Méthodes de détection des mutations connues et inconnues
COUTTON Charles
EC Génétique
09/02/2011
Clinique évocatrice d’une pathologie ou
syndrome
Clinique non évocatrice d’une pathologie ou
syndrome
Génique Chromosomique
Gène identifié Gène inconnu
Criblage du gène
DDGE, HPLCHRM
Inno-LIPASéquençage
Mutation ciblée
(ex: familiale)
Screening large
1. Caryotype2. MLPA
3. CGH-array4. Séquençage HD ?Etude de liaison
PCR-RFLPPCR temps réelPCR ARMS
Caryotypeet/ou FISHet/ou MLPA
si (-)
si (-)
si (-)
si (-)
Stratégie Générale
Clinique évocatrice d’une pathologie ou
syndrome
Génique Chromosomique
Gène identifié Gène inconnu
Criblage du gène
Mutation ciblée
(ex: familiale)
Suspicion mucoviscidose
Mutation ∆F508 dans la mucoviscidose
⇒ délétion de 3 paires de bases dans l’exon 10 du gène CFTR
responsable de la mucoviscidose.⇒70% des mutations
PCR-RFLPPCR temps réelPCR ARMS
MUCOVISCIDOSE� Pathologie généralisée des glandes exocrines
séreuses et à sécrétion muqueuse : accumulation
d'épaisses sécrétions dans les voies
respiratoires et digestives
� Fréquence : 1/2500
� Grande variabilité d'expression
� Traitements symptomatiques
� Gène : 7q31.2 - 27 exons - 230 Kb
� Protéine: CFTR (Cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator)
� Régule les flux d'eau et de sel au travers des
membranes cellulaires (canal chlore)
� Test de la sueur : dosage du Cl- de la sueur
(augmentation)
� Mutations : > 1000
� ∆F508 (F508del) = 70 % des mutations
� 7 - 8 mutations fréquentes (G542X, N1303K,…)
� Possibilité d’hétérozygote composite
� Variations régionales ou ethniques
� Certaines mutations : absence bilatérale des canaux déférents
Classe V : défaut d’abondance (épissage incorrect)
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Dénaturation
Hybridation
Elongation
Cycle répété n fois
Nb de copies final = 2n
PCR-RFLP (Restriction fragment Length Polymorphism)
PCR ARMSPCR spécifiques d’allèles
1 amorce commune (COM)
• • • • •+
• • • • • •A • • • • • • • • • • • • • • • Allèle 1 (n)• • • • • • C • • • • • • • • • • • • • • • Allèle 2 (m)
5’ • • • • • A 3’ Amorce spécifique de l’allèle 1 (ASPn)
5’ • • • • • C 3’ Amorce spécifique de l’allèle 2 (ASPm)
Hom (n) HétHom (m)
Construction d’amorces
PCR avec ASPn ou ASPm + COM
Possibilités :
- Réactions multiplex
- Introduction d’un site de restriction
3’
Evaluation de la fluorescence en temps réel
PCR temps réelHybridation d’une sonde fluorescente spécifique
Possibilité de quantifier
Détection de mutation ponctuelle
Sondes spécifiques d’allèles
Clinique évocatrice d’une pathologie ou
syndrome
Génique Chromosomique
Gène identifié Gène inconnu
Criblage du gène
Mutation ciblée
(ex: familiale)
Suspicion mucoviscidose
DDGE, HPLCHRM
Inno-LIPASéquençage
PCR-RFLPPCR temps réelPCR ARMS
Peu coûteux
Très sensible >95%
Applications :
Détection mutations inconnues
Etude de polymorphisme
Inconvénients :
Demande une analyse informatique de chaque région
Taille limite : 500 pb
Allèlemuté Formation des
hétéroduplex :dénaturation (95°C) puis
renaturation lenteCA G TGC ATAT GC+
Hétéroduplex HomoduplexAllèlenormal
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)= Electrophorèse en gradient dénaturant
Homoz
ygote
sain
Hétéro
zygo
te
Homoz
ygote
muté
Sen
s de
mig
ratio
n
Gra
dien
t dén
atur
ant (
urée
)
HRMHigh resolution melting
HRMHigh resolution melting
HRMHigh resolution melting
Clinique évocatrice d’une pathologie ou
syndrome
Génique Chromosomique
Gène identifié Gène inconnu
Criblage du gène
Mutation ciblée
(ex: familiale)
Suspicion mucoviscidose
DDGE, HPLCHRM
Inno-LIPASéquençage
PCR-RFLPPCR temps réelPCR ARMS
InnoLipa
InnoLipa
Sondes mutées
Sondes sauvages
Homozygote Hétérozygote
Clinique évocatrice d’une pathologie ou
syndrome
Génique Chromosomique
Gène identifié Gène inconnu
Criblage du gène
Mutation ciblée
(ex: familiale)
Suspicion mucoviscidose
DDGE, HPLCHRM
Inno-LIPASéquençage
PCR-RFLPPCR temps réelPCR ARMS
Séquençage classique
Séquençage classique
Clinique évocatrice d’une pathologie ou
syndrome
Génique Chromosomique
Caryotypeet/ou FISHet/ou MLPA
Syndrome de DiGeorge
Clinique non évocatrice d’une pathologie ou
syndrome
Screening large
Recherche X fragile et
1. Caryotype2. MLPA
3. CGH-array4. Séquençage HD ?
Maladie non spécifique
RM isolé
• Première cause de retard mental héritédans l’espèce humaine
• 1/4000 hommes et 1/6000 filles
• 2-3% des RM / 15-20% des RMLX
• Fragilité du chromosome X
• Découverte du mécanisme moléculaire: pathologies liées à une expansioninstable de triplets nucléotidiques
Maladies à tripletsExemple de l’X fragile
� Chez les garçons:� Retard mental
� constant: 90% QI entre 20 et 60� Troubles du comportement� Troubles du langage
� Syndrome convulsif� Dysmorphie faciale
� Visage allongé� Oreilles grandes et décollées
� Macro-orchidie
� Chez les filles:� 50% des filles malades� Tableau clinique + modéré� RM léger
X fragile
• Site fragile Xq27.3 (FRAXA)
Site fragile Xq28 surle chromosome X au
ME
Mise en évidence sur milieu pauvre en folatesRetrouvé chez l’homme et la majorité des femmes atteintesLe plus souvent absent chez les femmes conductrices et les hommes normaux transmetteurs
Résultats inconstants
Risque erreur en DPN
• 1991 clonage moléculaire du locus X fragile
� Mutation dynamique : Expansion instable d’une répétition CGG dans le 1er exon du gène FMR1
� Code une protéine FMRP 70 kDa
� Expression ubiquitaire chez le fœtus, puis prédominance dans le cerveau et les testicules
� Dans le cytoplasme et les dendrites des neurones +++
� Rôle : régulation du transport intracellulaire de ARNmimpliqués dans la fonction synaptique et synthèseprotéique
FMR1
FMR1
� Homme transmetteurnormaux
� Femmes conductrices� Enfants des hommes normaux transmetteur (NTM) jamaisaffectés.
� Petits enfants affectés (par la fille)
⇒ Paradoxe de Sherman⇒ Phénomène d’anticipation = aggravation au fil des générations
Transmission
� 5 à 50 répétitions : NORMALStable lors de la transmission à la génération suivantePhénotype normal
� 50 à 200 répétitions : PREMUTATIONHomme transmetteur sainInstable à la méiose féminine: amplification du nombre de
triplets lors de la transmission à la génération suivante. Risque de passage à la mutation complète.
Phénotype «normal»
� > 200 répétitions : MUTATION COMPLETEHyperméthylation régions flanquantes 5’ FMR1Pas de messager, pas de protéineInstable somatique et méiose fémininePhénotype anormal chez 100% des garçons et 50% des filles
Transmission
� Une femme prémutée transmet avec un risque de 50% l’X prémuté qui: � soit restera à l’état de prémutation (mais taille + grande)� soit passera à la mutation complète� avec un risque variable qui dépend de la taille de la
prémutation
� Le passage de la prémutation à la mutation complète survient obligatoirement lors de la transmission par une femme
� Un homme prémuté transmet � Toujours la prémutation� Aucun risque pour ses fils� Transmet la prémutation à toutes ses filles
Diagnostic
� PCR du triplet répété CGGn possible jusqu’à 55 répétitions(« seuil normal »).
- Si > 55: PCR moins efficace (pb polymérase). � Méthode de Southern pour détecter les patients porteurs
d’une prémutation ou d’une mutation complète X fragile et déterminer le statut de méthylation
� Patient atteint de retard mental: 1. PCR:
� permet de reconnaitre tous les garçons non atteints� 65% des filles non atteintes
2. Southern blot: � une pré mutation ou une mutation chez un patient � ou un profil de restriction normal chez les 35% de filles
non atteintes mais non distinguables des filles atteintes par la PCR.
Diagnostic
30 CGG
34 CGG
37 CGG
Femme N
Femme N ?
Garçon N
34 CGG
Garçon préou muté?
Diagnostic
• Southern blot
Dans 10 à 15% des cas coexistent la mutation mutée et prémutée
Diagnostic
Diagnostic
Clinique non évocatrice d’une pathologie ou
syndrome
Screening large
Recherche X fragile et
1. Caryotype2. MLPA
3. CGH-array4. Séquençage HD ?
Maladie non spécifique
RM isolé
Séquençage haut-débit
� Séquenceurs nouvelles génération
� Séquençage d’un grand nombre de fragments d’ADN au hasard (« shotgun »)
� Séquences générées alignées sur séquence de référence
� Application en cancéro / constitutionnel
� Efficacité validée
� Niveau de résolution meilleure que puces
Séquençage haut-débit
Séquençage haut-débit
Séquençage haut-débit
� Limites� Coût exorbitant
� Qualité de l’ADN dépendant
� Position (intron) et nature (duplication) des mutations
� Gestion des données(bioinformatique)
� Ethique
Clinique évocatrice d’une pathologie ou
syndrome
Clinique non évocatrice d’une pathologie ou
syndrome
Génique Chromosomique
Gène identifié Gène inconnu
Screening large
1. Caryotype2. MLPA
3. CGH-array4. Séquençage HD ?
Etude de liaisonEtude d’homozygotie
si (-)
Maladie cliniquement caractérisée ou non et génétiquement inconnue
si (-)
Etude de liaison
� Analyse indirecte
� Etude de liaisons des marqueurs intra ou juxta-géniques = microsatellites
� Permet de poser un diagnostic sans connaître le gène et/ou la mutation responsable
Il s'agit de séquences d'ADN constituées de motifs répétés avec 2, 3 ou 4 nucléotides :
nnnnnnCACACACACACACACACACACACACAnnnnnnnn
nnnnnnGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTnnnnnnnn
nnnnnnATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGnnnnn
nb variable de répétitions
Les microsatellites
nb variable de répétitions
nb variable de répétitions
Etude de liaison
Allèle paternelle
…nnnnnnnnCACACACACACACACACAnnnnnnnnnnnn……nnnnnnnnCACACACACACACACACAnnnnnnnnnnnn…
Allèle maternelle
…nnnnnnnnnCACACACACACACACACACACACACAnnnnnnn……nnnnnnnnnCACACACACACACACACACACACACAnnnnnnn…
9 répétitions (CA)
13 répétitions (CA)
Les microsatellites
Etude de liaison
Etude de liaison
Clinique évocatrice d’une pathologie ou
syndrome
Clinique non évocatrice d’une pathologie ou
syndrome
Génique Chromosomique
Gène identifié Gène inconnu
Screening large
1. Caryotype2. MLPA
3. CGH-array4. Séquençage HD ?
Etude de liaisonEtude d’homozygotie
si (-)
Maladie cliniquement caractérisée ou non et génétiquement inconnue
si (-)
Identification des gènes
� Rôle de CGH-array et du séquençage HD +++ (↑ 80% en 4 ans)
Augmentation des gènes identifiées ces dernières années liées àl’émergence des nouvelles techniques
Stratégies d’identification des gènes candidats
� L’approche par séquençage haut débit de tous les gènes du génome
� Approche gènes candidats� Lieu de l’expression des protéines� Gènes paralogues de gènes connus (ex NLGN4 et NLGN3)
� Gènes codant pour des protéines qui interagissent avec des protéines impliquées dans maladies
� L’identification d’une anomalie chromosomique comme une translocation réciproque ou un remaniement cryptique� CGH-array / FISH / MLPA / caryotype…
� Approche globale (carte d’homozygotie)
Microduplication en Xp11.22
Microduplication en Xp11.22
Les polymorphismes sont répartis sur la totalité du génome. L’étude de la ségrégation de polymorphismes sur de larges fragments chromosomiques permet de définir des haplotypes (code barre des chromosome).
Chr 1Microsatelites
(nb de répétitions CA)
a
baa
aa
a
aba
ba
Chr 1SNPs : Single nucleotide
polymorphismS
Approches globales
28
41073
23
4677
a
baa
a
a
aba
a
Famille consanguine
48543
23477
16453
43723
M
23477
43723
M
23477
16453
M
7M M
23477
23477
23477
23477
16453
MMM M
Effet fondateur
MGénération 1X X X
Génération 2
Génération 3
Génération n
En pratique : Recombinaisons
Prophase méiose I: Recombinaison
des chromosomes homologues
Famille consanguine
48543
23477
M
M M
Grand parents
Parents
Fils (cas index)
Méiose 1
Méiose 3
Méiose 2
Région d’homozygotie
M
Effet fondateur
48543
23477
MM
Méiose 1Génération 2
Génération n
Méiose 2
Méiose 3
Méiose 4
Méiose n
On étudie les polymorphismes (code barre) sur tout le génome afin de retrouver une région d’homozygotie
Affymetrix : 250000 SNPs
Single NucleotidePolymorphisms(SNPs)
a
Chr 1
gatggactg
pat mat
ABI- LMS 400
Microsatellites(répétitions CA)
105
158
Chr 1
891710
12 11
pat mat
Cartographie d’homozygotie
P1P2P3P4P5P6P7P8P9
Région minimale ?
Cartographie d’homozygotie
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