DOENÇAS RIQUETSIAIS HUMANAS:
Febre Maculosa
Tifo murino
Febre Q / Endorcardite por Coxiela
Erliquioses
Bartoneloses
Angiomatose Bacilar
Doença da Arranhadura do Gato
Endocardite por Bartonela (projeto INCOR)
Pesquisa de anticorpos específicos para o Grupo da Febre Maculosa
- Reação de Imunofluorescência Indireta em amostras de soro pareadas (intervalo ≥ 15 dias)
64 128 256 512 1024 C +
64 128 256 512 1024 C -
Antígeno – Cultura Concentrada de Riquétsias do
Grupo Febre Maculosa
Anti IgG/M Humano Marcado com Fluoresceína
• Cor e Forma
64 128 256 512 C +
C -
1024
Negativo Positivo
A B
C D
Figura 1: Reação de IFI para Grupo Febre Maculosa: A- controle negativo, IgG (10X); B- controle negativo (40X); C- controle positivo,IgG (10X); D- controle positivo (40X)
BHI 1mL
Coágulo 5mL sangue
Pérolas de vidro Agitação no vortex
Incubar com soro IgG positivo para FM
Anti IgG Marcado com Fluoresceína
Positivo focos
Negativo
Centrifugação 2500 rpm 25°C 1 hora Incubação 37°C 5 dias
A B C
D E F
Fig 2 – Isolamento em cultura celular (Vero) identificação por Imunofluorescência indireta para riquétsias do Grupo da Febre Maculosa: A- controle negativo (10x); B- controle negativo (20x); C- controle negativo (40x); D- isolamento positivo (10x); E- isolamento positivo (20x); F- isolamento positivo (40x); Fonte: Santos et al. Fotomicroscópio Zeiss, modelo Axioskop 2 plus Fotografado por Dra Jussara Bianchi Castelli do Laboratório de Patologia do InCor-HCFMUSP.
Immunohistoquímica para Rickettsia spp
Immunohistochemical assay showing granular an3gen staining in endothelium (polyclonal an3-‐ Ricke:sia an3body-‐ X400)
Fonte: Dra. Roosecelis A. Brasil, Centro de Patologia - IAL
PCR é uma reação baseada na replicação do DNA Extração do ácido nucléico através kit comercial (coluna de sílica) O DNA do agente infeccioso é amplificado e o sinal dessa amplificação é captado pelo aparelho (composto fluorescente)
A FMPCR atualmente é constituído por 3 reações de qPCR:
uma para Rickettsia spp (gene gltA, com detecção por sonda TaqMan®)
um para riquétsias Grupo Febre Maculosa (gene OmpA, com detecção por SYBR Green)
um controle interno endógeno (RNAse P humana, com detecção por sonda TaqMan®)
Validação dos ensaios de PCR em tempo real
Curva de concentração decrescente para reação de qPCR para Rickettsia spp analisada no ABI7500
Curva padrão de eficiência para reação de qPCR para Rickettsia spp analisado no ABI7500
Template DNA de Rickettsia rickettsii em co-cultivo de
células Vero [ ] estimada: 10+7 cópias/mL
Curva de concentração decrescente para o protocolo de qPCR para riquétsias GFM, analisada no LC480-ROCHE
LightCycler® 480 Roche
Curva dissociação dos produtos amplificados
Curva padrão de eficiência para o protocolo riquétsia GFM, analisado pelo LC480-Roche
LightCycler® 480 Roche
-mais frequentemente -Fácil processamento
-podem ser utilizados
Bacteremia • Período (curto)
• Intensidade
vasculite aguda compatível com casos de óbito
soroconversão 1ª amostra IgG<64
40 casos Não fatais
10 positivos
30 negativos
Sensibilidade 25% Em casos não fatais
AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DA PCR EM TEMPO REAL PARA O DIAGNÓSTICO DA FEBRE MACULOSA
BRASILEIRA EM CASOS FATAIS
Nos anos de 2010 e 2012 - casos fatais suspeita clínica e/ou epidemiológica de FMB:
Concordância entre os resultados foi de 100%
Concordância entre os resultados foi baixa (kappa=0,096, p-valor=0,435, intervalo de confiança 95% de
0,336 a –0,144).
RIFI positivo=título de anticorpos tipo IgG e/ou IgM≥128
concordância entre os resultados foi baixa
(kappa=0,186, p-valor=0,005, intervalo de confiança 95% de 0,316 a –0,056).
31,6% casos como positivos para FMB
FMPCR foi um avanço o diagnóstico laboratorial da FMB
156
38
(36 casos)
152
42
(41 casos)
-2011 a partir de maio
-2012 até 26 de outubro
23%
28% Fonte: SIGH
Elvira Maria Mendes do Nascimento Pesquisador Científico
Fabiana Cristina Pereira dos Santos Pesquisador Científico
Sílvia Colombo
Assistente Técnica de Apoio à Pesquisa Científica e Tecnológica
Nilcéia de Lourdes Ramos Arruda Auxiliar de Laboratório
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