Présentation des outils du laboratoire:
l t h i h t hiles techniques chromatographiques
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC)HAUTE PERFORMANCE (HPLC)
&
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (GC)
Emeline Houël – 04/06/2007
RAPPELS THEORIQUESQ
Principe de la CHROMATOGRAPHIE:Principe de la CHROMATOGRAPHIE:
Technique d’analyse pour séparer les constituants d’un mélange en Technique d analyse pour séparer les constituants d un mélange en phase liquide ou gazeuse
L lé l à é t t i é fl id (liq id ) Les molécules à séparer sont entrainées par un fluide (liquide ou gaz) = phase mobile
Elles interagissent (ou pas) avec un support fixe (solide ou liquide fixé) = phase stationnaire
Séparation <-> différence d’affinité des substances à analyser à l’égard des deux phases.
RAPPELS THEORIQUESQ
Mais aussi:CCM & CCM &
Chromatographie sur colonne
GPC / GPCHT: Chromatographie par perméation de gelHPLC: Chromatographie liquide haute performanceCI: Chromatographie ioniqueCI: Chromatographie ioniqueGC: Chromatographie en phase gazeuse
RAPPELS THEORIQUESQ
Ré lt t btRésultats obtenus:
Sous la forme d’un CHROMATOGRAMME
= tracé représentatif de la concentration de chaque constituant en fonction du tempsen fonction du temps
« Un pic = une molécule »« Un pic = une molécule »
Exemple de chromatogramme GC
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC)PERFORMANCE (HPLC)
P i iPrincipe:Exploiter les interactions entre les solutés et deux phases
Pour séparer les solutés en Pour séparer les solutés en
fonction de leurs affinités
Et les identifier et/ou les doser
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC)PERFORMANCE (HPLC)
A illAppareillage:
Injection:
Injecteur =
h i vanne haute pression
(manuelle ou non)
à plusieurs voiesà plusieurs voies
http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/dosart/Chaine HPLC semi-preparative: de l’ordre de 45 000 €
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC)PERFORMANCE (HPLC)
Colonnes:
Beaucoup moins rétentif que le C18 (généralement nécessite un plus grand % d’eau en mode phase inverse)Colonnes: p )
Analytique: 15 cm x 4.6 mm x 5 µm (450 €)Semi-préparative: 25 cm x 21.2 mm x 5 µm (2500 €)
Analytique: 15 cm x 4 6 mm x 5 µm Analytique: 15 cm x 4.6 mm x 5 µm (510 €)Semi-préparative: 25 cm x 21.2 mm x 5 µm (2800 €)
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC)PERFORMANCE (HPLC)
Détecteurs:Détecteurs:
UV (détecteur à barrette de diodes)UV (détecteur à barrette de diodes)
Indice de réfraction ( RID)
Diffusion de lumière
Vi i é i d i i é él hi i fl RMNViscosimétrie, conductivité, électrochimique, fluorescence, RMN…
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC)PERFORMANCE (HPLC)
E l d’ li tiExemples d’applicationsEtude d’une tisane de Quassia amara
¤ Profil suivi à 245 nm¤ Phase stationnaire C18
Time (min) flow (mL/min) % water % ACN curve1,00 70 30
10,00 1,00 50 50 612,00 1,00 0 100 11
Bertani, S., Houël, E., Stien, D., Chevolot, L., Jullian, V., Garavito, G., Bourdy, G., Deharo, E.,Simalikalactone D is responsible for the antimalarial properties of an amazonian traditionalremedy made with Quassia amara L. (Simaroubaceae), J. Ethnopharmacol., 108 (2006), 155-157
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC)PERFORMANCE (HPLC)
Dosage d’un composé: exemple de la Simalikalactone DDosage d un composé: exemple de la Simalikalactone D1. Courbe de calibration
Concentration (mg/mL) Aire du pic0 0
0,0061 1372581,22 139336303 05 38926414 84000000
Courbe de calibration3,05 389264146,1 69117131
01400000028000000420000005600000070000000
0 1 2 3 4 5 6 7Aire
du
pic
Concentration (mg/ml)
Droite de régression: Y= 11611021,7856 X
Quassine QuassineSkD SkD
Bertani, S., Houël, E., Bourdy, G., Stien, D., Landau, I., Deharo, E., Quassia amara L. (Simaroubaceae) leaf tea: effect ofthe growing stage and dessication status on the antimalarial activity of a traditional preparation, J.Ethnopharmacol., (2007), 111, 40-42
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC)PERFORMANCE (HPLC)
Etude d’extraits de Vouacapoua americana (Wacapou)Etude d extraits de Vouacapoua americana (Wacapou)
80:20 90:10 95:5 98:2
99:1
¤ Profil suivi à 230 nm¤ Phae mobile Hexane / Isopropanol¤ Phase stationnaire PEG (mode NP)
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC)PERFORMANCE (HPLC)
Mise au point d’un protocole HPLC pour l’étude d’extraits Mise au point d un protocole HPLC pour l étude d extraits méthanoliques d’Eperua falcata (Wapa): influence de la colonne
¤ Profil suivi à 245 nmM d i i ( % ACN)
¤ Profil suivi à 245 nm Ph t ti i PEG ( d NP)
Time (min) flow (mL/min) % hexane % iProp curve1,00 99 1
10,00 1,00 90 10 611 00 1 00 99 1 11
¤Mode isocratique (100 % ACN)¤ Phase stationnaire C18
¤ Phase stationnaire PEG (mode NP)
11,00 1,00 99 1 11
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC)PERFORMANCE (HPLC)
Identification de composés: extraits d’Eperua falcata (Wapa)
Thèse Mariana Royer
Identification de composés: extraits d Eperua falcata (Wapa)
Catéchine = composé j it i d t it
Chromatogramme de l’extrait de Wapa à l’acétate d’éthyle
majoritaire des extraits
Chromatogramme de la catéchine pure. d éthyle.
Chromatogramme de l’extrait d’aubier de Wapa au méthanol
Chromatogramme de l’extrait de duramen externe de Wapa au méthanolau méthanol. Wapa au méthanol.
Chromatographie en phase gazeuse (GC)g p p g ( )
P i iPrincipe:
Technique de séparation basée sur les interaction entre les composés gazeux et la phase stationnaire
Chromatographie en phase gazeuse (GC)g p p g ( )
A illAppareillage
Phase mobile Colonne
I j t
= gaz vecteur (exemple Hélium)Élution
= tube de silice qui contient la phase stationnaire
InjecteurMass spectrometer detector
Traitement des données
Colonne et détecteurdes données
GC/MS: de l’ordre de 70 000 €
Chromatographie en phase gazeuse (GC)g p p g ( )
Détection:Détection:Détecteurs universels
Catharomètre (ou détecteur à conductibilité thermique - DTC): tous é ( à )composés (1 à 10 ng)
Détecteur à ionisation de flamme (FID): composés organiques (20 à 100 pg)
L é i 1. Les composés organiques sont ionisés par la flamme
2. Les ions sont collectés d l’él t ddans l’électrode
3. Obtention d’un courant électrique
Détecteurs spécifiques: sensibilité pour certaines familles de composés
Dé à d’él é h l é é ( )Détecteur à capture d’électrons: composés halogénés (0,1 pg)
http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/dosart/ http://www.ac-nancy-metz.fr/http://perso.orange.fr/sand4/CPG.htm
Chromatographie en phase gazeuse (GC)g p p g ( )
Dét tiDétectionDétecteurs donnant des informations structurales
Infra-rouge (IR)
Spectrométrie de masse (MS)
g g
25
30
MCounts AN024.SMS 30:450 30:450
1A
5
10
15
20
10 20 30 40minutes
0
75%
100%
105.1 413708
119.1 367949
161.0 534543
Spectrum 1A19.194 min. Scan: 1011 30:450 Ion: 51 us RIC: 3,471e+6 (BC)BP 161,0 (534543=100%) an024.smsGC/MS : Gas Chromatography/ Mass
SpectrometryGC = séparation des molécules
0%
25%
50%
39.0 103847
41.0 146721
43.1 66568 79.2
42298
81.0 114898
95.1 33195
117.0 60693
120.0 100821 162.0
93300
204.0 193352
205.0 54444
-GC = séparation des molécules volatiles
-MS = analyse des molécules pour leur identification
100 200 300 400m/z
0%pour leur identification
Chromatographie en phase gazeuse (GC)g p p g ( )
A l d l’ d têt (h d ) GC (HS/GC)Analyse de l’espace de tête (headspace) par GC (HS/GC)
H d iHeadspace statique:
Préconcentration:Préconcentration:
Headspace dynamique (DHS) et méthode « purge & trap » (P&T)
SPME (Solid Phase Microextraction)SPME (Solid Phase Microextraction)Pérès, C., Begnaud, F., Eveleigh, L., Berdagué, J.-L., FastCharacterization of Foodstuff by Headspace Mass Spectrometry(HS-MS), Trends in Analytical Chemistry, 22(11), 2003, 858-866.
Chromatographie en phase gazeuse (GC)g p p g ( )
SPME/GC/MS SPME/GC/MS (Solid Phase Micro Extraction)
Extraction des composés volatils contenus dans une matrice solide ou liquidedans une matrice solide ou liquide
Fibre qui piège les volatils q p gcontenus dans l’espace de tête (headspace)
FIBREFIBRE
SPME
= EXTRACTION
GC
= SEPARATION
MS
= IDENTIFICATION
Chromatographie en phase gazeuse (GC)g p p g ( )
I fl d l tité t d t d’ t tiInfluence de la quantité et du temps d’extraction:Analyse de volatils dans des feuilles
Scan Range: 1 - 2796 Time Range: 0.00 - 43.97 min. Date: 05/04/2007 13:26
10.0
MCounts AN115.SMS 30:450 30:450
Scan Range: 1 - 2806 Time Range: 0.00 - 43.98 min. Date: 05/04/2007 17:13
7
MCounts an118.sms 30:450 30:450
Scan Range: 1 - 2841 Time Range: 0.00 - 43.98 min. Date: 05/04/2007 18:13MCounts an119.sms 30:450
30:450
2.5
5.0
7.5
2
3
4
5
6
0.5
1.0
1.5
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 minutes
0.0
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 minutes
0
1
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 minutes
0.0
Seg 1, <no description>, Time: 0.00-44.00, EI-Auto-Full, 30-450 m/z
100 mg - 15 minutes 100 mg - 5 minutes 15/30 mg - 5 minutes
Stage Elodie Courtois, 2007
Chromatographie en phase gazeuse (GC)g p p g ( )
I fl d h i d l fibInfluence du choix de la fibre:Analyse des volatils d’un même échantillon d’écorce
MCounts an003.sms 30:450 30:450
0
1
2
3
4 Fibre PDMS/DVB
PDMS 100µm
PDMS 30µm
PDMS 7 µm
PA PDMS/DVB
CAR/ DVB
CAR/ PDMS
CAR/ PDMS/0
1
2
3
4
MCounts an008.sms 30:450 30:450
Fibre PDMS
100µm 30µm 7 µm DVB DVB PDMS PDMS/DVB
volatils Semi-volatils apolaires
Com-posésapolaires de haut
Semi-volatils polaires
Volatils, amines, composés arom-
Alcools et composés polaires
Gaz et composésde faible poids
Volatilset semi-volatils : arômes et
0
2
3
4
MCounts an013.sms 30:450 30:450
Fibre CAR/PDMS
PM atiquesnitrés
molé-culaire
odeurs
Pillonel, L., Bosset, J.O., Rapid Preconcentration and Enrichment Techniquesfor the Analysis of Food Volatile. A Review, Lebensmittel Wissenschaft, 35,
10 20 30 40minutes
0
1
Échelles identiques
2002, 1-14.
Stage Elodie Courtois, 2007
Chromatographie en phase gazeuse (GC)g p p g ( )
Influence du choix du programme de température Influence du choix du programme de température Comparaison de la séparation des sesquiterpènes d’un échantillon d’écorce
10
15
20
MCounts an017.sms 30:450 30:450
30°C (1 min) 5°C/min 150°C (5 min) 5°C/min
250°C
0
5
10.0
MCounts an022.sms 30:450 30:450
250 C
30°C (1 min) 5°C/min
0.0
2.5
5.0
7.5
3 ( ) 5 /150°C (7 min) 7,5°C/min
250°C
5.0
7.5
MCounts an029.sms 30:450 30:450
30°C 10°C/min 100°C (3 min) 3°C/min
150°C (4 min)
17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5minutes
0.0
2.5
5 47,5°C/min à 250°C
Stage Elodie Courtois, 2007
Chromatographie en phase gazeuse (GC)g p p g ( )
E l d’ tili ti Exemples d’utilisation: Obtention de signatures chimiques d’écorces de bois par SPME/GC/MSSPME/GC/MS
0
5
10
15
20
25
30
MCoun ts an0 24 .sms 3 0:4 50 30 :45 0
Vouacapoua americana (Caesalpiniaceae)
0
1 00
2 00
3 00
4 00
5 00
6 00
7 00
kCoun ts
15
MCoun ts
an0 37 .sms 3 0:4 50 30 :45 0
an0 49 .sms 3 0:4 50 30 :45 0
Eperua falcata (Caesalpiniaceae)
0
5
10
15
5 00
6 00
7 00
kCoun ts an0 61 .sms 3 0:4 50 30 :45 0
Duguetia surinamensis (Annonaceae)
I th ti (M i ti )
0
1 00
2 00
3 00
4 00
3 00
4 00
5 00
6 00
7 00
8 00kCoun ts an0 68 .sms 3 0:4 50
30 :45 0
Iryanthera sagotiana (Myristicaceae)
Gustavia hexapetala (Lecythidaceae)
1 0 20 30 40m in ute s
0
1 00
2 00
Stage Elodie Courtois, 2007
é i d il d l b iPrésentation des outils du laboratoire: les techniques chromatographiques
MERCI DE VOTRE ATTENTION !
Chromatographie en phase gazeuse (GC)g p p g ( )
P i i d l t ét i d Principe de la spectrométrie de masse- Source d’ions: Bombardement des molécules par des électrons qui vont
y z
-Φ0
Source d'ions
molécules par des électrons qui vont les ioniser
x
+Φ0+Φ0
-Φ0
d
Electrode en anneauy
Electrode en calotte
U+V
y z
Détecteur
Sourced'ions
Quadripôle
Electrode en anneaux
U+V
Ions piègés
x
z
Détecteur
Electrode en calotte
- filtres d’ions:
de type quadripôle ou trappe ionique Détecteurde type quadripôle ou trappe ionique ne vont laisser passer qu’un type d’ions
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