Kulturmedium aufgenommen und abzentrifugiert. Das Pellet wird in 10 ml Medium
resuspendiert und 1 ml davon wird in eine neue Kulturflasche gegeben und mit 25 ml
Medium aufgefüllt. Wenn die Zellen für Experimente geerntet werden, wird das Pellet in
50 ml Kulturmedium über Nacht bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert.
3.2.3 Molekularbiologischen Methoden
3.2.3.1 Analytische Plasmidisolierung
Die analytische Plasmidisolierung wurde mit dem QIAprep®Spin Miniprep-Kit von
Qiagen durchgeführt. Dafür wird eine unter Selektionsdruck angezogene Übernachtkultur
benötigt. Die folgenden Schritte werden nach den Herstellerangaben durchgeführt.
3.2.3.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR, polymerase-chain-reaction)
Bei der PCR handelt es sich um ein Verfahren zum Vervielfältigen eines DNA-Stückes.
Der Bereich der DNA wird mit Hilfe von zwei synthetischen Oligonukleotidprimern
bestimmt.
Für die Vervielfältigung der SCA-DNA wurde das folgende PCR-Programm genutzt:
1. Denaturierung 94°C 4:00 min
2. Denaturierung 94°C 0:45 min
3. Annealing 55°C 0:30 min
4. Extending 72°C 2:00 min
30
30 Wiederholungen der Schritte 2.-4.
5. Extending 72°C 4:00 min
Zur Analyse wird eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt (vgl. 3.2.3.3.).
3.2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese
Die vervielfältigten DNA-Stücke werden nun nach ihrer Größe elektrophoretisch
aufgetrennt. Dazu wird 0,7 % Agarose in 1x TAE-Puffer aufgekocht und mit 10 %
Ethidiumbromid versetzt. Die Mischung wird zum Erstarren in eine Gelkammer mit
Kamm für die Probetaschen gegeben. Wenn das Gel erstarrt ist, wird es mit 1x TAE-Puffer
übergossen bis es vollständig bedeckt ist. Zum Auftragen der Proben werden sie mit 20 %
Ladepuffer versetzt. Als Größenstandard dienen 2,5 µl von der 1 kb DNA-Ladder. Die
Phorese wird mit einer Spannung von 90-110 Volt durchgeführt. Danach wird die DNA
mithilfe von UV-Licht (λ=302nm) sichtbar gemacht.
3.2.3.4 DNA-Extraktion nach Agarose-Gelelektrophorese
Zur DNA-Extraktion wird das GenElute™ Agaose-Kit von der Firma Sigma verwendet.
Dafür wird die gesuchte Bande aus dem Gel geschnitten und in ein Eppendorf-
Reaktionsgefäß gegeben. Die restlichen Schritte werden nach Herstellerangaben
durchgeführt.
3.2.3.5 DNA-Aufreinigung und -Konzentrierung
Zum Aufreinigen und Konzentrieren der aus 3.2.3.4 gewonnenen DNA wird das PCR-
Purification Kit von Qiagen verwendet. Es wurde nach Herstellerangaben verfahren. Zum
Eluieren der DNA wurde 30 µl A.dest. verwendet.
31
3.2.3.6 Konzentrationsbestimmung der DNA
Für die Bestimmung der Konzentration der DNA wird eine 1% Lösung aus der
vorhandenen DNA hergestellt und in einer Quarzküvette gegeben. Zum Messen wird die
Absorption der Lösung bei der Wellenlänge von 260 nm gemessen.
Es gilt: OD260 (Optische Dichte)= 50 µg/ml dsDNA
Um die Reinheit zu messen, wird zusätzlich noch mal bei 280 nm gemessen und der
Quotient A260/A280 ausgerechnet. Ist der Quotient zwischen 1,7-2,0, so ist die DNA rein
genug fürs weitere Arbeiten.
3.2.3.7 Sequenzierung
Die Firma GENterprise, in Mainz, hat die Sequenzierung durchgeführt. Die Analyse wurde
mit dem Programm FinchTv gemacht. Der Abgleich der ermittelten Peptidsequenz wurde
mittels BLAST (basic local assigment search tool) vom NCBI (National Center of
Biotechnology Information) durchgeführt.
3.2.4 Insel-spezifischer-Phagenklon (ISPC) Herstellung
Die durch verschiedene Selektionsrunden gefundenen Phagenklone wurden amplifiziert
und sequenziert um sie dann auf ihre Charakteristika zu untersuchen. Dazu wurden bereits
infizierte Bakterienkulturen der entsprechenden Klone verwendet.
3.2.4.1 Herstellung und Titern des M13-Helferphagenstocks
TG1-Bakterien werden in 5 ml 2x TY bei 37°C und 160 U/min (Umdrehung pro Minute)
bis zu einer OD600 von 0,4 inkubiert. Von dieser Bakterienkultur werden je 200 µl mit je
10 µl einer 100x seriellen Verdünnung des vorhanden M13-Helferphagenstocks infiziert
und anschließend in einem 37°C warmen Wasserbad inkubiert. Dieses Gemisch wird nun
mit ca. 42°C warmem H-Top Agar vermischt und auf eine TYE-Agarplatte gegeben.
Sobald der Agar erstarrt ist, werden die Platten über Nacht bei 37°C inkubiert. Nun werden
5 ml frische TG1 Bakterien der OD600 von 0,4 mit einem gepickten Plaque infiziert und für
32
2 h bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Mit dieser Kultur wird nun 500 ml 2xTY in einem
1 L Kolben beimpft und für 1 h bei 37°C und 200 U/min inkubiert. Darauf gibt man
Kanamycin bis zu einer Konzentration von 50 µg/ml hinzu, dann wird der Ansatz über
Nacht bei 37°C und 200 U/min inkubiert.
Die Übernachtkultur wird bei 10.800 g, 4°C für 15 min zentrifugiert. 400 ml des
phagenhaltigen Überstandes werden abgenommen und mit 100 ml PEG/NaCl vermischt,
um sie dann für 1 h auf Eis zu inkubieren. Nach einer weiteren Zentrifugation für 30 min
wird das Pellet in 8 ml PBS resuspendiert und dann mit 2 ml PEG/NaCl gut vermischt.
Nun für 20 min auf Eis stellen und dann für 30 min bei 3.300 g und 4°C zentrifugieren.
Das Pellet wird nun in 5 ml PBS resuspendiert und dann für 10 min bei 11.600 g und 4°C
zentrifugiert. Der phagenhaltige Überstand wird in ein neues Reaktionsgefäß gegeben und
kann nun für bis zu vier Wochen bei 4°C gelagert werden. Sollte er länger gelagert werden,
wird das PBS mit 15% Glycerin versetzt und dann können die Phagen bei -80°C
eingefroren werden.
Zum Titern der Phagen werden 45 µl mit 5 µl Trypsin-Lösung gemischt und im 37°C
warmen Wasserbad für 30 min inkubiert. 1 µl der mit Trypsin behandelten Phagen werden
mit 1 ml PBS versetzt und fünf 100x serielle Verdünnungen in 1 ml PBS angefertigt. Von
jeder Verdünnung werden 50 µl mit 1 ml TG1 Bakterien der OD600 0,4 gemischt. Dieses
Gemisch wird mit 3 ml geschmolzenen ca. 42°C warmen H-Top Agar vermischt und dann
auf eine TYE-Platte gegeben. Nach Erstarren des Agars werden die Platten bei 37°C über
Nacht inkubiert. Genauso wird mit nicht Trypsin behandelten Phagen vorgegangen. Die
mit Trypsin behandelten Phagen sollten einen 105-108 pfu/ml geringeren Titer haben als
die unbehandelten. Insgesamt sollte der Titer der Helferphagen mindestens 1012 pfu/ml
betragen.
3.2.4.2 Amplifizieren und Titern der gewünschten Phagen
Der gewünschte Phagenklon wird von der Agarplatte gepickt und mit 20 ml TY-Medium,
das 100µg/ml Ampicillin und 1% Glukose enthält, beimpft. Nun werden die Bakterien auf
eine OD600 von 0,4 inkubiert bei 37°C und 160 U/min geschwenkt. 10 ml dieser Kultur
werden nun mit 5x1010 Helferphagen versetzt und für 30 min im 37°C warmen Wasserbad
inkubiert. Danach wird die Kultur für 10 min bei 3.000 g und 4°C zentrifugiert. Der
Überstand wird verworfen und das Pellet in 50 ml 2x TY mit 100 µg/ml Ampicillin, 50
33
µg/ml Kanamycin und 0,1 % Glukose resuspendiert und in einem 200 ml
Erlenmeyerkolben bei 30°C und 200 U/min schwenkend über Nacht inkubiert. Nun wird
die Übernachtkultur für 15 min bei 4°C und 3.300 g zentrifugiert. 40 ml des Überstandes
werden mit 10 ml PEG/NaCl vermischt und 1h auf Eis inkubiert. Darauf wird wieder
zentrifugiert für 30 min bei 4°C und 3.300 g. Der Überstand wird verworfen und das Pellet
in 2 ml PBS resuspendiert und dann für 10 min bei 4°C und 11.600 g zentrifugiert. Im
Überstand sind nun die Phagen enthalten und sie können wie die Helferphagen für ca. vier
Wochen bei 4°C gelagert werden. Für eine längere Lagerung bei -80°C wird 15 %
Glycerin beigefügt.
Für die Titerbestimmung werden 1 µl der Phagen in 100 µl PBS aufgenommen und davon
ausgehend fünf 100x serielle Verdünnungen angefertigt. 900 µl TG1-Bakterien der OD600
0,4 werden zu jeder Verdünnung gegeben und dann für 30 min im 37°C warmen
Wasserbad inkubiert. Nun werden jeweils 10 µl der Verdünnungen auf eine TYE-
Agarplatte mit 100 µg/ml Ampicillin und 1 % Glukose ausplattiert und über Nacht bei
37°C inkubiert. Die amplifizierten Phagen sollten 1012-1013 pfu/ml betragen.
3.2.5 Proteinbiochemische Methoden
3.2.5.1 Herstellung von löslichen Antikörperfragmenten (SCA)
Für die Herstellung werden 200 µl der exponentiell wachsenden HB2151 Bakterien der
OD600 0,4 benötigt. Sie werden mit 10 µl der Phagen infiziert und dann für 30 min im
37°C warmen Wasserbad inkubiert. Es werden je 50 µl einer Verdünnungsreihe der
infizierten Bakterien auf eine TYE-Agarplatte mit 100 µg/ml Ampicillin und 1 % Glukose
ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. 10 ml TY mit 1 % Glukose und 100 µg/ml
Ampicillin werden mit einer Bakterienkolonie angeimpft und über Nacht bei 37°C und 200
U/min schwenkend inkubiert. 2 l TY-Medium, welches 100 µg/ml Ampicillin und 0,1 %
Glukose enthält, werden mit den Bakterien beimpft und bis zu einer OD600 von 0,6 bei
37°C und 200 U/min schwenkend inkubiert. Nun wird zur Induzierung der
Proteinproduktion 1 mM IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalacropyranosid) hinzugegeben und
dann für weitere 4 h bei 30°C und 200 U/min schwenkend weiter inkubiert. Danach
werden die Bakterien mittels Zentrifugation mit 6.000 g 15 min bei 4°C sedimentiert. Der
34
Überstand wird verworfen und das Pellet zur weiteren Präparation und Aufreinigung der
SCA verwendet.
3.2.5.2 Präparation und Aufreinigung von SCA aus Bakterien
Das Bakterienpellet das unter 3.2.5.1 hergestellt wurde, wird mit 5 ml PBS incl. 1 mM
PMSF resuspendiert und 1 h auf Eis inkubiert. Alle 5 min wird die Suspension für ca. 20 s
gevortext. Anschließend wird die Suspension für 1 h bei 11.600 g und 4°C zentrifugiert
und der Überstand einmal mit 0,45 µm und danach mit 0,22 µm Filtern filtriert.
Zur Aufreinigung nutzt man die sechs Histidinreste des SCA am N-Terminus. Damit
lassen sie sich über eine immobilisierte Metallionen Affinitätschromatographie (IMAC)
aufreinigen. Dabei bilden die Histidin-Reste Komplexe mit den Ni2+ Ionen. Die
Komplexbildung kann später mit einem Überschuss an Imidazol aufgelöst werden.
Die mit Nickel beladenen Säulchen werden mit PBS equilibriert bevor die SCA-
Suspension auf das Säulchen gegeben wird. Nachdem die SCA nun gebunden haben wird
sechsmal mit PBS gewaschen, um die ungebundenen Proteine zu entfernen. Um die SCA
zu eluieren, wird 80 mM Imidazol verwendet. Die aufgereinigten SCA werden daraufhin
über Nacht in PBS bei 4°C dialysiert und danach lyophilisiert. Für die Proteinbestimmung
nach Bradford (vgl. 3.2.5.3) werden die SCA rehydriert. Um die Reinheit der SCA zu
bestimmen, werden ein SDS-Gel mit anschließender Coomassie-Färbung(vgl. 3.2.5.4.1)
und ein Westernblot(vgl. 3.2.5.4.2) durchgeführt.
Die aufgereinigten und lyophilisierten SCA wurden bei 4°C bis zu vier Monaten und in
A.dest. rehydrierte bei 4°C bis zu vier Wochen gelagert.
3.2.5.3 Proteinbestimmung nach Bradford
Für die Bestimmung der Proteinkonzentration der aufgereinigten, dialysierten und
konzentrierten SCA nach Bradford (Bradford, 1976) wird das BCA Assay von Pierce
benutzt. Diese Bestimmungsart basiert auf der Verschiebung des Absorbtionsspektrum von
Coomassie Blau von 465 nm nach 595 nm bei Bindung an Proteine. Es wurde nach
Herstellerangaben verfahren. Die Extinktion wurde bei 595 nm gegen den Leerwert (PBS)
gemessen. Als Eichkurve diente Rinderalbumin in PBS verdünnt.
35
3.2.5.4 Denaturierende SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Die aufgereinigten und lyophilisierten SCA werden in einem 12 %igem SDS-Gel
elektrophoretisch aufgetragen, um die Reinheit zu prüfen. Das Trenngel wird nach Tabelle
2 in einem Becherglas angesetzt. Nach Zugabe des APS wird die Lösung schnell zwischen
die Glasplatten gegossen, damit sie auspolymerisieren kann. Danach wird das Sammelgel
hergestellt und ebenfalls nach Zugabe des APS auf das Trenngel zwischen die Glasplatten
gegeben. Bevor das Sammelgel auspolymerisiert ist, wird ein Kamm zum Auftragen der
Proben eingehängt. Sobald das komplette Gel auspolymerisiert ist, wird die Kammer in die
Elektrophorese-Apparatur eingespannt und der Kamm entfernt, um die Proben auftragen
zu können. Dafür werden 40 µl einer Probe mit 20 µl Roti® Load 1 vermischt und das
Gemisch für sieben Minuten und 30 Sekunden auf 99°C erhitzt. Nun kann die aufgekochte
Probe zusammen mit dem Protein-Molekulargewichtsmarker auf das Gel gegeben werden.
Die Elektrophorese wird für 2-3 h bei einer Spannung von 50 Volt ausgeführt.
Tabelle 2: Zusammensetzung von Sammel- und Trenn-Gel
Zusatz Sammel-Gel 12% Trenn-Gel
A.dest 6,25 ml 5,3 ml
Gel-Puffer
(ohne Glycerol) 2,5 ml 6,7 ml
30% Acrylamide 1,25 ml 8 ml
Phenol rot 2 Tropfen 1 Tropfen
TEMED 40 µl 50 µl
10% APS 60µl 70 µl
3.2.5.4.1 SCA-Aufreinigungsnachweis mittels Coomassie-Brilliantblau Färbung
Nach der Elektrophorese wird das Gel 2 h in Coomassie-Brilliantblau-Färbelösung gefärbt
und anschließend über Nacht im Entfärber entfärbt. Am nächsten Morgen kann das Gel
ausgewertet und gescannt werden.
36
3.2.5.4.2 Westernblot
Zum Nachweis, dass sich es bei der Bande des Gels auch um den gesuchten SCA handelt,
wurde ein Westernblot durchgeführt. Das Gel wird nach der Elektrophorese (vgl. 3.2.5.4)
erstmal 1 h im Transferpuffer equilibriert. Danach werden vier Whatmann-Filterpapiere
auf die Größe des Gels zugeschnitten und zusammen mit einer Nitrocellulosemembran mit
dem Transferpuffer getränkt. Nun wird der Blot wie folgt luftblasenfrei zusammengebaut.
Auf die Kathode der Blot-Apparatur werden zwei Whatmann-Filterpapier gelegt, darauf
kommen das SDS-Gel, die Nitrocellulosemembran und oben wieder 2 Whatmann-
Filterpapiere. Die Annode verschließt den Blot oben. Das Blotting findet bei 10 Volt für 5
h statt. Die Membran wird nach dem Blotting in A.dest. gespült und dann 1 h in NTBPF
geblockt. Der erste Antikörper anti-myc wird im Verhältnis 1:200 mit NTBPF verdünnt
und die Nitrocellulosemembran wird damit über Nacht bei 4°C schwenkend inkubiert.
Nach einmaligem Spülen mit A.dest. werden drei weitere Male mit PBS-T gespült.
Anschließend wird der zweite Antikörper anti-Maus, der 1:20 mit NTBPF verdünnt ist, für
1 h bei Raumtemperatur mit der Membran inkubiert. Nun wird die Membran dreimal mit
PBS-T gespült und danach das Pierce®ECL Western Blotting Substrate nach
Herstellerangaben auf die Membran gegeben und der Blot ausgewertet.
3.2.6 Charakterisierung der ISPC und SCA
3.2.6.1 Zellbasierter Bindungsassay
Die BRASIL-Methode (Biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands) von
Giordano et al. (2001) wird genutzt, um die Bindungsaffinität der ISPC zu evaluieren.
Hierfür werden INS-1- und AR42J-Zellen 12 h vor dem Versuch mit Tryspin/EDTA
abtrypsiniert, in entsprechendem Kulturmedium aufgenommen und 5 min bei 1.300 g
abzentrifugiert. Das Pellet wird im entsprechenden Kulturmedium resuspendiert und in ein
50 ml Rektionsgefäß überführt, damit es nicht anwächst. Nun werden die Zellen bei 37°C
und 5 % CO2 kultiviert. Von den Zelllinien werden für den Versuch je 106 Zellen mit 109
pfu/ml des ISPC für 4 h auf Eis unter leichtem Schwenken inkubiert. Die Phagen-Zell-
Suspension wird auf eine organische Phase gegeben. Sie besteht aus n-dodecan und
bromododecan im Verhältnis 1:90,8 (d=1,017 g/ml). Nun wird für 10 s bei 12.000 g
zentrifugiert und danach in flüssigen Stickstoff eingefroren. Das Zellpellet mit den
37
gebunden Phagen wird abgeschnitten und in 1 ml TG1-Bakterien der OD600 0,4
amplifiziert. Dieses Gemisch wird auf 100 µg/ml Ampicillin und 1 % Glukose enthaltende
TYE-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
3.2.6.2 Immunhistochemische Färbungen an Paraffin-Schnitten
Für die paraffinierten Gewebeschnitte wurden einer Ratte 100 µg SCA oder ISPC
intravenös injiziert. Nach 2 h wurde das Tier getötet und die Organe (Pankreas, Leber, etc.)
für die Schnitte entnommen. Die Tierversuche wurden von der Betreuerin mit meiner
Assistenz durchgeführt. Diese Gewebeschnitte werden über Nacht bei 37°C inkubiert. Nun
werden die Gewebeschnitte mit einer absteigenden Alkoholreihe entparaffiniert. Dazu
wird zuerst zweimal 10 min in Xylol inkubiert. Danach jeweils einmal 5 min in 100 %
EtOH, 96 % EtOH, 80 % EtOH, 70 % EtOH und zum Schluss noch mal 5 min mit A.dest.
inkubieren. Anschließend werden die Schnitte für 10 min in Antigen Unmasking Solution
aufgekocht. Nachdem die Schnitte 45 min bei Raumtemperatur abgekühlt sind, werden sie
in A.dest. und PBS gespült. Um unspezifische Bindungen zu blockieren, wird darauf 2 h
bei Raumtemperatur mit 2 % BSA in PBS inkubiert. Die Antikörper werden in PBS mit
2 % BSA verdünnt.
Die Gewebeschnitte werden mit dem Primärantikörper anti-myc (1:200) bei 4°C über
Nacht in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS-Puffer
wird für 1 h bei Raumtemperatur mit dem Antikörper anti-Maus (1:200) inkubiert.
Anschließend wird wieder zweimal mit PBS-Puffer gewaschen und dann für 1 h bei
Raumtemperatur mit Cy2-konjugiertem-Straptavidin (1:100) inkubiert. Für die
Doppelfärbung werden die Schnitte noch zwei weitere Male mit PBS-Puffer gewaschen
und entsprechend mit Anti-Insulin (1:800) oder Anti-Glukagon (1:200) für 30 min bei
37°C in einer feuchten Kammer inkubiert. Anschließend werden die Schnitte wieder mit
PBS-Puffer gespült, um darauf mit den entsprechenden Sekundärantkörpern, Cy3-Anti-Pig
(1:800, Anti-Insulin) und Cy3-anti-Maus (1:200, Anti-Glukagon) für 30 min beim
Raumtemperatur zu inkubieren. Am Ende erfolgt die Kerngegenfärbung, indem wiederum
zweimal mit PBS-Puffer gewaschen wird und dann für 30 min bei Raumtemperatur mit
DAPI inkubiert wird. Nun werden die Gewebeschnitte nach dem Waschen mit PBS-Puffer
mit Fluoreszence-Mounting-Medium eingedeckelt und unter einem Zeiss Axioplan
Mikroskop analysiert.
38
3.2.6.3 Chloramin-T Methode
Mittels der Chloramin-T Methode (DeNardo, et al., 1986) werden die SCA radioaktiv
markiert. Dafür werden 100 µg SCA mit 1/10 Volumen 0,2 M Natrium Phosphat Puffer
mit pH 7,4 und 125I im Verhältnis 1:1 (mg Protein:mCi) gemischt. Durch Zugabe von 1/10
Volumen 1 mg/ml Chloramin-T wird die Reaktion gestartet und bei Raumtemperatur für 1
min inkubiert. Die Reaktion wird durch Hinzugeben von 1/10 Volumen 1 mg/ml
Natriummetabisulfit gestoppt. Die Suspension wird auf eine mit PBS equilibrierte
NAP™10 Säule gegeben. In 250 µl Schritten wird der radioaktiv markierte SCA eluiert.
Im Gammazähler werden die gesammelten Fraktionen gemessen und die SCA-haltige
Fraktion wird darauf zur Proteinbestimmung in den BCA (vgl. 3.2.5.3) gegeben.
3.2.6.4 In vitro Analysen des Bindungsverhaltens vom SCA
Die im folgenden beschriebenen Methoden sind Teil der Veröffentlichung „In vitro phage
display in a rat beta cell line: a simple approach for the generation of a single-chain
antibody targeting a novel beta cell-specific epitope“ (Ueberberg, S., D. Ziegler, et. al.,
Diabetologia, Band 53, Ausgabe 7, Seite 1384-1394). Die Durchführung der Methoden
erfolgte überwiegend selbstständig sowie die Auswertung unter Hilfestellung der
wissenschaftlichen Mitarbeiter.
3.2.6.4.1 Charakterisierung der SCA mittels konfokalem Lasermikroskop
INS-1- und AR42J-Zellen werden auf Kulturschalen mit den entsprechenden Medien für
48 h bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. Auf die Zellen werden 100 µl Medium ohne FCS
mit 2 µg/ml SCA gegeben und 10 min bei entweder 4°C oder 37°C inkubiert.
Anschließend werden die Kulturschalen mit PBS gewaschen und mit eisgekühlten 4 %
Formaldehyd 15 min fixiert. Drauf werden die Zellen mit 0,1 % Triton X-100 für 10 min
permeabilisiert und ein anti-myc fluoreszenzmarkierter Sekundärantikörper (2µg/ml,
AlexaFluor 488 konjugiert) zugefügt. Am Ende werden die Zellen in Assistenz einer
wissenschaftlichen Mitarbeiterin mit einen konfokalem Lasermikroskop ausgewertet.
39
3.2.6.4.2 In vitro Radioaktivitäts-Bindungsassay
Für den Versuch werden je 106 Zellen der Zelllinien INS-1, AR42J und TC-6 benötigt. Sie
werden in 200 µl ihrer entsprechenden Kulturmedien für 30 min bei 37°C und 5 % CO2 in
Kulturschalen inkubiert. Anschließend werden 5 µg der radioaktiv markierten SCA für
5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 1 h oder 2 h mit den Zellen inkubiert. Durch Zentrifugation
für 10 s bei 12.000 g durch eine organische Phase (n-dodecan:bromododecan, 1:90,8 ,
d=1,017 g/ml) werden die gebundenen SCA von den ungebundenen SCA getrennt. Danach
wird das Zellpellet in flüssigen Stickstoff eingefroren und das gefrorene Pellet wird
abgetrennt. Von diesem wird mithilfe des Gamma-Zählers die Zell-assoziierte-
Radioaktivität (CAR) gemessen. Um die Retention der SCA zu messen wird ähnlich
verfahren. Dazu wird nach 10 minütiger Inkubation mit dem radioaktiv markierten SCA
die Zellen zweimal mit PBS gespült. Danach wird mit strahlungsfreiem Medium
entsprechend weiter inkubiert und durch die Ölschicht zentrifugiert. Die CAR der SCA
wird auf das spezifische mittlere Zellvolumen normiert, das mit dem CASY ermittelt
wurde, und in cpm/Zelle angegeben wird. Um Hintergrundrauschen rauszufiltern, wird ein
Versuch mit hoher Konzentration von unmarkierten SCA gemacht und der Wert von
jedem Datenpunkt abgezogen.
40
4. Ergebnisse
4.1 Bestimmung β-Zell-spezifischer SCA aus der Phage-Display-Technologie
Es wurden 20 Phagenklone, die in einem in vivo Ansatz mit Hilfe der Phage-Display-
Technologie generiert wurden, sequenziert, um nach unbekannten β-Zell-spezifischen
Phagenklonen zu suchen. Dabei wurden zwei verschiedene ISPCs gefunden. Sie werden in
Anlehnung an die Arbeit von S. Ueberberg (2009a) ISPC1 und ISPC8 genannt. ISPC1
wurde dabei in 70% der Phagenklone und ISPC8 in 30% der Klone entdeckt. Die
Sequenzauswertung wurde nach Kabat et al.(1991) durchgeführt. Mit Hilfe der Kabat-
Regeln unter 1.7 wurden die einzelnen CDR-Bereiche abgeleitet. In Abbildung 7 werden
die ausgewerteten Sequenzen dargestellt, die aus einer schweren Kette (blau) und einer
leichten Kette (grün) bestehen, die mit einem Linker verbunden sind. Die Variabilität der
ISPC liegt in den CDRs, der schweren (CDR-H1-CDR-H3) und leichten Ketten (CDR-L1-
CDRL3), die in der Abbildung 7a mit einem schwarzen Rahmen hervorgehoben werden.
Die hier gefundenen ISPCs und die aus der Arbeit von S.Ueberberg (2009a) unterscheiden
sich nur in den CDR-H2, CDR-H3, CDR-L2 und CDR-L3.
Die Sequenz vom ISPC1 ist mit der aus der Arbeit von S.Ueberberg (2009a) identisch. Die
Sequenz des ISPC8 wurde mittels BLAST (basic local alignment search tool) des NCBI
(National Center for Biotechnology Information) abgeglichen. Es wurde keine
Übereinstimmung mit bekannten Proteinsequenzen gefunden.
41
Abbildung 7: Sequenzen des ISPC1 und ISPC8
a) Aminosäuresequenzen der schweren (blau) und leichten (grün) Ketten der ISPC. Die CDRs sind mit einemschwarzen Rahmen markiert, die variablen Aminosäuren sind mit X. b) Aminosäurenvergleiche der CDRsder schweren Kette mit den variablen Aminosäuren (rot). c) Aminosäurevergleich der CDRs der leichtenKette mit den variabelen Aminosäuren (rot) (modifiziert nach Ueberberg, et al., 2009a).
42
4.2 In vitro Bestimmung der β-Zell-Spezifität des ISPC
Mittels eines zellbasierten Bindungsassay (Giordano, et al., 2001) wurde der IPSC8 auf
seine β-Zell-Spezifität untersucht. Dabei wurde das unterschiedliche Bindungsverhalten zu
einer exokrinen Pankreas-Zelllinie der Ratte (AR42J Zellen) mit einer β-Zelllinie der Ratte
(INS-1 Zellen) verglichen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 8 dargestellt. Das
Bindungsverhältnis zwischen INS-1 zu AR42J beträgt 1:1,55.
0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000
INS-1
AR42J
gebundene Phagen/ 10^6 Zellen
Abbildung 8: In vitro Bestimmung der β-Zell-Spezifität
Bindungsspezifität des ISPC8 ist gegenüber der INS-1-Zelllinie um das 1,5-fache höher als gegenüber derAR42J-Zelllinie.
4.3 SCA-Herstellung
Für die Herstellung der SCA wurden mit dem entsprechenden ISPC infizierte HB2151
Bakterien lysiert. Denn die hergestellten SCA befinden sich im inneren der Bakterie. Die
SCA werden mittels Nickel-Säule, aufgrund ihres His-Tag, von Fremdproteinen
aufgereinigt. Abbildung 9 zeigt beispielhaft den so aufgereinigten SCAB7 (β-Zell-
spezifischer SCA) mit der erwarteten Bande bei ca. 31 kDa. Der SCA konnte anhand des
His-Tag durch einen Westernblot nachgewiesen werden (vgl. Abb. 9b).
43
a) b)
Abbildung 9: SCA-Aufreinigung aus HB2151 Bakterien und Westernblot
a) 10% SDS-Gel nach Comassie-Färbung: Die SCA-Aufreinigung zeigt die erwartete Bande bei ca. 31 kDa.Spur 1:Marker (M); Spur 2: Probe vor Säule (P); Spur 3: Probe nach Säule (PS); Spur 4-9: Waschschritte 1-6(W1-W6); Spur 10: Eluat (E).b) Westernblot mit anti-His-Tag: Die erwartete Bande liegt bei ca. 31 kDa, Spur 1: Marker (M); Spur 2: Eluat(E).
4.4 In vivo Bestimmung der β-Zell-Spezifität der ISPC
Um in vivo die Lokalisation der ISPC zu untersuchen, wurden die ISPC einer nicht
diabetischen Ratte intravenös injiziert. Nach zwei Stunden Zirkulation wurde das Tier
getötet und das Pankreas entnommen. Das Pankreas wurde in Formalin fixiert und in
Paraffin eingebettet. Anhand immunhistochemischer Methoden konnte die Lokalisation
der ISPC innerhalb der Insel sowie das Bindeverhalten zum exokrinen Pankreas bestimmt
werden.
ISPC1 und ISPC8 zeigen bei der Bakteriophagen-Insulin-Doppelfärbung eine klare
Überlagerung der Färbungen (vgl. Abb. 10), während in der Bakteriophagen-Glukagon-
Doppelfärbung keine Überlagerung zu sehen ist (vgl. Abb. 10).
Beide ISPC sind damit β-Zell-spezifisch, wobei zwischen diesen ISPC Unterschiede zu
erkennen sind. Beim ISPC8 ist im exokrinen Gewebe ein erhöhtes Hintergrundrauschen zu
sehen. Dies deutet im Vergleich zum ISPC1 auf eine nicht so hohe Spezifität hin.
Nebenbei zeigt sich bei beiden ISPC eine Akkumulation im Zytoplasma. Der
Kontrollphage zeigt keine Affinität zu endokrinem oder exokrinem Gewebe (vgl. Abb.10).
44
Abbildung 10: In vivo Lokalisation der ISPC
Immunhistochemische Färbungen an Pankreasgewebeschnitten der Ratte mit ISPC1, ISPC8 und einemKontrollphagen. Färbungen der Phagen (grün), anti-Insulin (rot) , anti-Glukagon (rot) und KerngegenfärbungDAPI (blau). Anhand der Überlagerung der Phagen-Insulin-Doppelfärbung konnte gezeigt werden, dassbeide ISPC β-Zell-spezifisch sind. Der Kontrollphage zeigte keinerlei Bindung (Vergrößerung 40x).
45
4.5 In vivo Bestimmung der Spezifität des SCAB7
Um zu bestätigen, dass die SCA auch unabhängig von den ISPC ihre Spezifität in vivo
beibehalten, wurde exemplarisch der SCAB7 der Ratte intravenös injiziert. Nach zwei
Stunden Zirkulation wurde das Pankreas sowie Kontrollorgane entnommen. Entsprechend
der Ergebnisse des ISPC8 zeigt der SCAB7 eine selektive Bindung mit den β-Zellen und
eine Ablagerung des SCAs im exokrinen Pankreasgewebe. Ebenso ist eine Anreicherung
im Zytoplasma zu sehen, die wieder für eine Internalisierung spricht (vgl. Abb.11).
Abbildung 11: In vivo Lokalisation des SCAB7 im Pankreas
Der SCAB7 wurde mittels anti-myc (grün), Insulin mit anti-insulin (rot), Glukagon mit anti-Glukagon (rot)detektiert und die Kerngegenfärbung mit DAPI (blau) durchgeführt (10x Vergrößerung).
Eine wichtige Vorrausetzung für ein selektives Targeting ist es, dass es keine Bindungen
an anderen Organen gibt. Dafür wurden verschiedene Kontrollorgane (Herz, Leber, Lunge,
Milz und Niere) untersucht (vgl. Abb. 12).
46
Abbildung 12: In vivo Lokalisation des SCAB7 in den Kontrollorganen
Gewebeschnitte der verschiedenen Kontrollorgane mit immunhistochemischer Färbung des SCAB7 und demKontrollphagen. Bei allen Organen wurden entsprechend der SCA mittels anti-myc (grün) und derKontrollphage mit anti-Bakteriophage (grün) markiert. Die Kerngegenfärbung erfolgte mittels DAPI (blau)(40xVergrößerung).
Die Untersuchung hat gezeigt, dass es zu keiner spezifischen Bindung des SCAB7 an den
Kontrollorganen kommt. Nur im retikulohistiozytäres System, vor allem in der Milz, sind
ein wenig SCAs und Kontrollphagen zu finden. Dabei scheint es sich, um eine
unspezifische Clearance des SCA zu handeln. Dafür spricht, dass der SCAB7 und der
Kontrollphage das gleiche Aufnahmemuster besitzen.
4.6 In vitro Bestimmung der β-Zell-Spezifität des SCA
Aufgrund der schlechten Spezifität des SCAB7 und ISPC8 für β-Zellen im in vitro und in
vivo Ansatz wurde mit einem Antikörper (SCAB5) weitergearbeitet, der eine höhere β-
Zell-Spezifität hat (Ueberberg, et al., 2010b). Um das Bindungsverhalten des SCAB5 zu
bestimmen, wurde der [125I]-markierte SCAB5 einer in vitro Analyse zugeführt. Dazu
wurde die Affinität des SCAB5 an INS-1, beta-TC6 und AR42J-Zellinien untersucht. Es
zeigte sich für den SCAB5, dass es gegenüber der INS-1-Zelllinie zu einer raschen
Bindung kommt (t1/2=6min), wobei kein Auswaschen des SCAB5 möglich erscheint. Dies
deutet auf die Internalisierung des SCAB5 hin (vgl. Abb. 13a). Des Weiteren war die
Bindungsspezifität des SCAB5 gegenüber INS-1- und beta TC6-Zellen um 450-faches
größer als zu AR42J-Zellen (vgl. Abb. 13b).
47
Abbildung 13: in vitro Bindungsverhalten von [125I]-markiertem SCAB5 für endokrine und exokrineZelllinien
a) Bindung des SCAB5 an INS-1 Zellen über die Zeit: Rasche Bindung (t1/2=6 min) des SCAB5 an INS-1-Zellen (schwarze Kreise), aber keine Ausswaschung (weiße Kreise) konnte gefunden werden.b) Bindungsverhalten des SCAB5 an endokrine und exokrine Zellen: Hohe Bindungsaffinität des SCAB5 anINS-1-Zellen (schwarzer Balken) und beta-TC6-Zellen (grauer Balken) konnte festgestellt werden, währendfast keine Bindung mit den AR42J-Zellen (schraffierter Balken) erfasst wurde (*** p<0,001 gegen AR42JZellen) (Ueberberg, et al., 2010b).
4.7 Charakterisierung des Bindeverhaltens des SCAB5 mittelskonfokalem Lasermikroskop
Für die weitere Untersuchung des SCAB5 auf die Frage hin, ob der Antikörper
internalisiert wird, wurden INS-1- und AR42J-Zellen mit dem SCAB5 bei 4°C oder 37°C
inkubiert. Nach Fixierung der Zellen konnte der SCAB5 mittels fluoreszierender
Sekundärantikörper sichtbar gemacht werden. Dadurch konnte die rasche Bindung des
SCAB5 an die β-Zelloberfläche und auch die Internalisierung gezeigt werden (vgl. Abb.
14). Die Kontrollversuche ohne Primärantikörper und mit den AR42J-Zellen waren negativ.
Die Internalisierung ist nur bei aktiven Zellen vorhanden, dies spricht für einen aktiven
Transport des SCAB5 in die Zelle.
48
Abbildung 14: Bindeanalyse mittels konfokalem Lasermikroskops
Die INS-1-Zellen wurden entweder bei 4°C oder 37°C mit dem SCAB5 inkubiert. Es zeigte sich, dass bei4°C der SCAB5 auf der Zelloberfläche verteilt war und bei 37°C eine Internalisierung zu erkennen. DieKontrollen ohne Antikörper oder mit der AR42J-Zelllinie waren negativ (modifiziert nach Ueberberg, et al.,2010b).
49
5. Diskussion
Es sollten SCA, die spezifisch gegen Oberflächenproteine der β-Zellen sind, charakterisiert
und evaluiert werden. Dabei war das Ziel, dass diese SCA später für eine in vivo
Evaluation der BZM genutzt werden können, also eine hohe Spezifität für die β-Zellen
aufweisen mit einem geringen Bindungsverhältnis zu dem umliegenden Gewebe und den
anderen Organen.
5.1 Hintergrund zur humanen BZM-Darstellung
Bis heute ist es nicht möglich, eine einzelne Langerhans-Insel oder β-Zelle beim Menschen
nicht invasiv in vivo darzustellen (Schneider, 2008). Daneben besteht das Problem, dass
die Langerhans-Inseln diffus im gesamten Pankreas verteilt sind und ihr Anteil nur 1-2 %
ausmacht. Außerdem nimmt der Anteil im Verlauf der Diabeteserkrankung weiterhin ab.
Zusätzlich gibt es kaum einen Unterschied in Echogenität oder Dichte gegenüber dem
exokrinen Pankreas (Schneider, 2008). Dadurch ist eine Vorraussetzung, um die Inseln
nicht invasiv messen zu können, das Entwickeln eines β-Zell-spezifischen Kontrastmittels.
Um ein potentielles Kontrastmittel auf seine Spezifität hin zu testen, entwickelten Sweet et
al. (2004b) einen systematischen Screening-Assay, mit dem eine in vitro Untersuchung auf
die Spezifität des Kontrastmittels möglich ist. Des Weiteren stellten sie fest, dass die
Spezifität eines Kontrastmittels mindestens 100:1 β-Zellen gegenüber nicht β-Zellen sein
muss, um das Massenverhältnis zu überwinden (Sweet, et al., 2004b). In einer weiteren
Berechnung stellte sich heraus, dass das Verhältnis sogar 1000:1 sein muss, um in vivo
überhaupt ein genügend hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erreichen (Sweet, et al.,
2004b). Durch diese Berechnung ist anzunehmen, dass ein Kontrastmittel mit der
Spezifität von 50 oder kleiner klinisch nicht erfolgreich angewendet werden kann. Dabei
ist aber zu bedenken, dass es sich bei den Angaben nicht um absolute Zahlen handelt,
sondern vielmehr um einen Richtwert. Deswegen ist es durchaus sinnvoll, schon
Kontrastmittel mit einer Spezifität von z.B. größer 100 zu untersuchen. Neben der
Spezifität des Kontrastmittels gibt es noch weitere Aspekte, die berücksichtigt werden
sollten. Diese Aspekte wurden von Schneider (2008) näher beschrieben.
Bei den bisherigen Versuchen ein Kontrastmittel zu entwickeln, war das Target meist ein
Oberflächen-Protein oder -Rezeptor der β-Zelle, teilweise sogar intrazelluläre Proteine
50
oder Vesikel (z.B. Oberflächen Ganglioside, VMAT2, GLUT2,…). Diese Moleküle
werden zur in vivo Testung radioaktiv markiert, daher kommt es von den ungebundenen
Molekülen, z.B. dem noch intravasal verbliebenen Teilen, zur Überlagerung. Es wurde
berechnet, dass ein ungebundenes Signal solange das eigentliche Signal überlagert bis es
ca. 200-mal schwächer ist als die gebundene Markierung (Sweet, et al., 2004a). Damit
dieser Überlagerungseffekt kein Problem darstellt, sollte ein potentielles Kontrastmittel
eine hohe Affinität als auch eine hohe Target-Dichte pro Zelle besitzen. Alternativ kann
auch eine lange Retentionszeit oder eine Internalisierung in der β-Zelle ausreichen. Am
besten wäre es, wenn das Kontrastmittel neben dem Bindungsverhalten mit einer schnellen
Ausscheidung aus dem Körper gekoppelt wäre (Hampe, et al., 2005).
Mittels des Kontrastmittels soll es möglich werden, die BZM zu bestimmen. Um dies zu
erreichen, muss seine Signalstärke mit der BZM korellieren. Guiot et al. (2007) stellten ein
Kontrastmittel vor der am Sulfonylharnstoffrezeptor 1 bindet. Es konnte gezeigt werden,
dass er mit den Insulingranula assoziiert ist. Dazu wurde in einem in vitro Versuch gezeigt,
dass die Markierung an den β-Zellen nach der Degranulation deutlich abnahm. Dies
scheint darauf zu deuten, dass dieses Kontrastmittel eher mit den Insulinvorräten korreliert
als mit der BZM. Es ist davon auszugehen, dass andere Moleküle, die dasselbe Ziel
besitzen oder mit den Insulingranula assoziiert sind, ähnliche Resultate liefern werden. Das
muss aber noch bestätigt werden. Neben den bisher genannten Eigenschaften ist es
natürlich wichtig, dass ein Kontrastmittel nicht nur auf tierischen β-Zellen exprimiert wird,
sondern auch auf humanen Zellen. Ebenso sollte das Kontrastmittel weder für die β-Zelle
an sich noch für den restlichen Organismus toxisch sein (Schneider, 2008).
5.2 Antikörper als β-Zell-spezifischer Marker
Antikörper wurden bis jetzt für eine Vielzahl verschiedener Aufgaben entwickelt (Zheng,
et al., 2006), z.B. zum spezifischen Transport von Chemotherapeutika (Dubowchik and
Walker, 1999) oder zum Abfangen von Molekülen, die für den Tumorwachstum essentiell
sind (Ferrara, et al., 2005). Derzeitig sind ca. 17816 Substanzen und ca. 2025 verschiedene
Targets bekannt (Zhu, et al., 2012) und ihre Anzahl nimmt weiterhin zu. Deswegen ist
durchaus anzunehmen, dass ein hoch spezifischer Antikörper gegen die Oberfläche der β-
Zellen entwickelt werden kann und dieser sich für die nicht-invasive BZM-Darstellung
eignet. Ein paar Arbeitsgruppen haben schon daran gearbeitet, darunter auch Moore et al.
(2001). Sie untersuchten einen [111In]-IC2-Antikörper, der an einem bis dato unbekannten
51
Oberflächenprotein der β-Zelle der Maus gebunden hatte. In weiteren ex vivo Versuchen
konnten sie eine gute Korrelation von BZM und Antikörper-Akkumulation feststellen.
Leider musste festgestellt werden, dass das große Molekulargewicht des IC2-Antikörpers,
welches ein Antikörper des IgM-Typs ist, zu einer sehr langen Verweildauer im
Organismus führte. Das große Molekulargewicht sorgte für eine geringe Ausscheidung und
dadurch zu einer Halbwertszeit von mehreren Tagen. Dies führte zu einem schlechten
Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Eine weitere Arbeitsgruppe um Ladriere et al. (2001)
untersuchte den [125I]R2D6-Antikörper, der gegen ein Gangliosid der β-Zelle gerichtet war.
Leider wurde in vitro und in vivo Untersuchungen kein Unterschied im Rahmen der
Aufnahme in die β-Zellen von nicht diabetischen und diabetischen Ratten festgestellt.
Einen weiteren potenziellen β-Zell-Antikörper stellte Hampe et al. (2005) vor. Dabei
handelte es sich um einen IgM-Antikörper und das Fab-Fragment, die in vitro Screening-
Tests näher untersucht wurden. Dabei stellte sich heraus, dass die Spezifität des
Antikörpers zu gering war.
Durch diese Veröffentlichungen ist erkennbar, dass ein zu großes Molekulargewicht eines
monoklonalen Antikörpers die Halbwertszeit im Körper signifikant erhöht und es somit
äußerst schwierig macht das Hintergrundrauschen weit genug zu reduzieren, um eine
Aufnahme mit möglichst geringer Überlagerung und entspechender Schärfe zu generieren.
Große Moleküle besitzen die Tendenz, unspezifische Bindungen einzugehen, und sie
neigen zu sehr langen Zirkulationszeiten im Organismus. Durch das Entfernen des Fc-Teils
ist es möglich, diesen Effekt zu reduzieren. (Hampe, et al., 2005, Ladriere, et al., 2001).
Deshalb ist das Targeting der β-Zellen mittels Antikörpertechnologie weiterhin ein viel
versprechender Ansatz. Nur muss neben der Spezifität für das Target auch das Molekül
möglichst klein sein, um unnötiges Hintergrundrauschen zu vermeiden.
Da die Antikörper trotz der Probleme am vielversprechensten sind und mit möglichst
kleinen Molekülen gearbeitet werden sollte, bietet es sich an, einen SCA zu verwenden.
Damit ist es möglich, die Spezifität eines kompletten Antikörpers zu nutzen und trotzdem
ein möglichst geringes Molekulargewicht zu wahren.
5.3 Entwicklung β-Zell-spezifischer SCA
Die Entwicklung eines β-Zell-spezifischen Kontrastmittels wurde erschwert durch die
Tatsache, dass nur sehr wenig über die Oberflächenmarker der β-Zellen bekannt ist (Samli,
et al., 2005). Eine Möglichkeit dieses Problem bei der Entwicklung eines SCA zu umgehen,
52
ist das Nutzen der Phage-Display-Technologie. Sie ist eine Methode, um Peptide oder
Antikörper zu isolieren, die auf der Zelloberfläche binden, ohne dass ein
Oberflächenprotein vorher bekannt sein muss. Mit dieser Technik wurden schon
erfolgreich Peptide isoliert, die über das Gefäßsystem ganz spezielle Organe erreicht haben
unter anderem das Pankreas. (Pasqualini and Ruoslahti, 1996, Rajotte, et al., 1998, Trepel,
et al., 2002). Selbst für Langerhans-Inseln wurden schon mit dieser Technologie mittels in
vitro Panning spezifische Phagen isoliert (Samli, et al., 2005). Deshalb erscheint es
wahrscheinlich, dass mittels der Phage-Display-Technologie ein monoklonaler Antikörper
entwickelt werden kann, der eine entsprechend hohe β-Zell-Spezifität hat. Das Problem mit
der langen Verweildauer im Körper, dass durch das hohe Molekulargewicht bedingt ist,
wird durch den Einsatz einer SCA-Bibliothek umgangen. Der Einsatz von SCA-
Bibliotheken war zur Generierung von Insel spezifischen Phagen in vitro an Zell-Linien
der β- und α-Zellen und in vivo in Ratten schon erfolgreich. Sie zeigten eine signifikante
Anreicherung auf den Inseln (Ueberberg and Schneider, 2010a). Ebenso konnte bewiesen
werden, dass mit SCA die langen Zirkulationszeiten von bis zu Tagen nicht mehr auftreten.
Die Halbwertszeit betrug nur 22,7 oder 19,2 min für die SCA (Ueberberg, et al., 2009a).
Es wurde im Rahmen dieser Arbeit nun mit Hilfe der Phage-Display-Technologie nach
weiteren SCA gesucht um diese näher zu untersuchen und auf ihre β-Zell-Spezifität zu
testen. Oder bereits bekannte Klone, die bereits auf ihre Spezifität untersucht wurden,
weiter zu evaluieren. Es konnte ein Klon entdeckt werden, der bei einem Vergleich der
Peptidsequenz mit Hilfe des BLASTs (basic local alignment search tool) des NCBI
(National Center for Biotechnology Information) keine Übereinstimmung mit bereits
bekannten Proteinen lieferte Ein weiterer SCA wurde im in vivo Ansatz entdeckt, welcher
bereits durch Überberg (2009a) beschrieben wurde.
5.4 Bestimmung der β-Zell-Spezifität in vitro und in vivo
Ziel dieser Arbeit ist es, ein β-Zell-spezifisches Kontrastmittel zu finden. Mittels in vivo
Selektion in Ratten wurden zwei ISPC gefunden. Die beiden gefundenen Klone wurden
näher untersucht. Dazu wurde mittels Zell basiertem Bindungsassay das Bindeverhalten
der beiden SCA analysiert. Dabei wurden die beiden ISPC mit INS-1- und AR42J-Zellen
inkubiert und dann durch eine organische Phase zentrifugiert (Giordano, et al., 2001).
Dabei stellte sich heraus, dass der ISPC8 nur eine geringe β-Zell-Spezifität und der ISPC1
eine relative hohe erreicht. Die Ergebnisse sind mit denen von Ueberberg (2010a)
53
vergleichbar. Dies gab den ersten Hinweis, dass es sich um β-Zell-spezifische Phagenklone
handelte. Um dieses Ergebnis auch in vivo zu bestätigen, wurden die ISPC Ratten
intravenös injiziert, anschließend die Organe entnommen und immunhistochemisch
analysiert. In den histologischen Bildern bestätigte sich die Affinität beider ISPC zu den β-
Zellen. Während der ISPC1 keine weitere Bindung weder zu den Kontrollorganen noch
zum exokrinen Gewebe des Pankreas zeigte, entsprechend den Ergebnissen Ueberbergs
(2009a), konnte beim ISPC8 eine deutliche Aufnahme des ISPC8 in den exokrinen Zellen
festgestellt werden. In der Histologie hatten sich somit die Ergebnisse des Bindungsassay
bestätigt. Der Klon mit der geringen Spezifität zeigte entsprechend im exokrinen Gewebe
Anreicherungen, während der andere dort keine Aufnahme zeigte und nur in den β-Zellen
bindet. Des Weiteren zeigten beide Klone Anzeichen für eine Internalisierung. Da die
Ergebnisse mit denen Ueberbergs (2009a) korrelierten, wurde mit dem ISPC1 nicht
weitergearbeitet und der ISPC8 wurde näher untersucht. Um zu überprüfen ob der SCAB7
auch losgelöst vom Phagenanteil die gleiche Spezifität erreicht, ähnlich wie der ISPC1
(Ueberberg, et al., 2009a), wurde der SCA aufgereinigt und wie mit den ISPC den nicht
diabetischen Ratten intravenös injiziert. Es bestätigten sich die vorherigen Ergebnisse, dass
der SCAB7 spezifisch ist für die β-Zelle mit Anzeichen einer Internalisierung. Zusätzlich
zeigte sich nur eine leichte Ansammlung des SCAB7 im retikulohistozytären System der
extrapankreatischen Organe. Dies entsprach am ehesten der unspezifischen Clearance der
SCA, da auch die Kontrollen ein ähnliches Muster zeigten. Es zeigte sich auch hier wieder
eine niedrige Spezifität des SCAB7 auf β-Zellen. Denn neben der Bindung an den β-Zellen
war auch eine Anreicherung im exokrinen Pankreasgewebe zu sehen. Diese Ergebnisse
führen dazu, dass der SCAB7 für weitere Untersuchungen wahrscheinlich nicht in Frage
kommt, da der SCAB7 keine entsprechende Spezifität hat, die vorausgesetzt wurde (Sweet,
et al., 2004a, Sweet, et al., 2004b). Der SCAB1 hingegen ist durch seine große Spezifität
und geringe Bindung zu den restlichen Organen durchaus ein geeigneter Kandidat für ein
Kontrastmittel (Ueberberg, et al., 2009a). Weitere Untersuchungen sind hier durchaus von
Nöten.
Da der SCAB7 für weitere Analysen nicht geeignet ist, wurde entschieden, dass sich der
Erforschung eines weiteren SCA zugewandt werden sollte. Es wurde sich für den SCAB5
entschieden, denn er hat in Versuchen eine größere Spezifität gezeigt als der SCAB1
(Ueberberg, et al., 2010b). Aus diesem Grund sollte dieser Antikörper näher charakterisiert
werden. Der SCAB5 stammt aus einem in vitro Versuchsansatz. Die dafür verwendete
Bibliothek Tommlinson I wurde erst mit AR42J-Zellen inkubiert, damit die Klone
54
rausgefiltert werden können, die am exokrinen Pankreas binden. Erst darauf folgend wurde
mittels der INS-1-Zelllinie geschwenkt, um einen Klon zu bekommen, der gegen die β-
Zellen gerichtet ist. Im Gegensatz dazu stammen der SCAB7 und der SCAB1 aus einem in
vivo Ansatz, in dem die gleiche Bibliothek einer Ratte gespritzt wurde und der Pankreas
entnommen wurde, um die bindenden Phagenklone aufreinigen zu können. Aus dem
Pankreas werden die Langerhans-Inseln herauspräperiert, um an die spezifischen Phagen
zu gelangen. Da es aber leider keine Möglichkeit gibt, einzelne β-Zellen zu isolieren und
somit die β-Zell bindenden Phagen direkt zu ernten, kann es passieren, dass kein β-Zell-
spezifischer Klon, sondern ein α- oder δ-spezifische Variante dabei ist. Bei einer
Langerhans-Insel handelt es sich aber zum Großteil aus β-Zellen, daher ist es mit diesem
Versuchsaufbau am wahrscheinlichsten, einen β-Zell-spezifischen Klon zu generieren.
5.5 Bindungsverhalten von markierten SCA in vitro
Der entwickelte SCAB5 wurde mittels in vitro Versuch generiert. Er zeigte in einem
zellbasierten Bindungsassay eine 450-fach höhere Bindung an β-Zell-Linien als an einer
Zelllinien des exokrinen Pankreas. Dabei ist der SCAB5 älteren Liganden deutlich
überlegen (Hampe, et al., 2005, Sweet, et al., 2004b) und ist an der errechneten Spezifität
vergleichbar mit dem SCAB1 der einen Wert von ca. 500:1 hat (Ueberberg and Schneider,
2010a). Die Bindung des SCAB5 wird aber durch die Präinkubation mit SCAB1, SCAB2,
SCAB3 und SCAB4 nicht inhibiert. Dies spricht mindestens für eine separate
Bindungstasche innerhalb des gleichen Oberflächen-Antigen, wenn nicht sogar für ein
ganz anderes Oberflächen-Antigen.
Der SCAB5 überschreitet den in der Literatur angegebenen Schwellenwert (Sweet, et al.,
2004b), um als Kontrastmittel ein ausreichend hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu
erreichen. Dadurch ist der SCAB5 zu einem Kandidaten für weitere Untersuchungen
geworden. Bei diesen Tests wurde eine rasante Bindung des SCAB5 an INS-1-Zellen
festgestellt. Sie beträgt t1/2=6 min, außerdem konnte keine Auswaschung festgestellt
werden, was auf eine Internalisierung deutet. Verglichen mit dem SCAB1, der ebenfalls
eine schnelle Bindung hat (t1/2=8min) (Ueberberg, et al., 2009a), ist der SCAB5 nur
geringfügig schneller. Dies hat aber für die weitere Forschung kaum Relevanz. Um die
Aufnahme des SCAB5 in INS-1-Zellen nachzuweisen, wurde die INS-1-Zellen einmal bei
4°C und 37°C mit den SCAB5 inkubiert. Damit konnte gezeigt werden, dass bei aktiven
Zellen (37°C Ansatz) der SCAB5 sich im Zytoplasma ablagert, während bei den inaktiven
55
Zellen (4°C Ansatz) sich die Antikörper gleichmäßig auf der Zelloberfläche verteilten.
Dadurch konnte zusätzlich beweisen werden, dass der SCAB5 an der β-Zell-Linie bindet
und, dass der Antikörper aktiv von den Zellen aufgenommen wird. Daraufhin konnte
mittels Inkubation von radioaktiv markierten SCAB5 und INS-1-Zellen gezeigt werden,
dass mehr als 630.000 SCA pro β-Zelle internalisiert werden (Ueberberg, et al., 2010b).
Dies entspricht also ungefähr der selben Größenordnung wie der SCAB1 (Ueberberg, et al.,
2009a). Da es sich um eine aktive Internalisierung des SCAB5 handelt, kann davon
ausgegangen werden, dass nur noch lebende und wahrscheinlich gesunde β-Zellen die SCA
aufnehmen. Dementsprechend kann die Markierung durch den SCAB5 gleichgesetzt
werden mit der BZM. Des Weiteren konnte mittels Färbungen des pankreatischen
Gewebes von Ratten und Menschen gezeigt werden, dass das Epitop in Geweben
unterschiedlichen Ursprungs vorkommt (Ueberberg, et al., 2010b). Deshalb ist davon
auszugehen, dass die Ergebnisse, die durch Versuche an Ratten erlangt wurden, zumindest
teilweise auf menschliches Gewebe übertragbar sind.
Eine Grundvorrausetzung für die weitere Erforschung der Funktion der β-Zellen
insbesondere des Menschen ist es, dass das Kontrastmittel in Tierversuchen das gleiche
Verhalten aufzeigt wie an menschlichen Geweben. Dies scheint hier, der Fall zu sein.
Weitere Untersuchungen sind dennoch notwendig, um diese Eigenschaft bestätigen zu
können. Ein weiterer entscheidender Punkt, ob ein Ligand sich für ein β-Zell-spezifisches
Kontrastmittel eignet, ist seine Korrelation zur BZM. Mittels Infrarotaufnahmen von
markierten SCAB5 konnte gezeigt werden, dass die Zunahme der Signalintensität nur
abhängig ist von der BZM (Ueberberg, et al., 2010b). Damit erfüllt der SCAB5 einen Teil
der Vorgaben, die von Schneider (2008) beschrieben wurden, um als β-Zell-spezifisches
Kontrastmittel zu gelten.
Der SCAB5 ist zwar im Rahmen der Bindungsspezifität einem vollständigen Antikörper
oder seinem Fragmenten unterlegen (Hampe, et al., 2005), jedoch zeichnet er sich
insbesondere durch seine schnelle Bindung an den β-Zellen und seine Korrelation zur
BZM aus (Ueberberg, et al., 2010b). Die Spezifität mag zwar geringer sein, doch ist sie
immer noch ausreichend hoch, um als β-Zell-spezifisches Kontrastmittel in Betracht
gezogen werden zu können. Dadurch ist der SCAB5 weiterhin ein viel versprechender
Ligand für die nicht invasive Darstellung der BZM.
56
5.6 Ausblick
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein SCA entwickelt, der eine gewisse Spezifität gegenüber
den β-Zellen des Pankreas zeigt. Leider erreichte sie nicht den notwendigen Schwellenwert
von 1:100 gegenüber dem exokrinen Gewebe, sodass dieser Klon nicht zu der Entwicklung
eines β-Zell-spezfischen Kontrastmittels genutzt werden kann. Aus diesem Grund wurde
sich einem weiteren vielversprechenderen Klon zugewendet. Dieser war schon als β-Zell-
spezifisch bekannt, aber wurde noch nicht näher untersucht. Leider konnte zu keinem der
beiden das Target bestimmt werden an dem es bindet. Damit kann nicht ausgeschlossen
werden, dass die SCA an schon bekannte Antigene binden und dabei nur eine andere
Tasche des Proteins zur Erkennung verwenden. Einige konnten ausgeschlossen werden,
dazu gehören Insulin, GAD-65, C-Peptid und IAPP (Ueberberg, et al., 2010b). Aber um
das Potential des SCAB5 besser abschätzen zu können, ist es notwendig, das Ziel Antigen
zu identifizieren. Weitere Möglichkeiten könnten sich durch die Identifizierung des
Antigens offenbaren. Daher sollte ein Ziel sein, es in der weiteren Forschung zu
identifizieren.
Ueberberg (2009b) konnte mit ihrem entdeckten Klon SCA1 deutlich machen, dass die
Entwicklung von spezifischen SCA mittels Phage-Display-Technologie durchaus Früchte
tragen kann. Ihr ist es sogar möglich gewesen, die BZM nicht invasiv in einer Ratte zu
bestimmen. Hierfür koppelte sie den SCA1 an 124Iod und detektierte den SCA dann mit
dem Positronen-Emmisions-Tomographen. Die Ergebnisse zeigten, dass ein deutlicher
Unterschied der Signalstärke im Pankreas von diabetischen und nicht diabetischen Ratten
erkennbar wurde (Ueberberg, 2009b). Damit wurde erstmals die BZM nicht-invasiv
sichtbar gemacht. Dies ist ein großer Schritt in der Diabetesforschung, denn durch die
nicht-invasive Darstellung der BZM werden neue Einblicke in die Pathogenese des
Diabetes möglich. Dadurch ergibt sich weiter die Möglichkeit, neue Therapien zu
entwickeln und bereits bestehende genauer evaluieren zu können.
Neben diesen viel versprechenden Ergebnissen sollte nicht unbeachtet bleiben, dass diese
Technologie doch sehr vom Zufall abhängig ist. Mittels der Phage-Display-Technologie ist
es möglich, auch ohne Kenntnis über die Oberflächenantigene einer Zelle Antikörper zu
entwickeln. Doch wird dadurch nicht garantiert, dass dabei immer ein hoch spezifischer
entdeckt wird. In einigen Fällen werden auch Klone selektiert, die nur eine geringe
Spezifität besitzen oder gegen ein allgemeines Antigen gerichtet sind, welches in mehreren
Zellen oder Organen vorkommt. Dadurch wird die Entwicklung neuer Antikörper mit Hilfe
57
dieser Technologie durchaus teuer, und ein Erfolg ist dabei nicht garantiert. Dazu kommt,
dass die Entwicklung der SCA auch sehr störanfällig ist. Die SCA haben sich im Rahmen
dieser Arbeit als sehr instabil erwiesen. Durch den Einsatz von verschiedenen Linker wäre
es vielleicht möglich, die Stabilität zu erhöhen. Einer anderen Arbeitsgruppe ist es
gelungen durch den Einsatz eines anderen Linkers die proteolytische Stabilität von einem
SCA zu erhöhen (Alfthan, et al., 1995). Es gibt eine große Menge an Möglichkeiten, die
Stabilität der SCA zu erhöhen. Dabei existieren zwei Herangehensweisen, die rationelle
und die evolutionäre. Welche von beiden nun besser ist, kann derzeitig nicht mit Sicherheit
geklärt werden. Während die eine schnell und günstig ist, bietet die andere die Möglichkeit,
neue und vielleicht noch bessere Methoden zu entdecken. Daher ist anzunehmen, dass
durch die Kombination beider Ansätze noch bessere Ergebnisse erzielt werden können
(Wörn and Plückthun, 2001). Da es so viele Möglichkeiten gibt und bis jetzt noch nicht
klar ist welche die bessere ist, sollte es vorrangig sein, einen Antikörper zu finden, der den
Kriterien Schneiders (2008) entspricht. Danach kann dieser immer noch weiter modifiziert
werden, um ihn stabiler zu machen und damit den praktischen Nutzen zu verbessern. Um
im Weiteren die Produktivität für die Antikörper zu erhöhen, könnten einerseits Bakterien
zur Sekretion der Antikörper umgezüchtet oder es könnte mittels Chaperonen eine bessere
Produktivität erreicht werden (Hayhurst and Harris, 1999). Es ist sicherlich ebenfalls
denkbar, dass mittels Zellkulturen die Antikörper hergestellt werden können. Dies hat
entsprechende Vor- und Nachteile (Hellwig, et al., 2004).
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Technologien, die in dieser Arbeit
verwendet wurden, durchaus geeignet sind, spezifische Marker zu entwickeln. Die Marker
können bei entsprechender Spezifität auch als Kontrastmittel eingesetzt werden. Das Ziel
für diese Arbeit war es ein β-Zell-spezifisches Kontrastmittel zu entwickeln, da es bis jetzt
nicht möglich ist, die BZM in vivo beim Menschen zu bestimmen und dadurch vieles über
die Pathogenese des Diabetes noch unbekannt ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden nun
Marker entwickelt von denen sich herausstellte, dass nur einer den Anforderungen genügte.
Ueberberg (2009b, 2009a) hat gezeigt, dass es mit dem durch Phage-Display-Technologie
hergestellten SCA1 möglich ist, die BZM der Ratte mittels Positronen-Emissions-
Tomographen relativ darzustellen. Auch der SCAB5 konnte in den Versuchen zeigen, dass
er durch seine Eigenschaften als Kontrastmittel geeignet sein kann. Doch, ob es mit diesem
auch möglich ist, die BZM mittels radiologischen Methoden zu bestimmen, steht noch
offen. Ebenfalls ist die Frage auf die langfristige Reaktion des Organismus, die Elimination
aus dem pankreatischen Gewebe und evtl. Toxizität zu klären.
58
In wie weit durch dieses Kontrastmittel es nun möglich ist, die Pathogenese des Diabetes
genauer zu erkunden, und welche Methoden dazu am besten geeignet sind, ist Grund für
weiterführende Forschungen in diesem Gebiet.
59
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Danksagung
Als erstes möchte ich mich bei meinem Doktorvater Prof. Dr. S. Schneider bedanken, der
mir die Möglichkeit gab, an diesem äußerst interessanten Thema mitzuwirken sowie für
die schnellen Rückmeldungen und die fachliche Bewertung meiner Arbeit.
Zusätzlich gilt mein Dank auch Frau Dr. S. Ueberberg, die mit ihrer Betreuung und
Engagement einen großen Anteil am Zustandekommen dieser Dissertation hat. Ohne ihre
Anleitung und ihr ewig offenes Ohr für Fragen, wäre die Fertigstellung meiner Arbeit nicht
möglich gewesen.
Des Weiteren möchte ich allen Mitarbeitern des endokrinologischen Labors danken, für
den unermüdlichen Beistand bei jeglichen Fragen.
Außerdem will ich mich bei meiner Familie und Freunden bedanken, die mit viel Geduld,
Rat und Tat zur Seite standen.
Lebenslauf
Name: Georg Dennis Ziegler
Geburtsdatum: 05.06.1985
Geburtsort: Mannheim
Ausbildung
07/04 allgemeine Hochschulreife am Heinrich SigmundGymnasium Schriesheim, Baden-Württemberg
11/2011 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
10/2005–11/2011 Medizinstudium an der Ruhr-Universität-Bochum
09/2007 Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung
Seit 02/12 Arzt in Weiterbildung für Ophthalmologie im St.-Johannes-Hospital Dortmund
PublikationenIn vitro phage display in a rat beta cell line: a simpleapproach for the generation of a single-chain antibodytargeting a novel beta cell-specific epitope. Diabetologia53(7): 1384-94.Ueberberg, S., D. Ziegler, W. Schechinger, J. W. Dietrich, S.Akinturk, H. H. Klein, and S. Schneider (2010).
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