Dalam penyimpanan sampel, harus diperhatikan hal–hal berikut yang mungkin dapat mempengaruhi sampel: Suhu tinggi: dapat menguapkan analit yang bersifat volatile, degradasi baik oleh panas tau agen biologis, peningkatan reaktivitas kimia, dll Suhu rendah: menurunkan kelarutan analit dalam pelarut sehingga mengancam homogenitasnya. Perubahan kelembaban: dapat mempengaruhi kandungan air pada analit yang higroskopis, atau ancaman hidrolisis Radiasi UV: dapat menginduksi reaksi–reaksi fotokimia, fotodekomposisi, atau polimerasi Oksidasi yang diinduksi oleh udara dapat menyebabkan kerusakan sampel yang peka terhadap oksidasi seperti vitamin C dan lainnya.
Penyimpanan Sampel
PRE-TREATMENTPresipitasi / denaturasi
protein
Ekstraksi solven
Liofilisasi Hidrolisis konjugat
Homogenisasi
Derivatisasi kimia sebagai pendahuluan
ekstraksi
Pemurnian awal
Protein pengotor endogen :◦Mengikat obat hasil analisis tidak valid
◦Merusak alat (kolom HPLC)
Presipitasi / denaturasi proteinPerusakan ikatan antara protein dg obat / metabolitnya
Presipitasi /denaturasi protein
Presipitasi/denaturasi protein
Sampel Metanol Asetonitril
Sentrifuge
Endapan Supernatan
Pemanasan
Sentrifuge
Endapan Supernatan
Ekstraksi pelarut untuk menghilangkan senyawa hidrokarbon
Atur pH
Obat terionisasi
Ekstraksi dg pelarut organik
Fase organik /hidrofobik :hidrokarbon
Fase hidrofilik :Obat terionisasi
Alasan pemilihan liofilisasi :◦ Air sangat banyak, analit sangat larut air shg tidak dapat
dipisahkan secara ekstraksi pelarut◦ Analit mudah menguap & rusak oleh pemanasan
Contoh :◦ Feses mengandung mikroflora yang merusak analit pada
suhu kamar◦ Feses liofilisasi serbuk larutkan dengan pelarut yg
sesuai ekstraksi
Liofilisasi
Liofilisasi
Sampel dibekukan
Lyophilizer
Uap air divacum
Sublimasi
Padatan kering
Larutkan dg pelarut yg sesuai
Hidrolisis dengan penambahan enzim
Hidrolisis konjugat
tidak dapat dipisahkan
dengan ekstraksi pelarut
sangat hidrofil
Metabolit terkonjugasi
Sampel padat
Feses (homogenisasi : + metanol)
Sampel gelatinus
Sputum (homogenisasi : sonifikasi)Sampel yang mengandung protein tidak larut
Sampel otot (homogenisasi : + HCl 1N)
Homogenisasi
Obat / metabolit ekstraksi rusak Derivat obat / metabolit ekstraksi tidak rusak Hidralazin ekstraksi pelarut organik (pH basa)
rusak Hidralazin + NaNO3 (pada pH asam) tetrazolo
(1,5a) phthalazin ekstraksi pelarut organik (pH basa) tidak rusak
Derivatisasi kimia
Pemisahan senyawa berdasarkan perbedaan kelarutan
Ekstraksi padat – cair Pemisahan senyawa menggunakan kolom
kromatografi. Pemisahan didasarkan perbedaan
kelarutan dalam fase gerak (pelarut) Parameter : konstanta distribusi (KD)
Ekstraksi cair – cair
Ekstraksi
KD = [Vlarutan x Wsolut dalam fase diam] [Wfase diam x Wsolut dalam larutan]
Nilai KD dipengaruhi oleh :◦Polaritas pelarut◦Kecepatan aliran larutan◦Kontak larutan dengan fase diam
Konstanta Distribusi (KD)
Pemisahan didasarkan perbedaan kelarutan senyawa pada pelarut organik & air.
Parameter : koefisien partisi (P) P = Corganik / Cair
Faktor yang mempengaruhi P
◦Pelarut yang digunakan◦pH◦Derajat ionisasi
Ekstraksi cair – cair
Ekstraksi cair–cair digunakan untuk mengisolasi analit yang berada dalam suatu cairan (tidak peduli apakah analit tersebut larut di dalamnya atau tidak.
untuk memudahkan, selanjutnya cairan ini disebut sebagai cairan 1) menggunakan suatu cairan lain sebagai pelarut (selanjutnya cairan ini disebut sebagai cairan 2).
Syarat utama cairan 2 yang digunakan adalah: Tidak saling melarutkan dengan cairan 1 Tidak saling campur dengan cairan 1 Titik didih rendah Kemurnian tinggi Sedapat mungkin tidak toksik
Teknik SPE digunakan untuk pra-perlakuan sampel atau clean-up sampel-sampel yang kotor seperti sampel dengan kandungan matriks yang tinggi seperti garam-garam, protein, polimer, resin dll.
Efisiensi SPE dapat memperoleh recovery yang tinggi (>99 %).
Solid Phase Extraction (SPE)
Fase diam : padatFase gerak : cairPemisahan
senyawaAnalisis kualitatif &
kuantitatif (kurang sensitiv)
KLT
Fase diam : padat / cair Fase gerak : gas inert Analisis kualitatif &
kuantitatif Untuk pemeriksaan zat
yang volatil & tahan panas
GC
Fase diam : padat Fase gerak : cair Analisis kualitatif &
kuantitatif Untuk pemeriksaan zat
yang tidak tahan panas & tidak volatil
HPLC
Pemisahan berdasar perbedaan ukuran partikel Fase diam : gel Gel berupa butiran – butiran berpori (dekstran,
poliakrilamid, polistiren) Fase gerak : cair Contoh : pemisahan makromolekul (lemak, protein,
garam) dari sampel
Gel Permeation Chromatography (GPC)
Top Related