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Docentes Prof. Dr. Cesar Martins: [email protected] Prof. Dr. Cláudio Oliveira Prof. Dr. Rafael H Nóbrega
Morfologia Biologia Celular, Histologia e Embriologia
Introdução à Biologia Celular, Histologia e Embriologia e seus métodos de estudo
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A invenção do microscópio Microscópio óptico Microscópio eletrônico Avanços em Biologia Molecular
Invenção de lentes de aumento: levou ao descobrimento do mundo microscópico.
Desenvolvimento da Microscopia
Algumas grandezas... 1km ! 1.000m 1m ! 100 cm 1cm ! 10 mm 1mm ! 1000 µm 1 µm ! 1000 nm 1Å (Angstron) ! 10-10m
Visão panorâmica da célula
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Visão panorâmica da célula Aumento e Poder de Resolução
Resolução: menor distância para que duas partículas apareçam como objetos separados. O limite de resolução da Microscopia Óptica é de 0,2 µm
Visão panorâmica da célula
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Desenvolvimento da Microscopia
-Microscópio Óptico (luz) -Microscópio Eletrônico (elétrons)
Microscópio óptico – utiliza feixes de luz
Desenvolvimento da Microscopia
Sistemas de lentes (condensador, objetiva e ocular) O limite de resolução do MO é de 0,2 µm e depende essencialmente da objetiva.
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Microscópio óptico
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio óptico de campo claro
Desenvolvimento da Microscopia
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Microscópio óptico de fluorescência
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio óptico de fluorescência
Desenvolvimento da Microscopia
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Microscópio óptico confocal
Desenvolvimento da Microscopia
Outros tipos de microscópios ópticos
Desenvolvimento da Microscopia
Iluminação direta (sem coloração)
Contraste de fase (refração da luz)
Contraste diferencial de interferência (refração da luz)
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Microscópio eletrônico -utiliza feixes de elétrons -lentes eletromagnéticas
Desenvolvimento da Microscopia
! Alta resolução, abaixo de 0,3nm. ! Necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm) ! Material biológico é impregnado com metais pesados como ósmio, chumbo e urânio ! Imagem elétron-densa (escura) e elétron-lúcida (clara)
Estrutura e funcionamento
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Microscópio eletrônico de transmissão
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio eletrônico de varredura
! Alta resolução ! Fragmentos maiores ou tecidos inteiros ! Material biológico é recoberto com metais como ouro ou platina ! Estrutura tridimensional (3D)
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Microscópio eletrônico de varredura
Desenvolvimento da Microscopia
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Microscópio eletrônico de varredura
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Preparação de material para análise ao microscópio
As células e tecidos precisam estar perfeitamente preservados, apresentando a mesma estrutura e composição química que possuíam quando vivas.
Preparação de material para análise ao microscópio
Fixação – Preserva a morfologia e composição do tecido. Fixador mais utilizado ! Formaldeído. Para microscopia eletrônica (ME) os tecidos necessitam de tratamentos especiais em soluções de aldeído glutárico e tetróxido de ósmio.
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Preparação de material para análise ao microscópio
Lavagem
Preparação de material para análise ao microscópio
Desidratação – Retirada da água presente nos tecidos através de sucessivos banhos em uma série de etanol (70%!80%!90%!100%).
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Preparação de material para análise ao microscópio
Diafanização ou clareamento – Substituição do etanol por líquido miscível (geralmente xilol) com o meio de impregnação e retirada de lipídios.
Preparação de material para análise ao microscópio
Meio de impregnação – Substituição do líquido (xilol) por parafina ou resina sintética. A resina sintética possibilita cortes mais finos (1 a 2 µm). O ME necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm) e por isso utiliza se resinas mais duras. Neste caso os cortes são feitos com navalhas de vidro ou diamante.
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Preparação de material para análise ao microscópio
Meio de inclusão – Suporte para o tecido impregnado.
Preparação de material para análise ao microscópio
Tecido preparado para análise ao Microscópio Eletrônico
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Preparação de material para análise ao microscópio
Micrótomo Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1µm de espessura).
Preparação de material para análise ao microscópio
Micrótomo automatizado – Permite a obtenção rápida de cortes sem passar pelas etapas descritas antes.
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Preparação de material para análise ao microscópio
Micrótomo Realizando cortes do material
Preparação de material para análise ao microscópio
Micrótomo Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1µm de espessura).
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Preparação de material para análise ao microscópio
Estufa 60 oC Derreter e eliminar a parafina
Preparação de material para análise ao microscópio
Xilol Retirada da parafina
Série alcoólica - Rehidratação.
Hidratação completa
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Preparação de material para análise ao microscópio
Coloração
Preparação de material para análise ao microscópio
Hematoxilina/Eosina (HE) Coloração freqüentemente utilizada
Coloração – A maioria dos corantes utilizados se comportam como ácido ou base. !Estrutura celular basófila, liga-se a corantes básicos. !Estrutura celular acidófila, liga-se a corantes ácidos.
Além destes corantes freqüentemente utilizados, utiliza se também outros tipos de coloração, como a impregnação com sais de prata e ouro.
Corantes básicos: azul-de-tuluidina, azul-de-metileno, hematoxilina... Corantes ácidos: eosina, orange G, fucsina ácida...
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Preparação de material para análise ao microscópio
Além destas colorações frequentemente utilizadas, outros métodos baseados em reações químicas (citoquímica), imunológicas (imunocitoquímica), entre outras, também podem ser empregados.
Preparação de material para análise ao microscópio
Montagem das lâminas
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Preparação de material para análise ao microscópio
Análise do Material
Preparação de material para análise ao microscópio
Resultados
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Plano de corte
Desenvolvimento do Microscópio Óptico - 1700 Desenvolvimento Microscópio Eletrônico - 1930 Desenvolvimento da Biologia Molecular - 1970
Avanços em Biologia Celular
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...outras técnicas que podem ser empregadas na Biologia Celular e Molecular
: Radioautografia : Imunocitoquímica : Cromatografia : Eletroforese : Cristalografia e difração de raio-X : Hibridação de ácidos nucléicos
Avanços em Biologia Celular e Molecular
Cultura de Células e Manipulação de Moléculas
George Gey, 1951: primeira cultura de células
Células HeLa (Henrietta Lacks)
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Conhecimento da diversidade estrutural celular
Organização geral das células
Organismos da natureza (visão clássica) Eucariontes: Protozoários, fungos, plantas e animais Procariontes: Bactérias
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