ANALYSE DER INOSIN-5'-MONOPHOSPHAT-DEHYDROGENASE-AKTIVITÄT UND DER
IMPDH1-GENEXPRESSION IN DEN LYMPHOZYTEN VON MYCOPHENOLAT-MOFETIL-
BEHANDELTEN NIERENPATIENTEN
Masterseminar – Marc Müller6. November 2013
1 Grundlagen 1.1 Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere
1.2 Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands
1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
1.4 GMP-Synthese-Pathway humaner Zellen
2 Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH) 2.1 IMPDH als Target immunsuppressiver Medikamente
2.2 Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung
3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens
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Inhalt
1.1 Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere
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1 Grundlagen
Quelle: http://www.jameda.de/gesundheits-lexikon/bilder/
1.1 Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere
Lokalisierung und Besonderheiten: Knapp unterhalb der Rippenbögen in Höhe des 12. Brustwirbels jeweils rechts und links Neben der Lunge einziges Organ in doppelter Ausführung Form einer Bohne mit Einbuchtung in der Mitte
Einmündung der Nierenarterie
Ausmündung der Nierenvene, Lymphgefäße und Harnleiter
physiologische Hauptaufgaben:Reinigung des Blutes von harnpflichtigen Substanzen: Harnsäure, Harnstoff, toxische Metabolite
(= glomeruläre Filtration)Regulation des Wasserhaushalts ↔ BlutdruckRegulation der ElektrolytkonzentrationenGluconeogenese Hormonsynthese → u.a. Erythropoetin, Renin und Calcitriol (Vitamin D)
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1 Grundlagen
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1.2 Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands
Exemplarische Nephropathien
diabetische Nephropathie als Folge von Typ I und II - Diabtetes Glomerulonephritiden / Glomerulopathie (Autoimmunentzündung der Nieren) Tubulointerstitielle Nierenerkrankungen (bakteriell, viral oder toxisch) Fehlbildungen der Nierengefäße Tumore (Nierenzellkrazinom oder Onkozytom) …
1 Grundlagen
Datenquelle:
1.2 Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands
Inzidenz: 210 neue Dialysepatienten pro 1 Million Einwohner ( ≈ 16900 bezogen auf deutsche Gesamtbevölkerung)
Häufigkeit einer starken Niereninsuffizienz (Stufe 5): 0,13 % der deutschen Gesamtbevölkerung einer von 1000 Bürgern
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1 Grundlagen
GFR = glomeruläre Filtrationsrate
Datenquelle:
1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
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1 Grundlagen
Dialyse / Blutwäsche Nierentransplantation
Quelle: Fresenius Medical Care AG
1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
Problematik: Potenzielle Transplantatabstoßung! → induziert durch Immunantwort beim Transplantat-Empfänger
Gefahr des Misserfolgs der Nierenersatztherapie
Potentielle Lebensgefährdung für den Transplantat-Empfänger
Lösung:
Rejektionsprophylaxe durch eine immunsuppressive medikamentöse Therapie
→ gezielte Down-Regulation des Immunsystems des Transplantat-Empfängers
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1 Grundlagen
Nierentransplantation
1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
Wichtige immunsuppressive Medikamente
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1 Grundlagen
Azathioprin
Prodrug → Thiopurinmethyltransferase (TPMT) metabolisiert diese zu 6-Mercaptopurin
6-Mercaptopurin interferiert als atypisches Nukleosid mit der DNA-/RNA-Synthese
Inhibierung der Proliferation von B- und T-Lymphozyten
1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
Wichtige immunsuppressive Medikamente
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1 Grundlagen
Calcineurin-Inhibitoren
z.B. Ciclosporin
Hemmung der Phosphatase Calcineurin
dephosphoryliert und aktiviert den T-Lymphozyten Transkriptionsfaktor NF-AT (nuclear factor of activated T cells)
Quelle: C.R.Kissinger et al. (1995). Crystal structures of human calcineurin and the human FKBP12-FK506-calcineurin complex.. Nature, 378, 641-644.
1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
Wichtige immunsuppressive Medikamente
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1 Grundlagen
Mycophenolat-Mofetil (MMF)
Prodrug 2-Morpholinoethylester der Mycophenolsäure (MPA) selektiver, nicht-kompetitiver und reversibler Hemmer der
Inosinmonophosphat-Dehydrogenase (IMPDH) Greift in den Guanosinmonophosphat (GMP) – Stoffwechsel von B-
und T-Lymphozyten ein
aktiver immunsuppressiver Metabolit (MPA)
inaktive Prodrug (MMF)
1.4 GMP-Synthese-Pathway humaner Zellen
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1 Grundlagen
Quelle: http://www.uni-koeln.de/medfak/biochemie
2.1 IMPDH als Target immunsuppressiver Medikamente13
2 Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH)
IMPDH-abhängige Oxidation von IMP zu
XMP
Angriffspunkt für immunsuppressive MMF-Therapie nach
einer NierentransplantationQuelle:
http://www.uni-koeln.de/medfak/biochemie
2.2 Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung
Methodenentwicklung zur quantitativen Analytik der katalytischen Restaktivität des Plasmaenzyms Inosinmonophosphat-Dehydrogenase (IMPDH) in peripherem Blut mittels RP-IP-HPLC nach Hemmung mit dem Immunsuppressivum Mycophenolat
RP-IP-HPLC = reversed-phase ion-pairing high perfomance liquid chromatography
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2 Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH)
Quelle:chem.uft.uni-bremen.de
2.2 Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung
Prinzipielle Idee (keine Details! → Betriebsgeheimnis):
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2 Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH)
Isolation der Lymphozyten-Fraktion aus
Patienten Vollblut
(Li-Heparin)
Zellaufschluss und
Enzymisolation
durch ein geeignetes
Inkubationsverfahren:IMPDH-
induzierter Umsatz des
Substrats IMP zum Produkt
XMP
Messung der Analyte mittels RP-IP-HPLC und
Berechnung der IMPDH-
Restaktivität
beim Menschen: zwei Gene welche für IMPDHs codieren (IMPDH-1 u. IMPDH-2)
mehrere Isoformen von IMPDH-1 bekannt → alternatives Splicing der mRNA!
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3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens
Quellen: Prosise GL, Luecke H (February 2003), Crystal structures of Tritrichomonasfoetus inosine monophosphate dehydrogenase in complex with substrate, cofactor and analogs: a structural basis for the random-in ordered-out kinetic mechanism
National Human Genome Research Institute
Ziel: Beitrag zur Beantwortung grundlegender Fragen zur Förderung der Verständnisses hinsichtlich IMPDH-Immundiagnostik Korrelation der IMPDH-Genexpressionsaktivität und IMPDH-Enzymaktivität Bezug zwischen Transkriptom und Proteom bei der IMPDH-
Immundiagnostik Inwiefern beeinflusst die MMF-Medikation die IMPDH-Genexpression und -
regulation …
Analyse mittels qRT-PCR = quantitativer reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion
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3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens
Analyse mittels qRT-PCR = quantitativer reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion
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3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens
Isolation des
Transkriptoms (mRNA)
Generierung von cDNA mittels RT
Amplifikation von
IMPDH-Gen-Transkripten durch das
Design geeigneter
Primer
Detektion und
Quantifizierung von
IMPDH-Gen-Transkripte
n
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