Interleukine 33
de la reconnaissance de l’allergène
au relargage actif de la cytokine
Tinturier Dimitri
Contini Thomas
Sansen Thibault
Durand Virginie 2018/2019
Remerciements
Nous tenons premièrement à remercier Rémy Poupot pour ses précieux conseils,
sa disponibilité et son aide tout au long de ce projet.
Un immense merci à Corinne Cayrol de nous avoir reçu et d’avoir pris le temps
de nous conseiller et de nous aider afin de nous orienter dans la gestion du
projet.
Merci à toute l’équipe enseignante du Master 2 EGPR, et plus particulièrement
à Laurent Paquereau, pour leur bienveillance, leur investissement et leur
encouragement.
Enfin, un grand merci aux copains de la promo d’avoir été présents dans les
bons et les mauvais moments tout au long de ce semestre.
Résumé
L’asthme est une maladie inflammatoire chronique qui touche aujourd’hui plus de 235
millions de personnes dans le monde. La réaction inflammatoire allergique intervient dans les
premiers instants d’une crise allergique. Les mécanismes mis en place par le système
immunitaire pour lutter contre un allergène sont aujourd’hui bien documentés et de nombreux
traitements existent pour atténuer cette réaction inflammatoire. Ces traitements agissent
cependant sur les conséquences de la réaction inflammatoire (par exemple diminuer le
gonflement des muscles des voies respiratoires pour l’asthme). Il n’existe aujourd’hui aucun
traitement permettant de prévenir complètement cette réaction allergique. Il est donc
nécessaire de mettre au point de nouveaux traitements ciblant les premiers intervenants de la
réaction inflammatoire allergique.
Dans ce contexte, nous focalisons notre projet de recherche sur l’interleukine 33. IL-33 est
une cytokine pro-inflammatoire stockée dans le noyau des cellules endothéliales et
épithéliales. Lorsque ces cellules reconnaissent un allergène, l’IL-33 est libérée et se fixe sur
les cellules immunitaires présentant son récepteur ST2, les alertant de ce fait du danger. Ce
relargage rapide fait d’IL-33 un des premiers messagers relargués par les cellules après
exposition à un allergène. IL-33 est ainsi qualifiée “d’alarmine”. Les mécanismes engendrés
par la fixation de l’IL-33 sur son récepteur sont aujourd’hui bien documentés. Cependant, le
mécanisme de relargage d’IL-33 reste à ce jour méconnu. La découverte d’une voie de
signalisation menant au relargage de l’alarmine permettrait l’identification de nombreuses
cibles thérapeutiques intéressantes pour l’élaboration d’un traitement.
Au cours de ce projet de recherche, nous formulons plusieurs hypothèses concernant ce
mécanisme de relargage en se basant sur des informations recueillies dans la littérature. Nous
basons notre recherche bibliographique sur 3 axes : la détection de l’allergène par la cellule,
la signalisation de cette détection jusqu’au noyau et la sortie d’IL-33 de la cellule. Nous
procédons ensuite à une validation de nos hypothèses dans le but de proposer un modèle du
relargage de l’IL-33 dans un contexte de réaction inflammatoire allergique.
Table des matières
Introduction Bibliographique ..................................................... 1
I. Signaux de dangers ......................................................................................... 3
II. Récepteurs impliqués dans la détection des protéases des
allergènes ................................................................................................................ 5
III. Les partenaires protéiques impliqués dans la signalisation du
danger ...................................................................................................................... 9
IV. Décrochage d’IL-33 de la chromatine et sortie de la cellule ..... 11
I. Lignées cellulaires ............................................................... 15
II. Approche globale, validation du modèle ............................... 17
III. Etude du rôle des récepteurs PAR2 et purinergiques ........... 21
IV. Etude du rôle de l’inflammasome dans le relargage d’IL-33
................................................................................................ 25
V. Etude du rôle d’IL-1β et de la voie des MAPK dans le
relargage d’IL-33 ..................................................................... 29
VI. Recherche de modifications post-traductionnelles sur l’IL-33
relarguée .................................................................................. 33
VII. Recherche d’une protéine impliquée directement dans
l’export d’IL-33 du noyau ........................................................ 37
Bibliographie : ......................................................................... 45
Abréviations :
ADN : acide désoxyribonucléique
AEBSF : fluorure de 4-(2-
aminoéthyl)benzènesulfonyle
AIM 2 : absent in melanoma 2
ARNm : acide ribonucléique messager
ASC : adaptor protein apoptosis-associated
speck-like protein containing CARD
ATP : adénosine tri-phosphate
BALF : fluide de lavage bronchoalvéolaire
C : cystéine
Ca2+ : ion calcium
CO2 : dioxyde de carbone
DAMP : damage-associated molecular
pattern
DMSO : diméthylsulfoxyde
ERK : extracellular signal-regulated kinase
ESI : electrospray ionisation
HBSS : hepes buffer saline solution
HDM : house dust mite
HMGB1 : high-mobility group box 1
HPLC : high-pressure liquid
chromatography
IL-(1β, 33, 5, 6, 18) : interleukine
LPS : lipopolysaccharide
kDa : kilo dalton
K+ : ion potassium
KO : Knock-out
MS : mass spectrometry
MAPK : mitogen-activated protein kinases
MEL : Mouse erythroleukemia cells
MPT : modification post-traductionnelle
NES : nuclear export sequence
NHBE : Human bronchial epithelial cells
NLRC4 : NLR family CARD domain-
containing protein 4
NLRP(1, 3) : NOD-like receptor family,
pyrin domain-containing
NLS : nuclear localization sequence
NPOT : nematic protein organisation
technique
P2X7 : purinergic receptor X7
P2Y2 : purinergic receptor Y2
PAR2 : protease-activated receptor 2
PBS : Phosphate buffer saline
ROS : reactive oxygen species
RT-qPCR : reverse transcription-
quantitative polymerase chain reaction
siRNA : small interfering ribonucleic acid
SD : Standard deviation
SEM : Standard error of the mean
TIRF : total internal reflection
fluorescence microscopy
TLR4 : toll-like receptor 4
TQMS : spectromètre de masse avec un
triple quadrupôle
WT : Wild Type
1
Introduction Bibliographique
L’asthme est une maladie inflammatoire chronique qui touche plus de 235 millions de
personnes dans le monde (OMS). Cette pathologie se manifeste communément par une
respiration courte et sifflante et une toux persistante. Il n’existe aujourd’hui aucun traitement
qui permet de guérir l’asthme. Il existe cependant de nombreux traitements permettant de
contrôler la réaction asthmatique après qu’elle soit survenue tels que :
- Des corticostéroïdes qui permettent de réduire le gonflement des voies respiratoires.
- La théophylline qui aide à ouvrir les voies respiratoires en relaxant les muscles lisses
autour des voies respiratoires.
La réaction inflammatoire allergique joue un rôle dominant dans les pathologies allergiques
telles que l’asthme. La détection d’allergènes par les cellules des voies respiratoires entraîne
une forte production de mucus et un recrutement de cellules de l’immunité innée
(éosinophiles) menant à une forte réaction inflammatoire localisée. (Cayrol.C et al., 2018)
Dans leur article de 2018 « Environmental allergens induce allergic inflammation through
proteolytic maturation of IL-33 », Corinne Cayrol et son équipe identifient IL-33 comme un
acteur majeur de la réaction inflammatoire allergique, agissant comme une « alarmine », un
des premiers messagers impliqué dans l’induction de la réaction inflammatoire allergique
dans des cellules épithéliales pulmonaires et des modèles murins. L’implication d’IL-33 dans
la réaction inflammatoire est bien documentée dans la littérature, ainsi que ses cibles et son
mécanisme d’action. Cette cytokine représente une cible de choix dans l’élaboration d’un
traitement visant à atténuer, voire complètement supprimer la réaction inflammatoire
allergique.
Lorsqu’un allergène est détecté par les cellules épithéliales des voies respiratoires, ces
cellules relarguent très rapidement dans le milieu extracellulaire l’IL-33, stockée en temps
normal dans le noyau, complexée à la chromatine. Le clivage d’IL-33 par les protéases
d’allergènes va grandement augmenter son activité biologique (Cayrol.C et al., 2018). Une
fois relarguée et clivée par les protéases d’allergène, IL-33 se fixe sur son récepteur
ST2/IL1RAP, via son extrémité C-terminale. Cette fixation active la voie de signalisation
NFκB par l’intermédiaire de la protéine Myd88 et entraîne la production de cytokines pro-
inflammatoires (IL-6 et IL-13), spécifiques de la réaction allergique. (Lingel.A et al., 2009)
Figure 1: L’exposition des cellules aux allergènes entraînent très rapidement une
augmentation de la concentration intracellulaire de Ca2+ et une augmentation de la
concentration extra-cellulaire d’ATP.
(Kouzaki.H et al., J Immunol. 2011) A-/ Les cellules NHBE ont été traitées avec du milieu,
avec A.Alternata ou avec des extraits de blattes orientales (allergène). La cinétique des
concentrations d'ATP dans les surnageants a été mesurée. Les barres représentent la moyenne
± SEM (quatre expériences indépendantes). *p < 0,05, **p < 0,01 comparé au milieu seul par
le test Mann-Whitney U. B-/ Les cellules NHBE ont été chargées de fura 2-AM (indicateur
fluorescent de la concentration Ca2+ intracellulaire) et exposées à un extrait d'A.Alternata. La
fluorescence dans les cellules individuelles a été surveillée et analysée par microscopie
inversée. Les observations obtenues montrent [Ca2+] intracellulaire(i) dans la monocouche de
cellules NHBE avec des pseudo couleurs (vert < jaune < orange < rouge < blanc dans l'ordre
de [Ca2+]i. Le panneau de gauche montre avant l'exposition, et le panneau de droite montre
300s après l'exposition à A.Alternata. Les résultats sont représentatifs de cinq expériences
indépendantes.
3
Cependant, le mécanisme de relargage d’IL-33 n’est pas connu et peu abordé dans la
littérature. C’est pourquoi nous avons dirigé notre travail de recherche bibliographique selon
3 axes :
- La détection de l’allergène par la cellule
- Les partenaires protéiques impliqués dans la signalisation de cette détection jusqu’au
noyau
- Le mécanisme permettant le décrochage d’IL-33 de la chromatine et sa sortie du
noyau et de la cellule.
Nous proposons une hypothétique voie de signalisation permettant le relargage d’IL-33 des
cellules épithéliales pulmonaires dans un contexte de réaction inflammatoire allergique.
I. Signaux de dangers
L’exposition des cellules aux allergènes entraînent très rapidement une augmentation
de la concentration intracellulaire de Ca2+ et un efflux de K+, ainsi qu’un relargage
extracellulaire d’ATP (Kouzaki.H et al., 2011) (Figure 1). L’ATP est considéré comme le
premier signal de danger. Le stress oxydatif, et notamment la production de ROS (espèces
réactives de l’oxygène), est impliqué dans le relargage extra-cellulaire d’ATP et
l’augmentation de la concentration calcique intracellulaire. (Cruz.CM et al., 2007)
Figure 2: A-/ Reconnaissance des protéases d’A.Alternata par le récepteur PAR2 in vivo.
(Snelgrove.RJ et al., J Allergy Clin Immunol. 2014) Histogramme représentant la concentration d’IL-
33 dans le BALF chez des souris traitées par A.Alternata, ou par A.Alternata et la suramine
(antagoniste des récepteurs purinergiques), ou par A.Alternata et l’AEBSF (inhibiteur de PAR2).*p <
0,05 par rapport aux souris traitées au PBS. †p < 0,05 par rapport aux souris traitées par A.Alternata.
B-/ Les souris KO PAR2 ont une diminution de la concentration d’éosinophiles dans le BALF. (Boer
et al, 2014). Histogramme représentant la concentration d’éosinophiles dans le BALF chez des souris
sauvages, soit chez des souris sauvages en présence de HDM (allergènes acariens), soit chez des
souris KO PAR2, soit chez des souris KO PAR2 en présence de HDM. Les données sont des
moyennes SEM (105 cellules/ml) de 8 souris par groupe. **p < 0,01, ***p < 0,001.C-/La quantité
d’IL-33 diminue dans le BALF en présence A.Alternata et AEBSF (inhibiteur protéase à sérine).
(Snelgrove.RJ et al., 2014) Histogramme représentant la concentration d’IL-33 dans le BALF chez
des souris traitées soit par A.Alternata, soit par A.Alternata et AEBSF, soit par A.Alternata et KO
ST2, soit chez des souris traitées par HDM. *p < 0,05 par rapport aux souris traitées au PBS. †p <
0,05 par rapport aux souris traitées par A.Alternata. D-/Hausse de Ca2+ uniquement dû au récepteur
PAR2 (Boitano et al, Am J Physiol, 2011) Histogramme représentant le % de cellules épithéliales des
voies respiratoires humaines qui ont une augmentation de [Ca2+]i dans différentes conditions. Soit en
présence d’A.Alternata, soit en présence d’A.Alternata et d’inhibiteurs de protéase non spécifiques (PI
Alt), soit avec A.Alternata et AEBSF (inhibiteur de protéase à sérine) (AEBSF Alt), soit avec
A.Alternata et E64 (inhibiteur de la protéase à cystéine) (E64 Alt), ou avec A.Alternata et Peps
(inhibiteur de l'aspartyl protéase pepstatine) (Peps Alt). Les colonnes sont représentées graphiquement
± SEM pour chaque point dans le temps ; n ≥ 4 pour chaque traitement.
5
II. Récepteurs impliqués dans la détection des protéases des allergènes
Plusieurs récepteurs sont aujourd’hui décrits dans la littérature comme acteurs de la
réaction inflammatoire allergique et de la libération d’IL-33. Le récepteur TLR4 a été
identifié comme un de ces acteurs (Hammad.H et al., 2009), mais ici nous nous intéressons à
la détection des protéases d’allergènes par les cellules, TLR4 étant activé par le LPS.
Un des premiers acteurs de la reconnaissance des protéases d’allergènes par la cellule est le
récepteur PAR2 (protease-activated receptor 2). Les protéases d’A.Alternata reconnaissent et
clivent le récepteur PAR2 in vivo (Jairaman.A et al., 2016)(Figure 2A). De plus, il a été vu
que le blocage de l’activation du récepteur PAR2 par les protéases d’allergènes (A.Alternata)
inhibe la libération d’IL-33 dans le fluide de lavage broncho-alvéolaire (BALF) de modèles
murins (Snelgrove.RJ et al., 2014) (Figure 2B).
PAR2 fait partie d’une famille de 4 récepteurs, senseurs de protéases extracellulaires. Il s’agit
d’un récepteur transmembranaire, couplé à une protéine G (RCPG). Les protéases
extracellulaires clivent PAR2 sur son extrémité N-terminale. Ce clivage permet
l’internalisation du récepteur ce qui va activer une voie de signalisation intracellulaire menant
à l’induction de la réaction inflammatoire allergique. En effet, chez des souris KO (PAR2 -/-),
il a été observé une diminution de la concentration d’éosinophiles dans le fluide de lavage
broncho-alvéolaire, ainsi qu’une production de mucus et une réaction allergique diminuées en
présence d’allergènes. (Boer.JDD et al., 2012). De même, Snelgrove.RJ et al., 2014
démontrent que la quantité d’IL-33 relarguée dans les lavages broncho-alvéolaires de souris
WT est diminuée lorsque A.Alternata est incubé avec de l’AEBSF, un inhibiteur irréversible
des protéases à sérine (Figure 2C).
Il est démontré que la hausse intracellulaire de Ca2+ est dépendante du récepteur PAR2. En
effet lorsque PAR2 est bloqué avec un siRNA et que la réaction allergique est induite, on
n’observe pas de hausse intracellulaire de Ca2+. Ce résultat indique également que cette
hausse est uniquement due au récepteur PAR2 (Jairaman.A et al., 2016) (Figure 2D).
Figure 3: A-/ Le blocage de P2Y2 et P2X7 en présence A.Alternata, inhibe l’augmentation de Ca2+ et
la sortie d’ATP dans la cellule. (Kouzaki et al, 2011).
Des cellules NHBE ont été transfectées avec des siRNA contre P2X7 ou P2Y2 ou un siARN contrôle
et cultivées pendant 48 h. Les cellules transfectées ont été chargées de fura 2-AM et exposées à
A.Alternata (voir flèches). La [Ca2+]i dans des cellules individuelles a été analysée. Panel de gauche :
Graphique représentant les changements cinétiques de [Ca2+]i avec soit les siRNA contre P2X7 ou
P2Y2 soit avec le siRNA contrôle. (Résultats représentatifs de 3 expériences). Panel de droite :
Histogramme représentant la [Ca2+]i avant (basal) et 400’’ après l'exposition à A.Alternata. Les barres
représentent la moyenne ± SEM (3 expériences indépendantes de 50 cellules chacune). **p < 0,01 par
rapport à [Ca2+]i après exposition à A.Alternata dans les cellules traitées avec le siRNA contrôle par
ANOVA.B-/ L’activation de P2Y2 et P2X7 induit une production d’espèces réactives de l’oxygène
(ROS). (Wang.B et al., Purinergic Signal. 2013) (Müller et al,2010). Panel de gauche: Les cellules
MEL dans un milieu NaCl (contenant 2 mM Ca2+ et 1 mM Mg2+) ont été incubées à 37 °C en
l'absence (basal) ou en présence d'ATP (1 mM) pendant 30 min au plus. Les incubations ont été
arrêtées par addition de milieu MgCl2 et centrifugation, et l'intensité moyenne de fluorescence (MFI)
(formation de ROS) a été déterminée par cytométrie de flux. La formation de ROS est exprimée en
MFI. Les résultats sont en moyenne ± SD (n = 3). Panel de droite : Histogramme représentant la
production de ROS dans les éosinophiles de patients asthmatiques ou sains, en réponse à l’ATP ou au
C5a (peptide de 74 aa qui induit la production de ROS), dans un milieu exempt de Ca2+ pour exclure
la participation des sous-types P2X et avoir seulement l’effet de P2Y2 . Moyenne ± SEM n = 8. *P <
0,05 (test de Mann-Whitney).
7
Un deuxième type de récepteurs impliqués dans la détection de l’allergène par la
cellule sont les récepteurs purinergiques. Les récepteurs purinergiques sont des RCPG, et leur
implication dans la réaction inflammatoire allergique intervient après le relargage d’ATP
dans le milieu extracellulaire. En effet, l’ATP extracellulaire est reconnu par les récepteurs
P2Y2 et P2X7, qui sont activés et internalisés. Le récepteur purinergique P2Y2 est impliqué
dans l’entrée du calcium dans les cellules. Son blocage en présence d’A.Alternata inhibe
l’augmentation de Ca2+ dans le cytoplasme, tout comme la sortie d’ATP de la cellule
(Kouzaki.H et al., 2011) (Snelgrove.RJ et al., 2014) (Figure 3A).
P2Y2 et P2X7 vont également induire une production d’espèces réactives de l’oxygène
(ROS). Cette augmentation de la quantité de ROS est reconnue comme un signal d’alarme
pour la cellule (Qu et al., 2017) (Müller et al., 2010) (Figure 3B). Cette production de ROS a
déjà été reliée dans la littérature à l’activation d’un complexe multiprotéique ayant une
activité pro-inflammatoire: l’inflammasome NLRP3 (Martinon.F, 2010) (Zhou.R et al.,
2009).
Figure 4: L’augmentation de la concentration d’ATP induit une production de ROS et donc
une activation de l’inflammasome NLRP3. L’assemblage de l’inflammasome NLRP3 conduit
à l’activation de la caspase-1, qui va clivée la pro-IL-1β en IL-1β mature. (Cruz.M et al., J
Biol Chem. 2007). Histogramme représentant la concentration d’IL-1β dans des macrophages
incubés avec 1 µg/ml de LPS pendant 2 h à 37 °C, avant d'être traités soit avec de l’ATP seul,
soit avec de l’ATP et les inhibiteurs suivants : Z-YVAD-fmk (inhibiteur de la caspase-1),
DPI (inhibiteur redox) ou LY294002 (inhibiteur PI3K), soit avec les inhibiteurs seuls. La
sécrétion de IL-1β a été mesurée par ELISA. p < 0,001 pour les cellules traitées par ATP et
Z-YVAD-fmk, DPI ou LY294002, comparativement aux cellules traitées par ATP seul.
L'expérience a été réalisée deux fois en double, et les résultats représentent la moyenne et
l’écart-type.
9
III. Les partenaires protéiques impliqués dans la signalisation du danger
Dans un contexte pro-inflammatoire, l’activation des récepteurs PAR2 et
purinergiques semblent mener à une activation de l’inflammasome NLRP3.
L’inflammasome NLRP3 est un complexe protéique intracellulaire, lié à l'immunité innée. Il
aurait un rôle dans le développement et l’exacerbation de l’asthme (Simpson.JL et al.,
2014)(Im.H & Ammit, 2014). Ce complexe est constitué d'un récepteur, d'une protéine
adaptatrice et d'une protéase à cystéine. Une fois activé par une molécule associée aux dégâts
cellulaires (DAMP), ces constituants vont s’assembler. Concernant l’inflammasome le plus
connu, NLRP3, son assemblage conduit à l’activation de la caspase-1. Cette dernière, une
fois activée, clive la proforme pro-IL-1β en IL-1β mature, et la proforme pro-IL-18 en IL-18
mature (des cytokines pro-inflammatoires). Il a été démontré que l’inflammasome NLRP3 est
impliqué dans la réponse inflammatoire allergique en présence d’allergènes d’acariens, sur
des modèles murins. (Madouri.F et al., 2015)
Par ailleurs, il a été montré que l’augmentation de la concentration extra-cellulaire en ATP, la
hausse de la concentration intracellulaire en Ca2+, l’important efflux de K+ induisent
l’activation de l’inflammasome. (Murakami.T et al., 2012), (Pétrilli.V et al., 2007). C’est tout
ces facteurs qui permettent l’augmentation de concentration intracellulaire des ROS, puis
l’activation de l’inflammasome NLRP3.(Figure 4) (Zhou.R et al., 2010)
L’inflammasome est responsable de l’induction d’un phénomène de mort cellulaire
programmée : la pyroptose.
La pyroptose est caractérisée comme une « mort cellulaire inflammatoire programmée ».
L’implication principale de l’inflammasome NLRP3 dans la pyroptose est le clivage et
l’activation de la Gasdermine D par la caspase-1. La Gasdermine D, une fois clivée et
activée, va induire une génération de pores dans la membrane. (Liu.X et al., 2016). Ces pores
membranaires pourraient être à l’origine de la libération des alarmines.
Figure 5: IL-1β augmente l’expression de XPO1 (CRM1) via la voie des MAPK, ce qui
induit un relargage plus important de HMGB1. (Kazuhide Hayakawa et al, 2010).
Panel de gauche : Western Blot représentant le taux d’expression de HMGB1 dans les
astrocytes en présence d’IL-1β seul, ou en présence d’IL-1β et une concentration croissante
de U0126 (0.1 à 10 µM) (Inhibiteur de la voie de signalisation ERK). La normalisation est
réalisée avec la β-actine. Panel de droite : L’expression protéique de XPO1 est mesurée dans
des astrocytes sans IL-1β (control) et dans des astrocytes en présence IL-1β (100pg/mL) avec
ou sans U0126 (10µM) (Inhibiteur de la voie de signalisation ERK).
11
IV. Décrochage d’IL-33 de la chromatine et sortie de la cellule
Le mécanisme par lequel IL-33 se détache de la chromatine est aujourd’hui inconnu.
En comparaison, l’alarmine HMGB1 (une cytokine pro-inflammatoire), est elle aussi
complexée à la chromatine. Son export du noyau est précédée de différentes modifications
post traductionnelles (MPT) (Tang.Y et al., 2016). Aucune MPT n’a à ce jour été identifiée
sur IL-33 mais c’est une possibilité à ne pas exclure.
IL-33 est relarguée dans le milieu extracellulaire par au moins 2 mécanismes :
- Un relargage passif, pendant la nécrose. Les pores formés dans la cellule nécrotique
permettent la sortie de l’alarmine.
- La littérature indique qu’il existe également un mécanisme actif de sécrétion non-
canonique, qui n’implique pas de passage par l’appareil de Golgi (pas de séquence
signal sur IL-33). La sécrétion non-canonique semble être dépendante de la
concentration calcique intracellulaire et de la concentration en ATP extracellulaire.
(Lefrançais & Cayrol, 2012)
Dans leur étude en 2010 (Hayakawa.K et al., 2010), Hayakawa et ses collaborateurs
démontrent l’implication de la cytokine IL-1β dans le relargage de l’alarmine HMGB1. Cette
étude est réalisée dans des astrocytes, un parallèle avec les cellules épithéliales des voies
respiratoires dans le relargage d’IL-33 peut être imaginé mais ne peut cependant pas être
considéré comme vrai sans vérifications.
Dans cet article, ils démontrent que la présence d’IL-1β augmente le taux d’expression de la
protéine XPO1 (CRM1), une exportine responsable du décrochage de HMGB1 de la
chromatine et de son export vers le cytoplasme (Figure 5). Dans un contexte pyroptotique, la
sortie de HGMB1 du cytoplasme pourrait être médiée par la formation de vésicules de
Gasdermine D. Un mécanisme similaire pourrait donc être envisagé pour le relargage d’IL-33
avec l’aide d’une protéine de type XPO1.
Figure 6 : Voie de signalisation hypothétique de la détection de l’allergène par une cellule
jusqu’au relargage d’IL-33. La reconnaissance des protéases de l’allergène A.Alternata par le
récepteur PAR2 entraîne une augmentation de la concentration intracellulaire de Ca2+ et un
efflux de K+ et d’ATP. L’ATP est reconnu par les récepteurs purinergiques P2Y2 et P2X7 qui
induisent une production de ROS. Ces ROS induisent l’activation de l’inflammasome
NLRP3. La caspase-1 clive et active la Gasdermine D qui génère des pores dans la membrane
plasmique. De plus, la caspase-1 clive et active IL-1β. Dans les astrocytes, l’augmentation
d’IL-1β dans la cellule active la voie des MAPK (ERK), ce qui augmente le taux
d’expression de la protéine XPO1 et favorise le relargage de l’alarmine HMGB1. Nous
formulons les hypothèses qu’un mécanisme similaire pourrait exister pour IL-33, et que cette
dernière pourrait sortir ensuite de la cellule par des vésicules formées par la Gasdermine D.
(?) : hypothèses à confirmer dans un contexte de réaction inflammatoire allergique.
Contours verts (IL-1β / ERK1/2 / XPO1) : études réalisées dans des astrocytes murins.
Les “?” représentent les informations qui n’ont jamais été vérifiées dans un contexte de
réaction inflammatoire allergique induite par les protéases d’allergène.
13
D’autres résultats semblent confirmer l’hypothèse d’une protéine responsable du décrochage
d’IL-33 de la chromatine. En effet, XPO1 reconnaît sur HMGB1 une séquence d’export
nucléaire (NES), riche en leucine (Bonaldi.T, 2003). Lorsque l’on observe la séquence
primaire d’IL-33, on remarque dans son domaine N-terminal, sur l’exon 3 une région
hydrophobe riche en leucine pouvant représenter un site de reconnaissance d’une protéine
responsable de l’export du noyau.
De plus, il est possible que la sortie d’IL-33 de la cellule se fasse par un système de vésicules
lysosomales, comme cela a été démontré concernant IL-1β, notamment en réponse à
l’internalisation des récepteurs purinergiques P2Y2 après reconnaissance de l’ATP
extracellulaire. (Lefrançais.E & Cayrol.C, 2012), (Qu.Y et al., 2007)
D’après les informations recueillies dans la littérature, nous avons mis au point une voie de
signalisation hypothétique de la détection de l’allergène au relargage d’IL-33 (Figure 6).
Notre projet de recherche vise à valider cette voie de signalisation hypothétique par
différentes approches. Premièrement, une approche globale utilisant une technique innovante.
Ensuite, nous réaliserons différentes expériences de la quantification d’IL-33 relarguée en
inhibant différent points clés de cette voie hypothétique. Enfin, nous souhaitons rechercher
d’éventuelles modifications post-traductionnelles sur l’IL-33 relarguée, et identifier les
protéines responsables de ces potentielles modifications in vitro.
15
I. Lignées cellulaires
HMEC-1 : cellules endothéliales microvasculaires immortalisées. 10ng/mL Epidermal
Growth Factor (EGF), 1 µg/mL hydrocortisone, 10 mM glutamine, fetal bovine serum (FBS)
concentration finale : 10%
HBEC3-KT : cellules épithéliales pulmonaires immortalisées. Airway epithelial cell basal
medium (ATCC PCS-300-030) supplémenté avec le bronchial epithelial cell growth kit
(ATCC PCS-300-040)
Conditions de culture : air 95%, CO2 5%, température 37°C
Pour notre étude, nous souhaitons vérifier cette voie de signalisation hypothétique basée sur
nos découvertes dans la littérature, sur ces deux lignées cellulaires, des cellules endothéliales
microvasculaires HMEC-1 et des cellules épithéliales pulmonaires HBEC3-KT. Nous avons
choisi ces deux lignées puisque ces deux types cellulaires expriment IL-33 constitutivement.
De plus, nous avons sélectionné ces deux lignées puisqu’elles proviennent des tissus en
contact direct avec les allergènes lors d’une réaction inflammatoire allergique : les cellules
épithéliales pulmonaires et les cellules endothéliales des microvaisseaux pulmonaires.
L’objectif est d’observer les mécanismes de détection et de signalisation de la réaction
inflammatoire allergique dans un environnement correspondant le plus possibles aux
conditions physiologiques dans le poumon d’un individu exposé aux allergènes, bien que
nous nous plaçons in vitro.
L’utilisation des faibles concentrations d’allergènes A.alternata (<20µg/mL) suffit à induire
une réponse cellulaire médiée par les récepteurs PAR2. Une forte concentration d’A.Alternata
sur les cellules (20-120 µg/mL) provoque la mort des cellules par nécrose. La nécrose va
nécessairement relarguer de l’IL-33 dans le milieu. Nous allons donc utiliser des
concentrations faibles en allergène, afin de ne pas se placer en conditions nécrotiques et
empêcher un relargage passif de l’IL-33 qui “masquerait” le relargage actif que nous
cherchons à étudier.
De plus, dans toutes nos expériences, nous réaliserons nos mesures aux alentours de 5
minutes après induction de la réaction inflammatoire allergique. De cette manière, nous
pouvons une fois de plus limiter au maximum le signal IL-33 provenant des cellules
nécrotiques. Nous nous basons sur un temps de réaction de 5 minutes, puisque c’est 5
minutes après exposition de cellules aux allergènes que Cayrol.C et al. 2018 observent les
premières protéines IL-33 relarguées dans le milieu.
17
II. Approche globale, validation du modèle
Cette première étape de notre projet est une approche globale visant à confirmer les résultats
observés dans la littérature et possiblement identifier de nouveaux partenaires jusqu’alors
jamais détectés.
Nous souhaitons ici utiliser une technique brevetée par la société « INOVIEM Scientific », le
NPOT (Nematic Protein Organisation Technique). Basée sur la théorie de l’encombrement et
de l’agrégation moléculaire de Kirkwood-Buff (Gee.MB & Smith.PE, 2009), la technique
NPOT permet la formation et l’identification de complexes macromoléculaires impliqués
dans des processus physiologiques ou pathologiques. Le NPOT permet donc l’analyse
d’interactions ligand-protéines et protéines-protéines dans des cellules, sans modifier la
conformation moléculaire native du complexe macromoléculaire étudié. Nous allons exposer
nos 2 lignées cellulaires à l’allergène A.alternata et les équipes d’INOVIEM Scientific vont
par la suite être en mesure de complexer toutes les protéines impliquées dans le relargage
d’IL-33, et de les fixer en hétéro-assemblages. Ces hétéro-assemblages sont ensuite séparés et
analysés un par un, par spectrométrie de masse.
L’utilisation de cette technique permettrait de valider l’implications des récepteurs PAR2 et
purinergiques observée dans la littérature. Snelgrove.RJ et al. démontrent en 2014 que
l’inhibition des récepteurs PAR2 et purinergiques entraînent une diminution de la quantité
d’IL-33 relarguée dans les lavages de fluides broncho-alvéolaires de souris exposées à
l’allergène A.alternata. De nombreux autres articles indiquent que l’activation de ces
récepteurs s'accompagnent d’une augmentation de la concentration extra-cellulaire d’ATP et
la production d’espèces réactives à l’oxygène. C’est ces ROS qui seraient responsables de
l’activation de l’inflammasome NLRP3 (Harijith.A & Ebenezer DL, 2014). Nous espérons
donc observer l’inflammasome NLRP3 dans les hétéro-assemblages formés par la technique
NPOT. Nous espérons également observer dans les hétéro-assemblages les partenaires
impliqués dans la signalisation en aval de l’inflammasome : les cytokines IL-1β et IL-18,
ainsi que la suite de la voie : les protéines ERK1/2, la protéine responsable du décrochage
d’IL-33 et IL-33.
Figure 7 : La technique NPOT permet l’analyse de l’interactome, par formation d’un hétéro-
assemblage. (Figure tirée de Wang.L et al., 2018).
a-/ Le NPOT (Nematic Protein Organisation Technique) a été réalisé dans des conditions
stériles à 4°C. Les extraits de THP-1 (le type cellulaire de l’étude) ont étés sujets au système
NPOT de formation des hétéro-assemblages. Après l’isolation des hétéro-assemblages, ces
derniers sont placés sur des plaques 96 puits, sous la forme de gouttes d’huile minérale. Les
hétéro-assemblages sont ensuite directement analysés par spectrométrie de masse dans le
liquide formé par la goutte.
b-/ Capture d’un hétéro-assemblage dans une goutte sur une plaque 96 puits. Les hétéro-
assemblages sont entourés en pointillés (flèche rouge) sur les 3 expériences (experiment
1,2,3). Les protéines qui n'interagissent pas précipitent et se retrouvent au fond du puits, dans
les expériences 1 et 2. Le “latter” (flèche noire), dû aux vibration induites par la ventilation
de l’incubateur, apparaît sur le contour du puits dans l’expérience 3. Le contrôle (DMSO)
sans le ligand evodiamine (ligand utilisé dans cette étude) ne montre pas d’hétéro-
assemblages.
19
L’objectif principal de l’utilisation de la technique NPOT est de valider les informations
obtenues dans la littérature, cependant nous ne pouvons pas exclure la possibilité que ces
résultats de NPOT identifient de nouveaux partenaires impliqués dans la réaction
inflammatoire allergique et le relargage d’IL-33. On peut imaginer la découverte de
nouveaux récepteurs impliqués dans la détection de l’allergène (nous savons déjà que le
récepteur TLR4 joue un rôle dans la détection de l’allergène mais nous nous sommes
focalisés sur l’effet des protéases d’allergènes et non l’allergène dans son entièreté) et/ou de
nouveaux partenaires protéiques dans la voies de signalisation menant au relargage d’IL-33
dans le milieu extracellulaire.
Brièvement, des lysats cellulaires de HMEC-1 et HBEC3-KT seront préparés par des cycles
de congélation puis décongélation, en l’absence de détergents, d’agents réducteurs et
d’inhibiteurs de phosphatases et protéases. Ces lysats cellulaires seront ensuite incubés avec
l’allergène A.alternata (5 minutes). Un système de microdialyse avec gradient de pH
permettra la formation des hétéro-assemblages. Les hétéro-assemblages seront isolés dans
l’huile minérale, séparés par microdissection sous microscope, lavés à l’acétone avant d’être
solubilisés dans une solution HBSS (hepes buffer saline solution). Les hétéro-assemblages
solubilisés seront ensuite analysés par spectrométrie de masse (ESI-QTOF-MS/MS). La
société INOVIEM possède ses propres logiciels et bases de données pour l’identification des
différentes protéines présentes dans les hétéro-assemblages. Leur technologie leur permet
donc de déterminer avec fiabilité les probabilités d’interactions protéine-protéine et protéine-
ligand pour un tissu ou une lignée cellulaire spécifique et comparer ces données bio-
informatiques avec les résultats récoltés en spectrométrie de masse (Figure 7).
Nous sommes confiants concernant l’efficacité de cette technique et pensons qu’elle
représente un bon point de départ pour notre projet.
21
III. Etude du rôle des récepteurs PAR2 et purinergiques
Notre objectif ici est de vérifier l’implication des récepteurs dans la réaction inflammatoire
allergique observée dans la littérature et de suivre les résultats obtenus par la technique
NPOT.
L’implication du récepteur PAR2 et purinergiques dans la reconnaissance des allergènes est
avérée dans la littérature. (Snelgrove.RJ et al., 2014) (Müller.T et al., 2010) L’étude de
l’inhibition des deux familles de récepteurs (PAR et purinergiques) en même temps n’a
jamais été étudiée cependant.
Nous pensons observer une diminution de la quantité d’IL-33 dans le milieu extracellulaire
de cellules stimulées par A.alternata après inhibition de PAR2, idem après inhibition de P2Y2
et P2X7, ainsi qu’une diminution encore plus importante lorsque les récepteurs sont tous
inhibés.
Nous utiliserons ici un inhibiteur de l’activité de PAR2 : AEBSF, (fluorure de 4-(2-
aminoéthyl)benzènesulfonyle) qui est un inhibiteur hydrosoluble irréversible des protéases à
sérine. L’efficacité de l’AEBSF a déjà été démontrée sur des modèles murins wild type et
ST2-/- (récepteur spécifique d’IL-33). Une pré-incubation d’A.alternata avec AEBSF avant
d’induire la réaction inflammatoire allergique sur des souris diminuait la quantité d’IL-33
relarguée dans les fluides broncho-alvéolaires des souris (Snelgrove.RJ et al. 2014). Nous
souhaitons ici examiner l’effet de cet inhibiteur sur des cellules humaines.
Nous comptons également utiliser un inhibiteur des récepteurs purinergiques P2Y et P2X : la
suramine. Utilisée premièrement pour traiter la maladie du sommeil, puis comme un
anticancéreux et un antiviral pour ses propriétés inhibitrices de la transcriptase inverse, la
suramine est également un antagoniste des récepteurs purinergiques. Elle bloque la
signalisation entrainée par les récepteurs P2X et P2Y (Hoyle CH. et al., 1990) . Nous nous
attendons donc à :
- une inhibition de la hausse de concentration d’ATP extracellulaire
- une inhibition de la production de ROS
- une diminution de la quantité d’IL-33 relarguée dans les surnageants des cellules
lorsque nous traitons les cellules avec la suramine avant d’induire la réaction inflammatoire
allergique par A.alternata.
23
La quantité d’IL-33 dans les surnageants de HMEC-1 et HBEC3-KT sera mesurée par test
ELISA (anticorps anti IL-33, anticorps secondaire AlexaFluor 488) après stimulation par
A.Alternata (5 minutes)(contrôle), par A.alternata incubé avec AEBSF, par A.alternata
incubé avec la suramine,puis par A.alternata incubé avec AEBSF et la suramine. Nous
pouvons également quantifier l’ATP extracellulaire, la quantité de Ca2+ et K+ extracellulaire
et la quantité de ROS.
25
IV. Etude du rôle de l’inflammasome dans le relargage d’IL-33
Dans leur article, Gicquel et al., montrent le mécanisme d’activation de l'inflammasome
NLRP3, acteur du relargage actif de l’alarmine HMGB1 et qui de ce fait représente un acteur
potentiel du relargage d’IL-33. L’'inflammasome NLRP3 a été décrit comme pouvant être
activé par différentes voies, il a en effet été montré que l’inflammasome pouvait être activé
par un efflux de potassium K+ et une production de ROS en réponse à l’augmentation de
l’ATP dans le milieux extracellulaire après induction d’un stress. (Harijith.A et al., 2014)
L’inflammasome est potentiellement le centre de notre mécanisme car il peut répondre aux
signaux induit par les récepteurs membranaires PAR2, P2Y2 et P2X7 et permettre d’induire le
relargage d’IL-33 par l’activation de la caspase-1 et de la Gasdermine D dans un contexte
d’inflammation allergique.
Lors de nos manipulations, nous nous attendons à observer plusieurs choses :
- qu’en présence d’un inhibiteur de l’inflammasome et de l'allergène A.Alternata, nos
cellules ne relarguent pas d’IL-33.
- qu’en absence d'inhibiteur de l’inflammasome et en présence de l’allergène
A.Alternata, nos cellules relarguent IL-33.
Au vu de ses résultats nous pourrions avancer que l’inflammasome NLRP3 joue un rôle dans
le relargage d’IL-33.
Pour montrer que l’inflammasome NLRP3 est impliqué dans ce mécanisme de relargage,
nous allons utiliser les deux lignées cellulaires décrites précédemment : HMEC-1 et HBEC3-
KT. Pour inhiber l’activation de l’inflammasome, nous utiliserons MCC950. Le MCC950
(InvivoGen), est un inhibiteur puissant et sélectif de l’inflammasome NLRP3. Il va bloquer
l’activation d’IL-1β induite par les activateurs de l’inflammasome, tel que l’ATP, en
empêchant l’oligomérisation de la protéine adaptatrice de l’inflammasome : ASC. Nous
avons aussi choisi cet anticorps car il n’inhibe pas les autres inflammasomes (AIM2, NLRC4
et NLRP1) ce qui permettrai d’éviter les faux positifs ou négatifs.
27
Pour les manipulations nous réaliserons plusieurs conditions. Tout d’abord il nous faudra un
contrôle négatif, c’est à dire sans relargage d’IL-33. Pour cela, il faut cultiver nos cellules
HMEC-1 et HBEC3-KT dans des conditions de cultures normales et récupérer le milieu
extracellulaire de la même manière que pour nos tests précédents. Comme contrôle positif,
nous montrerons qu’il y a un relargage d’IL-33 lorsque les cellules sont exposées à
A.alternata.
Pour notre test, nous mettrons en présence nos cellules avec l’allergène ainsi qu’avec notre
inhibiteur de l’inflammasome NLRP3. Les cellules seront cultivées normalement et mise en
présence de l’inhibiteur et de l’allergène pendant 5 min, puis nous récupérerons le milieu
extracellulaire.
Les quantités d’IL-33 dans les surnageants des cellules seront évaluées par test ELISA. Nous
évaluerons également la quantité d’IL-1β présente dans les surnageants, également par test
ELISA.
29
V. Etude du rôle d’IL-1β et de la voie des MAPK dans le relargage d’IL-33
Nous souhaitons ici vérifier l’implication de la cytokine IL-1β et de la voie des MAPK dans
le relargage d’IL-33.
Dans leur article, Hayakawa.K et al., 2010 démontrent que l’activation d’IL-1β par
l’inflammasome NLRP3 induit une augmentation du nombre de protéines ERK1/2
phosphorylées par rapport au nombre de ERK1/2 total. Cette stimulation de la voie des
MAPK induit par la suite une augmentation du taux d’expression de la protéine XPO1, une
exportine jouant un rôle dans le relargage actif de l’alarmine HMGB1. Cette étude est
réalisée dans des astrocytes primaires de rats.
Du fait des similitudes entre HMGB1 et IL-33, notre objectif est de vérifier si cette
signalisation inflammasome NLRP3/IL-1β/MAPK intervient dans les cellules épithéliales et
endothéliales (ce qui constitue un modèle cellulaire différent de cellules d’astrocytes
primaires) lors de la reconnaissance d’un allergène, et participe au relargage actif d’IL-33.
Nous disposons ici d’une solution de protéines IL-1β recombinantes, d’un inhibiteur des
protéines ERK1/2 : U0126, et d’anticorps spécifiques des protéines ERK1/2 phosphorylées et
ERK1/2. Nous souhaitons ici traiter nos deux lignées cellulaires avec une solution de
protéines IL-1β recombinantes, et observer si la quantité de protéines ERK1/2 phosphorylées
augmente avec l’augmentation de la quantité d’IL-1β dans le milieu. Nous évaluerons
également la quantité d’IL-33 relarguée dans les surnageants de cellules traitées par
l’inhibiteur U0126 (inhibiteur des protéines ERK1/2).
Brièvement, nos expériences pour cette partie du projet seront :
- Un dosage de la quantité de protéines ERK1/2 phosphorylées par rapport à la quantité
de ERK1/2 totales par western blot sur des lysats de cellules non traitées, et un dosage
de la quantité d’IL-33 par ELISA sur les surnageants de cellules non traitées comme
contrôle négatif.
- Les mêmes expériences sur des cellules après 24h d’incubation avec une solution
d’IL-1β recombinante. Différentes concentrations d’IL-1β seront testées.
- Les mêmes expériences sur des cellules après 24h d’incubation avec une solution
d’IL-1β et d’inhibiteur U0126. Différentes concentrations d’IL-1β et U0126 seront
testées.
31
Nous disposerons d’anticorps Anti-Phospho-p44/42 MAPK (ERK 1/2) pour ERK
phosphorylée (Cell Signaling technology), Anti-MAPK (ERK 1/2) pour ERK1/2 non
phosphorylée (Cell Signaling technology)
En présence d’IL-1β, nous nous attendons à une augmentation de la quantité d’IL-33
relarguée dans le milieu et une augmentation de la quantité de protéines ERK1/2
phosphorylées par rapport à la quantité d’ERK 1/2 totale. L’inhibition de la voie des MAPK
devrait diminuer le relargage d’IL-33 dans les surnageants de nos cellules.
33
VI. Recherche de modifications post-traductionnelles sur l’IL-33 relarguée
L’alarmine HMGB1 peut subir plusieurs modifications post-traductionnelles (MPT). Ces
modifications semblent avoir un rôle important sur la localisation de HMGB1 et de ce fait
pour son déplacement du noyau vers le cytoplasme (Kang.R et al., 2014). Dans notre étude,
une des hypothèses possibles serait que ces modifications post-traductionnelles interviennent
dans le décrochage d’IL-33 de la chromatine et donc par la suite, à son relargage du noyau au
cytoplasme.
HMGB1 peut subir plusieurs MPT :
- une hyper-acétylation, en réponse à divers stimuli tels que l’exposition à IL-1β ou le
LPS, nécessaire à son export du noyau.
- une ADP-ribosylation nécessaire à son export nucléaire dans la nécrose
- une méthylation nécessaire à sa sortie du noyau dans les neutrophiles
- une phosphorylation de ses résidus sérine dans ses séquences NLS (nuclear
localization sequence) qui affecte son affinité de liaison à l’ADN.
Enfin un des acteurs du transport d’HMGB1 pourrait être son état redox. L’HMGB1 humaine
contient trois cystéines (positions 23, 45 et 106), la cystéine 106 est nécessaire pour la
localisation dans le noyau, car la mutation de C106, mais pas les mutations C23 et C45,
favorise la translocation de HMGB1 du noyau au cytosol. (Bonaldi.T, 2003) (Janko.C et al.,
2014)
Au vu de ces résultats et des similitudes existant entre HMGB1 et IL-33, notre objectif est
d’identifier si IL-33 possède des MPT qui interviendrait dans sa relocalisation vers le
cytoplasme. Nous nous attendons à identifier des MPT du même type que celles trouvées
pour HMGB1 dans la littérature.
Pour étudier la possibilité de MPT, nous souhaitons réaliser des analyses de spectrométrie de
masse. Nous exposerons nos cellules à A.Alternata et récupéreront le surnageant. Nous
purifierons l’IL-33, puis l’analyserons par HPLC-ESI-TQMS. Nous allons pouvoir comparer
la masse d’IL-33 connue dans les banques de données à celle obtenue par MS. Un incrément
de masse nous donnera une indication sur la présence et sur le type de MPT. Par la suite, nous
pouvons effectuer des expériences de MS/MS ce qui va nous permettre de confirmer le type
de MPT et surtout d’identifier sur quel résidu à lieu la MPT.
35
Une fois la MPT identifiée, nous pouvons réaliser une analyse bio-informatique. L’objectif
est ici d’identifier quelles protéines nucléaires sont susceptibles de réaliser la MPT identifiée
sur notre alarmine. De plus, si nous parvenons à identifier le site de la MPT, nous pourrons
augmenter la spécificité de notre crible en ne sélectionnant que les protéines pouvant réaliser
la MPT sur ce site précis.
37
VII. Recherche d’une protéine impliquée directement dans l’export d’IL-
33 du noyau
Notre objectif suivant est d'identifier la protéine responsable du transport d’IL-33 du noyau
vers le cytoplasme. Le candidat le plus probable pour la translocation d’IL-33 du noyau vers
le cytoplasme est la protéine XPO1. Cette protéine fait partie de la famille des exportines. Ce
sont des protéines nucléaires impliquées dans le transport protéique actif de macromolécules
de taille supérieure à environ 50 kDa. (Aggarwal.A & Agrawal.DK, 2014).
Les partenaires impliqués dans la translocation d’IL-33 sont à ce jour inconnus. XPO1 est
responsable de l’export de l’alarmine HMGB1 du noyau vers le cytoplasme. L’exportine
XPO1 reconnaît une séquence d’export nucléaire (NES) riche en Leucine, présente sur
certaines protéines nucléaires. XPO1 va permettre leur passage à travers la membrane
nucléaire jusqu’au cytoplasme. Il nous semble donc possible que XPO1 puisse également être
responsable de la translocation d’IL-33, du fait des nombreuses similarités trouvées entre les
deux alarmines.
XPO1 étant responsable du transport de nombreuses protéines pro-tumorales (ex : p53)
(Gandhi.UH et al., 2018), de nombreux inhibiteurs de cette protéine ont été synthétisés dans
l’optique de créer un nouveau médicament anti-cancéreux. Parmi eux, on retrouve la
leptomycine B (Kudo.N et al., 1999) ou encore le selinexor (KPT-330), actuellement en tests
de phase II pour une autorisation de mise sur le marché pour traiter la leucémie aiguë
myéloïde.
Nous souhaitons observer l’effet de la leptomycine B et du selinexor sur le relargage d’IL-33
dans nos deux modèles cellulaires. Si XPO1 joue un rôle dans le relargage d’IL-33, nous
nous attendons à une diminution de la quantité d’IL-33 relarguée dans les surnageants de nos
cellules HMEC-1 et HBEC3-KT.
Brièvement :
- notre contrôle négatif sera un dosage d’IL-33 sur les surnageants de cellules non
traitées
- notre contrôle positif sera un dosage d’IL-33 sur des cellules exposées à A.Alternata
- notre test sera effectué sur des cellules traitées par la leptomycine B ou le selinexor et
A.Alternata
La quantité d’IL-33 dans les surnageants des cellules sera déterminée par test ELISA, avec un
anticorps anti-IL-33 comme anticorps primaire, et un anticorps AlexaFluor 488 (conjugué à
un fluorophore) comme anticorps secondaire.
39
Cependant, nous ne pouvons pas exclure que d’autre protéines soient impliquées dans la
translocation d’IL-33. Les candidats les plus probables autres que XPO1 sont les autres
protéines appartenant à la famille des exportines, soit XPO2, XPOT, XPO4, XPO5, XPO6 et
XPO7. Nous pouvons exclure XPO5, XPO6 et XPOt qui ne transfèrent pas des protéines et
XPO2 qui sert à l’export de l’importine-α, une fois que celle-ci a relarguée sa protéine cargo
dans le noyau. (Kutay et al, 1997). Les candidats les plus probables pour l’export d’IL-33
sont XPO4 et XPO7. Ces deux protéines sont également responsables du transport de
protéines hors du noyau (Aksu.M et al., 2016) (Mingot.JM et al., 2004) mais leur spécificité
n’est à ce jour pas définie.
Nous souhaitons observer si ces deux protéines ont un rôle dans le relargage d’IL-33. Il
n’existe aucun inhibiteur de XPO4 et XPO7 sur le marché, nous souhaitons donc réaliser des
expériences de Knockdown sur ces deux protéines. Les gènes xpo4 et xpo7 sont connus, nous
souhaitons donc diminuer l’expression de ces deux protéines en utilisant des siRNA dirigés
contre les ARNm de ces deux protéines.
Brièvement, nous réaliserons deux jeux de siRNA, un pour chaque protéine. Chaque jeu sera
composé de 3 siRNA : deux qui ciblent la protéine, et un siRNA “untargeted”. L’efficacité de
nos siRNA sera déterminée par RT-qPCR. Enfin, pour tester le rôle de XPO4 et XPO7 sur le
relargage d’IL-33, nous réaliserons les mêmes expériences que celles réalisées précédemment
pour XPO1, à savoir :
- un contrôle négatif : dosage de la quantité d’IL-33 dans les surnageants de cellules
non traitées
- un contrôle positif : dosage de la quantité d’IL-33 dans les surnageants de cellules
traitées par A.Alternata
- dosage de la quantité d’IL-33 dans les surnageants de cellules transfectées par un jeu
de siRNA puis traitées par A.Alternata
Nous pouvons également doser la quantité d’IL-33 relarguée lorsque nous faisons agir les
deux jeux de siRNA en même temps. Si nous observons une diminution encore plus
importante qu’avec un seul jeu de siRNA, cela signifiera que les deux exportines jouent un
rôle dans le relargage d’IL-33.
41
Conclusion / perspectives
La réaction inflammatoire allergique joue un rôle dominant dans les pathologies allergiques
telles que l’asthme. Cette dernière est une maladie inflammatoire chronique qui touche plus
de 235 millions de personnes dans le monde. De nombreux traitements existent pour atténuer
les symptômes de la maladie ou pour calmer une crise mais il n’existe à ce jour aucun
traitement permettant d’éliminer complètement la pathologie.
L’identification de tout l’interactome dans la réaction inflammatoire allergique pourrait
mener à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement des maladies
inflammatoires, et à terme permettre l’élaboration de traitements efficaces contre ces
pathologies.
Nous espérons déterminer tous les intervenants dans la réaction inflammatoire allergique
médiée par les protéases d’allergènes. Notre projet s’articule sur 4 grands axes : une première
approche globale nous permettant de vérifier nos hypothèses et potentiellement identifier de
nouveaux intervenants dans la voie ; la validation de l’implication des récepteurs PAR2 et
purinergiques dans la reconnaissance des protéases d’allergène et l’activation de
l’inflammasome ; l’effet de l’inflammasome sur la voie des MAPK et le relargage d’IL-33 ;
l’identification de la protéine responsable du décrochage d’IL-33 de la chromatine et de son
export du noyau vers le cytoplasme.
Si nos résultats s’avèrent être en conformité avec nos observations préliminaires, il restera
cependant à déterminer les modalités de sortie d’IL-33 du cytoplasme. D’après notre voie de
signalisation hypothétique, l’IL-33 libérée du noyau sort de la cellule par des pores
membranaires formés par la Gasdermine D. Pour visualiser ce phénomène, nous pouvons
imaginer réaliser des expériences d’imagerie de fluorescence, en utilisant la technique de
microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF)(ou microscopie à onde
évanescente). Cette technique permet d’examiner très précisément une tranche très fine d’un
échantillon (200nm). Nous pensons que cette technique peut être utilisée dans une expérience
de double marquage, la Gasdermine D marquée et l’IL-33. Il serait alors techniquement
possible de déclencher la réaction inflammatoire allergique et d’observer en microscopie
TIRF l’internalisation d’IL-33 dans les vésicules tapissées de Gasdermine D et l’exocytose de
ces vésicules. Ces observations valideraient une fois de plus notre modèle, en indiquant que
l’inflammasome NLRP3 est à la fois impliqué dans le décrochage d’IL-33 par la stimulation
43
de la voie des MAPK et à la fois impliqué dans son relargage par le clivage et l’activation de
la Gasdermine D.
D’un autre côté, si nous parvenons à identifier les partenaires protéiques pouvant être
impliqués dans le décrochage de la chromatine et la sortie du noyau d’IL-33, il conviendra de
confirmer ces résultats. Nous pouvons imaginer réaliser des expériences de co-
immunoprécipitation d’IL-33 et de ces protéines. Toutes les expériences de notre projet de
recherche sont réalisées in vitro, aussi si nos résultats s’avèrent prometteurs, nous pouvons
également imaginer une reproduction des manipulations effectuées ici sur des modèles
murins, pour valider notre modèle in vivo.
Ce projet s’oriente donc principalement sur l’élucidation du mécanisme de relargage de l’IL-
33 et sur l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques, avec à terme l’objectif de
développer de nouveaux médicaments pour traiter l’asthme et les réactions inflammatoires
allergiques.
45
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