PLANAR KROMATOGRAFI

KARYA ILMIAH YANG TIDAK DI PUBLIKASIKAN

IYAN SOPYAN, M.Si, Apt

UNIVERSITAS PADJADJARANFAKULTS FARMASI

JATINAGOR 2010

2009 1

I. Pendahuluan Kromatografi merupakan suatu metode umum yang sudah biasa digunakan dalam

laboratorium baik untuk kepentingan analisis kualitatif ataupun kuantitatif walau ada beberapa

asumsi bahwa untuk keperluan kuantitatif metode planar kromatografi kurang representatif

namun dengan perkembangan penemuan dan pengembangan instumentasi, metode

kromatografi planar juga cukup representatif untuk keperluan kuantitatif bahkan tidak hanya

terbatas pada bahan atau material yang sederhana akan tetapi pada materi yang lebih

komplek misalnya suatu cairan biologis dari serum manusia.

Pada dasarnya yang kromatografi planar adalah suatu instrumen yang terdiri dari dua

komponen yang penting yang pertama adalah fase diam (stationary phase) dan fase gerak

(mobile phase) modifikasi pada dua komponen inilah yang mendasari perkembangan

instumen dari planar kromatografi sehingga menghasilkan pemisahan yang diharapkan lebih

baik, selain pada sistem deteksinya dengan perkembangan pada instrumen detektornya yang

sangat variatif, yang disesuaikan dengan keperluan analisis dan akurasi hasil.

Planar kromatografi merupakan suatu hal yang diperoleh dari fenomena pemisahan

suatu pigmen warna dari suatu klorofil yang di lakukan oleh Tsweet dimana Tswet

mengunakan kolom yang didalamnya dimasukan suatu fase diam yang berupa kalsium

karbonat yang disimpan diatasnya suatu ekstrak dari pigment klorofil yang kemudian dielusi

dengan suatu pelarut organik, sehingga dihasilkan pemisahan dari pigmen-pigmen tertentu

yang terelusi tidak bersamaan, sementara kertas original dari Tsweet berada di Rusia yang

dipublikasikan pada tahun 1906, dan di review oleh Ettre.

Prinsip pemisahan pada kromatografi sendiri bisa terjadi secara adsorbsi atau partisi.

Fase gerak pada planar kromatografi pada dasarnya merupakan suatu sistem pelarut atau

cair walaupun kadang bisa menggunakan gas, dan umumnya analit adalah analit yang akan

dianalisis dengan metode planar kromatografi merupakan molekul yang tidak mengaup dan

stabil di udara terbuka, sementara fase diam (solid phase) bisa berupa suatu padatan atau

suatu larutan yang ditempelkan pada suatu penunjang. Modifikasi dari fase solid ini sangat

menentukan sekali terhadap efisiensi pemisahan dan merupakan modifikasi yang paling

banyak dilakukan dalam perkembangan instrumen yang termasuk didalamnya HPTLC (high

perfomance thin layer chromatograpy) sementara kromatografi elektroforesis merupakan

modifikasi yang dilakukan karena sifat dari analit atau sampel yang akan di uji dan disini akan

lebih melibatkan instumen lain karena berhubungan dengan muatan listrik(elektroda), ukuran

molekul atau BM atau sistem polarisasi dari analit.

2009 2

I. Pembagian Instrumentasi pada Planar Kromatografi

a. Kertas Kromatografi (Paper chromatography)

Kromatografi ini adalah suatu metode pemisahan yang didasarkan atas perbedaan

mobolitas dalam suatu fase stasioner yang diberikan. Jika ada substansi campuran,

kromatografi dalam memungkinkan pemisahan dari substansi tersebut. Sebagai contoh, tinta,

yang biasanya disusun atas beberapa pewarna, denga kromatografi planar kita dapat

memisahkannya dan kemudian menganalisis dan mengidentifikasi nya. Kromatografi juga

digunakan untuk memperoleh kadar murni dari substanasi. Ada banyak metode dari

kromatografi. Diantarnya kromatografi kertas, thin layer chkromatography (TLC) atau

kromatografi lapis tipis, gas kromatografi, liquid kromatografi, dan kromatografi kolom.

Biasanya campuran dari senyawa dapat dipisahkan dimasukan ke dalam suatu pelarut. Jenis

larutan pengembang dan fase diam dapat dipilih dalam kisaran yang lebar dari

kemungkinannya. biasanya, pilihan ini membuat disesuaikan dengan molekul yang akan

dipisahkan. Disesuaikan dengan keadaan, yang dapat memanfaatkan perbedaan ukuran

molekul, afinitas kimia terhadap penunjang, derajat ionisasi pH, solubilitas dalam air, dan lain-

lain. Percobaan ini untuk di rumah atau sekolah dimana kita dapat menggunakan pelarut dan

penunjang yang mudah diperoleh. Test pipa sering digunakan untuk memuat uap pelarut,

manjaga kertas dari kekeringan dan tidak yang tidak membahayakan penguji. (Chamberlain J,

1995)

Kromatografi Kertas dan kromatografi lapis tipis. Juga dapat menghitung harga dari R f

dari masing-masing yang disolasi(dengan referensi terhadap garis pencil, R f = jarak pidah dari

solut dibagi jarak tempuh dari larutan pengembang). Dalam uji ini, campuran diperiksa harus

dalam konsentrasi tinggi. Kita dapat menyiapkan campuran sesuai dengan experimen

pendahuluan. Potong kertas filter sedikit sehingga kita dapat mamasukan dalam tube uji tanpa

menyentuh dinding (sedikit lebih lebar dari dasar), dengan pananda garis pencil mendatar 25

mm, (1 inch) dari dasar jalur. Tempatkan beberapa tetes dari campuran pada garis ini dan

biarkan kering. Tempatkan beberapa tetes lain sebelumnya dan biarkan kering. Ulangi

tindakan ini untuk mendapat banyak, spot yang sangat pekat. Dengan sebuah pin, pastikan

jalur dibawah tube. Letakan beberapa senimeter dari larutan pengembang dalam tube.

membutuhkan cukup sehingga larutan pengembang kira-kira setengah antara dasar dari

kertas dan 25 mm (1 inch) penanda pada kertas. Masukan lempeng pada tube. Bagian yang

lebih kecil dari lembar harus masuk kedalam larutan pengembang tanpa penyentuhan bagian

bawah tube. garis pencil dan spot harus dibuat kira-kira 1 cm diatas permukaan larutan

2009 3

pengembang. Untuk aksi kapiler, larutan pengembang akan diabsorbsi oleh serat dari kertas

dan, ketika sampai spot, ini akan mulai membawa substansi yang ada dalam campuran.

Sesuai dengan karakteristik mereka, substansi ini akan berjalan lebih cepat atau lebih lambat

diantara serat dari selulosa dan yang lebih cepat akan mengisi sisi utama dari yang lebih

lambat dan memperlihatkan sebagai pemisahan pita pada kertas. Pindahkan lambaran

sebelum solvent menjangkau ujungnya, dengan sebuah pencil, cepat tandai posisi yang

dicapai oleh larutan pengembang dan biarkan kering. Berikut urutan uji pertama yang dapat

dilakukan: 1. - campuran = tinta hitam, larutan pengembang = air, penunjang = filter kertas.

akan baik jika kertas murni selulosa, lain kali dapat dicoba kertas jenis kertas lain seperti 2 –

campuran dua tinta yang berbeda , jus tomat, jus kacang, jus turnip merah, jus cabe merah,

extrak daun , dll. 3 - gunakan pertama alkohol dan kemudia aseton sebagai larutan

pengembang. perhatikan karena larutan pengembang ini akan terbakar, dan aseton juga

toxic, sehingga percobaan ini dilakukan diluar atau dalam kotak. larutan pengembang harus

dapat melarutkan komponen dari campuran. Sebagai contoh, air tidak tersedia untuk

substansi lemak, melainkan gunakan aseton. Orang banyak menggunakan substansi sebagai

suatu larutan pengembang. Kita akan menemukan beberapa daftar dalam daftar dibawah ini.

Seperti yang disebut dalam percobaan sebelumnya, variasi campuran harus disiapkan dalam

air. Kemudian keringkan dan larutkan dalam sedikit pelarut. Campuran dibutuhkan sangat

pekat agar memungkinkan. 4 – gunakan lempeng untuk penunjang kromatografi lapis tipis..5

– buat uji lain menggunakan lempeng untuk TLC harus dibuat sendiri. Uintuk sekup ini

gunakan serbuk alumina, kalsium karbonat, silika gel, magnesium silikat, dll. Untuk

menggabungkan bahan penunjang dari suatu serbuk, gunakan suatu agen pengikat seperti

kanji, plaster, gelatin, gum arabikum, dll. Sebagai penunjang atau gunakan bahan gelas,

aluminum, atau keping plastik. Atau gunakan juga lembar asetat seperti kemudian gunakan.

Gambar lengkap suatu rangkaian kromatografi kertas dapat dilihat dibawah ini :

2009 4

Gambar. 1. kiri tradisional, kanan automatic sampler

b. Kromatografi Lapis Tipis (TLC)

Kromatografi lapis tipis (TLC) sama dengan kromatografi kertas, tidak mahal dan

sederhana serta mudah menjalankannya, dibandingkan dengan kromatografi kertas lebih

cepat, untuk kromatogarafi kertas perlu beberapa jam sedangkan dengan kromatografi TLC

cukup dengan beberapa menit, dan menjadikan metode ini sangat populer dilaboratorium.

Medium pemisahannya merupakan lapisan setebal 0.1-0.3 mm yang merupakan zat

padat absorben yang dilekatkan pada penunjang seperti pelat seng atau kaca, plastik,

alumunium, lempeng berukuran lazim berukuran 20X5 cm zat padat yang digunakan biasanya

berupa alumina, silika gel atau selulosa. Dulu peneliti menyiapkan lempeng sendiri dengan

menyalut kaca dengan suspensi air dari zat padat tersebut. yang biasanya mangandung zat

pengikat seperti plester paris dan kemudian mengeringkannya dalam oven, dan kemudian

setelah kering lempeng-lempeng alumunium, kaca atau plastik tersebut dapat dipotong-

potong sesuai dengan ukuran yang diminati, dan ini biasa digunakan oleh peneliti-peneliti di

laboratorium sekarang ini.

Umumnya campuran zat organik ditotolkan ke salah satu sisi lempeng dalam bentuk

larutan, biasanya beberapa mikroliter yang mengandung beberapa mikrogram dari analit,

dengan menggunakan siring atau pipet kaca kecil, noda analit dikeringkan kemudian di

2009 5

celupkan pada suatu chamber yang mengandung larutan pengembang dengan komposisi

tertentu, kemudian di biarkan beberapa menit sampai larutan pengembang tersebut telah

mencapai batas area pengembangan, setelah itu dikeringkan dan siap untuk dianalisis untuk

keperluan kualitatif dan kuantitatif, terkadang di gunakan pengembangan dua dimensi yaitu

secara vertikal dan kemudian secara horizontal hal ini dimaksudkan untuk pemisahan suatu

spot yang mungkin diduga masih belum murni. rangkaian lengkap dari suatu TLC dapat dilihat

pada gambar dibawah ini :

Gambar. 2 http://www.CAMAG.com

c. HPTLC

High perferpomance thin layer chromatography (HPTLC) adalah suatu metode

kromatografi yang merupakan pegembangan dari TLC, hal yang dikembangkan adalah fase

diam atau stationary phase dari dari instrumen, yang diharapkan menghasilkan daya pisah

yang lebih baik dari TLC baik dilihat dari hasil, efisiensi waktu dan biaya.

HPTLC dari sisi peralatan tidak terlalu jauh berbeda dengan TLC hanya biasanya pada

fase diam ukuran pori dari fase penyerap lebih kecil sehingga diharapkan terjadi pemisahan

yang lebih baik karena terjadi interaksi antara analit dengan absorbent pada permukaan yang

lebih luas, kemudian ukuran dari lempeng lebih kecil karena menggunakan suatu absorbent

dengan pori yang lebih kecil hal ini akan berpengaruh terhadap waktu pengembangan yang

memungkinkan lebih pendek atau singkat.

Dari profil hasil kromatogram yang diperoleh dari HPTLC lebih baik dari TLC karena pada

HPTLC, HETP atau efisiensi dari teori keping lebih baik dari pada TLC hal ini disebabkan

permukaan dari absorbent ukuran porinya lebih kecil dari absorben0 dari TLC sehingga

2009 6

permukaan interaksi analit dengan stationary fase lebih luas. HPTLC mempunyai beberapa

kelebihan di banding dengan TLC dalam hal:

Tebal, keseragaman manghasilkan garis dasar stabil dalam densitometry

Jarak pengembangan dan waktu lebih singkat

Pita difusi rendah manghasilkan keterpaduan pita sampel

Mikrosample (nanograms dan picogram)

dapat dianalisis

Sifat reproduksibilitas dalam hasil kromatografi.

(Day. R.A, et,. al. 1997)

d. Kromatografi Elektroforesis Kertas

Elektroforesis teknik pemisahan lain, yang didasarkan pada perbedaan kemampuan

pergerakan dari suatu ion (molekul yang bermuatan) dalam suatu media yang berada dalam

medan listrik. Ion bergerak dengan lambat atau cepat sesuai dengan muatan, ukuran, bentuk,

dan lain-lain. Sesuai dengan teknik yang digunakan, perlalatan terdiri dari dua kotak besar

yang mengandung suatu elektrolit, penunjang (filter kertas, lapisan selulose asetat, gel

poliacrilamide, atau pipa kapiler), sumber listrik DC dan dua elektrode. Elektroforesis secara

luas digunakan untuk memisahkan substansi seperti asam amino, protein, rantai DNA, dan

lain-lain. Seperti pada kasus kromatografi, orang menggunakan perbedaan penunjang dan

larutan pengembang sesuai dengan substansi yang akan dipisahkan dan tekhnik yang

digunakan (Sherma Joseph, 2004). Percobaan pada elektroforesis kertas, tempatkan dua

baskom kecil beberapa cm (1 inch) secara terpisah. Masukan kedalam baskom suatu

elektrolit dibuat dari sendok, dari tabel garam dan yang lainnya dari baking soda dalam 300

ml(1 1/2 cups) dari air. Letakan lempeng gelas pada dua baskom dan padanya letakan

sebuah alur kertas filter rendamkan dalam elektrolit. lajur ini harus di celupkan dengan

masing-masing ujung dalam larutan elektrolit dalam baskom untuk melengkapi aliran elektrik.

Dengan sebuah pencil, gambar sebuah garis melintang kertas filter dan tempatkan sedikit

teteskan sampel padanya. Tutup kertas dengan lempeng gelas kedua. masukan elektroda

kedalam larutan elektrolit dari tiap baskom dan masukan 45V dalam arus searah (dari 4

sampai 8 Volt per cm). sehingga nantinya akan di dapatkan suatu spot-spot pemisahan pada

kedua ujung kertas elektroforesis masing-masing zat yang dapat dipisahkan berdasarkan

muatan listriknya atau polaritasnya dan ukuran dari BMnya. Gambaran sederhana dari

kromatografi elektroforesis dapat dilihat pada gambar di bawah ini :

2009 7

Gambar. 3. Instrumentasi Kromatografi Elektroforesis Kertas

II. Instrumentasi Utama pada Kromatografi Planar

a. Fase Diam/Stationary Phase/Sorbent

1. Kromatografi Kertas

2009 8

Pada kromatografi kertas dapat digunakan sebagian fase diam adalah kertas, kertas

yang digunakan mulai dari kertas selulosa biasa atau kertas dengan spesifikasi Whatman

dengan berbagai ukuran atau nomor; berikut dapat dilihat gambar kertas yang digunakan

sebagai fase diam :

Gambar. 4 Paper for Chromatography

2. Fase Diam/Sorbent TLC dan HPTLC

Unsur yang dipandang penting pada lempeng: Format, penunjang, lapisan, dan pengikat:

lempeng Precoated TLC dengan penunjang suatu gelas tersedia dalam format yang banyak,

yang berukuran 20 cm × 20 cm bisanya dipandang sebagai standar untuk TLC awal. Pelat

Gelas sangat kuat dan dapat dikembangkan secara vertikal dan horizontal tanpa bergoyang,

kemudian pemastian ketetapan gerakan dari fase gerak pada lempeng. Mereka benar inert

ketika digunakan dengan semua larutan pengembang dan derivating agent dan sebab itu

dapat diaplikasikan secara universal. Pemisahan optimum (migration) jarak pada lempeng

TLC adalah 12–15 cm. Jika hanya sedikit sampel yang akan dipisahkan pada waktu

lempengnya sama, format yang lebih kecil seperti 10 cm × 20 cm atau 5 cm × 20 cm (20 cm

dalam pengembangan secara langsung), yang juga memungkinkan perpindahan jarak

optimum, terjadi. Jika efisiensi pemisahan optimum sesungguhnya kurang penting (sebagai

contoh, jika sample mangandung hanya satu atau sangat banyak komponen), Jarak

pengembangan dapat dikurangi sampai kira-kira 8 cm dan lempeng format 20 cm × 10 cm

(atau lempeng fraksional sekecil 2.5 cm × 10 cm) mungkin kurang.

2009 9

Gambar. 5 Silika gel untuk TLC

lempeng Thin-layer chromatography (TLC) untuk diadsorbsi, partisi, dan teknik ion exchange

enam pilihan media dengan gelas, polyester, dan dasar aluminum. Lapisan adsorbent silica-

based dalam Sigma-Aldrich lempeng TLC dipadukan dengan suatu pengikat polymeric;

lempeng silica gel yang lebih murni dipadukan pada suatu pengikat gypsum (CaSO4/polimer).

Atau dengan mengunakan lempeng silika gel yang biasa di gunakan :

Gambar. 6 lempeng silika gel untuk HPTLC (lebih kecil dari TLC) (WWW.LUMEX.RU)

Spesifikasi dari masing-masing sorbent :

2009 10

Silika gel - untuk pemisahan polarisasi lamah sampai kuat

High purity silika gel -asam washed untuk pemisahan dari aflatoxins

Sellulosa - untuk kromatografi partisi

Sellulosa PEI - untuk pemisahan dari anion lemah (amino acids, peptides)

Aluminum oxida – alumina dasar, untuk pemisahan hormone and antibiotika

Chiral silika - untuk pemisahan dari isomer optis aktif melalui pertukaran ligan

Dibawah ini daftar beberapa spesifikasi sorbent yang dapat digunakan sebagai fase stationary

yang sekarang biasa digunakan :

Tabel. 3

Cat. No. Ordering informationlayer

thickness[µm]

size[cm] quantity

/pack

034.5035 HPTLC lempengs cellulose F 100 10x10 25

034.5036 HPTLC lempengs cellulose F 100 20x10 50

034.5787 HPTLC lempengs cellulose (without F) 100 10x10 25

034.5786 HPTLC lempengs cellulose (without F) 100 20x10 25

034.5631 HPTLC lempengs silica gel 60 (without F) 200 10x10 25

034.5633 HPTLC lempengs silica gel 60 (without F) 200 10x10 100

034.5641 HPTLC lempengs silica gel 60 (without F) 200 20x10 50

034.3748 HPTLC lempengs silica gel 60 (without F),

concentration zone

200 10x10 25

034.3749 HPTLC lempengs silica gel 60 (without F), 200 20x10 50

2009 11

concentration zone

034.5628 HPTLC lempengs silica gel 60 F 254 200 10x10 25

034.5629 HPTLC lempengs silica gel 60 F 254 200 10x10 100

034.5564 HPTLC lempengs silica gel 60 F 254 GLP 200 10x10 25

034.5642 HPTLC lempengs silica gel 60 F 254 200 20x10 50

034.1764 HPTLC lempengs silica gel 60 F 254, extra thin layer 100 20x10 25

034.3727 HPTLC lempengs silica gel 60 F 254, concentration

zone

200 10x10 25

034.3728 HPTLC lempengs silica gel 60 F 254, concentration

zone

200 20x10 50

034.5613 HPTLC lempengs silica gel 60 F 254 GLP 200 20x10 25

034.1552 HPTLC lempengs silica gel WR 60 F 254s 200 20x10 25

034.5445 HPTLC lempengs LiChrospher® Si 60 F 254s 180 20x10 25

034.5547 HPTLC aluminium sheets silica gel 60 (without F) 200 20x20 25

034.5548 HPTLC aluminium sheets silica gel 60 F 254 200 20x20 25

034.5543 HPTLC aluminium sheets silica gel 60 F 254s,

RAMAN

200 10x10 25

034.5586 HPTLC aluminium sheets LiChrospher® Si 60 F

254s

100 20x20 25

034.3726 HPTLC lempengs RP-2 F 254s 200 10x10 25

034.3725 HPTLC lempengs RP-8 F 254s 200 10x10 25

034.4296 HPTLC lempengs RP-18 W (without F) 200 20x10 25

034.3124 HPTLC lempengs RP-18 W F 254s200

10x10 25

034.3724 HPTLC lempengs RP-18 F 254s200

10x10 25

034.6464 HPTLC lempengs CN F 254s 200 10x10 25

2009 12

034.2571 HPTLC lempengs CN F 254s 200 20x10 25

034.2572 HPTLC lempengs NH2 (without F) 200 20x10 25

034.3192 HPTLC lempengs NH2 F 254s 200 20x10 25

034.5647 HPTLC lempengs NH2 F 254s 200 10x10 25

034.2668 HPTLC lempengs Diol F 254 200 10x10 25

034.5636 HPTLC lempengs MERCK Diol F 254 200 20x1025

034.5607 UTLC silica gel 60 w/o F 254 10 6x3.6 25

(WWW.LUMEX.RU.com)

Secara umum bentuk dan ukuran dari pelat HPTLC lebih kecil dari pelat TLC ini bisa

sampai menjadi sepertiga dari Lempengf TLC hal ini lebih simple namun memang relatif

sedikit lebih mahal. Cara membaca kode pada fase diam/solid

SILICA GEL 60 G FSILICA GEL 60 G F254254

• Adalah Silica Gel dengan :

• Ukuran pori : 60 Å

• G = CaSO4.½ H2O sebagai binder/gypsum

• F = bahan fluorescen / fosforescen yg ditambahkan

• 254 = dituliskan sesudah F atau UV utk

menandakan panjang gelombang eksitasi bahan

fluorescent atau fosforescen yang

ditambahkan (Snyder, et al, 1997)

b. Chamber / Ruang Pengembang

Pada dasarnya chamber atau tempat untuk pengembangan dari kromatografi planar

tidak terlalu spesifik untuk masing-masing jenis kromatografi, yang membedakan chamber

yang digunakan adalah ukuran dari chamber, dimana ukuran dapat disesuaikan dengan

kebutuhan:

2009 13

Bahan dari chamber pisa dari kaca atau bahkan dari plastik yang kedap air, biasanya

bentuknya bisa bulat seperti toples atau kotak seperti gambar di bawah ini :

Gambar. 7 Glass Chamber

atau bahkan dalam suatu plastik seperti gambar dibawah ini :

Gambar. 8. Plastik chamber

2009 14

Untuk kromatografi elektroforesis dalam chamber di bagi dua bagian yang kedalam

masing-masing chamber dimasukan satu ujung dari kertas dan pada masing-masing chamber

dihubungkankan dengan suatu muatan listrik yang berbeda yaitu muatan positif dan negatif,

sehingga akan terjadi pemisahan, pada kedua chamber tersebut dimasukan suatu suatu

larutan elektrolit agar bisa menghantarkan muatan pada kertas sebagai fase diam dan larutan

elektrolit disini sekaligus bertindak sebagai fase gerak dari proses kromatografi. (Suherman,

M. Mulja. 1995)

IV. Instrumen Pendukung / Tambahan

a. Sprayer

Sprayer atu penyemprot bercak noda dari spot yang dihasilkan tidak terlalu bervariasi dari

metode planar kromatografi mulai dari alat yang sederhana atau alat yang sudah kompleks

dapat digunakan dengan baik pada penampakan noda dari spot yang sudah diperoleh

dengan sebelumnya memasukan suatu pereaksi penderivatisasi agar spot memendarkan

cahaya, berikut gambar dari sprayer mulai dari yang sederhana sampai dengan keluaran

terbaru:

2009 15

Gambar. 8 Sprayer

Berikut beberapa derivating agent yang bisa di gunakan :

(Snyder, et al, 1997)

a. Scaner

Scaner merupakan suatu alat yang dimaksudkan untuk memperjelas suatu spot pada

saat mengamati, bisanya pada alat ini disertai dengan lampu baik itu lampu UV atau yang

lainya yang dapat memendarkan cahaya dari spot-spot analit setelah disemprot dengan

larutan penampak noda (derivating agent), berikut beberapa gambar alat scaner :

2009 16

Gambar.9 UV Scaner 254 nm dan 366 nm

b. Detektor

Detektor yang bisa di gunakan pada analisis kromatografi planar adalah adalah detektor

photon, diamana sifat dari analit dapat dibuat atau di derivatisasi dengan senyawa yang

membuat senyawa tersebut berflourisensi dan dapat di deteksi atau di scanning dengan

detektor yang sesuai.

Detektor yang umum digunakan dalah detektor UV atau flourisensi detektor berikut

gambar dari beberapa detektor yang terkait erat dengan kromatografi planar: beberpa UV

detektor yang bisa digunakan dalam deteksi spot hasil kromatogram dari planar kromatografi.

1. Silicon Photodiodes

2. Germanium Photodiodes

3. InGaAs Photodiodes

4. Extended InGaAs Photodiodes

Prinsip kerjanya secara umum adalah lempeng yang terdapat spot didalamnya dikenai

sinar dan nanti akan berflourisensi kemudian flourisensinya akan ditangkap oleh detektor

kemudian intensitasnya akan terukur dan akan sebanding dengan kadarnya.

2009 17

Gambar. 10 UV- detektor 254 nm dan 366 nm

C. Alat Penderivatisasi

Alat ini dilmaksudkan untuk membuat senyawa yang terdapat pada spot dapat

terdeteksi yaitu dengan cara derivatisasi selain dengan cara disemprotkan dengan sprayer

bisanya alat ini di gunakan untuk fosforscent dan ini mengandung fosforscent anorganik yaitu

spot yang terbentuk di celupkan pada media yang mengandung zat penderivasi.

Gambar. 11 Derivating tool

D. Spray Cabinet

Alat ini untuk sebagai ruang untuk menyemprot spot dengan zat penampak noda/zat

penderivatisasi

Gambar. 12 Spray Kabinet

E. Lempeng heater

2009 18

Alat ini untuk memanaskan lempeng sebelum dipakai atau untuk mengaktifkan dengan

cara menguapkan uap air yang dikandungnya selain dengan menggunakan oven biasa:

Gambar. 13 Plate

F. Lempeng Coater

Alat ini dapat di gunakan jika kita akan membuat sendiri lapisan penyerap yang akan

dilapiskan pada penunjang kaca atau plastik atau alumunium.

Gambar. 14 Coater Plate

G. Pipet sampel/drods/Penetes Sampel

Adalah suatu kapiler dengan ukuran tertentu yang berguna untuk meneteskan sampel

pada lempeng atau fase diam, berikut dapat dilihat alah satunya ;

Gambar. 15 Droper/Penetes Sampel

2009 19

kaca Alumunium/plastik

IV. Aplikasi.

Penggunaan dari kromatografi planar secara umum dapat kelompokan untuk dua

keperluan yang pertama adalah untuk keperluan kualitatif dan kuantitatif. Keperluan secara

kualitatif biasanya menggunakan parameter dari Rf (Range Factor) dimana nilai ini dihasilkan

dari perbandingan antara jarak tempuh relatif dari spot-spot tertentu terhadap jarak tempuh

dari larutan pengembang atau larutan pengembang. Yang merupakan angka relatif dan

dibandingkan dengan Rf standard pada kondisi yang sama (instrument, pengembang dan

deteksi) jika sama maka dapat ditentukan dengan zat tertentu atau di scanning sehingga

menghasilkan suatu kromatogram yang dapat di bandingkan dengan standard. Jika spot yang

dihasilkan masing bertumpuk atau masih lebih dari satu spot atau berekor ini menandakan

masih belum murni, jika ini terjadi maka dapat dilakukan pengembangan dua arah dengan

arah tegak lurus (900) sehingga yang spot yang menumpuk terpisahkan dengan baik. Hal ini

apat dilihat pada gambar dibawah ini :

Gambar. 16

Cara perhitungan dari range factor (Rf) dapat diamati pada gambar dibawah ini :

2009 20

Gambar. 17

Untuk keperluan analisis kuantitatif maka spot tersebut setelah positif dengan scan

maka dapat di analisis oleh spectrofotodensitometry maka akan dihasilkan kromatogram

sama dengan HPLC yang manunjukan puncak dengan luas daerah AUC yang dapat di

integrasikan sehingga dapat dihitung terhadap kurva baku,

Gambar 18 . Kromatogram dari planar Kromatografi (Snyder, et al, 1997)

VI. Kesimpulan

Kromatografi planar merupakan kronmatografi yang sangat praktis dan mudah untuk

dipraktekan, kromatografi ini meliputi : kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis (KLT), atau

2009 21

high performance thin layer kromatografi (HPTLC) dan kromatografi elektroforesis, masing-

masing kromatografi ini mempunyai kelebihan dan kekurangan yang dapat berupa efisiensi

(biaya dan waktu), dan hasil dari kromatogram,

Kromatografi ini juga dibedakan juga berdasarkan fungsi pemisahan terhadap

subastansinya, apakah itu sederhana atau lebih komplek misalkan elektroforesis lebih

difokuskan atau digunakan untuk suatu substansi yang mempunyai polaritas atau muatan

misalnya asam amino dalam serum dan lain-lain.

Untuk keperluan analisis baik kuantitatif atau kualitatatif metode ini dapat digunakan

seiring dengan perkembangan instrumentasi sampai dengan sekarang ini. Secara umum alat

kromatografi planar dapat dikelompokan menjadi bebrrapoa bagian yang penting antara lain:

1. fase diam (stationary phase)

2. ruang pengembang (chamber)

3. penyemprot penampak Noda (sprayer)

4. drops penetes sampel (micro pipet)

5. scaner (panampak spot)

6. detektor (keperluan kuantitatif)

yang masing-masing dapat dikembangkan sehingga kromatografi planar juga dapat

representatif untuk keperluan analisis kuantitatif, selain metode-metode pemisahan lain.

2009 22

Pustaka

1. Chamberlain J, 1995, The Analysis Drugs in Biological Fluids, Second Edition,

CRC press, NewYork, P 105-117..

2. Day. R.A, and Underwood, A.L. 1996. Analisis Kimia Kuantitatif, Edisi kelima,

Erlangga press, Jakarta. P 551-554

3. Sherma Joseph, 2004, Planar Chromatography. Department of Chemistry,

Lafayette College, Easton, Pennsylvania 18042, Analytical Chemistry, Vol. 76,

No. 12, June 15,

4. Snyder, R.L., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC method

development, 2nd edition, p.686-697, John Wiley & Son, Inc., New York

5. Suherman, M. Mulja. 1995. Analisis Instrument. Airlangga University Press,

Surabaya, P 223-234.

6. http://www.CAMAG.com

7. http://www. titan.iwu.edu/

8. WWW.LUMEX.RU

2009 23