Polysakkaridialdehydien selektiivinen muokkaus
oksinitrilaasientsyymill
Tia-Annette Kakko Pro gradu -tutkielma
Orgaanisen kemian laboratorio Kemian laitos
Helsingin yliopisto Marraskuu 2012
i
Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion Faculty Matemaattis-luonnontieteellinen tiedekunta
Laitos/Institution Department Kemian laitos
Tekij/Frfattare Author Tia-Annette Kakko Tyn nimi / Arbetets titel Title Polysakkaridialdehydien selektiivinen muokkaus oksinitrilaasientsyymill Oppiaine /Lromne Subject Kemia Tyn laji/Arbetets art Level Maisterin tutkielma
Aika/Datum Month and year Marraskuu 2012
Sivumr/ Sidoantal Number of pages 67
Tiivistelm/ Referat Abstract
Guarkumi on monikyttinen aine niin lke- kuin ravintoaineteollisuudessa. Guarkumille tehtvt reaktiot lisvt mahdollisesti sen monikyttisyytt. Tss tyss tarkoituksena oli pident guarkumialdehydin (galaktomannaanin galaktoosin C-6 aldehydin) hiiliketjua yhdell hiilell syanohydriinien avulla. Oksinitrilaasi on syanohydriinej muodostava entsyymi, jota kasvit kyttvt syanogeneesiss. Orgaanisissa synteeseiss tt entsyymien ominaisuutta kytetn pinvastaiseen tarkoitukseen eli syanohydriinien muodostamiseen. Reaktioita oksinitrilaasilla on suoritettu kirjallisuuden mukaan runsaasti, mutta lhtaine on ollut orgaaniseen liuottimeen liukeneva, reaktioseoksena on kytetty orgaanista liuotinta, liuotinseosta tai entsyymi on ollut kiinnitettyn matriisiin. Tutkimuksen kohteena olivat polysakkaridialdehydien oksinitrilaasilla tehtvt entsymaattiset jatkoreaktiot. Tyss tutkittiin syanohydriinien entsymaattista syntetisointia vesipitoisissa puskuriliuoksissa. Kokeet tehtiin raffinoosilla ja guarkumilla, jotka oli hapetettu entsymaattisesti, selektiivisesti, galaktoosin C-6 asemasta aldehydiksi. Syanohydriinien muodostumista tutkittiin kolmella eri oksinitrilaasilla ja kahdella syanidia vapauttavalla yhdisteell; natriumsyanidilla ja etyylisyanoformaatilla. Lisksi tutkittiin erilaisten puskurien vaikutusta tulokseen. Nytteist muodostettiin johdos metanolyysin ja silyloinnin avulla. Haihtuviksi tehdyt sakkaridit analysoitiin GC-MS:lla. Tulokset tarkistettiin lisksi NMR- ja LC-MS/MS tekniikoilla. Reaktioiden tuloksena oli -hydroksiamidiksi hydrolysoitunut syanohydriini. Synteesin toimivuutta ja tuloksia olisi hyv tutkia viel alhaisessa lmptilassa, sill thn tutkimukseen sislletyt kokeet tehtiin huoneenlmptilassa. Lisksi parhaan tuloksen tuottanutta AtHNL -entsyymi olisi hyv kokeilla pH:ssa 3,3, jolloin kemiallinen reaktio olisi kokonaan suppressoitu.
Avainsanat Nyckelord Keywords
Oksinitrilaasi, hydroksinitriililyaasi, guarkumi, polysakkaridi, PaHNL, syanohydriini
Silytyspaikka Frvaringstlle Where deposited
Kumpulan kampuskirjasto, Kemian laitos, orgaanisen kemian laboratorio
Muita tietoja vriga uppgifter Additional information
ii
Alkusanat
Erikoistyn tekeminen ja pro gradun kirjoittaminen on ollut opettavainen ja krsivllisyytt
vaativa projekti. Haluaisin kiitt ohjaajaani FT Kirsti Parikkaa positiivisesta
kannustuksesta ja opastuksesta laboratoriotyt suoritettaessa. Lisksi hn on antanut hyvi
kommentteja kirjoitusta ajatellen. Kiitn mys Sami Heikkist avusta NMR-analyysien
suorittamisessa sek Sun-Li Chongia MS-analyysien tekemisest. Professori Maija
Tenkaselle kiitos siit, ett kokeellisen osuuden suorittaminen Viikin Elintarvike- ja
ympristtieteiden laitoksella oli mahdollista. Professori Ilkka Kilpelist haluan kiitt
tuesta ja ymmrtvisest asenteesta koko opintojeni aikana. Tyn, opiskelun ja kodin
yhteensovittaminen on toisinaan ollut haasteellista, opintojeni loppuun saattamiseksi olen
saanut paljon tukea sek ty- ett opiskelukavereilta. Kaikkein eniten tahdon kuitenkin
kiitt puolisoani Tommy siit, ett hn on tukenut minua opintojeni aikana ja
kannustanut minua tss projektissa aina loppuun saakka. jatkamaan opintojani filosofian
maisteriksi asti.
iii
Sisllys
Tiivistelm .................................................................................................................................... i
Alkusanat .................................................................................................................................... ii
Sisllys ........................................................................................................................................ iii
Lyhenneluettelo ............................................................................................................................v
KIRJALLINEN OSUUS ..............................................................................................................1
1 Johdanto ..............................................................................................................................1
2 Syanohydriinit .....................................................................................................................2
2.1 Mrittely ja synteesi ..................................................................................................2
2.1.1 Syanidilhteet ...........................................................................................................4
2.2 Syanohydriinien reaktioita..........................................................................................5
2.2.1 Hydroksyyliryhmn reaktiivisuus ..............................................................................5
2.2.2 Syanoryhmn reaktiivisuus........................................................................................7
3 Entsymaattiset menetelmt syanohydriinien valmistuksessa ........................................... 11
3.1 Entsyymit ................................................................................................................... 11
3.2 Syanohydriinien valmistaminen ............................................................................... 12
3.2.1 Hydroksinitriililyaasilhteit ................................................................................... 13
3.2.1.1 Rekombinanttientsyymit ................................................................................. 16
3.2.2 (R)-Oksinitrilaasi .................................................................................................... 17
4 Hiilihydraatit ..................................................................................................................... 18
4.1 Mono-, oligo- ja polysakkaridit ................................................................................. 18
4.2 Galaktomannaanit ..................................................................................................... 22
4.2.1 Galaktomannaanien reaktiivisuus ............................................................................ 23
KOKEELLINEN OSUUS .......................................................................................................... 25
5 Johdanto ............................................................................................................................ 25
5.1 Materiaalit ja menetelmt ......................................................................................... 26
5.1.1 Reagenssit ja entsyymit ........................................................................................... 26
5.1.2 Sokereiden hapetus ................................................................................................. 28
iv
5.2 Syanohydriinien synteesi ........................................................................................... 29
5.2.1 Syanidilhteet ......................................................................................................... 29
5.2.2 Puskuriolosuhteet .................................................................................................... 30
5.3 Synteesit hapetetulla raffinoosilla ............................................................................. 31
5.3.1 Reaktiot natriumsyanidilla ....................................................................................... 31
5.3.2 Reaktiot etyylisyanoformaatilla ............................................................................... 32
5.3.3 Kemiallisen reaktion tutkiminen .............................................................................. 33
5.3.4 Reaktiot korkeammassa pH:ssa ............................................................................... 34
5.4 Synteesit hapetetulla guarkumilla ............................................................................ 35
5.5 Nytteiden ksittely ................................................................................................... 36
5.5.1 GC-MS nytteiden valmistaminen ........................................................................... 36
5.5.1.1 Pelkistminen ................................................................................................. 36
5.5.1.2 Hapan metanolyysi ja silylointi ....................................................................... 36
5.5.2 NMR- ja MS- nytteiden valmistaminen ................................................................. 38
5.6 Muita kokeita ............................................................................................................ 38
5.6.1 Saostus.................................................................................................................... 38
5.6.1.1 Puhdistuskokeet .............................................................................................. 39
5.6.2 Jtteiden hvitys ...................................................................................................... 39
5.7 Analysointi ................................................................................................................. 40
5.7.1 GC-MS analyysi ..................................................................................................... 40
5.7.1.1 Lhtaineiden hapetusasteen mrittminen .................................................... 40
5.7.2 Massaspektrometrinen analyysi ............................................................................... 41
5.7.3 NMR analyysi ......................................................................................................... 42
5.8 Tulokset ..................................................................................................................... 42
5.8.1 Lhtaineiden hapetusasteet .................................................................................... 42
5.8.2 Syanohydriinit......................................................................................................... 43
5.8.2.1 GC-MS analyysin tulokset .............................................................................. 43
5.8.2.2 MS/MS analyysin tulokset .............................................................................. 51
5.8.2.3 NMR analyysin tulokset.................................................................................. 55
5.8.2.4 Tulosten kooste ............................................................................................... 59
6 Johtoptkset ................................................................................................................... 60
Viiteluettelo ................................................................................................................................ 61
LIITE 1.
v
Lyhenneluettelo
CLEA Cross -linked enzyme aggregate, ristisilloitettu entsyymiryhmittym
DAST Dietyyliaminorikkitrifluoridi
DIPE di-Isopropyylieetteri
DMF N,N-Dimetyyliformamidi
DS Substituutioaste
Et2O Dietyylieetteri
Fru Fruktoosi
Gal Galaktoosi
GC Kaasukromatografi
GG Guarkumi
Glc Glukoosi
GO Galaktoosioksidaasi
HCN Vetysyanidi
HMDS Heksametyylidisiloksaani
HNL Hydroksinitriililyaasi, (R)-oksinitrilaasi
KCN Kaliumsyanidi
KF Kaliumfluoridi
Man Mannoosi
Me3SiCl Trimetyylisilyylikloridi
MS Massaspektrometri
NaBD4 Natriumboorideuteridi
NaBH4 Natriumboorihydridi
NaCN Natriumsyanidi
NCCOOEt Etyylisyanoformaatti
NMR Nuclear magnetic resonance, ydinmagneettinen resonanssi
vi
NTP Normal temperature and pressure, normaalilmptila ja -paine
PCl5 Fosforipentakloridi
Pd Palladium
py Pyridiini
R3SiCN Trialkyylisilyylisyanidi
Raf Raffinoosi
Sac Sakkaroosi
TBDMS-Cl tert-Butyylidimetyylisilyylikloridi
TEMPO 2,2,6,6,-Tetrametyylipiperidiini-1-oksyyli
TMCS Trimetyylikloorisilaani
TMSCl Trimetyylisilyylikloridi
tr Retentioaika
1
KIRJALLINEN OSUUS
1 Johdanto
Kemia on jatkuvasti kehittyv tieteenala, jossa edistyst tapahtuu niin uusien tuotteiden
syntetisoinnissa kuin laitetekniikassa. Usein tutkimuksessa sovelletaan monia eri
menetelmi ja tieteen alalajeja. Kytnnss tm tarkoittaa sit, ett yhden asian hallinta
ei aina riit, vaan monen alalajin tuntemus ja soveltaminen on tarpeen. Tss tyss
yhdistyvt orgaaninen kemia, biotekniikka sek laitetekniikka.
Tutkimuksen tarkoituksena oli selvitt muodostuuko mantelista perisin olevan
hydroksinitriililyaasi -entsyymin avulla vesipitoisissa sakkaridiliuoksissa yhdisteit, jotka
sisltvt syanohydriini-funktionaalisuuden. Reaktiossa muodostui kuitenkin amidiksi
hydrolysoitunut syanohydriini. Haastetta tutkimukseen toivat sek lhtaineiden
liukoisuusominaisuudet ett entsyymien vaatimien reaktio-olosuhteiden stely. Lisksi
lhtaineiden rajallisuus ja synteesituotteen puhdistuksen haasteellisuus toivat
lismaustetta.
Uusien, synteesimenetelmien ympristystvllisyys, ns. vihre kemia, on viime aikoina
ollut trkess asemassa. Lisksi tuotantotekniset vaatimukset ovat tiukkoja, mieluiten
kytetn olemassa olevaa tekniikkaa, sit vain hiukan muunnellen. Orgaanisten
liuottimien kytn vhentminen ja synteesimenetelmien muuttaminen kestvmmn
kehityksen suuntaan ovat trkess asemassa uusia menetelmi kehitettess.
Bioteknologian yhdistminen orgaanisen kemian reaktioihin on vhentnyt suojaryhmien
kytt, samalla reaktioreitit ovat lyhentyneet ja tarvittavien reagenssien mr on
vhentynyt. Tss tyss ympristnkkohdat huomioitiin mahdollisuuksien mukaan.
Syanohydriinit ovat monikyttisi lhtaineita kemiallisissa synteeseiss ja niiden
muodostaminen on yksi orgaanisen kemian perusreaktioista. Kemiallisessa reaktiossa
tuotteena muodostuu -hydroksinitriilien raseeminen seos. Entsymaattisessa reaktiossa
saadaan muodostettua suurimmaksi osaksi tietty konformaatiota, jolloin lopputuotteen
stereokemia riippuu kytetyn entsyymin stereospesifisyydest.
2
2 Syanohydriinit
2.1 Mrittely ja synteesi
Syanohydriineiss on sek syano- ett hydroksyyliryhm, jotka ovat kiinnittynein
molekyylin samaan, alifaattiseen, osaan.1 Syanohydriinej valmistettaessa hiiliketju pitenee
yhdell hiilell ja molekyyliin saadaan usein muodostettua kiraliakeskus.2. Tmn lisksi
syanohydriinej voidaan valmistaa sek kemiallisesti ett entsymaattisesti.
Kuva 1. Syanohydriinien muodostuminen. R1= alkyyli, sykloalkyyli, aryyli, heteroaryyli; R2= H, alkyyli.3.
Kemiallisessa synteesiss vetysyanidia voidaan liitt raseemisesti joko aldehydi- tai
ketonirunkoon jolloin muodostuu -hydroksinitriilej. Reaktiota katalysoidaan emksell
(kuva 1.).1, 4 Vetysyanidin vaaralliselta ksittelylt vltytn muodostamalla se suola- tai
rikkihapon avulla in situ.5. Vaihtoehtoisesti -hydroksinitriili muodostetaan syanidi-ionin
vaihdolla ketonisyanohydriinin ja aldehydin vlill. Menetelm kutsutaan
transhydrosyanaatioksi.3 Reaktiossa muodostuu stabiilimpi, aldehydist perisin oleva,
syanohydriini (kuva 2.). Usein tss reaktiossa ketonina toimii asetonisyanohydriini.1, 6, 7
Kuva 2. Syanohydriinin valmistaminen transhydrosyanaatiolla. R, R ja R= alkyyli- tai aryyliryhm.1, 3
3
Mekanistisesti reaktio on nukleofiilinen additio karbonyylihiileen, jolloin syanidi-ionin
liittyminen karbonyylihiileen on reaktion nopeutta stelev tekij. Alifaattiset aldehydit ja
suurin osa alifaattisista ketoneista muodostavat syanohydriinej.5 Ketoneilla reaktio on
yleisesti ottaen hitaampi johtuen sek elektroneja luovuttavan ryhmn vaikutuksesta ett
alkyylin aiheuttamasta steerisest esteest. Joissakin tapauksissa reaktion tasapaino on
enemmn lhtaineiden puolella. Tllin tasapainon siirtminen tuotteen puolelle onnistuu
vain joko reaktiotuotteen poistamisella reaktioseoksesta, vetysyanidin mrn lismisell
tai biokatalyytin avulla.4 Aldehydeist muodostuva syanohydriini on pysyvmpi ja reaktion
tasapaino on psntisesti tuotteen puolella.1, 5 Ketonin ja aldehydin muoto vaikuttavat
reaktionopeuteen ja -tasapainoon siten, ett alkyyli-aryyliketonit reagoivat huonosti, jos
lainkaan. Lisksi molemmilla ryhmill molekyylin haaroittuneisuus hidastaa
reaktiivisuutta.1
Entsymaattisissa reaktioissa perusperiaate reaktiolle on sama kuin kemiallisessa reaktiossa,
mutta niss reaktioissa entsyymit katalysoivat vetysyanidin enantioselektiivist liittymist
karbonyylihiileen.3, 4 Samalla molekyyliin muodostuu kiraliakeskus, jossa hiiliatomiin on
liittynyt nelj erilaista ryhm ja molekyylist tulee optisesti aktiivinen. Kytettvt
entsyymit tuottavat reaktiossa usein vain joko R- tai S- muotoa, kun taas kemiallisessa
reaktiossa muodostuu aina molempia stereoisomeerej.2, 3, 8 Tllin enantiopuhtaita
tuotteita valmistettaessa kemiallisen reaktion tuottavuus j suurimmillaan 50 %:iin.9
Entsymaattinen hiili-hiili sidoksen muodostuminen on yleens hyvin diastereo-, enantio-,
kemo-, ja regioselektiivist.3
Edell mainittujen menetelmien lisksi syanohydriinien enantioselektiivist syntetisointia
on tehty yhdistmll sek kemiallinen ett entsymaattinen menetelm. Tllin
emskatalysoidussa reaktiossa muodostetaan syanohydriinien raseeminen seos, jonka
annetaan edelleen reagoida entsymaattisesti esim. lipaasientsyymin ja asetylointireagenssin
kanssa.10
Syanohydriinien muodostumisreaktio on eksoterminen ja korkeassa pH:ssa reversiibeli.
Tst seuraa, ett kemiallisten, emskatalysoitujen, reaktioiden tuotteet saadaan eristetty
vasta kun reaktioseos on stabiloitu hapon avulla.1
4
2.1.1 Syanidilhteet
Syanohydriinien muodostamiseen tarvitaan syanidi-ioni, -CN. Perinteinen tapa syanidi-
ionin muodostamiseksi on ollut kytt vetysyanidia (HCN) emskatalysoidussa tai
syanidisuolaa (NaCN tai KCN) happokatalysoidussa reaktiossa. Muita syanoryhmn
lhteit voivat olla asetonisyanohydriini11, etyylisyanoformaatti (NCCOOEt)12, 13, -
hydroksibentseeniasetonitriili eli mantelinitriili, dietyylisyanofosfonaatti13,
trialkyylisilyylisyanidi (R3SiCN)3, alkyylisyanidi ja metallisyanidi8. Esimerkkej
rakenteista on esitetty kuvassa 3.
Kuva 3. Asetonisyanohydriinin, etyylisyanoformaatin, trimetyylisilyylisyanidin14 ja mantelinitriilin rakennekaavat.
Kytettv substraatti valikoituu monien eri tekijiden summasta. Vetysyanidin
myrkyllisyys, alhainen kiehumispiste ja reaktion eksotermisyys ovat trkeit
tyturvallisuudessa huomioitavia seikkoja. Lhteiss kehotetaankin kyttmn
hlytysjrjestelm.3 Muiden, hiukan turvallisempien, lhtaineiden tarkoituksena on
vapauttaa vetysyanidi reaktioseokseen in situ, josta se liittyy kohdemolekyyliin. Kytettv
reaktiotyyppi vaikuttaa syanidilhteen valintaan siten, ett esimerkiksi lhtaineen
emksisyys vaikuttaa entsymaattisten reaktioiden kulkuun.3
5
2.2 Syanohydriinien reaktioita
Syanohydriinit ovat bi- tai monifunktionaalisia yhdisteit, joiden kemiallinen rakenne
sislt nitriili- ja hydroksyyliosan. Nm funktionaaliset ryhmt ovat reaktiivisia ja siten
monikyttisi.3, 15 Tst syyst niit kytetn vlituotteena useissa kemian teollisuuden
reaktioissa.1 Kiraliakeskus tuo lisarvoa syanohydriinien monikyttisyydelle, ja siksi
mys maatalouskemikaali- ja lkeaineteollisuus ovat kiinnostuneita syanohydriinien
kehittmisest.8, 12
2.2.1 Hydroksyyliryhmn reaktiivisuus
Hydroksyyliryhmn aktiivisuutta voidaan list muuttamalla se hyvksi poistuvaksi
ryhmksi.16 Tm mahdollistaa SN2 -tyypin korvautumisreaktiot, joissa tapahtuu
konfiguraation kntyminen.17 Hydroksyyliryhm voidaan syrjytt mys
elektronegatiivisella ryhmll; esimerkiksi primaariset ja sekundaariset amiinit korvaavat
hydroksyylin muodostaen -aminonitriilej. Mys halogeenivedyt sek fosforipentakloridi
(PCl5) reagoivat samalla tavalla muodostaen -halogeeninitriilej.1 Lisksi suorat
stereoselektiiviset reaktiot ovat mahdollisia eriden reagenssien avulla (kuva 4.)
esimerkkin dietyyliamiinirikkitrifluoridin (DAST) reaktio syanohydriinin kanssa.16
Kuva 4. (S)-2-fluoronitriilien ja edelleen (S)-2-fluorokarboksyylihappojen valmistaminen (R)-syanohydriineist.16
Sen sijaan, ett koko hydroksyyliryhm (OH) vaihdetaan, voidaan ainoastaan OH-ryhmn
vety korvata. Reaktioista yleisin on esterin muodostaminen hapon tai happokloridin
kanssa.1 Kuten alkoholeilla yleens, niin mys tsskin tapauksessa, aktivaatio
sulfonyyliryhmll johtaa useisiin erilaisiin jatkoreaktiomahdollisuuksiin (kuva 5).
6
Muodostuvat -sulfonyylioksinitriilit sisltvt hyvn poistuvan ryhmn.17, 18 Optisesti
aktiivisten -sulfonyylioksinitriilien nukleofiiliset substituutioreaktiot johtavat moniin
mielenkiintoisiin yhdisteisiin: -atsidonitriileihin, -aminonitriileihin, -aminohappoihin
sek etyleeni-imiineihin.19 Edell mainituista, alifaattiset optisesti aktiiviset molekyylit
silyttvt konfiguraationsa, kun taas aromaattiset ovat epstabiilimpia optisen puhtautensa
suhteen.16
Kuva 5. Kiraalisten syanohydriinien hydroksyyliryhmn jatkoreaktioita.17 a) R1SO2Cl,
pyridiini (py), b) kaliumftaali-imidi, N,N-Dimetyyliformamidi (DMF) c) kaliumatsidi,
DMF, d) LiAlH4, Et2O, - 80 C, pH 7 fosfaattipuskurissa, e) kaliumasetaatti (KOAc), DMF
f) KF, kruunueetteri, 45 100 C tai amberlyst A-26-F-, CH2Cl2, 0 C, g) DAST, - 80 C
25 C tai TMSCl. py, DAST, - 80 C 25 C, h) hydratsiini (N2H4), , i) Pd-C, H2.
7
Syanohydriineist poistetaan vett fosforipentoksidin avulla. Dehydrauksella molekyyliin
muodostetaan kaksoissidos, joka saadaan polymeroitua. Menetelmll valmistetaan
alkyyliakrylonitriilej, joita kytetn muun muassa muoviteollisuuden raaka-aineina.1
2.2.2 Syanoryhmn reaktiivisuus
Syanohydriinien nitriiliryhmlle voidaan tehd monenlaisia reaktioita, mutta suojaamalla
hydroksyyliryhm esimerkiksi tert-butyylidimetyylisilyylikloridin (TBDMS-Cl) avulla
voidaan syanoryhmn reaktiivisuutta list.17
Ilman hydroksyyliryhmn suojausta voidaan toteuttaa muun muassa pelkistys- ja
hydrolyysireaktioita. Hiili-typpi kolmoissidoksen pelkistminen amiiniksi tapahtuu joko
litiumalumiinihydridill (LiAlH4)16 tai katalyyttisell vedytyksell, jossa katalyyttin
toimii esimerkiksi palladium.20 Yleens natriumboorihydridi (NaBH4) ei pelkist
kolmoissidoksia, mutta eriden lhteiden mukaan sill voidaan pelkist syanohydriinien
nitriiliryhm, kun katalyyttin kytetn trifluorietikkahappoa8, 21 tai nikkelisuolaa.15
Hiili-typpi sidoksen pelkistyksen jlkeen on mahdollista muokata amiinifunktionaalisuutta
happoklorideilla, jolloin muodostetaan -hydroksiamideja. Vaihtoehtoisesti etikkahappo
muurahaishappoanhydridiln avulla muodostetaan N-alkyyli- -aminoalkoholeja.18
Nitriilien hydrolysointi on happokatalysoitu reaktio (kuva 6.), jossa muodostuu ensin amidi
joka hydrolysoituu edelleen karboksyylihapoksi.1 Vaikka hydrolysointi vkevll hapolla
tai emksell muodostaa yleens raseemisen seoksen,15 niin yllttv kyll vkev
suolahappo ei muuta kiraalisten syanohydriinien optista aktiivisuutta.17 Silloin kun amidin
hydrolyysi on hitaampi kuin nitriilin, on amidi mahdollista erist reaktioseoksesta.1
Hydrolysoitaessa trimetyylisilyylikloridia (TMSCl) vedell muodostuu suolahappoa. Jos
reaktio muodostetaan nitriilien kanssa in situ, hydrolysoituu nitriili amidihydrokloridiksi.
Amidi saadaan vapautettua suolastaan neutraloimalla seos.22
8
Kuva 6. Nitriilin hydrolyysi. R = alkyyli tai fenyyli ja R = alkyyli tai vety 1
Hellvaraisempia kemiallisia aineita tai biokatalyyttej kytettess tulee amidin
muodostumisesta todennkisemp, tllin amideja voidaan valmistaa siirtymtila-
metallikatalyyttien tai entsyymien avulla. Toimiviksi todettuja metallikatalyyttej ovat
olleet esimerkiksi platinium(II)fosfiniitti tai palladium(II)kloridi.15 Entsyymeist
nitriilihydrataasit aikaansaavat amideja, kun taas nitrilaaseilla hydrolyysi etenee
karboksyylihapoksi saakka.23
Liittmll useampaa entsyymi apuaineeseen muodostetaan nk. CLEA- entsyymej
(cross-linked enzyme aggregate), joita kyttmll on mahdollista suorittaa monta
reaktiovaihetta samanaikaisesti. Esimerkkin (S)-mantelihapon valmistaminen
bentsaldehydist (kuva 7).24 Toisen tyyppinen nitriilin hydrolyysi tehdn Pinner
reaktiossa, jossa kuivan alkoholin ja suolahapon avulla, saadaan valmistettua estereit.1, 25
Kuva 7. Kyttmll samanaikaisesti (S)-HNLa ja epspesifist nitrilaasia CLEA-matriisiin immobilisoituna saadaan syntetisoitua (S)-2- hydroksihappoja. R=C6H5 24
9
-Aminoalkoholien valmistaminen on trket niiden biologisen aktiivisuuden takia.8
Esimerkiksi efedriinityyppisiin yhdisteisiin kuuluvan yhdisteen, enantiomeerisesti puhtaan
2-aminoalkoholin, valmistuksessa hydroksyyliryhm suojataan trimetyylisilyylikloridilla
(Me3SiCl), reaktioseokseen listn Grignardin reagenssia ja muodostunut imiini vlituote
pelkistetn natriumboorihydridill (kuva 8.).16, 17 Edell mainituista imiineist voidaan
edelleen valmistaa N-substituoituja aminoalkoholeja transiminaatiolla. Vaihtoehtoisesti
aminoalkoholit voidaan hydrolysoida, jolloin muodostetaan optisesti aktiivisia asyloineja,
joiden karbonyylihiilen -asemassa on hydroksyyliryhm.16
Kuva 8. Stereoselektiivinen 2-aminoalkoholien synteesi. R = C3H7, C6H5; R1 = CH3, C2H5, C6H5; X = Br, I 16
Hydroksyyliryhmn suojauksen jlkeen nitriilin mahdollisia reaktioita (kuva 9.) ovat
nukleofiiliset additioreaktiot, joissa muodostetaan -hydroksialdehydej (a),
hydroksiketoneita (b), 2-amino-1,3-dioleja (c), substituoituja -aminoalkoholeja (d), N-
substituoituja -hydroksi--aminohappoja (e), N-substituoituja, -substituoituja, -amino-
-alkoholeja (f), -hydroksialdonitroneja (g), -substituoituja -aminoalkoholeja (h),
tetronihappoja (i) ja -aminoalkoholeja (j).18 Niden yhdisteiden jatkoreaktiona voivat
esimerkiksi olla pelkistminen, transiminaatio, hydrolyysi sek syklisointi.8
10
Kuva 9. Hydroksyyliryhmn suojaus mahdollistaa seuraavat reaktiot: a) Di-isobutyyli-
alumiinihydridi (DIBAL), H2SO4, b) Grignard, H3O+, c) Vinyyli Grignard, NaBH4, di-tert-
butyylidikarbonaatti [(BOC)2O], metanoli, NaBH4, d) DIBAL, amiini, NaBH4 e) DIBAL,
amiini, HCN, karbonyyli-imidatsoli, ems, happo, f) Grignard, NaBH4, formyyliasetaatti,
litiumalumiinihydridi (LiAlH4) g) DIBAL, N-bentsyylihydroksyyli-amiini h) Grignard,
NaBH4 i) BrZnCHR3COOR4, H3O+ j) LiAlH4 tai boraani (BH3). Mukailtu lhteest
Sharma et al.18
11
3 Entsymaattiset menetelmt syanohydriinien valmistuksessa
3.1 Entsyymit
Entsyymit ovat luonnonkatalyyttej, joita esiintyy kaikissa elm sisltviss
olosuhteissa. Ne katalysoivat valtavan mrn erilaisia reaktioita alentamalla reaktioiden
aktivointienergiaa. Reaktionopeus muuttuu tyypillisesti 105108 -kertaiseksi, mutta voi
muuttua jopa 1017 kertaa nopeammaksi kuin ilman entsyymi tapahtuva reaktio.4, 26
Entsyymit ovat proteiineja, ja pysykseen aktiivisena niiden tulee esiinty tietyss
luonnonmukaisessa muodossa.26 Toisin kuin useat kemialliset reagenssit, entsyymit eivt
ole herkki kosteudelle tai ilmalle.4 Osa entsyymeist vaatii toimiakseen mys kofaktorin
ja/tai koentsyymin. Kofaktori on eporgaaninen ioni, esimerkiksi Fe2+ tai Mg2+, kun taas
koentsyymi on metalli-orgaaninen- tai orgaaninen molekyyli.27
Entsyymien luonnonmukaisuuden ja rakenteen takia niill on tiettyj reaktio-
olosuhdevaatimuksia. Kullakin entsyymill on sille ominainen pH- ja lmptila-alue, jossa
se toimii optimaalisesti.26 Entsyymien toiminta on usein substraattispesifist, eli entsyymit
toimivat vain tietynlaisen rakenteen omaavien lhtaineiden kanssa. Nm aineet sisltvt
kullekin entsyymille oikeanlaisen, aktiivisen sitoutumiskohdan. Entsyymin kiinnittyess
substraattiin siihen muodostuu entsyymisubstraattikompleksi, reaktion aktivointienergia
laskee ja reaktio nopeutuu.27
Entsyymien kytt lisntyy jatkuvasti mik johtuu niiden tietyist, hyvist
ominaisuuksista: ne ovat yleens kemo-, regio- ja stereoselektiivisi.9 Entsyymien
katalysoimat reaktiot suoritetaan normaalipaineessa ja lmptilassa (NTP), jolloin
sivureaktioita tapahtuu vhemmn kuin perinteisiss kemiallisissa reaktioissa. Entsyymien
katalysoimissa reaktioissa suojaryhmien kytt on yleens tarpeetonta. Lisksi nit
biokatalyyttej saadaan eristetty luonnosta ja synteesituotteiden tuotantoprosessien
energiankulutus on NTP -olosuhteiden takia vhisemp.28 Edelleen biokatalyytit
hajoavat biologisesti ja teollisuudessa ympristystvllisyys tuo tuotteille lisarvoa.28
12
3.2 Syanohydriinien valmistaminen
Oksinitrilaaseja esiintyy luonnossa erittin yleisesti. Siemenkasvit tuottavat
puolustuksekseen ja aminohappojen biosynteesiin hydroksinitriililyaasia (HNL) eli
oksinitrilaasia. Kasvin sisltmt syanogeeniset glykosidit ja/tai syanolipidit ovat
stabiilissa muodossa olevia syanohydriinej, joita oksinitrilaasit pilkkovat vapauttaen
samalla vetysyanidia (kuva 10).15, 29, 30 -Hydroksinitriilien entsymaattisessa valmis-
tuksessa tt katalyyttiominaisuutta kytetn pinvastaiseen tarkoitukseen eli
syanohydriinien muodostamiseen.15 Syanohydriinit ovat trkeit kemiallisten reaktioiden
lhtaineina kytettvi bifunktionaalisia yhdisteit, joilla voidaan valmistaa
enantiopuhtaita synteesituotteita.31 Lipaasientsyymill (E.C.3.1.1.3) saadaan valmistettua
syanohydriinej, mutta tllin tuotteet muodostuvat raseemisena seoksena, aivan kuten
kemiallisessa reaktiossa.11
Kuva 10. Syanogeenisten glykosidien hajoaminen ensin glukosidaasin avulla, seuraavassa vaiheessa HNL katalysoi vetysyanidin vapautumisen kasvin puolustukseksi. - Hydroksinitriilien entsymaattinen valmistus tapahtuu knteisess reaktiossa. Mukaillen lhteist Schmidt et al. 17, Pichersky et al.32ja Johnson et al.33
13
Entsyymeill on niille suositellut nimet, mutta useiden eri synonyymien takia International
Union of Biochemistry and Molecular Biology:n nimemislautakunnasta koostuva
entsyymikomissio (E.C.) on luokitellut entsyymej E.C.-numeroilla vuodesta 1961
alkaen.34 E.C.-numeron kytt julkaisuissa on suositeltavaa epselvyyksien vlttmiseksi.
Entsyymien luokittelussa kytetn nelinumeroista jrjestelm, jossa ensimminen
numero kertoo reaktiotyypin, toinen reaktion alaluokan, kolmas antaa listietoa reaktiosta
ja neljs numero kertoo substraattispesifisyyden.35 Esimerkiksi E.C.4.1.2.x:ss
ensimminen 4. tarkoittaa, ett entsyymit kuuluvat lyaaseihin, toisena oleva 1. kertoo
kyseess olevan hiili-hiilisidoksia muodostava lyaasi ja kolmantena oleva 2. on
aldehydilyaasien numero.35, 36.
Enantioselektiivinen vetysyanidin additio tuottaa tietyn stereoisomeerin omaavia
syanohydriinej, jotka saadaan aikaan kyttmll hydroksinitriililyaaseja eli
oksinitrilaaseja. Nihin kuuluvat E.C.4.1.2.x; E.C.4.1.2.10, E.C.4.1.2.11, E.C.4.1.2.37,
E.C.4.1.2.38 ja E.C.4.1.2.39.18, 36. E.C.-numerot E.C.4.1.2.37 ja E.C.4.1.2.39 on poistettu ja
niit korvaavat uudet numerot E.C.4.1.2.46 ja E.C.4.1.2.47. Tss tyss kytetn uusia
numeroita, vaikka viitteess olisi kytetty vanhoja E.C.-numeroita. (Taulukko 1. s. 15)
3.2.1 Hydroksinitriililyaasilhteit
Kolmisentuhatta kasvilajia tuottaa oksinitrilaasientsyymi. Lajeihin kuuluu useita eri
kasvisukuja, joiden tuottamat entsyymit erovat toisistaan substraattispesifisyyden ja
koentsyymivaatimusten mukaisesti.37
Entsyymilhteet jaotellaan kahteen luokkaan sen mukaan, minklaisen kofaktorin ne
tarvitsevat. Luokkaan I kuuluvat kyttvt flaviiniadeniinidinukleotidia (FAD) ja luokkaan
II eivt.18. Luokkaan I kuuluvat Rosaceae-suvun alalajien Pruinoideae ja Maloideae
kasvit, kuten omenat (McHNL), kirsikat (PsHNL, PlyHNL) ja mantelit (PaHNL).18.
Niden entsyymien sekvenssi koostuu psntisesti N-glykolysoituneesta proteiinista,
jonka hiilihydraattipitoisuus on 30 %.17 I luokan entsyymien luonnossa esiintyv
substraatti on (R)-mantelinitriili (E.C.4.1.2.10).37, 38 (R)-mantelinitriililyaasin substraatti-
spesifisyys on laaja sill se reagoi mys alifaattisten, aromaattisten, heteroaromaattisten ja
-tyydyttymttmien aineiden kanssa.15 Luokkaan II kuuluvat entsyymit eivt vaadi
FAD:a toimiakseen. Thn luokkaan kuuluvat Euphorbiaceae-sukuun kuuluvat kumipuu
14
(Hevea Brasiliensis) HbHNL (E.C.4.1.2.47) ja kassava (Mannihot esculenta) MeHNL
(E.C.4.1.2.38). Niden entsyymien toiminta on /-hydrolaasien kaltaista. Edell
mainituista kasveista saatavan entsyymin luonnollinen substraatti on asetonisyanohydriini,
mutta ne hyvksyvt reagenssikseen mantelinitriililyaasin lailla alifaattiset, aromaattiset,
heteroaromaattiset ja -tyydyttymttmt substraatit. Niiden stereoselektiivisyys on
mantelinitriilist poiketen S-muotoa.37. (Taulukko 1. s. 15)
Muita II luokkaan kuuluvia kasveja ovat mm. durra ja pellava. Durran (Sorghum bicolor)
SbHNL (E.C.4.1.2.11), entsyymin aminohapposekvenssi on erilainen kuin muiden
tunnettujen hydroksinitriililyaasien ja muistuttaakin suurimmaksi osaksi
karboksipeptidaasien sekvenssi.37 Sen luonnollinen substraatti on (S)-4-hydroksi-
mantelinitriili, ja se reagoi lisksi aromaattisten ja heteroaromaattisten aineiden kanssa.15, 39
Pellavasta (Linus usitatissimum) saadaan (R)-spesifist hydroksinitriililyaasia (LuHNL,
E.C.4.1.2.46), joka on alkoholidehydrogenaasien lailla toimiva sinkist (Zn2+) riippuvainen
entsyymi. Sen luonnollinen substraatti on (R)-2-butanoni syanohydriini, ja se toimii
alifaattisten ja -tyydyttymttmien aldehydien kanssa.37 (Taulukko 1.)
Entsyymilhteest riippuen kullakin HNL:lla on sille optimaalinen pH-toiminta-alue.
Edell mainituista suurin osa toimii hyvin pH:ssa 5.5, mutta ritapauksia ovat MeHNL:n
pH-alue 3.55.4 ja PsHNL:n alue 6.07.0.18 Lisksi rekombinanttitekniikalla tuotetuilla
entsyymeill on omat optimialueensa.
Entsymaattisissa reaktioissa lmptilalla on suuri vaikutus entsyymien stabiilisuuteen ja
muodostuvien tuotteiden enantiomeeriseen puhtauteen. Sen lisksi, ett alhainen lmptila
(-5 4 C) stabiloi entsyymien toimintaa, tuottavat ko. lmptilassa tehdyt reaktiot
enantiomeerisesti puhtaampaa syanohydriini.3, 18, 40, 41
15
Taulukko 1. Hydroksinitriililyaasien E.C.-numerot, niiden suositellut nimet ja synonyymit.35, 42
E.C.-numero Systemaattinen nimi Synonyymej Substraatit pH alue Lmp- tila-alue
4.1.2.10 (R)- mantelinitriili bentsaldehydilyaasi (syanidia muodostava)
(R)-mantelinitriililyaasi, (R)-oksinitrilaasi, Oksinitrilaasi, D-oksinitrilaasi, D--hydroksinitriililyaasi mantelinitriili bentsaldehydilyaasi PaHNL, AtHNL, (R)-HNL, (R)-PeHNL, (R)-hydroksinitriililyaasi R-selektiivinen hydroksinitriililyaasi R-selektiivinen HNL (R)-(+)- mantelinitriililyaasi
Mantelinitiriili Alifaattiset ja aromaattiset aldehydit ja metyyliketonit
2,5-7 10-35 C
4.1.2.11 (S)-4- hydroksimantelinitriili 4-hydroksi bentsaldehydilyaasi (syanidia muodostava)
Hydroksimantelinitriililyaasi Hydroksinitriililyaasi Oksinitrilaasi (S)-4-hydroksimantelinitriili Hydroksibentsaldehydilyaasi Sorghum hydroksinitriililyaasi SbHNL
4-Hydroksi-mantelinitriili, aromaattiset aldehydit, ja metyyliketonit
3,2-6,5 -5-25 C
4.1.2.38 2-hydroksi-1,2-difenyylietanoni bentsaldehydilyaasi (bentsaldehydi muodostava)
Bentsoiini aldolaasi Bentsaldehydilyaasi
2-hydroksi-1,2-difenyylietanoni, 6-8,5 25-37
i
4.1.2.46
(2R)-2-hydroksi-2-metyylibutaaninitriili butan-2-one-lyaasi (syanidia muodostava)
Alifaattinen (R)- hydroksinitriililyaasi (R)-HNL (R)-oksinitrilaasi (R)-hydroksinitriililyaasi LuHNL
Asetonisyano-hydriini, alifaattiset aldehydit ja metyyliketonit 4,1-5,5 25 C
4.1.2.47 (S)-syanohydriinilyaasi (syanidia muodostava)
(S)-hydroksinitriililyaasi (S)-oksinitrilaasi, (S)-HbHNL (S)-MeHNL, Hydroksinitriililyaasi
Mantelinitriili, alifaattiset ja aromaattiset aldehydit sek metyyliketonit
4,8-8 -5-25 C
i stabiilisuustestien tulos
16
3.2.1.1 Rekombinanttientsyymit
Entsyymien saatavuus riippuu tuotantokasvin HNL pitoisuudesta ja kasvien sadosta. Jotta
entsyymien tuotanto ei olisi kasvien tuotannosta ja kasvikaudesta riippuvaista, on niiden
tuottamiseksi kehitetty geenitekniikkaan perustuvia menetelmi.15
Useita HNL-entsyymej on tuotettu yhdistelm-DNA-tekniikkaa hyvksi kytten.
Esimerkiksi bakteeri- ja hiivakantojen avulla on onnistuttu optimoimaan MeHNL ja
HbHNL entsyymien kloonaus ja tuottaminen.15 Mantelista (Prunus amygdalus, Pa)
saatavaa oksinitrilaasia, PaHNL-entsyymi, on muokattu DNA-tekniikalla kloonaamalla
isoentsyymi 5:a. Tt on edelleen tuotettu Pichia pastoris -hiivan kasvuliuoksessa
onnistuneesti.43, 44 Tll tavalla muokkaamalla voidaan tuottaa reaktiivisempia entsyymej.
Rekombinantti isoentsyymi PaHNL5:n toiminnallinen pH-alue on 2.56.5,44 ja
perinteisesti mantelista eristetyn PaHNL:n optimaalinen alue on 5.56.0. Reaktiivisempien
entsyymien ansiosta mys eptavallisten substraattien kytt on mahdollistunut44, 45 ja
lkeaineena kytettyjen kiraalisten tuotteiden saanto on parantunut.46
Yhdistelm-DNA-tekniikan avulla on tuotettu mys lituruohosta (Arabidopsis thaliana,
AtHNL, E.C.4.1.2.10), saatavaa oksinitrilaasia. Se on rakenteeltaan samankaltainen
raseemisen seoksen tuottavan lipaasientsyymin, sek (S)-syanohydriini tuottavien
HbHNL:n ja MeHNL:n kanssa.47, 48 Edell mainituista poiketen AtHNL tuottaa (R)-
konformaatiota. Tllin voidaan syntetisoida (R)-syanohydriinej49 tai (R)--
nitroalkoholeja.50
17
3.2.2 (R)-Oksinitrilaasi
Syanohydriinien synteesi on tehty pasiassa PaHNL -entsyymill, sill mantelista
perisin olevaa entsyymi on saatavilla kohtuulliseen hintaan ja runsaasti.51
Kirjallisuudessa on esitetty useita erilaisia menetelmi sislten eri lhtaineita ja muita
reagensseja syanohydriinien valmistamiseksi. Seuraavassa ksitelln vain (R)-
oksinitrilaasientsyymill suoritettuja reaktioita.
Suurin osa kaupallisesti kiinnostavista oksinitrilaasin substraateista on
bentsaldehydijohdannaisia, yleens veteen liukenemattomia aineita.42 Oksinitrilaasi on
inaktiivinen tysin vedettmiss olosuhteissa ja kaikissa viitteiss onkin kytetty vett
pH:n stmiseksi tai entsyymin aktivoimiseksi. Reaktioita (R)-oksinitrilaasilla on tehty
etyyliasetaatissa, di-isopropyylieetteriss (DIPE) ja dibutyylieetteriss.52-57 Tm johtuu
siit, ett nm liuottimet liukenevat veteen vain osittain. Tllin jopa hitaasti reagoivat
karbonyyliyhdisteet muodostavat haluttuja tuotteita mittmn pienill vetysyanidin
lisyksill.17 DIPE on osoittautunut hyvksi liuottimeksi, sill entsyymin aktiivisuus pysyy
pitkn hyvn.51 Muita kytettyj liuoksia ja liuosyhdistelmi ovat olleet vesi-etanoli,16, 52,
55 vesi-dietyylieetteri,52 metyyli-tert-butyylieetteri (MTBE),58, 59 etanoli-etikkahappo,60
vesi-ioniliuos,61 kaliumfosfaatti-sitraattipuskuri,12 tolueeni,12 ja dikloorimetaani.12
Vetysyanidilhtein on kytetty HCN,54, 55, 62, 63 KCN,52 asetonisyanohydriini,52, 62, 63
NaCN58 tai etyylisyanoformaattia.12
Reaktion pH:ta on sdetty oksinitrilaasientsyymille optimaalisen pH:n aikaansaamiseksi.
Kirjallisuudessa reaktioseoksen pH on vaihdellut 3,3 ja 7 vlill lhtaineesta ja puskurista
riippuen. Artikkeleissa todetaan optimin olevan pH viidess11, 17 tai 5,5-6,0:ssa.64 Tmn
lisksi todetaan orgaanisen liuottimen ja alhaisen pH:n, vhentvn kemiallista reaktiota.11,
37, 51
Reaktiolmptila vaikuttaa entsyymin stabiilisuuteen ja tuotteen enantiomeeriseen
puhtauteen.3 Syanohydriinej onkin syntetisoitu oksinitrilaasilla reaktioseoksissa joiden
lmptila on ollut 0 - 30 C asteen vliss, yleens noin 5 C:ssa.29, 65, 66
18
4 Hiilihydraatit
Hiilihydraatit ovat aldehydej tai ketoneja, joiden hiilirunkoon on liittyneen useita
hydroksyyliryhmi. Suurin osa luonnon orgaanisesta materiaalista koostuu
hiilihydraateista; ne toimivat muun muassa energiavarastona, osana DNA- ja RNA:ta sek
rakenne-elementtein kasvi- ja bakteerisoluissa. Kasvien kuivapainosta jopa 80 % on
hiilihydraatteja.20, 67
4.1 Mono-, oligo- ja polysakkaridit
Hiilihydraatit jaotellaan mono, oligo- ja polysakkarideihin. Monosakkarideissa on yksi
sokerimolekyyli, oligosakkarideista muodostuu hydrolyysiss kahdesta kahdeksaan
monosakkaridiyksikk68 ja polysakkaridit hydrolysoituvat monosakkarideiksi.69
Monosakkaridit ovat yksinkertaisimpia hiilihydraatteja, joissa on kolmesta yhdeksn
hiiliatomia69 ja joiden stereokemiallinen rakenne vaihtelee yhden tai useamman hiiliatomin
osalta. Viisi- ja kuusiatomiset sokerit ovat yleisimpi luonnossa. Pentooseja ovat mm. D-
ksyloosi ja D-arabinoosi, heksooseja ovat D-glukoosi, D-fruktoosi, D-galaktoosi ja D-
mannoosi.70 Monosakkaridit esiintyvt usein rengasrakenteisena johtuen molekyylin
etisten funktionaalisten ryhmien interaktiosta. Yleisesti aldehydin ja alkoholin reaktiossa
muodostuu hemiasetaali ja vastaavasti ketonin reagoidessa alkoholin kanssa muodostuu
hemiketaali.71 Sokerimolekyylin sisltmt hydroksyyliryhmt numeroidaan molekyyliss
olevien hiiliatomien mukaisesti.71
19
Kuva 11. Glukoosimolekyylin hemiasetaalin muodostuminen.71
Rengasrakenne syntyy, kun aldoheksooseista muodostuu hemiasetaali ensimmiseen ja
viidenteen hiilen kiinnittyneen ryhmn reaktiossa esimerkkin glukoosi (kuva 11).
Vastaavasti ketoheksooseista muodostuu hemiketaali, kun toisen ja viidennen hiilen
funktionaaliset ryhmt reagoivat keskenn esimerkkin fruktoosi (kuva 12.). Molemmissa
tapauksissa entiseen karbonyylihiileen muodostuu uusi kiraliakeskus ja siit tulee ns.
anomeerinen hiili.
Kuva 12. Fruktoosin hemiketaalin muodostuminen.71
Rengasrakenteinen, anomeerisen hiilen sisltv sokerimolekyyli esiintyy - tai -
muodossa, riippuen muodostuneen hydroksyyliryhmn suunnasta molekyyliin nhden.71
Liuoksissa sokerien anomeeriset muodot esiintyvt tautomerisessa tasapainossa (kuva
13.)72
20
Oligo- tai polysakkaridissa anomeerisen hiilen hydroksyyliryhm on sitoutunut toisen
sokerimolekyylin hiileen. Sokerimolekyylin anomeerinen hiili voi liitty toisen sokerin
mihin tahansa hydroksyyliryhmn muodostaen uuden - tai -glykosidisen sidoksen.
Aksiaalisesti toisiinsa sitoutuneet sokerimolekyylit voivat muodostaa kierteisen
konformaation, tllin glykosidiset sidokset ovat -muotoa. Trkkelyksen sisltm
amyloosi on esimerkki tllaisesta kierteisest muodosta. -Glykosidisten sidosten
muodostama molekyyli on taas lineaarinen, kuten esimerkiksi galaktomannaanissa.70
Kuva 13. Glukoosin vesiliuoksessa (rt) muodostuvat eri tautomeriamuodot. - furanosodi, -furanosodi-, ja asyklista aldehydi -muotoa on liuoksessa yhteens alle 0,2 %. Mukaillen lhteest 72
21
Kolme trkeint oligosakkaridia ovat sakkaroosi, laktoosi ja maltoosi, nm kaikki ovat
disakkarideja. Niiden kemiallinen merkitys on lhinn ravitsemuksellinen. Ne
hydrolysoituvat elimistss siten, ett sakkaroosi glukoosiksi ja fruktoosiksi, laktoosi
galaktoosiksi ja glukoosiksi sek maltoosi kahdeksi glukoosiksi. Nm muutetaan
elimistss aineenvaihdunnan avulla energiaksi.71 Ers esimerkki trisakkaridista on
raffinoosi, jota saadaan uutettua soijapavuista.73 Raffinoosi koostuu galaktoosi-, glukoosi-
ja fruktoosiyksikist (kuva 14.).68 Trisakkaridina siin on noin 30 %
galaktoosiyksikit.74
Kuva 14. Raffinoosin eli -D-Galaktopyranosyyli-(16)--D-glukopyranosyyli-(12)--D-fruktofuranosidin rakenne. Mukailtu lhteest Neubauer et al. 75
Polysakkaridit ovat homo- tai heteropolysakkarideja sen mukaan koostuuko sen rakenne
samanlaisista vai erilaisista monosakkarideista. Polysakkaridien rakenne voi olla suora tai
haaroittunut. Esimerkiksi glukoosin energiavarastomuoto glykogeeni on
homopolysakkaridi. Se koostuu suorasta glukoosiketjusta, jossa on noin joka
kymmenenness yksikss haarautuma.69 Ers esimerkki heteropolysakkaridista on
guarkumi (kuva 15.).
22
4.2 Galaktomannaanit
Galaktomannaanit ovat trkeit polysakkarideja useilla eri teollisuuden aloilla. Vilja- ja
palkokasvien siementen varastoravintoa on yleens trkkelys, mutta joidenkin
palkokasvien varastopolysakkaridina toimivat galaktomannaanit.76 Nm ovat
monikyttisi makromolekulaarisia hiilihydraatteja, joita saadaan sek monivuotisten
puuvartisten ett yksivuotisten kasvien siemenist.77 Guarkumi (Cyamopsis
tetragonolobus) on ers tllainen yksivuotinen palkokasvi, jota kasvaa runsaasti Intian
niemimaalla. Sen rakenne on muistuttaa useimmista palkokasveista saatavien
galaktomannaanien perusrakennetta (kuva 15.). Se on lineaarinen (14) -glykosidisin
sidoksin sitoutunut D-mannopyranosidiketju, jossa on satunnaisesti liittyneen yksittinen
(16)-sidoksella kiinnittynyt D-galaktoosihaara. Johanneksen leippuusta (Cerartonia
siliqua) saatava kumi (locust bean gum, LBG) on toinen trke galaktomannaani.78
Kuva 15. Idealisoitu guarkumin rakenne.77
Eri kasvilajien galaktomannaanit eroavat toisistaan mannoosi-galaktoosi -suhteen (M:G),
galaktoosihaarojen paikan- ja molekyylipainovaihteluvlin mukaan.76, 79 Galaktoosihaarat
voivat esiinty molekyyliss snnllisesti, satunnaisesti tai jaksoina. Guarkumin M:G -
suhde on noin 2:1 ja siin olevat galaktoosiyksikt esiintyvt pareittain tai kolmen
sarjoissa. Haarautumaton mannoosiketju on yleens alle kuuden sokerimolekyylin
mittainen.76, 78 Johanneksenleippuukumin M:G -suhde on 4:1 ja sen haarautumaton
mannoosiketju voi olla jopa 20. yksikn mittainen.70 Johanneksenleippuun
23
galaktomannaanin galaktoosipitoisuus on noin 1726 % ja guarkumin galaktoosipitoisuus
vaihtelee 3340 % vlill.74, 77 Galaktomannaanien rakenteiden erot vaikuttavat niiden
vesiliukoisuuteen, viskositeettiin ja reaktiivisuuteen.80 Nm mrittelevt edelleen kunkin
galaktomannaanin teolliset sovellukset. Guarkumin teollinen kytt on lhtisin
paperiteollisuuden tarpeista, mutta koska se on taloudellisin ja runsaimmin saatavilla oleva
raaka-aine, on sen kytt nykyn laaja-alaista mm. elintarvike- ja lketeollisuudessa.76
Kytttarkoituksesta riippumatta galaktomannaanin perusrakenne pysyy
muuttumattomana, mutta mm. molekyylipainoa, viskositeettia ja liukoisuutta voidaan
muuttaa hydrolyyttisella tai oksidatiivisella depolymerisaatiolla. Tllin muodostetaan
stabilisaattoreita, viskositeetin muodostajia ja emulsaattoreita.76 Nit kytetn
ljylhteiden kaivauksissa, rjhde-, kaivos-, paperi- ja tekstiiliteollisuudessa. Edelleen
guarkumia kytetn ruoka-, lke- ja kosmetiikkateollisuudessa edullisena lisaineena
esimerkiksi estmn veden kidemuodostusta jteliss, ravintoaineissa lismss
kyllisyyden tunteen syntymist ja ruokavalmisteissa miellyttvn suutuntuman
aikaansaamiseksi.76, 77, 81
4.2.1 Galaktomannaanien reaktiivisuus
Guarkumin galaktoosisivuhaarat sisltvt yhden primaarisen ja kolme sekundaarista OH-
ryhm, substituoitu mannoosi kaksi sekundaarista OH-ryhm, sek substituoimaton
mannoosi kaksi sekundaarista ja yhden primaarisen OH-ryhmn (kuva 15).77
Galaktomannaanien hydroksyyliryhmt voidaan derivatisoida. Niiden primaariset ja
sekundaariset hydroksyyliryhmt (OH) ovat lhes yht reaktiivisia.77 Yleisesti ottaen
primaarinen hydroksyyli reagoi helpommin kuin sekundaarinen. Hydroksyyliryhmi on
mahdollista hapettaa selektiivisesti kyttmll joko kemiallista tai entsymaattista
menetelm. Kemiallisessa reaktiossa voidaan kytt esimerkiksi 2,2,6,6-
tetrametyylipiperidiini-1-oksyyli (TEMPO)82, 83 ja entsymaattisessa esimerkiksi
galaktoosioksidaasia (GO).74, 84, 85 TEMPO:lla galaktoosin ja vapaiden mannoosiryhmien
C-6 hydroksyyliryhmt hapettuvat karboksyylihapoksi. Entsymaattisella menetelmll
terminaalisten galaktoosien C-6 hydroksyyliryhmt hapettuvat aldehydiksi.
Guarkumia voidaan derivatisoida tarpeen mukaan muodostamalla siit estereit tai
eetterijohdannaisia. Sit karboksimetyloidaan vesiliuoksissa86, 87 ja hydroksietyloidaan
24
emksisiss olosuhteissa.88 Siit on muodostettu metyylieettereit, joiden
metyylisubstituentit ovat olleet satunnaisesti kiinnittyneen sokerirenkaisiin
substituutioasteella 0,3-0,6.89 Teollisuuden tarpeisiin valmistetaan hydroksipropyyli-,
hydroksietyyli-, karboksimetyyli-hydroksipropyyli- ja kationista guarkumia.90 Mys
kationisia hydroksyylipropyyliguarkumeja, hydrofobisia guarkumeja sek
guarkumifosfaatteja valmistetaan.77 Hydroksyyliryhmien korvautumista kuvataan
substituutioasteella (DS, degree of substitution). Sen maksimaalinen arvo on kolme, jolloin
kaikki molekyylin hydroksyyliryhmt ovat substituoituja.90 Polysakkaridin
liukoisuusominaisuudet voivat muuttua niinkin pienill DS:n arvoilla kuin 0,1.90
Guarkumia voidaan depolymerisoida lmmittmll sit suolahapon kanssa.89 Mys
muiden vahvojen happojen tai orgaanisten happojen, kuten sitruuna- tai askorbiinihapon,
kyttminen on mahdollista. Ketjun pilkkomiseen on mahdollista kytt mys emksisi
olosuhteita tai vahvoja hapettimia esim. vetyperoksidia, mys elektronisuihkulla tai
gammasteill steilyttminen pilkkovat polymeerin pienempiin osasiin.77 Nin ollen
derivatisointireaktioita suoritettaessa on huomioitava kytetyn emksen konsentraatio,
lmptila sek reaktioaika suurimman mahdollisen substituutioasteen saavuttamiseksi,
kuitenkin molekyylikoon siit krsimtt.89
25
KOKEELLINEN OSUUS
5 Johdanto
Tss tyss tutkittiin oligo- ja polysakkarideja, joiden terminaalisen galaktoosin C-6-
asemassa oleva hydroksyyliryhm hapetettiin entsymaattisella reaktiolla selektiivisesti
aldehydiksi. Muodostetun aldehydin annettiin edelleen reagoida vetysyanidin kanssa siten,
ett katalyyttin toimi mantelista perisin oleva oksinitrilaasientsyymi. Reaktioseoksessa
muodostui syanohydriini, joka hydrolysoitui edelleen -hydroksiamidiksi (kuva 16.).
Reaktioseokseen mahdollisesti jljelle jnyt lhtaine (aldehydi) pelkistettiin alkoholiksi
NaBH4:ll.
Kuva 16. Synteesireitti, GO = galaktoosioksidasi, HRP= piparjuuriperoksidaasi, PaHNL= (R)-oksinitrilaasientsyymi
Tuotteet analysoitiin pasiassa kaasukromatografia-massaspektrometrill (GC-MS).
Analyysi varten tuote kuivattiin vakuumiuunilla, hydrolysoitiin ja silyloitiin.
Synteesituotteiden rakenteet varmistettiin nestekromatografia-massaspektrometrilla (LC-
MS/MS) ja ydinmagneettisella resonanssispektroskopialla (NMR). Nit menetelmi
varten nytteet kuivattiin kylmkuivaimella.
26
5.1 Materiaalit ja menetelmt
5.1.1 Reagenssit ja entsyymit
Sakkaridit:
D-(+)-raffinoosi pentahydraatti (Sigma R0250)
Guarkumi, GG (Sigma, G 4129)
Pilkottu guarkumi, GM50, (3KP17, mw 50 000 g/mol)
Metyyli--D-galaktopyranosidi (Fluka 66916)
D-(+)-mannoosi, Merck
D-(+)-glukoosi, Merck
D-(+)-galaktoosi, Merck
Syanidilhteet:
Natriumsyanidi, NaCN, Merck
Etyylisyanoformaatti, NCCOOEt, (Sigma E18859)
Entsyymit:
Galaktoosioksidaasi (GO, G7907, E.C.1.1.3.9, Sigma), 73 U/mg
Piparjuuriperoksidaasi (HRP, P8250, EC 1.11.1.7, Sigma), Tyyppi II, 188 U/mg
Katalaasi (Kat, C30, E.C. 1.11.1.6, Sigma), 22000 U/mg ja 638 kU/ml
(R)-Oksinitrilaasi (PaHNL, M6782, E.C.4.1.2.10, Sigma) 560 U/ml
-glukosidaasi (G0395, E.C. 3.2.1.21, Sigma) 2,18 U/mg
Hydroksinitriililyaasi (HNL), Arabidopsis thaliana, recombinant from E.Coli, (79847,
Sigma), 581 U/ml
27
Pelkistimet:
Natriumboorihydridi (NaBH4, Sigma)
Natriumboorideuteridi (NaBD4, Sigma)
Silylointireagenssit:
Klooritrimetyylisilaani, TMCS (Fluka 92360)
Heksametyylidisiloksaani, HMDS (Fluka 52619)
Pyridiini, py, (Sigma)
Muut reagenssit:
Etanoli, EtOH, (92,4 %)
Metanoli, MeOH, (Sigma)
Asetyylikloridi, (Sigma)
Sitruunahappo monohydraatti, (Merck)
Trinatriumsitraatti dihydraatti, (Merck)
Natriumdivetyfosfaatti dihydraatti NaH2PO42H2O, (Riedel de Han)
Dinatriumvetyfosfaatti Na2HPO4, (Riedel de Han)
Dowex 1x2-200 ioninvaihtohartsi, (Sigma 217387)
Synteesit tehtiin huoneenlmptilassa magneettisekoituksella.
28
5.1.2 Sokereiden hapetus
Hapetettua sakkaridia valmistettiin D-(+)-raffinoosi pentahydraatista (Raf) sek
guarkumista (GG).74, 84 Menetelmss galaktoosiyksikn C-6 hydroksyyli hapetetaan
selektiivisell entsymaattisella menetelmll aldehydiksi vesiliuoksessa. Hapetusreaktioon
kytettyjen entsyymien pitoisuus laskettiin suhteellisena osuutena polysakkaridin
sisltmist terminaalista galaktoosiyksikist.
D-(+)-raffinoosi pentahydraattia liuotettiin ultrapuhtaaseen veteen siten, ett sen
raffinoosipitoisuus oli 42 mM. Liuosta sekoitettiin 200-300 rpm nopeudella kahden tunnin
ajan huoneenlmptilassa, jotta kaikki raffinoosi oli varmasti liuennut. Thn liuokseen
listtiin galaktoosioksidaasia (GO) 73U, katalaasia (kat) 127 kU ja piparjuuriperoksidaasia
(HRP) 226 U. Liuosta hapetettiin avoimessa astiassa 200 rpm sekoituksella 72 tunnin ajan
+4 C. Entsyymien toiminta inaktivoitiin kuumentamalla liuosta kiehuvassa vesihauteessa.
Liuoksen sislmptilaa pidettiin 5 minuutin ajan 80 C, jonka jlkeen liuos siirrettiin
silpulloon ja +4 C. Tst liuoksesta otettiin nyte hapetusasteen mrityst varten.
Guarkumia hapetettaessa liuotettiin se ultrapuhtaaseen veteen ja annettiin liuoksen (1
mg/ml) sekoittua 200-300 rpm nopeudella kahden tunnin ajan. Thn liuokseen listtiin
GO (29 U), kat (51 kU) sek HRP (188U). Liuosta hapetettiin avonaisessa astiassa 200
rpm sekoituksella 24 h, + 4 C. Reaktio lopetettiin lmmittmll seosta vesihauteessa,
jossa sit pidettiin niin kauan ett liuoksen sislmptila oli 5 minuutin ajan + 80 C. Liuos
jhdytettiin ja silytettiin + 4 C. Liuoksesta otettiin nyte hapetusasteen mrityst
varten. (Taulukko 7. s. 43)
Pilkottua guarkumia (GM50) hapetettiin liuottamalla sit (5 mg/ml) ultrapuhtaaseen veteen,
liuosta sekoitettiin 200-300 rpm 1,5 tunnin ajan huoneenlmptilassa. Reaktio
kynnistettiin lismll liuokseen HRP (37,6 U), kat (10 kU) ja GO (5,8 U).
Reaktioliuosta sekoitettiin avonaisessa astiassa 200 rpm sekoituksella + 4 C 48 h, jonka
jlkeen se siirrettiin silpulloon.
29
5.2 Syanohydriinien synteesi
Syanohydriininien syntetisointia on tehty aikaisemmin useilla eri entsyymeill, mutta
reaktioliuoksena on ollut joko liuotin tai kaksifaasisysteemi. Vaihtoehtoisesti entsyymej
on kytetty kantajamateriaalissa, esimerkiksi selluloosassa. Tss tyss tarkoituksena oli
saada mantelista perisin oleva (R)-oksinitrilaasientsyymi toimimaan sellaisenaan vesi-
puskuri-liuoksessa.
Synteeseiss tutkittiin (R)-oksinitrilaasientsyymi sek -glukosidaasia, jotka molemmat
toimivat kasveissa syanogeenisten glykosidien katabolian katalyyttein. Lisksi kokeiltiin
lituruohosta saatavan hydroksinitriililyaasin toimivuutta. Synteesit suoritettiin pasiassa
pH 4.0:ssa, jotta korkeammassa pH:ssa tapahtuva kemiallinen reaktio olisi ehkisty
mahdollisimman hyvin. Kemiallisen reaktion suuruutta tutkittiin ns. reaktionollalla, jossa
reaktio suoritettiin entsymaattisen reaktion optimaalisissa olosuhteissa ilman entsyymi.
Suoritettuja kokeita tehtiin suuri mr, sill haluttiin selvitt kaikkien reaktioon
osallistuvien aineiden ristikkisvaikutus. Nin ollen esimerkiksi oksinitrilaasilla
onnistuneet kokeet toistettiin -glukosidaasilla. Lisksi synteesin toimivuutta tutkittiin
guarkumilla.
5.2.1 Syanidilhteet
Reaktioissa syanidilhteen kytettiin natriumsyanidia (NaCN) ja etyylisyanoformaattia
(NCCOOEt). Kirjallisuuden mukaan asetonisyanohydriini olisi helppokyttinen
kaupallinen syanidilhde syanohydriinin muodostamiseksi, sill se liukenee veteen ja
hydrolysoituu reaktioseoksessa asetoniksi ja syanidiksi.2 Valitettavasti
asetonisyanohydriini ei ollut saatavilla tynsuoritusajankohtana. Mys sek
natriumsyanidi ett etyylisyanoformaatti muodostavat reaktioseokseen vetysyanidia in situ.
Etyylisyanoformaatti hajoaa vedess (kuva 17.) muodostaen vetysyanidia, hiilidioksidia ja
etanolia, kun taas natriumsyanidi muodostaa vetysyanidia ja emst.
30
Kuva 17. Etyylisyanoformaatin hajoaminen vedess.12
Ensimmiset kokeet tehtiin natriumsyanidilla, mutta todettiin kytn olevan hankalaa pH:n
stmisen takia. Etikkahapolla olisi ollut mahdollista aikaansaada oikea pH
natriumsyanidia kytettess,39 mutta riskin oli sakkaridin hydrolysoituminen, joten sit
reitti ei edes harkittu. Natriumsyanidin emksisyys aiheutti reaktioseokseen pH:n
kohoamisen jopa kolmeentoista saakka. Tllin reaktioseokseen listtiin sitruunahappoa,
jonka seurauksena liuoksen puskurointikyky menetettiin. Koska reaktio-olosuhteiden
vakioiminen todettiin hankalaksi ja samanlaisten olosuhteiden aikaansaaminen useisiin eri
reaktioihin koettiin mahdottomaksi, ptettiin jatkossa kytt etyylisyanoformaattia
syaanilhteen.
5.2.2 Puskuriolosuhteet
Kytetyt lhtaineet olivat sakkarooseja jotka liukenevat veteen ja pyridiiniin sek osittain
etanoliin. Lhtaineiden hapetus tehtiin laimeissa vesiliuoksissa ja jatkoreaktion
puskurointikyky saavutettiin lismll lhtaineliuokseen vkevmp puskuria. Tm
laimeni siten, ett saatiin reaktioille sopiva puskurikonsentraatio ja pH.
Kirjallisuudessa (R)-oksinitrilaasin kanssa on yleisimmin kytetty sitraattipuskuria66 mutta
mys fosfaatti-12, 21 tartraatti-11, 91 ja asetaattipuskureja29, 92 on kytetty. Fosfaattipuskurilla
saavutettava pH-taso (5,78,0) on huomioitava sit kytettess ja puskurin pH:ta
laskettiinkin kirjallisuuden mukaisesti sitruunahapolla.12, 21
Tss tyss puskuriliuoksena kytettiin pasiassa pH 4.0:n sitruunahappopuskuria, mutta
mys saman pH:n fosfaatti-sitraattipuskurin toimivuutta kokeiltiin. Edelleen testattiin
synteesin toimivuutta fosfaattipuskurin pH-tason alarajalla (5,8) ja sen vaikutusta
kemiallisen reaktion mrn.
31
5.3 Synteesit hapetetulla raffinoosilla
5.3.1 Reaktiot natriumsyanidilla
Alkuvalmisteluina turvotettiin -glukosidaasi entsyymi, jotta se oli aktiivista heti
reaktioseokseen pipetoitaessa. -glukosidaasia punnittiin Eppendorf-putkeen, johon
listtiin natriumsitraattipuskuria (pH 4,0) siten, ett liuoksen puskurikonsentraatio oli
reaktioseoksessa noin 40 mmol. Entsyymin annettiin turvota putkessa 20 minuutin ajan. -
glukosidaasilla tehdyiss reaktioissa liuoksen vri oli keltainen tai kellertv.
Kaksikaulakolviin, jossa oli magneettisekoitus, pipetoitiin hapetettua raffinoosiliuosta
(esim. 0,34 mmol). Kolviin listtiin joko 0,1 M natriumsitraattipuskurissa turvotettua -
glukosidaasia (esim. 55 U) tai (R)-oksinitrilaasia (esim. 106 U) sek punnittu,
sitruunahappoon (pH 4,0) liuotettu natriumsyanidi (NaCN, esim. 2 mmol). Liuoksen
natriumsitraattikonsentraatio oli tllin 48 mM (taulukko 2.). Lisysten jlkeen tarkistettiin
liuoksen pH ja sdettiin se neljksi sitruunahapon avulla. Kolviin liitettiin
vetysyanidipoisto, joka johdettiin letkun kautta suppilolla laimeaan NaOH -liuokseen.
Tllin reaktioseoksesta mahdollisesti kaasumaisena vapautuva vetysyanidi ji
emsliuokseen. Tt vetysyanidin talteenottoa kytettiin kaikissa kokeissa.
Taulukko 2. Reaktiot hapetetulla raffinoosiliuoksella (Raf), jossa vetysyanidia vapauttavana reagenssina oli natriumsyanidi (NaCN). Puskurina kytettiin natriumsitraattia pH 4,0.
Koe n (Raf) [mmol]
-glukosi-daasi [U]
n (NaCN) [mmol]
Oksi-nitrilaasi
[U]
Puskuri-konsen-traatio [mM]
RAFCN 1 0,34 55 2 48
RAFCN 2 0,34 110 4 40
RAFCN 7 0,17 106 1 40
RAFCN 6 0,17 1 106 40
32
Reaktio suoritettiin huoneenlmptilassa, ilman erillist jhdytyst. Seoksesta otettiin
nytteit 0-24 h reaktioajoilla. Nytteet (esim. 0,08 mmol gal) saostettiin etanoli-vesi -
liuoksella (3:1), sentrifugoitiin 13400 rpm, 5 min. Supernatantti dekantoitiin pois, sakka
pestiin vedell ja nyte saostettiin uudelleen etanoli-vesi -liuoksella. Nytteet pelkistettiin
NaBD4:lla (esim. 0,2 mmol) yli yn, ja saostettiin kuten edell. Vaihtoehtoisesti nytteet
pelkistettiin ensin NaBD4:lla, jonka jlkeen suoritettiin vastaava saostus ja pesu kuin edell
ennen pelkistyst. Saatu tuote jatkoksiteltiin kohdan 5.5. mukaisesti.
5.3.2 Reaktiot etyylisyanoformaatilla
Kolviin pipetoitiin hapetettua raffinoosiliuosta (esim. 0,10 mmol), listtiin
natriumsitraattipuskuria (pH 3,3 tai 4,0) siten, ett liuoksen puskurikonsentraatio oli 10 tai
40 mM (taulukko 3). Vaihtoehtoisesti kytettiin fosfaattisitraattipuskuria. Seokseen listtiin
natriumsitraattipuskurissa turvotettua -glukosidaasia (esim. 57 U) tai mantelista perisin
olevaa oksinitrilaasia (esim. 53 U) sek etyylisyanoformaattia (NCCOOEt, esim. 0,42
mmol), (taulukko 3.). Etyylisyanoformaatti ei liuennut vesi- puskuri -liuokseen, joten
NCCOOEt:in reaktiivisuutta parannettiin pienentmll sen pisarakokoa. Pisara hajotettiin
sekoitusta hetkellisesti nopeuttamalla, jolloin seokseen muodostui useita mikropisaroita.
Nin saavutettiin suurempi reaktiivinen pinta-ala, joka lissi reaktiivisuutta.
Reaktiot toteutettiin huoneenlmptilassa magneettisekoituksella. Nytteidenotto- ja
reaktioaika oli 0,5-25 tuntia. Nytteet pelkistettiin analyysimenetelmn vaatimusten
mukaisesti joko NaBD4:lla tai NaBH4:ll yli yn. Nytteet saostettiin etanoli-vesiliuoksella
(6:1-8:1), sentrifugoitiin ja pestiin kuten kohdassa 5.5.
33
Taulukko 3. Hapetetulla raffinoosiliuoksella (Raf) tehtyj kokeita, jossa vetysyanidilhteen toimi etyylisyanoformaatti (NCCOOEt).
Koe n (Raf) [mmol]
-glukosi-
daasi [U]
n (NCCOOEt)
[mmol]
Oksi-nitrilaasi
[U]
Natrium-sitraatti-puskuri [mM]
Fosfaatti-sitraatti- puskuri [mM]
RAFCN 9 0,10 57 0,42
40
RAFCN 3 0,34 1,2 106 10
RAFCN 8 0,17 0,84 53 40
RAFCN 14 0,17 0,84 53 40
RAFCN 14_II 0,50 2,5 160 40
RAFLituCN 0,20 0,84 54a 40
a Rekombinanttitekniikalla tuotettu, lituruohosta perisin oleva oksinitrilaasi, AtHNL (taulukko 1. s. 15).
5.3.3 Kemiallisen reaktion tutkiminen
Kemiallisessa reaktiossa muodostuvien syanohydriinien mr rajoitetaan pitmll
reaktion pH mahdollisimman alhaisena. Tss tyss reaktiot suoritettiin suurimmaksi
osaksi pH 4:ss, jossa entsyymin toiminta olisi kohtalaista ja kemiallinen reaktio olisi ollut
vhist. Kemiallista reaktiota tutkittiin seuraamalla etyylisyanoformaatin ja
raffinoosialdehydin vlist reaktiota puskuriolosuhteissa. Tutkittiin lisksi pelkn puskurin
vaikutusta hapetettuun raffinoosiliuokseen (taulukko 4).
Hapetettua raffinoosiliuosta (esim. 0,17 mmol), natriumsitraatti- tai fosfaatti-
sitraattipuskuria (pH 4,0) ja etyylisyanoformaattia (esim. 0,84 mmol) sekoitettiin
huoneenlmptilassa 1-19 tunnin ajan. Liuoksen puskurikonsentraatio oli 40 mM.
Seoksesta otetut nytteet pelkistettiin NaBD4:lla. Pelkistetty nyte saostettiin etanolilla
(1:3-1:6). Nyte sentrifugoitiin 13400 rpm, 10 min. Supernatantti kaadettiin pois ja nyte
pestiin vedell, toistettiin saostus ja sentrifugointi. Nytteet ksiteltiin kohdan 5.5
mukaisesti.
34
Taulukko 4. Kemiallisen reaktion tutkiminen pH 4,0:ssa.
Koe n (Raf) [mmol]
n (NCCOOEt)
[mmol]
Natrium-sitraatti-puskuri [mM]
Fosfaatti-sitraatti- puskuri [mM]
RAFCN 0 0,17 0,84 40
RAFCN0_2 0,10 40
RAFCN 15 0,10 0,42 40
5.3.4 Reaktiot korkeammassa pH:ssa
Tutkittiin pH:n vaikutusta reaktioon, tutkittiin mys vastaava reaktionolla kemiallisen
reaktion vertaamiseksi korkeammassa pH:ssa.
Hapetettuun raffinoosiliuokseen (0,17 mmol) listtiin natriumsitraatti- tai
natriumvetyfosfaattipuskuri. Puskurien pH-arvot olivat 5,8 ja reaktiossa reaktioseoksen pH
sdettiin 5,95 vastaavan puskurin happo- tai emsmuodolla. Reaktioseoksen
puskurikonsentraatio oli 40 mM. Seokseen listtiin oksinitrilaasientsyymi (53 U) sek
etyylisyanoformaatti (0,84 mmol), (taulukko 5.). Reaktio- ja nytteidenottoaika oli 1-4
tuntia. Nytteet pelkistettiin NaBH4:ll yn yli, saostettiin etanolilla (1:8) ja pestiin kuten
edell kohdassa 5.5.
Taulukko 5. Hapetetun raffinoosiliuoksen kokeet pH 5,95:ss.
Koe n (Raf) [mmol]
Oksi-nitrilaasi
[U]
n (NCCOOEt)
[mmol]
Natrium-sitraatti-puskuri [mM]
Natrium-vetyfosfaatti-
puskuri [mM]
RAFCN 10 0,17 53 0,84 40
RAFCN 11 0,17 53 0,84 40
RAFCN 13 0,10 0,42 40
35
5.4 Synteesit hapetetulla guarkumilla
Reaktion toimivuutta tutkittiin hapetetulla guarkumiliuoksella. Lisksi reaktiota tutkittiin
hapetetulla, pilkottua guarkumia (molekyylipaino noin 50 000 g/mol, GM50) sisltvll,
liuoksella. Selvitettiin lisksi reagenssien mrn vaikutusta tulokseen.
Hapetettuun guarkumiliuokseen (esim. 0,1 mmol gal) listtiin oksinitrilaasia (esim. 38 U)
tai natriumsitraattipuskurissa turvotettua -glukosidaasia (40 U). Liuokseen listtiin joko
sitruunahappoliuokseen (pH 4,0) liuotettua NaCN (0,45 mmol) tai etyylisyanoformaattia
(esim. 0,56 mmol), sek natriumsitraattipuskuria (pH 4,0). Liuoksen puskurikonsentraatio
oli 40 mM tai 160 mM (taulukko 6.).
Taulukko 6. Hapetetulla guarkumilla suoritetut kokeet. GG_kem = kemiallisen reaktion tutkiminen, GG_oxCN ja GuarCN 1 ja 2 ovat guarkumiliuoksien koodeja, GuarCN_R = rekombinanttitekniikalla tuotetun entsyymin AtHNL merkint, GM50_oxCN ja CN2 ovat pilkotun guarkumin (M =50 000 g/mol) koodeja, n(Gal) on reaktioseoksen sisltm laskennallinen galaktoosin ainemr.
Koe n (Gal) [mmol]
-glukosi-
daasi [U]
Oksi-nitrilaasi
[U]
n (NaCN) [mmol]
n (NCCOOEt)
[mmol]
Natrium-sitraatti-puskuri [mM]
GG_kem. 0,02 0,11 40
GG_oxCN 0,10 40 0,45 160
GuarCN 1 0,10 38,0 0,56 40
GuarCN 2 0,10 76,0 1,12 40
GuarCN_R 0,10 38,0a 0,56 40
GM50_oxCN 0,04 15,2 0,22 40
GM50_oxCN 2 0,04 30,4 0,44 40
a Rekombinanttitekniikalla tuotettu, lituruohosta perisin oleva oksinitrilaasi, AtHNL (taulukko 1. s.15).
36
Reaktio- ja nytteenottoaika oli 1-24 tuntia. Nytteet (0,007-0,010 mmol gal) joko
pelkistettiin heti NaBD4:lla (0,03-0,07 mmol) yn yli ja pelkistettiin seuraavana pivn tai
vaihtoehtoisesti saostettiin ennen pelkistyst. Nytteet saostettiin etanolilla (1:1-1:3),
sentrifugoitiin 13000 rpm 5 min, dekantoitiin supernatantti pois ja pestiin etanoli-
vesiseoksella (1:1-3:1). Toistettiin sentrifugointi ja dekantointi. Nytteet jatkoksiteltiin
kohdan 5.5. mukaisesti.
5.5 Nytteiden ksittely
5.5.1 GC-MS nytteiden valmistaminen
5.5.1.1 Pelkistminen
Hapetetuista sakkaridiliuoksista, tai vaihtoehtoisesti syanohydriinien synteeseist, otetut
nytteet pelkistettiin NaBD4:ll. Tllin lhtaineen raffinoosin tai guarkumin galaktoosin
C-6- asemassa ollut hapettunut aldehydi pelkistyi deuteroiduksi alkoholiksi. Nytteisiin
listtiin kolmea galaktoosiekvivalenttia vastaava mr NaBD4:a, jonka annettiin reagoida
yn yli huoneenlmptilassa magneettisekoituksella. Nytteet saostettiin etanolilla (1:1-
1:8) ja sentrifugoitiin 5 tai 10 min 13400 rpm. Supernatantti dekantoitiin pois ja sakka (5-
10 mg) siirrettiin prynkolviin.
5.5.1.2 Hapan metanolyysi ja silylointi
Reaktioseoksista otetut pelkistetyt ja saostetut nytteet kuivattiin veden poistamiseksi
prynkolvissa vakuumiuunissa +40 C, 30120 min, 0 bar. Nytteet hydrolysoitiin
happamalla metanolyysill, jolloin sokerimolekyyleist muodostettiin metyylieettereit.
Tllin tutkittavana olleen polysakkaridin terminaalinen galaktoosiyksikk saatiin erilleen
ja metyloitua 1-asemassa olleen hiilen hydroksyylistn.93-95. Edelleen nyte silyloitiin,
jotta saatiin muodostettua haihtuva, GC-MS:ll analysoitava monomeeri. Silyloinnissa
galaktoosin ja muidenkin liuoksessa olevien sokereiden vapaat hydroksyyliryhmt
derivatisoitiin trimetyylisilyylieettereiksi (kuva 18.).93, 94
37
Kuva 18. NaBD4:ll pelkistetyn guarkumin metanolyysi ja silylointi kaavamaisesti esitettyn. Kuvassa olevat rakenteet ovat esitetty esimerkinomaisesti, sill metanolyysiss voi muodostua useita eri sokerirakenteita.93, 95
Kuivuneisiin nytteisiin listtiin 2 ml vedetnt, 2M hapanta metanolia (HCl/MeOH),
korkki suljettiin tiukasti kiinni ja kolvi laitettiin lmpkaappiin 100 C, 3h. Nytteiden
annettiin jhty, mahdollinen jljelle jnyt happo neutraloitiin 100 l:lla pyridiini.
Liuos siirrettiin mitta-asteikolliseen muoviputkeen ja kolvi huuhdeltiin metanolilla, kunnes
liuoksen tilavuus vastasi 1 mg/ml pitoisuutta. Lopputilavuus oli nin ollen 5-10 ml.93
Tst otettiin edelleen 1 ml lasiseen koeputkeen silylointia varten. Liuos haihdutettiin
koeputkesta typpivirralla 50 C:ssa, johon listtiin silylointireagenssit: pyridiini (py, 180
l), heksametyylidisiloksaani (HMDS, 60 l) ja trimetyylikloorisilaani (TMCS, 20 l).
Tarvittavan silylointireagenssin mrn muuttuessa, olivat aineiden suhteelliset tilavuudet
kuitenkin 9:3:1 (py, HMDS, TMCS).96 Koeputki suljettiin kierrekorkilla ja liuokset
vorteksoitiin. Putki siirrettiin uuniin 60 C puolen tunnin ajaksi, jonka jlkeen nyte
haihdutettiin jlleen typpivirralla 50 C kuivaksi (20 min). Koeputkeen pipetoitiin 1 ml
heptaania ja vorteksoitiin. Saatu liuos suodatettiin Pall 0,45 l ruiskusuodattimen lpi
38
nytteensyttjn lasiastiaan (vialiin) joka suljettiin korkilla. Nyte analysoitiin GC-
MS:ll.94
5.5.2 NMR- ja MS- nytteiden valmistaminen
NMR- ja LC-MS/MS- analyysi varten nyte pelkistettiin reagoimattoman aldehydin
poistamiseksi NaBH4:ll, saostettiin etanolilla (1:5) ja sentrifugoitiin 8500 rpm, 10
minuutin ajan. Nyte pestiin vedell ja saostettiin uudelleen. Sakka liuotettiin pieneen
mrn ultrapuhdasta vett, jdytettiin pakastimessa (-22 C) ja kuivattiin
pakkaskuivaimessa noin 20 tunnin ajan.
Muodostuneesta hienojakoisesta jauheesta punnittiin noin 20 mg NMR-nyteeksi
eppendorf-putkeen. Jauhe liuotettiin 1,0 ml:aan deuteroitua vett (D2O) ja suodatettiin Pall
0,45 m ruiskusuodattimen lpi NMR- putkeen.
LC-MS/MS -analyysi varten valmistettiin kuivatusta jauheesta 1 mg/ml pitoisuustasolla
oleva liuos ultrapuhtaaseen veteen.
5.6 Muita kokeita
5.6.1 Saostus
Yleisesti ottaen oligosakkaridit saostuvat noin 60 % etanoliliuoksella.97, 98 Kokeissa
raffinoosiperisten nytteiden saostuksessa oli hankaluuksia, sill kytetty noin 70 % (3:1,
v/v) etanoliliuos ei saostanut synteesist otettuja nytteit ja todettiin tarvittavan etanolin
mrn olevan jopa 8:1 veteen nhden. Polysakkarideilla tt saostusongelmaa ei ollut.
Puskuriolosuhteet vaikuttivat saostumiseen. Fosfaattisitraattipuskurilla nytteist
saostuneen sakan mr oli hyvin pieni, kun taas natriumsitraattipuskurilla sakka oli
selkesti suurempi. Tm voi johtua sitraattipuskurin suuresta sitruunahappomrst, sill
se liukenee etanoliin, joka taas aiheutti suuremman sakan nytteenksittelyss.
Fosfaattisitraattipuskurissa sitruunahappoa listtiin ainoastaan pH:n stn, jolloin sen
mr puskurissa oli suhteellisen pieni.
39
5.6.1.1 Puhdistuskokeet
Nytteiden sisltm sitruunahappoa yritettiin poistaa kokeilumuotoisesti Dowex 200
kationinvaihtohartsilla sek DP-10 suolanpoistopylvll. Dowex-hartsilla saatiin
erottumaan kaksi fraktiota UV-signaaliin perustuen, mutta fraktiot sislsivt edelleen
puskurin komponentteja. Sephadex-matriisilla tytetty DP-10 suolanpoistopylvn
todettiin kapasiteetiltaan liian pieneksi, jotta puskurin ja tuotteen samankaltaisesti
kyttytyvt molekyylit olisi saatu erilleen toisistaan.
5.6.2 Jtteiden hvitys
Reaktiossa kytettiin joko natriumsyanidia tai etyylisyanoformaattia jolloin vapautui
vetysyanidia. Tst syyst kaikki tyss muodostuneet pesuliuokset ja jljelle jneet
reagenssit, joihin olisi mahdollisesti jnyt syanidia, ksiteltiin vaarattomaksi.
Liuosten maksimaalinen syanidimr arvioitiin mahdollisimman tarkasti. Isoon
dekantterilasiin sdettiin magneettisekoitus ja seos laimennettiin syaniditasolle 1 mg/ml ja
sen pH sdettiin NaOH:lla noin yhdeksitoista. Thn liuokseen listtiin 72 l 1015 % -
natriumhypokloriittia yht syanidimilligrammaa kohden. Sekoitusta jatkettiin 0,5-1 tunnin
ajan. pH:n tarkistettiin olevan 10 ja seokseen listtiin 2 M HCl pieniss eriss, kunnes pH
oli 7-8. Liuosta seisotettiin vhintn tunnin ajan (yleens yli yn), jonka jlkeen se
kaadettiin viemriin runsaan veden kera.99
40
5.7 Analysointi
5.7.1 GC-MS analyysi
Nytteet analysoitiin Hewlett-Packard 5890 kaasukromatografilla (GC), johon oli liitetty
saman valmistajan 5972 massaspektrometri (MS). Kolonnina kytettiin DB-5-tyypin
kolonnia, jossa on 5 % fenyyliryhmi metyylipolysiloksaanifaasissa. Kolonnin pituus oli
30 m, sishalkaisija 0,32 mm, sek stationrifaasin paksuus 0,25 m. Tmn tyyppiset
kolonnit ovat poolittomia, monikyttisi ns. yleiskolonneja, jotka kestvt korkeitakin
lmptiloja.
Nytteen injektiotilavuus oli 1 l, kolonnin kantajakaasuna kytettiin heliumia, jonka
virtaus oli 1,1 ml/min. Nytteen jakosuhde oli 1:10 sek huuhteluventtiilin virtaus 3
ml/min. Kolonnin alkupn paine oli 15 psi ja injektorin lmptila 250 C.
Kaasukromatografin ajo-ohjelma oli seuraavanlainen:
Uunin lmptila 120 C (5 min) - 3 C/min, 180 C - 15 C/min, 250 C (5 min).
Kokonaisajoaika oli 32,67 min.
5.7.1.1 Lhtaineiden hapetusasteen mrittminen
Hapetettujen guarkumi- ja raffinoosiliuosten hapetusaste mritettiin, jotta voitiin tarkistaa
reaktion onnistuminen. Hapetusaste vaikutti mys jatkoreaktioiden saannon arvioimiseen.
Nytteen kaasukromatografisesta kromatogrammista haettiin galaktoosin piikki standardin
retentioajan perusteella. Tmn piikin massaspektrin ionien m/z 361 ja m/z 362
intensiteettien avulla saatiin laskettua tuotteen hapetusaste (kaava 1).74
Kaava (1)
Kaavassa 1. A= m/z 361 intensiteetti ja B= m/z 362 intensiteetti.
41
Kuva 19. Hapetetun guarkumin kromatogrammin piikin tr 19,544 min spektrin osa, jossa ovat tutkittavat ionit A m/z 361 ja B m/z 362, sek niiden intensiteetit (A =3284 ja B = 5748).
Kaavan (1) avulla saadaan kuvan 19. tuloksista laskettua guarkumin hapetusasteeksi
58,6%. Lhtaineiden hapetusasteiden tulokset on esitetty taulukossa 7 sivulla 43.
5.7.2 Massaspektrometrinen analyysi
Massaspektrometrinen (MS) analyysi tehtiin Agilent 6330 Ion Trap LC/MS -laitteella,
jossa ionisointimenetelmn oli shksumutusionisaatio (ESI), (Agilent Technology, Palo
Alto, USA).
Massaspektrometrist analyysi varten nytett tai raffinoosiliuosta (1 mg/ml) pipetoitiin
3-5 l 400 l:aan metanoli-vesi-muurahaishappoliuosta (50:49:1). Lisksi varauksellisten
adduktien muodostamiseksi nytteisiin pipetoitiin apuaineita (1-3 l). Positiivisten ionien
muodostamiseen litiumasetaattia (10 mg/ml) ja negatiivisten ionien aikaansaamiseksi
ammoniumkloridia (10 mg/ml). Nytteen virtausnopeus shksumutusionisaatioyksikkn
oli 7 ml/min. Nytteet analysoitiin pasiassa positiivisella ionisaatiolla, mutta yksi nyte
tutkittiin kokeeksi mys negatiivisella ionisaatiolla.
42
5.7.3 NMR analyysi
NMR analyysit tehtiin Varian NMR-spektometreill kytten joko 300, 500 tai 600
MHz:in laitetta. Nytteist mitattiin sek 1H- ett 13C NMR spektrit 27 C:n lmptilassa.
Vertailuksi NMR:ll analysoitiin reaktiossa kytetty D-(+)-raffinoosi pentahydraatti tai
puskurissa kytetty sitruunahappo.
NMR-analyysit tehtiin deuteroidussa vedess (D2O) ilman kemiallisen siirtymn
referenssi, joka D2O- liuoksilla on tyypillisesti asetoni tai 4,4-dimetyyli-4-silapentaani-1-
sulfonihappo (DSS).100 Nin ollen spektrien ppm-asteikkoa ei voitu asettaa kohdalleen ns.
tunnettujen kemiallisten siirtymien avulla, vaan nollakohta mritettiin laskennallisesti
kytten liuottimen deuteriumsignaalin taajuutta.
5.8 Tulokset
5.8.1 Lhtaineiden hapetusasteet
Reaktion onnistumista seurattiin pelkistmll tuote NaBD4:ll jolloin aldehydist
muodostui deuteroitualkoholi. Tmn jlkeen tuote metanolysoitiin ja silyloitiin
kromatografista analyysi varten. Kaasukromatografisessa analyysiss havaittiin
galaktopyranoosin piikki, galaktoosille tyypillisell retentioajalla (tr) noin 19,55 min.
Piikin massajakaumasta voitiin havaita muodostetun, silyloidun d1-metyyli--D-
galaktopyranosidin ioni, jonka massaluku 362 eroaa yhdell massayksikll
hapettumattoman, silyloidun, metyyli--D-galaktopyranosidin massasta 361 (Kuva 20.).74,
96
Kuva 20. Vasemmalla d1-metyyli--D-galaktopyranosidin ja oikealla metyyli--D-galaktopyranosidin massaspektrometrist tulosta vastaavat rakenteet.74
43
Taulukko 7. Lhtaineiden hapetusasteet. GG=guarkumi, RAF= raffinoosi, GM50 = pilkottu guarkumi ja RAF ox =50 mg/ml raffinoosi.
Lhtaine Pitoisuus [mg/ml] Hapetusaste
[%]
GG_1 1 67
RAF_1 21 100
GM50 5 97
RAF ox 42 100
5.8.2 Syanohydriinit
5.8.2.1 GC-MS analyysin tulokset
Menetelm, jossa tutkitaan tietyn kromatografisen piikin massaspektrin yht tai kahta ionia
vaatii kohtalaisen vahvat nytteet. Tst syyst nytteiden kromatogrammit eivt tss
tyss edustaneet ns. kaunista muotoa, vaan piikit levenivt, jotta massaspektriss nkyi
tarpeeksi intensiivinen ioni.
Kromatografisen erotuksen varmistamiseksi analysoitiin standardeina D-(+)-mannoosi
(Man), D-(+)-glukoosi (Glc) ja D-(+)-galaktoosi (Gal), jotka metanolysoitiin ja silyloitiin,
kuten nytteet yleens (kohta 5.5.). Nin saatiin varmistettua kromatogrammissa olevien
piikkien retentioajat (taulukko 8.), sek kyseisten aineiden massaspektrit. Lisksi
analysoitiin hapetettu, pelkistetty raffinoosi ja guarkumi.
Jokaisen kokeen kaikki nytteet metanolysoitiin, silyloitiin ja analysoitiin GC-MS:ll.
Onnistuneissa kokeissa havaittiin kromatogrammin muuttuneen raffinoosin
kromatogrammista (kuva 21.) siten, ett galaktoosin signaalit retentioajoilla (tr) 18,6, 19,6
ja 20,6 min olivat pienentyneet tai jopa hvinneet kokonaan. Lisksi kromatogrammiin
muodostui uusia, kohtalaisen suuria signaaleja retentioajoilla 6,3, 9,3, 26,2, 26,6 ja 26,8
minuuttia. (kuvat 22 ja 23). Nist 6,3 ja 9,3 min eluoituvat yhdisteet olivat massaspektrien
mukaan puskurin sisltmi sitruunahapon ja natriumsitraatin silyloituja muotoja.
44
Taulukko 8. GC-MS:ll analysoitujen standardien retentioajat minuutteina. tr = retentioaika [min], man = mannosi, gal = galaktoosi, glc = glukoosi, raf = raffinoosi ja guar = guarkumi. Guarkumistandardi analysoitiin ensimmisen, jonka jlkeen kolonnin alkupst poistettiin pieni pala, tst syyst mannoosi- ja galaktoosistandardien retentioajat eroavat hiukan guarkumin ajoista.
tr 1 tr 2 tr 3 tr 4 tr 5 tr 6
Man 18,03
Gal 18,59 19,62 20,60
Glc 21,39 22,06
Raf 18,57 19,58 20,58 21,39 22,05
Guar 18,15 18,52 19,56 20,52
Kuva 21. Raffinoosin kromatogrammi. Galaktoosin signaaleja ovat 18,57, 19,58 ja 20,58 min eluoituvat piikit ja glukoosin vastaavasti 21,39 ja 22,05 min.
45
Hapetettun raffinoosin syanohydriinisyntetisointi aloitettiin 24 tunnin reaktioajalla, josta
otettiin muutamia nytteit reaktioajan optimoimista varten. Neljn ja kuuden tunnin
reaktioajoilla ei ollut merkittv eroa tuloksissa, mutta 24 h reaktioajalla
kromatogrammin oletetut tuotepiikit retentioajoilla 26,2 ja 26,5 min pienenivt.
Seuraavaksi otettiin 0-4 tunnin ajanjakso, jonka aikana nytteit otettiin 0,5 tunnin vlein.
Tuloksena oli reaktioaikaoptimi 1,52,0 tuntia, jonka kohdalla tuotteiden piikit olivat
maksimissaan.
Kuva 22. Nytteen (RAFCN 5, 2,5 h) kromatogrammi. Galaktoosin piikit tr 18,50 ja 19,50 min ovat pienentyneet huomattavasti. Glukoosin piikit ovat edelleen paikallaan tr 21,29 ja 21,97 min, tr 26,14 min jlkeen eluoituu useita eri yhdisteit.
Tutkittaessa nytteiden kromatogrammeja voitiin todeta ajon loppupuolella eluoituneiden
piikkien olevan sokeriyhdisteit. Johtoptksen oli se, ett joku tai jotkut nist suurista
tr 2627 min eluoituneista yhdisteist olisi voinut olla synteesiss muodostunut toivottu
tuote.
46
Kuva 23. Nytteen kromatogrammi (RAFCN 7, 2 h). Galaktoosin piikit tr 18,50 ja 19,50 min ovat pienentyneet niin pieniksi, etteivt integroituneet. tr 26,2, 26,5 ja 26,7 min eluoituvat mahdollisen tuotteen piikit.
Kuva 24. Nytteen (RAFCN 4, 4 h) kromatogrammin tr 26,5 min eluoituneen piikin massaspektri.
47
Nytteiden massaspektrit noudattavat sokerimolekyyleille tyypillist pilkkoutumisspektri.
Esimerkiksi galaktoosistandardin tr 19,53 min spektrin suurimpien intensiteettien ionit
ovat: 217, 204, 147, 133 ja 73 aivan kuten kuvassa 25.96
Tutkittaessa tarkemmin reaktiossa selvsti muodostuneiden yhdisteiden tr 26,2 ja 26,5 min
massaspektrej (kuva 24.), lytyi jlkimmisest mielenkiintoinen tulos: ionit 509 ja 525;
niiden molekyylimassat ovat suuremmat kuin oletetun synteesituotteen molekyylimassa
507 olisi ollut (kuva 25.). Nin ollen ptettiin tehd MS- ja NMR -analyysi samalla lailla
tehdylle nytteelle.
Kuva 25. GC-MS analyysi varten metyloitu ja silyloitu synteesituote ja sen oletettu rakenne.
Raffinoosialdehydin muuttumista tuotteeksi tutkittiin suhteellisena osuutena glukoosin
piikkien (tr 21,40 ja 22,06 min) pinta-alasta (taulukko 9.). Oletuksena oli, ett glukoosi ei
reagoi reaktio-olosuhteissa, sill se on raffinoosissa galaktoosin ja fruktoosin vliss, eik
sisll sellaista reaktiivista ryhm, joka olisi voinut reagoida kyttmissmme reaktio-
olosuhteissa. Tllin sen osuus nytepiikeist pysyy vakiona analyysimenetelmn
vaihteluvlin puitteissa. Analysoinnissa kytettiin automaattista integrointia. Lhes
kaikissa analyyseiss glukoosin piikki oli kromatogrammin suurin. Galaktoosin kahden
isomeerin piikkien pinta-alat olivat keskimrin 147,6 % ( 1,6 %) nytteiden
kokonaispinta-aloista.
48
Kytetyll menetelmll ei toistaiseksi voida laskea saantoprosenttia, sill menetelmn ei
ole olemassa sellaista standardia, joka kestisi happaman metanolyysin. Menetelmss
olisi voitu kytt sorbitolia ulkoisena standardina. Sen kytt ei koettu tarpeelliseksi,
sill tss tyss arvioitiin lhinn entsymaattisen reaktion onnistumista. Tt voitiin
arvioida yhtlailla glukoosin avulla.
Tuotteen muodostumista aldehydist arvioitiin lhtaineen galaktoosin piikin pinta-alan
avulla. Hapetetulla raffinoosilla galaktoosin piikki on noin 128 % ja glukoosin vastaavasti
148 %, jolloin pinta-alojen suhde on natriumsitraattipuskurissa tehdyill reaktioilla noin 86
%. Nin ollen kromatogrammissa olevien tuotteen piikkien ja glukoosin piikkien pinta-
alojen maksimaalinen suhdeluku voi olla saman verran (86 %). Tm vastaisi 100 %
muuttumista lhtaineesta tuotteeksi. Vastaavasti sitraattifosfaattipuskurissa tehtyjen
reaktioiden maksimaalinen konversio on noin 70 %.
Konversiota arvioitiin tuotteen ja glukoosin pinta-alojen suhteena. Tulos esitetn
muuttumisena maksimikonversioista (kaava 2.).
(Kaava 2.)
Kaavassa 2. K = konversio, P = tuotteen prosentuaalinen yhteenlaskettu pinta-ala, S = lhtaineen prosentuaalinen yhteenlaskettu pinta-ala. Esimerkkilaskuna kaavan 2 mukaisesti laskettu, fosfaattisitraattipuskurilla tehdyn reaktion,
konversioprosentti:
49
Taulukko 9. Sitraattipuskurissa (pH 4,0) tehtyjen reaktioiden konversioprosentit. Glukoosi (glc), galaktoosi (gal), Gal/Glc suhde sek konversioprosentti. Luvut kohdissa glc, gal ja tuote esitetn kromatogramissa esiintyvien ko. yhdisteen piikkien yhteenlaskettujen pinta-alojen prosentuaalisina osuuksina. Konversio on laskettu kaavan 2 mukaisesti.
Reaktio Glc [%] Gal [%] Gal/Glc [%] Tuote [%] Konversio
[%]
Hapetettu raffinoosi (Raf) 148,8 128,1 86,1 - -
Kemiallinen reaktio (Raf 0) 148,7 51,4 34,6 44,7 34,9
RafCN 8 146,3 20,9 14,3 40,5 32,1
RafCN 9 149,9 75,0 50,0 33,2 25,7
RafCN 10 145,9 59,5 40,8 34,9 27,8
RafCN 11 148,7 64,8 43,6 46,0 35,9
RafCN 12 147,2 43,2 29,4 20,9 16,5
Nollanytteen konversio tuotteeksi on 1035 % hapetetun raffinoosin metanolysoidusta ja
silyloidusta galaktoosin piikist. Sitraattipuskurilla tehtyjen synteesituotteiden konversio
ji pienemmksi kuin pelkn kemiallisen reaktion muodostama konversio (Taulukko 9.).
Paras saatiin pitkll reaktioajalla (1920 h), fosfaattisitraattipuskurissa, pH 4,0 tehdyss
kokeessa. Tllin kemiallisen reaktion osuus ji pieneksi, kun vastaavassa pH 6,0 tehdyss
reaktiossa kemiallinen reaktio tuotti 50 % konversion (Taulukko 10.).
Top Related