Immunologische Nachweismethoden
Block „Molekularbiologische Arbeitstechniken“
29.10.2004
Sandra Niemeier
Gliederung
• Antigene
• Antikörper
• Antigen-Antikörper-Reaktion
Was passiert nach dem Protein-Blotting?
• Nachweisreaktion durch Antikörper
• Visualisierung
Maus-Antikörper
Einleitung
Begriff der Antigene und Antikörper aus Immunologie
Antikörper in Organismen von Vertebraten unterscheiden
zwischen Eigen und Fremd; spezifische Abwehr von
Pathogenen (Mikroorganismen, Viren)
Wandelbares + adaptives Immunsystem
Hohes spezifisches Bindungsvermögen als
Nachweismethode für versch. Substanzen in Bioanalytik
einsetzbar
Antigene
• Immunologie: Begriff definiert durch „passenden“
Antikörper; lösen Immunantwort aus
• Proteine, Polysaccharide, selten Glycolipide, synthetisch
hergestellte Makromoleküle
• Teilbereiche auf Ag-Oberfläche
reagieren mit Ak
(Epitope, 5-8 Aminosäuren)
Antigene
Voraussetzungen für Immunogenität:
Chemische Differenz des Ag zum immunisierten Individuum
(evolutionäre Distanz)
Größe mind. bis 5-10 kDa
(kleinere Peptide müssen gekoppelt werden)
Zugänglichkeit der Epitope für Ak
(durch Denaturierung teilw. zu verbessern)
Potenz der Epitope bedingt durch Seitenketten der AS:
polare + große Seitenketten sehr bestimmend
Antikörper
• Glycoproteine, sog. Immunglobuline
• Produziert von B-Lymphocyten ( => Knochenmark)
• Antikörperklassen Ig A, D, G, E, M
IgG = 75% der Ak im Organismus
meist gebrauchter Ak für Nachweisreaktionen
leicht zu gewinnen aus Serum nach Immunisieren von Tieren gut löslich, bei 4ºC lange lagerbar
kann mit anderen Substanzen kovalent gekoppelt werden
Größe: 150 kDa
Antikörper
4 UE:
2 ident. leichte Ketten L
2 ident. schwere Ketten H
Y-förmiges Molekül durch
Disulfidbindung und nicht
kovalente WW
Leichte Kette
Schwere Kette
Antigen-Bindungsstelle besteht aus variabler Region der H- und L-Kette
Antikörper - Handhabung
Problem: 1) Verlust der Antikörperaktivität
Schädigung durch bakterielles Wachstum oder
Aggregieren der Moleküle
Lagerung bei 4ºC + Natriumazid
Hinzufügen von 1% BSA2) Austrocknung durch Einfrieren
Ak am stabilsten in Form von Antiserum
Einfrieren kein Problem
Austrocknen bei Einfrieren kleiner Mengen
Röhrchen fest verschließen, Raum über Probe
mögl. klein halten, T-Schwankungen vermeiden
Antigen-Antikörper-Reaktion
Bindung durch
van-der-Waals-Kräfte,
hydrophobe + ionische WW,
Wasserstoffbrückenbindungen
Dissoziationskonstante 10-4 – 10-10 M
(vergleichbar/größer als Enzym + Substrat)
Antikörper meist divalent -> Bindung von 2 Antigenen
Nachweisreaktion
Wenn zu untersuchendes Protein auf Membran geblottet ist… 1) Absättigen des Protein-Blots (Blocking):
Um überschüssige Proteinbindestellen auf Membran zu sättigen
Verhindert unspez. Bindungen der Nachweisreagenzien
schwach gebundene Proteine können abgelöst werden
Trocknen der Membran vor Auftragen d. Blocking-Reagenz
Welche Lösungen?
Nicht-ionische Detergenzien (Tween 20), nicht relevante Proteine (BSA), Proteinmischungen, Milchpulver, Kombis daraus
! Kreuzreaktionen mit Ak ausschließen
Nachweisreaktion
2) Bindung des Erst-Antikörpers
Ak bindet an Protein auf Membran (nicht sichtbar)
Inkubation 1-6 h bei RT oder üN bei 4ºC
Gründliches Entfernen der Lösung (TBS)
3) Bindung des Zweit-Antikörpers an Erst-Antikörper
Erforderlich zur Visualisierung
Aus anderer Spezies als Erst-Antikörper
Zweit-Antikörper an Enzyme, Radionuclide,
Fluoreszenzfarbstoffe gebunden
Nachweisreaktion
Weitere Brückenmoleküle anlagern um noch
größere Verstärkung zu erzielen (Dritt- oder
Viert-Antikörper)
Verstärkung des Signals, da mehrere Zweit-
Antikörper an Erst-Antikörper binden können
Beispiel: Biotin-Avidin-Signalverstärkersystem
Avidin bindet mit sehr hoher Affinität an Biotin
am Zweit-Ak
Avidin ist tetravalent, bindet 3 Enzymmoleküle
Vervielfachung des Signals
Visualisierung
4) Geblottetes Protein mit gebundenen Antikörpern sichtbar machen
A)Zweit-Antikörper trägt Radionuclid-/Fluorophormarkierung
Direkte Visualisierung
Radioaktiver Abfall
Hoher apparativer Aufwand
Radionuclide gut zur Quantifizierung geeignet
(Visualisierung mit Röntgenfilm + Messung am
Szintillationszähler)
Visualisierung
B) Enzym-Markierung
Indirekte Visualisierung
Welche Enzyme?
Meerrettichperoxidase (günstig, wenig sensitiv)
Alkalische Phosphatase (hohe Sensitivität, aber teuer)
Seltener ß-Galaktosidase
ODER: Lichtemittierendes Produkt (Chemilumineszenz)
1 Enzymmolekül setzt viele Substratmoleküle um => Verstärkung
Zur Quantifizierung nur eingeschränkt geeignet (Farbintensität
schwer unterscheidbar)
Visualisierung
Beispiel: Meerrettichperoxidase-System
Zweit-Antikörper hat Meerrettich-
Peroxidase gebunden
Zugabe von
3,3‘Diaminobenzidin
Umsetzung zu braunem
Farbkomplex
• Photographieren, einscannen, bei RT im Dunkeln für kurze
Zeit lagern
Das war‘s, Das war‘s,
Danke für die Danke für die Aufmerksamkeit!Aufmerksamkeit!
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