1
ȘCOALA DE STUDII AVANSATE A
ACADEMIEI ROMÂNE
PROVOCĂRI ÎN DIAGNOSTICUL PRECOCE
AL BOLILOR MAJORE PRIN ABORDAREA
TEHNOLOGIILOR PROTEOMICE
REZUMAT
Conducător ştiinţific:
CS I Dr. Gabriela ANTON
Student-Doctorand:
Simona MIHAI
Bucureşti
2020
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
2
Cuprins
Introducere ............................................................................................................. 3
CONTRIBUȚII PERSONALE ............................................................................. 6
SCOPUL ȘI OBIECTIVELE TEZEI .................................................................... 6
I. Screening proteomic, bazat pe spectrometrie de masă de tip SELDI-ToF MS,
pentru identificarea de potențiali biomarkeri circulatori cu expresie diferențiată
la pacienții cu BRC versus control ........................................................................ 7
II. Profil proteomic al BRC bazat pe analiza dot-blot Proteome Profiler și
Luminex xMAP array, diferențiat în funcție de gradul de severitate al bolii
renale ................................................................................................................... 14
III. Corelații între markerii inflamatori și de demineralizare osoasă luați în studiu
și markerii paraclinici convenționali, la pacientul renal. Selectarea unui panel de
biomarkeri cu potențială relevanță clinică în diagnosticul precoce, stratificarea și
gradul de severitate al BRC ................................................................................. 21
CONCLUZII FINALE ........................................................................................ 26
Bibliografie selectivă ........................................................................................... 29
LISTA DE LUCRĂRI ȘTIINȚIFICE PUBLICATE .......................................... 30
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
3
Introducere
Boala renală cronică (BRC) reprezintă o boală majoră la nivel mondial, care acoperă
toate gradele de insuficiență a funcției renale, cu incidență și prevalență în creștere, fiind una
dintre cele mai costisitoare dintre bolile cronice. Potrivit ghidurilor clinice internaționale -
KDIGO (Kidney Disease Improving Global Outcomes) 2017 - Clinical Practice Guideline
Update for the Diagnosis, Evaluation, Prevention, and Treatment of Chronic Kidney
Disease: Mineral and Bone Disorder, această boală este definită drept „anomalii în structura
sau funcția rinichilor, prezente mai mult de 3 luni, cu implicații asupra sănătății pacientului”.
Caracteristicile de bază ale BRC sunt reprezentate de pierderea progresivă și ireversibilă a
funcției renale, cu afectare renală extinsă, conducând necondiționat la boala renală în stadiul
final și complicații cardiovasculare, cu excepția cazurilor în care se va administra tratamentul
afecțiunii de bază, se va realiza diagnosticarea precoce și tratarea manifestărilor patologice,
precum și planificarea în timp util a terapiei de substituție renală pe termen lung (Isakova et
al., 2017).
Povara economică a acestei boli este studiată predominant în țările cu venituri mari, în
principal în ceea ce privește prevalența, calitatea vieții, mortalitatea și complicațiile renale și
cardiovasculare. Chiar și în cazul în care sunt disponibile rezultatele programelor naționale de
depistare a BRC la scară largă, multe surse de date raportează doar estimări ale BRC și doar
pentru populațiile selectate (limitate în funcție de grupe de vârstă, geografie, ocupație etc.), iar
pentru multe țări nu există date pentru epidemiologia BRC. Deosebit de important, BRC a
continuat să se impună printre principalele cauze de mortalitate în ultimii ~30 de ani, având
drept cauze îmbătrânirea populației și principalii factori de risc, care includ diabetul zaharat și
hipertensiunea arterială care, împreună, au contribuit la mai mult de jumătate dintre decesele
cauzate de BRC în anul 2017 (2020).
Deși îmbunătățiri substanțiale au fost aduse în sistemele de sănătate, BRC rămâne în
continuare o povară majoră pentru sănătatea publică, iar prevalența acesteia este în continuă
creștere. Datorită naturii sale insidioase, BRC este rareori diagnosticată în stadiile incipiente
și, odată dezvoltată, progresia bolii este, din păcate, ireversibilă, conducând la terapie de
substituție a funcției renale (dializă și transplant renal) (Mihai et al., 2018).
Bolile cronice sunt însoțite de un status inflamator persistent, de intensitate scăzută
sau moderată, asociat de regulă bolilor coronariene, sindromului metabolic, diabetului zaharat
sau vârstei înaintate. Având în vedere că nu numai patologiile populației vârstnice au fost
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
4
asociate cu prezența inflamației sistemice scăzute, acest status fiind raportat și la copiii și
adolescenții cu variate probleme de sănătate (obezitate, infecții enterale, stres etc.), studiile au
relevat că BRC și mecanismele moleculare care o declanșează trebuie luate în considerare în
tandem cu procesul inflamator cronic care însoțește boala. Principalele surse de citokine
inflamatorii sunt monocitele circulante și celulele endoteliale, a căror distribuție ubiquitară ar
putea fi responsabilă pentru impactul larg răspândit al inflamației în aproape toate organele,
incluzând rinichiul. Deși rinichii primesc 25% din întregul volum de sânge al organismului,
fără a beneficia de mecanisme de apărare antioxidante, detoxifiante și anti-inflamatorii,
dezvoltate de alte țesuturi intens vascularizate (cum ar fi țesutul hepatic), aceste organe se
constituie ca o țintă vulnerabilă în fața diverselor agresiuni persistente (Dregan et al., 2014,
Guarner and Rubio-Ruiz, 2015, Pawelec et al., 2014). Conform studiilor clinice, 50% dintre
pacienții diagnosticați cu BRC prezintă un prognostic nefast datorat complicațiilor
cardiovasculare, respectiv calcificările vasculare avansate arteriale și valvulare; cu toate
acestea, procesele care stau la baza calcificărilor accelerate în BRC nu sunt pe deplin
descifrate, reprezentând subiectul mai multor studii de cercetare științifică în sfera
nefrologică. Astfel, screening-ul pentru prezența calcificărilor vasculare este sugerat în
ghidurile clinice actuale, întrucât calcificarea vasculară este considerată a fi un marker de risc
cardiovascular și este asociată cu o creștere substanțială a morbidității și mortalității, atât în
populația generală, cât și în BRC (Aikawa et al., 2009).
Pe măsura pierderii funcției renale, metabolismul mineral perturbat agravează
microstructura și remodelarea osoasă, scenariu patologic care implică axa os-rinichi-sistem
cardiovascular și care este recunoscut sub denumirea de BRC – boală minerală și osoasă
(BRC-BMO), în orchestrarea căreia participă variate molecule care mediază procesele de
mineralizare în BRC. Ghidurile clinice internaționale KDIGO definesc astfel BRC-BMO ca o
tulburare sistemică mai largă a metabolismului mineral și osos ca urmare a BRC, caracterizată
printr-un metabolism anormal al calciului, fosforului, hormonului paratiroidian (PTH) sau
vitaminei D, anomalii ale turn-over-ului osos, de mineralizare și creștere osoasă, precum și
calcificări anormale ale țesuturilor moi (extra-osoase, vasculare) (Fukagawa and Komaba,
2017). În conformitate cu ghidurile de evaluare, clasificare și stratificare NKF KDOQI -
National Kidney Foundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiative, boala renală
cronică este împărţită în 5 stadii de boală, în funcţie de eGFR, contribuind astfel în mod
esențial la o definire mai facilă şi o încadrare a pacienţilor cu afecţiuni renale cronice.
Recunoscute la nivel mondial pentru îmbunătățirea diagnosticului și a tratamentului bolilor
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
5
renale, ghidurile KDOQI au îmbunătățit practicile clinice curente pentru numeroase
specialități și discipline și au îmbunătățit speranța de viață pentru mii de pacienți cu patologie
renală. Odată stabilit diagnosticul de BRC, următorul pas este stadializarea bolii, care se
bazează pe următoarele componente: GFR, albuminuria și componenta etiologică. Ghidurile
clinice internaționale KDIGO (Kidney Disease Improving Global Outcomes) 2017, clasifică
BRC în funcție de etiologie, categoria GFR (G1-G5), care evaluează funcția renală și
albuminurie (A1-A3), parametru care evaluează lezarea renală. (Inker et al., 2014)
În contextul unor date epidemiologice îngrijorătoare, a naturii insidioase a BRC și a lipsei de
markeri de diagnostic care să surprindă boala într-un stadiu incipient, dezvoltarea platformelor
proteomice de ultimă generație ar putea avea o contribuție majoră în managementul pacientului
renal, direcționând strategia terapeutică actuală care vizează „repararea daunelor”, către strategia de
prevenire a bolii (Pejchinovski and Mischak, 2017). Descoperirea de noi biomarkeri, cu expresie
modificată în torentul circulator înainte ca boala să fie confirmată clinic, cu sensibilitate și
specificitate ridicate, reprezintă una dintre preocupările majore ale cercetărilor fundamentale și
clinice din aria nefrologică.
Toate aceste considerente au contribuit la orientarea proiectului de cercetare științifică,
care a făcut obiectul prezentei teze, către selectarea, prin tehnologii proteomice avansate, a
unui panel de noi biomarkeri, cu rol în diagnosticarea precoce, stadializarea și determinarea
severității BRC. Prin abordarea tehnologiilor proteomice, identificarea de noi biomarkeri într-
o manieră neinvazivă permite conturarea semnăturilor proteice unice pentru fiecare stadiu de
boală, utile în managementul pacientului renal.
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
6
CONTRIBUȚII PERSONALE
SCOPUL ȘI OBIECTIVELE TEZEI
BRC este caracterizată printr-un debut insidios, iar simptomele ce însoțesc boala în
stadiile inițiale nu sunt specifice, împiedicând astfel un diagnostic precoce, într-un stadiu în
care aplicarea terapiilor curente ar putea oferi o vindecare completă. În conformitate cu
ghidurile clinice actuale, diagnosticul BRC se bazează pe calculul eGFR, detectarea
albuminuriei și realizarea unei biopsii renale, însă aceste metode de diagnostic sunt adesea
utilizate într-un stadiu tardiv al bolii, când leziunile glomerulare renale sunt avansate și adesea
ireversibile, conducând invariabil la terapia de substituție renală, respectiv dializă și transplant
renal. Având în vedere că markerii paraclinici convenționali prezintă anumite limite, nefiind
utili în stadiile precoce ale bolii, sunt necesari noi biomarkeri ai funcției renale care să fie capabili
să detecteze în mod neinvaziv debutul precoce al bolii renale, să faciliteze diagnosticul diferențial,
să monitorizeze răspunsurile la terapie și progresia spre stadiile mai avansate ale bolii, precum și
spre boala renală în stadiu final. Dezvoltarea tehnologiilor proteomice a permis noi abordări vizând
bolnavul renal, prin descoperirea de noi biomarkeri și stabilirea de semnături proteice unice,
caracteristice pentru fiecare stadiu de boală.
Pornind de la aceste considerente, scopul acestei teze a constat în selectarea unui nou
panel de biomarkeri cu potențială relevanță clinică în diagnosticul precoce, stratificarea și
gradul de severitate al BRC. Utilizând tehnologii proteomice avansate, această teză a urmărit
trei obiective principale:
Screening proteomic bazat pe spectrometrie de masă de tip SELDI-ToF MS pentru
identificarea de potențiali biomarkeri circulatori cu expresie diferențiată la pacienții cu
boală renală cronică versus control.
Profil proteomic al bolii renale cronice, bazat pe analiza dot-blot Proteome Profiler,
diferențiat în funcție de gradul de severitate al bolii renale.
Corelații între markerii inflamatori și de demineralizare osoasă luați în studiu și markerii
paraclinici convenționali, la pacientul renal.
Nota de originalitate a acestei lucrări științifice rezidă în selectarea unui panel de nouă
biomarkeri, care au dovedit un real potențial în evaluarea gradului de severitate al BRC, în
stratificarea și diagnosticarea timpurie a BRC.
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
7
I. Screening proteomic, bazat pe spectrometrie de masă de tip SELDI-ToF
MS, pentru identificarea de potențiali biomarkeri circulatori cu expresie
diferențiată la pacienții cu BRC versus control
În vederea identificării de molecule cu expresie diferită în BRC comparativ cu lotul
control, dar și între diferite stadii de boală, urmând design-ul studiilor proteomice clasice de
tip Fishing Expedition proiectate în vederea investigării de proteine specifice, într-o primă etapă a
fost realizat un screening proteic utilizând spectrometria de masă de tip SELDI-ToF MS.
Pornind de la rezultatele screening-ului proteic, spectrul de molecule supus analizei a fost
extins, coroborând în acest sens și datele existente în literatura de specialitate care vizează
patologia nefrologică. Moleculele identificate prin spectrometrie de masă, împreună cu alte
potențiale molecule relevante pentru boala renală, au fost analizate și cuantificate utilizând
tehnologia de multiplexare Luminex xMAP array și metoda ELISA. Ulterior au fost analizate
posibilele interconexiuni funcționale între aceste molecule, atât între lotul de pacienți cu BRC
și lotul control, cât și între loturile distincte de pacienți aflați în stadii diferite de boală.
Obiectivele studiului:
Identificarea de molecule cu rol potențial în fiziopatologia BRC, în diferite stadii,
bazat pe analiză spectrometrică de masă de tip SELD-ToF MS;
Evaluarea profilului inflamator și de demineralizare osoasă în BRC, bazat pe
tehnologia de multiplexare xMAP array și metoda ELISA;
Explorarea potențialelor asocieri și covariații ale moleculelor identificate și
cuantificate, cu expresie semnificativă în BRC, în vederea selectării unui panel de
molecule reprezentativ.
Material și metodă
Lotul de pacienți. În studiu au fost incluși 106 indivizi - 86 de pacienți internați în Clinica de
Nefrologie, Institutul Clinic Fundeni, București și diagnosticați cu BRC în conformitate cu
criteriile KDIGO (28% femei și 72% bărbați, cu vârsta medie de 65 de ani), nesupuși dializei:
20 de pacienți cu BRC stadiul 4; 52 de pacienți cu BRC stadiul 3; 14 pacienți cu BRC stadiul
2; studiul a inclus și 20 de martori sănătoși. Au fost colectate datele clinice, antropometrice și
rezultatele testelor uzuale de laborator ale pacienților. Estimarea ratei de filtrare glomerulară
(eGFR) a fost calculată pe baza formulei CKD-EPI, în conformitate cu ghidurile curente
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
8
KDIGO. Probele de sange (ser) au fost recoltate a jeun și apoi stocate la -80°C până la
momentul analizei.
Metode utilizate:
- Tehnologia SELDI-ToF MS Proteinchip pentru screening-ul potențialilor biomarkeri serici;
- Tehnologia de multiplexare Luminex xMAP array pentru evaluarea cantitativă a
biomarkerilor-candidați serici, relevanți pentru pacientul renal și kit-urile:
- Milliplex MAP Human Bone Magnetic Bead Panel, (Merck-Millipore, Billerica,
MA, USA), cu următoarele molecule: citokine pro-inflamatorii - IL-6, TNF-α;
markeri asociați metabolismului mineral și osos - Osteoprotegerin (OPG),
Osteopontin (OPN), Osteocalcin (OCN) și Factorul de creștere a fibroblastelor-23
(FGF-23).
- kitul Milliplex MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel, (Merck-
Millipore, Billerica, MA, USA), cu următoarii mediatori ai răspunsului inflamator:
IL-1β, IL-4, IL-8, IL-10, MIP-1α.
- Tehnica ELISA cantitativă pentru determinarea nivelului seric al Fetuin-A.
Rezultate
Caracterizarea prin spectrometrie de masă de tip SELDI-ToF MS a profilului proteic
S-au identificat 78 de clustere (proteine) serice la pacienți cu BRC versus control
dintre care, în intervalul de masă moleculară 20.000 – 40.000 Da, s-au selectat 5 clustere cu
cea mai bună putere de clasificare între loturile de pacienți în stadiile 2-4 și lotul control
(valori ROC cuprinse între 0,83-0,89). Selecția potențialelor molecule relevante pentru
fiziopatologia BRC s-a axat pe identificarea spectrelor ale căror niveluri de expresie să difere
semnificativ de la un lot la altul și s-a utilizat analiza software Protein Chip DATA Manager,
bazată pe algoritmi capabili să grupeze pick-uri de proteine cu greutate moleculară similară,
prezente în probele aparținând aceluiași lot. Valorile p și curbele ROC au fost utilizate pentru
a dezvălui relevanța statistică pentru markerii individuali. Apelând la baze de date precum
UniProt, ExPASy, au fost identificate proteine specifice aferente maselor moleculare
determinate prin analiza spectrometrică, urmând a fi luate în analiză.
Având în vedere rezultatele obținute în urma screening-ului prin SELDI-ToF MS,
acest studiu a urmărit în continuare analiza și cuantificarea unor molecule implicate în
mecanismele care stau la baza fiziopatologiei BRC. Utilizând tehnologia de multiplexare
Luminex xMAP array, spectrul de analiză proteomică a fost extins în două direcții majore de
cercetare:
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
9
evaluarea unor mediatori importanți în orchestrarea răspunsului inflamator, respectiv
citokine pro-inflamatorii (IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, MIP-1α și TNF-α);
analiza și cuantificarea unui panel de molecule implicate în metabolismul mineral și
osos (OPG, OPN, OCN și FGF-23). Pentru cuantificarea nivelului de expresie serică a
moleculei Fetuin-A a fost utilizată metoda ELISA.
Statusul inflamator şi BRC
În urma analizei de multiplexare xMAP array, mediatorii răspunsului inflamator IL-6
și TNF-α au prezentat niveluri serice crescute, relevante din punct de vedere statistic, la
pacienții cu BRC în comparație cu lotul martor (p<0,001). IL-6 a prezentat cel mai ridicat
nivel de expresie serică la grupul de pacienți cu BRC stadiul 4 (p<0,001), concentrația medie
în acest lot de pacienți fiind de 11 ori mai mare decât media concentrațiilor din lotul control
(Figura 1 - a, b). TNF-α a prezentat, de asemenea, un nivel seric crescut, concentrația medie
fiind de 3,6 ori mai mare (p<0,001) la lotul de pacienți cu BRC stadiul 4 (Figura 1 - c, d).
a
b
c d
Figura 1. Nivelul de expresie serică pentru IL-6 (a, b) și TNF-α (c, d) în grupul pacienților
cu BRC versus control, precum și expresia diferențiată în funcție de stadiile BRC, utilizând
analiza Luminex xMAP array (Mihai et al., 2016)
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
10
Creșterea nivelului seric al IL-6 și TNF-α în BRC concordă cu rezultatele altor studii
recente care menționează un trend uniform în creșterea nivelului markerilor pro-inflamatori și
progresia bolii renale. Inflamaţia reprezintă o marcă reprezentativă a BRC, iar gradul în care
procesul inflamator este asociat cu stadiul bolii rămâne încă neelucidat. Studii recente au
evidentiat niveluri crescute ale citokinelor pro-inflamatorii IL-6 şi TNF-α la pacienţii cu
disfuncţii renale, fiind corelat și cu evoluţia şi complicaţiile BRC, respectiv bolile
cardiovasculare (Abraham et al., 2015, Hénaut et al., 2015). Spoto și colab. au relevat că
procesul inflamator este asociat cu insuficiența renală, cu nivele crescute ale IL-6 doar în
stadiile inițiale ale BRC; însă studiul acestora a arătat o corelație negativă între nivelul TNF-α
și eGFR, indicând diferențe în dinamica relației dintre cele două citokine (Spoto et al., 2012).
Analiza xMAP a celorlalți markeri inflamatori a indicat că nivelul seric al citokinelor
IL-8, IL-10, IL-1β și MIP-1α a prezentat un nivel de expresie serică diferit la pacienții cu
BRC versus control, dar și în funcție de stadiul bolii (Figura 2).
Expresia citokinei IL-10 în relație cu dezvoltarea și progresia BRC a fost abordată de
mai multe studii din literatură, Yilmaz M.I. și colab. raportând un nivel crescut al IL-10, IL-6
și al Proteinei C-reactive în rândul pacienților cu funcție renală scăzută (eGFR scăzut); un
nivel seric crescut al IL-10 a fost asociat cu riscul de evenimente cardiovasculare în timpul
monitorizării pacienților, speculând că nivelurile mai mari de IL-10 în acest context semnifică
un millieu pro-inflamator general (Yilmaz et al., 2014).
Pe de altă parte, eliberarea de interleukină IL-1β în contextul activării inflamazomului
este considerată un element central al multor forme de inflamație, având un potențial rol în
promovarea dezvoltării și evoluției bolii renale diabetice (Lei et al., 2019). . Nu în ultimul
rând, există studii care, la pacienții cu diverse forme de glomerulonefrită sau în boala
tubulointerstitială progresivă, au descris un nivel crescut al MIP-1α, alături de alte
citokine/chemokine, (Chung and Lan, 2011).
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
11
Figura 2. Raportul nivelului de expresie (fold-change) al MIP-1α, IL-8, IL-10, IL-1β în
stadiile 2-4 de BRC față de lotul control
Markeri asociați metabolismului mineral și osos în BRC
Analiza multiplex xMAP array a relevat, în BRC versus control, creșteri semificative statistic
ale expresiei serice ale osteoprotegerinei (OPG), osteopontinei (OPN), osteocalcinei (OCN) și
a factorului de creștere a fibroblastelor-23 (FGF-23) (Figura 3).
P a c i e n t i C o n t r o l
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
O P G
pg
/mL
P a c i e n t i C o n t r o l
0
2 0 0 0 0
4 0 0 0 0
6 0 0 0 0
8 0 0 0 0
O C N
pg
/mL
P a c i e n t i C o n t r o l
0
2 0 0 0 0
4 0 0 0 0
6 0 0 0 0
8 0 0 0 0
O P N
pg
/mL
P a c i e n t i C o n t r o l
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
F G F - 2 3
pg
/m
L
Figura 3. Nivelul de expresie serică al OPG, OCN, OPN și FGF-23 în grupul pacientilor cu
BRC versus control
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
MIP-1a IL-8 IL-10 IL-1b
Rap
ort
niv
el e
xpre
sie
se
rică
BRC std 4/ctrl
BRC std 3/ctrl
BRC std 2/ctrl
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
12
Dintre moleculele implicate în procesul de calcificare vasculară, Fetuin-A are un rol inhibitor,
pacienții cu BRC având o deficiență a nivelului circulant al acestui marker, așa cum a rezultat
în urma dozării sale prin metoda ELISA.
Evaluarea markerilor asociați metabolismului mineral și osos în diferite stadii ale BRC este
prezentată în Figura 4.
Figura 4. Nivelul seric mediu al biomarkerilor evaluați în BRC stadiile 4, 3 si 2 versus
control ( Mihai et al., 2016).
Analiza corelațiilor dintre mediatorii inflamației și markerii metabolismului mineral și
osos selectați, în relație cu stadiile BRC s-a realizat pe două direcții distincte:
corelațiile dintre moleculele analizate, pentru fiecare stadiu de BRC, în vederea stabilirii
tendințelor similare de variație de expresie serică, pentru selectarea de potențiali markeri
utili în stratificarea pacienților renali;
corelațiile dintre mediatorii inflamației, markerii metabolismului mineral și osos și
gradul de alterare a funcției renale, în vederea stabilirii de potențiali markeri revevanți
în stabilirea gradului de severitate a BRC.
Evaluarea profilului inflamator și a markerilor asociați metabolismlui mineral și osos în BRC
a indicat corelații semnificative statistic între IL-6, FGF-23, TNF-α, OCN, OPN, Fetuin-A și
gradul de disfuncție renală (eGFR) în grupul de pacienți cu BRC stadiile 2-4. (Tabelul 1)
Concluzii
În urma acestui studiu au fost selectate molecule apartinand mediatorilor inflamatiei dar si
markeri ai metabolismlui mineral și osos care au prezentat un nivel de expresie semnificativ
diferențiat în cazul BRC versus control, iar acest panel de molecule a făcut obiectul studiilor
ulterioare, în vederea design-ului unei semnături proteice specifice pacientului renal, aflat în
diferite stadii de BRC.
13
Tabelul 1. Corelații (χ2-test) între citokinele pro-inflamatorii, markerii implicați în metabolismul mineral și osos și gradul de alterare a funcției renale
(eGFR) în BRC stadiile 4, 3 si 2 (nedializați)
χ2-test
IL-6
TNF-α OPN OPG OCN FGF-23 Fetuin-A
<6 ≥6 <5 ≥5 <6000 ≥6000 <400 ≥400 <12000 ≥12000 <35 ≥35 <400 ≥400
Sex M 31 31 p=0,16 χ
2=1,9
39 23 p=0.29 X2=1.1
13 49 p=0.65 X2=0.2
10 52 p=0.17 X2=1.85
21 41 p=0.75 X2=0.1
20 42 p=0.29 X2=1.09
13 49 p=0.65 X2=0.2
F 8 16 18 6 4 20 7 17 9 15 5 19 4 20
Vârstă <60 10 12 p=0,99 χ2=0,0001
12 10 p=0.18 X2=1.8
7 15 p=0.09 X2=2.7
7 15 p=0.09 X2=2.7
9 13 p=0.5 X2=0.5
4 18 p=0.19 X2=1.7
7 15 p=0.09 X2=2.7
≥60 29 35 45 19 10 54 10 54 21 43 21 43 10 54
eGFR <60 27 47 P<0,001 X2=16,8
46 28 p=0.04 X2=4.02
12 62 p=0.04 X2=4.2
14 60 p=0.6 X2=0.2
22 52 p=0.01 X2=6.2
15 59 P<0.001 X2=19.9
17 64 p=0.07 X2=3.08
≥60 12 0 11 1 5 7 3 9 8 4 10 2 0 12
IL-6 <6 32 7 p<0.005 X2=7.9
12 27 p<0.02 X2=5.4
13 26 p=0.004 X2=8.28
18 21 p=0.04 X2=4
16 23 p=0.02 X2=5
7 32 p=0.7 X2=0.2
≥6 25 22 5 42 4 43 12 35 9 38 10 37
TNF-α <5 19 38 p=0.03 X2=4.6
15 42 p=0.03 X2=4.6
22 35 p=0.3 X2=1.02
22 35 p=0.006 X2=7.4
7 50 p=0.01 X2=5.9
≥5 3 26 2 27 8 21 3 26 10 19
OPN <6000 6 11 p=0.07 X2=3.2
10 7 p=0.02 X2=5.3
6 11 p=0.52 X2=0.39
3 14 p=0.8 X2=0.06
≥6000 11 58 20 49 19 50 14 55
OPG <400 9 8 p=0.08 X2=3.04
4 13 p=0.57 X2=0.3
4 13 p=0.66 X2=0.2
≥400 21 48 21 48 13 56
OCN <12000 14 16 p=0.008 X2=6.9
6 24 p=0.96 X2=0.001
≥12000 11 45 11 45
FGF-23 <35 2 23 p=0.07 X2=3.07
≥35 15 46
Fetuin-A <400
≥400
14
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
II. Profil proteomic al BRC bazat pe analiza dot-blot Proteome Profiler și
Luminex xMAP array, diferențiat în funcție de gradul de severitate al
bolii renale
Pornind de la faptul că o expresie crescută a citokinelor pro-inflamatorii serice reflectă
prezența procesului inflamator, iar un nivel alterat al moleculelor implicate în metabolismul
mineral și osos reflectă posibile demineralizări osoase și calcificări extraosoase vasculare, în
acest studiu s-a urmărit evaluarea profilului circulator de citokine asociat inflamației și
metabolismului mineral și osos, pe loturi de pacienți în stadiile 2-4 de BRC, comparativ cu
lotul martor.
Obiectivele studiului:
Stabilirea de semnături proteice unice, utilizând tehnologia proteomică multianalit de
imunodetecție semicantitativă, de tip dot-blot și compararea profilului circulant al
pacienților din loturi aparținând diferitelor stadii de BRC versus control;
Identificarea de paneluri de citokine al căror nivel de expresie serică diferă
semnificativ între loturile cu BRC și lotul control, precum și între diferite loturi care
corespund unor stadii diferite de boală renală;
Selectarea unui panel de markeri serici care prezintă potențialul de a discrimina
pacientul renal aflat într-un stadiu precoce al bolii față de control.
Material și metodă
Lotul de pacienți. În acest studiu de tip transversal (cross-sectional) au fost incluși 56 de
pacienți (care, conform criteriilor KDIGO, au fost diagnosticați cu boală renală cronică) 20 de
controale normale. Pacienții cu BRC au fost împărțiți în trei loturi, corespunzând stadiilor 2, 3
si 4 de boală renală. Pentru a evita potențiale rezultate fals pozitive/negative care ar putea
interfera cu acuratețea determinărilor calcitriolului și a celorlalți markeri serici, din acest
studiu au fost excluși în primul rând pacienții supuși tratamentului cu analogi sintetici de
vitamina D. Lotul control a fost selectat astfel încât să prezinte aceeași distribuție a vârstei și
sexului, într-un mod similar loturilor de pacienți cu BRC. S-au colectat datele clinice și
antropometrice ale pacienților luați în studiu. eGFR a fost calculat pe baza ecuației EPI
(coroborare BRC – date epidemiologice), iar albuminuria a fost determinată din probe de
urină de 24 de ore.
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
15
Material și metodă
- Screening-ul proteomic al serurilor provenite de la pacienții cu BRC (imunodetecția
semicantitivă simultană a proteinelor serice - citokine, chemokine, factori de creștere, markeri
de angiogeneză și alte proteine solubile) s-a realizat prin tehnica dot-blot cu kitul Proteome
Profiler Human XL Cytokine Array (ARY022B, R&D Systems, Inc., Abingdon, Marea
Britanie).
- Tehnologia de multiplexare xMAP array a fost utilizată pentru cuantificarea simultană,
din serurile pacienților cu BRC stadiile 2-4 și serurile control, a unui panel de molecule
(citokine și moleculele implicate în metabolismul mineral și osos) cu rol în fiziopatologia
BRC, folosind kitul multiplex MILLIPLEX MAP Human Bone Magnetic Bead Panel (Merck-
Millipore, Billerica, MA, SUA).
- Determinarea expresiei serice a Dkk-1 (Dickkopf-related protein-1) și a calcitriolului
(1,25OH2D3) s-a realizat utilizând metoda ELISA cantitativă.
Rezultate
Semnătura proteică a BRC și a diferitelor stadii ale bolii, prin screening de tip dot-blot
La evaluarea dot-blot, expresia proteică pentru fiecare dintre cele 4 pool-uri de seruri,
corespunzând celor 4 membrane de nitroceluloză, a fost testată prin analiza densitometrică,
așa cum este relevat în Figura 5, iar spot-urile marcate au prezentat diferențe de intensitate a
semnalului între membranele ce corespund loturilor diferite de pacienți cu BRC, precum și
față de lotul control.
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
16
Figura 5. Membranele dot-blot corespunzând diferitelor stadii ale BRC și controlului (4 pool-
uri de seruri). Moleculele care au prezentat modificări semnificative față de control și au făcut
obiectul testărilor ulterioare au fost marcate în consecință.
Dintre cele 105 molecule analizate pe kitul Proteome Profiler, pentru fiecare lot în
parte, 24 de molecule au fost relevante, prezentând un nivel de expresie semnificativ crescut
la pacienții cu BRC versus control, precum și pentru diferitele stdii de boală renală (Figura 6).
Printre proteinele care au prezentat un nivel de expresie semnificativă în comparație cu
controlul au fost identificați mediatori ai răspunsului inflamator, reflectând importanța
componentei inflamatorii în fiziopatologia BRC, precum și markeri ai metabolismului mineral
și osos, reflectând rolul axei os - rinichi - sistem cardiovascular. Dintre mediatorii inflamației,
IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IFN-Ɣ, RANTES, RAGE, ICAM-1, IP-10, PAI-1, PDGF, Proteina
C-reactivă și alte molecule au fost identificate ca fiind importante în realizarea semnăturii
proteice a BRC. Așa cum subliniază studiile științifice din literatura de specialitate, un status
inflamator persistent, de intensitate scăzută, reprezintă o caracteristică ce însoțește BRC încă
din stadiile timpurii, iar mediatorii inflamației Proteina C-reactivă și IL-6 sunt cunoscuți ca
predictori independenți ai unui prognostic nefavorabil în BRC (Mihai et al., 2018b).
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
17
Figura 6. Profilul proteinelor serice în stadiile 2-4 ale BRC față de control. Moleculele au
prezentat un trend crescător de expresie, în funcție de severitatea bolii; Dkk-1 și vit. D BP au
prezentat o tendință descendentă, pe măsura progresiei bolii.
Screening-ul dot-blot din studiul efectuat în cadrul tezei a relevat ca mediatorii
consacrați ai inflamației - IL-6, IL-8, IL-12, Proteina C-reactivă și markeri ai metabolismului
mineral și osos – vitamina D (BP), Osteocalcin (OCN), Dkk-1 sunt importanți în constituirea
profilului proteic al bolnavului renal, într-un stadiu al bolii în care simptomatologia clinică nu
este manifestă; pe de alta parte, nivelul de expresie al acestor molecule este semnificativ
modulat (crescut/scăzut), în funcție de stadiul BRC. Având în vedere aceste observatii și
rezultatele analizei statistice, au fost selectate următoarele molecule pentru conturarea unui
panel de biomarkeri relevanți pentru pacientul cu BRC:
Mediatori ai inflamației: IL-6, TNF-α
Vitamina D activă – calcitriol
Mediatori ai metabolismului mineral și osos: Dkk-1 (Dickkopf-related protein-1),
Osteoprotegerin (OPG), Osteocalcin (OCN), Osteopontin (OPN), Factorul de
creștere a fibroblastului-23 (FGF-23).
Cuantificarea prin ELISA a Dkk-1 și calcitriolului si analiza în funcție de severitatea
BCR, a relevat scăderea acestor markeri proporțional cu stadiul bolii (Figura 7).
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
18
Figura 7. Nivelul de expresie serică a Dkk-1 (fold-change) si calcitriolului (fold-change) în BRC
stadiile 4, 3 și 2 față de control, evaluate prin tehnica ELISA.
Scăderea semnificativă înregistrată la lotul BRC stadiul 4, recomandă aceaste
molecule ca având potențial în diferențierea gradului de severitate al bolii, corelându-se cu
riscul crescut de complicații la pacientul renal aflat într-un stadiu avansat de boală.
Cuantificarea simultană, pe platforma de multiplexare Luminex 200, a moleculelor din
orchestrarea răspunsului inflamator ( IL-6 și TNFα) și a celor cu implicații în metabolismul mineral
și osos (OPG, OCN, OPN și FGF-23) a indicat că nivelul de expresie serică al acestora crește la
pacienții din diferitele stadii de BRC comparativ cu lotul control.
Corelațiile între markerii asociați inflamației și cei asociați metabolismului
mineral și osos în BRC, obținute prin aplicarea testului Chi-square test/ χ2-test (χ2, P), au
relevat următoarele:
- tendința de variație a expresiei serice a markerilor analizați cu stadiul BRC;
- asocieri statistice între Dkk-1 și calcitriol, citokinele pro-inflamatorii și funcția renală, în
diferite stadii ale BRC.
S-au obținut corelații semnificativ statistice între Dkk-1 și calcitriol (χ2 = 21.4, P < 0,001) și între
nivelul seric al Dkk-1 și mediatorii inflamației IL-6 (χ2 = 13,7, P <0,001) și TNF-α (χ2 = 10,4, P =
0,001), precum și cu markerul osos FGF-23 (χ2 = 10 , P = 0,001). Nivelul de expresie serică a
calcitriolului la pacienții cu BRC a fost corelat semnificativ statistic cu IL-6 (χ2 = 4.4, P <0.05) și
FGF-23 (χ2 = 5.5, P = 0.01). A fost observată o corelație puternică între eGFR și Dkk-1 (χ2 = 8,48,
P <0,01) și calcitriol (χ2 = 8,36, P <0,01), indicând potențialul crescut pentru aceste două molecule
în ceea ce privește evaluarea severității bolii renale.
Testele de corelatie Spearman au identificat corelațiile cu semnificație statistică între moleculele
analizate și diversele stadii de BRC. Pentru subiecții aparținând stadiului 4 BRC, în urma aplicării
testului statistic, s-au obținut corelații semnificative între TNF-α și Dkk-1 (r = 0,50, p <0,05), OPG
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
19
(r = 0,58, p <0,02) și OPN (r = 0,66, p = 0,01), iar pentru pacienții apartinând stadiului 3 al BRC au
fost evidențiate corelații între TNF-α și OPG (r = 0,60, p = 0,001) și FGF-23 (r = 0,57, p <0,01). Pe
de altă parte, în cazul lotului de pacienți aparținând stadiului 2 al BRC a fost observată o corelație
negativă puternică între Dkk-1 și FGF-23 (r = −0,84, p <0,001) și corelații moderate între calcitriol
și IL-6 (r = 0,53, p <0,05), TNFα (r = 0,58, p <0,05), OPG (r = 0,71, p <0,05) și FGF-23 (r = 0,52 , p
<0,05). (Tabelul 2 – a, b, c)
Tabelul 2. Teste de corelație Spearman (p-value) între moleculele analizate în BRC stadiile 2-4.
a. BRC stadiul 4
std. 4 p-value
IL-6
TNF-a
OPG
OC
OPN
FGF-23
Fetuin-A
Dkk-1
Calcitriol
eGFR
IL-6 0.78 0.13 0.28 0.28 0.49 0.14 0.73 0.33 0.85
TNF-a 0.78 0.02 0.16 0.01 0.19 0.11 0.05 0.53 0.53
OPG 0.13 0.02 0.29 0.05 0.27 0.02 0.93 0.92 0.44
OC 0.28 0.16 0.29 0.15 0.09 0.13 0.32 0.31 0.09
OPN 0.28 0.01 0.05 0.15 0.79 0.01 0.91 0.53 0.55
FGF-23 0.49 0.19 0.27 0.09 0.79 0.36 0.33 0.83 0.34
Fetuin-A 0.14 0.11 0.02 0.13 0.01 0.36 0.90 0.34 0.99
Dkk-1 0.73 0.05 0.93 0.32 0.91 0.33 0.90 0.37 0.22
Calcitriol 0.33 0.53 0.92 0.31 0.53 0.83 0.34 0.37 0.21
eGFR 0.85 0.53 0.44 0.09 0.55 0.34 0.99 0.22 0.21
b. BRC stadiul 3 std. 3
p-value
IL-6
TNF-a
OPG
OC
OPN
FGF-23
Fetuin-A
Dkk-1
Calcitriol
eGFR
IL-6 0.95 0.31 0.05 0.26 0.69 0.32 0.99 0.05 0.59
TNF-a 0.95 0.00 0.90 0.02 0.00 0.38 0.20 0.51 0.31
OPG 0.31 0.00 0.67 0.06 0.07 0.01 1.00 0.56 0.92
OC 0.05 0.90 0.67 0.94 0.66 0.98 0.91 0.42 0.35
OPN 0.26 0.02 0.06 0.94 0.43 0.25 0.84 0.91 0.23
FGF-23 0.69 0.00 0.07 0.66 0.43 0.21 0.86 0.68 0.17
Fetuin-A 0.32 0.38 0.01 0.98 0.25 0.21 0.78 0.90 0.23
Dkk-1 0.99 0.20 1.00 0.91 0.84 0.86 0.78 0.33 0.68
Calcitriol 0.05 0.51 0.56 0.42 0.91 0.68 0.90 0.33 0.14
eGFR 0.59 0.31 0.92 0.35 0.23 0.17 0.23 0.68 0.14
c. BRC stadiul 2 std. 2
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
20
p-value IL-6
TNF-a OPG OC OPN FGF-23 Fetuin-A Dkk-1 Calcitriol eGFR
IL-6 0.03 0.02 0.82 0.82 0.95 0.06 0.78 0.05 0.55
TNF-a 0.03 0.23 0.27 0.60 0.68 0.19 0.72 0.03 0.24
OPG 0.02 0.23 0.82 0.55 0.91 0.08 0.40 0.00 0.76
OC 0.82 0.27 0.82 0.91 0.60 0.13 0.31 0.39 0.23
OPN 0.82 0.60 0.55 0.91 0.83 0.16 0.96 0.96 0.25
FGF-23 0.95 0.68 0.91 0.60 0.83 0.59 0.00 0.05 0.58
Fetuin-A 0.06 0.19 0.08 0.13 0.16 0.59 0.24 0.04 0.37
Dkk-1 0.78 0.72 0.40 0.31 0.96 0.00 0.24 0.37 0.72
Calcitriol 0.05 0.03 0.00 0.39 0.96 0.05 0.04 0.37 0.93
eGFR 0.55 0.24 0.76 0.23 0.25 0.58 0.37 0.72 0.93
Aplicarea testului de analiză unidirecțională a varianței Kruskal-Wallis (Kruskal–Wallis one-
way analysis of variance) pentru evaluarea variației în nivelul de expresie serică pentru fiecare
moleculă în relație cu fiecare dintre stadiile 4, 3 si 2 de BRC a condus la următoarele rezultate:
- diferențe semnificative de variație în expresia circulantă a Dkk-1, calcitriol și eGFR la
pacienții cu BRC (P <0,0001);
- diferențe semnificative ale nivelurilor Dkk-1, calcitriol și eGFR între BRC stadiul 4 și
stadiul 3, între stadiile 4 și 2 și, respectiv, între stadiile 3 și 2 (P <0,0001), evidențiind
potențialul acestor doi markeri în evaluarea severității bolii;
- diferențe semnificative de variație în expresia IL-6 (P <0,0001) în functie de stadiul bolii.
Concluzii
- existența unei interacțiuni funcționale între markerii inflamației și markerii de mineralizare
osoasă în BRC, în funcție de severitatea bolii.
- moleculele Dkk-1 și calcitriol se corelează statistic semnificativ cu gradul de severitate al BRC,
având un trend circulator descendent pe măsura agravării bolii renale.
- existența unor corelații semnificative între Dkk-1, calcitriol și citokinele pro-inflamatorii,
începând cu stadiile incipiente ale BRC.
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
21
III. Corelații între markerii inflamatori și de demineralizare osoasă luați în
studiu și markerii paraclinici convenționali, la pacientul renal.
Selectarea unui panel de biomarkeri cu potențială relevanță clinică în
diagnosticul precoce, stratificarea și gradul de severitate al BRC
Investigarea corelațiilor între markerii evaluați, care prezintă o potențială relevanță în
BRC, și markerii convenționali de diagnostic și prognostic utilizați în mod current în clinică
reprezintă un pas important în extinderea spectrului de biomarkeri utilizați în screening-ul și
diagnosticul precoce al BRC. În cazul acestui studiu, am evaluat corelațiile dintre molecule
pentru fiecare stadiu de boală, în vederea identificării markerilor care se corelează cu
severitatea BRC și pentru a stabili pattern-uri de expresie specifice în funcție de stadiul bolii.
Obiectivele studiului:
Analiza corelațiilor dintre markerii selectați și markerii convenționali inflamatori de
fază acută (Proteina C-reactivă și fibrinogen), precum și parametrii biochimici
efectuați de rutină în clinică pentru diagnosticarea BRC (creatinină serică, eGFR, acid
uric seric și albuminurie).
Evaluarea interrelațiilor funcționale dintre moleculele analizate, prin abordarea bazei
de date STRING și selectarea unui panel de biomarkeri relevanți, util în diagnosticarea
precoce, stadializarea și severitatea BRC.
Material și metodă
Lotul de pacienți. Pentru realizarea acestui studiu, a fost luat în calcul lotul de pacienți cu
BRC care a fost descris la capitolul II, iar acest lot a fost constituit din 56 de pacienți,
diagnosticați cu boală renală cronică, conform criteriilor KDIGO; acești pacienți au fost
împărțiți în trei loturi, corespunzând stadiilor 2, 3 si 4 de boală renală, respectiv 28,6% stadiul
2 BRC, 46,4% stadiul 3 BRC, 25% stadiul 4 BRC.
Metode statistice pentru analiza corelațiilor dintre markerii selectați
- Analiza statistică și graficele aferente pentru acest studiu au fost realizate cu ajutorul
software-ului GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA).
- Evaluarea distribuției valorilor analiților luați în studiu, în cadrul celor 3 loturi de
pacienți cu BRC stadiile 2, 3 si 4, a fost realizată utilizând testul Kolmogorov-Smirnov.
- Coeficientul de corelație Spearman a fost aplicat în vederea evaluării corelației a două
variabile cantitative, cu distribuție non-normală, în cadrul aceluiași lot de pacienți, pentru
fiecare dintre cele 3 loturi de boală renală.
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
22
- Investigarea posibilelor interacțiuni dintre moleculele analizate și markerii convenționali
utilizați în mod curent în practica clinică pentru diagnosticul BRC, a fost realizată prin abordarea
bazei de date STRING.
Rezultate
Analiza corelațiilor dintre markerii selectați și cei convenționali inflamatori de fază
acută (Proteina C-reactivă și fibrinogen), precum și parametrii biochimici efectuați de
rutină în clinică pentru diagnosticarea BRC (creatinină serică, eGFR, acid uric seric și
albuminurie)
În cadrul studiului s-au evaluat corelațiile dintre molecule pentru fiecare stadiu de
boală, în vederea identificării markerilor care se aociază cu severitatea BRC și pentru a stabili
pattern-uri de expresie specifice în funcție de stadiul bolii. Corelațiile Spearman (p-value)
între moleculele analizate si stadiile BRC sunt prezentate în Tabelul 3 – a, b, c.
Tabelul 3. Corelații Spearman (p-value) între moleculele analizate pentru lotul de pacienți
aferent BRC stadiilor 2-4 (abrevieri: CAL – calcitriol, Fbg – fibrinogen, CRE – creatinină,
ALB – albuminurie, AU – acid uric, FA- Fetuin-A)
a. BRC stadiul 2 p-value
Spearman
BRC std. 2
IL-6
TNFa
OPG
OC
OPN
FGF23
Dkk
CAL
FA
eGFR
PCR
Fbg
CRE
ALB
AU
IL-6
(pg/mL)
0.03 0.02 0.82 0.07 0.95 0.78 0.05 0.06 0.14 0.16 0.00 0.00 0.27 0.26
TNFa (pg/mL) 0.03 0.23 0.27 0.14 0.68 0.72 0.03 0.19 0.42 0.83 0.07 0.03 0.19 0.21
OPG (pg/mL) 0.02 0.23 0.82 0.88 0.92 0.39 0.01 0.08 0.67 0.16 0.08 0.15 0.18 0.90
OC
(pg/mL)
0.82 0.27 0.82 0.45 0.61 0.31 0.39 0.13 0.82 0.67 0.68 0.82 0.19 0.04
OPN (pg/mL) 0.07 0.14 0.88 0.45 0.59 0.89 0.62 0.96 0.54 0.33 0.09 0.01 0.33 0.08
FGF23 (pg/mL) 0.95 0.68 0.92 0.61 0.59 0.00 0.06 0.59 0.63 1.00 0.92 0.75 0.75 0.69
Dkk-1 (pg/mL) 0.78 0.72 0.39 0.31 0.89 0.00 0.37 0.24 1.00 0.83 0.90 0.96 0.77 0.99
Calcitriol (pg/mL) 0.05 0.03 0.01 0.39 0.62 0.06 0.37 0.04 0.31 0.33 0.12 0.18 0.95 0.47
Fetuin-A (pg/mL) 0.06 0.19 0.08 0.13 0.96 0.59 0.24 0.04 0.51 0.50 0.02 0.16 0.85 0.36
eGFR 0.14 0.42 0.67 0.82 0.54 0.63 1.00 0.31 0.51 0.16 0.25 0.08 0.45 0.97
PCR (mg/dL) 0.16 0.83 0.16 0.67 0.33 1.00 0.83 0.33 0.50 0.16 0.16 0.16 0.66 0,66
Fbg (mg/dL) 0.00 0.07 0.08 0.68 0.09 0.92 0.90 0.12 0.02 0.25 0.16 0.00 0.45 0.15
CRE
(mg/dL)
0.00 0.03 0.15 0.82 0.01 0.75 0.96 0.18 0.16 0.08 0.16 0.00 0.58 0.21
ALB (mg/mmol) 0.27 0.19 0.18 0.19 0.33 0.75 0.77 0.95 0.85 0.45 0.66 0.45 0.58 0.02
AU
(mg/dL)
0.26 0.21 0.90 0.04 0.08 0.69 0.99 0.47 0.36 0.97 0.66 0.15 0.21 0.02
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
23
b. BRC stadiul 3 p-value
Spearman
BRC std. 3
IL-6
TNFa
OPG
OC
OPN
FGF23
Dkk
CAL
FA
eGFR
PCR
Fbg
CRE
ALB
AU
Il-6
(pg/mL)
0.94 0.31 0.05 0.26 0.69 0.99 0.05 0.32 0.59 0.08 0.78 0.93 0.86 0.30
TNFa
(pg/mL)
0.94 0.00 0.89 0.02 0.00 0.20 0.52 0.38 0.29 0.76 0.27 0.51 0.95 0.76
OPG
(pg/mL)
0.31 0.00 0.67 0.06 0.07 1.00 0.56 0.01 0.92 0.77 0.67 0.02 0.12 0.58
OC
(pg/mL)
0.05 0.89 0.67 0.94 0.66 0.91 0.42 0.98 0.35 0.79 0.13 0.23 0.92 0.04
OPN
(pg/mL)
0.26 0.02 0.06 0.94 0.43 0.84 0.91 0.25 0.23 1.00 0.06 0.53 0.71 0.54
FGF-23
(pg/mL)
0.69 0.00 0.07 0.66 0.43 0.86 0.68 0.21 0.17 0.53 0.60 0.79 0.53 0.64
Dkk-1
(pg/mL)
0.99 0.20 1.00 0.91 0.84 0.86 0.33 0.78 0.68 0.42 0.77 0.50 0.02 0.38
Calcitriol
(pg/mL)
0.05 0.52 0.56 0.42 0.91 0.68 0.33 0.90 0.14 0.23 0.23 0.96 0.85 0.64
Fetuina-A
(pg/mL)
0.32 0.38 0.01 0.98 0.25 0.21 0.78 0.90 0.23 0.15 0.61 0.76 0.48 0.26
eGFR 0.59 0.29 0.92 0.35 0.23 0.17 0.68 0.14 0.23 0.67 0.72 0.69 0.60 0.74
PCR
(mg/dL)
0.08 0.76 0.77 0.79 1.00 0.53 0.42 0.23 0.15 0.67 0.64 0.39 0.50 0.36
Fbg
(mg/dL)
0.78 0.27 0.67 0.13 0.06 0.60 0.77 0.23 0.61 0.72 0.64 0.93 0.74 0.28
CRE
(mg/dL)
0.93 0.51 0.02 0.23 0.53 0.79 0.50 0.96 0.76 0.69 0.39 0.93 0.34 0.01
ALB
(mg/mmol)
0.86 0.95 0.12 0.92 0.71 0.53 0.02 0.85 0.48 0.60 0.50 0.74 0.34 0.34
AU
(mg/dL)
0.30 0.76 0.58 0.04 0.54 0.64 0.38 0.64 0.26 0.74 0.36 0.28 0.01 0.34
c. BRC stadiul 4 p-value
Spearman
BRC std. 4
IL-6
TNFa
OPG
OC
OPN
FGF23
Dkk
CAL
FA
eGFR
PCR
Fbg
CRE
ALB
AU
IL-6
(pg/mL)
0.78 0.13 0.28 0.28 0.49 0.73 0.33 0.15 0.59 0.00 0.86 0.00 0.30 0.35
TNFa
(pg/mL)
0.78 0.02 0.16 0.01 0.19 0.06 0.53 0.11 0.19 0.20 0.14 0.24 0.74 0.21
OPG
(pg/mL)
0.13 0.02 0.29 0.05 0.26 0.93 0.93 0.03 0.53 0.05 0.86 0.30 0.50 0.97
OC
(pg/mL)
0.28 0.16 0.29 0.15 0.09 0.32 0.31 0.13 0.04 0.02 0.38 0.78 0.42 0.51
OPN
(pg/mL)
0.28 0.01 0.05 0.15 0.80 0.91 0.53 0.02 0.21 0.02 0.70 0.58 0.84 0.20
FGF23
(pg/mL)
0.49 0.19 0.26 0.09 0.80 0.33 0.83 0.36 0.11 0.42 0.01 0.43 0.88 0.46
Dkk-1
(pg/mL)
0.73 0.06 0.93 0.32 0.91 0.33 0.37 0.90 0.66 0.71 0.13 0.47 0.18 0.69
Calcitriol
(pg/mL)
0.33 0.53 0.93 0.31 0.53 0.83 0.37 0.34 0.87 0.99 0.88 0.20 1.00 0.34
Fetuina-A
(pg/mL)
0.15 0.11 0.03 0.13 0.02 0.36 0.90 0.34 0.86 0.04 0.66 0.33 0.49 0.67
eGFR 0.59 0.19 0.53 0.04 0.21 0.11 0.66 0.87 0.86 0.60 0.98 0.20 0.95 0.52
PCR
(mg/dL)
0.00 0.20 0.05 0.02 0.02 0.42 0.71 0.99 0.04 0.60 0.85 0.01 0.79 0.78
Fbg
(mg/dL)
0.86 0.14 0.86 0.38 0.70 0.01 0.13 0.88 0.66 0.98 0.85 0.78 0.46 0.69
CRE
(mg/dL)
0.00 0.24 0.30 0.78 0.58 0.43 0.47 0.20 0.33 0.20 0.01 0.78 0.55 0.34
ALB
(mg/mmol)
0.30 0.74 0.50 0.42 0.84 0.88 0.18 1.00 0.49 0.95 0.79 0.46 0.55 0.52
AU
(mg/dL)
0.35 0.21 0.97 0.51 0.20 0.46 0.69 0.34 0.67 0.52 0.78 0.69 0.34 0.52
Evaluarea interrelațiilor funcționale dintre moleculele analizate, prin abordarea bazei
de date STRING și selectarea unui panel de biomarkeri relevanți, utili în diagnosticarea
precoce, stadializarea și severitatea BRC
Având în vedere rezultatele obținute, pentru investigarea posibilelor interacțiuni dintre
moleculele analizate și markerii convenționali utilizați în mod curent în practica clinică pentru
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
24
diagnosticul BRC, a fost abordată baza de date STRING, care oferă analiza complexă a moleculelor
implicate în fiziopatologia BRC, printr-o abordare sistemică, prin integrarea tuturor informațiilor
existente; această bază oferă posibilitatea de a descoperi și de a obține o înțelegere aprofundată a
evenimentelor moleculare cheie care modulează patogeneza BRC. Existența corelațiilor
semnificative între markerii selectați și cei convenționali inflamatori de fază acută (Proteina C-
reactivă și fibrinogen), precum și parametrii biochimici efectuați de rutină în clinică pentru
diagnosticarea BRC (creatinină serică, eGFR, acid uric seric și albuminurie), sugerează un potențial
ridicat al noilor biomarkeri în managementul pacientului renal.
Figura 8. Interacțiuni funcționale între moleculele selectate - mediatori inflamatori, markeri de
demineralizare osoasă, markeri convenționali, precum și alte molecule cu potențiale implicații în
fiziopatologia BRC. Legenda figurii: Nodurile colorate sunt reprezentate de proteine cu potențial
de a fi biomarker-candidat și primul „shell”/prima linie de interacțiuni. Liniile dintre proteine
reprezintă asocieri funcționale proteină-proteină, atribuite cu coduri diferite de culoare, astfel: linia
albastră indică interacțiunile cunoscute din bazele de date explorate, linia roz indică interacțiuni
cunoscute, care au fost determinate prin studii experimentale, linia verde indică interacțiuni asociate
alterărilor genetice, linia roșie indică interacțiuni previzionate pentru fuziunile genice, linia indigo
indică interacțiuni previzionate pentru coexpresii genice, linia verde deschis indică alte interacțiuni
derivate din documentări din literatura de specialitate, iar linia neagră indică coexpresia genică,
derivată din alte baze de date.
Abrevieri: CYP24A1 – calcitriol, 1,25-dihydroxyvitam D3, 1,25OH2D3; SPP1 – osteopontin, OPN;
TNFRSF11B – osteoprotegerin, OPG; BGLAP – osteocalcin, OC; CXCL8 – IL-8, interleukin-8; GC
– vitamin D binding protein, DBP; VDR – vitamin D receptor, ITGA2B – fibrinogen, CRP –
Proteina C-reactivă.
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
25
Concluzii
- Asocierea între intensitatea variației nivelulului de expresie a mediatorilor inflamației,
a moleculelor implicate în metabolismul mineral și osos și gradul de afectare a funcției renale
sugerează o interrelație funcțională complexă între aceste molecule.
- În urma rezultatelor obținute în cadrul acestor studii, precum și pe baza studiilor
menționate în literatura de specialitate, se poate concluziona că un panel de
biomarkeri/biomarker multiplu, nu doar un singur biomarker, este necesar pentru a
diagnostica BRC, cu o sensibilitate și o specificitate ridicate, cât și pentru a identifica
pacienții cu un risc ridicat de progresie a bolii.
- Evaluarea nivelului de expresie a biomarkerilor și a corelațiilor dintre aceștia în
diferite stadii ale BRC sugerează existența unor pattern-uri de expresie diferențiate în funcție
de gradul de severitate al bolii renale.
Biomarkerii semnificativi pot fi configurați astfel într-un panel mai larg, care să cuprindă
markeri asociați inflamatiei – IL-6, TNF-α și markeri asociați metabolismului mineral și osos
– calcitriol, Dkk-1, OPG, OPN, OC, FGF-23 și Fetuin-A
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
26
CONCLUZII FINALE
Datele obținute în cadrul acestei teze de doctorat au condus la următoarele concluzii:
- Screening-ul proteic pentru identificarea unor molecule cu expresie diferită în BRC
comparativ cu lotul control și realizat prin spectrometrie de masă de tip SELDI-TOF
MS, a identificat 78 de clustere (proteine) serice din care, pe baza puterii de clasificare
pentru pacienții în stadiile 2-4 de boală, s-au selectat 5 clustere semnificative
(intervalul de masă moleculară 20.000 – 40.000 Da, valori ROC cuprinse între 0,83-
0,89). Prin coroborarea datelor obținute prin SELDI-ToF MS cu bazele de date
UniProt, ExPASy și cu literatura de specialitate, s-au selectat molecule implicate în
procesul inflamator și în metabolismul mineral și osos, procese care stau la baza
fiziopatologiei BRC.
- Evaluarea profilului inflamator și a markerilor asociați metabolismlui mineral și osos
în BRC (tehnologia Luminex xMAP array și metoda ELISA) a indicat corelații
pozitive, semnificative statistic, între IL-6, FGF-23, TNF-α, OCN, OPN, Fetuin-A și
gradul de disfuncție renală (eGFR) în grupul de pacienți cu BRC stadiile 2-4, aceste
molecule având un potențial important în stabilirea gradului de severitate a bolii -
corelații între eGFR și IL-6 (χ2= 16,8; P< 0.01), precum și între eGFR și FGF-23
(χ2=19,9; P<0,001; între eGFR și TNF-α (χ2=4,02; P=0,04), OPN (χ
2=4,2; P=0,04),
OCN (χ2=6,2; P=0,01) și Fetuin-A (χ
2=3,08; P=0,07).
- Screening-ul proteomic de tip dot-blot Proteome Profiler pentru 105 molecule
(citokine, chemokine, alte proteine solubile) pe pool-uri de seruri corespunzând
stadiilor 2, 3 și 4 de BRC, respectiv control, a identificat IL-6, IL-8, IL-12, IL-18,
IFN-Ɣ, RANTES, RAGE, ICAM-1, IP-10, PAI-1, PDGF și Proteina-C reactivă, ca
mediatori ai răspunsului inflamator în BRC.
- Dkk-1 și vitamina D (BP – binding protein) au prezentat, la screening-ul proteomic de
tip dot-blot Proteome Profiler, cel mai mare potențial de diferențiere la pacienții cu
BRC stadiul 4 versus control, având cea mai semnificativă scădere a nivelului seric (de
~1,5 ori, p <0,05), cu potențial în stabilirea gradului de severitate al bolii.
- Cuantificarea prin metoda ELISA a moleculelor Dkk-1 și calcitriol, a relevat o scădere
semnificativă a nivelului seric al acestora, pe măsura agravării BRC. Astfel, în BRC
stadiul 4 s-a înregistrat o scădere de 2,36 ori față de control (p<0,05) pentru Dkk-1,
respectiv 2,24 ori (p<0,05) pentru calcitriol.
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
27
- Aplicarea testului de analiză unidirecțională a varianței Kruskal-Wallis (Kruskal–Wallis one-
way analysis of variance) pentru evaluarea nivelului de expresie serică a moleculelor
analizate în functie de stadiile 2, 3 si 4 de BRC, a relevat diferențe semnificative în expresia
circulantă a Dkk-1, calcitriol și eGFR la pacienții cu BRC (P <0,0001); nivelul Dkk-1,
calcitriol și eGFR au fost semnificativ diferite între stadiile 2, 3 și 4 ale BRC (P <0,0001),
evidențiind potențialul acestor doi markeri în stadializarea și evaluarea severității bolii.
- Cuantificarea prin Luminex xMAP a moleculelor relevante pentru BRC (IL-6, TNF-α,
OPG, OPN, OCN, FGF-23) a indicat o creștere progresivă a nivelului seric a acestora,
începând cu stadiile incipiente ale bolii; astfel, în lotul de pacienți cu BRC stadiul 4, nivelul
circulator al acestor 6 molecule au prezentat cele mai semnificative diferențe în comparație
cu lotul control analizat (p<0,05).
- Analiza tendinței de variație a expresiei serice a markerilor analizați, prin aplicarea testelor
Chi-square test for trends și Chi-square/ χ2-test, a relevat corelații semnificative în funcție
de stadiul BRC, astfel:
- în BRC stadiul 4, a fost observată o corelație pozitivă puternică între Dkk-1 și
calcitriol, precum și o corelație semnificativ statistică negativă între Dkk-1 și
moleculele IL-6, OPG, OC, OPN și FGF-23 (P <0,001). În ceea ce privește gradul de
alterare a funcției renale, eGFR a fost corelat pozitiv cu Dkk-1 (P <0,001). Nivelul seric
al calcitriolului a fost corelat în mod semnificativ cu TNF-α (P <0,01, Chi-square test),
precum și cu markerii metabolismului mineral și osos - OC, OPN și FGF-23(P <0,01,
Chi-square test).
- în BRC stadiile 2 și 3, au fost obținute corelații semnificative, după cum urmează:
Dkk-1 și calcitriol în BRC stadiile 3 și 2 (P <0,001, Chi-square test for trends); Dkk-1 și
OPG, OPN și FGF-23 (P <0,001, Chi-square test for trends) în BRC stadiile 3 și 2;
calcitriol și TNF-α (P <0,01, Chi-square test for trends) în BRC stadiul 3; Dkk-1 și
OPG, FGF-23 în BRC stadiul 2 (P <0,001, Chi-square test for trends).
- Aplicarea testelor de corelație Spearman (r, p-value), pentru identificarea de potențiale
corelații cu semnificație statistică între moleculele analizate, pentru loturile de pacienți aflați
în diversele stadii de BRC, a relevat:
- în BRC stadiul 4, corelații semnificative au fost obținute între TNF-α și Dkk-1 (r =
0,50, p <0,05), OPG (r = 0,58, p <0,02) și OPN (r = 0,66, p = 0,01), precum și între
OPG și OPN (r = 0,51, p <0,05).
- în BRC stadiul 3, au fost evidențiate corelații între TNF-α și OPG (r = 0,6, p = 0,001),
FGF-23 (r = 0,57, p <0,01).
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
28
- în BRC stadiul 2, a fost stabilită o corelație negativă puternică între Dkk-1 și FGF-23
(r = −0,84, p <0,001), corelații moderate între calcitriol și IL-6 (r = 0,53, p <0,05),
TNFα (r = 0,58, p <0,05), OPG (r = 0,71, p <0,05) și FGF-23 (r = 0,52 , p <0,05), o
corelație moderată între IL-6 și OPG (r = 0,61, p = 0,01).
- Investigarea corelațiilor dintre moleculele analizate și markerii convenționali inflamatori de
fază acută (Proteina C-reactivă și fibrinogen), precum și parametrii biochimici efectuați de
rutină în clinică pentru diagnosticarea BRC (creatinină serică, eGFR, acid uric seric,
albuminurie), prin aplicarea testelor de corelație Spearman (r, p-value) a relevat:
- în BRC stadiul 4, corelații puternice au fost stabilite între IL-6 și PCR (r=0,74,
p=0,001), precum și între IL-6 și creatinina serică (r=0,87, p<0,001). Corelații
moderate au fost stabilite între OPN și PCR (r=0,60, p=0,02), precum și între PCR
și creatinină (r=0,47, p=0,01).
- în BRC stadiul 3, a fost stabilit un grad de asociere acceptabil între IL-6 și PCR
(r=0,55, p=0,08), între OPG și creatinină (r=0,43, p=0,02), între OC și acidul uric
(r=0,44, p=0,04), între OPN și fibrinogen (r=0,37, p=0,06).
- în BRC stadiul 2, corelații puternice au fost stabilite între IL-6 și fibrinogen
(r=0,97, p<0,01), IL-6 și creatinină (r=0,94, p<0,01), PCR și fibrinogen (r=0,94,
p=0,16), creatinină (r=0,94, p=0,16), albuminurie (r=0,86, p=0,66) și acidul uric
seric (r=0,86, p=0,66). O corelație puternică a fost stabilită între fibrinogen și
creatinină (r=0,90, p<0,01). De asemenea, un grad de asociere foarte bun a fost
stabilit între IL-6 și PCR (r=0,94, p=0,16), între OPG și PCR (r=0,94, p=0,16),
precum și între eGFR și PCR (r=-0,94, p=0,16). Aceste corelații sugerează
potențiale modulări reciproce, cu impact în progresia și gradul de severitate al
bolii renale.
- Analiza interrelațiilor funcționale dintre moleculele analizate, prin abordarea bazei de date
STRING, a indicat o interconexiune complexă între markerii selectați, cei convenționali de
fază acută și parametrii biochimici efectuați în clinica curentă, sugerând implicarea acestora
în fiziopatologia complexă a BRC și un potențial ridicat al acestor biomarkeri în conturarea
de pattern-uri de expresie diferențiată în funcție de gradul de severitate al bolii renale.
- Biomarkerii care au prezentat diferențe semnificative statistic, atât în lotul de pacienți cu
BRC versus control, cât și între loturile aparținând stadiilor diferite de boală renală, pot fi
configurați într-un panel care cuprinde mediatori ai inflamației – IL-6, TNF-α și biomarkeri
asociați metabolismului mineral și osos – calcitriol, Dkk-1, OPG, OPN, OC, FGF-23 și
Fetuin-A.
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
29
Bibliografie selectivă
2020. Global, regional, and national burden of chronic kidney disease, 1990-2017: a systematic analysis for
the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet, 395, 709-733.
Abraham, A. G., Darilay, A., Mckay, H., Margolick, J. B., Estrella, M. M., Palella, F. J., Jr., Bolan, R.,
Rinaldo, C. R. & Jacobson, L. P. (2015) Kidney Dysfunction and Markers of Inflammation in the
Multicenter AIDS Cohort Study. J Infect Dis, 212, 1100-10.
Aikawa, E., Aikawa, M., Libby, P., Figueiredo, J. L., Rusanescu, G., Iwamoto, Y., Fukuda, D., Kohler, R. H.,
Shi, G. P., Jaffer, F. A. & Weissleder, R. (2009) Arterial and aortic valve calcification abolished by
elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation, 119, 1785-94.
Chung, A. C. K. & Lan, H. Y. (2011) Chemokines in Renal Injury. Journal of the American Society of
Nephrology, 22, 802-809.
Dregan, A., Charlton, J., Chowienczyk, P. & Gulliford, M. C. (2014) Chronic inflammatory disorders and risk
of type 2 diabetes mellitus, coronary heart disease, and stroke: a population-based cohort study.
Circulation, 130, 837-44.
Fukagawa, M. & Komaba, H. (2017) Chronic Kidney Disease-Mineral and Bone Disorder in Asia. Kidney
Dis (Basel), 3, 1-7.
Gounden, V., Bhatt, H. & Jialal, I. (2020) Renal Function Tests. StatPearls. Treasure Island (FL).
Guarner, V. & Rubio-Ruiz, M. E. (2015) Low-grade systemic inflammation connects aging, metabolic
syndrome and cardiovascular disease. Interdiscip Top Gerontol, 40, 99-106.
Hénaut, L., Sanchez-Nino, M. D., Aldamiz-Echevarría Castillo, G., Sanz, A. B. & Ortiz, A. (2015) Targeting
local vascular and systemic consequences of inflammation on vascular and cardiac valve
calcification. Expert Opinion on Therapeutic Targets, 20, 89-105.
Inker, L. A., Astor, B. C., Fox, C. H., Isakova, T., Lash, J. P., Peralta, C. A., Kurella Tamura, M. & Feldman,
H. I. (2014) KDOQI US Commentary on the 2012 KDIGO Clinical Practice Guideline for the
Evaluation and Management of CKD. American Journal of Kidney Diseases, 63, 713-735.
Isakova, T., Nickolas, T. L., Denburg, M., Yarlagadda, S., Weiner, D. E., Gutierrez, O. M., Bansal, V., Rosas,
S. E., Nigwekar, S., Yee, J. & Kramer, H. (2017) KDOQI US Commentary on the 2017 KDIGO
Clinical Practice Guideline Update for the Diagnosis, Evaluation, Prevention, and Treatment of
Chronic Kidney Disease-Mineral and Bone Disorder (CKD-MBD). Am J Kidney Dis, 70, 737-751.
Lei, Y., Devarapu, S. K., Motrapu, M., Cohen, C. D., Lindenmeyer, M. T., Moll, S., Kumar, S. V. & Anders,
H.-J. (2019) Interleukin-1β Inhibition for Chronic Kidney Disease in Obese Mice With Type 2
Diabetes. Frontiers in Immunology, 10.
Mihai, S., Codrici, E., Popescu, I. D., Enciu, A. M., Albulescu, L., Necula, L. G., Mambet, C., Anton, G. &
Tanase, C. (2018) Inflammation-Related Mechanisms in Chronic Kidney Disease Prediction,
Progression, and Outcome. J Immunol Res, 2018, 2180373.
Mihai, S., Codrici, E., Popescu, I. D., Enciu, A. M., Rusu, E., Zilisteanu, D., Albulescu, R., Anton, G. &
Tanase, C. (2016) Proteomic Biomarkers Panel: New Insights in Chronic Kidney Disease. Dis
Markers, 2016, 3185232.
Pawelec, G., Goldeck, D. & Derhovanessian, E. (2014) Inflammation, ageing and chronic disease. Curr Opin
Immunol, 29, 23-8.
Pejchinovski, M. & Mischak, H. (2017) Clinical Proteomics in Kidney Disease: From Discovery to Clinical
Application. Prilozi, 38, 39-54.
Spoto, B., Leonardis, D., Parlongo, R. M., Pizzini, P., Pisano, A., Cutrupi, S., Testa, A., Tripepi, G., Zoccali, C.
& Mallamaci, F. (2012) Plasma cytokines, glomerular filtration rate and adipose tissue cytokines
gene expression in chronic kidney disease (CKD) patients. Nutr Metab Cardiovasc Dis, 22, 981-8.
Yilmaz, M. I., Solak, Y., Saglam, M., Cayci, T., Acikel, C., Unal, H. U., Eyileten, T., Oguz, Y., Sari, S.,
Carrero, J. J., Stenvinkel, P., Covic, A. & Kanbay, M. (2014) The relationship between IL-10 levels
and cardiovascular events in patients with CKD. Clin J Am Soc Nephrol, 9, 1207-16.
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
30
LISTA DE LUCRĂRI ȘTIINȚIFICE PUBLICATE
(selecție)
LUCRĂRI PUBLICATE PE TEMATICA TEZEI
Articole publicate în jurnale ISI:
1. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Rusu E, Zilisteanu D, Necula LG, Anton
G, Tanase C, Inflammation-Related Patterns in the Clinical Staging and Severity
Assessment of Chronic Kidney Disease, Disease Markers; Article ID:1814304, 2019,
doi: 10.1155/2019/1814304, IF=2,738 (Research Article).
- Articol premiat UEFISCDI - Premierea rezultatelor cercetării PN-III-P1-1.1-
PRECISI-2019- 39736.
2. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM , Rusu E, Zilisteanu D, Albulescu R,
Anton G, Tanase C, Proteomic Biomarkers Panel: New Insights in Chronic Kidney
Disease, Disease Markers, Article ID 3185232, 2016, doi.org/10.1155/2016/3185232,
IF=2,738 (Research Article).
- Articol premiat UEFISCDI - Premierea rezultatelor cercetării PN-III-P1-1.1-
PRECISI-2016-12780.
3. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Albulescu L, Necula LG, Mambet C,
Anton G, and Tanase C, Inflammation-Related Mechanisms in Chronic Kidney
Disease Prediction, Progression, and Outcome, Journal of Immunology Research, ID
2180373, 2018, doi: 10.1155/2018/2180373, IF= 3,327 (Review Article).
- Articol premiat UEFISCDI - Premierea rezultatelor cercetării PN-III-P1-1.1-
PRECISI-2018- 27561.
Capitol de carte:
1. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Necula LG, Anton G, and Tanase
C, Inflammation and Chronic Kidney Disease: Current Approaches and Recent
Advances, Chronic Kidney Disease - from Pathophysiology to Clinical
Improvements, IntechOpen, Chapter 6131-151, ISBN 978-953-51-3844-0, 2018
(Book Chapter).
Studii/rezumate în jurnale ISI:
1. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Albulescu L, Albulescu R, Anton G, Adi
Lupu M, Tanase C, Cytokine Patterns in Chronic Kidney Disease-Mineral and Bone
Disorders, FEBS Open Bio, Volume: 9, Pages: 407-40, Supplement: 1 Meeting
Abstract: P-39-016, Published: JUL 2019.
2. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Albulescu R, Codorean E, Rusu E,
Zilisteanu D, Anton G, Tanase C, Protein profiling in chronic kidney disease assessed
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
31
by high-throughput technologies, The FEBS Journal 284 (Suppl. 1) 135,
doi:10.1111/febs.14174, 2017.
3. Rusu EE, Rosca M, Calin A, Mihai S, Atasie T, Balanica S, Neatu A, Zilisteanu D,
Serum fetuin-A and osteoprotegerin are correlated with left atrial size and function
in patients with chronic kidney disease, Nephrology Dialysis Transplantation,
2016/5/1, IF=4.085, Vol 31, suppl 1, i436-i436, Oxford University Press.
4. Rusu EE, Zilisteanu DS, Atasie T, Rosca M, Calin A, Mihai S, Balanica S,
Voiculescu M, Correlates of osteoprotegerin and association with cardiovascular
status in patients with chronic kidney disease, Nephrology Dialysis Transplantation
2015/5/1, IF=4.085, Vol 30, suppl. 3, iii489-iii489.
5. Mihai S, Rusu E, Zilisteanu D, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Albulescu R,
Voiculescu M, Anton G, Tanase C, Proteomics and metabolomics in early diagnosis
and monitoring of patients with chronic kidney disease, FEBS Journal,
IF=4,001, 2015, 282 (Suppl.1): 56–408: 196.
6. Mihai S, Rusu E, Codrici E, Popescu ID, Nita AI, Voiculescu M, Tanase C,
Circulating biomarkers assessment for early diagnosis of vascular calcification in
chronic kidney disease, FEBS Journal, IF=4,001; 2014, 281 (Suppl.1): 65–783: 107.
7. Rusu E, Zilisteanu D, Atasie T, Circiumaru A, Carstea F, Ecobici M, Rosca M,
Tanase C, Mihai S, Voiculescu M, Serum osteoprotegerin is a predictor of diastolic
dysfunction and vascular stiffness in chronic kidney disease patients, Oxford Univ
Press, IF=4.085,117-117, vol. 29, 2014.
8. Zilisteanu D, Rusu E, Atasie T, Ecobici M, Circiumaru A, Carstea F, Rosca M,
Tanase C, Mihai S, Voiculescu M, Fibroblast growth factor 23 correlates with aortic
valve calcifications and non-dipper status in chronic kidney disease patients, Oxford
Univ Press, IF=4.085, 119-119, vol. 19, 2014.
Studii/rezumate în jurnale ISSN/ ISBN:
1. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Albulescu L, Luntraru CM, Anton G, Tanase
C, Inflammation-related patterns in chronic kidney disease assessment, A 48-a Conferință
Anuală de Imunologie, pg 60, 2019.
2. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Albulescu R, Anton G, Tanase C, Advances
in CKD Early Detection Using Proteomic Technologies, 13 edition – Academician
Nicolae Cajal Symposium of the Romanian Medical Sciences Academy, Romania, 2018.
3. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Albulescu L, Albulescu R, Codorean E,
Tanase C, Gut microbiota-renal axis: exploration of novel therapeutic avenues in renal
diseases, The 11th National Pathology Symposium, Annual Scientific Meeting of Victor
Babes Institute, 22-24 noiembrie 2018, ISSN 2601-0771.
4. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Rusu E, Zilisteanu D, Albulescu R,
Voiculescu M, Radu I, Anton G, Tanase C, Proteomic study - a useful tool in chronic
kidney disease treatment, Journal of Translational Medicine and Research, Vol 21
(Supplement I), ISSN, 2392-7232, S67, 2016.
Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice
32
5. Mihai S, Zilisteanu D, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Albulescu R, Voiculescu M,
Anton G, Tanase C, Lopazan N, Abordări proteomice în managementul bolii renale
cronice, Sesiunea anuală a Institutului “Victor Babeş”, Al 8-lea Simpozion Naţional de
Patologie Medicina de Precizie – de la modele experimentale la biomarkeri, 2015, pg. 91
ISBN 978-973-708-862-8.
6. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Tanase C, Albulescu R, Nita A, Rusu E, Voiculescu
M, Vascular calcification in chronic kidney disease - proteomic challenges, New Trends
on Sensing - Monitoring- Telediagnosis for Life Sciences, Brasov, 2014, pg. 124, ISBN
978-973-131-280-4.
Top Related