Metodologie di Metodologie di biochimica clinica in biochimica clinica in
vivo vivo
Emiliano [email protected]
Laboratorio di Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica Laboratorio di Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica ––Facoltà di Medicina, Università di PisaFacoltà di Medicina, Università di Pisa
Esplorazione funzionale in vivo del cervelloEsplorazione funzionale in vivo del cervello
Perché studio in vivo?1. Differenze in vitro e in vivo2. Limite anatomico: “santuario anatomico”
Esplorazione funzionale in vivo del cervelloEsplorazione funzionale in vivo del cervello
Perché studio in vivo?3. Segregazione e integrazione funzionale
Esplorazione funzionale in vivo del cervelloEsplorazione funzionale in vivo del cervello
Perché studio in vivo?
4. Limite dei modelli animali
Esplorazione funzionale in vivo del cervelloEsplorazione funzionale in vivo del cervello
La prima esperienza di Angelo Mosso: l’aumento dell’attività cerebrale induce un aumento di flusso ematico
Angelo Mosso (1881):Concerning the Circulation of the Blood in the HumanBrainVerlag von Viet & Company: Leipzig, pages 66-67
Nonostante i numerosi sforzi per risolvere il quesito del “coupling”, il meccanismo fisiologico è ancora sconosciuto: dopo l’ipotesi omeostatica di Roy e Sherrington, sono stati
suggeriti differenti modelli di regolazione dinamica cerebrovascolare e vari agenti mediatori di tipo biometabolico.
Recentemente, è stata proposta un’ipotesi di regolazione multilivello, che interessa anche le cellule neurogliali
Fisiologia della Correlazione Flusso Fisiologia della Correlazione Flusso EmaticoEmatico--MetabolismoMetabolismo CerebraleCerebrale
Il metabolismo cerebrale del glucosioIl metabolismo cerebrale del glucosio• Tessuto nervoso comprende neuroni e cellule gliali
• In condizioni fisiologiche l’ossidazione del glucosio a CO2 ed H2O è pressoché l’unica via metabolica per la produzione di ATP (corpi chetonici nel digiuno prolungato)
• L'apporto di glucosio ed ossigeno dipende strettamente dal flusso ematico cerebrale
cervello: ~2% del peso corporeo ma riceve il 15% della gittata cardiaca basale e consuma il 20% dell'O2 (50% nel bambino)
estrae circa il 10% del glucosio nel sangue
riserve cerebrali di glicogeno molto limitate
il flusso ematico cerebrale aumenta nelle regioni cerebrali dove vi è un’aumentata richiesta metabolica
− i prodotti del metabolismo energetico (CO2, ADP, AMP) contribuiscono a regolare l’aumento di flusso ematico
− l'interruzione completa del flusso ematico cerebrale comporta perdita di coscienza in pochi secondi e danni irreversibili in pochi minuti
• L’ipoglicemia si associa a confusione mentale, obnubilamento del sensorio →coma
• Questi effetti possono essere corretti dalla somministrazione di glucosio o di mannosio
ma non dai substrati intermedi della glicolisi, che non possono passare attraverso la BEE
condizionifisiologiche
ipoglicemia grave ipoglicemiacon coma
Glicemia (mg/dL)
Consumo di Glucosio(mg/100g/min)
Consumo di O2(ml/100g/min)
Flusso Ematico Cerebrale(ml/100g/min)
8
0,8
1,9
63
19
2,3
2,6
60
70-100
5,5
3,5
58
Mannosio Mannosio-6-P Fruttosio-6-PEsochinasi Fosfato
isomerasi
ATP ADP
Il metabolismo energetico cerebrale:Il metabolismo energetico cerebrale:Effetti della deprivazione di glucosioEffetti della deprivazione di glucosio
Glicogeno
Glucosio-1-P
Glucosio Glucosio-6-PGlicolisi
Piruvato
sintesi componenti cellulari (glicoproteine,
glicolipidi, ecc.)
Lattato
10%sintesi e metabolismo di neurotrasmettitori
(ossidasi, ossigenasi ecc.)Acetil-CoA
Ciclo di Krebs
CO2 + H2O36-38 ATP
~ 10-15%
~ 85-90%
condizioni anaerobiche
90%ossidazionedel glucosio
Fosforilazione ossidativa
Ribulosio-5-Pcondizioniaerobiche
shunt5-8%
UDP-glucosio
O2
Fosforilasi a
Glucosio-6-fosfatasi
Esochinasi
2 ATP
La glicolisi libera solo il 5,2% dell’energia totale
disponibile nella molecola di glucosio e che può essere ricavata dall’ossidazione
completa a CO2 e H2O
DESTINO METABOLICO DI GLUCOSIO E ODESTINO METABOLICO DI GLUCOSIO E O22
• 65% processi collegati ai flussi ionici:• pompa Na+/K+: mantenimento del potenziale di membrana
negativo; processi legati al reuptake di neurotrasmettitori• 15% processi biochimici di sintesi:
• sintesi proteica (6%)• sintesi lipidica (2%)• sintesi dei nucleotidi (1%)• glicogenosintesi (2%)• turn-over neurotrasmettitoriale
• 20% altri processi:• trasporto assoplasmatico veloce (6%)• trasporto di calcio• reazioni di fosforilazione• riciclo vescicole sinaptiche
La maggior parte della produzione di ATP nel cervello a riposo èdestinata a mantenere la funzione della pompa Na+/K+
Consumo di ATP nel Cervello in CondizioniConsumo di ATP nel Cervello in Condizionidi Riposo di Riposo SomatosensorialeSomatosensoriale
• Stimolando una cellula nervosa si provoca la sua depolarizzazione e lo sviluppo di un potenziale d’azione, caratterizzato a livello intracellulareda un aumento del sodio e da una diminuzione del potassio
• L’aumento dell’attività di trasmissione sinaptica aumenta l’attività della pompa Na+/K+, necessaria a ripristinare il potenziale negativo della membrana cellulare
• Questo comporta un incremento della richiesta energetica, che per essere soddisfatta attraverso il metabolismo ossidativo del glucosio, produce un aumento della produzione di ATP dal 60% al 80%
Eventi legati all’Attivazione Neuronale CerebraleEventi legati all’Attivazione Neuronale Cerebrale
Esperimento di Mata e coll., 1980J Neurochem, 34: 213-215
preparati in vivo di cellule nervose
del 30%
=consumo di glucosio
stimolazione elettrica a 10 Hz
UABAINAblocco della pompa
Na+/K+
Il maggior quantitativo di ATP prodotto durante Il maggior quantitativo di ATP prodotto durante l'attivazione neuronale è utilizzato esclusivamente per l'attivazione neuronale è utilizzato esclusivamente per
il funzionamento della pompa il funzionamento della pompa NaNa++/K/K++
Eventi legati all’Attivazione Neuronale CerebraleEventi legati all’Attivazione Neuronale Cerebrale
Il consumo di ATP avviene a livello delle Il consumo di ATP avviene a livello delle sinapsi e non dei corpi cellularisinapsi e non dei corpi cellulari
Eventi legati all’Attivazione Neuronale CerebraleEventi legati all’Attivazione Neuronale Cerebrale
Esperimento di Kadekaro e coll., 1987 Proc Natl Acad Sci USA, 84: 5492-5495
• L’aumento dell’attività neuronale in una regione cerebrale induce un aumento del flusso ematico locale (coupling)
• Il flusso ematico fornisce glucosio e ossigeno ai neuroni
• In condizioni fisiologiche nel neurone l’unica via metabolica è l’ossidazione del glucosio con produzione di ATP
• L’ATP serve a ripristinare il potenziale di membrana
• Il glucosio rappresenta un indice indiretto dell’attività neuronale sinaptica
• Il consumo di ATP avviene a livello delle sinapsi e non dei corpi cellulari
Eventi legati all’Attivazione Neuronale CerebraleEventi legati all’Attivazione Neuronale Cerebrale
Esplorazione funzionale in vivo dei correlati Esplorazione funzionale in vivo dei correlati neurometabolici dell’attività cerebraleneurometabolici dell’attività cerebrale
attività neuronale sinaptica
richiesta di ATP
richiesta di
ossigeno e
glucosio
flusso ematico cerebrale
attività della
pompa Na+/K+
Rip
oso
Att
ivaz
ion
e
= HbO2
= Hb
-70
0
+50
mV
2 msec31
metabolismo ossidativo del
glucosio e produzione di
ATPHH221515OO--PETPETfMRIfMRI
FDGFDG--PETPETsMRIsMRI
EEGEEGMEGMEG
Lo Studio in vivo del Metabolismo Cerebrale del Glucosio mediante Tomografia ad Emissione di Positroni
• Presupposti fisici:• Radionuclidi a breve emivita (es. 18Fluoro, 15Ossigeno) che
decadono ed emettono positroni
• Positroni ed elettroni (stessa massa, carica opposta) annichilano e danno origine a due raggi γ in direzione diametralmente opposta, rilevabili da appositi detettori (Tomografo PET)
Lo Studio in vivo del Metabolismo Cerebrale del Glucosio mediante Tomografia ad Emissione di Positroni
• 18FDG per misurare il metabolismo glucidico
• H215O per misurare il
flusso ematico
misurano l'attività sinaptica neuronale di un determinato
distretto cerebrale
Caratteristiche distintive
• emivita (min)• tempo di osservazione (min)• durata singolo studio (min)• numero di studi possibili
nella stessa sessione PET
18FDG H215O
11045 651-2
21 - 41 - 4> 10
• Sostanze di interesse biologico, quali substrati metabolici, possono essere marcati usando questi radionuclidi positrone-emittenti
• Per lo studio in vivo del metabolismo cerebrale possiamo utilizzare:
HO
HO-CH2
OH
H
H
OH
HO
H
OH
H
( 18F )
[18F]deossi-glicogeno
[18F]glicolipidi[18F]glico-proteine
[18F]UDPDG
[18F]deossiglucosio-1-P
[18F]deossiglucosio-6-P
glucosio-6-P
fruttosio-6-P
CO2 + H2O
Tessuto cerebralePlasma
[18F]deossiglucosio
Bar
riera
em
ato-
ence
falic
a[18F]deossi-
glucosio
glucosio glucosio
Il modello del Il modello del 1818FluoroFluoro--22--deossideossi--DD--glucosio nello glucosio nello Studio in vivo del Metabolismo Glucidico Cerebrale Studio in vivo del Metabolismo Glucidico Cerebrale
precursori prodotti metabolici
K*2
K*1
K1
K2
K*3
K3esochinasi fosfoglucosio
isomerasi
esochinasi
glucosio 2-deossi-D-glucosio
HO
HO-CH2
OH
H
H
H
HO
H
OH
H
G-6-Pasi
Lo Studio in vivo del Metabolismo Cerebrale del Glucosio mediante Tomografia ad Emissione di Positroni
Lo Studio in vivo del Metabolismo Cerebrale del Glucosio mediante Tomografia ad Emissione di Positroni
Studio del Metabolismo Cerebrale del Glucosio in vivo Studio del Metabolismo Cerebrale del Glucosio in vivo nell’Uomo in Condizioni Fisiologiche nell’Uomo in Condizioni Fisiologiche
• Condizione di riposo
• Effetti della stimolazione sensoriale visiva
occhi chiusi 1 occhio 2 occhi scenacomplessa
0
10
20
30
40
50
60Corteccia Visiva
aum
ento
% d
el m
etab
olis
mo
del g
luco
sio
Studio del Metabolismo Cerebrale in vivo nell’Uomo in Studio del Metabolismo Cerebrale in vivo nell’Uomo in Condizioni FisiologicheCondizioni Fisiologiche
18FDG -glucosio
18F-fluorodopa
18F-fluoroetilspiperone
Anziano
Sano
Malato
AD
Studio in vivo delle funzioni cerebrali: elaborazione Studio in vivo delle funzioni cerebrali: elaborazione dei dati acquisiti con metodologia PETdei dati acquisiti con metodologia PET
ATTIVAZIONE RIPOSO CONTROLLO
IMMAGINE MEDIADELLE DIFFERENZE
NORMALIZZAZIONE ANATOMICA (Talairach e Tournoux Atlas)IMMAGINI INDIVIDUALI DI DIFFERENZA
PET - applicazioni cliniche
Oncologiche
Cardiache
Cerebrali
Malattie Infettive
Farmacologiche
Metaboliche
Studio in vivo nell’Uomo del Metabolismo Cerebrale del Glucosio nelle Formazioni Neoplastiche Cerebrali → Diagnostica Molecolare in Vivo
• La misurazione del metabolismo cerebrale del glucosio consente di:• determinare la natura (benigna/maligna) della neoformazione• determinarne il grado di anaplasia (↑ anaplasia → ↑ consumo glucosio)• valutare nel tempo gli effetti della terapia e la presenza di eventuali
recidive
• Cellule neoplastiche:↑ replicazione cellulare → ↑ attività metabolica di sintesi
↑ attività glicolitica
Esplorazione funzionale in vivo dei correlati Esplorazione funzionale in vivo dei correlati neurometabolici dell’attività cerebraleneurometabolici dell’attività cerebrale
attività neuronale sinaptica
richiesta di ATP
richiesta di
ossigeno e
glucosio
flusso ematico cerebrale
attività della
pompa Na+/K+
Rip
oso
Att
ivaz
ion
e
= HbO2
= Hb
-70
0
+50
mV
2 msec31
metabolismo ossidativo del
glucosio e produzione di
ATPHH221515OO--PETPETfMRIfMRI
FDGFDG--PETPETsMRIsMRI
EEGEEGMEGMEG
Esplorazione funzionale in vivo dei correlati Esplorazione funzionale in vivo dei correlati neurometabolici neurometabolici –– risonanza magnetica funzionalerisonanza magnetica funzionale
Cosa accade al consumo di ossigeno?
• Il segnale BOLD permette l’individuazione dei cambiamenti locali cerebrali di ossigenazione ematica durante una stimolazione fisiologica
• Il segnale BOLD si basa sui cambiamenti fisiologici delle proprietà magnetiche del sangue:
fMRI
fMRI: functional Magnetic Resonance Imaging: Tecnica che utilizza il segnale BOLD per visualizzare il metabolismo cerebrale mediante MRI .
OSSIEMOGLOBINA DIAMAGNETICA
DEOSSIEMOGLOBINA PARAMAGNETICA
decrease of venous dHb during increased perfusion:
O2
The influence of arterial blood on the BOLD signal is probably insignificant (it contains low dHb and represent
less than 25% of CBV)
Esplorazione funzionale in vivo dei correlati Esplorazione funzionale in vivo dei correlati neurometabolici neurometabolici –– lo scannerlo scanner
Analisi Analisi deidei datidati: postprocessing: postprocessing
reconstructionreconstruction registrationregistration smoothingsmoothing
RationaleRationale: : ipotesiipotesisperimentalesperimentale
Preprocessing e Preprocessing e sessionesessionesperimentalesperimentale
InterpretazioneInterpretazione deidei risultatirisultati, , correlazionecorrelazione con con datidaticomportamentalicomportamentali e e verificaverificadell’ipotesidell’ipotesi
ParadigmaParadigma sperimentalesperimentale
SelezioneSelezione, screening, , screening, test test psicologicipsicologici e e comportamentalicomportamentali
EsperimentiEsperimenti fMRI: fMRI: ingegneriaingegneriabiomedicabiomedica
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