Práctica 2
EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO DE DIFERENTES FUENTES
Dra. Yenizey M. Alvarez
26.08.13
IntroducciónLa extracción y purificación de los ácidos nucleicos es el primer
paso en la mayoría de los estudios de Biología Molecular.
Para manipular o amplificar el ADN es necesario eliminar otroscomponentes celulares que pueden interferir con los experimentoscomo: proteínas, ARN y lípidos.
Actualmente existen varios métodos para la extracción y purificación de los ácidos nucleicos, los cuales son seleccionados según:
• El tipo de ácido nucleico
• El organismo de donde se extraerá
• El material de extracción
• Los resultados deseados
• La posterior aplicación
1.Amplificación
2.Clonación
3.Expresión
Es Importante Diferenciar dos Conceptos
• Extracción: sacar los componentes desde un compartimento celular. Involucra: – Lisis de las células que contienen a los AN– Inactivación de nucleasas– Clarificación: separación de los AN de los restos
celulares (debris).
• Purificación: Separación de AN:– De proteínas solubles – De otros AN no deseados– De Lípidos, carbohidratos– De sales y otros compuestos orgánicos
Para muchas aplicaciones que involucran manipulaciónde AN es necesario disponer de éstos en estado puro.
¿Por qué purificar?
El desafío es separar los ácidos nucleicos deseados desde unamezcla compleja, manteniendo la integridad de los AN
•Contaminantes: Proteínas, lípidos y carbohidratos, sales del medio, iones, etc.
•Nucleasas que se liberan al lisar las células degradanlos ácidos nucléicos.•Interferentes que inhiben a las enzimas que se usanen ingeniería genética.
Disgregación o fragmentación del tejido
Lisis celular
Clarificación
Purificación
AnálisisCualitativo
electroforesis
Cuantitativo
espectrofotometría UV
Etapas básicas de un procedimiento general para
Extracción y Purificación de AN
Estas etapas
deben ir
acompañadas de
medidas o
agentes que
inactiven
nucleasas
celulares
Durante todo el
procedimiento se
debe usar
soluciones y
material estéril, ademas
de guantesPrecipitación
Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza de los AN purificados
• Cantidad de material de partida – Número de copias de las moléculas de AN
– Cantidad de tejido
• Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado)
• Contaminantes en el material biológico
• Hay un compromiso entre rendimiento/calidad/pureza
1. Métodos de fragmentación y lisis celular para la extracción de AN
El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para
romper el material de inicio (células o tejido) y la delicadeza requerida
para preservar las moléculas de interés (ADN o ARN).
• Métodos físicos
– Homogenización mecánica,
– Homogenización en solución
– Molienda manual en mortero
– Bolitas de vidrio
– Sonicación
•Métodos químicos
– Detergentes
•Métodos enzimáticos
– Lysozima: rompe enlaces -1.4- entre N-acetil murámico y N-acetil glucosamina de peptidoglucano de la pared celular de bacterias
– Lyticasa: rompe enlaces -1.3 de glucano de levaduras
– Proteasas: rompe enlaces peptídicos de pared y membrana plasmática e interacciones célula-célula.
2. Clarificación. Eliminación de restos celulares (debris)
– Centifugación
– Filtración
–Método mixto: enzimas + centrifugación
3. Purificación
• Desproteinización con fenol (denaturaliza proteínas)
• Precipitación de proteínas con sales (“salting out”)
• Cromatografía– De intercambio iónico– De adsorción a sílica– De filtración
• Extracción de DNA a partir de un gel de agarosa
Extracción Fenólica de proteínas
fenol
ADN total = ADN cromosómico = ADN plasmídico
Extracción de ADN plasmídico
Los plásmidos utilizados en Ingeniería genética sedenominan vehículos o vectores y pueden serutilizados para la clonación y la expresión de genes,entre otras aplicaciones.
Protocolos de extracción:
• La desnaturalización alcalina con SDS (dodecilsulfato de sodio),
• La precipitación sal-SDS • La ebullición rápida.
Solución I(almacenadas a 4°C)
Solución II(preparar antes de ser utilizada)
Solución III(almacenadas a 4°C)
Purificación
Cuantificación de ADN por espectrofotometría
Concentración de ADN puede ser determinada midiendola absorbancia a 260 nm (A260) en un espectrofotómetroutilizando una cubeta de cuarzo.
– Medidas tomadas a una A260 deben estar entre 0.1 y 1.0.
– Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm correspondea 50 µg de ADN/mL
A260nm de DNA de cadena doble = 50 μg / mLA260nm de DNA de cadena sencilla = 33 μg / mLA260nm de RNA de cadena sencilla = 40 μg / mL
Pureza de ADN:
Proporción indica pureza/presencia de contaminantes que pueden absorber luz UV (proteínas, etc.)
ADN puro tiene una proporción de ≈ 1.7-2.0 --en buffer ligeramente alcalino, pH 7.5
Proporción A260/A230
A230 nm= Indica la presencia de sales caotrópicas o compuestos órganicos. Se desean proporciones mayores a 2.
Proporción A260/A280
Lecturas a 320 nm podrían indicar si hay turbidez en la solución “posible contaminación”
A260/A230 ≥ 2
A260/A280 =1.7-2.0
A230 nm= 0
Determinar el % de proteína y ADN en la muestra
NanoDrop
¿Qué es la electroforesis?
La electroforesis en gel es una técnica sencilla empleada de forma rutinaria en laboratorios para separar moléculas biológicas especialmente ADN, ARN y proteínas.
De frente móvil (en solución)
Tipos:
De zona (sobre un soporte)
Agarosa Poliacrilamida
(DNA) (DNA y proteínas)
Geles (a través de una matríz porosa)En papel Sílice
La movilidad del DNA depende de:
Factores extrínsecos a la partícula
[agarosa] o [poliacrilamida]
Voltaje
Buffer
Tiempo
Temperatura
pH
Factores intrínsecos a la partícula
Relación carga/masa
Conformación
Tamaño
Log(
PM
o K
bs)
m
0,5%
0,7%
1%
1,2%
% de agarosa
a b
m b > m a
[ ] Agarosa
A > % de agarosa la movilidad de la partícula disminuye
A > % de agarosa la resolución de partículas de PM similar aumenta
Los fragmentos más pequeños se mueven más rápido y progresan más lejos que los fragmentos más grandes.
% agarosa Rango separación
poliacrilamida 1-5 pb a 500 pb
0,5 700 pb a 25 Kpb
0,8 500 pb a 15 Kpb
1 250 pb a 12 kpb
1,2 150 pb a 6 kpb
1,5 80 pb a 4 kpb
Fragmentos grandes de DNA se corren en geles de agarosa de campo pulsante
Poliacrilamida
Alta resolución
NO para fragmentos grandes
Difícil de armar
Agarosa
Baja resolución (poros grandes)
SI fragmentos grandes
Fácil de armar
Si el % es muy bajo el gel es frágil
=
Voltaje aplicado
Voltaje típico = 10 V / cm de gel
Mejor resolución Voltajes menores (70 V)
(máxima resolución fragm. > 2kb, se corre a 5 V / cm de gel)
Buffer de corrida
ComposiciónTAE
TBE
Más usado. No puede reciclarse mucho.
Mayor capacidad buffer
Loading Buffer
Glicerol o ficol o sacarosa Densidad a la muestra
Colorantes de corrida
(ubicar frente de corrida)
Azul de bromofenol
(corre como DNA 300 pb)
Xylene Cyanol(corre como DNA 4000 pb)
Orange G
(corre como DNA 50 pb)
Equipo de Electroforesis de Agarosa
Bio-Rad
• Cubetas de Electroforesis
• Fuentes de Electricidad
• Geles de agarosa preparados
PowerPac™
Junior PowerPac™
Basic
PowerPac™
HC PowerPac™
Universal PowerPac™
3000
Mini-Sub®
Cell GT Wide Mini-Sub Cell GT
Electroforesis
• Corriente
Fuente de Poder
Búfer
Tinta
Gel de agarosa
OCH2
O
P O
O
OBase
CH2
O
P
O
O
O
Base
OH
Azúcar
Azúcar
O
Conformación del DNA plasmídico
DNA circulares: 3 conformaciones posibles
CCC
Lineal
CA
Circular covalentemente cerrado
(superenrrollado)
Circular abierto
+
-
0,6 a 1% agarosa
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