AURIMAR DE OLIVEIRA ANDRADE
PREVALÊNCIA DE ENTEROCOCCUS SP. NAS
INFECÇÕES ENDODÔNTICAS PRIMÁRIAS
ORIENTADORA: Professora Dra. Miriam Fátima Zaccaro Scelza
CO-ORIENTADOR: Professor Dr. Raphael Hirata Júnior
Universidade Federal Fluminense
Niterói
2009
AURIMAR DE OLIVEIRA ANDRADE
PREVALÊNCIA DE ENTEROCOCCUS SP. NAS
INFECÇÕES ENDODÔNTICAS PRIMÁRIAS
ORIENTADORA: Professora Dra. Miriam Fátima Zaccaro Scelza
C0-ORIENTADOR: Professor Dr. Raphael Hirata Júnior
Universidade Federal Fluminense Niterói 2009
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre. Área de concentração: Clínica Odontológica.
A553 Andrade, Aurimar Oliveira
Prevalência de Enterococcus sp nas infecções endodônticas primárias. / Aurimar de Oliveira
Andrade; orientadora: Profª. Dra. Miriam Fátima Zaccaro Scelza, co-orientador: Profº. Dr. Raphael Hirata Júnior – Niterói: [s.n.], 2009.
78 f.
Inclui tabelas e figuras Dissertação (Mestrado em Clínica Odontológica) – Universidade Federal Fluminense, 2009. Bibliografia: f. 67-75
1. Enterococos, 2. Endodontia, 3. Microbiologia. I. Scelza, Miriam Fátima Zaccaro [orien.] II. Hirata Júnior, Raphael [co-orien.] III. TÍTULO
CDD 617.6342
AURIMAR DE OLIVEIRA ANDRADE
PREVALÊNCIA DE ENTEROCOCCUS SP. NAS
INFECÇÕES ENDODÔNTICAS PRIMÁRIAS
ORIENTADORA: Professora Dra. Miriam Fátima Zaccaro Scelza
CO-ORIENTADOR: Professor Dr. Raphael Hirata Júnior
Aprovado em 20 de agosto de 2009
BANCA EXAMINADORA
____________________________________
Profa. Dra. Miriam Fátima Zaccaro Scelza Universidade Federal Fluminense – UFF
___________________________________ Prof. Dr. Raphael Hirata Júnior
Universidade do Estado do Rio de Janeiro – UERJ
___________________________________ Profa. Dra. Apoena de Aguiar Ribeiro
Universidade Federal Fluminense–UFF / Nova Friburgo
Niterói 2009
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre. Área de concentração: Clínica Odontológica.
Saudade, carinho e gratidão. Dedico este
trabalho a Otávio de Carvalho Andrade,
Júlia de Oliveira Andrade (meus pais),
Amaury de Oliveira Andrade e Jair de
Oliveira Andrade (meus irmãos) – in
memoriam
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida e presença em todos os momentos.
Aos Professores Miriam Fátima Zaccaro Scelza e Raphael Hirata Júnior pela
excelente orientação, incentivo, dedicação e contribuição para minha formação.
À Coordenação do Curso de Mestrado em Odontologia da Universidade Federal
Fluminense na pessoa do Prof. Ricardo Carvalhaes Fraga.
A todos os Professores do Curso de Mestrado em Odontologia da Universidade
Federal Fluminense por todas as informações transmitidas.
Aos Professores da Disciplina de Endodontia da FO-UFF por terem me recebido
de forma acolhedora no período do Estágio de Docência.
À Professora Shirley de Souza Pinto pelo auxílio importantíssimo na fase de
coleta de material junto à Clínica de Endodontia da FO-UFF.
Aos colegas de turma de Mestrado pelo convívio harmônico.
Aos Professores Raphael Hirata Júnior e Ana Luíza de Mattos Guaraldi da
Disciplina de Microbiologia e Imunologia da FCM-UERJ pela generosidade em
disponibilizar as facilidades do laboratório 3 para a realização da parte
experimental desta dissertação.
Aos colegas do laboratório 3 e funcionários da Disciplina de Microbiologia e
Imunologia da FCM-UERJ pela dedicação, amizade e companheirismo.
Aos familiares e amigos que me apoiaram e incentivaram : Amaro Viana,
Andréa Andrade, Camila Fontes, Carlos Rodrigues, Cláudia Andrade,
Conceição Cova, Diva Mello, Francis Martins, José Cunha, Laís Souza, Luciano
Lemos, Marlene Andrade, Onildo Lemos e Onilene Lemos.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo
apoio financeiro tão importante para o desenvolvimento deste projeto.
SUMÁRIO
LISTA DE ILUSTRAÇÕES LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS RESUMO 11 ABSTRACT 12 1. INTRODUÇÃO 13 2. REVISÃO DE LITERATURA 16 3. OBJETIVOS 37 4. MATERIAL E MÉTODOS 38 4.1. MATERIAL 38 4.1.1 MEIOS SELETIVOS 38 4.1.2 MEIOS DE CULTIVO 38 4.1.3 REAGENTES PARA IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA 38 4.1.4 GALERIA DE IDENTIFICAÇÃO MINIATURIZADA 39 4.1.5 OUTROS MATERIAIS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS 39
4.2. MÉTODOS
4.2.1 SELEÇÃO DOS PACIENTES, COLETA E PROCESSAMENTO DO MATERIAL CLÍNICO 40 4.2.2 CARACTERIZAÇÃO FISIOLÓGICA DAS AMOSTRAS BACTERIANAS 41
4.2.3 IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA 43
5. RESULTADOS 47
6. DISCUSSÃO 59
7. CONCLUSÕES 71
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 72
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Sistema miniaturizado API 20 Strep
Figura 2. Capela de fluxo laminar. No interior da câmara todo ar circulante é
estéril
Tabela 1. Percentual de isolamento de Enterococcus sp em pacientes
portadores de dentes com canais com necrose pulpar por
gênero/dente
Tabela 2. Percentual de isolamento de Enterococcus sp. em pacientes
portadores de dentes com canais com necrose pulpar por
gênero/espécie
Tabela 3. Pacientes com culturas positivas relacionados à sintomatologia
dolorosa
Tabela 4. Percentual de dentes com culturas positivas relacionados aos
aspectos radiográficos / gênero
Tabela 5. Número de pacientes com culturas positivas que apresentaram
secreção purulenta, presença de odor, edema e fístula no
momento da coleta
Tabela 6. Dentes com cultura positiva relacionados a grupo de dentes e
gênero
Tabela 7. Espécies microbianas (isolados) relacionadas ao paciente, número
do dente por ordem de coleta e meio seletivo utilizado
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
EBM Eosina e Azul de Metileno EDTA Ácido Etilenodiamino Tetracético Dissódico EMAs Enzimas modificadoras de aminoglicosídeos DNA Ácido desoxirribonucleico HIB Caldo Infuso de coração MTAD Composto de diferentes agentes microbianos NaCl Cloreto de sódio NaOCl Hipoclorito de sódio NNISS National Nosocomial Infections Surveillance System P Paciente PCR Reação em cadeia da polimerase TSA Ágar Soja Tripticaseína VRE Enterococo resistente à vancomicina
13
RESUMO
Os enterococos fazem parte da microbiota normal dos seres humanos, especialmente trato gastrintestinal, cavidade oral e trato geniturinário. A temperatura ótima de crescimento é de 35ºC, porém, a maioria das amostras tolera temperaturas que variam de 10ºC a 45ºC. Dentre as espécies atualmente descritas, Enterococcus faecalis representa de 80% a 90% dos isolamentos oriundos de material clínico humano. O objetivo deste estudo foi isolar, identificar e caracterizar fisiologicamnete Enterococcus sp de canais radiculares portadores de necrose pulpar. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Antonio Pedro/Universidade Federal Fluminense sob o número 025/06 envolvendo um total de 70 pacientes. Foram isoladas 35 amostras de Enterococcus sp em 50% dos pacientes (n=35) com a seguinte incidência : 33 amostras de Enterococcus faecalis (94,28%), 1 amostra de Enterococcus faecium (2,85%) e 1 amostra de Enterococcus durans (2,85%). Dezesseis amostras foram isoladas de 27 pacientes do sexo masculino (59,25%) e 19 de 43 pacientes do sexo feminino (44,18%). Dos 35 pacientes com cultura positiva , 20 apresentaram sintomatologia dolorosa. Odor fétido e secreção purulenta foram observados em 3 dentes com cultura positiva (8,57%). Dos 35 pacientes com cultura positiva, 4 apresentaram edema no momento da coleta e apenas 1 paciente apresentou fístula. A espécie E. faecalis foi majoritária dentre os isolados, estando relacionada a sinais e sintomas.
14
ABSTRACT
Enterococci are members of normal human microbiota, particularly from gastrointestinal, oral cavity and, genitourinary tracts. Microorganisms are gram-positive, facultative anaerobic cocci. The optimum growth temperature is 35ºC. However, most samples may flourish in temperatures that vary from 10ºC to 45ºC. Among the current described species, Enterococcus faecalis represents 80% to 90% of isolations derived from human clinical material, and may be isolated from 60 to 70% endodontic infections refractory to treatment. The aim of this study was to isolate, identify and physiologically characterize Enterococcus sp from necrotic endodontic infections.The experimental protocol was approved by the Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Antonio Pedro/Universidade Federal Fluminense under registration 025/06, and involved a total of 70 patients. Thirty-five Enterococcus sp strains were isolated in 50% of the patients (n=35), according to the following incidence: 33 samples of Enterococcus faecalis (94,28%), 1 sample of Enterococcus faecium (2,85%) and 1 sample of Enterococcus durans (2,85%). Sixteen strains were isolated from 27 male patients (59.25%), and 19 from 43 female patients (44.18%). From 35 individuals whose enterococci were isolated, 20 reported painful symptoms. Fetid odor and purulent discharge were observed for three teeth which enterococci were isolated (8.57%). With respect to the presence of edema, 4 patients carried enterococci at the moment of material collection, and one patient (2.85%) presented fistulae drainage at the moment of collection for culture of microorganisms. The E. faecalis was the major species isolated from root canal infections presenting signals and symptoms.
15
1. INTRODUÇÃO
Os microrganismos do gênero Enterococcus são cocos Gram-positivos, se
apresentam isoladamente, aos pares ou em cadeias curtas. As células podem ser
cocobacilares, principalmente quando a coloração de Gram é realizada a partir de
colônias crescidas em meio sólido. São microrganismos fastidiosos, com necessidades
nutricionais variáveis e o crescimento requer meios complexos, contendo soro ou
sangue. Apesar de crescerem na presença de oxigênio, são incapazes de sintetizar o
composto heme e por isto não possuem metabolismo respiratório, sendo anaeróbios
facultativos. A temperatura ótima de crescimento é de 35ºC, porém, a maioria das
amostras tolera temperaturas que variam de 10ºC a 45ºC (FACKLAM, SAHM &
TEIXEIRA, 1999).
Os enterococos estão amplamente distribuídos no ambiente. Nos seres
humanos fazem parte da microbiota do trato gastrintestinal, da cavidade oral e do trato
geniturinário. Estes microrganismos toleram temperaturas equivalentes a 60ºC por até
30 minutos e são capazes de crescer em meios contendo cloreto de sódio a 6,5%.
Adicionalmente, a capacidade de hidrolisar a esculina em presença de bile e produzir
leucina-aminopeptidase (LAPase) e pyrolidonylarylamidase (PYRase), são
características importantes do gênero. Apesar de não possuírem a enzima citocromo, o
teste da catalase pode ser positivo. Isto se deve à produção de uma pseudocatalase
que caracteriza uma ligeira liberação de oxigênio quando a colônia é colocada em
16
contato com o peróxido de hidrogênio. Nas últimas décadas se tornaram importantes
agentes etiológicos das infecções hospitalares, principalmente em hospedeiros
imunocomprometidos e de superinfecções em pacientes tratados com agentes
antimicrobianos de amplo espectro (MURRAY, 1990; TEIXEIRA & FACKLAM, 2003).
Quando colonizam os canais radiculares E. faecalis são capazes de sobreviver,
utilizando-se provavelmente dos substratos oriundos dos fluidos dos tecidos
conjuntivos subjacentes (osso alveolar e ligamento periodontal). Dentre os fatores de
virulência destacam-se as enzimas líticas, citolisinas, substâncias de agregação,
feromônios e ácido lipoteicoico. E. faecalis pode interferir com a ativação dos linfócitos
e outros grupos celulares, contribuindo para o fracasso endodôntico (LEE; LIM & SON,
2004). Além da sua habilidade para invadir e permanecer no interior dos túbulos
dentinários apresenta elevada resistência aos curativos de demora utilizados entre
sessões, inclusive aqueles à base de hidróxido de cálcio. Foi descrito que as cepas de
E. faecalis possuem uma bomba de prótons capaz de proteger o citoplasma bacteriano
do elevado pH conferido pelos produtos contendo hidróxido de cálcio. A espécie
também é capaz de formar biofilmes onde as células bacterianas formam estruturas
multicelulares coesas de difícil remoção pelo sistema imunológico, além de dificultar a
atividade dos agentes antimicrobianos. Tais propriedades conferem aos E. faecalis
grande poder agressivo aos tecidos perirradiculares e maior resistência ao controle das
infecções endodônticas (MC HUGH, ZANG & MICHALEK, 2004).
Para o controle das infecções dos sistemas de canais radiculares onde os E.
faecalis fazem parte da microbiota, é necessário a máxima vigilância em relação às
17
fases da terapia endodôntica. Todas as fases devem ser executadas em um mesmo
plano de igualdade quanto à importância por serem consideradas fundamentais, a
negligência de qualquer uma dessas fases poderá influenciar no resultado final
(LEONARDO, 1973). Procedimentos de assepsia, incluindo a desinfecção do dique de
borracha com clorexidina ou hipoclorito de sódio e a desinfecção dos cones de guta-
percha com hipoclorito de sódio antes da inserção no canal radicular, são medidas
preventivas recomendadas (SENIA et al., 1975). Devido à sua alta incidência como
patógeno envolvido nas infecções endodônticas refratárias ao tratamento, a presença
dos enterococos nos canais radiculares e os fatores de virulência deste grupo
microbiano os torna alvo importante de investigações na área da endodontia.
18
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Infecções sistêmicas causadas por Enterococcus sp
Os enterococos foram primeiramente reconhecidos como potenciais patógenos
humanos em 1899 quando THIERCELIN (apud SHERMAN,1937) relatou a presença
desses microrganismos em quadros de endocardite, apendicite e meningite.
Posteriormente, foi observada a participação dos enterococos em outras infecções tais
como sepse puerperal e infecções intra-abdominais. Na Primeira Grande Guerra
Mundial foram notificados relatos sobre infecções enterocócicas em ferimentos
(MOELLERING, 1992; FRANZ, HOLZAPPEL & STILES, 1999).
Nos dias atuais sabe-se que os enterococos podem causar uma variedade de
infecções monomicrobianas e polimicrobianas, principalmente em pacientes em estado
clínico grave. Dentre esses quadros infecciosos incluem predominantemente infecções
do trato urinário, bacteremias, endocardites, infecções intra-abdominais, do trato biliar e
de feridas (incluindo operatórias), as úlceras de decúbito e do pé diabético. Em menor
freqüência, os enterococos causam infecções dos sistemas nervoso central e
respiratório, em tecidos moles, do conduto auditivo, da conjuntiva e região periodontal
19
(JOHNSON, 1994; MUNDY, SAHM & GILMORE, 2000; TENG et al., 2002;
ARCHIMBAUD et al., 2002).
De acordo com o estudo realizado pelo NNISS (National Nosocomial Infections
Surveillance System, 1997), os enterococos são a quarta principal causa de infecções
nosocomiais. Doze espécies deste gênero bacteriano já foram identificadas a partir de
infecções humanas. A maioria das amostras clínicas pertence à espécie E. faecalis
(80% a 90%) seguida de E. faecium (5% a 10%). As demais espécies são identificadas
com menor freqüência, apesar de relatos de surtos causados por E. raffinosus e E.
casseliflavus (CHIRURGI et al., 1991; NAUSCHUETZ et al., 1993). As espécies E.
avium, E. cecorum, E. gallinarum, E. díspar, E. gilvus, E. mundtii, E. durans, E. hirae, E.
pallens e variantes de E. faecalis, embora raramente, já foram identificadas em
infecções humanas, associadas normalmente a surtos específicos. Algumas espécies
ainda não foram isoladas de humanos tais como E. columbae, E. malodoratus, E.
porcinus, E. ratti, E. pseudoavium, E. saccharolyticus e E. sulfureus (TEIXEIRA &
FACKLAM, 2003).
Apesar da ampla variedade de infecções causadas por enterococos, os fatores
que determinam a patogenicidade dos membros deste gênero não são bem
conhecidos. Alguns atributos de virulência têm sido identificados, porém, não há
evidências definitivas de que seus mecanismos contribuam para a patogênese das
infecções humanas (JETT, HUYCKE & GILMORE, 1994).
20
A bacteremia é uma das apresentações clínicas mais comuns. Nesses casos, a
origem pode ser um foco infeccioso presente em qualquer sítio anatômico ou
colonização. Aparentemente, o trato urinário é a origem mais comum, o trato
hepatobiliar e as infecções intra-abdominais são outros sítios importantes. Em
bacteremias secundárias de pacientes com infecções pós-operatórias, amostras de
enterococos já foram apontadas como principal causa, assim como infecções
enterocócicas em tecidos moles constituem uma outra fonte para o desenvolvimento de
bacteremia (SHAES, LEVY & WOLINSKY, 1981; WHITESIDE, MOORE & RATZAN,
1983; MAKI & AGGER, 1988; CHENOWETH & SCHABERG, 1990). Em algumas
situações não são detectados sítios infectados que possam ser apontados como a
origem óbvia para bacteremia e nesses casos, os acessos intravasculares podem estar
implicados (GRANINGER & RAGETTE, 1992; JARVIS & MARTONE, 1992). Os fatores
de risco associados com as bacteremias enterocócicas incluem doença de base,
presença de cateter uretral ou intravascular, queimaduras, traumas múltiplos e
profilaxia e/ou terapia antimicrobiana prévia (LEWIS & ZERVOS, 1990; MONDINO et
al., 2003).
Os enterococos causam de 5% a 15% das endocardites bacterianas, podendo
levar à mortalidade cerca de 30% dos casos (MEGRAM, 1992; BADDOUR, 1994;
BERTI, 1997). Embora as endocardites enterocócicas estejam associadas a infecções
extra-hospitalares (comunitárias), também acometem pacientes hospitalizados (MAKI &
AGGER, 1988). A fonte de aquisição não é conhecida, porém, em alguns casos as
infecções do trato geniturinário constituem o foco infeccioso primário. Assim, a
endocardite muitas vezes ocorre em pacientes que tenham sofrido anteriormente
21
procedimentos invasivos, infecções no trato urinário ou aborto (CHENOWETH &
SCHABERG, 1990; LEWIS & ZERVOS, 1990; MOELLERING, 1992, BEM AMI et al.,
2004).
As infecções enterocócicas do sistema nervoso central são raras e podem ser
decorrentes de complicações cirúrgicas em geral ou de procedimentos neurológicos,
como a implantação de dispositivos de drenagem de líquor (CHENOWETH &
SCHABERG, 1990). Casos de meningite em pacientes imunocomprometidos também
já foram relatados (PATTON et al., 1991; MOELLERING, 1992; CALLEGAN et al.,
1999).
A resistência aos antimicrobianos é conceitualmente dividida em intrínseca e
adquirida. O termo resistência intrínseca é utilizado para designar os fenótipos de
resistência que são propriedades inerentes de determinada espécie bacteriana, isto é,
praticamente todas as amostras da espécie apresentam tal característica. Genes
codificadores de mecanismos de resistência intrínseca devem se localizar no
cromossomo. Os mecanismos de resistência adquirida são aqueles decorrentes de
uma mutação do DNA cromossômico bacteriano ou da aquisição de nova molécula de
DNA, como plasmídeos e/ou transposons (MURRAY, 1990).
Uma característica importante dos enterococos é a presença de resistência
intrínseca a vários antimicrobianos habitualmente utilizados no tratamento de infecções
por bactérias Gram-positivas. Os vários perfis de resistência intrínseca exibidos pelos
enterococos incluem resistência aos beta-lactâmicos, ao trimetoprim-sulfametoxazol, a
22
vancomicina, a baixas concentrações de aminoglicosídeos e clindamicina. Mecanismos
adquiridos quando expressos, induzem resistência a níveis elevados de beta-
lactâmicos, aminoglicosídeos, vancomicina, cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina,
clindamicinas e fluoroquinolonas (MURRAY, 1998).
A resistência adquirida aos aminoglicosídeos é decorrente de dois mecanismos
diferentes: alteração do alvo ribossomal e inativação enzimática através da produção
de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos ( EMAs ). O primeiro mecanismo é
conseqüência de mutações cromossômicas enquanto o segundo é mediado por genes
localizados em plasmídeos transferíveis e transposons (ZERVOS et al., 1986).
A vancomicina é um agente antimicrobiano alternativo no tratamento de
infecções enterocócicas e na maioria das vezes é a droga de escolha quando a terapia
sinérgica com beta-lactâmicos e aminoglicosídeos falha (TEIXEIRA & FACKLAM,
2003).
Um número limitado de fatores tem sido relacionado à virulência dos
enterococos, ressaltando-se uma citolisina, uma metaloprotease (gelatinase), um
sistema Quorum Sensing ( fsr ) envolvido na regulação da gelatinase e/ou de uma
serina-protease e uma outra proteína de superfície responsável pela formação de
agregados de células bacterianas durante a transferência genética por conjugação,
conhecida como substância de agregação (GARSIN et al., 2001). A aderência
bacteriana à célula do hospedeiro é considerada como um evento inicial na patogênese
das infecções. Alguns estudos têm demonstrado que amostras de E. faecalis podem
23
aderir in vitro a uma variedade de linhagens de células como as do trato urinário,
intestinal e as cardíacas (GUZMAN et al., 1989; KREFT et al., 1992; CHOW et al.,
1993; SUSMUTH et al., 2000; WELLS et al., 2000; DUPRÈ et al., 2003). Já foi relatado
também que amostras de E. faecalis e de E. faecium mostraram ligações específicas
com proteínas da matriz extracelular tais como trombospondina, lactoferrina e
vitronectina (ZAREBA et al., 1997).
A substância de agregação é um dos fatores mais estudados dentre os que
possivelmente estão envolvidos na aderência de enterococos. Esta proteína é uma
adesina filamentar, cuja expressão é induzida por feromônio, encontra-se inserida na
parede celular e se apresenta em forma de tufos distribuídos irregularmente na
superfície da célula bacteriana (GALLI & WIRTH, 1991; HIRT, SCHLIEVERT &
DUNNY, 2002). A distribuição desta estrutura na célula é dependente da indução e do
tempo de exposição aos denominados feromônios sexuais (BENSING & DUNNY,
1993).
A importância crescente do gênero Enterococcus no cenário das infecções
humanas, principalmente as de origem nosocomial, traduziu o extenso interesse no
estudo da diversidade genética desses microrganismos. A aplicação de técnicas
moleculares tem contribuído significativamente para a definição da distribuição clonal,
tornando possível a demonstração da transmissão destes microrganismos por contato
direto e indireto entre pacientes. O rastreamento da transmissão inter e intra-hospitalar
de amostras de enterococos resistentes e também os multirresistentes a
antimicrobianos tem sido objeto diversos estudos ( PEGUES et al., 1997).
24
Atualmente a análise do DNA cromossômico por enzimas de restrição,
principalmente Smal, através de eletroforese em campo pulsado é considerado o
método “padrão ouro” extensamente referendado para a análise epidemiológica de
infecções enterocócicas independente da espécie estudada (CARVALHO et al., 1997;
CLARK et al., 1993; PEGUES et al., 1997; TOMAYKO & MURRAY, 1995).
2.2 Infecções endodônticas causadas por E. faecalis
A espécie E. faecalis há algum tempo é considerada como contaminante dos
canais radiculares, normalmente por exposição do espaço endodôntico ao ambiente da
cavidade oral. Estudos recentes investigando canais radiculares por coleta e métodos
de cultivo vem encontrando uma baixa prevalência de E. faecalis nas infecções
endodônticas primárias (GOMES et al., 2006 ; SEDGLEY et al., 2006).
A identificação de Enterococcus sp nos canais radiculares de dentes de seres
humanos foi feita pela primeira vez por MEJARE (1975) que isolou e identificou E.
faecalis e E. faecium. FERRARI et al., (2005) identificaram E. faecalis, E. faecium e E.
casseliflavus.
25
Apesar do número pouco relevante nas infecções endodônticas primárias,
SASSONE et al. em estudos de 2006 e 2008, detectaram a espécie E. faecalis em
infecções endodônticas primárias em pecentuais relativos a 89,3% e mais de 75%,
respectivamente. Paralelamente, a incidência de E. faecalis encontrados em lesões
perirradiculares persistentes é muito alta, acredita-se que este microrganismo esteja
relacionado em maior prevalência às infecções secundárias ou em casos de
contaminação durante o preparo químico-cirúrgico. Normalmente estão albergados em
áreas do canal inacessíveis aos procedimentos de desinfecção endodôntica,
mantendo-se viáveis por serem resistentes aos efeitos dos agentes químicos
empregados ou através da inativação dos mesmos em função das condições
ambientais na região do canal onde os mesmos estão alojados (LOPES & SIQUEIRA,
2004). Alguns autores vêm demonstrando o isolamento de E. faecalis como a espécie
mais comumente isolada dos canais radiculares quando do fracasso da terapia
endodôntica (MEJARE, 1975; SUNDQVIST, 1998; DAHLEN et al., 2000).
Adicionalmente, alguns autores em trabalhos utilizando métodos de cultivo
conseguiram isolar E. faecalis em diversos percentuais, a seguir : MÖLLER em 1966
(29%), MOLANDER et al., em 1998 (32%) e PECIULIENE et al., em 2000 (70%).
Outros estudos utilizaram técnicas moleculares (PCR) e altas prevalências foram
observadas : ROÇAS et al., em 2004 (33%), SIQUEIRA & ROÇAS em 2004 (77%) e
ZOLETTI et al., em 2006 (81,5%).
O controle microbiano do canal radicular é delegado à sanificação proporcionada
pela fase do preparo químico-cirúrgico. Apesar de expressiva redução de
microrganismos ser observada após a conclusão da desinfecção, alguns
26
microrganismos localizados no interior dos túbulos dentinários podem não ser
eliminados apenas com a instrumentação e irrigação (PEREZ et al.,1993). Levando-se
em consideração a complexa anatomia dos canais radiculares, a grande resistência
frente aos agentes antimicrobianos (inclusive ao efeito antimicrobiano do hidróxido de
cálcio), sua eliminação constitui um sério problema para a terapia endodôntica
(HAAPASALO, 1987; BYSTRÖM, 1985), sendo considerado um dos poucos
microrganismos facultativos associados com a periodontite apical persistente
(HAAPASALO, 1983).
Estudo realizado por EVANS et al. (2002) para apontar o pH exato em que o E.
faecalis seria eliminado em contato com o hidróxido de cálcio, observaram que este é
resistente a um pH de 11,1 e seriam eliminados a uma exposição equivalente a um pH
a partir de 11,5. A resistência dos E. faecalis foi relacionada a uma relativa força
exercida para sintetizar proteínas, por indução. Como forma de eliminação total de E.
faecalis, eles sugerem a utilização de hipoclorito de sódio como coadjuvante na inibição
da bomba de prótons do microrganismo.
Investigações têm mostrado que as infecções endodônticas persistentes são
frequentemente causadas por E. faecalis que são altamente resistentes às medicações
utilizadas durante a terapia e é dos poucos microrganismos resistentes aos efeitos
antimicrobianos do hidróxido de cálcio. DISTEL et al. (2002), apresentaram evidências
da colonização e formação do biofilme em canais radiculares de dentes humanos. É
provável que a formação de biofilme explique a habilidade dos E. faecalis em persistir
no meio pois comparadas com células flutuantes, os microrganismos agregados em
27
biofilmes são mais de 100 vezes mais resistentes à fagocitose, anticorpos e muitos
antibióticos.
Foram isolados E. faecalis de pacientes com endocardite bacteriana e os
mesmos associados à formação de biofilmes em outros sítios. Isto talvez seja atribuído
à virulência específica da produção de gelatinase e presença determinante da
aderência. Este e outros fatores de virulência foram também identificados em E.
faecalis isolados clinicamente de canais radiculares e da cavidade oral (MOHAMED et
al., 2001; SEDGLEY et al., 2006). Contudo, não existem informações da capacidade de
formações de biofilmes de E. faecalis isolados clinicamente de canais radiculares e
cavidade oral comparados à colônias de outras infecções humanas (SPRATT et al.,
2001).
Os fatores de virulência dos E. faecalis promovem sua adaptação e
sobrevivência em diferentes sítios. Substância de agregação, secreção de toxinas e
proteases são alguns desses fatores. Essa espécie microbiana também é capaz de
produzir gelatinase. A gelatinase hidroliza a gelatina, colágeno e outros peptídeos. Foi
descrito que a gelatinase é produzida por 70% de colônias de Enterococcus faecalis
isoladas de canais radiculares (SEDGLEY et al., 2005).
2.3 Controle das infecções endodônticas causadas por E. faecalis
28
Durante a terapia endodôntica, os procedimentos empregados visam a
eliminação ou prevenção da infecção causada por quaisquer patógenos capazes de
persistir no interior dos canais radiculares, incluindo E. faecalis e em virtude da
infecção por esta espécie apresentar tendência a ocorrer durante a terapia
endodôntica, entre consultas. A incapacidade de adaptação dos instrumentos
endodônticos às paredes do canal em função das variações anatômicas é outro fator
que impede o sucesso da desinfecção. São istmos, reentrâncias e ramificações dos
sistemas de canais radiculares muitas vezes não afetados durante a instrumentação,
podendo permitir a sobrevivência dos E. faecalis (WALTON, 1976). Durante o preparo
químico-cirúrgico, instrumentos endodônticos promovem a remoção mecânica de
microrganismos, seus produtos e tecidos degenerados. Quando auxiliados por uma
substância química, além de maximizar a remoção de detritos através da ação
mecânica do fluxo e refluxo, também pode exercer um efeito químico significativo
desde que possua ação antimicrobiana e solvente de matéria orgânica (LOPES &
SIQUEIRA, 1999). Mesmo quando não se emprega uma substância dotada de
atividade antimicrobiana, a ação dos instrumentos endodônticos e da irrigação são
suficientes para a eliminação de quantidade substancial de microrganismos e tecido
degenerado do interior do sistema de canais radiculares. Entretanto, a eliminação total
de microrganismos não é observada na maioria dos casos (SIQUEIRA et al., 1999).
2.3.1 Substâncias químicas auxiliares
29
As substâncias químicas auxiliares utilizadas durante a terapia endodôntica
atuam através de pulsos de irrigação-aspiração de curta duração. Os agentes químicos
e os veículos precisam apresentar eficácia e eficiência que dependem das
propriedades físicas e químicas. Atualmente, o hipoclorito de sódio é a substância mais
utilizada e mais aceita na Endodontia. VAHDATY, PITT FORD & WILSON (1993) em
estudo in vitro em dentes bovinos, concluíram que a clorexidina (0,2% e 2%) foram
igualmente eficazes como agentes antimicrobianos quando testados em concentrações
similares sobre culturas de E. faecalis. COHEN & BURNS (1997) em estudo com o
hipoclorito de sódio, relataram que é a solução irrigadora antimicrobiana mais eficaz,
podendo eliminar todos os microrganismos dos canais radiculares incluindo bactérias e
vírus formadores de esporos. Segundo eles, a utilização do hipoclorito de sódio em
baixa concentração (abaixo de 2,5%), elimina a infecção, mas não dissolve os resíduos
pulpares de maneira consistente. O poder de dissolução do NaOCl é influenciado pela
integridade estrutural dos componentes do tecido conjuntivo pulpar. Se a polpa estiver
decomposta, não demorará muito para que ocorra dissolução dos resíduos de tecido
mole remanescente. Caso a polpa esteja vital e apresentar uma pequena degeneração
estrutural , levará muito tempo para que o NaCl dissolva os resíduos. Finalizando,
frisaram que a frequência da irrigação e o volume da solução utilizados são fatores
importantes na remoção dos resíduos e que a frequência deve aumentar à medida que
se aproxima do ápice. HELING & CHANDLER (1998), compararam a clorexidina e o
hipoclorito de sódio a 0,2% e 2% que foram igualmente efetivos na eliminação de E.
faecalis. Acrescentaram o peróxido de hidrogênio ao estudo e após testarem as três
soluções, notaram um efeito sinérgico quando misturas de clorexidina e peróxido de
hidrogênio foram associadas a uma concentração específica (0,2% e 3%). SIQUEIRA
30
et al., (2000), avaliaram a redução microbiana produzida pela instrumentação e
irrigação com hipoclorito de sódio a 1%, 2,5% e 5,25% ou solução salina, em estudo in
vitro. Os autores não observaram diferença significante entre as três concentrações de
hipoclorito de sódio, visto que todas reduziram o nível microbiano nos canais
radiculares. No entanto, as soluções de hipoclorito de sódio foram bem mais efetivas
que a solução salina. SEGURA et al., (1999) demonstraram que o digluconato de
clorexidina foi menos efetivo que o hipoclorito de sódio a 5,25% pra a inibição da
capacidade do macrófago em se aderir ao substrato. Levando-se em consideração que
a aderência ao substrato é o primeiro grau no processo de fagocitose e apresentação
de antígeno, a clorexidina poderia inibir a função do macrófago e modular a resposta
inflamatória. Concluíram que a utilização da clorexidina a 0,12% ou hipoclorito de sódio
a 5,25% no preparo químico-cirúrgico dos canais, maior radiculares deverá ser feita de
maneira cuidadosa para evitar extravasamentos pois estes podem reduzir a adesão
macrofágica, alterando os mecanismos de reparo e as reações inflamatórias dos
tecidos perirradiculares. Em estudo mais recente, SASSONE et al., (2004) avaliaram in
vitro a atividade antimicrobiana do hipoclorito de sódio – NaOCl (1% e 5%) e da
clorexidina (0,12%, 0,5% e 1%). A solução de clorexidina a 0,12% não foi capaz de
eliminar os E. faecalis em nenhum intervalo de tempo testado, enquanto que as
soluções de clorexidina a 0,5% e 1% eliminaram os microrganismos, assim como as
duas concentrações de hipoclorito de sódio.
É oportuno salientar que a ação dos instrumentos durante a terapia endodôntica
parece ser um dos fatores que contribuem para a formação de uma camada residual
(conhecida como smear layer) que se extende para dentro dos túbulos dentinários,
31
funcionando como um tampão e dificultando a ação dos agentes antimicrobianos
(ARAÚJO et al., 2003). Como a incidência dos E. faecalis em lesões perirradiculares
persistentes é muito alta, parece lógico entender que esta espécie esteja incluída
nessa camada residual. No estudo de SCELZA et al., (2004) foram comparadas três
substâncias: ácido cítrico a 10%, EDTA e EDTA T para a remoção da smear layer das
paredes dentinárias em tempos de 3, 10 e 15 minutos. Os resultados mostraram que
estatisticamente houve diferença significativa quando se utilizou o ácido cítrico por 3
minutos comparando com 5 e 15 minutos. O EDTA a 17% se mostrou mais efetivo
quando utilizado por 3 minutos e o EDTAT não apresentou diferença em relação ao
tempo de utilização da substância. Concluíram que as referidas substâncias foram
efetivas e que essa efetividade não é aumentada pelo aumento do tempo. Com o
intuito de avaliar comparativamente a citotoxidade de irrigantes utilizados no sistema de
canais radiculares, MALHEIROS et al. (2005) testaram as soluções de EDTA a 17% e
ácido cítrico (10, 15 e 25%) em fibroblastos cultivados pois estas substâncias devem
ser compatíveis com os tecidos perirradiculares. A solução de ácido cítrico não
danificou o crescimento dos fibroblastos, confirmando não ser tóxica in vitro.
BYSTRÖM et al., (1985) estudaram a ação antimicrobiana do EDTA e do hipoclorito de
sódio, concluindo que o EDTA produz um efeito reduzido no combate ao E. faecalis,
porém, em combinação com o hipoclorito de sódio a 5%, apresentou atividade
antimicrobiana mais eficaz do que quando se utilizou apenas o hipoclorito de sódio.
VASSILIADIS et al., (1994) avaliaram por meio da microscopia eletrônica a penetração
do cimento de Grossman em túbulos dentinários. Houve a penetração do cimento nos
túbulos dentinários mesmo sem a remoção da smear layer. Diferentes profundidades
32
de penetração foram observadas provavelmente devido a diferenças na manipulação,
na consistência do cimento e na força empregada na condensação lateral.
Apesar do hipoclorito de sódio ser a substância mais utilizada e aceita na
Endodontia, investigações resultam em novas substâncias, como é o caso do MTAD,
composto de diferentes agentes antimicrobianos (um quelante, tetraciclina e
detergentes). Em estudos preliminares, o MTAD obteve sucesso na eliminação do E.
faecalis (TORABINEJAD et al., 2003). Se faz necessário lembrar que Enterococcus sp
costumam adquirir resistência a diversos agentes antimicrobianos e o ideal é que haja
um acompanhamento e monitoramento dessa resistência.
2.3.2 Medicação Intracanal
A finalidade principal da medicação intracanal é a eliminação de microrganismos
que sobreviveram aos efeitos do preparo químico-cirúrgico. O medicamento deve
permanecer ativo durante todo o período entre consultas, evitando a reinfecção e
reduzindo o risco de proliferação de microrganismos residuais, existe suporte científico
de que é essencial em determinadas situações clínicas. Em cerca de 40% a 70% dos
casos, microrganismos sobrevivem aos efeitos do preparo químico-cirúrgico, muitos
destes estão destinados a serem eliminados pela exposição a um material obturador
dotado de atividade antimicrobiana ou confinados no interior do canal radicular, ficando
desprovidos de nutrientes. Apesar disso, microrganismos podem sobreviver mesmo a
despeito de uma obturação adequada do canal radicular, obtendo nutrientes e
33
sobrevivendo em número suficiente para perpetuar uma lesão perirradicular
(BYSTRÖM et al., 1981).
Os E. faecalis são altamente resistentes às medicações utilizadas durante a
terapia endodôntica, sendo um dos poucos microrganismos resistentes ao hidróxido de
cálcio. TRONSTAD et al. (1981) utilizaram o hidróxido de cálcio como curativo
intracanal por quatro semanas e observaram que o pH na dentina medicada com o
hidróxido de cálcio é variável. Na dentina adjacente variou de 8 a 11, na dentina
periférica a variação ocorreu de 7,4 a 9,6 e dentro do canal o pH observado foi de 10 a
12,2. Mesmo com a alcalinização do meio, os níveis de pH são insuficientes para a
eliminação do E. faecalis que sobrevive em pH 11,5.
A invasão dos E. faecalis no interior dos canais radiculares varia em termos de
profundidade e penetração. Essa invasão não é uniforme em todos os túbulos
dentinários (HAAPASALO et al., 2003). Os procedimentos de desinfecção encontrarão
muitas dificuldades na eliminação desses microrganismos quanto maior o nível de
profundidade atingido nos túbulos dentinários. O pH alcalino do hidróxido de cálcio
talvez não seja suficiente para a inibição do crescimento dos E. faecalis nos canais
radiculares, parece promover a adesão do microrganismo ao colágeno e o aumento da
invasão aos túbulos dentinários. Nos dentes com polpa necrosada, os fluidos apicais
têm acesso direto aos tecidos perirradiculares, sendo a albumina um componente
desses fluidos. Em adição, já foi descrito que os E. faecalis estão intimamente
envolvidos com a albumina, proteínas e carboidratos contidos nesta região. Com
34
nutrientes à disposição, não parece ser difícil a sobrevivência das espécies
microbianas (SHORROCK & LAMBERT, 1989).
Apesar da limitação em relação ao pH, o hidróxido de cálcio é o medicamento
mais utilizado na terapia endodôntica. Ao longo dos anos, estudos procuram prover
essa deficiência adicionando substâncias na formulação de pastas denominadas
“pastas de hidróxido de cálcio”. ÖZCELIK, TASMAN & OGAN (2000) compararam a
tensão superficial de diferentes veículos (glicerina, solução anestésica, solução de
Ringer e solução salina) que foram associados ao hidróxido de cálcio para utilização
como medicação intracanal. Os resultados demonstraram uma diferença significativa
entre os veículos isoladamente e associados ao hidróxido de cálcio. Os autores
concluíram que a solução anestésica é o melhor veículo para ser associado ao
hidróxido de cálcio por apresentar menor tensão superficial.
SIQUEIRA et al., (1996) avaliaram a pasta de hidróxido de cálcio com água
destilada para eliminação do E. faecalis e o F. nucleatum. Mesmo após uma semana
de contato, a pasta não foi considerada eficaz. Em contrapartida, a pasta de hidróxido
de cálcio, paramonoclorofenol canforado e glicerina mostrou-se eficaz em realizar tal
intento em apenas um dia de contato. Os autores observaram que quanto maior a
quantidade de paramonoclorofenol canforado adicionado, maior a eficácia
antimicrobiana.
Em estudo in vitro que investigou a desinfecção dos túbulos dentinários
infectados por E. faecalis, TANRIVERDI et al., (1997) acompanharam a ação do
35
hidróxido de cálcio, paramonoclorofenol e paramonoclorofenol canforado sobre o E.
faecalis. Eles observaram que no prazo de 3 dias, o paramonoclorofenol canforado foi
o agente antimicrobiano mais eficaz, seguido do hidróxido de cálcio. É importante
ressaltar que a exposição do microrganismo ao medicamento teve como tempo
máximo apenas 3 dias.
MENEZES et al. (2004) estudaram a eficiência do hipoclorito de sódio a 2,5%,
da clorexidina a 2% como substâncias químicas auxiliares e também de algumas
medicações utilizadas na Endodontia: hidróxido de cálcio, hidróxido de cálcio com
paramonoclorofenol canforado, paramonoclorofenol canforado, tricresol formalina e
paramonoclorofenol com furacin. Dentre as soluções testadas, a clorexidina foi mais
eficaz que o hipoclorito de sódio na eliminação do E. faecalis. Na avaliação das
medicações, o hidróxido de cálcio adicionado de paramonoclorofenol canforado
utilizado sob forma de pasta demonstrou maior eficácia tanto na eliminação do E.
faecalis quanto na eliminação da Candida albicans.
É importante lembrar que o material selador temporário utilizado entre sessões
na terapia endodôntica é mais um aliado no controle das infecções, pois impede que a
saliva e microrganismos da cavidade oral adentrem ao canal radicular, prevenindo
assim o risco de infecção ou reinfecção e evitando a passagem da medicação contida
no interior do canal radicular para o meio bucal, preservando assim a eficiência do
medicamento (WEINE, 1996).
36
2.3.3 Obturação dos canais radiculares
A obturação dos canais radiculares visa a obliteração tridimensional desde
abertura do canal até o término apical. Este procedimento aliado ao selamento
proporcionado por adequada restauração coronária previne a microinfiltração de
microrganismos, incluindo os E. faecalis (SHIPPER et al., 2004). Microrganismos
residuais que sobreviveram ao preparo químico-cirúrgico constituem em um potencial
para o insucesso endodôntico a longo prazo e uma das funções da obturação é impedir
a migração destes microrganismos para os tecidos perirradiculares (GUTMANN et al.,
1998).
A guta-percha é o material mais empregado atualmente, porém, apresenta
propriedades desfavoráveis como escoamento e adesividade, necessitando portanto da
complementação de um cimento obturador de canais radiculares (MANIGLIA et al.,
1997 ; LEONARDO & LEAL, 1998).
GOLDBERG et al., (1979) em estudo microscópico da estandardização dos
cones de guta-percha e observaram que frequentemente cones de todas as marcas
apresentavam depressões e protuberâncias em suas extremidades, as irregularidades
eram geralmente repetidas em diferentes cones de uma mesma marca e estas
discrepâncias criavam variações de calibre entre os mesmos números de diferentes
marcas. Os autores concluíram que as deformações observadas não permitiam o
ajuste correto do cone principal no canal radicular, dificultando a possibilidade de
37
obtenção de um correto selamento apical, advertiram ainda da necessidade de
fabricação de instrumentos endodônticos e cones de guta-percha em perfeita
correspondência de forma e tamanho.
A utilização dos cimentos obturadores é fator decisivo no êxito da terapia
endodôntica, seu emprego é baseado na grande necessidade de promover
preenchimento da interface cone – parede dentária, objetivando melhorar o selamento
do canal radicular. O cimento deve ser fácil de ser levado ao canal, com tempo de
trabalho satisfatório e uma vez dentro do canal juntamente com os cones de guta-
percha, satisfaça as propriedades físico-químicas desejáveis e necessárias a um
correto selamento e que seja bem tolerado pelos tecidos apicais e perirradiculares
(SIQUEIRA JR & GARCIA FILHO, 1994).
FERREIRA (2001) avaliou a capacidade da pasta L&C e do cimento AH-Plus
em associação a cones de guta-percha empregados na obturação de canais
radiculares para prevenção da infiltração de microrganismos da saliva. Após 67 dias, a
infiltração microbiana ocorreu em 45% das amostras obturadas com a pasta L&C e em
65% das obturadas com AH-Plus. Concluiu que não houve diferença significativa entre
os grupos estudados. Estudo envolvendo a eliminação de E. faecalis, incluiu o
hidróxido de cálcio dentre os cimentos endodônticos e a avaliação foi feita após um
período de 7 dias. O hidróxido de cálcio contribuiu para a redução do E. faecalis,
porém, não eliminou totalmente. Alguns cimentos como Roth 811, AH Plus e cimento
de Grossman são considerados efetivos na eliminação de E. faecalis no interior dos
túbulos dentinários (SALEH et al., 2004).
38
Além de todas as medidas descritas para a prevenção e eliminação do E.
faecalis do sistema de canais radiculares, é imperioso lembrar que a outros
procedimentos de assepsia incluindo a adequada desinfecção do dique de borracha
com clorexidina ou hipoclorito de sódio e a desinfecção dos cones de guta-percha com
hipoclorito de sódio antes da sua inserção nos canais radiculares também fazem parte
da complexa barreira para a eliminação desse e de outros microrganismos que na
grande maioria das vezes se torna um problema para quem pratica a endodontia
(SENIA et al., 1975).
39
3. OBJETIVOS
Diante do exposto sobre a participação dos enterococos nos processos
infecciosos de natureza endodôntica, seus mecanismos de resistência aos
procedimentos realizados no preparo químico-mecânico e nas situações de persistência
após a obturação do sistema de canais radiculares, a presente investigação teve como
objetivo geral o isolamento, identificação e caracterização bioquímica dos Enterococcus
sp. de canais radiculares de dentes com infecção endodôntica primária. Os seguintes
objetivos específicos foram propostos:
1) Seleção de pacientes portadores de dentes com canais radiculares com
necrose pulpar e coleta de material de canais radiculares com auxílio de
cones de papel estéreis e semeadura em meios seletivos líquidos caldo
enterococcosel e caldo EBM.
2) Isolamento e caracterização bioquímica convencional e por galeria API 20
Strep.
3) Correlação do isolamento de cepas de E. faecalis segundo o gênero e
grupo de dentes.
4) Associação do isolamento de Enterococcus sp. com situações clínicas de
edema, dor, presença de secreção purulenta intra-canal, fístula e com
aspectos radiográficos.
40
4. MATERIAL E MÉTODOS Os protocolos experimentais realizados na presente investigação foram
aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal Fluminense
sob o número 025/06.
4.1 MATERIAL
4.1.1 MEIOS SELETIVOS
- Caldo Enterococosel (Merck Darmstadt, DE)
- Caldo Eosina e Azul de Metileno (Becton & Dickinson, USA)
4.1.2 MEIOS DE CULTIVO
- Agar Cled (Becton & Dickinson, USA)
- Agar Sangue (Becton & Dickinson, USA)
- Agar Bile Esculina (Difco, USA)
- Agar Mac Conkey (Merck Darmstadt, DE)
- Agar Soja tripticaseína (TSA) – Merck Darmstadt, DE.
- Agar Soja tripticaseína + 6,5% Na Cl ( Merck Darmstadt, DE)
- Agar Enterococosel (Merck Darmstadt, DE)
- Base de descarboxilação de aminoácidos de Möeller (Difco, USA).
- Caldo HIB (Heart Infusion Broth, Difco, USA)
41
- Cystine Tryptcase Agar (Difco, USA)
- Motility medium (Becton & Dickinson, USA)
4.1.3 REAGENTES PARA IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA
- Manitol P.A. (Vetec Química Fina Ltda, Duque de Caxias, RJ).
- Sorbose (Merck Darmstadt, DE).
- Arginina L (Isofar, Duque de Caxias, RJ)
- D- Sorbitol ( Merck Darmstadt, DE)
- Inulina (Merck Darmstadt, DE).
- Telurito de Potássio (Riedel-de-Häen, DE).
- Arabinose L+ (Isofar, Duque de Caxias, RJ).
- D (+)- Rafinose (Sigma Chemical Co, Saint Louis, USA)
- Sacarose P.A. (Quimibrás Ind. Químicas, RJ).
4.1.4 GALERIA DE IDENTIFICAÇÃO MINIATURIZADA
- API 20 Strep (Biomérieux, La Balme, Les Grotes, France) (Figura 1).
4.1.5 OUTROS MATERIAIS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS
- Leite Desnatado a 10% ( Skim Milk, Difco, USA )
- Glicerol 5% (Merck Darmstadt, DE)
- Câmara de Fluxo Laminar (Veco – Mod. VLF9)
- Púrpura de Bromocresol (Micro Méd Ltda, Sampaio, RJ)
- Cones de Papel Absorvente (Konne – Ind. Com. de Mat. Odont., MG)
- Peróxido de Hidrogênio 3%
- Alças descartáveis plásticas
- Placas de Petri
42
- Criotubos de Plástico (crio)
- Bulbos
- Tubos de Ensaio (Tampa de Rosca 13 x 100)
- Microtubos tipo Eppendorf
4.2 MÉTODOS
4.2.1 Seleção dos pacientes, coleta e processamento do material clínico
Os pacientes participantes do estudo gozavam de boa saúde sistêmica e não
tinham sido atendidos em hospitais ou medicados com antibióticos pelo menos seis
meses antes da realização da coleta. As amostras para a pesquisa foram obtidas de
70 (setenta) pacientes submetidos a tratamento endodôntico na Clínica de
Endodontia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, com
diagnóstico de polpa necrosada. Os indivíduos participantes da pesquisa receberam
esclarecimento sobre a importância do estudo e o material clínico foi colhido
somente após a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo 1).
A elaboração de fichas clínicas (Anexo 2) objetivaram as análises relativas à
sintomatologia dolorosa, aos aspectos radiográficos, presença de odor, secreção
purulenta, edema e fístula nos indivíduos envolvidos na pesquisa quando da coleta
de material dos dentes com canais radiculares com necrose pulpar. Apenas
pacientes portadores de dentes com diagnóstico de polpa necrosada sem prévio
tratamento endodôntico ou acesso prévio da cavidade oral ao sistema de canais
43
radiculares (câmara pulpar sem contaminação com a cavidade oral), foram incluídos
no estudo.
O acesso aos canais radiculares foi realizado sob isolamento absoluto,
respeitando as condições de assepsia (após remoção do biofilme supragengival e
utilização de agente antisséptico (clorexidina a 2%) e irrigação intensa com soro
fisiológico). Em seguida, cones de papel esterilizados foram introduzidos
cuidadosamente até o terço cervical e médio dos canais, removidos após 30
segundos e introduzidos em tubos contendo meios estéreis específicos para o
crescimento de microrganismos anaeróbios facultativos, incluindo Enterococcus sp:
Caldo Eosina e Azul de Metileno (EMB) e Caldo Enterococcosel. Em todas as
ocasiões os meios foram transportados para a Disciplina de Microbiologia e
Imunologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade do Estado do Rio de
Janeiro e incubadas até 48/37ºC. Alíquotas dos meios de cultivo líquidos foram
semeados por esgotamento nos meios Agar Mac Conkey (Merck Darmstadt, DE),
Agar Cled (Becton, Dickinson and Company, USA), Agar Sangue (Becton, Dickinson
and Company, USA ) e Agar Soja Tripticaseína (Merck Darmstadt, DE). Todos os
procedimentos envolvendo a semeadura nos meios de cultura foram realizados no
interior de capelas de fluxo laminar (Figura 2).
4.2.2 Caracterização Fisiológica das Amostras bacterianas
a) Coloração pelo Método de Gram
44
A partir do crescimento bacteriano em placas de TSA, foram selecionadas
colônias sugestivas de enterococos. As colônias foram repicadas isoladamente para
meios de cultura e preparados esfregaços em lâminas de vidro. Depois da coloração
pelo método de Gram, os esfregaços foram observados ao microscópio óptico com
aumento de 100X. Destarte, cada colônia isolada, suspeita de Enterococcus sp. foi
semeada para a obtenção de cultura pura (massa bacteriana) para o congelamento,
realizado em 10% de Skim milk contendo 5% de glicerol, e para a caracterização
fisiológica e bioquímica, segundo proposto por TEIXEIRA & FACKLAM (2003).
b) Produção da enzima catalase
A observação da produção da catalase foi feita por metodologia convencional
com a utilização de lâmina de vidro. Foi preparada uma suspensão espessa de
microrganismos cultivados por 24h/37ºC em superfície de placas de TSA em solução
salina fisiológica estéril (NaCl 0,85%). Em seguida, uma gota de peróxido de
hidrogênio a 3% (v/v) foi colocada sobre o esfregaço. Os Enterococcus sp. são
negativos neste teste, porém, algumas poucas amostras foram capazes de produzir
pseudocatalase (MAC FADDIN, 2000).
c) Tolerância ao Cloreto de Sódio a 6,5%
Foram utilizadas placas de TSA (Agar Soja tripticaseína – Merk Darmstadt
DE) acrescidas de cloreto de sódio a 6,5%. Inicialmente foram feitas semeaduras por
esgotamento das amostras e incubadas a 37ºC por 24 horas. O crescimento
45
bacteriano nessas condições é uma das características do gênero Enterococcus
(MAC FADDIN, 2000).
d) Crescimento na Presença de 40% de bile e utilização da
esculina
As cepas bacterianas também foram cultivadas na superfície de placas de
agar bile-esculina. O crescimento em agar contendo 40% de Bile bovina e a
utilização concomitante da esculina também constitui prova chave para a
identificação bioquímica de Enterococcus sp. (MAC FADDIN, 2000).
4.2.3 Identificação Bioquímica
a) Bioquímica convencional
Após os testes fisiológicos, as amostras suspeitas de enterococos foram
divididas em 5 grupos baseados na produção de ácidos a partir de manitol e sorbose
(ambos realizados em meio HIB contendo púrpura de bromocresol como indicador
de pH) e na capacidade de decarboxilar a arginina (em base de descarboxilação de
aminoácidos de Möeller). Depois de agrupadas, as cepas foram identificadas através
de provas adicionais que incluiram a fermentação de açucares tais como arabinose,
rafinose, sorbitol, inulina, sacarose e a capacidade de crescer em meio contendo
0,04% de telurito de potássio (TEIXEIRA & FACKLAM, 2003). Durante a realização
dos ensaios, as amostras foram mantidas através de passagem em placas de Agar
soja Tripticaseína (TSA – Merck Darmstadt, DE).
46
b) Identificação por sistema miniaturizado
A identificação através do sistema de galerias miniaturizadas API 20 strep
(Biomérieux, La Balme, Les Grotes, France ) foi realizada segundo as instruções do
fabricante. As amostras foram semeadas em agar sangue durante 24 horas em
atmosfera de anaerobiose (visualização do padrão de hemólise em anaerobiose) e
em seguida utilizadas para formação de uma suspensão de trabalho em meio de
suspensão do kit de identificação. Em seguida, 100 µL da suspensão foram
utilizados para preencher as células das galerias e o material foi mantido em câmara
úmida em estufa a 37ºC. As reações foram lidas após 4 e 24 horas de incubação.
Quando necessários, testes adicionais: Crescimento em 6,5% de NaCl, crescimento
a 45ºC e fermentação de salicina, foram realizados para a confirmação do isolado
P40 (E. durans). Os resultados numéricos foram confirmados pelo sistema APIWEB,
utilizando a database da Biomérieux (BOSSHARD et al., 2004).
Análise estatística
Os dados relativos à distribuição isolamento dos enterococos por gênero e
presença de edema, dor, lesão radiográfica e odor foram analisados através de
quiquadrado através do programa GraphPad Prism. Foi considerada diferença
estatisticamente significativa quando P< 0.05.
47
Figura 1: Sistema miniaturizado API 20 Strep.
Figura 2: Capela de fluxo laminar. No interior da câmara todo ar circulante é estéril.
48
5. RESULTADOS
5.1 Frequência de isolamento de Enterococcus sp. a partir de dentes com canais radiculares com necrose pulpar
No presente estudo foram isoladas 35 (50%) amostras de Enterococcus sp. a
partir dos canais radiculares com necrose pulpar cujas câmaras pulpares não
apresentavam comunicação com a cavidade bucal, de 70 pacientes. As culturas
foram positivas em 16 dos 27 pacientes do sexo masculino (59,25%) e em 19 dos 43
pacientes do sexo feminino (44,18%). Apesar do maior número de pacientes do
gênero feminino no estudo, o maior percentual relativo de isolamento de
Enterococcus sp. ocorreu em indivíduos do gênero masculino (Tabela 1). A Tabela 2
mostra a distribuição do isolamento das espécies de Enterococcus sp. entre os
gêneros feminino e masculino, isoladas dos sistemas de canais radiculares com
necrose pulpar. Foram encontradas as espécies: E. faecalis (33 cepas - 94,2%), E.
faecium (01 cepa - 2,85%) e E.durans (01 cepa - 2,85%).
5.2 Sintomatologia Dolorosa
Em um total de 35 pacientes com culturas positivas, 20 (57,14%) relataram
sintomatologia dolorosa prévia ao tratamento endodôntico. (Tabela 3). Dentre os 19
pacientes do sexo feminino com cultura positiva, 11 (57,89%) relataram a presença
de sintomatologia dolorosa. Nove (56,25%) dos 16 pacientes do sexo masculino
relataram sintomatologia dolorosa. Não houve diferença significativa quando da
49
relação entre o isolamento de Enterococcus sp. e a presença de sintomatologia
dolorosa (P> 0.05).
50
Tabela 1 - Percentual de isolamento de Enterococcus sp em pacientes portadores de e dentes com canais com necrose pulpar por gênero/dente.
Gênero / No de dentes1 Culturas positivas para Enterococcus sp.
Percentual de isolamento
Feminino – 43 19 44,18%
Masculino – 27 16 59,25%
Total – 70 35 50% 1As coletas de material foram obtidas de um (01) dente por paciente.
Tabela 2 - Percentual de isolamento de Enterococcus sp. em pacientes portadores de e dentes com canais com necrose pulpar por gênero/espécie.
Espécies Percentual de isolamento em pacientes
Total Feminino Masculino
E. faecalis
33 (94,2%) 18 (94,8%) 15 (93,8)
E. faecium
1 (2,85%) 1 (5,3%) _
E. durans
1 (2,85%) _ 1 (6,2%)
Total* 35 19 16
51
5.3 Presença de Odor
Seis dos 70 pacientes atendidos durante a realização do estudo apresentaram
odor fétido durante o acesso aos canais radiculares. O isolamento dos enterococos
ocorreu em 3 (8,57%) pacientes. Dentre estes, 2 pacientes do sexo feminino e 1 do
sexo masculino apresentaram a espécie E. faecalis (Tabela 4).
5.4 Presença de Secreção Purulenta
A observação de secreção purulenta durante o primeiro atendimento também
foi observada em 05 pacientes. Três dentes com cultura positiva para E. faecalis
apresentaram secreção purulenta intra-canal no momento da coleta. Tal fato ocorreu
em 2 pacientes do sexo feminino e 1 paciente do sexo masculino (Tabela 4).
5.5 Presença de fístula
A drenagem externa (presença de fístula) também foi observada em apenas
dois pacientes dos 70 envolvidos no estudo. Em um deles foi isolada a espécie E.
faecalis (Tabela 4).
52
Tabela 3 - Pacientes com culturas positivas relacionados à sintomatologia dolorosa.
Sintomatologia Presente Ausente
Feminino 11 (31,43%) 8 (22,85%)
Masculino 9 (25,72%) 7 (20%)
Total 20 (57,15%) 15 (42,85%)
Tabela 4 -Número de pacientes com culturas positivas que apresentaram secreção purulenta, presença de odor, edema e fístula no momento da coleta.
Odor / Secreção purulenta / Edema / Fístula
Masculino Feminino
Odor 1 (2,85%) 2 (5,71%)
Secreção purulenta 1 (2,85%) 2 (5,71%)
Edema 2 (5,71%) 2 (5,71%)
Fístula - 1 (2,85%)
Culturas positivas 16 (45,72%) 19 (54,28%)
53
5.6 Presença de Edema
Cinco pacientes apresentaram edema ao primeiro atendimento visando o
tratamento endodôntico. Dentre os 35 pacientes com cultura positiva, 4 (11,42%)
eram portadores de edema no momento da coleta, 2 do sexo masculino e 2 do sexo
feminino. Em todas as circunstâncias foi isolada a espécie E. faecalis (Tabela 4).
5.7 Distribuição Por Grupos de Dentes
A Tabela 5 mostra a relação entre os grupos de dentes com cultura positiva
relacionado com o gênero e ordem de coleta. Os 70 indivíduos participantes (P) da
presente investigação, que assinaram o termo de consentimento informado, tiveram
os materiais clínicos numerados segundo a ordem de atendimento. Os pacientes
foram incluídos no estudo de forma randômica, ou seja, não houve uma distribuição
similar entre os grupos de dentes incluídos no estudo. Dos 15 incisivos submetidos
às coletas de material, nove (60%) apresentaram-se colonizados por E. faecalis,
enquanto três caninos (75%) dos quatro submetidos às coletas apresentaram a
espécie E. faecalis. Dos pré-molares (n=22) submetidos às coletas ocorreu o
isolamento de Enterococcus sp. de 09 dentes (41%). De forma similar, dentre os 29
molares submetidos às coletas, 14 cepas (48,2%) de Enterococcus sp. foram
isoladas.
54
Tabela 5 - Dentes com cultura positiva relacionados a grupo de dentes e gênero.
Grupo de dentes Masculino Feminino
Incisivos (n= 15) P27 (42); P34 (11); P43 (12); P68 (11)
P1(21); P12 (21); P13(11); P16 (12); P24(31)
Caninos (n= 4) P4(23) P7(13); P39(13)
Pré-molares (n=22) P14(25); P19 (34); P35(14); P67(24)
P2(25); P5(34); P23(35); P28(24); P52(45)
Molares (n=29) P15(47); P17(38); P25(17); P32(16); P33(16); P40(46);
P54(16).
P6(46); P18(47); P38(46); P45(46); P47(27); P51(46);
P66(46).
Tabela 6 - Espécies microbianas (isolados) relacionadas ao paciente, número do dente e por ordem de coleta e meio seletivo utilizado.
Espécie Ordem de coleta /meio enterococcosel
Ordem de coleta /meio eosina e azul de metileno
E.faecalis P1E; P2E; P4E; P5E; P6E; P7E; P13E; P14E; P15E; P17E; P18E; P24E; P25E; P28E; P32E; P33E; P34E; P35E; P39E; P43E; P45E; P51E; P52E; P66E; P67E; P68E.
P6EMB; P16EMB; P19EMB; P27EMB; P38EMB; P47EMB; P54EMB.
E. faecium - P23EMB.
E. durans P40E
55
5.8 Espécies de Enterococcus sp. e os Meios Seletivos Utilizados
Na Tabela 6, as espécies microbianas identificadas no estudo estão
associadas aos números dos pacientes por ordem de coleta (P), e os meios
seletivos utilizados durante a coleta do material clínico: Caldo Enterococosel (E) ou
Caldo Eosina e Azul de Metileno (EMB). Cada isolado foi representado pelo número
do paciente e o meio seletivo utilizado no procedimento de coleta (p.ex. a cepa P1E
corresponde à amostra de E. facealis isolada do primeiro paciente coletado que
cresceu no meio enterococcosel). Vinte e sete (27) isolados foram obtidos a partir do
caldo enterococcosel, totalizando 77,14% de isolamento dos casos com cultura
positiva, enquanto 8 cepas foram obtidas do caldo EMB (22,86%).
56
6. DISCUSSÃO
Os enterococos estão amplamente distribuídos no ambiente e nos seres
humanos compõem a microbiota do trato gastrintestinal, cavidade oral e trato
geniturinário. Nas últimas décadas, os enterococos se tornaram importantes
agentes etiológicos de infecções hospitalares, principalmente em hospedeiros
imunocomprometidos e de superinfecções em pacientes tratados com agentes
antimicrobianos de amplo espectro (TEIXEIRA & FACKLAM, 2003). Atualmente, é
reconhecido que os enterococos podem causar uma variedade de infecções
monomicrobianas e polimicrobianas, especialmente em pacientes em estado
clínico grave. Dentre os quadros infecciosos se destacam as infecções do trato
urinário, bacteremias, endocardites, infecções intra-abdominais, trato biliar, e de
feridas (incluindo as operatórias), úlceras de decúbito e de pé de diabéticos.
Adicionalmente, causam em menor freqüência infecções dos sistemas respiratório
e nervoso, conduto auditivo, da conjuntiva e região periodontal (JOHNSON, 1994;
MUNDY, SAHM & GILMORE, 2000; TENG et al.,2002; ARCHIMBAUD et al., 2002).
A importância crescente do gênero Enterococcus no cenário das infecções
humanas fez surgir extenso interesse no estudo da diversidade genética de tais
microrganismos. As técnicas moleculares têm auxiliado significativamente para a
definição da distribuição clonal, sendo possível a demonstração da transmissão
destes microrganismos por contato direto e indireto entre pacientes (LIVORNESE
et al.,1992; PEGUES et al., 1997). O aumento significativo de infecções
enterocócicas causadas principalmente pela espécie E. faecalis e a emergência de
57
mecanismos de resistência justificam o interesse no entendimento dos fatores de
virulência destes microrganismos, assim como a determinação da presença de
amostras portadoras dessas características em nosso meio.
O principal objetivo do presente estudo foi o de isolar, identificar e
caracterizar fisiologicamente Enterococcus sp em canais radiculares de dentes
portadores de necrose pulpar. Estudos recentes investigando a microbiota dos
canais radiculares através de coleta e métodos de cultivo vêm encontrando uma
baixa prevalência de E. faecalis nas infecções endodônticas primárias, variando de
13% a 4% dos isolamentos (FERRARI et al.,2005 – 13%; SEDGLEY et al.,2006a -
10,2%; GOMES et al.,2006 – 4%). Em nosso estudo foram isoladas 35 amostras
de Enterococcus sp de um total de 70 pacientes com diagnóstico de necrose
pulpar nos respectivos canais radiculares, perfazendo assim uma prevalência de
50%. As culturas foram positivas em 16 dos 27 pacientes do sexo masculino
(59,25%) e em 19 dos 43 pacientes do sexo feminino (44,18%). Apesar das
variações da distribuição entre os gêneros, não houve diferença estatisticamente
significativa. Poucos trabalhos realizados com a detecção de enterococos vêm
relevando a colonização dos canais radiculares por este grupo de microrganismos.
Um trabalho realizado em Singapura, com pacientes internados em hospitais,
relevou a colonização de E. faecalis resistente à vancomicina (VRE) propondo,
dentre os fatores de risco para a colonização, a associação: pacientes idosas
(sexo feminino) e diabéticas (YANG et al.,2007).
58
Quanto ao grupo de dentes (incisivos, caninos, pré-molares e molares), o
presente estudo demonstrou tendência à colonização de E. faecalis em caninos
(75%) e incisivos (60%). Para os outros grupos de dentes, os premolares e
molares apresentaram menor taxa de colonização por Enterococcus sp, de 41% e
48,2%, respectivamente. Apesar dos percentuais elevados de colonização de
caninos e incisivos por E. faecalis, novos estudos são necessários para afirmar a
tendência de colonização por esta espécie, tendo em vista a pequena amostragem
de incisivos (15 dentes) e caninos (04 dentes) envolvidos na presente
investigação.
Durante a realização dos ensaios 10 outros pacientes apresentando
dentes com câmara pulpar aberta também foram investigados (dados não
apresentados). Foram caracterizadas (07) sete cepas de E. faecalis dos dentes
portadores de canais radiculares com infecção endodôntica primária, cujas
câmaras pulpares apresentavam-se com comunicação com a cavidade oral,
representando uma prevalência de isolamento de 70%. Tais resultados não foram
incluídos no presente estudo devido ao fato da literatura consultada relacionar o
isolamento dos Enterococcus sp. com a contaminação dos sistemas de canais
radiculares por deficiência de selamento da câmara pulpar (SIREN et al., 1997).
Apesar da pequena amostragem, tais resultados sugerem que a comunicação dos
sistemas de canais rediculares com a cavidade oral pode de fato influenciar na
colonização por E. faecalis. Estes aspectos constituem perspectivas para a
realização de novos trabalhos em endodontia.
59
A infecção endodôntica primária é causada por microrganismos que
colonizam a polpa necrosada e é também conhecida como infecção inicial. Já a
infecção secundária (ou refratária) tem como origem microrganismos que
permanecem infectando o sistema de canais radiculares após a intervenção
endodôntica, ou que penetraram os canais através de falhas na manutenção da
cadeia asséptica, entre as sessões da terapia ou mesmo após a conclusão desta.
Os enterococos são os microrganismos mais comumente associados aos casos de
insucesso endodôntico, podendo manter-se viáveis por períodos variáveis de
tempo (LOPES & SIQUEIRA, 2004), sendo detectados através de técnicas
moleculares (em especial PCR) em 77% dos casos de infecções endodônticas
refratárias (SIQUEIRA & ROÇAS, 2004).
Alguns estudos realizados pelo método de cultivo comprovaram a
presença majoritária dos E. faecalis na infecção endodôntica refratária ao
tratamento ou secundária. MÖLLER em 1966, estudou casos de insucesso da
terapia endodôntica encontrou uma média de 1,6 espécie microbiana por canal.
Microrganismos anaeróbios estritos corresponderam a 51% das cepas isoladas e
E. faecalis foi encontrado em 29% dos casos. SUNDQVIST et al.,1998 relataram
uma média de 1,3 espécie por canal, sendo que 42% dos microrganismos foram
anaeróbios estritos e E. faecalis detectado em 38%. MOLANDER et al.,1998
estudaram 100 canais radiculares obturados e com lesões perirradiculares,
encontrou uma prevalência de 69% de anaeróbios facultativos e os enterococos
presentes em 32% dos elementos dentários investigados. A maior prevalência em
estudos por métodos de cultivo em casos de insucesso endodôntico foi verificada
60
no trabalho de PECIULIENE et al.,2000, em que o isolamento de E. faecalis atingiu
a marca de 70%.
Estudo empregando métodos moleculares demonstrou a presença de E.
faecalis em infecções refratárias ao tratamento endodôntico em 77% dos casos. A
associação com outras espécies microbianas também foi relevada nos casos de
infecções refratárias. Foi observada a presença de Pseudoramibacter alactolyticus
em 52%, Propionibacterium propionicum (52%), Dialister pneumosintes (48%) e
Filifactor alocis (48%). A levedura C. albicans foi encontrada em 9% das amostras
(SIQUEIRA & ROÇAS, 2004).
A identificação de Enterococcus sp nos canais radiculares de dentes de
seres humanos através de métodos de cultivo foi feita pela primeira vez por
MEJARE (1975) que isolou e identificou as espécies E. faecalis e E. faecium.
FERRARI et al., 2005 em estudo incluindo enterococos, enterobactérias e fungos,
identificaram E. faecalis, E. faecium e E. casseliflavus. No presente estudo foram
isoladas e identificadas 35 amostras de Enterococcus sp: 33 amostras de E.
faecalis (94,28%), 1 amostra de E. faecium (2,86%) e 1 amostra de E. durans
(2,86%). Esta última espécie pela primeira vez isolada e identificada em canais
radiculares de dentes de seres humanos. É oportuno ressaltar que para a
identificação da espécie E. durans foram necessárias algumas provas adicionais
tais como crescimento na presença de NaCl a 6,5%, crescimento em salicina e à
temperatura de 45ºC/48h. Estas provas adicionais diferenciaram a espécie E.
61
durans da espécie Lactococcus lactis Os resultados da identificação bioquímica
convencional foram concordantes com a identificação pelo sistema API 20 Strep.
Alguns pesquisadores detectaram E. faecalis em materiais provenientes
de infecção endodôntica primária através de diversas técnicas. ROÇAS et al., 2004
em estudo relativo à infecção endodôntica primária correlacionou os achados pela
técnica de PCR e por métodos de cultivo. O estudo contou com 50 casos e a
detecção pela técnica de PCR atingiu 33% (7 de 21 casos) de canais radiculares
associados a lesões perirradiculares crônicas assintomáticas, em 10% (1 de 10
casos) de canais radiculares associados com periodontite apical aguda e 5% (1 de
19 casos) de amostras de secreções purulentas de abscessos perirradiculares. A
prevalência foi de 18% (9 de 50 casos) dos casos de infecção endodôntica
primária.
ZOLETTI et al., (2006) detectaram E. faecalis por PCR e identificaram por
procedimentos convencionais de cultivo, além de fazerem a comparação dos dois
métodos em relação à sua eficácia. O estudo contou com 50 casos e dos 27 casos
em que os canais radiculares estavam associados a lesões perirradiculares E.
faecalis foi detectado em 22 casos (81,5%) por PCR e 5 casos (18,5%) por
métodos de cultivo. Na comparação entre os dois métodos em relação a 23 dentes
(também incluídos no estudo) com canais radiculares associados a lesões
perirradiculares com evidências de destruição óssea, a espécie E. faecalis foi
detectada em 18 casos (78%) através de PCR e em 3 casos (13%) pelos métodos
de cultivo.
62
Com o objetivo de investigar a presença de E. faecalis em vários sitios da
cavidade oral, SEDGLEY et al., (2006b) utilizaram amostras clínicas coletadas da
língua, sulco gengival, mucosa oral e de canais radiculares através do método da
reação em cadeia da polimerase e por métodos de cultivo, verificando que o
método PCR na detecção da espécie E. faecalis é mais sensível que a utilização
dos métodos de cultivo. Este trabalho contou com um número de 136 pacientes
portadores de infecção endodôntica e E. faecalis foi detectado por PCR na língua
em 55% (22 de 40), no sulco gengival em 22% (7 de 32), na mucosa oral em 29%
(12 de 41) e nos canais radiculares em 9% (2 de 23). Em contrapartida, a espécie
E. faecalis foi identificada na língua por método de cultivo em 5% (2 pacientes de
40) e mucosa oral em 10% (4 de 41 pacientes). Em outro estudo de SEDGLEY et
al.,(2006) envolvendo 88 pacientes, E. faecalis foi identificado em 9 indivíduos
(10,2%) por método de cultivo e detectado em 70 pacientes (79,5%) através de
PCR.
Em outro estudo em que os autores tentaram correlacionar o isolamento
microbiano através de métodos de cultivo e a detecção molecular pelo método
PCR, GOMES et al.,(2006) em trabalho realizado com 50 dentes, conseguiu o
isolamento de E. faecalis por método de cultivo em 2 oportunidades (4%) e a
detecção através de PCR em 41 dentes (82%). A alta detecção pelo método
molecular foi justificada pelo fato de 49 dos 50 dentes serem portadores de
infiltrações coronárias devido a restaurações deficitárias, facilitando a migração
63
dos microrganismos em questão para a câmara pulpar e posteriormente para os
canais radiculares.
Deve ser ressaltado que, comparando com os estudos anteriores
envolvendo dentes com infecção endodôntica primária, a presente investigação foi
a que mais isolou e caracterizou bioquimicamente, cepas de Enterococcus sp.
Talvez a metodologia empregada possa ter corroborado com a aproximação dos
resultados de cultura com as detecções pelos métodos moleculares, onde o
material foi coletado e imediatamente semeado em meios seletivos. Nos trabalhos
supracitados, o material coletado foi introduzido em meios de transporte tais como
VMGA III, que pode permitir o crescimento de microrganismos anaeróbios estritos,
os quais poderiam ser capazes de produzir bacteriocinas capazes de eliminar os
Enterococcus sp. comprometendo a viabilidade bacteriana durante os
procedimentos de transporte.
Outros pesquisadores utilizaram o método denominado Checkerboard pela
técnica da hibridização do DNA-DNA (sonda genômica total) para os estudos
relacionados à infecção endodôntica primária. SASSONE et al., (2007), avaliaram
a composição da microbiota predominante em infecção endodôntica primária de
111 dentes selecionados entre elementos unirradiculares com diagnóstico de polpa
necrosada. Foram detectadas 40 espécies microbianas e a de maior prevalência
nos canais radiculares com polpa necrosada foi a espécie E. faecalis, com 89,3%.
Os autores discutiram que tal resultado foi surpreendente devido à referida espécie
ser associada às infecções persistentes dos canais radiculares, apresentando
64
baixos índices de prevalência em estudos que utilizam métodos de cultivo para o
isolamento de microrganismos nas infecções endodônticas primárias.
SASSONE et al. (2008b), em estudo relacionado à microbiota das
infecções endodônticas primárias, avaliaram 15 dentes com fístula e 15 dentes
sem fístula pelo método de Checkerboard com a hibridização do DNA-DNA.
Observaram que 5 casos que apresentaram fístula e 4 que não apresentaram,
tinham relatos de sintomatologia dolorosa. Neste estudo foram detectadas 40
espécies microbianas de um total de 30 amostras. Algumas espécies estiveram
presentes em mais de 75% das amostras: E. faecalis, F. nucleatum sp.vincentii, P.
gingivalis, V. parvula, C. gracilis e N. mucosa. A espécie E. faecalis foi detectada
em 90% das amostras, índice considerado muito alto devido a esta espécie estar
geralmente associada aos casos de fracasso da terapia endodôntica, com
prevalência relativamente baixa nas infecções endodônticas primárias.
Paralelamente, 4 espécies foram detectadas em casos que não apresentavam
fístula: E. faecalis, S. anginosus, C. sputigena e C. gingivalis. Na presente
investigação, apenas 2 pacientes apresentaram fístula no momento da coleta de
material e 1 deles apresentou crescimento da espécie E. faecalis. Devido ao
pequeno número de dentes apresentando fístulas no momento da coleta de
material, é importante que as investigações acerca da colonização dos canais de
dentes apresentando drenagem externa por E. faecalis sejam ampliadas visando a
correlação da presença da espécie com a formação de abscessos.
65
Adicionalmente, fichas clínicas elaboradas objetivaram a detecção de
sintomatologia dolorosa, presença de odor fétido, secreção purulenta intra-canal e
edema. A sintomatologia dolorosa foi relatada em 20 (57,14%) dos 35 pacientes
que apresentaram cultura positiva para E. faecalis. Tais dados apresentam
concordância com o estudo de SASSONE et al. (2008a) que avaliaram a microbiota
da infecção endodôntica primária associada à sintomatologia dolorosa de 60
dentes, utilizando o método Checkerboard pela técnica de hibridização DNA-DNA.
Os autores detectaram uma média de 24 espécies nas 60 amostras (7 a 38
espécies por amostra) e os dentes que apresentaram sintomatologia dolorosa
albergavam uma média de 26 espécies detectadas (11 a 38 por amostra). Além da
espécie E. faecalis outros microrganismos foram detectados como prevalentes em
dentes apresentando sintomatologia dolorosa: Fusobacterium nucleatum
ssp.vincentii, Veillonella parvula, Treponema socranski e Campylobacter gracilis.
A presença de odor fétido foi verificada em apenas 3 dentes (8,57%), igual
número daqueles que apresentaram secreção purulenta. Quando somados os
indivíduos que apresentaram drenagem de secreção purulenta intra e extra canal,
de um total de sete, de quatro (57%) dentes foram isolados E. faecalis. Em relação
à presença de edema, dos cinco pacientes que foram atendidos com edema, em
quatro foram isolados E. faecalis.
Como abordado anteriormente, a espécie E. faecalis é a mais
predominantemente isolada de pacientes internados em unidades nosocomiais.
Em nosso estudo, o isolamento de E. faecalis seguiu o mesmo perfil de freqüência
66
nos processos infecciosos endodônticos de natureza primária, seguido pelas
outras espécies. Os enterococos vêm assumindo grande importância devido à
emergência de amostras resistentes aos agentes antimicrobianos diversos. Os
glicopeptídeos, principalmente a vancomicina, têm sido apontados como os
principais fármacos alternativos para o tratamento de enterococcias. Na maioria
das vezes, a vancomicina é a droga de escolha quando a terapia sinérgica com
beta-lactâmicos e aminoglicosídeos não logra o efeito desejado (LECLERCQ &
COURVALIN, 1997). Paralelamente, mecanismos de resistência adquirida a
vancomicina em amostras de enterococos são descritos com maior frequência e
tal resistência ocorre por aquisição de DNA extracromossômico (plasmídeos e/ou
transposons). Estudos sugerem que a utilização indiscriminada de antibióticos
incluindo, vancomicina, cefalosporinas, metronidazol e clindamicina são
importantes fatores predisponentes para a colonização e/ou infecção por amostras
resistentes a vancomicina (SUPPOLA et al.,1996; EDLUND et al.,1997). Neste
trabalho, a espécie E. faecalis foi a mais isolada de situações clínicas
acompanhadas de edema, sintomatologia dolorosa e presença de fístula. As
outras espécies isoladas não puderam ser associadas a tais situações clínicas. As
razões que determinam a maior freqüência de isolamento da espécie E. faecalis
na microbiota dos canais radiculares, os fatores de virulência apresentados por
esta espécie e o surgimento de resistência bacteriana aos agentes
antimicrobianos permanece sob investigação.
67
7. CONCLUSÕES
Enterococcus sp foram isolados e identificados a partir de espécimes clínicos
oriundos de canais radiculares de dentes com diagnóstico de necrose pulpar. A
prevalência de Enterococcus sp. foi de 50%. O diferencial aparenta ter sido os
meios seletivos utilizados: caldo enterococcosel e caldo EMB.
Três espécies de Enterococcus sp foram isoladas e identificadas: E. faecalis
(94,28%), E. faecium (2,86%) e E. durans (2,86%). A identificação de E. durans
necessitou de procedimentos adicionais: crescimento em Na Cl a 6,5%,
crescimento em salicina e crescimento em temperatura de 45ºC/48h. A espécie
E. faecalis foi a única que se associou aos dentes com situações clínicas de
edema, dor, drenagem de secreção purulenta intra-canal e fístula.
Os percentuais de isolamento entre os gêneros dos sexos masculino (59,25%) e
feminino (44,18%) indicaram a ausência de tendência entre os sexos.
Entretanto, ocorreu tendência à colonização dos incisivos e caninos por E.
faecalis.
Sintomatologia dolorosa foi verificada em 20 (57,14%) dos 35 pacientes com
cultura positiva e na análise dos aspectos radiográficos, 14 pacientes (40%)
apresentaram lesão definida no momento da coleta.
Dentre os 35 dentes que apresentaram cultura positiva, em 3 (8,57%) foram
observados odor fétido e drenagem de secreção purulenta intra-canal. A
presença de edema foi verificada em 4 dentes (11,42%) e apenas 1 dente
apresentou drenagem extra-canal (fístula) (2,85%).
68
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FICHA DE EXAME DA PESQUISA INTITULADA "ISOLAMENTO DE
:MICRORGANISMOS AERÓBIOS E ANAERÓBIOS FACULTATIVOS DE INFECÇÕES ENDODÔNTICAS PRIMÁRIAS"
Anexo 2
NOME :
ENDEREÇO:
TELEFONE:
1- DENTE:
2- SINTOMATOLOGIA. (PRESENTE / AUSENTE)
3- DENTE VEIO ABERTO? SIM / NÃO.
4· CANAL PURULENTO? SIM / NÃO.
5 - CANAL COM ODOR? SIM / NÃO
6-PRESENÇA DE EDEMA? SIM / NÃO
7- PRESENÇA DE FÍSTULA? SIM / NÃO
8- DATA DA COLETA.
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