Prof. Dr. Nilgün ÇerikçioğluMarmara Üniversitesi Tıp Fakültesi
Tıbbi Mikrobiyoloji AD, 2016
Antifungaller Direnç gelişimi
Geniş spektrumlu antifungaller
Tedavi için antifungal seçiminde karmaşa
•Tür düzeyinde tanımlama•Antifungal Duyarlılık Testi (AFDT)
• uygun• doğru tedavi
Comparative Evaluation of a New Commercial Colorimetric Microdilution Assay (SensiQuattro Candida EU) with MIC Test Strip and EUCAST Broth Microdilution Methods for Susceptibility Testing of Invasive Candida IsolatesJCM, 53, 255- 261 , 2015
STANDART REFERANS YÖNTEMLERİ
Buyyon Mikrodilüsyon (BMD) [CLSI - EUCAST]
Zaman alıcı
İş yoğunluğu
Rutin laboratuvarlar için uygun değil
SEÇENEK - YÖNTEMLER
Uygulaması
Ticari olarak elde edilebilir
Maliyet – etkin
Manuel
Yarı otomatize Seçenek Yöntemler Otomatize
Kolay
Kısa süreli
Seçenek Yöntemlerden Beklenenler (İ)1. CLSI ya da EUCAST BMD ile kıyaslanabilir
sonuçlar :
2. Esas uyum (EU): ±2 kat sulandırımı aşmayan
MİK sonuçları
3. Kategorik Uyum (KU):
Yorumlanabilir MİK sonuçları arası uyum [Hassas (H), Intermediate (I) (Orta) , Dirençli (D)] ≥ %90)
Seçenek Yöntemlerden Beklenenler (İİ)
4. Çok Büyük Hata (ÇBH): Yalancı duyarlılık(<%1.5)
5. Büyük Hata (BH): Yalancı dirençlilik
6. Küçük Hata (KH): Dirençli/duyarlı ↔Orta (I)
7. Reproducibility: Tekrarlanabilirlik
8. Değişikliklere uygunluk (İlaç ekleme / çıkarma, son noktada değişiklik…..)
FDA ONAYLI TESTLER
SYO ( Sensitre Yeast One) (TREK
Diagnostic systems, Inc., Cleveland, ABD)
Vitek 2 (bioMérieux, Fransa)
E test (AB Biodisk İsveç--bioMérieux, Fransa)
Antifungal Susceptibilities of Candida Isolates Causing Bloodstream Infections at a Medical Center in Taiwan, 2009-2010; AAC, 58, 3814 – 3819, 2014
SYO Kolorimetrik Buyyon Mikrodilusyon
CLSI uyumlu
1998 (5 antifungal) → 2012 (9 antifungal)
Dehidrate iki kat seri sulandırımlar( SYO-YO10)
Alamar mavisi
Kolorimetrik okuma
Kırmızı: üreme + Mavi:üreme –
MİK:Üremenin olmadığı en düşük ilaç [C]
Candida türleri
Cryptococcus türleri
Hızlı çoğalan mayalar
Aspergillus türleri
Üretici firmanın önerileri
doğrultusunda test hazırlanır.
Posakonazol C.albicans Vorikonazol C.glabrata Flukonazol C.tropicalis Itrakonazol
Trailing (Hafif mor renk)
VİTEK 2 Tam otomatize
9-24 saat içerisinde (ortalama 15 saat)
Spektrofotometrik okuma
VİTEK 2 AF03 IUO Güncelleştirilmiş Form FCZ son konsantrasyon 1→ 0.5
Yeni CLSI CBP leri ile uyumlu
Dirençli kökenleri saptayabiliyor.
E test
Kullanıma hazır
MİK
Antifungalin gradient
konsantrasyonlarını içeren şerit
Amfoterisin B
Anidulafungin
Kaspofungin
Mikafungin
Flukonazol
Itrakonazol
Posakonazol
Vorikonazol
Flusitozin
RPMI 1640AM3 besiyerleri
Flukonazol
Üremenin %80 inhibisyonu
Küçük kolonilerin dışlanması
Büyük kolonilerin kestiği nokta
VOR Üremenin %80 inhibisyonu Büyük kolonilerin kestiği nokta
RPMI-1640
AM3
C. lusitaniae – Amfoterisin B
ÇALIŞMALARDAN ÖRNEKLERVİTEK 2 (AST-YS01 kart) – SYO (Y08 formatı)
UYUMU / Candida türleri
(CLSI M27 A3 S3 Temelli KIYASLAMA !)
FCZ için EU düşük bulunan türler
C.albicans → %70±10
C.parapsilosis → %71.4±12
C.kefyr → %50
Toplamda → %81.4±4.6 EU Interlaboratory evaluation of VITEK2 system and Sensititre YeastOne© for antifungal susceptibility testing of yeasts isolated from blood cultures against four antifungal agentsNEWMICROBIOLOGICA, 34, 195-201, 2011
Amfoterisin B için EU düşük bulunan türler C.krusei %60 C.kefyr %50 Toplamda → %84.3±4.3 EU
Flusitozin için EU düşük bulunan türler C.guilliermondii, C.tropicalis %66 C.lusitaniae %50 Toplamda → %81.4±4.6 EU
Vorikonazol için EU düşük bulunan türler C.guilliermondii %16.6 C.tropicalis, C.lipolytica %50 Toplamda → %88,6±3.4 EU
SONUÇ: VİTEK 2 daha güvenilir / 13 saatte sonuç !!
SYO-CLSI M27 A3-S4SYO MİK yorumu
474 Kan izolatı Candida türü
Problemli hastalar(YBÜ, Cerrahi servisi, Hematoloji
Servisi)
Türe özgül revize CBP lere göre ya da
ECV lere göre
Antifungal Susceptibilities of Candida Isolates Causing Bloodstream Infections at a Medical Center in Taiwan, 2009-2010; AAC, 58, 3814 – 3819, 2014
SYO-CLSI EU ORANLARI
C.albicans → >%95 FCZ (H) C.parapsilosis C.krusei
C.glabrata → C.tropicalis → %78.6 VOR (H)
%100 VOR (H)
%90.9 FCZ (DBD)
Tüm izolatlar >%97 MİKA,ANİDİLA
Tüm izolatlar %100 Amfo B (WT)
(MİK<1)
SYO-CLSI UYUMU
24 saatte sonuç
C.tropicalis VOR «duyarlı değil»
C.tropicalis POS «WT dışı» izolatlarda
SYO-CLSI UYUMU
24 saat
Uyum %95-99
ECV → SYO da 1 dilüsyon değişiyor.
CLSI – CBP → SYO için uygun mu?
SYO ya özgül CBP ler belirlenmeli?
E test-SYO-CLSI M38 A2Aspergillus/Aspergillus dışı küfler
AMFOTERİSİN B YÖNTEMLER ARASI UYUM
± 2 DİLÜSYONDA GÖRECE
VORİKONAZOL
İTRAKONAZOL
In Vitro Susceptibility Testing of Aspergillus and Non-Aspergillus Filamentous Moulds to Antifungal Agents: Evaluation of Three Different MethodsMacedonian Journal of Medical Sciences. 15; 5(3):280-287, 2012
E test CLSI ile uyumlu Zon içi mikrokoloniler DEĞERLENDİRME
DIŞI
Kaspofunginde rezidüel üreme (okuma zorluğu)
Amfoterisin B ve ITR direncini saptamada SYO’dan üstün !!!!
Besiyeri hazırlığında üretici firma önerilerine %100 uyulmalı!!!
SYO Aspergillus / Aspergillus dışı kökenlerde /
Amfoterisin B dirençli kökenleri saptayamıyor !!!!!
Kaspofungin → yalancı yüksek MİK değeri
ITR, VOR, POS
Tüm küf cinsleri için için uygun
CLSI SYO
Farklı antifungal ajanlar için E test sonuçları
SYO-CLSI EKİNOKANDİN / CANDIDA KÖKENLERİ
AND %98.3CAS %93.6MİKA %99.6CAS - C.glabrata %89.7
C.krusei %69.1SonuçEkinokandin, CLSI YENİ CBP ve ECV
SYO için uygun
Toplamda KU
Comparison of the Sensititre YeastOne colorimetric antifungal panel with CLSI microdilution for antifungal susceptibilitytesting of the echinocandins against Candidaspp., using new clinical breakpoints and epidemiological cutoff valuesDiagnostic Microbiology and Infectious Disease 73, 365-368, 2012
MALDI TOF MS / CLSI
CASCandida albicans
Rapid Antifungal Susceptibility Testing by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry Analysis; Journal of Clinical Microbiology, 51, 9, 2964 –2969, 2013
YÖNTEM C.albicans klinik izolat n=65
Fks1 mutant(+) kontrol kökenleri
MALDİ TOF MS-CLSI (revize CBP)
CAS RPMI da 9 farklı ilaç konsantrasyonu+
C.albicans kökenleri
37 °C, 15 saat-3 saat inkübasyon
Toplanan Maya Hücreleri Steril su ile yıkama Formik asit ile süspansiyon (1 er µl)
Etanol + Sinnamik asit Bruker Daltonik Biotyper(3,0 yazılım)
Spektraların Toplanması- Veri Tabanı Eldesi
65 C.albicans spektraları / veritabanı ile kıyaslama
CCI (Composite Correlation Index)
MPCC (Minimal Profile Change Concentration)
saptanması
MALDİ TOF MS Spektra ve rölatif jel MALDI
a. WT C. albicans izolatı
b. Fks1 mutant C.albicans izolatı
WT ve fks1→ 0, 0.03 ve 32 µg/ml CAS ile muamele sonucu
her iki izolat için minimal değişiklikler görülmektedir.
MALDI TOF MS CCI lerin ısı haritasına çevrilmesi
MALDI TOF MS - CLSI UYUMU
65 kökenin 61’i uyumlu sonuç
51 köken HASSAS
11 köken DİRENÇLİ(fks1 mutasyon+)
1 ÇBH (%1.6)
Toplam uyum %98.4
MİKROKALORİMETRİ – CLSI Amfo B, VOR, POS, CAS
Aspergillus türleri
Prensip:
Sabit sıcaklıkta (izotermal / 37 °C)
Mikrobiyal üreme
Artan metabolizmayla birlikte ISI üretimi
Mikrokalorimetri ile ısı üretiminin ölçülmesiIsothermal microcalorimetry: a novel method for real-time determination of antifungal susceptibility of Aspergillus species,; Clinical Microbiology and Infection , 18, 7, E241–E245, 2012
A.fumigatus ATCC 204305 için MHIC saptanması.
Sol panelde «ISI AKIŞI»,
Sağ paneldeANTİFUNGALLERİN varlığında TOPLAM ISI(SDB ‘de inokülüm: 2.5 X10 ⁴ konidia/ ml.)GC: Growth Control (Üreme Kontrol)
Sayılar: Antifungalkonsantrasyonu (mg/L).
NOKTALI YATAY ÇİZGİ: Amfo B ve TRİAZOLLER için: üretilen TOTAL ISININ %50 inhibisyonuEkinokandinler için: ISI AKIŞ PİK’inde %50 azalma.
MHIC = DAİRE içindeki KONSANTRASYONLAR
GC (Growth Control)
(Üreme kontrolü)
Daire içindekiler
Amfoterisin B ve triazoller:GC ye göre toplam ısının %50 inhibisyonuEkinokandinler:GC ye göre toplam ısı akış pikinde %50
Noktalı yatay çizgi
MHIC
o Antifungalsiz ortam Kontrol o Değişik konsantrasyonlarda ilaç varlığında
ISI DEĞİŞİKLİKLERİ
MHIC (Minimal Heat Inhibitory Concentration) ölçümü
CİNS ve TÜRE göre: 5. (Candida türleri) – 22. – 72. saatte sonuç
Mikrokalorimetri –/CLSI M38 A2 Uyumu (± 2 dilüsyon)
Amfo B → %90
VOR → %100
POS → %90
CAS → %70
Mikrokalorimetri - Dezavantajları
Dolaşımda gaz habbecikleri / mikroorganizma
kümeleri → Kanallarda tıkanıklık
Kanaldan kalorimetriye transferde
mikroorganizma miktarında değişiklikler
RUTİN KULLANIMA UYGUN DEĞİL
Yeni üretilen ilaçlar için kullanılabilir.
AKIM SİTOMETRİ
AKIM SİTOMETRİSİ / CLSI C.albicans Amfoterisin B + Maya …..30 dk. FCZ + Maya………………6 saat Vital DNA boyası (FUN-1..)
MİK= (en düşük İlaç [C] Hücreiçi Floresein yoğunluğunda %50
CLSI M27 A2 ile uyum: %96 (amfo B için)-%99 FCZ için Dezavantaj: Özel ekipman gerekliliği
Int J Pharmaceutical & Biological Archives.5, 1-6, 2014.
DİĞER YÖNTEMLER ERGOSTEROL ÖLÇÜMÜ FCZ Farklı [C]+ Maya
Toplam Ergosterol miktarında Değişiklik
o CLSI ile ~ %100 uyumlu«Trailing» sorunu YOK
Küfler için uygun
Dezavantaj: Geliştirilmesi gerekli
Quantitation of Candida albicans Ergosterol Content Improves theCorrelation between In Vitro Antifungal Susceptibility TestResults and In Vivo Outcome after FluconazoleTreatment in a Murine Model ofInvasive Candidiasis. AAC. 44, 2081-2085, 2000.
XTT (Kolorimetrik Yöntem) (XTT) + Mantar (Candida, Cryptococcus, küfler) + Antifungal
( Farklı [C] Biyofilm içinde / planktonik Canlı mantar hücrelerinin varlığında….XTT
indirgenmesi…RENK DEĞİŞİMİ Spektrofotometrik ölçüm
Amfoterisin B, FCZ, ITR, FLC
MİK : Metabolik aktiviteyi %50--%80 azaltan antifungal [C] CLSI ile UYUM→ %90-100 Kısa sürede sonuç
Dezavantajı: Geliştirilmesi gerekli
Biofilm production and evaluation of antifungal susceptibility amongst clinical Candida spp. isolates, including strains of the Candida parapsilosis complex
Med Mycol . 49 , 253-262. , 2011.
Top Related