Induzierbare Enzyme:
Genotypische und phänotypische Charakterisierung der bgaR-Disruptionsmutante Bacillus megaterium MS970
Prof. Dr. F. Meinhardt B-Kurs Mikrobielle Molekularbiologie
Institut für Mikrobiologie WWU Münster
- Ergebnisse WS 02/03 -
1. und 2. Woche: genotypische Charakterisierung
- Isolation chromosomaler DNA aus B. megaterium DSM319/MS970
- Restriktion mit HincII
- Gelelektrophorese
- Transfer auf Nylonmembran (Southern Blot)
- Nachweis zweier Restriktionsfragmente mit bgaR-Anteilen
Genetische Organisation der bgaR-Disruptionsmutante MS970 im Vergleich zum Wildtyp DSM319
1.4
1.4
2.6
3.4
Der Stamm MS970 ist Glucanase-positiv, der Stamm DSM319 negativ
Gelelektrophoretische Überprüfung der isolierten chromosomalen DNA
HincII-Restriktion der chromosomalen DNA
Hybridisierung der chromosomalen DNA mit einem Digoxygenin-markierten EcoRI-Fragment aus pUCXL
Ergebnis des Southern-Blots
Quantifizierung der -Galactosidase-Aktivität
O
CH2OH
OH
OH
OH O
NO2
O
CH2OH
OH
OH
OH
OH
+ HO
NO2
ONPG (farblos) Galaktose o-Nitrophenol (gelb)
420
546
ODOD V t
Miller - Units
1000
OD420 Extinktion bei 420 nmOD546 Extinktion der Probe bei 546 nm zum Zeitpunkt der ProbenahmeV Probenvolumen (in ml)t Zeit der Inkubation mit ONPG (in min)
Ergebnis des -Galactosidase-Enzymtests
Der bgaM-Promotor ist von CREs (catabolite responsive elements) überlagert
Das bgaR-Genprodukt ist ein positiver Regulator der -Galactosidase-Expression bei B. megaterium
Protokollgliederung
1. Zusammenfassung2. Einleitung
- Prinzip Gendisruption- bgaR / Disruptionsvektor pDXyl- Versuchsziel
3. Material und Methoden- Abweichungen vom Skript- Prinzip des Glucanase-Tests erläutern- Prinzip des Southern-Blot / DIG-System erläutern
4. Ergebnisse- Ergebnis des Glucanase-Tests- Ergebnis des Southern-Blot- Ergebnis des Enzymtests
5. Diskussion- Genotypische Charakterisierung erläutern- Welchen Rückschluß auf die Funktion von BgaR erlaubt der Enzymtest ?- Vergleich der Mechanismen zur Katabolitrepression / Substratinduktion bei E. coli / Bacillus, wo positive/negative Kontrolle ?
6. Literatur7. Anhang
- Pipettierschemata- Einzelwerte der photometrischen Messungen
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