MetodeMetode enzimaticeenzimatice sisiimunochimiceimunochimice dede analizaanaliza
-- BIOANALIZABIOANALIZA --
TITULARI DISCIPLINAProf.dr.ing. Gabriel-Lucian RADU
S.l.Dr. Emanuela CRACIUN
Studenţii vor fi evaluaţi în mod continuu, atât în cursul semestrului, cât şi lafinal, alocându-se următoarele ponderi în notarea finală:Activitate la curs (răspuns la întrebări, implicareîn activitatea din cadrul cursului, teme de casă) 10% din nota finalăPerformanţa în activităţile aplicative 40% din nota finalăExamen 50% din nota finală
a) Activităţile evaluate şi ponderea:10% activitatea pe parcurs, 40% evaluare laborator, 50% examen
b) Cerinţele minimale pentru promovare:Parcurgerea tuturor lucrărilor de laborator;Obţinerea a 50% din punctajul total;Obţinerea a 50% din examenul final.
c) Calculul notei finale:Calculul notei finale prin rotunjirea punctajului final total.
EVALUARE
Domenii de aplicabilitateDomenii de aplicabilitate
monitorizareamonitorizarea calitatiicalitatii vietiivietii sisi mediuluimediului
valorificareavalorificarea deseurilordeseurilor
iindustriandustria chimicochimico--farmaceuticafarmaceutica
biologiebiologie--bbiotehnologieiotehnologie
medicinamedicina
aparareaparare
INSTRUMENTUL BIOANALITICINSTRUMENTUL BIOANALITICidealideal
selectivselectiv
specificspecific
reproductibilreproductibil
utilizareutilizare simplasimpla
compactcompact
rapidrapid
ieftinieftin
fiabilfiabil
AlegereaAlegereametodeimetodei sisi instrumentuluiinstrumentului
probaproba
instrumentinstrument
metodametoda
**stareastarea dede agregareagregare
**omogenitateaomogenitatea
**istoriaistoria probeiprobei
**securitateasecuritatea
**sensibilitateasensibilitatea
**mediumediu (t, p, etc.)(t, p, etc.)
**acceptabilitateaacceptabilitatea
ProbaProba PreparareaPrepararea probeiprobei AparaturaAparatura
gaz
lichid
solid
TEHNICATEHNICAMETODAMETODA
PROCEDEUPROCEDEUPROTOCOLPROTOCOL SP
ECIF
ICIT
ATEA
•• CALITATIVACALITATIVA•• SEMISEMI--CANTITATIVACANTITATIVA
•• CANTITATIVACANTITATIVA
INFORMATIAANALITICA
•• SCREENINGSCREENING
•• RUTINARUTINA•• RECUNORECUNOASTEREASTERE
•• STANDARDSTANDARD•• REFERINTAREFERINTA
•• PRIMARAPRIMARA
INCR
EDER
EA
Clasificarea metodelor analitice în funcţie decantitatea de determinat
10-2μgSub-micro1 μgUltra-micro1 mgMicro10 mgSemi-micro100 mgMacro
Marimeaaproximativa
Metoda
TEHNICATEHNICA
M E T O D AM E T O D A
ProceduraProcedura
ProtocolProtocol
ProcesulProcesul bioanaliticbioanaliticPrelucrareaPrelucrarea
datelordatelorOperatiiOperatii
preliminarepreliminare
RezultateRezultateProbaProbabrutabruta
MasurareaMasurarea sisitrasabilitateatrasabilitatea
Tehnicile de analiză si principalele aplicatii
Calitativa si cantitativa pentruCalitativa si cantitativa pentrumajoritatea.majoritatea.
Caracteristicile radiaCaracteristicile radiaţţiiloriilorionizante nucleare emise deionizante nucleare emise deanalitanalit
Analizaradiochimica
Calitativa si cantitativa pentruCalitativa si cantitativa pentrumajoritatea.majoritatea.
Proprietatile electrice aleProprietatile electrice aleanalitului in solutieanalitului in solutie
Analizaelectrochimica
Caracterizarea compusilorCaracterizarea compusilormajoritari sau minoritari singurimajoritari sau minoritari singurisau in amestecsau in amestec
Schimbări fizice sau chimiceSchimbări fizice sau chimice îînnanalit atunci când esteanalit atunci când este îîncălzitncălzitsau răcitsau răcit
Analiza termica
Separarile cantitative siSepararile cantitative sicalitative ale amestecurilorcalitative ale amestecurilor
Diferite proprietăDiferite proprietăţţi fizicoi fizico--chimicechimiceale analiale analiţţilor separatiilor separati
Cromatografia sielectroforeza
Calitativa sau structurala pentruCalitativa sau structurala pentrumajoritatea majoremajoritatea majore îîn jos pentrun jos pentrua urmări componentele nivela urmări componentele nivelizotop raporturiizotop raporturi
Masa analitului sau fragmenteMasa analitului sau fragmentedin eadin ea
Spectrometria demasa
Calitativa,cantitativa sauCalitativa,cantitativa saustructurala pentru componentelestructurala pentru componentelemajoremajore
Lungimea de undăLungimea de undă şşi intensitateai intensitatearadiaradiaţţiilor electromagneticeiilor electromagneticeemise sau absorbite de analitemise sau absorbite de analit
Spectrometriamoleculara si defluorescenta
AAplicareplicareProprietatea masurataProprietatea masurataTehnicaTehnica
ComponentComponentele de baza aleele de baza ale unuiunuiiinstrumentnstrument analiticanalitic
GENERATOR
SEMNAL
Detector
Tranductor
Procesor
SemnalInregistrator
SURSA DECURENT
Semnal
analitic
SemnalSemnal
electricelectricmecanicmecanicopticoptic
Semnal
iesire
TendinteleTendintele inin domeniuldomeniul dezvoltariidezvoltariiinstrumentelorinstrumentelor bioanaliticebioanalitice
prezentprezent
viitorviitor multinivelmultinivel
multimod
multimod
modmod
dimensiunedimensiune
mul
tidi
men
sion
alm
ulti
dim
ensi
onal
com
plex
itat
eco
mpl
exit
ate
MULTIFUNCTIONALMULTIFUNCTIONAL
hardware
marimeamarimea ((u.au.a.).)
inte
rfet
ein
terf
ete
elec
tron
ice
elec
tron
ice software
ConceptulConceptul generalgeneralbiobio--detectiedetectie
datedate
analitanalitinputinput
traductor
receptor
outputoutput
MicrosistemeMicrosisteme analiticeanaliticeconjugate/integrateconjugate/integrate
(lab on a chip)(lab on a chip)
ChimieChimie BiologieBiologie
TehnologieTehnologiemedicalamedicala
ElectronicaElectronica
MecanicaMecanica
OpticaOptica
TehnologiaTehnologiainformatieiinformatiei
BiotehnologieBiotehnologie
SistemSistem
BIOCHIPULBIOCHIPUL--lab on a chiplab on a chip--
MODEL
PROBA
ANALIZA
PLAN
EVALUARE
Defineste scopul
Selecteaza procesul analitic,numarul analizelor si centrele deanaliza pe baza scopurilor sicosturilor
Colecteaza probele, testepreliminare
Efectueaza operatii de ajustareaconditiilor, separarea intereferente,efectueaza masurarile siachizitioneaza datele
Selecteaza dintre date valoarea ceamai buna, estimeaza sigurantavalorii, revizuieste si repeta daca estenecesar
REPREZENTAREA PROCESULUI ANALITIC GLOBALREPREZENTAREA PROCESULUI ANALITIC GLOBAL
RaportulRaportul SemnalSemnal // ZgomotZgomotSemnalSemnal == informainformattiaia despredespre analitanalit carecare
este de interes pentru chimisteste de interes pentru chimistZgomotZgomot == informainformattiaia externexternaa care nucare nu
esteeste necesarnecesaraa deoarecedeoarece degradeazdegradeazaaacurateacuratetteaea ssii precizia analizeiprecizia analizei ssiimicmicssoreazoreazaa cantitatea decantitatea de analitanalit carecarepoate fipoate fi detectatdetectatS/Z = meS/Z = mediadia//deviadeviaţţiaia standard = x/sstandard = x/sS/Z = 1/ RSDS/Z = 1/ RSD
undeunde RSD =>RSD => deviadeviaţţiaia standardstandard relativărelativă, s/x, s/x
Surse deSurse de zgomotzgomotîîn analizelen analizele intrumentaleintrumentale
•• Zgomot chimicZgomot chimic•• rezultă din variabilerezultă din variabile iincontrolabilencontrolabile
ccareare afectează analiza chimică afectează analiza chimică•• Zgomot instrumentalZgomot instrumental•• TTipuriipuri•• Zgomot termicZgomot termic•• ZgomotZgomot ţţintăintă•• Zgomot slabZgomot slab•• Zgomot de mediuZgomot de mediu
ModalităModalităţţi pentru reducereai pentru reducerea zzgomotuluigomotuluiÎÎmpământarempământare şşi protejarei protejareAmplificatori diferiAmplificatori diferiţţiiFiltrareFiltrareModulareModulare““TăiereaTăierea”” semnaluluisemnaluluiBlocarea amplificatorilorBlocarea amplificatorilor
MetodeMetode SoftwareSoftware-- S/ZS/Z intensitatea laintensitatea la nn0.50.5,, undeunde nn este mediaeste media
mmaasursuraarilorrilor-- AdunareaAdunarea intensitatiiintensitatii medii amedii a semnalelorsemnalelor
Media semnalelor 1Media semnalelor 1--3, 53, 5--7,etc7,etc..-- FiltrareFiltrare DigitalDigitalaa-- Metode de CorelareMetode de Corelare-- AdunareaAdunarea intensitatiiintensitatii medii amedii a semnalelorsemnalelor
Adunarea intensităţii medii a semnalelor
Se observă că scalaverticală este maimică decât numărulscanărilor. Astfel,zgomotul creşte învaloare absolutăodată cu creştereanumărului scanărilor.Totusi, valoarearelativă a semnaluluianalitic creşte.
Efectul medierii semnalelor
Metode enzimatice si imunochimice deanaliza
2
Sursele de eroare in bioanaliza
100%100%
10%10%
1%1%
samplingsampling analizaanalizapropriupropriu--zisazisa
prelucrareaprelucrareadatelordatelor
coeficientcoeficientdede variatievariatie
timptimp40%40% 30%30%20%20%
Erori de masurare: Toate procesele de masurare sunt supuse erorilorce afecteaza datele numerice si care decurg dintr-o varietate de cauze.
Erori absolute si relative: O eroare absoluta este diferenta numericadintre o valoare masurata si o valoare reala sau o valoare acceptata. Eroarearelativa este eroarea absoluta impartita la valoarea reala sau acceptata.
Erori determinate: Sunt cunoscute ca fiind erori sistematice, eleaparand, in general, din surse determinate, identificabile, care duc lavarierea valorilor masurate de la valoarea reala la cea acceptata.
Erori nedeterminate: Sunt cunoscute si sub numele de erori aleatorii,ele aparand dintr-o varietate de surse necontrolate si cauzeaza mici variatiialeatorii in masuratorile cantitative cand masurarea este repetata de unnumar de ori.
Erori cumulate: Cand diferite masuratori sunt combinate pentru acalcula un rezultat analitic global, erorile asociate acestor masurariindividuale contribuie la erori totale sau acumulate.
ERORI IN MASURARILE ANALITICE
Sursele de erori (I)
Erorile de la reactivi- Reactivii si solvenţii sunt impuri.- Depozitarea improprie de reactivi.- Neglijarea datei de expirare a reactivului.- Evaporarea reactivilor.- Respectare gradelor si puritaţilor diferite.
Erorile materialului de referinţă- Impuritatea materialelor de referinţă.
- Erorile de la introducerea unor substanţe.- Schimbările datoritã depozitãrii necorespunzãtoare.- Erorile în pregãtirea materialul de referintă.- Utilizarea materialul de referintă expirat.
Sursele de erori (II)
Generarea erorilor- Devierea de la procedura de analiza.- Neluarea in seama a limitei de detectie.- Neluarea in seama a spatiului de colectare.- Calcularea erorilor (diluari, amestecuri,adaugari).
- Folosirea unor proceduri analitice incorecte.
Erorile de calibrare- Erorile ale masurarilor volumetrice.- Erorile de cantarire.- Reglarea inexacta a echipamentului.
Sursele de erori (III)
Erorile de la echipamentEchipamentul nu este curat.Intretinerea lui este neglijata.Influenta temperaturii, electricitatii si influenta
magnetica.Erori în folosirea auto-pipetelor necalibrate, pipetele nu
sunt atasate in mod corect sau sunt contaminate.Erori in folosirea pipetelor de sticla (se pot deterioara,
materiale de calitate mai slaba, ele pot fi contaminateanterior).
Erorile la spectrometru (lungimea de undã greşita, lampã de intensitateinsuficientã, optica murdară, ignorarea efectului de deviaţie, în mod incorectzeroul configurat, introducerea probei într-o camera luminoasa).
Erorile cuvei (defecte ce nu sunt luate în consideraţie,sticla necorespunzãtoare decuva, cantitate insuficienta, umedã pe exterioar, bulele de aer, contaminare).
Sursele de erori (IV)Erorile de la inregistrarea semnalelor- Domeniul incorect de raportare.- Erorile de citire.- Erorile de scriere.- Schimburile de informaţii.
Erorile din calculul- Erorile aritmetice, erorile de virgula, unitati
incorecte.- Erorile circulare.- Neluarea in calcul a valorilor volumului de reactiv
adaugat.- Erorile in factorul de diluare.
PROTEINELE
Proteina Trivia
Cea mai abundenta molecula organica din celula(50% din greutate)
30-50K - codul genelor structurale pentruproteine
Fiecare celula contine 3-5K proteine distincte Circa 300 de proteine au fost identificate in
plasma
Diversitatea functionala a proteinelor
Structura Keratina, colagen, actina, miozina
Transport Hemoglobina, transferina, ceruloplasmina
Hormonal Insulina, TSH, ACTH, PTH, GH
Reglator Enzime
Dimensiunile proteinelor
Limita inferioara este arbitrara, in jurulvalorii de 5.000 MW
Proteinele pot avea o dimensiune mai mare de1 milion MW, desi cele mai multe proteine seincadreaza in intervalul 12-36 K Aminoacizi 100-300 Albumina ( ce mai abundenta proteina la om) este
de 66K si contine 550 de aminoacizi (reziduuri)
Compozitia proteinelor
Aminoacizi (proteine simple) 20 aminoacizi comuni (standard)
Proteinele compuse contin un grup proteic: Metaloproteine Glicoproteine Fosfoproteine Lipoproteine Nucleoproteine
CLASIFICAREAAMINOACIZILOR COMUNI
Catene laterale unice, care difera in polaritate:- Hidrofilic
- neincarcat- relativ solubil in apa
- incarcat- acid, baza
- Hidrofobic- relativ insolubil
HIDROFOBIC Alanine Ala
-CH3
Valine Val-CH(CH3)2
Leucine Leu-CH2CH(CH3)2
HIDROFOBIC Isoleucine Ile
- CH(CH3)(CH2CH3) Metionine Met
- CH2SCH2CH3
Fenilalanine Phe- CH2(C6H5)
Aminoaciziesentiali
De obicei, organismuluman nu poatesintetiza : Leu, Ile, Val, Met,
Phe, Trp, Thr, Lys,His (Arg)
Proteinele provenitedin dietele alimentaresunt principala sursade aminoaciziesentiali
Stereochimia aminoacizilor
Toti aminoacizii gasiti in proteine au configuratie “L”
R
NH2 COOHH
R
HOOC NH2
H
L-Alanine D-Alanine
Legatura peptidica
H2N CH C
R
OH
O
H2N CH C
R
OH
OH2O
Legatura peptidica
H2N CH C
R
O
N CH
R
C
O
OH
H
Dipeptide
ELEMENTELE STRUCTURIIPROTEINELOR
Primara- > 200 kJ/mol
Secundara- 10 kJ/mol
Tertiara- < 5 kJ/mol
Cuaternara – doar oligomeric (> 1 lant)
STRUCTURA PROTEINELOR Primara
- Numarul aminoacizilor in catena lineara• N - terminal (pornit, prin conventie)• C - terminal (sfarsit)
Secundara- Portiunile catenei laterale se indoaie inconformatiile regulate
• -helix• -sheet• Alte structuri: cicluri inverse sau , bucle
omega, spirala aleatorie
STRUCTURA PROTEINELOR Structura tertiara Forma generala
Structuracuaternara In proteinele cu mai
multe lanturipeptidice
Exemple:hemoglobina
1A3O: de la Homo Sapiens
STRUCTURA SECUNDARA - -HELIX
Forma cilindrica Stabilizata de legaturile de H intre C=O a
rezidurilor i si a rezidurilor i+3 a protonuluiamida
Specifica rezidurilor celor 10 -15 aminoacizi sicelor 3-4 cicluri- Fiecare ciclu:
• contine 3.6 reziduri de aminoacizi• acopera distanta de 5.41 Å
STRUCTURA SECUNDARA - -HELIX
Aminoacizi cu catenelaterale prelungite.
Aminoacizi hidrofilicisi hidrofobici pe feteleopuse ale cilindrului.
1IRL: from Homo sapiens; Mott, H. R., Baines, B. S., Hall, R. M., Cooke, R. M., Driscoll,P.C., Weir, M. P., Campbell, I. D.: The solution structure of the F42A mutant of humaninterleukin 2. J Mol Biol 247 pp. 979 (1995).
STRUCTURA SECUNDARA - -SHEET
Structura gen coala (sheet)Alcatuit din 2-6 lanturi (3-10 aminoacizi
pe fiecare), stabilizate cu legaturi dehidrogen- Parelele- Neparalele (cele mai intalnite cazuri)Contin aminoacizi ramnificati la -C- izoleucine, treonine, valine
STRUCTURA SECUNDARA - -SHEET
CONTINUAREFibroin de matase (poli Ala-Gly) (teoretic)Continut ridicat de -sheet400,000 Da
STABILIZAREAINTERACTIUNILOR
INTRAMOLECULARE
Legaturi de H- 3 kcal/mol
Interactii electrostatice – intre catenelelaterale incarcate ale aminoacizilor
- punti de sareLegaturi disulfidice
- 2 S-H = S-S + 2H+
Interactii hidrofobice- 3-5 kcal/mol (entropic)
PROTEINELEProteina MW Numarul de
reziduriNumarul desubunitati
Insulina(bovine)
5,733 51 2
Mioglobina(cai)
16,890 153 1
Acidul grassintetizat(ferment)
2,300,000 20,000 21
Virusulmozaic altutunului
40,000,000 336,500 2,130
PROTEINELE – DIVERSEFUNCTIONALITATI
Proteina Functie
Citocrom P450 Detoxifiere (ficat)
Clostridium botulinum Provoaca intoxicatiealimentatra bacteriana
Hormonul de crestere Stimuleaza crestereaoaselor
Ubiquitin Elimina proteineledegradate
Protamine Sperma pestilor
E. coli - 1000 proteine diferiteNumarul total de proteine > 1010
STABILITATEA CHIMICA
Proteoliza- Digestia legaturilorpeptidice de catre proteaze
Hidroliza- Enzimatica- Chimica
Oxidare- serina- cisteina
Agregare Adsorbtie
Dezaminarea- asparagina
Fosforilarea si glicarea Eliminarea Formarea isopeptidelor Decarboxilare Chimia Maillard
- reactia aminelor cuzaharurile reducatoare
STABILITATEACONFORMATIONALA AFECTATA
DE CATRE pH Agregarea hidrofobica Presiunea Forfecare (amestecare, debit, UF) Temperatura Interfete de sorbtie Legaturile metalului Efectele soventului
DENATURAREA PROTEINELOR- INACTIVAREA TERMICA -
Hidroliza- De evitat pH-ul acid/alcalinOxidare sulfhidrilica- Agenti reducatori, ex: ditiotreitol (DTT) sau -
mercaptoetanolRearanjarea disulfida- De evitat pH>10- t1/2 (S-S) = 10 ore la temperatura camerei
STABILIZAREA STOCARIIPROTEINELOR
Aditivi chimici- 50% glicerol- 50% metanol Adaugarea de saruri- 3M(NH4)2SO4- <0.15M (izotonice in organismele vii) Inghetare/Topire
STABILIZAREA STOCARIIPROTEINELOR
LiofilizareModificare chimica Reticulare (gluteraldehida)
- Cristalografie de raze X
Dializa- Indeparteaza impuritatile cu MW micUltra-filtrare
PROTEINELE SI pH-UL
Avand in vedere ca proteinele sunt constituitedin aminoacizi:- la orice pH mai mare ca pKa, molecula va fi
incarcata negativ (R-COO-)- la orice pH mai mic decat pKa, molecula va fi
incarcata pozitiv (R-NH3+)
- la orice pH la o distanta mai mare de o unitatede pKa, grupul functional poate fi considerat afi complet ionizat
PI
pH-ul la care proteina nu are o sarcina neta
proteinele au o solubilitate slaba langavaloare pI
PROTEINELE BAZICE
sunt proteinele care au pI-ul la pH mare.
R-NH3=R-NH2+H+
la pH neutru, proteina este incarcata pozitiv
pentru HPLC se foloseste schimbul de cationi
PROTEINELE ACIDE
pI-ul la pH mic
R-COOH = RCOO- + H+
la pH neutru proteina este incarcata negativ
pentru HPLC se foloseste schimbul de anioni
SOLUBILITATEA PROTEINELOR
Variaza destul de mult- depinde de hidrofilia si hidrofobia catenelor
laterale reziduale ale aminoacizilor
Daca se variaza pH-ul- proteinele mai putin solubile langa pI pot fi
afectate• proteinele animale cu pI intre 5.5 si 6• proteinele din plante sau bacterii cu pI
intre 4.5 si 5
SOLUBILITATEA PROTEINELOR
solubilitatea poate creste putin prin adaugareaunui solvent sau detergent
se dizolva sau se precipita prin adaugarea deacetona sau etanol
dezavantajul principal este acela ca substanteleadugate in acest caz trebuiesc indepartatedeoarece pot denatura
IMUNOCHIMIE
ANTICORPI-ANTIGENISI INTERACTIUNILE LOR
REACTII IN-VITRO AG-AC (antigen-anticorp)
Antigen: (greacă: anti=contra si geano=a naste, agenera)
Defineste orice substanta de origine endogena sauexogena, care, odata ajunsa in organism, nu esterecunoscuta ca proprie si determina aparitia unuiraspuns imun, ce vizează neutralizarea si eliminarea ei.
Odata patrunse in organism antigenele pot determina: Sinteza de molecule de anticorpi, care le recunosc
specific. Instalarea memoriei imunologice ("amintirea"
organismului despre întalnirile anterioare avute cuacelasi antigen).
Aparitia eventuala a unor reactii imune aberante:reactii alergice, autoimune etc.
ANTIGENII
Un imunogen este un tip specific de antigen, deci osubstanta care este capabila de a provoca un raspunsimun adaptativ, daca este injectat pe cont propriu. Unimunogen este capabil de a induce un raspuns imun,intrucat un antigen este capabil sa combine cu produsecu un raspuns imun odată ce acestea sunt făcute.
Conceptele suprapuse aleimunogenitate si antigenicitate sunt, prin urmare,subtil diferit. In mod curent:
Imunogenitatea este capacitatea de a induce unraspuns umoral si / sau celule-mediate imun
Antigenitatea este abilitatea de a se combina in modspecific cu produsele finale ale raspunsului imun (deexemplu, anticorpi secretati si/sau receptorii desuprafata celulelor T). Desi toate moleculele care auproprietatea de imunogenitate au, de asemenea,proprietatea antigenitatii, invers nu este adevarat ".
ANTIGENII La nivel molecular, un antigen poate fi, uneori,
caracterizat prin capacitatea sa de a fi "legat" la site-ulantigen-legare al unui anticorp. Anticorpii au tendința dea discrimina intre specifice structurile moleculareprezentate pe suprafața de antigen. Antigenele sunt deobicei proteine sau polizaharide . Aceasta include parti(capsule, peretii celulelor, flagella, si toxine)de bacterii, virusuri si alte microorganisme etc.
Lipidele si acizi nucleici sunt antigenice numai atunci candsunt combinate cu proteinele si polizaharidele. Non-microbiene exogene (non-auto) antigene pot include polen,albus de ou, si proteine din tesuturi siorganetransplantate sau pe suprafata celulelor sanguinetransfuzate.
Vaccinurile sunt exemple de antigene administrate inmod intentionat imunogene pentru a induce imunitatedobandită in destinatar.
Caracteristicile antigenuluiConventional, antigenele se definesc ca substante straine, care,consecutiv introducerii in organismul uman sau animal pe o caleparenterala (alta decat cea digestiva), declanseaza sinteza anticorpilorcu care se combina specific.
•Calea digestiva de administrare a antigenelor nu exclude totdeaunaposibilitatea declansarii raspunsului imun. Pentru agentii infectiosicare se multiplica in tractul digestiv, administrarea orala asigura obuna imunizare.
- Fata de unele antigene, organismele nu declanseaza raspunsul imun,ci manifesta o stare de toleranta.
- Unele molecule in stare nativa nu induc un raspuns imun, ci numaidupa cuplarea covalenta cu o molecula purtator. Molecula nativa isipastreaza proprietatea de a se combina specific cu anticorpii sintetizati.Astfel de molecule se numesc haptene.
Aminobenzen sulfonat,o Haptena
Haptena este un antigen incomplet, arespecificitate dar nu are imunogenitate.
NH2 NH2NH2
SO3
SO3
SO3Orto Meta Para
ANTICORPII Anticorp se numeste o molecula de natura proteica
(globuline), produsa in organitele limforeticulare sanguinedenumite limfocite, capabila sa recunoasca o subtanta
straina de organism, denumita antigen, si sa declanseze oreactie imunologica, care are ca rezultatindepartarea/blocarea/anihilarea respectivei
componente Unitatea structurala a anticorpului este o proteina
tetracatenara, denumita monomer. Anticorpii se leaga de markeri specifici - antigene - care
se gasesc pe suprafata virusurilor, bacteriilor, sau aunor toxine si le aglutineaza.
Sistemul imunitar poate fabrica milioane de anticorpidiferiti, care "lupta“ impotriva unei largi varietati de“invadatori” potentiali
ANTICORPII
IgG IgM IgA IgD IgE
ANTICORPII
oo imunoglobulinaimunoglobulina capabilacapabila de a sede a se combinacombina specificspecificcu un antigencu un antigen
Afinitatea anticorpilor
AgAbAgAb
]][[
][
AgAb
AgAbKa
Proprietatile legaturii Anticorp-Antigen
Ne -covalente Reversibile Forte intermoleculare Interactiuni coulombice (legaturi de hidrogen) Interactiuni hidrofobe Legaturi van der WaalsVariatia clonala
Proprietati principale: specificitatea si reversibilitatea.Interactiunea primara se datoreaza legarii efective Ag-Ac si depinde
in mod direct de cantitatea si afinitatea Ac. Reactiile Ag-Ac in carereactantii se afla in interactiune primara pot fi puse in evidentaprin nefelometrie.
Interactiuni secundare - apar la circa 30 min dupa cea primara.Datorita faptului ca Ag poate avea mai multi epitopi iar Ag areminim 2 paratopi, complexele primare mici solubileinteractioneaza intre ele formand complexe secundare, produsulfinal fiind o retea 3D insolubila. Pot fi evidentiate prin:imunofluorescenta, chemiluminiscenta, enzimatic si izotopic etc.
Ag-Ac1 - Diagnosticul de boli infecțioase:
preparatele antigenice cunoscute sunt folosite pentru adetecta anticorpii care circula in serul pacientului cadovadă a unei infecții anterioare sau actuale cu acelagent;SAU
anticorpi cunoscuti sunt folositi pentru a detectaantigene asociate cu un agent infecțios direct înfluidele corporale;
2 - Identificarea culturilor necunoscute:
anticorpi cunoscuti sunt folositi pentru a detectaantigenii omologi in diferite culturi;
REACTII IMUNOCHIMICEREACTII IMUNOCHIMICE1. REACTIA DE PRECIPITARE-Ag-solubil
2. REACTIA DE AGLUTINARE-Ag-particule
3. REACTIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI
4. REACTII CU REACTIVI MARCATIa) reactia de imunofluorescentab) analiza imunoenzimatica: TEHNICA ELISA, RIA etc.
METODE DE DETECTARE A REACTIILORAg-Ac (antigen-anticorp)
I
Metode imunochimicede analiza
Imunochimia
Disciplina de granitaa imunologiei si biochimiei
studiaza substantele si procesele chimicece participa la reactiile imunologice
REACTII ANTIGEN-ANTICORPREACTII IMUNOCHIMICEREACTII IMUNOCHIMICE
• REACTIA DE PRECIPITARE-Ag-solubil
• REACTIA DE AGLUTINARE-Ag-particule
• REACTIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI
• REACTII CU REACTIVI MARCATIa)reactia de imunofluorescentab)analiza imunoenzimatica: TEHNICA ELISA, RIA etc.
ImunochimiaReactivii imunochimici sunt produse biologice (Ac,
Ag, C, hematii etc.)ce se utilizează pentru determinări calitative sau/si
cantitative de Ag sau Ac
Tehnici:Fizico-chimice: - precizie
- acurateteImunochimice: - sensibiliate
- specficitate
Reactia Ag-Ac
Este determinata deinteractiunea specifica
dintreepitopii antigenului şi
paratopii anticorpilor
Intervin legaturio de hidrogen
o electrostaticeo forţe Van der Waals
o hidrofobe
REACTIA Ag-Ac este:- exoterma- specifica- reversibila
Afinitateaunui Ac pentru un Ag specific
Depinde de:- intensitatea fortelor delegatura a complexuluiAg-Ac- complementaritateasterica dintre paratop siepitop
Aviditateaunui Ac pentru un Ag specific
Reprezintarapiditatea aparitiei manifestarii
reactiei Ag-Ac (precipitare, aglutinare)Depinde de
constanta de asociere valenta Ac
numarul de epitopi temperatura, pH
forta ionica a mediului
Un paratop se poate combina cu un singur epitop, numit“specific”
Reactia Ag-Ac
Are o mare putere de rezolutie/sensibilitate Selectivitatea fiecarei reactii nu este absolută Necesita obtinerea unui semnal secundar
pentru a fi detectabila si cuantificata Prezinta un domeniu de aplicare extrem de
larg
Reactii Ag-Ac
Seroidentificare: detectarea si dozarea Ag (componentnecunoscut) (medicamente,hormoni peptidici, antigene virale sau bacteriene) cu:
- Ac monoclonali- Ac policlonali
Serodiagnostic: detectarea si titrarea Ac din serulbolnavilor (component necunoscut) fata de un Ag specificcunoscut
REACTIILE DE PRECIPITARE
Ag = macromolecula solubila
Se produc in: mediu lichid (difuzia în gel) solidPot fi: Calitative CantitativeSunt: reactii specifice mai putin sensibile necesita cantitati importante de anticorpi
Precipitarea Formarea unei retele tridimensionale de Ag reunite prin Ac Conditiile de formare a reţelei de precipitare:
- Ac sa fie cel putin bivalent (Ac complet)- Ag sa fie multivalent
Precipitarea maximacorespunde cu zona de echivalenta(Ac si Ag sunt in raport optimal de concentratie) ce permite precipitarea
tuturor moleculelor de Ac cu Ag corespunzator* In exces de Ag sau de Ac precipitatul NU se formează
Formarea precipiatului depinde de: cantitatea si concentratia Ag,calitatea si concentratia Ac, temperatura, molaritatea, pH-ul, volumul dereactie, continutul in lipide al antiserului, etc.
Compozitia precipitatului imun, proportia de combinare a Ag cu Ac suntvariabile in functie de zona in care a avut loc precipitarea: exces de Ag,echivalenta sau exces de Ac.
Una dintre cele mai usoare teste serologice
Precipitarea in mediu lichid
Reactia de precipitare inelara (depistarea antigenelor microbiene):prot.M streptococi, Ag termostabil antrax (reactia Ascoli)
Precipitare inelara:- tuburi- capilare
Precipitarea in mediu lichidReactia de floculare (tehnica Ramon)
- Calitativa- Cantitativa
Se efectueaza dilutia succesiva a serului imunla care se adauga cantitati egale de Ag Se introduc probele in termostat
Periodic se examineaza pentru depistarea tubului in careapare precipitatul initial (zona de echivalenta)
Utilizare: determinarea cantitativa de toxina, antitoxinasau anatoxina,VDRL
Reactia de floculare
TUBURI GODEURI
Reactia de floculare
V.D.R.L. (Veneral Disease Research Laboratory)
Precipitarea in mediu solid
Difuzia in gel
Difuzia simplaDifuzia dubla
Difuzia combinata cumigrarea in camp electric
Se utilizeaza gel de agar sau agaroza(concentratie de 0,8-1,6 g %)
Imunodifuzia radiala simpla
EXEMPLE DE REACTII DE PRECIPITARE
IMUNODIFUZIA SIMPLA RADIALA
Se efectueaza pe o placa acoperita cu geloza, in caresunt incorporati Ac specifici.
Ag este depus in godeuri din stratul de geloza sidifuzeaza radial in geloza pe parcursul a 48 deore.
Daca Ag corespunde Ac are loc formarea de discuride precipitare, cu suprafata proportionalaconcentratiei de Ag din godeu.
Se utilizeaza pentru identificarea si cuantificareahormonilor, enzimelor etc.
Precipitarea in mediu solidImunodifuzia radiala simpla
(Mancini, Carbonara, Heremans;1965)IDRS
Aplicaţii (cantitativ): IgG, IgA, IgM, C3,alfa-1 antitripsina, siderofilina,
proteina C-reactiva (CRP)
2. IMUNODIFUZIA DUBLA(TEHNICILE QUCHTERLONY SI ELEK)
Se acopera cu geloza o placa de sticla sau se toarna gelozain placa Petri.
A) In tehnica QuchterlonyQuchterlony Ag si Ac difuzeaza in godeurisituate la o distanta de 15 mm unul de altul.
B) In tehnica ElekElek cele doua substante reactive difuzezadin benzile de hartie plasate pe suprafata gelozei.
Moleculele difuzeaza in functie de greutatea lor si formeazalinii de precipitare pentru fiecare sistem Ag-Ac cecorespund in zona lor de echivalenta. Daca doua Ag suntidentice liniile lor se unesc daca sunt diferite seintersecteaza.
UTILIZARE: determinarea toxinelor (toxigeneza),antitoxinele, Ag proteice etc.
Precipitarea in mediu solidImunodifuzia dublă ( Elek, Ouchterlony; 1948 )
Aplicatii (calitative) : proteinele Bence-Jones(kappa şi lambda), crioglobuline
Imunodifuzia dublă
Testul Elek(toxinogeneza la C.diphteriae)
Metoda Elektest pozitiv formarea a patru liniiradiante care rezulta in urma
reactiei de precipitare
Metoda Ouchterlonya
Incubare
1h la 37°C
21
C 3
Ag
21
C 3
Ag
Difuzia combinata cumigrarea electroforetica
Imunoelectroforeza (IEF)Grabar si Williams (1953)
Scheidegge (1955)Imunoelectroforeza
bidimensionala cantitativaRessler (1960), Laurell (1965),
Clarke si Freeman (1968)
Imunoelectroforeza
Difuzia combinata cumigrarea electroforetica
Contra-imunelectroforeza (CIEF)Bussard (1959)
CIEF
CIEF
Difuzia combinată cumigrarea electroforetică
Electro-imunodifuzia (EID)
Electroimunodifuzia EID a fost imaginata de Laurell (1965).
Se realizeaza prin electroforeza Ag in strat de gel ce conţineAc monospecifici. Precipitatul Ag-Ac apare sub forma derachete (conuri) a caror inaltime este direct proportionala cuconcentratia Ag si invers proportionala cu cea a Ac.Reactia are sensibilitate mai mare decat IDRS. In cazul Ig seutilizeaza ca suport agarul sau agaroza. IgG migreaza anodicin gelul de agar. IgA si IgM migreaza catre anod in gelul deagaroza.
Reactia prezinta unele dificultati la efectuare. De ce s-a dorit combinarea imunodifuziei cu electroforeza?
Viteza Specificitatea
Carl-Bertil Laurell ( Universitatea Lund , Suedia) Tehnica Laurell (factori de coagulare) “ Electroforeza Rocket”
Electroimunodifuzia
+
-
Imunoelectroforeza
Imunoelectroforeza reprezinta asocierea electroforezei cu dubla difuzie.In prima etapa are loc electroforeza proteinelor, urmata de dubladifuzie cu un antiser corespunzator. Reactia Ag-Ac se vizualizeazaprin linii de precipitare corespunzatoare sistemelor Ag-Ac din reactie.
Imunoelectroforeza (IEF) ofera numai informatii calitative indiagnosticul gamapatiilor monoclonale. Metoda ilustreaza in cazulcomponente monoclonale a Ig, clasa si tipul de Ig patologice.
Metoda se foloseste pentru studiul puritatii unui Ag sau Ac.
Combina electroforeza proteinei serice cu detectia imunochimica Electroforeza face separarea Imunoprecipitarea produce detectia
Imunoelectroforeza
Specimen
ser -uman
+
-
Imunoelectroforeza
P C P C P C
+
-
Imunofixarea electroforetica
•Cuprinde un grup de tehniciimunochimice care au comun EFprobei in gel, combinata cuimobilizarea (fixarea) unui reactantde catre celalalt (imobilizarea Ag decatre Ac cunoscut, fie invers).Precipitatele se evidentiaza dupacolorare.•Metoda se utilizeaza pentrustabilirea clasei si tipului de Igmonoclonala, pentru diagnosticulimunochimic al bolii lanturilor grele şipentru diagnosticul diferential alhipergama-globulinemiilormonoclonale.
SPE IgG IgA IgM
•Metoda a fost imaginata de Alper şi Johnson (1969).
Reactia de aglutinare
DEFINITIEAgregarea antigenelor corpusculare
naturale sau fixate artificialpe suprafaţa unor particule
(bacterii, hematii, latex)/aglutinogeneprin Ac specifici completi/aglutinine
Reactia de aglutinare
Ac reacţionează numai cu determinantul Ag specific Ac specifici sunt compleţi, cel puţin bivalenţi Ac pot fi:
- aglutinanţi- neaglutinanţi (blocanti sau incompleti)- care aglutinează numai la rece (+4°C)
Aglutinarea
Mecanism: scaderea fortelor de respingere electrostatice dintre particulesi aparitia unor punti de legătura prin intermediul Ac
Aglutinarea
Factori determinanti: Valenta Ac (Ac din clasa IgM sunt mult mai aglutinanti
decat cei care aparţin clasei IgG) Densitatea determinantilor antigenici de la suprafata
particulei Forta ionica a mediului in care are loc reactia
Reactia de aglutinare
Are sensibilitatea mai mare decat reactia de precipitare(Ag este o particula si nu o molecula solubila)
Excesul de Ag nu inhiba reactia Concentratiile mari de Ac pot inhiba reactia (fenomenul de
prozona) Raportul intre Ag-Ac este tot in favoarea Ac (ca si la
precipitare)
Clasificarea reactiilor de aglutinare
• Aglutinare “activa” sau “directa”, in care particulafigurata (Ag corpuscular) este el insusipurtator de determinante antigenicespecifice (hematii, leucocite,trombocite,spermatozoizi, bacterii etc.)
Aglutinare “pasiva” sau “indirecta”, in careparticula serveste doar de suport pentru undeterminant antigenul solubil fixat artificial pesuprafata sa (hematii, particule de latex saumicrocristale de colesterol)
Aglutinarea directă “activa”
Poate fi:- Calitativa
- CantitativaUtilizare: ex. determinarea grupelor sanguine,
seroidentificarea Ag bacteriene saudepistarea si titrarea Ac din serul pacientilor (ex. bruceloza)
Sensibilitatea poate fi crescuta prin:- tratarea celulelor cu enzime
- executarea reactiei in mediul cu vascozitate crescuta
Reactia de aglutinare directacalitativa
LAMA
(4+) (-)
(4+)(-)
Reactia de aglutinare directacalitativa
TUBURI
(4+) (-)
R. aglutinare directacantitativa
METODA DILUTIILOR SUCCESIVETITRUL AGLUTINANT AL SERULUI
(3+)
Aglutinarea indirecta “pasiva“
Particula serveste doar ca suport pentru undeterminant antigenul solubil fixat artificial pesuprafaţa sa
Sunt utilizate ca suport hematii formolate, tanate particule de latex microcristale de colesterol proteina A stafilococ
Poate fi:- Calitativa- CantitativaSensibilitate mai inalta fata de aglutinarea directaCitire mai usoara
Hemaglutinarea indirecta (pasiva)RHAI/RHAP
TUBURI
Fixarea pe hematii:- Ag.polizaharidice: scurta
incubatie- Ag.proteice: hematii tanate,
formolate
Hemaglutinarea indirecta (pasiva)RHAI/RHAP
GODEURI
Hemaglutinarea indirecta (pasiva)RHAI/RHAP
Tehnica se bazeaza pe o reactie dehemaglutinare pasiva pentruevidentierea anticorpilor specificianti-treponemici
Principiu: hematii de cocossensibilizate cu antigenetreponemice se pun in contact cuserurul pacientului; daca serulcontine anticorpi specifici, acestiadetermina aglutinarea hematiilor
±1+2+3+
4+
Treponema pallidumhaemagglutination assay
(TPHA)
Hemaglutinarea indirecta (pasiva)RHAI/RHAP
TPHA / MHA-TP(microhaemagglutination assay for antibody to
Treponema pallidum )
Reactia de latex-aglutinare
Ac sau Ag sunt fixaţipe particule de latex
Reacţia se efectuează pe:- lame de sticla
- slide-uri cartonate
Utilizare:- Identificare Ag din
prelevate patologice- Serodiagnosticul unor
infectii
Reactia de latex-aglutinare
NEREACTIV REACTIV
Reactia de latex-aglutinare
POZITIV / REACTIV
Reactia de Co-aglutinare
Anumite tulpini de Staphylococcus aureus (tulpina Cowan, ATCC12498) prezinta un continut ridicat de proteina A de suprafata
Proteina A din peretele celular al stafilococului aureus se leagade fragmentul Fc al moleculei de imunoglobulina, lasand liberfragmentul Fab pentru legarea antigenului
Aglutinarea vizibila a stafilococilor reprezintă un test pozitiv careindica legatura antigen-anticorp
Reactia de co-aglutinare este utilizata in detectarea antigenelordiferitelor grupuri de steptococi, Neisseria meningitidis şiNeisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Streptococcuspneumoniae
Reactia de Co-aglutinare
TESTUL COOMBS
Tehnica Coombs directa(test antiglobulinic direct)La un nou-nascut: prezenta Acmaterni anti-Rh fixaţi pe hematii(dacă mama este Rh-)Tehnica: La aceste hematiisuspecte se adaugă un ser anti-IgumanăMetoda: hemaglutinare pe lama
TESTUL COOMBS
Testul Coombs indirect(detecteazz anticorpii circulanti
anti-eritrocitari)Tehnica: - serul pacintului se
pune în contact cu eritrociteleunui donator Rh+- se adauga antiglobulinaumana (poli/monospecific)
Metoda: hemaglutinare pe lama
Reactia de inhibare a aglutinării
Reactia de aglutinare a particulelor incarcate cuAg solubil
este inhibata in cazul în careAc reacţioneaza in prealabil cu Ag omolog
(Exemplu:Testul inhibarii hemaglutinarii virale HAI)
Reactia de inhibare a aglutinarii
Reactia de inhibare ahemaglutinării
III
Metode imunochimicede analiza
REACŢIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC)
Este o reacţie complexă, constituită din 2 sisteme Ag-Ac şi cuparticiparea C.
-participă Ig capabile să fixeze C – IgM şi IgG.- se utilizează în diagnosticul virozelor, infecţiilor bacteriene, etc.
Toate componentele RFC sunt utilizate în acelaşi volum fiind titrate înprealabil pentru aprecierea dozelor de lucru.
Reacţia este însoţită de martori ai tuturor componenţilor.
Reacţia se efectuează în 2 etape utilizând 2sisteme.
I etapă – Sistemul de bază este constituit din Ag1 (diagnosticuri sau Agnecunoscute), Ac1 (serul bolnavului sau serul imun) şi complement îndoza de lucru. Amestecul este incubat 1h la 37° C sau menţinut 16-18ore la 4° C. Dacă Ac se combină cu Ag omolog va avea loc şi fixarea C(efect frecvent invizibil).
II etapă – la sistemul de bază se adaugă sistemul indicator(hemolitic),constituit din hematii de berbec (Ag2) combinate cu Ac specifici – serulhemolitic(Ac2). Peste 1h incubare la 37° C reacţia este terminată.
Evaluarea rezultatelor – dacă complementul a fost fixat de primulsistem Ag-Ac hemoliza nu se observă (rezultat pozitiv). Dacă Ag1 nucorespunde cu Ac1, complementul rămâne disponibil pentru fixare pesistemul indicator Ag2 Ac2, provocând hemoliza (rezultat negativ)
REACTII ANTIGEN-ANTICORP CUCOMPONENTE MARCATE
Marcarea componentelor de reactie:
sa permita detectarea unor cantitati infime de substanta sa nu altereze capacitatea de legare a Ac la Ag
corespunzatoare se monteaza pe suport solid (lame, placi din plastic)
Tehnici serologicecu componente marcate
Marcanţii utilizaţi:
Fluorocromi (rodamina, fluoresceina): emit lumină roşu-oranj sauverde-galbenă la tratarea cu raze UV(Reacţia de Imuno-Fluorescenţă) Coons,1942
Radio-izotopi (125 I sau 3H): emit raze gamma sau beta(Analiza Radio-Imună) Zalow şi Berson, 1960
Enzime (fosfataza alcalină, peroxidaza): capabile să modificeculoarea unui substrat(Reacţia Imuno-enzimatică) Engwall şi Perlman, 1972
Analiza imunochimica in fazaheterogena
Competitiv Exces de antigen De obicei implica
antigene concurentemarcate
RIA este prototipul
Ne-competitiv Exces de anticorp Implica de obicei
anticorpi secundarmarcati
ELISA este prototipul
Analiza imunochimica in fazaheterogena
Care este trasatura distinctiva a imunodozariiin faza heterogena ? Necesita separarea de liganzii legati sau liberi
Au metodele heterogene vreun avantaj fata demetodele omogene? Da
Care sunt acestea? Sensibilitatea Specificitatea
Marcare fluorescenta
Advantaje Dimenisune Specificitate Sensibilitate
Dezavantaje Complet Limita de selectie Fundal/Zgomot
Marcare chemiluminescenta
+ 2 H 2 O 2 + O H -
C O O -
C O O -
O -
O -
+ h ( m a x = 4 3 0 n m )
+ N 2 + 3 H 2 O
N H 2
L u m i n o l
P e r o x i d a s e
O
O
N
NH
N H 2
H
O
O *N H 2
C H 3N +
CO 2 H
O O
B r -
A c r i d i n i um e s t e r
O -
CO 2 H
+ H 2O 2 + O H -+ + CO 2 + h
O
C H 3N
Reacţia de imunofluorescenţă(RIF)
Coons,1942
Reacţia de imunofluorescenţă(RIF)
Se prepară un frotiu dinmaterialul ce conţine Ag
(material nativ, cultură pură,biopsie tisulară)
Colorare cu ser conjugatIncubare în cameră umedă 20 min
SpalareExaminare la microscopul cu fluorescenta
Metoda directă (IFD)(seroidentificare)
Reacţia de imunofluorescenţă(RIF)
Metoda indirectă(IFI)(sero-identificare şi
sero-diagnostic)
Pe frotiul ce conţine Agse aplică Ac specifici nemarcaţi
Peste 20 min se spală preparatulColorare cu Ac policlonali anti-Ig
marcati fluorescent
Metoda directă (IFD)
• test pozitiv pentru turbare • test negativ pentru turbare
Reacţia de imunofluorescenţă(RIF)
Teste pentru molecule mici
Analiza de chemiluminescență pentru testosteronÎn urma acestei analize se obţine o curbă:
Chemiluminescenta pentru molecule mari
testele de chemiluminescentă pentru imunoglobulina G- aufost unele dintre primele teste care a implicat cuplarea directă aluminolului cu un antigen proteic. Cea mai mică concentratiestandard de imunoglobulină G folosită a fost 5 ug/tub.
prepararea anticorpilor marcati- această procedură areprezentat prima folosire pe scară largă a anticorpilor marcatiîntr-un test cu 2 situri.Randamentul cuantic al luminolului a fost redus în aceastăreactie la mai putin de 1% din valoarea sa originală, datorităformării de polimeri si pierderea randamentului prin modificăristructurale.
Marcarea cu enzime
Advantaje Diversitate Dezvoltare Adaptabilitate
Dezavantaje Instabilitate Dimensiune Heterogenitate
Reacţia Imuno-Enzimatică(RIE, ELISA/Enzyme Linked Immunosorbent Assays)
Marcarea Directa a Anticorpului
Reacţia Imuno-Enzimatică(RIE, ELISA/Enzyme Linked Immunosorbent Assays)
Marcarea Indirecta a Antigenului
Aceasta tehnica este: Foarte sensibila Nu necesita echipament specializat Evita pericolele de radioactivitate
Metoda de conjugare depinde de o enzima demarcare a Ag sau Ac, apoi se adauga substratulpentru a se masura cantitativ in functie de activitateaenzimatica
Reacţia Imuno-Enzimatică(RIE, ELISA/Enzyme Linked Immunosorbent Assays)
ELISA
Reacţia Imuno-Enzimatică(RIE, ELISA/Enzyme Linked Immunosorbent Assays)
Reacţia Imuno-Enzimatică(RIE, ELISA/Enzyme Linked Immunosorbent Assays)
Ac cunoscuţi sunt fixaţi in godeurile placiiSe adauga soluţia de Ag necunoscut
Incubare1hSpălare
Se adaugă Ac marcaţi cu enzimeIncubare de 30 min-1h
SpalareAdaugare substrat cromogen
Metoda sandwich(seroidentificare)
ELISA direct (tehnica dubla Ac):folosita pentru detectarea de Ag. Cunoscutul Ac este imobilizat prin adsorbtie pe
o suprafata din material plastic Se adauga esantionul clasic (in cazul in care este
prezent Ag si se va lega la Ac imobilizat) Se spala excesul Se adauga substratul
Ac specific pentru Ag Se schimba culoarea Daca nu este Nu schimba culoarea
Galben inchis extrem ++ve Galben moderat +ve Culoare mai putina --ve
Dezavantaje: metoda scumpa(pentru fiecare Ag avem nevoie de Acspecific marcat)
AntigeniAntigeni
++
AnticorpAnticorp marcatmarcat cucu enzimeenzime
spalatspalat
++
substratsubstrat
ELISA indirect In acesta varianta, o enzima marcata lg anti-uman
este utilizata pentru a detecta prezenţa de ABSspecifica in serurile de analizat
Cunoscutul Ag este fixat prin adsorbtie pe osuprafata din material plastic
Proba de ser, se adauga (in cazul in care Abspecific este prezent, acesta se va lega fix de Ag).
Se spala Se adauga enzima marcata lg anti-uman Se spala excesul Se adauga substrat, apoi se masoara cantitativ prin
determinarea spectrometrica a gradul de schimbarea culorii.
AntigeniAntigeni
++
AnticorpiAnticorpi
==spalarespalare
++
EnzimeEnzime marcatemarcate lglg
== ++
substratsubstrat
==
ELISA aplicatii
Screening-ul donatorilor de sange pentru evidentiereacontaminarii:
- HIV-1 si HIV-2 (prezenta anticorpilor anti-HIV) hepatita C (prezenta anticorpilor) hepatita B (testarea anticorpilor si antigenilor virali)
Masurarea nivelului hormonilorHCG (test de graviditate)LH (determinarea timpului de ovulatie)TSH, T3 si T4 ( functiunea tiroidei)Hormoni (steroizi anabolizanti, HGH) sportiviDetectarea infectiilor: sifilis, chlamydia,Toxoplasma gondii
Detectarea alergenilor si toxinelor din alimenteMasurarea auto-anticorpilor in bolile autoimmune (lupus erythematosus)Detectarea drogurilor ilicite (cocaina, opiacee, marijuana)
Analize heterogeneautomatizate
Metoda ELISA poate fi automatizataSepararea este un elementcheie în proiectarea testelorimunochimice heterogeneautomatizate
Abordari pentru separarea automatizata Anticorpi imobilizati Captare/filtrare Separare magnetica
Metode de separare magnetica
Fe
Fe
FeFe
Fe
Fe
FeFe
Fe
Metode de separare magnetica
Fe Fe FeFe Fe
Aspirat/spalat
Metode de imobilizare aanticorpilor
Tuburi filmate (acoperite) Bile filmate (acoperite) Metodele anticorpilor in faza solida
Metoda cu tuburi filmateSpecimen Antigen marcat
Spalat
Metoda cu bile filmate
Microparticle enzyme immunoassayMEIA
MEIA este o tehnica in caresuportul fazei solide consta dinmicroparticule foarte mici de lichidin suspensie.
Anticorpii specifici reactiv suntcovalent legati de microparticule
Antigenul, dacă este prezent esteca un “ sandwich”, intre anticorpiilegati si antigenii specifici,anticorpii marcati cu enzima.
Complexele antigen-aticorp suntdetectate prin analiza defluorescenta prin interactiuneaenzima-substrat.
E
E ES P
Matrice fibra de sticla
Anticorp marcat
Analiza imunochimica in fazaomogena
Care este trasatura distinctiva a detectie prin imunochimieomogena Nu necesita separarea liganziilor legati sau liberi
Au metodele omogene vreun avantaj fata de metodeleheterogene? Da
Care sunt acestea? Viteza Adaptabilitate
Analize imunochimiceomogene
Toate imunotestele omogene sunt peprimul loc
Toate imunotestele omogene suntcompetitive
Toate imunotestele omogene suntconcepute pentru antigenii mici Terapeutic/medicamente Steroizi/hormonii peptidici
Proiectarea tipica a analizelorimunochimice in faza omogena
Enzima
S
S P
Fara semnal
Cu semnalEnzima
S
Tehnica imunologica deamplificare cu enzime (EMIT)enzyme multiplied immunoassay technique
Dezvoltata de Corporatia Syva (Palo Alto, CA) in1970s—detinuta in prezent de Behring Diagnostics.
A oferit o alternativa la RIA sau HPLC pentrudeterminarea medicamentelor in urmarirea unor terapii.
A declansat utilizarea pe scara larga a TDM (therapeuticdrug monitoring).
Adaptabila pentru aproape orice analizor de chimie. Are atat aplicatii cantitative (TDM) cat si calitative
(DAU). Testarea antidrog in criminalistica este cea mai
comuna utilizare a metodei EMIT.
Curba semnalul/ concentratie EMITSe
mna
lul(
activ
itate
aen
zim
ei)
Concentratia antigenului
Intervalul deconcentratie functional
Electrochemiluminiscentaimunologica( sistemul Elecsys™ )
Fluxul celulei
Fe
Oxidat
RedusRedus
Imunologia imprastierii luminiiin faza solida
Polarizarea de fluorescenta in analizaimunologica (FPIA)
Dezvoltata de Abbott Diagnostics, aproximativ in acelasitimp cu EMIT care a fost dezvoltata de Syva
O tehnica, care foloseste cresterea polarizarii (depropagarea non-aleatoare de emisie) din emisiilede lumină fluorescenta atunci când un antigen marcatfluorescent este legat de un anticorp reactiv.
Ca si EMIT, primele aplicatii au fost pentru medicamenteutilizate in terapii
In prezent este metoda cea mai utilizata pe scara larga Necesita intrumentul specific
Radiatia polarizata
z
y
z
y
x
z
y
x
Filtrul polarizatorului
Polarizarea de fluorescenta
OHO OH
C
O
O
Fluoresceinain
Orientarea radiatiilor polarizate este mentinuta
out(10-6-10-9 sec)
Polarizarea de fluorescenta
OH O
OH
CO
O
Frecventa de rotatie 1010 sec-1
in
Orientarea radiatiei polarizate NU este mentinuta
out(10-6-10-9 sec)
Dar. . . Fluoresceina
Polarizarea de fluorescenta in analizaimunochimica
OHO OH
C
O
O
Polarizarea mentinutaRotatie lenta
OHO OH
C
O
O
Rotatie rapida
Polarizarea pierduta
Curba semnalul/concentratie FPIASe
mna
l(I /
I )
Concentratia antigenului
Intervalul deconcentratie functional
Cloned enzyme donorimmunoassay (CEDIA)
Dezvoltata de Microgenics (achizitionat deBMC, si cesionate de Roche)
Ambele aplicatii TDM si DAU suntdisponibile
Adaptabil la orice analizor chimic Sunt in prezent cereri de patrundere pe
piata de noi aplicatii EMIT and FPIA
CEDIA™ semnalul/concentratieSe
mna
lul(
activ
itate
aen
zim
ei)
Concentratia antigenului
Intervalul deconcentratie functional
Alte abordari ale analizelorimunologice omogene Metode fluorescente Metode electrochimice Metode enzimatice Imunologia directionata pe enzime
Substrat marcat prinfluorescenta
Enzima
S
S Fluorescenta
Fara semnal
CusemnalEnzima
S
Grupuri imunologice proteice
Enzima
Enzima
P
P
S P
Cu semnal
Fara semnal
Directionarea enzimatica in analizaimunochimica
Ag
E1
E2
Substrat
Produsul 1
Produsul 2
IV
Metode imunochimicede analiza
Reacţia Imuno-Enzimatică
Tehnica imunoblot (western blot)(identificarea Ag sau Ac dintr-un amestec)
• I etapă – electroforeza în gel a probei de Ag• II etapă – transferul electric al Ag pe membrana de
nitroceluloză• III etapă – pe membrană sunt aplicaţi succesiv:
- Ac dirijaţi contra Ag- conjugatul marcat cu enzimăSpălareSe adaugă substratul cromogen
western blot
western blot
RADIO IMUNO-ANALIZA(RIA)
Marker de reactieizotop radioactiv (I125, P32 etc.)
Detectarea activităţii radioactivecontor de scintilaţie (sesizează emisiile β si γ)
Contor deradiatii gamma
picograme (10−12 g) de antigen
Marcarea radioizotopilor
• Advantaje– Flexibilitate– Sensibilitate– Dimensiune
• Dezavantaje– Toxicitate– Perioada de viata– Eliminarea
costurilor
resturile de tirozina dinproteine,
isotopii radioactivi125 I sau 131 I
RIA
Rosalyn YalowRosalyn Yalow sisiSolomonSolomon BersonBerson in 1957in 1957
auau descrisdescris primiiprimii RIARIA
RADIO IMUNO-ANALIZA(RIA)
Testul cantitativ pentru anticorpi
Suportul solid este standardizat prin legarea unui Ag nemarcat şi oconcentraţie standard pentru Ac (marcat cu o substanţăradioactivă)
Proba (necunoscută) care conţine Ac ce trebuie determinat(nemarcat) se adaugă la mediul de reacţie
Concentraţia Ac în proba necunoscută este determinată princitirea comparativă a valorilor pe o curbă standard
Curba este funcţie de gradul de inhibiţie a legării Ac marcat,combinat cu valorile diluţiilor în serie ale cantităţilor cunocute deAc nemarcat
RADIO IMUNO ANALIZA(RIA)
Testul cantitativ pentruantigeni
Metoda de lucru estesimilară
Excepţie: cand antigenulmarcat este folositpentru dozareaantigenului liber dinprobă
RADIO IMUNO-ANALIZA(RIA)
Testul RAST (radioallergosorbent test)
Este o variantă specializată a RIA utilizată pentru a determina
cantitatea de anticorpi IgE sericicare reacţionează cu un alergen cunoscut
PRODUCEREA ANTICORPILORMONOCLONALI
Plasmociteproducatoare de Ac
Antigen
FuzionareacelulelorHIBRIDOM Mielom
Anticorpii monoclonalisunt purificati
Cloneledorite secultiva sausecongeleaza
Testarea clonelor
Hibridoamele se separasi se cultiva
Cultivareahibridoamelor
Mentinereahibridoamelor insoareci
PRODUCEREA ANTICORPILOR MONOCLONALI
Antigenul (celule, componente ale membraneicelulare, microorganisme etc.) se injecteazasoarecelui
Cand titrul de anticorpi serici a crescutcorespunzator, se realizeaza splenectomia si secolecteaza LB
Inginerie geneticaSoareci transgenici
(gene pentru Ig umane)
PROBLEME
• HAMA = human anti-mouse antibodies– Dupa 10-14 zile– Eruptie cutanata (urticarie)– Bronhospasm– Hipotensiune– Soc anafilactic
APLICATIILE ANTICORPILORMONOCLONALI
• Diagnostic– Imunohistochimie– Imunofluorescenta– Radioimunodetectie (RIA)
• Medicamente• Hormoni• Proteine• Toxine• Droguri
– Imunoanaliza enzimatica (ELISA)
Procedee analitice cu anticorpi
• Anticorpii pot fi folositi pentru a detecta patogeni șiorganisme, cum ar fi virusuri, bacterii și mucegaiuri, dar, deasemenea, si la analiza contaminanților alimentari cugreutate moleculară mică.
• Specificitatea unei imunodetectii este în mare măsurădeterminată de specificitatea intrinsecă utilizata pentrudetectarea anticorpilor.
• Există trei tipuri diferite de anticorpi disponibili pentrudezvoltarea metode de analiza: anticorpii policlonali,anticorpii monoclonali si anticorpii recombinanti
Foarte reproductibilReproductibilitatea sistandardizarea dificila
Se poate obtine unanticorp specific plecandde la un antigen impur
Se poate obtine unanticorp specific doarplecandu-se de la unantigen foarte pur
Se produce o singura clasade anticorpi
Exista clase variate deanticorpi policlonali(IgG, IgM etc.)
Contin un sigur anticorp cerecunoaste un singurdeterminant
Contin mai multi anticorpicare recunosc mai multideterminatii aiantigenului
MonoclonaliPoliclonaliA N T I C O R P I I
Ce sunt anticorpi monoclonali si care estescopul lor
• În plus față de sonde genetice, oamenii de stiinta folosescanticorpii monoclonali pentru a dezvolta teste de siguranțăalimentară.
• Anticorpii sunt proteine produse de organism pentru aeticheta/marca “invadatorii” straini.
• Anticorpii monoclonali sunt anticorpi identici produsi încantități mari, în condiții de laborator.
• Atunci cand sunt aplicati la analiza esantioanelor/probelorde produse alimentare, anticorpii pot fi utilizati pentru amarca sau a identifica microbii dăunători și toxinele.
Antigen (Ag) = o substanţă străină capabilă săinducă un răspuns imun
Virusuri Bacterii Fungi Paraziţi Polen Alimente Medicamente
• Un bun antigen:– Are masa moleculară mare
(>5.000 Da)
– este organic
– are structură complexă– este non-self
ANTIGENEANTIGENE –– substansubstanţţee străinestrăine ((nonnon--selfself)) de natură de naturăendoendo-- sau exogenă capabile să sau exogenă capabile să declandeclanşşezeeze ununrăspunsrăspuns imun (umoral, celular, toleranimun (umoral, celular, toleranţţăăimunologicăimunologică, m, memorie imunologicăemorie imunologică, paralizie, paralizieimunologicăimunologică).).
ProprietăProprietăţţileile de bază ale de bază ale AgAg::1.1. ImunogenitateaImunogenitatea –– capacitateacapacitatea AgAg de ade a fifi
recunoscutrecunoscut caca strstrăăinin şşi de ai de a induceinduce răspunsrăspunsimun specificimun specific
2.2. AntigenitateaAntigenitatea (specificitatea)(specificitatea) –– capacitateacapacitateaAgAg de ade a interacinteracţţionaiona specific cu Ac sau cuspecific cu Ac sau cureceptorul pentrureceptorul pentru AgAg complementar alcomplementar allimfocitelor sensibilizatelimfocitelor sensibilizate
In functie de natura chimica:GlucideLipideProteineAcizi nucleiciCompusi sintetici
HAPTENA = o substanţă străină cu masa molecularăsuficient de redusă ca să nu poată produce răspunsimun
• Pentru a produce răspuns imun trebuie să se lege deun carrier - prin cuplare cu haptena → imunogena
Exemplu: Medicamentele = haptene, fiind suficient demici ca să nu fie recunoscute ca fiind străine deorganism. Uneori, acestea se pot lega de exemplu deeritrocite şi devin imunogene.
Exemple de hapteneExemple de haptene:: săruri ale metalelor grelesăruri ale metalelor grele (Cr, Ni),(Cr, Ni),substansubstanţţe de origine vegetalăe de origine vegetală, medicamente, coloran, medicamente, coloranţţi,i,oligonucleotide.oligonucleotide.Superantigene –– molecule proteice particularemolecule proteice particulare(enterotoxinele stafilococice, toxina(enterotoxinele stafilococice, toxina şşocului toxicocului toxicstafilococicstafilococic, t, toxina exfoliativă a stafilocociloroxina exfoliativă a stafilococilor,,nucleocapsida virusului rabic), capabilenucleocapsida virusului rabic), capabile să stimuleze unsă stimuleze unnumăr mare de limfocite Tnumăr mare de limfocite T (10(10--40%). N40%). N –– 0 0.01%..01%. SuperAgSuperAgprovoacă reacprovoacă reacţţii imunopatologiceii imunopatologice..
Se disting arbitrar:Se disting arbitrar:-- AgAg solubilesolubile: proteine plasmatice,: proteine plasmatice, toxinetoxine,, enzime, hormoni,enzime, hormoni, etcetc-- AgAg figuratefigurate (celulare, corpusculare): celule, bacterii,(celulare, corpusculare): celule, bacterii, paraziparaziţţii,,
etc.etc.ÎÎnn funcfuncţţieie dede provenienprovenienţţăă se deosebesc:se deosebesc:-- AgAg heterofileheterofile –– AgAg comune mai multor specii animale. Ex.:comune mai multor specii animale. Ex.: AgAg
polizaharidicepolizaharidice ForssmanForssman, prezent, prezentee îîn hematiile de cal,n hematiile de cal, câinecâine,,oaie, cobai;oaie, cobai; sistemulsistemul RhRh al eritrocitelor seal eritrocitelor se îîntâlnentâlneşştete la omla om şşiimaimumaimuţţeleele MacaccusMacaccus rrhesushesus,, etcetc
Anticorpii artificiali• Imunoglobulinele au o durata de viata
limitata.– Necesita intotdeauna refrigerare– Denaturarea afecteaza afinitatea, aviditate
• Putem crea anticorpi “artificiali” mai stabili?– Recunoasterea moleculara a moleculelor– Amprenta moleculara
Istoria amprentei moleculare
• Linus Pauling (1901-1994)a sugerat mai intai
posibilitatea de obtinere aanticorpilor artificiali in 1940
Bazele interactiunii antigen/anticorp
O
O-
O
O-
NH 3
+CH2-CH2-CH2-CH3
OH
N
NH2
Cl
Amprenta moleculara (Step 1)
N
NO N
NH
O
H 3 C
CH3
N
NO N
N H
O
H 3 C
CH3
Acid metacrilic+ Porogen
Amprenta moleculara (Step 2)
N
NO N
NH
O
H3C
CH3
N
NO N
NH
O
H3C
CH3
Amprenta moleculara (Step 3)
N
NO N
NH
O
H3C
CH3
N
NO N
NH
O
H3C
CH3
Monomer-reactiv initiatorde cross-linking
Amprenta moleculara (Step 4)
Compararea MIP cu anticorpii
• In pregatirea “in vivo”
• Limitat de stabilitate
• Specificitate variabila
• Aplicabilitate generala
• In pregatirea “in vitro”
• Nelimitat de stabilitate
• Specificitate previzibila
• Aplicabilitate limitata
Anticorp MIPs
Analiza Imunochimica utilizandMIPs
• Medicamente in terapii: Teofilina, Diazepam,Morfine, Propranolol, Yohimbine (2-adrenoceptor antagonist)
• Hormoni: Cortisol, Corticosteron
• Neuropeptide: Leu5-enkephalin
• Altele: Atrazina, Methyl--glucoside
FIAFIA -- ANALIZA PRIN INJECTIE IN FLUXANALIZA PRIN INJECTIE IN FLUXSIASIA -- ANALIZA PRIN INJECTIE SECVENTIALAANALIZA PRIN INJECTIE SECVENTIALA
SISTEME DE ANALIZA IN FLUX
FIAFIA –– DEFINITIIDEFINITII
DEFINITIADEFINITIA ((ACADEMICAACADEMICA)):: informatiile adunateinformatiile adunate dedela un gradient dela un gradient de concentratieconcentratie formatformat intrintr--oo zonazonainjectatainjectata,, binebine definitadefinita aa fluxuluifluxului,, dispersatdispersat intrintr--unun curentcurent continuucontinuu,, nesegmentatnesegmentat alal unuiunuipurtatorpurtator..
DEFINITA (PRACTICA):DEFINITA (PRACTICA): oo tehnologietehnologie analiticaanaliticasimplasimpla sisi multilateralamultilaterala pentrupentru analizeanalize chimicechimiceumedeumede automatizateautomatizate,, bazatabazata pepe manipulareamanipulareafizicafizica sisi chimicachimica aa uneiunei probeprobe dispersatedispersate intrintr--oozonazona,, formataformata prinprin injectiainjectia probeiprobei intrintr--unun curentcurentpurtatorpurtator, fluid, fluid sisi detectatdetectat inin avalaval..
DIAGRAMA FIADIAGRAMA FIAANALIZA PRIN INJECTIE IN FLUXANALIZA PRIN INJECTIE IN FLUX
COMPONENTE:COMPONENTE: 1. POMPA:1. POMPA: 2.2. DETECTOR:DETECTOR: 3. TUB INGUST, PERFORAT;3. TUB INGUST, PERFORAT; 4. VALVA DE INJECTIE.4. VALVA DE INJECTIE. ATRIBUTE:ATRIBUTE: 1)1) principiiprincipii fundamentalefundamentale
usorusor dede intelesinteles sisi dedeimplementatimplementat;;
2)2) aparateaparate sisi instrumenteinstrumenteusorusor dede asamblatasamblat sisimanipulatmanipulat;;
3)3) automatizareautomatizare manualamanuala aamultormultor proceseprocese analiticeanaliticechimicechimice umedeumede..
DIAGRAMA SIADIAGRAMA SIAANALIZA PRIN INJECTIE SECVENTIALAANALIZA PRIN INJECTIE SECVENTIALA
COMPONENTE:COMPONENTE: 1. POMPA BI1. POMPA BI--
DIRECTIONALA;DIRECTIONALA; 2. VALVA DE SELECTIE;2. VALVA DE SELECTIE; 3. DETECTOR.3. DETECTOR. ATRIBUTE:ATRIBUTE: 1) hardware1) hardware maimai simplusimplu
decatdecat la FIA (ola FIA (o pompapompa, o, ovalvavalva sisi un detector);un detector);
2)2) uzuz eficienteficient dede reactivireactivi sisiminimizareaminimizarea deseurilordeseurilor;;
3)3) manipularemanipulare sisiimplementareimplementare simple.simple.
ETAPELE FIAETAPELE FIA 1.1. PREPARAREA PROBELORPREPARAREA PROBELOR:: probaproba esteeste masuratamasurata sisi
injectatainjectata inin curentulcurentul purtatorpurtator fluidfluid –– prinprin valvavalva dedeinjectieinjectie..
CalitatileCalitatile uneiunei valvevalve:: - precizie;- schimbarea rapida asensului;- limite de presiune (cca. 100 psi);- abilitateade a injecta volume mici de proba.
2.2. PROCESAREA PROBEIPROCESAREA PROBEI –– ETAPA CHEIEETAPA CHEIE::transformarea analitului intr-o specie masurabila dedetector, a carei concentratie poate fi manipulata intr-un interval compatibil cu detectorul.
DilutiaDilutia:: 1.1. dispersiadispersia;;•• 2.2. dilutiadilutia electronicaelectronica;;•• 3.3. preparareaprepararea pepe zone;zone;•• 4. camera cu gradient;4. camera cu gradient;•• 5.5. dispozitivedispozitive dede preparareaprepararea membranelormembranelor (MSD(MSD).).
3.3. DETECTIA: analitul genereaza un pic-semnal, folositpentru a cuantifica compusul care trebuie determinat.
DISPERSIADISPERSIA Proces complex, definit ca un amestec dinamic siProces complex, definit ca un amestec dinamic si
reproductibil de probe cu un reactiv si/sau purtator,reproductibil de probe cu un reactiv si/sau purtator,datorat modelelor debitului, creat de dinamicadatorat modelelor debitului, creat de dinamicafluidelor prin tubul ingust.fluidelor prin tubul ingust.
TipuriTipuri dede dispersiedispersie FIA/SIA:FIA/SIA:• 1. axiala – are loc in directia fluxlui si determina o dilutie si o
largire a picului mai mare decat cea radiala;• 2. radiala – este determinata de modelele fluxului/debitului in
curentul care circula normal in directia fluxului, datoritaacestuia avand loc o dilutie si o largire a picului minime.
EfectulEfectul geometrieigeometriei reactoruluireactorului asupraasupra dispersieidispersiei:: esteestedramaticdramatic asupraasupra piculuipicului..
DILUTIA ELECTRONICADILUTIA ELECTRONICA DILUTIA ELECTRONICADILUTIA ELECTRONICA
SIMPLASIMPLA –– tehnicatehnica dede masuraremasurareaa semnaluluisemnalului analiticanalitic inainteinainte dedeaparitiaaparitia piculuipicului detectoruluidetectorului..SemnalulSemnalul esteeste masuratmasurat lala piculpiculmaxim (tmaxim (t11).).
TimpulTimpul masurariimasurarii semnaluluisemnaluluitrebuietrebuie sasa fiefie controlatcontrolat cucuprecizieprecizie pentrupentru caca aceastaaceastatehnicatehnica sasa meargamearga binebine..
DEZAVANTAJDEZAVANTAJ:: datoritaerorilor inerente care apar lamasurarea semnalului (eroridatorate schimbarilor slabe inpozitia picurilor), aceastatehnica este cea mai putinprecisa.
PREPARAREA PE ZONEPREPARAREA PE ZONE PRINCIPIUL 1PRINCIPIUL 1–– cu primacu prima valvavalva esteeste injectatainjectata oo probaproba relativrelativ
mare, caremare, care curgecurge inin avalulavalul curentuluicurentului,, dispersatdispersat inin zonazona dedereactiereactie.. PePe masuramasura cece probaproba dispersatadispersata umpleumple celcel maimai micmicorificiuorificiu alal celeicelei dede--aa douadoua valve, un altvalve, un alt volumvolum dede probaproba esteesteinjectatinjectat inin curentulcurentul purtatorpurtator, care, care trecetrece prinprin zonazona dede reactiereactiepentrupentru oo viitoareviitoare dispersiedispersie sausau dilutiedilutie..
PRINCIPIUL 2PRINCIPIUL 2 –– indepartareaindepartarea uneiunei partiparti dindin piculpicul primeiprimei injectiiinjectiisisi injectareainjectarea luilui in alin al doileadoilea purtatorpurtator.. SincronizareaSincronizarea celorcelor 2 valve2 valveesteeste deosebitdeosebit dede importantaimportanta..
CAMERA CU GRADIENTCAMERA CU GRADIENT CAMERA CU GRADIENTCAMERA CU GRADIENT ––
dispozitivdispozitiv simplusimplu pentrupentrudilutiadilutia in FIAin FIA sisi SIA. CameraSIA. Cameracu gradientcu gradient esteeste un vasun vas micmicdede amestecareamestecare ((volumvolum de 1de 1mLmL sausau maimai putinputin), cu o), cu o barabaraagitatoareagitatoare, o, o guragura dede admisieadmisiesisi unauna dede evacuareevacuare pentrupentrucurentulcurentul purtatorpurtator..
PRINCIPIULPRINCIPIUL -- probaproba esteesteinjectatainjectata inin purtatorpurtator sisi trecetreceprintrprintr--oo dispersiedispersie largalarga,,deoarecedeoarece sese amestecaamesteca cucu celcelmaimai maremare volumvolum dede purtatorpurtatorin camera cu gradient.in camera cu gradient.
TIPURI DE MEMBRANETIPURI DE MEMBRANE 1.1. MEMBRANELE POROASEMEMBRANELE POROASE –– transportultransportul
dede masamasa are locare loc prinprin difuziadifuzia analituluianalitului prinprinporipori. Se. Se folosescfolosesc membrane cumembrane cu analitianalitivolatilivolatili: NH: NH33, H, H22SS sisi HCN.HCN.
2.2. MEMBRANELE NEPOROASEMEMBRANELE NEPOROASE –– analitulanalitul sesedizolvadizolva inin membranamembrana sisi difuzeazadifuzeaza prinprinstructurastructura pereteluiperetelui,, panapana lala curentulcurentulreceptor.receptor. ConditieConditie:: analitulanalitul trebuietrebuie sasa aibaaibaoo solubilitatesolubilitate maimai mare inmare in curentulcurentulreceptorreceptor decatdecat inin membranamembrana. Tip de. Tip demembranamembrana:: cauciuculcauciucul siliconicsiliconic..
3.3. MEMBRANELE IONICEMEMBRANELE IONICE –– transportultransportulionicionic miscamisca analitulanalitul dede--aa lungullungulmembraneimembranei.. MembranaMembrana ceacea maimai desdesfolositafolosita esteeste NAFION (NAFION (polimerpolimer perfluoroperfluoro--hidrocarbonathidrocarbonat cucu grupegrupe de acidde acid sulfonicsulfonic),),carecare transportatransporta cationiicationii micimici,, monovalentimonovalenti::NHNH44
++ sisi HH++..
DISPOZITIVE DE PREPARAREADISPOZITIVE DE PREPARAREAMEMBRANELOR (MSD)MEMBRANELOR (MSD)
MSD – sunt proiectate cucanale pentru 2 curentifluizi, un curent donor siunul acceptor, separati deo membrana subtire.TIPURI:
1. MSD TIP PLANSAINTINSA –pe fetele planseiintinse sunt taiate canalepentru curentii donor siacceptor, iar membranaeste introdusa intrecanalele plansei.
DISPOZITIVE DE PREPARAREADISPOZITIVE DE PREPARAREAMEMBRANELOR (MSD)MEMBRANELOR (MSD)
2. MSD TIP TUB IN2. MSD TIP TUB INCOAJACOAJA – membranadin fibre, cu o “coaja”concentrica in jurulei. Curentul receptoreste pompat prinscobitura de fibre, iarcurentul donor princoaja.
DISPOZITIVE DE IMBOGATIRE ADISPOZITIVE DE IMBOGATIRE AMEMBRANELORMEMBRANELOR
ImbogatireaImbogatirea sisi analizeleanalizele presupunpresupun 22 etapeetape::
1.1. COLECTARECOLECTARE –– valva estemutata in pozitia care directioneazacurentul purtator prin deschidereaby-pass; in aceasta faza, purtatoruleste stationar in tubul MSD si iipermite analitului sa se acumuleze sisa se concentreze in purtator. DupaDupatrecereatrecerea unuiunui timptimp adecvatadecvat pentrupentruimbogatireaimbogatirea suficientasuficienta aa purtatoruluipurtatoruluicucu analitanalit,, valvavalva esteeste schimbataschimbata pentrupentruceacea dede--aa douadoua etapaetapa..
2.2. REVARSAREREVARSARE –– purtatorulpurtatorulcurgecurge prinprin MSD,MSD, revarsandurevarsandu--seseinin zonazona probeiprobei dindin avalaval,, pentrupentruaa aveaavea locloc reactiilereactiile chimicechimice sisi aafifi detectatadetectata..
DISPOZITIVE DE IMBOGATIRE ADISPOZITIVE DE IMBOGATIRE AMEMBRANELORMEMBRANELOR
MiniMini--coloanacoloana esteeste instalatainstalatadede--aa lungullungul orificiilororificiilor opuseopuseuneiunei valve devalve de injectieinjectie cu 6cu 6orificiiorificii. Se. Se pozitioneazapozitioneazavalvavalva,, curentulcurentul cucu probaprobacurgecurge prinprin coloanacoloana panapana lalairosireirosire,, iariar analitulanalitul esteesteantrenatantrenat pepe coloanacoloana.. ValvaValvaesteeste schimbataschimbata sisi eluentuleluentulcurgecurge prinprin coloanacoloana,,antrenandantrenand analitulanalitul cece curgecurgeinin avalaval undeunde fuzioneazafuzioneaza cucuunun curentcurent dede reactivreactiv pentrupentru aaaveaavea locloc reactiilereactiile chimicechimice sisidetectiadetectia..
CHIMISMUL FIACHIMISMUL FIA--FIA CU UN SINGUR CURENTFIA CU UN SINGUR CURENT--
UnUn curentcurent continandcontinandreactivulreactivul esteeste pompatpompatprinprin sistemsistem. Un. Un volumvolum dedeprobaproba esteeste injectatinjectat inincurentcurent sisi dispersiadispersiadeterminadetermina amestecareaamestecareareactivuluireactivului cucu probaproba,,conducandconducand lala reactiireactiiintreintre analitanalit sisi reactivreactiv inintimptimp cece probaproba trecetrece prinprinreactorreactor sisi apoiapoi prinprindetector.detector.
FIA CU DOI CURENTIFIA CU DOI CURENTI
Proba este injectata inprimul curent, continandreactivul R1. Analitulreactioneaza cu reactivulgenerand un intermediar.La amestecarea cucurentul in aval,intermediarul reactioneazacu reactivul R2, formandprodusul care estemasurat in detector.
EXEMPLU: determinareacianurii prin reactia Konig.
FIA CU TREI CURENTIFIA CU TREI CURENTI
Proba este injectata intr-un purtator ce continereactivul R1. Produsulacestei reactii seamesteca cu reactivul R2,in aval pentru a forma unal doilea intermediar.Acest intermediar seamesteca cu reactivul R3in aval formandu-seprodusul final, ce estemasurat de detector.
EXEMPLU: determinareaurmelor de amoniac.
COMPARATIECOMPARATIE 1. FIA1. FIA folosestefoloseste oo valvavalva dedeinjectieinjectie,, pepe candcand SIASIA folosestefolosesteunauna dede selectieselectie..
2. FIA face2. FIA face uzuz de ode o pompapompaperistalticaperistaltica, in, in timptimp cece la SIAla SIAaceastaaceasta esteeste inlocuitainlocuita dede unaunapentrupentru irigatiiirigatii sisi oo serpentinaserpentina dedesustineresustinere..
3. La FIA, o3. La FIA, o prizapriza dede probaprobanedispersatanedispersata esteeste introdusaintrodusaintrintr--unun curentcurent purtatorpurtator, in, in timptimpcece la SIAla SIA dispersiadispersia incepeincepe sasaaibaaiba loc inloc in timpultimpul aspirariiaspirariiprobeiprobei inin serpentinaserpentina dedesustineresustinere. In. In acestacest cazcaz,,schimbareaschimbarea fluxuluifluxului ininmomentulmomentul trimiteriitrimiterii probeiprobei sprespredetectordetector joacajoaca unun rolrol importantimportantinin amestecareaamestecarea probeiprobei cucupurtatorulpurtatorul..
DISPERSIA IN FIA SI SIADISPERSIA IN FIA SI SIA DiagramaDiagrama descriedescrie cece sese
petrecepetrece inin momentulmomentul injectariiinjectariiprobeiprobei (1)(1) intrintr--unun procesproces FIAFIAsisi inin timpultimpul inversariiinversarii fluxuluifluxuluiintrintr--unun procesproces SIA,SIA, precumprecum sisilala catevacateva secundesecunde dupadupa cecepurtatorulpurtatorul aa inceputinceput sasa mistemisteprobaproba sprespre detector (2).detector (2).
AcestAcest fenomenfenomen poatepoate face caface caunun picpic in SIAin SIA sasa aratearate putinputindiferitdiferit dede unulunul din FIA.din FIA.
DacaDaca intreintre probaproba sisi reactivreactiv aaavutavut loc oloc o amestecareamestecare bunabuna,,cuantificareacuantificarea vava aveaavea locloccorespunzatorcorespunzator. In plus,. In plus,inversareainversarea fluxuluifluxului contribuiecontribuiesemnificativsemnificativ lala amestecareaamestecareazonelorzonelor dede interesinteres..
AVANTAJELE SIAAVANTAJELE SIA CantitateaCantitatea dede reactivreactiv folositfolosit esteeste redusaredusa drastic.drastic. VarietateaVarietatea dede debitedebite esteeste simplasimpla sisi robustarobusta,, incluzandincluzand oo
pompapompa, o, o valvavalva dede selectieselectie sisi un detectorun detector conectatconectat printrprintr--un tub.un tub. AceastaAceasta configuratieconfiguratie poatepoate fifi folositafolosita prinprinschimbareaschimbarea programuluiprogramului dede debitaredebitare la ola o multitudinemultitudine dedereactiireactii chimicechimice maimai degrabadegraba decatdecat prinprin schimbareaschimbareainstalatiilorinstalatiilor dede apaapa, a, a tevilortevilor; de; de aceeaaceea,, mentinereamentinereaanalizoruluianalizorului esteeste simplificatasimplificata..
ValvaValva dede selectieselectie inlocuiesteinlocuieste valvavalva dede injectieinjectie sisi asiguraasiguraselectiaselectia diferitilordiferitilor curenticurenti dede probaproba sisi calibranticalibranti,, acestacestlucrulucru facandfacand posibilaposibila folosireafolosirea unorunor metodemetode automatizateautomatizatedede calibrarecalibrare..
ComponenteleComponentele utilizateutilizate in SIA sein SIA se preteazapreteaza lala operatiioperatii dedelaboratorlaborator, camp de, camp de lucrulucru sisi proceseprocese dede fabricarefabricare..
ECHIPAMENT PENTRU SIAECHIPAMENT PENTRU SIA COMPONENTECOMPONENTE:: 1.1. POMPA – Tipuri: a) pompe de
irigatie; Cerinte: precizie, reproductibilitate,
bi-directionale, capabile sa masoarevolume mici de proba;
• b) pompe peristaltice.
2. VALVA DE SELECTIE2. VALVA DE SELECTIE –– tip multitip multi--pozitionalepozitionale..
3. REACTORUL SI BOBINA DE3. REACTORUL SI BOBINA DESUSTINERE;SUSTINERE;
4. DETECTORUL4. DETECTORUL –– trebuietrebuie sasa fiefiedotatdotat cu ocu o celulacelula de debit (flux).de debit (flux).
5. SOFTWARE5. SOFTWARE -- punctulpunctul cheiecheie esteesteprogramulprogramul dede reglarereglare aa debitelordebitelor..
TIPURI DE DETECTORI SI TEHNICI SIATIPURI DE DETECTORI SI TEHNICI SIA
DETECTORIDETECTORI:: FOTOMETRICI UV, VIZ, IRFOTOMETRICI UV, VIZ, IR FLUORESCENTAFLUORESCENTA CHEMILUMINESCENTACHEMILUMINESCENTA pHpH ELECTROZI ION SELECTIVIELECTROZI ION SELECTIVI CONDUCTIVITATECONDUCTIVITATE AMPEROMETRIEAMPEROMETRIE ANALIZE DE STRIPINGANALIZE DE STRIPING
POTENTIONOMETRICPOTENTIONOMETRIC ALTE TEHNICIALTE TEHNICI
ELECTROCHIMICEELECTROCHIMICE
TEHNICI:TEHNICI: DILUTIADILUTIA IMBOGATIREA URMELORIMBOGATIREA URMELOR MASCAREA CHIMICAMASCAREA CHIMICA AJUSTAREA pHAJUSTAREA pH--ULUI;ULUI; COLOANE IN MINIATURACOLOANE IN MINIATURA
PENTRU SCHIMBAREAPENTRU SCHIMBAREAMEDIULUIMEDIULUI
SCHIMBAREA DE FAZESCHIMBAREA DE FAZEFOLOSIND MSDFOLOSIND MSD
FOLOSIREA DE REACTIVIFOLOSIREA DE REACTIVISOLIZISOLIZI
TITRAREATITRAREA
VALIDAREA METODELOR ANALITICEVALIDAREA METODELOR ANALITICE
ValidareaValidarea MetodeiMetodei AnaliticeAnalitice CeCe reglementarireglementari,, ghidurighiduri proceduriproceduri seseaplicaaplica?? CeCe anumeanume sese valideazavalideaza?? CeCe implicaimplica validareavalidarea metodeimetodei?? CeCe impactimpact vava aveaavea validareavalidarea ((sausau lipsalipsaeiei)?)? CandCand esteeste obligatorieobligatorie validareavalidarea??
ConcepteConcepte** ValidareaValidarea esteeste unun procesproces dede determinaredeterminare aapotriviriipotrivirii (suitability)(suitability) uneiunei proceduriproceduri datedate pentrupentrufurnizareafurnizarea dede rezultaterezultate analiticeanalitice utile.utile.** ValidareaValidarea uneiunei metodemetode analiticeanalitice esteeste ininprincipalprincipal legatalegata de:de: identificareaidentificarea surselorsurselor dede erorierori potentialepotentiale cuantificareacuantificarea erorilorerorilor potentialepotentiale aleale metodeimetodei* O* O validarevalidare descriedescrie inin termenitermeni matematicimatematici sisicuantificabilicuantificabili performanteleperformantele caracteristicecaracteristice alealeuneiunei masurarimasurari..* O* O metodametoda carecare esteeste validavalida intrintr--oo situatiesituatie poatepoatefifi invalidatainvalidata inin altaalta situatiesituatie
DefiniţiiValidarea(a) Confirmare prin furnizare de dovezi obiective că aufost îndeplinite cerinţele pentru o anumită utilizare sau oaplicaţie intenţionată.Note: 1. Termenul „validat” este utilizat pentru adesemna această stare.
2. Cerinţele de utilizare pentru validare pot fi realesau simulate.
Standardul SR EN ISO 9000:2001, ASRO, Bucureşti, 2001
(b) Este o evaluare sistematică a unei proceduri analiticeîn scopul determinării faptului că are suport/bazaştiinţific/a în condiţiile în care va fi aplicată.
Ghidul Eurachem/WELAC „Acreditarea pentru laboratoarele chimice”, 1993
NeintelegeriNeintelegeri CurenteCurente
ValidareaValidarea masurariimasurarii OptimizareaOptimizareamasurariimasurarii CuantificareaCuantificarea masurariimasurarii
OO metodametoda validatavalidata NUNU esteeste in modin mod necesarnecesaroo metodametoda performantaperformanta
RepetareaRepetarea uneiunei masurarimasurari de unde un numarnumar dedeoriori nunu constituieconstituie validareavalidarea eiei
CumCum evolueazaevolueaza oo metodametoda analiticaanalitica
Optimization
Validare
Implementare
Elaborare
Revalidare
Pre-Validare
Frecvent, dezvoltarea metodei poate implica activitatea pe un numărmare de idei diferite, simultan şi, în final, se alege ce mai bună.
Studiul de literaturăStudiul compuşilor, caracteristici,
reactivi etc.
Primirea cerinţelorclientului
Dezvoltarea metodei
Pregătirea schiţei metodeiPregătirea protocolului de
validare
Validarea metodei urmândprotocolul
Revizuirea datelor devalidare
Întocmirea raportului de validare ametodei
Trimiterea raportuluide validare şi adatelor la client
Etapele procesului de validare a unei metode analiticeelaborate la solicitarea unui client
În afara acestor etape principale mai pot exista două etapesecundare: modificarea şi testarea. Toate aceste etape au la bazăînregistrări care le permit trecerea de la o etapă la alta.
Plan de re(validare)
Metodadezvoltată
/extinsă
Decide potrivireapentru scop
Implementarea/Verificareaperformanţelor locale (EQ)
Verificarea continuă aperformanţei (QC/QA)
Modificareautilizării
Metoda nouă
OO altă formulare a ciclului de altă formulare a ciclului de vviaiaţţăă al unei metode analitice validateal unei metode analitice validate
Organismelor de reglementare europene şi internaţionale şi ghidurile şistandarde lor pe diferite aspecte ale AQA.
TestareaTestarea capabilităcapabilităţţiiiiAcreditareaAcreditarea
International Laboratory Accreditation CooperationInternational Laboratory Accreditation CooperationILACILAC
Organization Codex Committee on Method of AnalysisOrganization Codex Committee on Method of Analysisand Samplingand Sampling
CODEX/ CCMASCODEX/ CCMASValidarea metodei analiticeValidarea metodei analiticeInternational Conference on HarmonizationInternational Conference on HarmonizationICHICH
Japanese PharmacopoeiaJapanese PharmacopoeiaJPJPUnited States PharmacopoeiaUnited States PharmacopoeiaUSPUSP
Validarea metodei analiticeValidarea metodei analiticeFood and Agricultural Organization/ World HealthFood and Agricultural Organization/ World HealthFAO/WHOFAO/WHOValidarea metodeiValidarea metodeiUnited States Foods and Drug AdministrationUnited States Foods and Drug AdministrationFDAFDA
Controlul intern al calităControlul intern al calităţţiiiiTestareaTestarea capabilităcapabilităţţiiiiAcreditareAcreditare
Association of Official Analytical ChemistsAssociation of Official Analytical ChemistsAOACAOACInternationalInternational
StandardizareStandardizareInternational Standardization OrganizationInternational Standardization OrganizationISOISOValidarea metodei analiticeValidarea metodei analiticeInternational Union of Pure and Applied ChemistryInternational Union of Pure and Applied ChemistryIUPACIUPACStandardizareStandardizareEuropean Committee for NormalizationEuropean Committee for NormalizationCENCENAcreditareAcreditareEuropean Cooperation for AccreditationEuropean Cooperation for AccreditationEAEA
TestareaTestarea capabilităcapabilităţţiiiiAsigurarea calităAsigurarea calităţţiiii
Cooperation of International Traceability in AnalyticalCooperation of International Traceability in AnalyticalChemistryChemistry
CITACCITACValidarea metodeiValidarea metodeiAsociationAsociation ofof European AnalyticalEuropean Analytical ChemistsChemistsEurachemEurachem
DomeniulDomeniulDenumirea completă a organismuluiDenumirea completă a organismuluiOrganismulOrganismul(abreviat)(abreviat)
ParametriiParametrii esentialiesentiali aiai validariivalidarii
ValidareaValidareaMetodeiMetodei
BioanaliticeBioanalitice
Exactitatea
Precizia
Liniaritatea
Efectul de matrice
Integritatea
Specificitatea
Robustetea
Reproductibilitatea
CriteriileCriteriile dede AcceptareAcceptare
TrebuieTrebuie stabilitestabilite criteriilecriteriile specificespecifice dedeacceptareacceptare pentrupentru fiecarefiecare parametruparametru
CriteriulCriteriul dede acceptareacceptare vava fifi diferitdiferit pentrupentruprobeprobe diferitediferite
CriteriileCriteriile dede acceptareacceptare trebuietrebuie sasa fiefiestabilitestabilite inin pespectivapespectiva utilizariiutilizariirezultatelorrezultatelor
CandCand esteeste necesaranecesara validareavalidareacompletcompletăă, par, parţţialialăă,, îîncrucincrucişşatatăă
efecteleefectelecong./cong./decongelariidecongelarii duratadurata dede incubareincubare temperaturatemperatura dedeincubareincubare vechimeavechimea reactivilorreactivilor preparareaprepararea probeiprobei stocareastocarea probeiprobei
numarulnumarul dede pasajepasajecelularecelulare
loturileloturile dedemedicamentemedicamenteadministrateadministrate
variabilitateavariabilitateaserumuluiserumului provenindprovenindde lade la diferitediferite animaleanimale
variabilitateavariabilitatea dintredintrepacientipacienti
Reproductibilitatea: modificari nedoriteStabilitatea: modificari deliberate
CCaandnd esteeste necesaranecesara validareavalidareacompletcompletăă, par, parţţialialăă,, îîncrucincrucişşatatăă
CandCand sese dezvoltadezvolta oo metodametodapentrupentru primaprima oaraoara
PentruPentru unun nounou medicamentmedicament DacaDaca unun metobolitmetobolit sese
adaugaadauga la ola o metodametodaexistentaexistenta
TransferulTransferul intreintre laboratoarelaboratoare TransferulTransferul intreintre analistianalisti MatriciMatrici rarerare SchimbariSchimbari lala nivelulnivelul matriciimatricii ((urinaurina--plasma; plasmaplasma; plasma
umanaumana--plasmaplasma animalaanimala))
SchimbareaSchimbarea procesuluiprocesului dedesamplingsampling
SchimbareaSchimbarea inin volumulvolumul probeiprobei SchimbariSchimbari inin domeniuldomeniul de conc.de conc. SchimbareaSchimbarea instrumentuluiinstrumentului
analiticanalitic (GC/MS(GC/MS--LC/MS)LC/MS)
SchimbareaSchimbarea sistemuluisistemului dededetectiedetectie (UV(UV--MS)MS)
AdministrareaAdministrarea concomitentaconcomitenta dedemedicamentemedicamente
DiferiteDiferite metodemetode analiticanalitic utilizateutilizateprentruprentru acelasiacelasi componentcomponent intrintr--unun singursingur studiustudiu sausau inin diferitediferitestudiistudii
(Bio)(Bio) StandardeStandarde CareCare vava fifi standardulstandardul dede lucrulucru ?? AcestAcest standardstandard vava fifi suficientsuficient pentrupentru aa fifi facutefacute toatetoate
activitatileactivitatile de prede pre--validation,validation, protocolulprotocolul dede validarevalidare sisitoatetoate analizeleanalizele probelorprobelor pentrupentru prepre--clinicclinic sisi clinic ?clinic ?
CareCare esteeste stabilitateastabilitatea standarduluistandardului ?? CandCand trebuitrebui preparatpreparat standardulstandardul ? de? de fiecarefiecare datadata candcand sese
faceface analizaanaliza sausau poatepoate fifi utilizatutilizat dupadupa stocarestocare ((prinprininghetareinghetare) ?) ?
SeSe poatepoate masuramasura standardulstandardul pentrupentru fiecarefiecare tip detip de probaproba ininmatriceamatricea respectivarespectiva ??
Cum seCum se coreleazacoreleaza concentratiaconcentratia standarduluistandardului ? Cum se? Cum sepoatepoate determinadetermina lala inceputinceput, la, la mijlocmijloc sisi lala sfarsitulsfarsitultrasarariitrasararii curbeicurbei standard ?standard ?
AdaugareaAdaugarea standarduluistandardului inin probaproba farafara diluarediluare poatepoate fififacutafacuta directadirecta ??
PreciziaPrecizia StandardelorStandardelor IndustrialeIndustriale((EuropeneEuropene))
Enzyme based assayEnzyme based assay <10%<10% ELISAELISA 1010--20%20% Cell based assayCell based assay aproxaprox. 25%. 25% Animal assayAnimal assay 2020--50%50% Virus plaque assayVirus plaque assay 330% (0.5 log)330% (0.5 log) Target for cell basedTarget for cell based <50%<50%
TestulTestul pentrupentru PParalelismaralelism
Cand se traseazagraficul logaritmic alraspunsului analitic alunei serii de dilutii alesubstantei de referinta(standardului) si a uneiserii de dilutii aleprobei trebuie saobtinem curbe paralele
ParametriParametri SSpecificipecifici lala AnalizaAnaliza CCelulelorelulelor
-- sursasursa dede celulecelule((inceputulinceputul,, mijloculmijlocul sausau sfarsitulsfarsitul inghetariiinghetarii))
-- nivelulnivelul pasajuluipasajului utilizatutilizat-- densitateadensitatea celulelorcelulelor stocstoc
(cat(cat timptimp pentrupentru sedimentaresedimentare))-- varstavarsta celulelorcelulelor (de(de catecate zilezile suntsunt inin culturacultura))-- timpultimpul dede incubareincubare-- recipientulrecipientul-- lotullotul dede mediumediu dede culturacultura folositfolosit-- sursasursa dede reactivireactivi
Rolul validării în asigurarea calităţii în laboratoareleanalitice de măsurare şi încercare
Validarea unei metode analitice este o investigaţie în ceea ce priveştefaptul că scopul analitic al unei metode este atins, obţinându-serezultate analitice cu un nivel de incertitudine acceptabil.
Validarea analitică (validarea metodei, validarea instrumentaţiei,validarea soft-urilor, validarea personalului) reprezintă primul nivel alasigurării calităţii (QA) în laborator.
Validarea este necesară pentru orice metodă nouă; pentru un anumit tipde material şi un anumit domeniu de concentraţii de operare, metodatrebuie să fie capabilă să rezolve o problemă analitică etc.
Revalidarea este necesară ori de câte ori un component al sistemuluianalitic este modificat sau dacă există indicaţii că metoda stabilită nufuncţionează corect.
a. Laboratorul utilizează o metodă validată complet.Metoda a fost studiată într-un studiu colaborativ şi, din acest motiv,laboratorul trebuie să verifice dacă este capabil să asigurecaracteristicile de performanţă ale metodei publicate (sau altfel spus,dacă este capabil să îndeplinească cerinţele sarcinii analitice). Înacest caz, laboratorul ar trebui să efectueze studii de precizie, studiide adecvare (incluzând studii de variaţie ale matricei) şi posibil studiide liniaritate, iar anumite teste, cum ar fi cel de robusteţe, ar putea fiomise.
b. Laboratorul utilizează o metodă o metodă validatăcomplet, dar apare o nouă matriceMetoda a fost studiată într-un studiu colaborativ şi din acest motiv,laboratorul trebuie să verifice dacă nu cumva noua matrice nuintroduce noi surse de erori în sistem. În acest caz, laboratorul artrebui să efectueze studii de adecvare (incluzând studii de variaţii alematricei) şi posibil studii de liniaritate.
c. Laboratorul utilizează o metodă bine stabilită, darnestudiată colaborativÎn acest caz laboratorul ar trebui să efectueze studii de precizie,studii de adecvare şi posibil, studii de liniaritate.
d. Metoda a fost publicată în literatura de specialitateîmpreună cu câteva caracteristici analiticeÎn acest caz, laboratorul ar trebui să efectueze studii de precizie,studii de adecvare (incluzând studii de variaţii ale matricei), studii deliniaritate şi robusteţe.
e. Metoda a fost publicată în literatura de specialitate fărăcaracteristici analitice sau a fost dezvoltată „in house”.În acest caz, laboratorul ar trebui să efectueze studii de precizie,studii de adecvare (incluzând studii de variaţii ale matricei), studii deliniaritate şi robusteţe.
f. Metoda este empiricăO metodă empirică este aceea în care cantitatea estimată esterezultatul găsit prin aplicarea procedurii stabilite ca atare. Aceasta sedeosebeşte de metodele în care măsurările care au drept scop de aevalua cantităţi independente, cum ar fi concentraţia unui anumitanalit într-o probă, la care potrivirea (adecvarea) metodei esteconvenţional zero şi variaţia matricei este irelevantă (aceea este înclasa definită).
g. Analiza ad-hocAnaliza ad-hoc este necesară ocazional pentru a stabili, în general,domeniul unei valori fără prea mari cheltuieli şi cu exigenţă scăzută.Efortul care trebuie făcut pentru validare este în consecinţă strictlimitat. În acest caz, adecvarea trebuie studiată prin metode cum ar fiestimarea recuperării sau adiţiilor multiple de analit, iar precizia dinmăsurări repetate.
h. Modificări ale analitului sau echipamentului
Având în vedere activitatea complexă dintr-un laborator, pot existaurmătoarele situaţii care să impună efectuarea de studii de validare:-modificări majore pe care le suferă instrumentele;-loturi noi sau foarte variabile de reactivi;-schimbări efectuate în încăperile laboratorului;-metode utilizate pentru prima dată de către analişti noi;-metodă validată folosită după o perioadă de întrerupere.
În acest caz acţiunea esenţială este să se demonstreze că nici oînrăutăţire nu s-a produs. Verificarea minimă constă într-un test depotrivire singular ce presupune un experiment de verificare înainteşi după modificarea survenită pe un material de control sau detestare.
Selectivitatea = abilitatea metodei analitice sau bioanalitice de adiferenţia şi măsura analiţii în prezenţa componenţilor care suntaşteptaţi a fi prezenţi.Specificitatea = abilitatea de a evalua, fără echivoc, analitul înprezenţa componenţilor care sunt aşteptaţi a fi prezenţi.
Un alt termen înrudit este confirmarea identităţii = dovada căsemnalul măsurat, care a fost atribuit, se datorează numai analitului şinu prezenţei a ceva chimic sau fizic similar sau nu apare ca ocoincidenţă.Precizia unei metode analitice exprimă apropierea de, potrivireasau gradul de concordanţă între o serie de măsurări obţinute de lamai multe probe provenite de la aceeaşi probă omogenă subcondiţii de specificitate. Aceasta se exprimă ca abatere standardsau ca abatere standard relativă procentuală, RSD%.Precizia poate fi de trei feluri:
repetabilitaterepetabilitate intermediarăreproductibilitate
Exactitatea = apropierea între valoarea acceptată ca o valoare dereferinţă şi valoarea găsită.Exactitatea exprimă “apropierea rezultatelor măsurărilor de o valoareadevărată” sau „exactitatea reprezintă gradul de concordanţă întrerezultatul unei încercări şi valoarea de referinţă acceptată (adevărată) amăsurandului/analitului”.
Domeniul de lucru = intervalul dintre concentraţia (cantitatea)superioară şi inferioară a analitului din probă (incluzând acesteconcentraţii) pentru care s-a demonstrat că procedura are un nivelpotrivit de precizie, exactitate şi liniaritate.
Limita de cuantificare (LC)Limita de cuantificare (LC) - cea mai joasă concentraţie saucantitate de analit care poate fi determinată cantitativ cu un nivelacceptabil de fidelitate a repetabilităţii şi exactităţii.
Limita de detecLimita de detecţţie (LD)ie (LD) -concentraţie netă minim detectabilă (ISO)-valoare minim detectabilă (IUPAC).
LD = cea mai mică concentraţie de analit dintr-o probă care poate fidetectată cu o certitudine statistică rezonabilă, dar nu neapăratcuantificată ca o valoare exactă în condiţiile stabilite ale încercării.
Pentru determinarea practică a celui mai mic semnal detectabilpot fi aplicate două metode:
a. 10 probe oarbe independente măsurate o singură datăfiecare:
xLD = xm(blanc) + 3blanc,unde blanc este abaterea standard a blancului;
b. 10 probe oarbe independente fortificate la cea mai scăzutăconcentraţie acceptată, măsurate o singură dată fiecare:
xLD = 0 + 3probă.
Media şi abaterea standard a probelor oarbe este posibil să depindăde matricea probelor oarbe, LD va fi astfel dependentă de matrice. Înacest caz se va aplica la determinare prima variantă (a).
Limita de detecLimita de detecţţie nu trebuie confundatăie nu trebuie confundatăcu sensibilitatea metodei.cu sensibilitatea metodei.
Pentru determinarea practică a celui mai mic semnalcuantificabil pot fi aplicate, de asemenea, două metode:
a. 10 probe oarbe independente măsurate o singurădată fiecare:
xLQ = xm(blanc) + 10blanc,unde blanc este abaterea standard;
b. 10 probe oarbe independente fortificate la cea maiscăzută concentraţie acceptată, măsurate o singură datăfiecare:
xLQ = 0 + 10probă.
Robusteţea = o măsură a capacităţii metodei analitice dea rămâne neafectată de variaţii mici, dar deliberate aleparametrilor metodei şi oferă o indicaţie privind siguranţametodei pe parcursul unei utilizări în condiţii normale.
Trebuie luati în considerare 3 tipuri diferite de parametripentru evaluarea robusteţii şi rezistenţei:- parametri interni (temperatură, pH etc., în cazul HPLC);- parametri externi (analişti, echipamente, laboratoarediferite etc.)- parametri fundamentali (stabilitatea soluţiilor de testareetc.)
Top Related