GAMETOGENEZA OPLODITEV

ZGODNJI EMBRIONALNI RAZVOJ

Doc.dr. Borut Kovačič, univ.dipl.biol.

SPOLNE CELICE

Dan 2 Dan 5 Dan 14

Epiblast

Hipoblast

Embrionalnidisk

Rumenjakovavrečka

TOTIPOTENTNECELICE

PLURIPOTENTNE CELICE

PLURIPOTENTNECELICE

???

3. teden

Prekurzorji primordialnihkličnih celic

Primordialneklične celice

Migracija predhodnic primordialnih kličnih celic iz pluripotentnega epiblasta v ekstraembrionalni mezoderm

123456789NB

Primitivni žlebPrimitivna vdolbinaPrimitivni vozelOrofaringealna membranaKardialna ploščaPresek amnijske membraneMezodermEndodermBodoča kloaka1+2+3 = primitivna proga

Migracija primordialnih kličnih celic iz ekkstraembrionalnega mezoderma v endodermalni epitelij rumenjakovega mehurčka

4. teden

POJAV PRIMORDIALNIH KLIČNIH CELIC

Dan 21

PRIMORDIALNEKLIČNE CELICE(PRASPOLNE)

MIGRACIJA PRIMORDIALNIH KLIČNIH CELIC

• Med 5.in 6. tednom potujejo iz rumenjakovega mehurčka ameboidno in s pomočjo morfogenetskih premikov proti mestu nastanka gonad (genitalnemu grebenu), ki jih kemotaksično privlači.

• Med migracijo se pomnožujejo, nekatere zaidejo ali propadejo.• Nadaljnji razvoj spolnih celic vodijo somatske celice v gonadah.

5.-6. teden

MIGRACIJA PRIMORDIALNIH KLIČNIH CELIC

RAZVOJ GONAD

Primordialne klične celice

+ SRY Sertolijeve celice (AMH) Leydigove celice (testosteron)

- SRY foliklove celice

(ovidukt, maternica)

Genitalni greben

semenovod

8. teden

16.-20. teden

Gametogeneza poteka v treh fazah

• faza delitev (mitotične delitve)• faza rasti• faza diferenciacije - mejoza (redukcijska delitev)

- funkcionalna usposobitev spolne celice

• Je med najmanjšimi celicami. • Vsebuje minimalno citoplazme (brez R, ER, GA).• Ima specifične strukture (akrosom in rep).• Je edina aktivno plavajoča celica.• Ima močno kondenzirano haploidno jedro z neaktivno DNA. • Histoni so zamenjani z drugimi proteini. • V reprod. obdobju se jih proizvede nekaj bilijonov.

SPERMIJ in SPERMATOGENEZA

NEZRELO MODO (PRED PUBERTETO)• Semenski kanalček brez lumna, • Gonociti v sredini, • Sertolijeve cel. nezrele

DELNO ZRELO MODO (PUBERTETA)• Vpliv gonadotropinov • Nastanek lumna v kanalčkih• Spermatogoniji na periferiji kanalčka

MODO ODRASLEGAsemenski kanalček s spermatogenezo

Sertolijeve celice

Spermatogonij

Sertolijeve celice s citopl. izrastki obdajajo germinalne cel. , segajo od bazalne membrane do lumna

Spermatogoniji vstopajo v spermatogenezo oz. mejozo

Leydigove celice izven kanalčkov

SPERMATOGENEZA

• Začne se v puberteti.

• Spermatogoniji se pod vplivom testosterona delijo v intervalih z mitotičnimi delitvami (As, A1, A2, A3, A4, B spermatogoniji)

• Del jih vstopa v mejozo z dolgo profazo prve redukcijske delitve Spermatociti I (rekombinacija) .

• Po redukciji št. homolognih kromosomov – Spermatociti II (redko vidni) s haploidnim št. kromosomov.

• Po delitvijo kromatid (druga mejotična delitev) nastanejo Spermatide

• Spermatogeneza do spermatide traja konstantno 70 dni.

SPERMIOGENEZA – OD SPERMATIDE DO SPERMIJA

protamini(kondenzacija kromatina)

ZORENJE SPERMIJEV V OBMODKU

• Morfološko: -odstranitev citoplazme, -organizacija mikrotubulov.

• Biokemijsko: -površinske spremembe (receptorji), -lipidna sestava membrane.

• Biofizikalno: -dehidracija spermija, -gibljivost.

• Fiziološko: -sposobnost prepoznavanja zone pelucide in akrosomske reakcije. -razgradnja spermijev.

ANATOMIJA SPERMIJA

• Pri človeku velika morfološka heterogenost.

Glava

• Membrana – Receptorji

• Akrosom– Hialuronidaza– Akrozin– Protein ζ (fosfolipaza C)

• Jedro– Kromatin neaktiven– Vakuole,– DNA-proteinski kompleks (protamini)

Vrat, rep

Centriol

Mitohondrijski ovoj

Biček s proteinskimi fibrilami

SERTOLIJEVE CELICE- Medsebojno povezane s tesnimi stiki.

- Ohranjajo pluripotentnost oz. diferenciacijo spermatogonijev.

- z N-kadherini povezuje spermatogonije in spermatocite.

- Pod vplivom FSH In testosterona regulirajo spermatogenezo.

Ohranjajo v androgene v semenskih kanalčkih.

LEYDIGOVE CELICE- Pod vplivom LH proizvajajo testosteron.

- Testosteron potuje v semenski kanalček in se veže na Sertolijeve celice.

Leydigove celice

Sertolijeve celice

LABORATORIJSKI PREGLED SEMENA:Število, koncentracija, gibljivost, morfologija

SPERMIOGRAMDiagnoza Referenčne vrednosti

Normozoospermija > 15 x 109 semenčic / ml

Oligozoospermija < 15 x 109 semenčic / ml

Asthenozoospermija: < 50% gibljivih semenčic

Teratozoospermija <5% normalnih oblik

Oligoasthenoteratozoospermija Kombinirani defekt

Kriptozoospermija Komaj nekaj semenčic v izlivu

Azoospermija Ni semenčic v izlivu

Aspermija Ni izliva

Hipospermija Majhen volumen izliva

Levkocitospermija Levkociti v izlivu

Avtomatska analiza: koncentracija, gibljivost, oblike gibanja

Avtomatska analiza: morfologija

• Nastane iz primordialnih kličnih celic.

• Po namestitvi v gonadnem žepu v 6. tednu po oploditvi se primordialne celice imenujejo oogoniji.

• Je najredkejša celica v telesu.

• Je največja celica v ženskem telesu.

• Je totipotentna (proizvede vse celične tipe, fetalne membrane in horionske celice).

• Je specializirana (za mejozo in pretvorbo semenčic).

• Ob koncu prvega tromesečja se začne redukcijska delitev ali mejoza - oogoniji se spremenijo v primarne oocite.

• Ob rojstvu jih je 1-2 milijona.

JAJČNA CELICA in OOGENEZA

Novitski, 2000

REDUKCIJSKA DELITEV V OOGONIJIH / OOCITIH

Pred rojstvom

Ob ovulaciji

Ob oploditvi

I. interfazaPodvojitev kromosomov

Profaza I

Metafaza I

Anafaza I

Telofaza I

Metafaza II

Anafaza II

Telofaza II

MEHANIZMI ZA RAST OOCITA

1. Podaljšana profaza I (diplotenski mirujoči stadij), ko sta v celici 2 para kromosomov (4 kopije genov),2. Dekondenzirana DNK vseh 4 kromatid - “lumpbrush kromosomi”- RNA sinteza,3. Povezovanje s somatskimi celicami (granulozne celice). 4. Asimetrično postavljena delitvena ravnina v 1. redukcijski delitvi.

Kromatinske zankesestrskih kromatidenega homologa

Kromatinske zankesestrskih kromatiddrugega homologa

Sinaptonema

Kohezini

• Premer oocita se poveča od 35 na 120 mikrom .

• 22 teden: oociti v diplotenu se povezujejo s somatskimi celicami, ki okoli tvorijo enoplastni ploščati epitel predgranuloznih celic - primordialni folikli.

• Ob rojstvu 1-2 milijona primordialnih foliklov.

• Enoplastni epitel je endokrinološko neaktiven.

• Njihovo jedro je še vedno v profazi I in se imenuje germinalni vezikel oz. mehurček.

JAJČNE CELICE PRED IN OB ROJSTVU

ZGODNJA FOLIKULOGENEZA

Primarni folikel

Primordialni folikel Predpubertetni jajčnik

• Zorenje foliklov - folikulogeneza - se začne v puberteti in traja do menopauze.

• Neodvisno od gonadotropinov začne zoreti skupina primordialnih foliklov: • glede na lego v jajčniku, • glede na vaskularizacijo.

• Celice enoplastnega epitela granuloze se pomnožijo - primarni folikli.

• Granulozne celice so v povezavi med seboj in z oocitom z medceličnimi stiki.

Zona pellucida:

• Proizvedejo jo GA.

• ZP je glikoproteinski ovoj.

• Razl. glikoproteini:ZP1,ZP2,ZP3.

• ZP2 in ZP3 tvorita heterodimerne filamente; ZP1 jih povezuje.

• Na ZP3 receptorji za spermije.

ZP2

ZP3

ZP1 Serin, treonin

oligosaharidi

asparagin

Polipeptidna veriga

CITOMORFOLOŠKE SPREMEMBE OOCITA MED OOGENEZO

RNA sinteza

• raste z rastjo folikla - akumulira se v jedru;• obsežna v oogonijih med mitozo in nato konstantna v diplotenu.

Sinteza proteinov

• raste z rastjo oocita;• skladiščeni proteini + glikogen + lipidne kapljice = rumenjak;• 50% endogenih + 50% eksogenih proteinov, ki jih prispevajo granulozne celice;• sinteza in poraba časovno ne sovpadata.

CITOMORFOLOŠKE SPREMEMBE OOCITA MED OOGENEZO

Citoplazemski organeli • prekurzorji: mitohondriji, ER, ribosomi, GA, se pomnožijo; • postanejo bolj kompleksni (razen centriolov, ki se reducirajo); • razporeditev organelov: primarni oociti - okoli jedra preovulatorni oociti - razpršeno po ooplazmi • GA se namestijo periferno.• Kortikalne granule na periferiji.

Preovulatorni oocit Primarni oocit

FOLIKULOGENEZA

Primarni folikel

Sekundarni folikel

Graafov folikel

Predovulacijski jajčnik

antrum

cumulusoophorus

FOLIKULOGENEZA

Neodvisni od gonadotropinov

Reagirajo na gonadotropine

Odvisni od gonadotropinov

Oblikovanje plasti teka celic

CUMULUS OOPHORUS - CORONA RADIATA - OOCIT KOMPLEKS

JEDRNE SPREMEMBE V PREDOVULATORNEM OOCITU

PROFAZA I METAFAZA I ANA- / TELOFAZA I METAFAZA II

REDUKCIJA 1 SETA HOMOLOGNIH KROMOSOMOV V PRVO POLARNO TELO

REDUKCIJA 1 SETA KROMATID V DRUGO POLARNO TELO

PRVA REDUKCIJSKA DELITEV DRUGA REDUKCIJSKA DELITEV

REGULACIJA JEDRNIH SPREMEMB V PREDOVULATORNEM OOCITU

MITOZO PROMOVIRAJOČI FAKTOR(MPF)

GONADOTROPINI (LH)

SPERMIJEVI FAKTORJI

SELEKCIJA V (ASISTIRANI) REPRODUKCIJI

Folikulogeneza: 4000 primordialnih foliklov / mesec

1000 antralnih foliklov

1 dominantni folikel

zarodek

se ne vgnezdi

začasna vgnezditev

klinična nosečnost

primeren oocit

spontan splav

Porod

okvarjen oocit50%

20% 20%

30%

30%70%

Semenčica: - kapacitacija - hiperaktivacija - akrosomska reakcija - vezava na ZP in oolemo - aktivacija jajčne celice - rekonstrukcija centrosoma - rekonstrukcija jedra

Oploditev je proces, ko se v aktivirani jajčni celici združi jedro semenčice z ženskim pronukleusom.

Jajčna celica: - zrelost ovojnic, citoplazme in jedra - sprejem semenčice - aktivacija - zaključek mejoze - sinhronizacija nastanka moškega in ženskega pronukleusa

Oploditev

POT SPERMIJA PO JAJCEVODU

Odstranitev semenske plazme, •sprememba pH, •prisotnost proteinov, ki vežejo holesterol iz membrane

Destabilizacija spermijeve membrane

Večja prepustnost za Ca2+ ione

Povečanje konc. intracelularnega cAMP

Aktivacija kinaz (protein kinaze-A) v semenčici

HIPERAKTIVACIJA oz. hitrejše plavanje

AKROSOMSKA REAKCIJA

MEHANIZEM AKTIVACIJE (KAPACITACIJE) SPERMIJEV

Kapacitacija spermijev: je sposobnost spermija za dostop do jajčne celice in vstop vanjo.

Fosforilacija proteinov

Akrosomska reakcija:•Je eksocitoza akrosoma.•Je odgovor na ekstracelularne signale iz oocita - njegove izvencelične strukture (zone pelucide) in ženskega reprod. trakta.•Je predpogoj za oploditev.

MEHANIZEM AKROSOMSKE REAKCIJE SPERMIJEV

• Spermij ima receptor (zona receptor kinaza - ZRK) za zono pelucido (ZP3).

• ZRK je na zunanji strani akrosoma.

•ZP3 in ZRK omogočata vrstno specifično prepoznavanje.

• ZRK reagira z ZP3.

•Sprožene reakcije v glavici:- influks Ca2+ .- perforacija membrane na akrosomu,- sprostitev proteolitskih encimov - akrozina.

• Prehod zone in stik z oolemo.

Ca2+

Akrozin

ZRK

ZP3

Zona pelucida

STIK SPERMIJA Z MEMBRANO OOCITA

Zeta proteinCa2+

Ca2+Ca2+

Kalcijeve rezerve

Ca2+

Kinazna kaskada

ZRK ZRK

ZP3 ZP3

Zona pelucida

Spermij

Membrana

• Tangencialna vezava spermija na membrano.

• Zlitje membran spermija in oocita.

• Sprostitev spermijevega zeta proteina v oocit.

• Sprostitev Ca2+ v citosol.

• Fosforilacija proteinov.

• Kortikalna reakcija – eksocitoza kortikalnih granul.

• Sprememba ZP2 – blok za polispermijo.

• Aktivacija oocita.

CIKLIČNE Ca2+ OSCILACIJE PO AKTIVACIJI OOCITA

VKLJUČEVANJE SPERMIJEVEGA JEDRA V OOCIT

• Zlije membran.

• Vstopi spermijeva glavica in vratni del (centrosom).

• Jedrne ovojnice spermijevega jedra se razgradijo.

• Redukcija spermijevih protaminskih disulfidnih vezi in nadomestitev s histoni.

• Sledi dekondenzacija jedra s pomočjo citoplaz. faktorjev iz oocita.

• Nastane nova jedrna ovojnica.

• Nastane moški pronukleus.

Kovačič in Vlaisavljević, Med. Razg., 2001, 40(1):95-105

PRITEGOVANJE PRONUKLEUSOV

• Astralni mikrotubuli iz očetovskega centriola pritegnejo pronukleusa v center.

• Prekurzorska telesca nukleolusov (NPB) - vloga nepojasnjena.

• Naj bi predstavljali centromere kromosomov z afiniteto do proteinov kinetohora - ti polimerizirajo mikrotubule, ki bi naj pritegnili pronukleuse.

Oploditev (20 ur po osemenitvi)

Normalna zigota (2PN)

Partenogeneza

Triploidija

Ginogeneza

Androgeneza

Diginična

Dispermična

Diploidija

Diploidija

Triploidija

Mozaik

Mozaik

Monospermija

Dispermija

Dispermija-1PN

Monospermija+diginija

Monospermija+diginija 1PN

Poliploidija ali fragmentirani pronukleusi

SAMO MOŠKI CENTROSOM JE AKTIVEN

PRVA DELITEV ZIGOTE

S-faza

FAZE EMBRIONALNEGA RAZVOJA

1. BRAZDANJE – delitve, sinteza DNA

2. BLASTULACIJA – oblikovanje votle blastule (blastociste)

3. GASTRULACIJA – gibanje celic (oblikovanje embrija) sinteza mRNA (diferenciacija)

1. ORGANOGENEZA – oblikovanje tkiv in organov

2. RAST

OD OVULACIJE DO IMPLANTACIJE

• Pred kompaktnostjo– Maternalni genom – Nizka stopnja biosinteze– Delitev brez G1 faze– Skupek individualnih celic– Totipotentnost

• Po kompaktnosti– Embrionalni genom – Visoka stopnja biosinteze– Diferenciacija– Pluripotentnost

ZGODNJI IN KASNEJŠI PREDIMPLANTACIJSKI RAZVOJ

Neenakomerna delitev blastomer.

NEPRAVILNOSTI ZGODNJEGA BRAZDANJA

Pojavljanje brezjedrnih citoplazemskih fragmentov.

Večjedrnost blastomer.

Polarizacija zunanjih celic:

• Tesnejši medcelični stiki (adherentni, tesni in presledkovni stiki) med celicami.

• Premik jedra in mitohondrijev proti notranji membrani.

• Na/K ATPaza na notranji membrani ustvari ionski gradient.

MEHANIZEM KOMPAKTNOSTI (Watson, 1992):

• Na/K ATPase in akvaporini zagotovijo ionski gradient na notranji membrani.

• Ozmotski pritisk – voda polni blastocel.

• Tesni stiki onemogočajo iztekanje tekočine.

• Rastni faktorji regulirajo kavitacijo.

MEHANIZEM NASTANKA BLASTOCELA (Watson, 1992):

ICM

TE BC

ICM - notranja celična masaBC - blastocelTE - trofektodermZP - zona pelucida

ZP

NASTANEK BLASTOCISTE

• Pomanjkanje tesnih stikov med blastomerami. • Nepravilna polarizacija in razporeditev organelov.• Rast vakuol namesto blastocela.

.

MEHANIZEM NENORMALNEGA RAZVOJA BLASTOCELA:

B1 B2 B3 B4

B5 B6 B7 B8

Kovačič et al., RBM Online, 2004

HETEROGENA MORFOLOGIJA BLASTOCIST

Nastanek enojajčnih dvojčkov

IMPLANTACIJA BLASTOCISTE

Sinciciotrofoblast z mikrovili

Pinopodi

Sinciciotrofoblast:Placenta

Cytotrofoblast

Dvoplastni embrionalni disk

Epiblast: Amnion

Hipoblast: rumenjakova vrečka

SinciciotrofoblastCitotrofoblast

AmnionRumenjakova vrečka

Horionskavotlina

Progesteron

Progesteron hCGHorion

ENDODERM

MEZODERMEKTODERM