haziran 2011

25

nuçlar› yüksek background olarakal›n›r. Bu sebeplerden ötürü HPLCsistemlerinde kullan›lan organiksolventlerin de mutlak suretleHPLC derecesinde olmas› gerek-mektedir. Mobil fazda kullan›lan su ve sol-ventlerin safs›zl›¤›n›n yedek parça-lar üzerindeki etkisine de¤inilecekolursa; öncelikli olarak ak›fl yoluüzerindeki check valfler kirlenereksolvent ak›fl›n› sa¤layan pompa üni-tesinin performans›n› düflürür veak›fl kararl›l›¤›n› bozar. Bunun so-nucunda ise al›konma zamanlar›nda tutars›zl›klar ile karfl›lafl›labilir.Ayn› zamanda mobil fazdaki kirlilik-ler kullan›lan kolona ve dedektörüncell ünitesine de zarar verebilirler.

MMoobbiill ffaazzddaakkii ççöözzüünnmmüüflfl OO22 vvee

CCOO22::

UV Dedektör üzerindeki etkisi:Degaze edilmemifl bir solvent kullan›-m› halinde mutlaka birtak›m problem-ler ile karfl›lafl›labilir. Bunlar›n bafl›n-da, özellikle UV dedektör kullan›larakyap›lan analizlerde, mobil fazdaki çö-zünmüfl oksijenden kaynakl› yüksekbackground gelmektedir.

RID dedektör üzerindeki etkisi:RID (refractive index dedector)kullan›larak uygulanan analizlerdeise mobil faz degaze ifllemine ayr›-ca önem verilmelidir. Ifl›¤›n k›r›lmaindisini, referans ve örnek hücrele-ri aras›ndaki fark›na göre sonuç ve-ren bu yüksek hassasiyetli dedek-törde mobil faz içerisindeki çözün-memifl hava baseline dengesini he-men de¤ifltirecektir. Bunun sonu-cunda ise al›nan kromatogramlardaistenmeyen pikler ile karfl›lafl›lmas›mümkündür. Analize bafllamadan önce haz›rla-nan mobil faz mutlaka ultrasonikbanyoda belirli sabit bir s›cakl›k al-t›nda degaze edilmelidir. RF dedektör üzerindeki etkisi:Örnek verilecek olursa çözünmüfloksijen sert plastik ve ilaç fliflesiüretiminde kullan›lan Bisphenol-A’n›n optik ›fl›ma yapmas›n› engel-ledi¤i için bu maddenin analiz so-nuçlar›n› do¤rudan etkiler ve al›nanpik yüksekliklerinin küçülmesinisa¤lar. Bu da yap›lan miktar tayini analiz-lerinde yanl›fl sonuçlar al›nmas›nasebep olur.

EEmmiiflfl ((SSuuccttiioonn)) ffiillttrreessii:: Mobil faz fliflesinin içerisinde bulu-nan ve organik solventler ile direkttemas eden emifl filtrelerinin bak›m›ve belirli periyotlar ile de¤ifltirilmesioldukça önemlidir. Çünkü kullan›mömrünü tamamlam›fl bu filtreler di-rek olarak mobil faz› kontamineeder. Uzun süre temizlenmeyenemifl filtreleri zaman ile paslanabilir.Paslanm›fl emifl filtresinden ç›kanmetal iyonlar› sistemde gürültüyesebebiyet verir. Özellikle LC-MS sistemlerinde veiyon kromatografisi sistemlerindehassasiyetin azalmas›na neden olur.Bu sistemlerde seramik emifl filtresikullan›lmamal›d›r. Baz› tampon çözeltiler ise üremeyapmaya oldukça müsaittir. Özellik-le amino asit analizlerinde üremeyapan mobil faz›n etkisi çözünmüflmateryalleri dedekte ederek analizsonuçlar›n› negatif bir flekilde etki-lenmesi ile görülür.

NNuummuunnee:: Numune içerisindeki çözünmemiflpartiküller ak›fl yolundaki hatlardanbirini, otomatik örnekleyici ç›k›fl›n-daki tubingi veya kolonu t›kar. But›kan›kl›k sistemde yüksek bas›ncasebep olarak analiz sonuçlar›n›ndo¤rulu¤unu etkiler. Bu t›kan›kl›kbaz› durumlarda cihazda çok yüksek

kapak

24haziran 2011

kapa

k

HPLC sistemlerinde kontaminasyon riskleri;

sisteme ve analiz sonuçlar›na yans›malar›

HPLC sistemleri analitik cihazlar içerisinde belki de en komplike ve kontaminasyon riski en fazla olan sistemlerdir. Bu yüzden kontaminasyon

riski oluflturabilecek bütün faktörler detayl› bir flekilde de¤erlendirilip önlem al›nmal›d›r.

Serhat KÖSTEREL‹Elektrik-Elektronik MühendisiAnt Teknik Servis Müdürü

Analitik sistemlerde yap›lananalizlerin güvenilirli¤ini sa¤-lamak en önde gelen konular-

dan biridir. Al›nan sonuçlar›n do¤ru-lu¤unu teyit etmek ad›na bütün etkenfaktörler teker teker de¤erlendirilme-lidir. HPLC sistemleri analitik cihaz-lar içerisinde belki de en komplike vekontaminasyon riski en fazla olan sis-temlerdir. Bu yüzden kontaminasyonriski oluflturabilecek bütün faktörlerdetayl› bir flekilde de¤erlendirilip ön-lem al›nmal›d›r. Kontaminasyon için risk oluflturanfaktörler;

MMoobbiill ffaazzddaa kkuullllaann››llaann ssuu vvee ssoollvveennttlleerrddeenn ggeelleenn ssaaffss››zzll››kkllaarr:: Kullan›lan mobil faz›n içindeki suve solventlerden gelen safs›zl›klar,

analiz esnas›nda özellikle UV de-dektörlü sistemlerde yüksek back-ground oluflturarak sonuçlar›n do¤-rulu¤unu direkt olarak etkiler. Busafs›zl›klar öncelikle baseline’dakidalgalanmalar› art›rarak sisteminstabil olmas›n› engellerler. Al›nansonuçlarda hayalet pik diye tan›m-lad›¤›m›z numuneden veya stan-darttan ba¤›ms›z mobil fazdan kay-naklanan ve istenmeyen pikler eldeedilebilir. Su, bir laboratuvarda kullan›lan enönemli hammaddedir. HPLC ana-lizlerinde de en s›k karfl›lafl›lan hatakayna¤›, mobil faz›n haz›rlanmas›n-da kullan›lan sudan gelen safs›zl›k-lard›r. Su organik ve inorganikmaddeler, iyonik ve non-iyonikmaddeler ile UV absorbent ve flore-san maddeler içerebilmektedir. Su-dan gelen safs›zl›klar baseline kay-malar›na ve hayalet piklere nedenolabilmektedir. Yine düflük kalitede su kullan›m›sisteme veya ay›r›m› gerçeklefltirenkolona ciddi zararlara yol açmakta-d›r. Düflük kalitedeki su, sodyum,kalsiyum, fosfor iyonlar› veya orga-nik maddeler içerebilir. Kullan›m›sonucunda ak›fl yolu üzerindeki mal-zemelerin t›kanmas›; check valflerinhassasiyetinin azalmas›; kolonun t›-kanarak cihaz›n yüksek bas›nçlaraç›kmas› gibi problemler ile karfl›lafl›-

labilir. Yaflanan bu problemlerin so-nucu olarak al›konma zamanlar›nda-ki farkl›l›klar ve pik flekillerinin bo-zuklu¤u hemen göze çarpmaktad›r. Tüm bu problemlerin minimuma in-dirilmesi aç›s›ndan, HPLC analizle-rinde, laboratuvarda elde edilen ul-tra saf su (ters ozmoz, iyon exchan-ge membrane, membrane filtrasyon,UV radyasyon vb. ifllem görmüfl su)veya ticari olarak ‘HPLC derecesin-de su’ ad› alt›nda sat›lan su kullan›l-mas› son derece önemlidir. Sa¤l›kl› sonuçlar için, ayr›ca mobilfaz solventlerinin kalitesi de sonderece önemlidir. Örnek olarak ens›k kullan›lan mobil faz solventle-rinden olan asetonitril düflük kalite-de oldu¤unda, propionitril (CH3CH2 CN) içerebilir ve bunun so-

SHIMADZU Nexera Yeni Nesil UHPLC Sistemi

Mobil Faz içerisindeki Çözünmemifl Hava Kabarc›klar›n›n Kromatograma Hayalet Piklerolarak Yans›mas›

HPLC Sistemlerinde kullan›lan Degazer Ünitesi

Emifl Filtreleri

fi›r›nga Ucu Filtreler

26haziran 2011

kapa

k

bas›nc›n oluflmas› ile sistemin dur-mas›na yol açar. Bu yüzden haz›rla-nan numuneler mutlaka mobil fazlargibi filtre edilip süzülmelidir. Baz› özel durumlarda -numune mikta-r›n›n çok az olmas› gibi- numune filtreedilemez. Hat içi filtreler kullanarakbu sorun çözülmeye çal›fl›labilir.

CCaamm mmaallzzeemmeelleerr::Laboratuvarlarda kullan›lan cammalzemelerin temizlenmesinde kul-lan›lan deterjan bu malzemelerin

üzerinde kalabilir. Cam›n üzerindekalan deterjan özellikle MS analizle-rinde sinyal olarak -örnek olarak eti-len glikol sinyali olarak- görülebilir.Bu yüzden cam malzemelerin temiz-li¤ine çok önem verilmelidir. Aka-binde temizlik validasyonunu yapa-rak kullan›lan malzemelerin güveni-lirli¤ini artt›rmak gerekmektedir.

ÇÇeevvrreesseell ffaakkttöörrlleerr::Ortamda bulunan toz ve kirlilikHPLC modüllerinden özellikle de-

dektör ünitesine ciddi zararlar vere-bilir. Dedektörün optik sistemindebulunan aynalar kontamine olarakhassasiyeti azaltacakt›r. Dedektörenerjisinin azalmas› sonucunda,dedektör modülü ilk aç›ld›¤›ndaenerji testini geçmeyecek ve cihazaç›lmayacakt›r. Bu yüzden labora-tuvar havaland›rma sistemi çok iyihava sirkülasyonunun sa¤land›¤› veortam s›cakl›¤›n› stabil tutabilen birsistem olmad›r. Ortam s›cakl›¤›ndan öte cihaz içeri-sindeki s›cakl›k de¤ifliklikleri desistem içerisindeki baz› malzemele-rin kontamine olarak analiz sonuç-lar›n›n do¤rulu¤unu etkiler. Örnek verilecek olursa; 40°C kolonf›r›n› s›cakl›¤› uygulanan bir analiz-de; kolon içerisinde 40°C sabit s›-cakl›kta hareket eden mobil faz ko-londan sonra direk olarak oda s›cak-l›¤›ndaki dedektör hücresine gide-rek kullan›lan mobil faz›n buharlafl-mas›na yol açar. Buharlaflan mobil faz dedektör içe-risindeki materyallerin üzerine ya-p›flarak bu materyallerin zamanlabozulmas›na yol açar. Dedektöroptik sistemi de do¤al olarak zarargörür. Sadece Shimadzu sistemlerindeolan s›cakl›k kontrollü dedektörler-de; dedektör hücre s›cakl›¤›n› kolonf›r›n› s›cakl›¤› ile efllefltirerek mobilfaz›n farkl› s›cakl›klara girmesiniengelleyerek yap›lan analizin do¤-rulu¤undan emin olunur. Ayn› zamanda dedektör optik siste-minde bulunan malzemelerin vehücre içerisindeki lenslerin ömrünüuzat›r. r

Filtre edilmifl Asetonitril ve filtre edilmemifl Asetonitril aras›ndaki farkl›l›¤›n kromatogramdaki görüntüsü

S›cakl›k kontrollü ak›fl hücresinde oda s›cakl›¤›n›n 20oC’den 30oC’ye ç›kmas› durumunda baseline’›n tepkisi