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Sperimenta  il  Biolab

Analisi  molecolare  di  mala.e  gene0che.   Il  caso  della  FIBROSI  CISTICA

Università  degli  Studi  di  Milano  

1.  Conoscenze  propedeu<che

1.1  Le  mutazioni  Nella  specie  umana  esistono  23  coppie  di  cromosomi  che  contengono  circa  21.000  geni. Le   mala:e   gene;che   sono   causate   da   mutazioni,   cioè   da   alterazioni   del   corredo   gene;co  (genoma)  di  un  individuo.  Se  le  mutazioni  avvengono  nelle  cellule  che  formano  i  game;,  cioè  nelle  cellule  germinali,  allora  possono  essere  trasmesse  alla  discendenza  dove  saranno  presen;  in  ogni  cellula  dell’individuo  affeFo.  Queste  mutazioni  possono  sorgere  come  mutazioni  nuove  nei  game;  di   uno   dei   genitori   oppure   possono   essere   ereditate   dai   genitori.   Viceversa   le   mutazioni   che  avvengono   nelle   cellule   soma;che   non   sono   trasmesse   alle   generazioni   successive,   ma  determinano   una   differenza   gene;ca   tra   le   cellule   dello   stesso   organismo   (mosaicismo).   La  conseguenza  può  essere  l’insorgenza  e  lo  sviluppo  di  un  cancro.  Le  mutazioni  possono  riguardare  il  numero   dei   cromosomi   (mutazioni   genomiche),   la   struFura   dei   cromosomi   (mutazioni  cromosomiche)  o  i  singoli  geni  (mutazioni  geniche).

1.1.2  Mutazioni  geniche Le   mutazioni   geniche   che   insorgono   all’interno   di   un   gene   possono   alterare   l’espressione   e   la  funzionalità  della  proteina  prodoFa  o,  se  insorgono  all’interno  delle  regioni  di  controllo  di  un  gene,  

possono  invece  influenzarne  il  livello  di  trascrizione.  Le  mutazioni  si  suddividono  in  (fig.  1): • sinonime:  sos;tuzione  di  una  base  del  DNA  con  

un   altro   codone   codificante   per   lo   stesso  amminoacido  

• missenso:  sos;tuzione  di  una  base  del  DNA  che  determina   l’inserzione   nella   proteina   di   un  diverso  amminoacido  

• non-­‐senso:   sos;tuzione   di   una   base   del   DNA  con   un   codone   di   stop   che   provoca   la   fine  prematura   della   sintesi   della   proteina   o   un  prodoFo  proteico  incompleto  

• frameshiR:  delezioni  o   inserzioni  di  un  numero  di  bp  non  mul;plo  di  3,  che  altera  la  leFura  dei  codoni  

• mutazioni   che   alterano   lo   splicing   (rimozione  degli   introni):   interessa   una   sequenza  nucleo;dica   cruciale   per   il   meccanismo   di  splicing    di  un  trascriFo  primario  di  RNA;  come  conseguenza  si  avrà  il  blocco  o  la  modificazione  dello  schema  di  splicing  di  quel  trascriFo,  con  la  mancata  produzione  del  mRNA  corrispondente  o  la  produzione  di  un  mRNA  modificato  

• ripe;zioni  di  tripleFe  

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Fig.   1:   ;pi   diversi   di   mutazione.   Le   mutazioni  pun;formi   (faFa   eccezione   per   le   mutazioni  sinonime)   e   le   piccole   delezioni   causano   quasi  sempre   la   produzione   di   una   proteina   con  funzionalità  alterata.

Per  descrivere  una  mutazione,   si   usa  una  nomenclatura  par;colare   che  permeFe  di   capire   se   la  mutazione  è  stata  descriFa  in  termini  di  cambiamento  nel  DNA  genomico  (g.),  nel  cDNA  (c.)  o  nella  proteina  codificata  (p.);  nel  caso  in  cui  la  mutazione  cada  in  un  esone,  si  indica  quale  amminoacido  è  coinvolto,   in  quale  posizione  si   trova  e  come  sia   stato  modificato   (se   sia   stato   sos;tuito  da  un  altro  amminoacido,  da  un  codone  di  stop  o  se  sia  stato  deleto);  nel  caso  in  cui  la  mutazione  sia  in  un  introne  si   indica  quale  nucleo;de  è  stato  modificato,   la  sua  posizione  (espressa  rela;vamente  all’ul;mo  nucleo;de  dell’esone  che  lo  precede)  e  con  quale  nucleo;de  sia  stato  sos;tuito.

1.2  Le  leggi  di  Mendel  e  le  malaBe  monogeniche Le   mala:e   ereditarie   monogeniche   sono   determinate   da   mutazioni   in   singoli   geni   che   si  trasmeFono  nelle   famiglie   secondo   leggi  ben  definite   scoperte  dall’abate  Gregorio  Mendel  nella  seconda   metà   dell’OFocento.   Per   questo   mo;vo   le   mala:e   monogeniche   o   monofaForiali  vengono  anche  chiamate  “mendeliane”.  In  par;colare  bisogna  ricordare  che  i  geni  possono  avere  alleli  diversi  (varian;  alterna;ve  di  uno  stesso  gene)  ossia  essere  polimorfici. Gli   organismi   diploidi   hanno   due   copie   di   ogni   gene,   cioè   due   alleli:   se   i   due   alleli   sono   uguali,  l’individuo   è   omozigote   (ad   esempio   ha   geno;po   AA   oppure   aa);   se   i   due   alleli   sono   diversi,  l’individuo  è  eterozigote   (ad  esempio   il  geno;po  è  Aa).  L’allele  dominante  si  manifesta  allo  stato  eterozigote,   quello   recessivo   è   mascherato   dall’allele   dominante   e   si   manifesta   solo   allo   stato  omozigote,   mentre   si   parla   di   codominanza   quando   si   hanno   due   alleli   dis;nguibili   entrambi  espressi  allo  stato  eterozigote,  che  agiscono  sul  feno;po  in  modo  indipendente. La  I   legge  di  Mendel  o  legge  dell’uniformità  della  prima  generazione  ibrida  afferma  che  l’incrocio  tra   individui  della  generazione  parentale,   ciascuno  omozigote  per  due  alleli  diversi  di  uno  stesso  gene   (ad   esempio   AA   x   aa)   e   che   quindi   differisce   dall’altro   genitore   per   una   caraFeris;ca   (ad  esempio  pelo  nero  o  marrone),  dà  una  progenie  cos;tuita  da  individui  tu:  eterozigo;,  iden;ci  tra  loro  (ad  esempio  Aa). Durante   la   meiosi   i   due   alleli   di   un   gene   segregano   e   si   distribuiscono   ciascuno   in   un   gamete  aploide   (II   legge   di  Mendel,   legge   della   segregazione).   Un   individuo   omozigote   produce   un   solo  ;po  di  gamete  (A  oppure  a)  rela;vamente  a  un  dato  locus  (la  posizione  occupata  da  un  gene  in  un  cromosoma).  Un  individuo  eterozigote  produce  due  ;pi  di  game;  (A  e  a)  in  ugual  quan;tà,  cioè  in  una   percentuale   del   50%   ciascuno.   Una   buona   rappresentazione   grafica   della   segregazione   si  o:ene  costruendo  il  “quadrato  di  PunneF”. Alleli  appartenen;  a  geni  diversi  localizza;  su  cromosomi  diversi  segregano  in  modo  indipendente  (III  legge  di  Mendel,  legge  della  segregazione  indipendente). L’1%   circa   dei   neona;   è   affeFo   da   una   mala:a   gene;ca   monogenica.   La   mutazione   genica   è  presente   fin   dal   concepimento   anche   se   non   sempre   si   manifesta   feno;picamente   alla   nascita.  Alcune   di   queste  mala:e   comportano   conseguenze   già   apprezzabili   nel   neonato.   Altre  mala:e  monogeniche  si  manifestano,   invece,  durante  le  età  successive  della  vita.  La  corea  di  Hun;ngton,  ad  esempio,  è  una  mala:a  gene;ca  a  insorgenza  tardiva  che  si  manifesta  solo  in  età  adulta. Si  definisce  mala:a  autosomica  quella  in  cui  l’allele  malato  è  presente  nelle  coppie  di  cromosomi  non  coinvol;  nella  determinazione  del  sesso,  gli  autosomi;  si  parla   invece  di  mala:a   legata  all’X  quella   in   cui   l’allele   si   trova   nel   cromosoma   sessuale   X.   In   questo   caso   la   trasmissione   segue  modalità  par;colari  in  quanto  la  maggior  parte  dei  geni  rappresenta;  sul  cromosoma  X  non  sono  rappresenta;   sul   cromosoma   Y.   Il   cromosoma   Y,   infa:,   è   molto   più   piccolo   e   con;ene   quasi  

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esclusivamente   i   geni   per   la   determinazione   del   sesso.   Nelle   mala:e   autosomiche,   se   l’allele  normale  è  dominante,  la  mala:a  si  rende  manifesta  solo  nella  condizione  di  omozigote  recessivo,  ossia  negli  individui  in  cui  entrambi  gli  alleli  del  gene  sono  altera;  (mala:a  autosomica  recessiva);  se  invece  è  l’allele  alterato  a  prevalere  su  quello  sano,  la  mala:a  si  rende  sempre  evidente,  anche  nella  condizione  di  eterozigote,  ossia  è  sufficiente  che  uno  solo  dei  due  alleli  sia  alterato  perchè  la  mala:a  si  manifes;  (mala:a  autosomica  dominante). Nelle   mala:e   legate   all’X,   se   l’allele   è   recessivo,   come   nella   maggior   parte   dei   casi,   i   maschi  ricevono  l’X  difeFoso  dalla  madre,  ma  non  possono  bilanciarlo  con  un  allele  sano  nell’Y  in  quanto  questo   cromosoma   non   con;ene   l’allele   corrispondente;   le   femmine   invece   manifestano   la  mala:a  solo  nella  condizione  di  omozigote.  Di  conseguenza  la  frequenza  delle  mala:e  recessive  legate  al  cromosoma  X  è  maggiore  nei  maschi  che  nelle  femmine.  Nel   caso   di   mala:e   dominan;   le   femmine   manifestano   la   mala:a   anche   nella   condizione  eterozigote.

1.2.2  Analisi  dei  pedigree Uno   degli   aspe:   della   gene;ca   è   lo   studio   dei   meccanismi   con   cui   i   geni   sono   trasmessi   dai  genitori  ai  figli.  A  tale  scopo  i  gene;s;  effeFuano  accoppiamen;  tra  organismi  della  stessa  specie,  per  analizzare   la  trasmissione  dei  caraFeri.  Nella  gene;ca  umana,  gli  accoppiamen;  sperimentali  ovviamente  non  sono  possibili.  Molte  delle  nostre  conoscenze  sull’ereditarietà  dei  caraFeri  umani  derivano  perciò  dalla  analisi  degli  alberi  genealogici  o  pedigree. In   pra;ca,   il   pedigree   è   la   rappresentazione   sistema;ca   della   storia   familiare   aFraverso   l’uso   di  simboli   standardizza;.   Il   pedigree   viene   s;lato   partendo   da   un’intervista   ai   componen;   di   una  famiglia,   al   fine   di   ricostruirne   la   storia   (anamnesi);   in   questo   modo   è   possibile   seguire   la  trasmissione  di  un  dato  caraFere  aFraverso  parecchie  generazioni  in  una  data  famiglia. L’analisi   del   pedigree   permeFe   di   determinare   se   il   caraFere   ha   una   modalità   di   trasmissione  recessiva  o  dominante  e  se  il  gene  in  ques;one  è  localizzato  su  un  autosoma  o  su  un  cromosoma  sessuale;   permeFe   in   ul;ma   analisi   di   informare   i   membri   di   una   famiglia   sulla   probabilità   di  trasmeFere  queste  mala:e  ai  propri  figli. Nell’analisi  del  pedigree  ci  si  basa  sui  principi  dell’eredità  di  Mendel  per  escludere   le  modalità  di  trasmissione   che   sono   incompa;bili   con   il   pedigree.   Ad   esempio,   la   presenza   nell’albero  genealogico  di  femmine  malate  ci  permeFe  di  escludere  la  trasmissione  legata  all’Y. Dall’analisi  di  un  pedigree  si  può  determinare  (talvolta  non  in  modo  univoco,  in  quanto  un  pedigree  può  essere  compa;bile  con  più  di  una  modalità  di  trasmissione  ereditaria)  come  viene  trasmesso  un  dato  caraFere.   Analizziamo   le   caraFeris;che   dei   pedigree   rela;vi   a   caraFeri   con   differen;   modalità   di  trasmissione: • autosomici   recessivi   (AR):     possono  

essere   affe:   sia   i   maschi   sia   le  femmine;   in  genere  gli   individui  affe:  hanno   genitor i   sani   (portator i  asintoma;ci).   I   genitori,   entrambi  portatori   sani,   hanno   il   25%   di  probabilità  di  avere  figli  mala;  ad  ogni  

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gravidanza;   l’incidenza   della   mala:a  aumenta   in   caso   di   consanguineità.  Tu:   i   figli   di   genitori   entrambi   affe:  (omozigo;)   sono   a   loro   volta   affe:  (fig.  2).  

• autosomici   dominan<   (AD):   possono  essere   affe:   sia   i   maschi   sia   le  femmine;   gli   individui   affe:   possono  essere   presen;   in   tuFe   le   generazioni  e   hanno   sempre   un   genitore   affeFo.  Poiché   i   geni   responsabili   di   mala:e  autosomiche   dominan;   sono   rari,   in  genere   gli   individui   affe:   sono  eteroz igo;.   Rar i ss imi   sono   g l i  omozigo;,   che   possono   nascere   solo  da   genitori   entrambi   eterozigo;.   Ogni  affeFo   (eterozigote)   ha   il   50%   di  probabilità   di   avere   figli   mala;;  individui   non   affe:   del   pedigree   che  sposano   individui   non   affe:   non  hanno   discenden;   affe:.   Genitori  entrambi   affe:   (eterozigo;)   possono  avere   figli   sani   (25%),  mentre   genitori  di  un  bambino  malato  possono  essere  sani,   non   portatori:   in   questo   caso   si  può  dedurre  che  la  mala:a  sia  indoFa  da   una   nuova   mutazione   verificatasi  durante   la   formazione   di   un   gamete  (mutazione  “de  novo”)  (fig.  3).  

• lega<   al   cromosoma   X   recessivi   (XR):  la  frequenza  della  mala:a  è  maggiore  nei  maschi  che  nelle  femmine,  le  quali  possono   essere   portatrici   sane.   Le  donne   portatrici   hanno   un   rischio   del  50%   di   avere   figli   maschi   mala;;   i  maschi   affe:   hanno   figlie   portatrici  sane   e   figli   maschi   sani,   mentre   la  madre   di   un   individuo   affeFo   è  portatrice   sana.   I l   caraFere   si  trasmeFe   a   zig-­‐zag   con   maschi   affe:  in   generazioni   diverse   (eredità  

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Fig.   2:     albero   genealogico   e   quadrato   di   PunneF   di   una   mala:a   a  trasmissione  autosomica  recessiva.

Fig.  3:  albero  genealogico  e  quadrato  di  PunneF  di  una  mala:a  a  trasmissione  autosomica  dominante.

diaginica).  La  metà  delle  figlie  femmine  di   madri   portatrici   sono   anche   loro  portatrici  (fig.  4).  

 

• lega<   al   cromosoma   X   dominan<  (XD):   maschi   affe:   generano   solo  femmine  affeFe  e  maschi  sempre  sani.  F e mm i n e   e t e r o z i g o ;   a ff e F e  trasmeFono  il  caraFere  al  50%  dei  figli  ( s ia   masch i   che   femmine) .   La  frequenza  nelle  femmine  è  solitamente  doppia  che  nei  maschi  (fig.5).  

 

• lega<  al  cromosoma  Y:  i  pochi  caraFeri  individua;   si   manifestano   solo   nei  maschi   e   sono   trasmessi   direFamente  da   padre   a   figlio   (eredità   olandrica)  (fig.  6).  

1.3  Eterogeneità  gene<ca  Per   alcune   mala:e   ereditarie   monogeniche   tu:   gli   individui   affe:   portano   un’iden;ca  mutazione:  l’anemia  falciforme  ne  è  un  esempio.    Per   molte   altre   mala:e   ci   sono   invece   più   mutazioni   che   possono   produrre   lo   stesso   quadro  patologico.  Quando   le  diverse  mutazioni   sono  a  carico  dello   stesso  gene  si  parla  di  eterogeneità  allelica.  Nel   caso   dell’emofilia   A,   ad   esempio,   il   catalogo  OMIM   riporta   270   varian;   alleliche.   La  fibrosi   cis;ca   è   causata   da   più   di   1000   mutazioni   diverse   nel   gene   CFTR.   Le   diverse   mutazioni  possono  produrre  feno;pi  di  gravità  diversa.    Nel  caso   in  cui   le  mutazioni  avvengono   in  geni  diversi  che  collaborano  alla  determinazione  di  un  feno;po,  si  parla  di  eterogeneità  di  locus.  Ad  esempio,  in  una  stessa  via  metabolica,  mutazioni  in  geni  diversi  possono  portare  alla   stessa  modificazione  del   feno;po.  E’   il   caso  delle  due   forme  di  ipercolesterolemia  familiare  A  e  B  dovute  rispe:vamente  a  mutazioni  del  gene  del  receFore  che  lega  le  lipoproteine  LDL  e  del  gene  della  apoproteina  B-­‐100  che  media  il  legame  delle  par;celle  LDL  al  receFore.  

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Fig.  5:  albero  genealogico  e  quadrato  di  PunneF  di  una  mala:a  a  trasmissione  X-­‐linked  dominante.  

Fig.  4:    albero  genealogico  e  quadrato  di  PunneF  di  una  mala:a  a  trasmissione  X-­‐linked  recessiva.  

Fig.    6:  albero  genealogico  e  quadrato  di  PunneF  di  una  mala:a  a  trasmissione  Y-­‐linked.

1.4  Pleiotropia Questo   conceFo   sta   a   indicare   che  un   solo   gene  può  essere   responsabile   di   feno;pi   diversi.  Un  esempio   di   pleiotropia   nell’uomo   è   quello   dell’anemia   falciforme,   una  mala:a   caraFerizzata   da  diversi   sintomi  a   carico  di  organi  e   tessu;  diversi.  Ques;  possibili   effe:   feno;pici  derivano   tu:  dall’azione  di  un   solo  allele  mutato  presente   in  omozigosi.   L’effeFo  direFo  dell’allele  dell’anemia  falciforme   è   quello   di   indurre   i   globuli   rossi   a   produrre   molecole   anomale   di   emoglobina   che  tendono  a  unirsi  fra   loro  e  cristallizzare.  Di  conseguenza,   i  globuli  rossi  si  deformano,  assumendo  forme   a   falce   con   contorni   frastaglia;,   sono   più   fragili   e   lisano   e   tendono   ad   aggregarsi   e   a  occludere  i  capillari.  TuFo  questo  produce  molteplici  danni  a  carico  di  organi  e  tessu;  diversi.

2.  Fibrosi  Cis<ca  

La   fibrosi   cis;ca   (CF)   è   la   mala:a   ereditaria,  autosomica   recessiva,   più   comune   nella  popolazione  caucasica  e  colpisce  un  neonato  su  2500-­‐3500   na;   vivi;   la   frequenza   dei   portatori  sani   (eterozigo;   asintoma;ci)   è   di   1/25-­‐30  individui.   La   patologia   interessa   molteplici  funzioni,   come   la   respiratoria,   la   diges;va   e   la  riprodu:va;   colpisce   sia   i   maschi   che   le  femmine   ed   è   caraFerizzata   da   un’anomala  regolazione   del   trasporto   degli   eleFroli;   da  parte  degli  epiteli  e  quindi  da  una  conseguente  alterazione   della   composizione   salina   delle  secrezioni  delle  ghiandole  esocrine  (fig.  7).   Spesso   nella   fibrosi   cis;ca   si   ha   la   completa  perdita   di   funzione   del   canale   del   cloro,   che  causa   la   produzione   di   secrezioni   disidratate   e  di  muco  denso.    In  tu:  gli   individui  colpi;,   le  ghiandole  sudoripare  producono  un  eccesso  di  sale,  nel  pancreas   il  muco   inspessito   blocca   il   trasporto   degli   enzimi   diges;vi,   con   conseguente   graduale   distruzione  della   ghiandola,   i   polmoni   producono   un   muco   denso   e   vischioso,   che   conges;ona   i   condo:  respiratori   rendendo   difficile   la   respirazione,   ed   infine,   nei   maschi,   il   muco   blocca   i   do:   che  portano  lo  sperma  con  la  conseguenza  che  solo  il  2-­‐3%  dei  maschi  colpi;  dalla  mala:a  è  fer;le.

2.1  Sintomatologia,  terapia  e  prognosi La   fibrosi   cis;ca   è   una   mala:a   cronica   progressiva   complessa,   non   ancora   guaribile,   ma  sicuramente  curabile.  CaraFeris;ca  della  mala:a  è  che   l’esordio,   l’en;tà  dei  sintomi  e   il  decorso  sono   estremamente   variabili.   Alcuni   mala;   possono   presentare   precocemente   gli   aspe:  polmonari  della  mala:a   (infezioni   respiratorie   ricorren;)  e   le  manifestazioni  gastrointes;nali   già  alla  nascita,   segui;  dalla   sindrome  da  malassorbimento  dovuta  all’insufficienza  pancrea;ca;   altri  hanno   sintomi   respiratori   contenu;   fino   all'adolescenza   con   quadro   diges;vo   normale;   per   altri  

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Fig.  7:  struFure  ed  appara;  colpi;  dalla  CF.

ancora   i   sintomi  predominan;   sono  quelli   dell'epatopa;a  o  del   diabete.   Le   forme  della  mala:a  diagnos;cate   in   età   adulta   hanno   come   manifestazione   episodi   di   pancrea;te   ricorrente   e   nei  maschi  frequentemente  si  ha  infer;lità.  La  prognosi  è  determinata  dall'en;tà  della  broncopneumopa;a  che,  nella  maggior  parte  dei  casi,  si  aggrava   nel   tempo,   ma   è   influenzata   anche   dallo   stato   di   nutrizione   (migliore   nei   sogge:  diagnos;ca;  precocemente)  e  dal  programma  di  cure. Gli  approcci  terapeu;ci,  spesso  combina;,  per  curare  la  fibrosi  cis;ca  sono:

• fisioterapia   respiratoria:   per   aiutare   a   liberare   le   vie   aeree   dal   muco   che   può   causare  infezioni  

• esercizio  fisico:  u;le  quale  forma  di  fisioterapia  e  per  il  benessere  generale  • terapie   farmacologiche:   somministrazione   di   diversi   farmaci   (mucoli;ci,   an;bio;ci   ecc.)  

assun;  per  via  inalatoria,  orale  o  endovenosa  per  ripulire  il  muco  e  combaFere  le  infezioni  • nutrizione  ed  assunzione  di  enzimi  pancrea;ci,  per  aiutare  a  digerire  il  cibo  • terapia   delle   complicanze:   specifiche   terapie   per   curare   le   complicanze   tardive   della  

mala:a  (sterilità,  diabete,  epatopa;a,  calcoli  biliari  ecc.)    • trapianto  d’organo,  in  par;colare  polmone  e  fegato  

L'aspeFa;va   di   vita   rimane   poco   prevedibile   individualmente;   mediamente   è   ridoFa   rispeFo   a  quella   della   popolazione   generale,   ma   va   progressivamente   aumentando   e   dipende   dalla  eterogeneità  clinica  della  mala:a.

2.2  La  proteina  CFTR La  fibrosi  cis;ca  è  causata  da  mutazioni  nel  gene  che  codifica   per   una   proteina,   chiamata   cys%c   fibrosis  transmembrane   regulator   (CFTR),   che   regola   la  secrezione   di   ioni   cloro,   sodio   e   bicarbonato   nei  tessu;  epiteliali   (fig.  8).  La  proteina  CFTR  appar;ene  alla   superfamiglia   dei   trasportatori   con   casseFe   che  legano  ATP,   denominate   ABC   (ATP   binding   casse:e),  ed  ha  diverse  funzioni:  proteina  regolatrice  del  pH  di  organelli   citoplasma;ci,   trasportatore   di   membrana,  cana le   i on i co   ed   è   anche   co invo l ta   ne l  processamento  di  glicoproteine.  La  proteina  con;ene  1480   amminoacidi   e   ha  massa   168142   Da,   con   una  localizzazione   intramembrana   di   circa   l’80%.   La  proteina   è   formata   da   due   regioni   idrofobiche  transmembrana,   ciascuna   cos;tuita   da   sei   α-­‐eliche  (TM   –   trans   membrane   helices)   e   da   una  regionecitoplasma;ca   aFa   a   legare   l’ATP   (NBD   -­‐  nucleo%de   binding   domain).   Un   grosso   dominio  centrale   di   regolazione   (R   domain)   collega   le   due  par;  della  molecola  e  presenta   si;  mul;pli  di   fosforilazione  da  parte  di  diverse   chinasi,   come   la  proteina  chinasi  AMP  ciclico  dipendente  (PKA)  o  la  proteina  chinasi  C  (PKC).  

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Fig.   8:   La   proteina   CFTR   è   localizzata   nella  membrana   plasma;ca   della   cellula   e   regola   il  movimento   degli   ioni   cloro   tra   i   due   la;   della  membrana.  Nella  maggior  parte  dei  casi  di  CF   la  proteina  è  priva  della  regione  1  di  legame.

Per   la   piena   funzionalità   del   canale   ionico   è   necessaria   la   dimerizzazione   della   proteina   CFTR,  indoFa  mediante  fosforilazione.    

2.3  Il  gene  CFTR Il   gene   CFTR   si   trova   sul   braccio   lungo   del   cromosoma   7,   in   posizione  7q31.2  (fig.  9).  E’  un  gene  molto  grande,  cos;tuito  da  27  esoni  distribui;  su   una   regione   di   lunghezza   pari   a   250188   basi.   La   fibrosi   cis;ca   può  essere   causata   da   più   di   1000   mutazioni   diverse   situate   in   qualunque  punto   del   gene,   ma   quelle   più   comuni   nella   popolazione   sono  rela;vamente  poche  (tab.  1  e  fig.  11);  in  tab.  2  sono  riportate  le  mutazioni  che   ricorrono   nelle   varie   regioni   italiane.   TuFe   le   mutazioni   sono  cambiamen;  di  un   singolo  nucleo;de   (mutazioni  missense,  nonsense)  o  di  un  piccolo  numero  di  nucleo;di  (mutazioni  frameshiR)  e  mutazioni  che  alterano   lo   splicing,   localizzate   prevalentemente   negli   esoni   o   nelle  giunzioni  tra  esoni  ed  introni,  più  raramente  negli  introni.  In  base  al  ;po  di  mutazione  si  hanno  diversi  effe:  sull'espressione  e  sulla  funzionalità  della  proteina.    Sono  state  individuate  sei  classi  di  mutazioni:  

• classe   I   (difeFo   di   produzione):   causano  l'interruzione  prematura  della   trascrizione  e   la  proteina  è  assente  

• classe   II   (difeFo   di   maturazione):   le   proteine  mutate   non   raggiungono   la   membrana  cellulare   e   vengono   degradate   nell'apparato  del  Golgi  

• classe   III   (difeFo   di   regolazione):   le   proteine  mutate   sono   presen;   sulla   membrana  cellulare,  ma  non  possono  essere  a:vate  

• classe   IV   (difeFo   di   trasporto):   le   proteine  mutate   sono   presen;   e   a:ve   sulla  membrana  cellulare,   ma   è   alterato   il   trasporto   degli   ioni  cloro  

• classe  V   (rallentata   sintesi):   si   verifica   la   sintesi  d i   p rote ine   norma l i ,   ma   in   quan;tà  notevolmente  ridoFe  

• classe   VI   (degradazione   precoce):   le   proteine   sono   normalmente   espresse   e   a:ve,   ma  vanno  incontro  a  degradazione  precoce.  

Poiché  la  mala:a  è  autosomica  recessiva,  un  soggeFo  malato  ha  entrambe  le  copie  del  suo  gene  CFTR  mutate  e   le  due  mutazioni  possono  essere  uguali  o  diverse  tra   loro.  Questo  è  una  ulteriore  causa  della  eterogeneità  clinica  della  mala:a.

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Fig.9:   localizzazione  del   gene   CF   sul  cromosoma  7.

Mutazione Localizzazione %

p.F508del esone  10 81,0

p.Gly551Asp esone  11 3,5

p.Gly542X esone  11 1,1

c.621+1G>T introne  4 1,0

c.1898+1G>A introne  12 0,9

Tab.  1:  mutazioni  più  frequenti  nel  gene  CFTR;  p  e  c  indicano  rispettivamente  che  la  mutazione  è  descritta  nella  proteina  e  nel  cDNA;    >  significa  “cambia  in”,  X  significa  un  codone  di  stop;    +1  significa  che  è  coinvolto  il  primo  nucleotide  dell’introne  successivo  all’esone  che  termina  con  il  nucleotide  indicato  dal  numero  che  precede  il  segno  +.

L'iden;ficazione  delle  specifiche  mutazioni  non  è  predi:va  della  severità  della  mala:a  polmonare  anche  per  questo   si   suppone   l'intervento,   accanto  al   gene  CFTR,  di   geni  modificatori   e  di   faFori  ambientali.   Una   correlazione   geno;po-­‐feno;po   è   documentata   solo   per   alcune   mutazioni   e   lo  stato   di   sufficienza   o   insufficienza   pancrea;ca   o   nel   caso   di   sogge:   adul;   con   infer;lità  secondaria. In   ques;   casi,   tuFavia,   l'interpretazione   del   risultato   fornito   dall'analisi   del   geno;po   è   molto  complessa.

 

 

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Tab.   2:   frequenza   percentuale   delle   12   più   frequen;   mutazioni   CFTR   nelle   regioni   italiane   (3442  cromosomi  CFTR)  (Rendine  et  al.  1997).

2.4  La  mutazione  p.F508del  (ΔF508) L a   mu t a z i o n e   p . F 5 0 8 d e l   ( d e l e z i o n e  dell’amminoacido  fenilalanina  F  in  posizione  508)  (fig.   10)   è   la   più   comune   nella   popolazione  nordeuropea   e   cos;tuisce   il   70-­‐80%   di   tuFe   le  mutazioni   della   fibrosi   cis;ca   in   molte  popolazioni.   In   Italia   questa   mutazione  rappresenta   il   51%   del   totale,   ma   con   una  notevole  variabilità  nelle  diverse  regioni.  Questa  mutazione,  appartenente  alla   II  classe,  è  determinata   dalla   delezione   di   tre   paia   di   basi  codifican;   per   la   fenilalanina   al   codone   508  e   causa   il   mancato   processamento   a   livello   del  re;colo  endoplasma;co  della  proteina  CFTR.    La   proteina   non   raggiunge   la   membrana   non  perché  la  sua  struFura  sia  dras;camente  alterata  dalla   mutazione,   ma   in   quanto   la   maturazione  post-­‐traduzionale  della  proteina  non  può  essere  completata  a  causa  della  mancanza  di  un  segnale  specifico   in   cui   è   coinvolta   la   F508.   La   proteina  con  la  delezione  F508  quindi  non  supera  il  severo  controllo  di  qualità  a  cui  sono  soFoposte  tuFe  le  proteine   a   livello   del   re;colo   endoplasma;co   e  quindi  viene  trasportata  ai  proteasomi  dove  viene  degradata.

2.5  La  diagnosi  di  fibrosi  cis<ca Nonostante   l’alta   frequenza   di   portatori,   per   la   fibrosi   cis;ca   è   difficile   realizzare   un   test  diagnos;co   di  massa   a   causa   della   variabilità   allelica   della  mala:a.   L'alterna;va   pra;cabile   è   la      diffusione  di  un  programma  di  screening  gene;co  nei  sogge:  che  hanno  probabilità  aumentata,  rispeFo  alla  popolazione  generale,  di  essere  portatori  del  gene  FC  o  rischio  aumentato  di  avere  la  mala:a.    Alla  nascita  si  esegue  un  test  basato  sul  dosaggio  della   tripsina  ema;ca  (enzima  pancrea;co  che  serve  per  digerire  le  proteine)  su  una  goccia  di  sangue  del  neonato  u;lizzata  anche  per  la  diagnosi  neonatale  di  altre  mala:e  gene;che.  Se   il   "test  della  goccia"  dimostra  che   i   livelli  di   tripsina  nel  sangue  sono  eleva;  non  è  deFo  che   il  bambino  sia  effe:vamente  affeFo  da  FC,  ma   il   centro  di  screening   richiama   la   famiglia   per   effeFuare   il   secondo   dosaggio,   tra   i   15-­‐20   giorni   di   vita   del  neonato.  L’elevata  concentrazione  di  tripsina  nel  sangue  è  probabilmente  dovuta  all'ostruzione  dei  do:   pancrea;ci,   condizione   presente   in   quasi   tu:   i   neona;   con   FC,   indipendentemente   dallo  sviluppo  successivo  di   insufficienza  pancrea;ca.   In  caso  di  valori  eleva;  di   tripsina   la  diagnosi  va  confermata  o  esclusa  ricorrendo  ad  altri  test.  Per  la  diagnosi  di  fibrosi  cis;ca,  in  prima  baFuta  si  esegue  un  semplice  esame  per  stabilire  il  livello  di   ioni   Na+   e   Cl-­‐  nel   sudore.  Un   an;co   proverbio   tedesco   del   XVII°   secolo   così   recitava:   “morirà  

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Fig.  10:  Classi  delle  mutazioni  del  gene  CFTR  e  i  loro  effe:  (Cimino  et  al.  2012).

presto   il   bambino,   la   cui   fronte   sa   di   sale   se   baciata”.   Nei   tempi   an;chi   nell’Europa   del   Nord,  durante   cerimonie  di  purificazione,   si   era   soli;   leccare   la   fronte  di  neona;  e  bambini.   Se   veniva  percepito  un  sapore   salato,   il  bambino  veniva  deFo  stregato  e  des;nato  a  morte  precoce.   In   tal  modo,   la   saggezza   popolare   aveva   già   an;cipato   quanto   l’osservazione   medica   avrebbe   poi  scoperto  negli  anni  ’50  e  la  ricerca  scien;fica  non  ancora  completamente  chiarito.  Infa:  il  testo  di  questo   an;co   proverbio   tedesco   ci   indica,   nella   concentrazione   di   sali   nel   sudore,   il   metodo   di  diagnosi   per   la   fibrosi   cis;ca.   È   proprio   questa   caraFeris;ca   del   sudore   par;colarmente   salato,  avver;to   dalle  madri   quando   baciavano   i   bambini   affe:,   che   farà   chiamare   la   fibrosi   cis;ca   “la  mala:a  del  bacio  salato”.  Per   la   diagnosi   gene;ca   si   usano   analisi   a   vari   livelli:   le   tecniche   di   primo   livello   ricercano   le  mutazioni   più   frequen;   del   gene   CFTR   (Reverse   Dot   Blot,   Amplifica%on   Refractory   Muta%on  Systems,  Oligonucleo%de  Specific  Allele  e  Oligonucleo%de  Liga%on  Assay).  Le  tecniche  di  secondo  livello,   che  analizzano   tu:  gli  esoni  e   le   regioni   limitrofe  cercando  variazioni  di   sequenza,     sono  esami   più   sensibili,   ma   di   più   difficile   interpretazione   perchè   evidenziano   anche  mutazioni   non  patologiche   (Denaturing   Gradient   Gel   Electrophoresi,   Denaturing   High   Performance   Liquid  Cromatography,  sequenziamento  dire:o).    Le  tecniche  di  terzo  livello  ricercano,  infine,  delezioni  ed  inserzioni   nella   sequenza   genica   (Quan%ta%ve   Mul%plex   Polymerase   Chain   Reac%ons   of   Short  Fluorescent  Fragments).  AFualmente  è  possibile  aggiungere  anche  un  quarto  livello  di  analisi  che  si  basa   sullo   studio   del   mRNA   che   permeFe   di   iden;ficare   mutazioni   negli   introni   che,   pur   non  adiacen;  agli  esoni,  causano  alterazioni  nello  splicing.  Nel  caso  della  gravidanza  di  una  coppia  cos;tuita  da  due  portatori  si  può  effeFuare  una  diagnosi  prenatale  per  sapere  se   il  nascituro  ha  ereditato  entrambi   i  geni  difeFosi  presen;  nei  genitori,  e  quindi  se  è  malato  di  fibrosi  cis;ca  o  meno.  Per  poter  eseguire  la  diagnosi  prenatale  è  necessario  aver   in   precedenza   individuato   i   geni   difeFosi   presen;   in   entrambi   i   genitori   e   talora   a   questo  scopo  può  essere  necessaria  un’analisi  gene;ca  in  altri  familiari.  Per  eseguire  la  diagnosi  prenatale  è  necessario  un  campione  di  DNA,  che  abitualmente  viene  oFenuto  con  un  prelievo  di  villi  coriali,  un  tessuto  placentare  che  con;ene  lo  stesso  DNA  del  feto,  eseguito  tra  la  decima  e  la  dodicesima  se:mana   di   gravidanza,   o,   più   raramente,   u;lizzando   cellule   contenute   nel   liquido   amnio;co,  oFenute   tramite   amniocentesi,   eseguita   tra   la   sedicesima   e   la   dicioFesima   se:mana   di  gravidanza.   L’analisi   prenatale   può   essere   effeFuata   anche   dopo   ecografie   che   mostrano  determinate  anomalie,  come  iperecogenicità  (aumento  della  densità)  delle  anse  intes;nali.  Sono  in  fase  di  studio  nuove  tecniche  per  la  diagnosi  prenatale  non  invasiva  (NIPD)  di  fibrosi  cis;ca  con  metodiche  analoghe  a  quelle  già  u;lizzate  per  la  diagnosi  di  patologie  cromosomiche;  durante  la  gravidanza  alcuni   frammen;  di  DNA  del   feto  e  della  placenta  circolano  nel   sangue  materno.   Il  DNA   fetale   è   rilevabile   sin   dalla   quinta   se:mana   di   gestazione,   la   sua   concentrazione   aumenta  nelle   se:mane   successive  e   scompare  dopo   il   parto.   Il   test   si   esegue  mediante   il   prelievo  di  un  campione   di   sangue   della   madre,   a   par;re   dalla   decima   se:mana   di   gravidanza,   da   cui   viene  isolato  il  DNA  fetale  libero,  presente  nel  circolo  materno  che  viene  successivamente  sequenziato.  

2.6  Il  vantaggio  seleBvo  degli  eterozigo< Perché   vi   è   una   notevole   diffusione   delle   mutazioni   del   gene   CFTR   nelle   popolazioni   di   pelle  bianca? La  teoria  del  vantaggio  del  portatore  ipo;zza  che  il  portatore  di  una  mutazione  CFTR  abbia  avuto,  in   tempi   remo;,   un   vantaggio   nella   salute   sugli   altri   individui   non   portatori,   per   la   resistenza   a  

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qualche   mala:a   cui   invece   il   resto   della   popolazione   era   susce:bile,   come   il   ;fo   o   il   colera,  mala:e  che  in  passato  hanno  scatenato  epidemie  gravissime.  Recentemente  una  ricerca  condoFa  in  una  popolazione  indonesiana,  in  un’area  in  cui  il  ;fo  è  endemico,  cioè  presente  abitualmente  in  quella  regione,  ha  confermato  che  effe:vamente  i  portatori  di  FC  hanno  un  rischio  di  contrarre  il  ;fo  molto  più  basso  dei  non  portatori. Nel  1994  Gabriel  et  al.,  usando  dei  modelli  murini  che  correlano  streFamente  con  feno;po  FC  per  quanto   riguarda   il   traFo   intes;nale   (omozigo;   recessivi,   eterozigo;   e   normali   rispeFo   al   CFTR),  hanno   dimostrato   che   i   topi   eterozigo;   per   il   CFTR   mutato   hanno   una   secrezione   (perdita   di  liquidi),  in  risposta  alla  tossina  colerica,  del  50%  inferiore  rispeFo  ai  topi  normali;  nessuna  risposta  è   riscontrata  nei   topi   con  CFTR  mutato  allo   stato  omozigote   in  accordo  alle  preceden;  evidenze  sull’uomo.   Come   nel   modello   animale,   nell’uomo   eterozigote   un   più   basso   livello   di   CFTR  funzionante   a   livello   intes;nale   si   dovrebbe   tradurre   in   un   meccanismo   prote:vo   che   evita   o  riduce  la  disidratazione  in  risposta  alla  tossina  colerica.   È   stato   inoltre   evidenziato   in   vitro   come   altri   baFeri   enteroinvasivi   come   E.   Coli   o   Salmonella  Dublin  possano  modulare  la  secrezione  di  cloro  e  la  funzione  di  barriera  intes;nale.   Pier   et   al.   ipo;zzano   che   il   ΔF508   eterozigote   possa   essere   prote:vo  nei   confron;  della   febbre  ;foide,   contribuendo   a   spiegare   perché   i   ΔF508   siano   così   diffusi   in   alcune   popolazioni.   Una  rassegna  del  U.S.  Cys%c  fibrosis  founda%on  registry  non  è  riuscita  a  trovare  un  solo  caso  di  febbre  ;foide  tra  i  pazien;  FC  (Prince,  1998).    

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Fig.  11:    prevalenza  approssima;va  alla  nascita  di  individui  affe:  da  FC  nel  mondo  e  rela;ve  mutazioni  più  frequen;  in  tali  regioni  (O’Sullivan  BP  and  Freedman  SD,  2009).

2.7  Tecniche  di  laboratorio  per  la  diagnosi  di  fibrosi  cis<ca  Analisi  di  primo  livello  • Reverse  Dot  Blot  (RDB)  

Prevede  una   reazione  di  PCR  mul;pla   in   grado  di   amplificare   contemporaneamente  differen;  regioni  del  gene.  A  questa  fa  seguito  una  reazione  di   ibridazione  colorimetrica  allele-­‐specifica,  che   si   basa   sull’ibridazione   dei   prodo:   di   PCR   con   sonde   molecolari   oligonucleo;diche  complementari  alla  sequenza  normale  e  alle  sequenze  mutate.  Il  metodo  è  rapido,  affidabile  e  non  prevede  l’u;lizzo  di  strumentazioni  sofis;cate.

• Amplifica0on  Refractory  Muta0on  Systems  (ARMS)  Prevede  una  reazione  di  PCR  (Polymerase  chain  reac%on   -­‐  amplificazione  di  una  parte  di  DNA  u;lizzando  un  enzima  chiamato  Taq  polimerasi  che  genera  un  nuovo  filamento  di  DNA,  a  par;re  da   un   innesco   chiamato   primer,   complementare   a   quello   in   analisi)   con   uno   dei   due   primer  costruito  in  modo  che  il  nucleo;de  in  posizione  3’  sia  complementare  alla  sequenza  mutata  o  a  quella  normale  del  gene.  Il  DNA  genomico  non  verrà  amplificato  quando  si  userà  il  primer  non  perfeFamente  complementare  alla  sequenza  in  esame.  La  visualizzazione  degli  ampliconi  viene  normalmente  eseguita  mediante  eleFroforesi  su  gel  di  agarosio  (tecnica  di  separazione  del  DNA  in  base  alla  massa  e  alla  generazione  di  un  campo  eleFrico).

• Oligonucleo0de  Liga0on  Assay  (OLA)  E’  basata  sull’u;lizzo  di  sonde  fluorescen;  specifiche  e  della  ligasi  termostabile  rTth,  un  enzima  per   la   riparazione   del   DNA.   La   reazione   di   PCR   con   sonde   complementari   all’allele  mutato   e  normale   è   seguita   da   una   reazione   di   ligasi   che   unisce   le   sonde   che   si   sono   legate   al   DNA  bersaglio,   discriminando   tra   quelle   con   complementarietà   completa   e   incompleta.   La  visualizzazione   dei   risulta;   avviene   mediante   eleFroforesi   capillare   su   sequenziatore  automa;co.  

Analisi  di  secondo  livello Come   per   le   analisi   mutazione-­‐specifiche,   anche   le   metodiche   di   II   livello   che   permeFono   di  effeFuare  lo  scanning  dell’intero  gene  alla  ricerca  di  eventuali  mutazioni  sono  piuFosto  numerose.  In  passato  il  sequenziamento  dell’intero  gene  CFTR  era  considerato  complesso  e  costoso  e  quindi  applicabile   solo   a   casi   molto   limita;.   Per   questo,   nel   corso   degli   anni   ’90,   sono   nate   e   si   sono  diffuse   numerose   tecniche,   che   permeFono   di   eseguire   uno   screening   delle   variazioni  nucleo;diche,   per   ridurre   al   minimo   le   analisi   di   sequenziamento.   Tra   queste   metodiche  ricordiamo  quelle  che  hanno  dato  i  risulta;  migliori,  permeFendo  di  iden;ficare  il  94%-­‐98%  delle  mutazioni   (la   percentuale   delle   mutazioni   non   iden;ficate   dipende   dalla   frequenza   dei  riarrangiamen;   genici   e   delle   mutazioni   localizzate   nelle   regioni   introniche):   DGGE   (Denaturing  Gradient  Gel  Electrophoresis)  e  D-­‐HPLC  (Denaturing  High  PerformanceLiquid  Chromatography).   In  ques;  ul;mi  anni,  vis;  i  progressi  della  tecnologia  legata  al  sequenziamento  del  DNA,  i  laboratori  di  gene;ca  molecolare  preferiscono  procedere  al  sequenziamento  completo  del  gene  CFTR  anziché  effeFuare  all’analisi  D-­‐HPLC. • Sequenziamento  direIo  del  DNA  

PermeFe   di   leggere   la   sequenza   di   basi   azotate  mutate,   pertanto   questa   tecnica   segue   le  preceden;  per  caraFerizzare  la  mutazione,  con  una  sensibilità  vicina  al  100%.  

• Denaturing  Gradient  Gel  Electrophoresis  (DGGE)  

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SfruFa  il  principio  che  la  temperatura  di  denaturazione  del  DNA  dipende  dalla  sua  sequenza  nucleo;dica  ed  è  peculiare  di  ogni  frammento.  Variazioni  di  un  singolo  nucleo;de  (mutazioni  o  polimorfismi)  modificano  la  temperatura  di  denaturazione  del  frammento  e  di  conseguenza  la  sua  mobilità.  La  variazione  nella  Tm  (temperatura  di  legame)  di  un  dato  frammento  di  DNA  può  essere  controllata  su  un  gel  di  poliacrilammide  a  concentrazioni  di  denaturan;  crescen;  poiché   il   raggiungimento   della   temperatura   di   denaturazione   (in   questo   caso   della  concentrazione   di   denaturante   ad   essa   equivalente)   comporta   una   parziale   apertura   della  doppia   elica   e   quindi   un   rallentamento   nella   progressione   del   frammento   sul   gel.   E’   una  tecnica  con  buona  sensibilità  (>95%),  ma  di  difficile  messa  a  punto  e  non  automa;zzabile.

• Denaturing  High  Performance  Liquid  Cromatography  (DHPLC)  Rappresenta   l’evoluzione   in   automa;co   del   DGGE   e   permeFe   l’iden;ficazione   di   varian;  nucleo;diche   in  brevissimo  tempo.  Si   traFa  di  una  cromatografia   ionica   in   fase   inversa  che  sfruFa,  in  condizione  di  parziale  denaturazione,  la  diversa  ritenzione  delle  molecole  di  DNA  in   assenza/presenza   di   variazioni   di   sequenza.   Ha   una   buona   sensibilità   (>95%)   ed   è  semiautoma;zzabile.  

Analisi  di  terzo  livello Tra   le   metodiche   che   permeFono   la   quan;ficazione   del   DNA   per   rilevare   la   presenza   di  riarrangiamen;   genici,   ricordiamo:   l’analisi   QMPSF   (Quan0ta0ve   Mul0plex   PCR   of   Short  Fluorescent   Fragments)   e   l’analisi   MLPA   (Mul0plex   Liga0on-­‐dependent   Probe   Amplifica0on).  Entrambe   si   basano   sull’amplificazione   simultanea   di   piccoli   frammen;   di   DNA   seguita   dalla  quan;ficazione   della   fluorescenza   di   ciascun   frammento   amplificato.   In   Italia   le   delezioni/duplicazioni  hanno  una   frequenza  pari   al  2-­‐3%  e   le  delezioni  più   frequen;  sono:  delezione  degli  esoni   22-­‐23;   delezione   esoni   22-­‐24;   delezione   esone   2;   delezione   esoni   2-­‐3;   delazione   esoni  17a-­‐18;  delezione  esone  1.  Recentemente  sono  sta;  riporta;  dei  da;  oFenu;  mediante  la  ricerca  dei   riarrangiamen;   u;lizzando   la   tecnica   dell’array   CGH   (Array   Compara0ve   Genomic  Hybridiza0on),  tecnica  per  valutare  la  perdita  o  acquisizione  di  materiale  gene;co)  che  dimostrano  una   maggiore   sensibilità   e   specificità   del   sistema   e   hanno   permesso   l’iden;ficazione   di   estese  duplicazioni  non  evidenziabili  con  le  tecniche  QMPSF  e  MLPA.

3.  Tecniche  u<lizzate  in  laboratorio  per  la  diagnosi  di  malaBe  gene<che

3.1  Reverse  Dot  Blot  (RDB) La  tecnica  del  Reverse  Dot  Blot  fu  per  la  prima  volta  descriFa  nel  1989  da  Saiki  et  al.  e  u;lizzata  per  la  geno;pizzazione  HLA-­‐DQA  e  per  l’iden;ficazione  di  mutazioni  che  provocano  la  beta-­‐talassemia. Su   un   filtro   di   nylon   vengono   applica;   degli   oligonucleo;di   specifici   per   la   variante   normale   o  mutata   di   un   determinato   gene;   si   effeFua   una   ibridazione   sul   filtro   con   DNA   sano   o   mutato  oFenuto  mediante  PCR  con  un  primer  a  cui  è  aFaccata  una  molecola  di  bio;na  o  u;lizzando  dUTP  coniuga;  alla  bio;na  (Chehab  and  Wall,  1992). L’ibridazione   viene   rilevata   dopo   il   legame   della   strepdavidina   con   la   bio;na;   poichè   la  streptavidina  è  coniugata  con  una  perossidasi,   il   legame  tra  DNA  del  paziente  e   l’oligonucleo;de  viene  visualizzato  dalla  reazione  colorimetrica  in  seguito  al  traFamento  con  H2O2  (fig.  12).

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Questa  tecnica  permeFe  di  valutare  simultaneamente  più  mutazioni  sullo  stesso  filtro,   rendendo  questa  analisi  rapida  e  affidabile.  Infa:  è  stata  applicata  anche  alla  diagnosi  di  CF:   in  par;colare  nello  studio  condoFo  da  Chehab  and   Wall   nel   1992,   è   stato   messo   a   punto   un   reverse   dot-­‐blot   in   grado   di   permeFere  simultaneamente   lo  screening  dell’85%  dellemutazioni  più   frequen;  tra   i   caucasici  nord  europei,  u;lizzando   oFo   coppie   di   sonde   che   permeFono   di   iden;ficare   altreFante   mutazioni   (di   ;po  missenso,  non-­‐senso,  frameshiR  o  che  alterano  lo  splicing).    

 

                           

3.2  Sequenziamento Il   processo  di   sequenziamento  del  DNA  permeFe  di   iden;ficare   la   successione  di   nucleo;di   che  cos;tuiscono   il   frammento  da  analizzare.  Questa   tecnica   si  è  affinata  negli   anni,  permeFendo  di  iden;ficare   la   sequenza   di   DNA   di   varie   specie   in   tempi   brevi   e   con   cos;   contenu;   e  progressivamente  diminu;.  Il  sequenziamento  è  diventato  quindi  una  tecnica  di  elezione  anche  per  la  diagnosi  di  mala:e  gene;che. Le  metodologie  di  sequenziamento  del  DNA  sono  state  ideate  verso  la  metà  degli  anni  ’70,  ma  già  dieci  anni  prima   il  gruppo  di  Robert  Holley   fece   i  primi   tenta;vi  per   sequenziare   il   tRNA;  questo  metodo   prevedeva   la   diges;one   dell’RNA   con   RNAsi   sequenza-­‐specifiche,   il   frazionamento   degli  oligoribonucleo;di   risultan;   e   la   determinazione   dell’ordine   delle   basi   per   ogni   frammento   con  una  diges;one  ad  opera  di  un’esonucleasi.   Successivamente   vennero   fa:   mol;   tenta;vi,   tu:   rilevatesi   poi   poco   adegua;,   per   applicare  questo   metodo   al   sequenziamento   del   DNA,   aFraverso   il   taglio   in   frammen;   più   piccoli   con  l’endonucleasi  IV  o  con  elemen;  chimici.   Dieci   anni   dopo   vennero   proposte   due   nuove   tecniche:   Sanger   mise   a   punto   il   metodo   a  terminazione  di   catena,   in  cui   la   sequenza  di  DNA  single  strand  veniva  determinata  aFraverso   la  

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Fig.  12:   rappresentazione  del  reverse  dot-­‐blot:  sulle  sonde  posizionate  sul  filtro  viene  ibridato   il  DNA  di  vari  individui  di  una  stessa  famiglia  per  determinarne  il  geno;po.

sintesi  enzima;ca  di  catene  polinucleo;diche  complementari,  di   lunghezza  variabile  e   terminan;  con  nucleo;di  marca;,  mentre  Maxam  e  Gilbert   determinarono   la   sequenza  di   una  molecola   di  DNA  a  doppio  filamento  mediante  traFamento  con  reagen;  chimici  capaci  di  tagliare  la  molecola  in  posizioni  specifiche.   La  facilità  di  automazione  del  metodo  ideato  da  Sanger  e  la  tossicità  dei  reagen;  chimici  usa;  da  Maxam  e  Gilbert  hanno  contribuito  alla  maggior  diffusione  del  metodo  a  terminazione  di  catena.  Sanger  e  Gilbert  hanno  ricevuto  entrambi  il  Premio  Nobel  nel  1980. La  tecnica  di  sequenziamento  ideata  da  Sanger  prevede  l’u;lizzo  di  un  templato  di  DNA  a  singolo  filamento,   di   un   primer   specifico   per   l’avvio   della   reazione   di   polimerizzazione,   di   una   DNA  polimerasi,   di   normali   dNTPs  e  di   3’ddNTPs,   didesossinucleo;di  modifica;   con  un  atomo  di  H   al  posto  del  convenzionale  gruppo  -­‐OH  sul  carbonio  in  posizione  3’  dello  zucchero,  e  marca;  con  32P,  33P   o   35S   in   modo   da   renderli   iden;ficabili.   Quando   un   ddNTP   viene   incorporato   nel   nuovo  filamento,   a   causa   della   mancanza   del   3’-­‐OH,   non   può   formare   il   legame   fosfodiesterico   con   il  successivo  dNTP  e  pertanto  la  sintesi  del  filamento  si  arresta.  Poiché  la  polimerasi  non  è  in  grado  di  discriminare   tra   dNTPs   e   ddNTPs,   il   prodoFo   della   reazione   è   cos;tuito   da   una   popolazione   di  catene   di   nucleo;di   di   lunghezza   differente   in   base   alla   distanza   tra   il   primer   e   il   sito   di  incorporazione  del  ddNTP.   I   ddNTPs   vengono  aggiun;   in  quan;tà   inferiore  ai   dNTPs   in  modo  da  permeFere  la  formazione  di  frammen;  sufficientemente  lunghi  per  consen;re  la  loro  analisi. In   differen;  proveFe   si   aggiungono   i   quaFro   diversi   ddNTPs,   un   solo   ;po   per   ogni   campione,   e  vengono  quindi  prodo:  filamen;  che  coprono  tuFa   la   lunghezza  della  regione  da  sequenziare.   I  campioni  oFenu;  vengono  poi  carica;  in  quaFro  pozze:  con;gui  di  un  gel  di  poliacrilammide:  la  corsa  eleFrofore;ca,  rilevata  mediante  autoradiografia,  permeFe  di  determinare   la  sequenza  del  campione   analizzato,   confrontando   la   posizione   dei   quaFro   ddNTPs   nei   rispe:vi   traccia;;   il  frammento   più   piccolo,   cioè   quello   con   una   corsa  maggiore,   rappresenta   la   prima   base   azotata  della  sequenza  (fig.  13A).    AFualmente  i  ddNTPs  usa;  per  il  sequenziamento  non  sono  più  marca;  con  isotopi  radioa:vi,  ma  legano  in  posizione  3’  un  fluorocromo,  diverso  per  ogni  ;po  di  base  azotata  (fig.  14).  I  frammen;  oFenu;  con  la  PCR  in  presenza  di  ddNTP  marca;  con  fluorocromo  vengono  analizza;  tu:  insieme  da  un  sequenziatore  automa;co  che  li  separa,  in  base  alle  loro  dimensioni,  mediante  corsa  lungo  un  capillare  del  diametro  di  50  µm  contenente  un  polimero  di  corsa  che  svolge  la  stessa  funzione  del   gel  di   poliacrilammide.   I   sequenziatori   più  efficien;  u;lizzano  96   capillari   che  permeFono  di  sequenziare  fino  a  100.000  bp  per  corsa.  Al  termine  della  corsa  i  frammen;,  sono  ordina;  in  base  alle   dimensioni,   dal   più   piccolo   al   più   grande,   e   qui   un   raggio   laser   eccita   le   molecole   di  fluorocromo   associate   all’ul;mo   nucleo;de   di   ciascun   frammento;   queste   emeFono   dei   segnali  rileva;   dal   computer   e   un   soRware   elabora   i   da;   oFenu;   da   un   fotomol;plicatore   o   da   un  disposi;vo   CCD   (Charge-­‐Coupled   Device)   e   li   rappresenta   su   di   un   tracciato   chiamato  eleFroferogramma  come  un  insieme  di  picchi  colora;  per  i  quaFro  diversi  fluorocromi  (fig.  13B). La  sequenza  dei  colori  presen;  nel  tracciato  permeFe,  quindi,  di  ricostruire  la  sequenza  delle  basi  azotate  nel  filamento  del  DNA,  mentre  la  diversa  altezza  dei  picchi  dipende  dal  numero  di  molecole  di  quella  data  lunghezza  che  si  sono  forma;  durante  il  processo  di  duplicazione;  sequenziando  più  volte  lo  stesso  frammento  troveremo  quindi  sempre  la  stessa  sequenza  di  colori,  ma  non  la  stessa  altezza  dei  picchi  perché  l’inserimento  dei  ddNTPs  al    posto  del  dNTPs  è  casuale.

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3.3  Percorso  bioinforma<co  

Ensembl  Il  sito  di  Ensembl,  hFp://www.ensembl.org,  ha  una  interfaccia  di  facile  leFura  (fig.  15).  Ensembl  (un  gioco  di  parole   fra   “ensemble”   cioè   “insieme”  e   “EMBL”   la   sigla  del  European  Molecular  Biology  Laboratory),  è  un  progeFo  sviluppato  in  collaborazione  tra  Sanger  Center  (uno  dei  più  importan;  centri   di   ricerca   sul   genoma   a   Cambridge)   e   EMBLEBI   (European   Bioinforma%cs   Ins%tute)   per  sviluppare   un   sistema   soRware   di   annotazione   automa;ca   dei   genomi   animali.   Con   il   termine  “annotazione”   si   intende   l’inserimento   di   tuFe   le   informazioni   riguardan;   la   funzione   di   una  determinata  sequenza.   In  questa  pagina  di   ingresso  si  possono  osservare   i   link  alle  sequenze  dei  genomi  di  diverse  specie.  AFualmente  sono  note  le  sequenze  di  molte  più  specie  rispeFo  a  quelle  qui  elencate,  sia  di  organismi  procario;  che  eucario;,   tuFavia  Ensembl  prende   in  considerazione  sopraFuFo   le   sequenze   degli   organismi   del   regno   animale,   importan;   perchè   molto   simili   al  

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Fig.  13:    A  -­‐  sequenziamento  mediante  autoradiografia                                B  -­‐  Sequenziamento  con  u;lizzo  di  ddNTPs  fluorescen;

Fig.  14:  ddNTP  con  H  in  3’  

nostro.   Cliccando   su   Homo   sapiens   si   apre   la   pagina   rela;va   al   genoma   umano.

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                                                                                                                                                                   Fig.  15:  homepage  Ensembl

OMIM OMIM,  Online  Mendelian  Inheritance  in  Man,  è  una  banca  da;  che  con;ene  informazioni  sui  geni  umani   e   sulle   mala:e   gene;che   realizzata   e   mantenuta   dall’NCBI,   the   Na%onal   Center   for Biotechnology   Informa%on   (fig.  16).  La  banca  con;ene   la  descrizione  dei  geni  e  delle  mala:e  ad  essi  associate,   i  quadri  clinici  e   i  riferimen;  bibliografici,  oltre  a   link  a  sequenze  e  ad  altre  risorse  web.  Si  traFa  della  versione  on  line  del  testo  “Mendelian  Inheritance  in  Man”  a  cura  del  gene;sta  medico   Victor   A.  McKusick   e   di   un   gruppo   di   colleghi   della   Johns   Hopkins   University   e   di   altre  is;tuzioni.   La   banca   da;   è   aggiornata   quo;dianamente   e   riporta   solo   mala:e   che   sono   state  associate  ad  uno  o  più  geni.

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BLAST BLAST  (Basic  Local  Alignment  Search  Tool)  è  un  programma  euris;co  (ogni  principio  o  espediente  che  contribuisca  a  ridurre  la  quan;tà  di  ricerca  media  necessaria  per  la  soluzione  di  un  problema)  per  la  ricerca  di  omologie  locali  di  sequenza. Il  soRware  BLAST  (fig.  17)  in  realtà  è  composto  da  diversi  algoritmi  che  consentono  di  allineare  non  solo  sequenze  nucleo;diche  con  sequenze  nucleo;diche,  ma  anche  sequenze  proteiche  fra  di  loro,  sequenze  nucleo;diche  con  sequenze  proteiche  e  viceversa,  ovviamente  u;lizzando  le  regole  del  codice  gene;co  per  passare  dalle  sequenze  nucleo;diche  a  quelle  amminoacidiche.

!                                                                                                                                                                              Fig.  17:  homepage  BLAST

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Fig.  16:  homepage  NCBI

Deep  View Le   struFure   tridimensionali   (3D)   delle   proteine   possono   essere   determinate   con   una   serie   di  approcci  sperimentali,  fra  i  quali  i  più  u;lizza;  e  in  grado  di  fornire  le  informazioni  più  deFagliate  sono   la   cristallografia  ai   raggi  X  e   la   risonanza  magne;ca  nucleare.  E’   inoltre  possibile  effeFuare  delle  previsioni  di  struFura  per  proteine  che  mostrino  un  sufficiente  livello  di  iden;tà  di  sequenza  con   proteine   la   cui   struFura   sia   stata   determinata   sperimentalmente.   Questo   ;po   di   analisi   è  ovviamente  molto  meno  accurato,  ma  può  fornire  informazioni  molto  importan;  sulla  struFura  e  sulla  funzione  di  una  proteina.  Le  coordinate  tridimensionali  di  ogni  singolo  atomo  vengono  scriFe  in  un  file  che  è  poi  possibile  visualizzare  mediante  diversi  soRware.  In  par;colare  noi  u;lizzeremo  il  soRware   Deep   View   (fig.   18).   I   file   contenen;   le   coordinate   molecolari   delle   molecole   la   cui  struFura   3D   è   già   stata   risolta   sono   raccol;   (in   diversi   forma;   u;lizzabili   con   diversi   ;pi   di  soRware)  in  un  database  chiamato  PDB  (Protein  Data  Bank)  (fig.  19).  Deep   View   è   un   potente   programma   di   grafica,   oFenibile   da   Expert   Protein   Analysis   System  (ExPASy)  Molecular   Biology   Server   di   Ginevra.   Il   programma   è   semplice   da   usare   e   consente   di  vedere  la  struFura  di  una  proteina  e  creare  modelli  dando  una  sequenza  di  amminoacidi;  permeFe  di  vedere  diverse  proteine  contemporaneamente  e  sovrapporle    per  comparare  la  loro  struFura  e  sequenza.  Per  proteine  di  sequenze  conosciute  ma  struFura  sconosciuta,  Deep  View  soFomeFe  la  sequenza   a   ExPASy   per   trovare   analogie   con   altre   proteine,   con   cui   potete   allineare   la   vostra  sequenza  per   costruire  un  modello  preliminare   in   tre  dimensioni.  Deep  View   soFopone   il   vostro  allineamento   a  ExPASy,   il   server  SWISS_MODEL   costruirà   un  modello   finale,   chiamato  homology  model,  e  lo  invierà  al  vostro  indirizzo  email.  Il   soRware   permeFe   di   osservare   la   struFura   terziaria   della   proteina,   iden;ficare   domini   e  struFure   secondarie,   familiarizzando   con   le   diverse   visualizzazioni   (ribbon   diagram,   backbone   e  sidechains),   permeFendo   di   iden;ficare,   all’interno   della   struFura,   i   residui   eventualmente  interessa;   da  mutazioni   patologiche   (es:   ΔF508del),   confrontando   la   struFura   3D   della   proteina  sana  con  quella  malata.

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Fig.  18:  homepage  Deep  View

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PARTE  PRATICAScenario  1  e  simulazione  di  consulenza  gene<ca        In  consultorio  si  presenta  una  giovane  coppia  (Davide  e  Sofia).  Hanno  2  figli,  Pietro  di  6  anni  sano,  e  Maria,   di   4   anni,   che   soffre   spesso  di   tosse,   raffreddore   e   infezioni   polmonari.   Sofia   racconta   di  avere  una  sorella  e  un  fratello  sani,  ma  una  sua  sorella  maggiore  è  morta  giovane  di  fibrosi  cis;ca  (CF),  mentre  nella  famiglia  di  Davide  non  ci  sono  casi  di  mala:a.  Sofia  è  in  aFesa  di  un  terzo  figlio  (è  alla  fine  della  sesta  se:mana  di  gravidanza)  e  vorrebbe  informazioni  sul  rischio  di  avere  un  figlio  affeFo  da  CF.  Viene  suggerito  alla  coppia  di  soFoporre  Maria  al  test  del  sudore  per  stabilire  il  livello  di  ioni  Na+  e  Cl-­‐,    un  test  semplice  di  valore    diagnos;co  per  la  CF,  e  di  ritornare  con  i  risulta;  delle  analisi.    

Con   i   da;   a   vostra   disposizione   in   questo   momento   costruite   l’albero   genealogico   di   questa  famiglia  e  rispondete  alle  seguen;  domande:  

 

Il  test  del  sudore  conferma  la  diagnosi  di  fibrosi  cis;ca  (livello  di  Na+  di  87  nmol/l,  molto  superiore  al  valore  normale  di  60  nmol/l).  In  base  a  questa  nuova  informazione,  rispondete  nuovamente  alle  domande:    

 

La  CF  è   sempre  causata  da  mutazioni  del  gene  CFTR  sul   cromosoma  7.   La  mala:a  è   recessiva  e  quindi  se  Maria  è  malata,  devono  essere  mutate  entrambe  le  copie  del  suo  gene  CFTR.  NB:  Le  due  mutazioni  possono  essere  uguali  o  diverse.    A   questo   punto   il   gene;sta   suggerisce   di   accertare,   mediante   analisi   del   DNA,   quali   sono   le  mutazioni  presen;  in  Maria  e  nei  suoi  genitori.    Sofia  deve  inoltre  soFoporsi  ad  amniocentesi,  per  determinare,  aFraverso  l’analisi  del  DNA,  il  geno;po  del  nascituro.    

 

 

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• quale è il rischio che Sofia sia portatrice di CF? • quale è il rischio che Davide sia portatore di CF? • quale è il rischio che il nascituro sia affetto da CF? • che probabilità ha il nascituro di essere sano? Di essere portatore?

• quale è il rischio che Sofia sia portatrice di CF? • quale è il rischio che Davide sia portatore di CF? • quale è il rischio che il nascituro sia affetto da CF? • che probabilità ha il nascituro di essere sano? Di essere portatore?

• Quale è il genotipo dei genitori? • Quale è il genotipo di Maria? • Quale è il genotipo del feto?

 

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Sequenza  WT  

Sequenza  eterozigote  

Sequenza  mutato  

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Scenario  2  e  simulazione  di  consulenza  gene<ca        In   consultorio   si   presenta   una   giovane   coppia   (Sara   e   Tommaso).   Sara   ha   una   sorella   affeFa   da  fibrosi   cis;ca  mentre   Tommaso   ha   un   fratello   che   soffre   spesso   di   tosse,   raffreddore   e   infezioni  polmonari;  Tommaso   lo   invita  a   soFoporsi  al   test  del   sudore  per   scoprire  se   i   suoi   sintomi  siano  riconducibili  alla  fibrosi  cis;ca.    La  coppia  richiede  una  consulenza  gene;ca  perchà  la  donna  è   incinta  e  vuole  sapere  quale  sia   la  probabilità  che  il  nascituro  sia  affeFo  da  CF.  Con   i   da;   a   vostra   disposizione   in   questo   momento   costruite   l’albero   genealogico   di   questa  famiglia  e  rispondete  alle  seguen;  domande:    

 

Il  test  del  sudore  conferma  la  diagnosi  di  fibrosi  cis;ca  (livello  di  Na+  di  87  nmol/l,  molto  superiore  al  valore  normale  di  60  nmol/l).  In  base  a  questa  nuova  informazione,  rispondete  nuovamente  alle  domande:    

 

La  CF  è   sempre  causata  da  mutazioni  del  gene  CFTR  sul   cromosoma  7.   La  mala:a  è   recessiva  e  quindi  se  il  feto  è  malato,  devono  essere  mutate  entrambe  le  copie  del  suo  gene  CFTR.  NB:  Le  due  mutazioni  possono  essere  uguali  o  diverse.    A   questo   punto   il   gene;sta   suggerisce   di   accertare,   mediante   analisi   del   DNA,   quali   sono   le  mutazioni  presen;  nelle  famiglie  .    Sara  deve  inoltre  soFoporsi  ad  amniocentesi,  per  determinare,  aFraverso  l’analisi  del  DNA,  il  geno;po  del  nascituro.    

 

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• quale è il rischio che Sara sia portatrice di CF? • quale è il rischio che Tommaso sia portatore di CF? • quale è il rischio che il nascituro sia affetto da CF? • che probabilità ha il nascituro di essere sano? Di essere portatore?

• quale è il rischio che Sara sia portatrice di CF? • quale è il rischio che Tommaso sia portatore di CF? • quale è il rischio che il nascituro sia affetto da CF? • che probabilità ha il nascituro di essere sano? Di essere portatore?

• Quale è il genotipo dei genitori? • Quale è il genotipo degli individui affetti? • Quale è il genotipo del feto?

 

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Sequenza  WT  508  

Sequenza  eterozigote  

Sequenza  omozigote  recessivo  

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Sequenza  WT  G542X  

Sequenza  eterozigote  

Sequenza  omozigote  recessivo  

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Scenario  3  e  simulazione  di  consulenza  gene<ca        In   consultorio   si   presenta   una   giovane   coppia   (Barbara   e   Luca).   Hanno   2   figli,   Sabrina   di   4   anni  sana,   e   Gabriele,   di   6   anni,   che   soffre   spesso   di   tosse,   raffreddore   e   infezioni   polmonari.   Luca  racconta  di  avere  una  zia  da  parte  di  sua  mamma  morta  giovane  di  fibrosi  cis;ca  (CF),  mentre  nella  famiglia  di  Barbara  non  ci   sono  casi  di  mala:a.  Barbara  è   in  aFesa  di  un   terzo  figlio   (è  alla  fine  della  sesta  se:mana  di  gravidanza)  e  vorrebbe  informazioni  sul  rischio  di  avere  un  figlio  affeFto  da  CF.  Viene  suggerito  alla  coppia  di  soFoporre  Gabriele  al  test  del  sudore  per  stabilire  il  livello  di  ioni  Na+  e  Cl-­‐,    un  test  semplice  di  valore    diagnos;co  per  la  CF,  e  di  ritornare  con  i  risulta;  delle  analisi.    

Con   i   da;   a   vostra   disposizione   in   questo   momento   costruite   l’albero   genealogico   di   questa  famiglia  e  rispondete  alle  seguen;  domande:    

 

Il  test  del  sudore  conferma  la  diagnosi  di  fibrosi  cis;ca  (livello  di  Na+  di  87  nmol/l,  molto  superiore  al  valore  normale  di  60  nmol/l).  In  base  a  questa  nuova  informazione,  rispondete  nuovamente  alle  domande:    

 

La  CF  è   sempre  causata  da  mutazioni  del  gene  CFTR  sul   cromosoma  7.   La  mala:a  è   recessiva  e  quindi  se  Gabriele  è  malato,  devono  essere  mutate  entrambe  le  copie  del  suo  gene  CFTR.  NB:  Le  due  mutazioni  possono  essere  uguali  o  diverse.    A   questo   punto   il   gene;sta   suggerisce   di   accertare,   mediante   analisi   del   DNA,   quali   sono   le  mutazioni  presen;  in  Gabriele  e  nei  suoi  genitori.    Barbara  deve  inoltre  soFoporsi  ad  amniocentesi,  per  determinare,  aFraverso  l’analisi  del  DNA,  il  geno;po  del  nascituro.    

 

 

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• quale è il rischio che Barbara sia portatrice di CF? • quale è il rischio che Luca sia portatore di CF? • quale è il rischio che il nascituro sia affetto da CF? • che probabilità ha il nascituro di essere sano? Di essere portatore?

• quale è il rischio che Barbara sia portatrice di CF? • quale è il rischio che Luca sia portatore di CF? • quale è il rischio che il nascituro sia affetto da CF? • che probabilità ha il nascituro di essere sano? Di essere portatore?

• Quale è il genotipo dei genitori? • Quale è il genotipo di Gabriele? • Quale è il genotipo del feto?

 

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Sequenza  WT  G551D    

 Sequenza  eterozigote  

Sequenza  omozigote  recessivo      

Sequenza  omozigote  recessivo  

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Scenario  4  e  simulazione  di  consulenza  gene<ca        In   consultorio   si   presenta   una   giovane   coppia   (AntonieFa   e   Davide),   due   cugini   discenden;  entrambi  dagli  ebrei  Ashkenazi.  Sono  in  aFesa  di  un  figlio  e  vorrebbero  informazioni  sul  rischio  di  avere   un   figlio   affeFto   da   CF   perché   Alessio,   il   nipote   di   Davide,   figlio   di   sua   sorella,   soffre   di  ripetute  infezioni  polmonari  ed  è  stato  da  poco  soFoposto  al  test  del  sudore  per  stabilire  il  livello  di  ioni  Na+  e  Cl-­‐,    un  test  semplice  di  valore  diagnos;co  per  la  CF.  Davide  riferisce  anche  che  sua  sorella  ha  un  altro  figlio  maschio  sano.  

Con   i   da;   a   vostra   disposizione   in   questo   momento   costruite   l’albero   genealogico   di   questa  famiglia  e  rispondete  alle  seguen;  domande:    

 

Il  test  del  sudore  conferma  la  diagnosi  di  fibrosi  cis;ca  (livello  di  Na+  di  87  nmol/l,  molto  superiore  al  valore  normale  di  60  nmol/l).  In  base  a  questa  nuova  informazione,  rispondete  nuovamente  alle  domande:    

 

La  CF  è   sempre  causata  da  mutazioni  del  gene  CFTR  sul   cromosoma  7.   La  mala:a  è   recessiva  e  quindi  se  Alessio  è  malato,  devono  essere  mutate  entrambe  le  copie  del  suo  gene  CFTR.  NB:  Le  due  mutazioni  possono  essere  uguali  o  diverse.    A   questo   punto   il   gene;sta   suggerisce   di   accertare,   mediante   analisi   del   DNA,   quali   sono   le  mutazioni   presen;   in   Alessio   e   nei   genitori   del   feto.     AntonieFa   deve   inoltre   soFoporsi   ad  amniocentesi,  per  determinare,  aFraverso  l’analisi  del  DNA,  il  geno;po  del  nascituro.    

 

 

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• quale è il rischio che Antonietta sia portatrice di CF? • quale è il rischio che Davide sia portatore di CF? • quale è il rischio che il nascituro sia affetto da CF? • che probabilità ha il nascituro di essere sano? Di essere portatore?

• quale è il rischio che Antonietta sia portatrice di CF? • quale è il rischio che Davide sia portatore di CF? • quale è il rischio che il nascituro sia affetto da CF? • che probabilità ha il nascituro di essere sano? Di essere portatore?

• Quale è il genotipo dei genitori? • Quale è il genotipo di Alessio? • Quale è il genotipo del feto?

 

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Sequenza  WT  W1282X  

 Sequenza  eterozigote  

Sequenza  omozigote  recessiva  

�  

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N

Percorso    bioinforma<co  

Ensembl  www.ensembl.org    

Nel  campo  search  di  Ensembl    • scegliete  “human”  • scrivete  nel  campo  bianco  “CFTR”  • dalla  tendina  scegliete  CTFR(human  gene)  • cliccate  sul  primo  transcript-­‐>transcript  ID  

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• sulla  sinistra  della  pagina  cliccate  sul  link:  cDNA  

Nella   parte   bassa   della   pagina   si   visualizzerà   la   sequenza   del   cDNA   e   si   potranno   localizzare   le  principali  caraFeris;che    del  cDNA/mRNA,  per  esempio:  

• 5’UTR  (5’  UnTranslated  Region)  • start  codon  (inizio  della  traduzione,  ATG  (AUG)  il  codone  della  me;onina)  • CDS  (CoDing  Sequence)  • stop  codon  (fine  della  traduzione,  TAA  (UAA)/  TAG  (UAG)  /  TGA  (UGA)  

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 Visualizzazione   della   stru_ura   3D   della   proteina   CF   e   confronto   tra   la   proteina   sana   e   quella  mutata  (ΔF508).  

Aprite  il  file  (con  estensione  “.pdb”)  contenente  la  struFura  3D  della  proteina  in  esame  disponibile  anche   sul   sito   “Protein  Data  Bank”   (hFp://www.rcsb.org/pdb/)     inserendo  nella   casella   search   il  riferimento  2BBO  (wild  type)  (scaricare  il  file  in  PDB  format).  Aprite  il  file  con  il  soRware  di  visualizzazione  “DeepView”  (disponibile  su  hFp://www.expasy.org/spdbv/)  

Deep  View    Deep   View   è   un   potente   programma   di   grafica,   oFenibile   da   Expert   Protein   Analysis   System  (ExPASy)  Molecular  Biology  Server  di  Ginevra.  Deep  View  è  semplice  da  usare  e  consente  di  vedere  la  struFura  di  una  proteina  e  creare  modelli  dando  una  sequenza  di  amminoacidi;  permeFe  di  vedere  diverse  proteine  contemporaneamente  e  sovrapporle    per  comparare  la  loro  struFura  e  sequenza.  Per  proteine  di  sequenze  conosciute  ma  struFura  sconosciuta,  Deep  View  soFomeFe  la  sequenza  a  ExPASy  per  trovare  analogie  con  altre  proteine,  con  cui  potete  allineare   la  vostra  sequenza  per  costruire  un  modello  preliminare   in   tre  dimensioni.   Deep   View   soFopone   il   vostro   allineamento   a   ExPASy,   il   server   SWISS_MODEL  costruirà  un  modello  finale,  chiamato  homology  model,  e  lo  invierà  al  vostro  indirizzo  email.  Aprite  DeepView,  comparirà  la  seguente  finestra.  

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�  

Per  inserire  la  proteina  da  analizzare,  andate  su  File,  cliccate  su  Open  PDB  File,  scegliete  un  file  con  estensione   pdb   e   apritelo.   Automa;camente   la   struFura   della   proteina   verrà   inserita   in   una  finestra  posta  soFo  la  precedente.  

La  finestra  superiore  dà  accesso  al  menu  e  ai  più  comuni  strumen;  u;li  per  manipolare  la  proteina  mentre  la  finestra  posta  in  basso  mostra  la  struFura  della  proteina.  

Manipolazione  della  proteina  

Le    icone  poste  soFo  il  menu  della  prima  finestra  consentono  di  manipolare  la  proteina.  

L’icona�  posta  all’estrema  sinistra  consente  di  portare  la  proteina  al  centro  dello  schermo.  

Le   tre   icone   successive,   � poste   sopra   la   scriFa   Move   all,   servono   a   trascinare,  zoomare   e   ruotare   la   proteina.   Una   volta   che   l’icona   è   selezionata,   (cliccando   su   di   essa   con   il  mouse)   si   può  manipolare   la   proteina,   mostrata   nella   finestra   soFostante,   muovendo   il   mouse  tenendo  premuto  il  pulsante  destro.  

Le     icone  del  terzo  gruppo,  poste  a  destra,� permeFono  di   compiere   alcune   operazioni   di   misura   come   ad   esempio   la   distanza   tra   atomi,   gli   angoli   tra  atomi,  ecc.  di  cui  però  non  ci  occupiamo.  

Cliccando   sull’icona   � a   forma  di  pagina   scriFa,   situata   in  basso,   vicino  alla   scriFa  Move  all,   si  apre   un’altra   finestra   dove   sono   elencate   molte   informazioni   sulla   proteina,   compresa   la   sua  sequenza  amminoacidica.  

Control  Panel  

Si  può  aprire  la  finestra  del  Control  Panel  andando  sul  menu,  cliccando  su  Wind  e  su  Control  Panel,  vi  si  aprirà    sulla  sinistra  dello  schermo,  una  nuova  finestra.  Con  il  mouse  potete  trascinare  la  finestra  del  Control  Panel  dove  meglio  ritenete  più  opportuno  e  cambiare  le  sue  dimensioni  agendo  sui  bordi.  Si  usa  il  Contro  Panel  per  selezionare,  osservare  e  nascondere  parte  del  modello  agendo  sui  singoli  amminoacidi  che  sono  elenca;  sulla  sinistra  della  finestra.  Il   primo   click   sulla   finestra   l’a:va   senza   cambiare   nulla.  Quando   si   selezionano   gli   amminoacidi  (group),   essi   diventano   rossi.   Si   possono   selezionare   cliccando   su   ciascuno   di   essi   o   cliccando   e  trascinando  il  mouse  su  di  essi  tenendo  premuto  il  pulsante  destro.  Premendo  Invio  sulla  tas;era,  gli  amminoacidi  scompariranno  tranne  quelli  seleziona;  (in  rosso).  Da  notare  che  appare,  nella  colonna  show  del  Contro  Panel,  un  segno  di  spunta  accanto  a  ciascun  amminoacido   selezionato,   indicando   che   essi   sono   resi   visibili.   Può   esserci   un   segno   di   spunta  

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anche   nella   colonna   side   indicando   che   i   residui   R   degli  amminoacidi  sono  visibili.  A   sinistra   della   colonna   group   ci   sono   altre   due   streFe  colonne,   la   prima   è   vuota   se   la   proteina   è   formata   da  un’unica   catena,   mentre   se   è   formata   da   più   catene   in  questa   colonna   compariranno   delle   leFere  A,   B   ecc.   ad  indicare   le  varie  catene  presen;  nel  cristallo;  nel  Control  Panel   è   presente   una   catena   corrispondente   ai   residui  amminoacidici     389-­‐678,   corrispondente   al   dominio  funzionale   NBD1   della   proteina.     La   seconda   colonna  con;ene  una  h  se  il  residuo  fa  parte  di  un  alfa  elica  o  una  s  se  il  residuo  fa  parte  di  un  beta  foglieFo  (beta  sheet).  Si  può  selezionare   la  catena  A   semplicemente  cliccando  su  una   A   qualsiasi,   tu:   i   gruppi   A   diventeranno   rossi,  premendo   Invio   la   catena  A   comparirà   nella   finestra.   La  stessa  cosa  vale  per  le  h  o  le  s,  premendo  su  una  qualsiasi  verranno  selezionate  tuFe  le  alfa  eliche  (o  le  beta  sheet).  Se  si  vogliono  selezionare  due  gruppi  diversi,  stacca;  tra  loro,   basta   selezionare   un   gruppo   e   poi   selezionare   il  secondo   gruppo   tenendo   premuto   il   tasto   Control,   una  volta  seleziona;  premere  Invio  per  visualizzarli.  

Selezionate   alcuni   amminoacidi   e   provate   a   cliccare   sulle   colonne   show,   side,   labl,   surface   (un  quadrato  di  pun;ni)  e  ribn  e  guardate  l’effeFo.  

• Labl:  mostra  il  nome  degli  amminoacidi  seleziona;.  • Surface:  mostra   per   ogni   amminoacido,   aFraverso   dei   pun;ni,   la   superficie   di   van   der  

Waals.   Altri   ;pi   di   superficie   sono   oFenibli   nel   piccolo   menu   posto   soFo   il   simbolo  (triangolino  nero).  

• Ribn:  disegna  la  struFura  tridimensionale  della  protena  Sempre  tenendo  premuto  il  pulsante  del  mouse  e  trascinandolo  lungo  le  colonne  del  Control  Panel  si  possono  selezionare  o  deselezionare  i  gruppi;  si  può  oFenere  lo  stesso  risultato  cliccando  in  cima  alla  colonna.    Ricordate   che   potete   centrare,   spostare,   zoomare,   ruotare   la   figura   nella   finestra   del   display  u;lizzando  le  apposite  icone.  Per   visualizzare   la   struFura   ad   alfa   elica   (in   rosso)   e   beta   foglie:   (in   giallo),   nel   Control   Panel  selezionate   tu:   gli   amminoacidi   soFo   la   colonna   ribn   (tenendo   cliccato   control   e   shib   sulla  tas;era),  dal  menu  Color  selezionate  secondary  structure  e  dal  menu    display  scegliete  render   in  3D.  

Colorazione  (menu  Color)  Deep   View   consente   di   dare   diversi   ;pi   di   colorazione   al   modello.   La   colorazione   consente   di  evidenziare  e  rivelare  le  configurazioni  struFurali  e  chimiche  della  proteina.  Andare  su  menu  Color  e  cliccate  su:  

• Secondary  Structure:  le  alfa-­‐eliche  verranno  colorate  di  rosso  e  i  beta  foglie:  in  giallo  e  le  altre   in  grigio.  Contemporaneamente   la  colorazione  apparirà  anche  sul  Contro  Panel,  nella  colonna  in  cui  compaiono  piccoli  quadra;.  

• Secondary  Structure  Succession:  colora  le  eliche  e  i  folglie:  ma  l’ordine  dei  colori  rifleFe  l’ordine  aFraverso  cui   le  varie  struFure  compaiono  nella  proteina.  Risulta  così  più   facile  seguire  la  formazione  di  struFure  secondarie  lungo  la  catena  polipep;dica.  

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• Chain:   colorerà   di   colore   diversi   le   singole   catene   che  possono   cos;tuire   una  proteina.  Naturalmente,   se   una   proteina   è   formata   da   una   singola   catena   apparirà   colorata  uniformemente.  

• Type:   gli   amminoacidi   vengono   colora;   in   base   alle   proprietà   chimiche,   i   gruppi   non  polari   in  grigio   (da  notare  che  mol;  gruppi  non  polari  sono  verso   l’interno  perchè  sono  idrofobici),  i  gruppi  acidi  in  rossi  e  basici  in  blu.  

• CPK:  questa  operazione  riporta   i  gruppi  ai  colori   standard:  bianco  per   il   carbonio,   rosso  per  l’ossigeno,  blu  per  l’azoto  e  giallo  per  lo  zolfo.  

 

N.B   Potete   cambiare   i   colori   scel;   dal   programma   per   indicare   gli   atomi,   gli   amminoacidi,   le  struFure   secondarie,   le   catene   o   lo   sfondo   andando   su   Preferences   e   cliccando   su   color,     si  apriranno  nuove  finestre  aFraverso  cui  potete  selezionare  i  colori  che  preferite.  

Menu  Select  Da  menu  Select  si  possono  selezionare  i  soFomenu:  

• All:  seleziona  tu:  gli  amminoacidi  della  proteina,  premendo  invio  verranno  mostra;    • Secondary  structure:  permeFe  di  selezionare  e  mostrare  premendo  Invio  varie  par;  della  

proteina.  - Helices:  seleziona  e  mostra  gli  amminoacidi  che  formano  un  alfa  elica,    - Strand:  seleziona  e  mostra  solo  le  beta  sheet  - Coil:  seleziona  e  mostra  il  resto  degli  amminoacidi  

• Group   property:  permeFe   di   selezionare   e  mostrare,   sempre   premendo   Invio,   solo   gli  amminoacidi  basici,  acidi,  polari  o  non  polari.  

Menu  Wind  Dal  menu  Wind  si  possono  selezionare  i  soFomenu:  

• Ramachandran  Plot:  Si  usa  questa  finestra  per  giudicare  la  qualità  del  modello,  consente  di   visualizzare   i   residui   i   cui   angoli   conformazionali   stanno   fuori   dal   range  permesso.   Si  possono  anche  cambiare  gli  angoli  conformazionali  del  modello.  

• Layer   Infos:questa   tavola   permeFe   il   controllo   di   molteplici   modelli   proteici,  permeFendo  di  scegliere  quale  modello  rendere  visibile,  quale  muovere  ecc.  

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• Alignment:   La   finestra   alignment   appare   in   basso,  mostra   la   sequenza   di   amminoacidi  delle  proteina.  Si  usa  questa  finestra  quando  si  confrontano  due  o  più  proteine.  

Provate  ora  a  selezionare  nell’elenco  degli  amminoacidi  la  fenilalanina  in  posizione  508  e  coloratela  di   blu;   nell’immagine   in   3D   visualizzerete   la   posizione   dell’amminoacido   e   nella   sequenza   che   è  comparsa  soFo  la  figura,  nella  finestra  Alignment,  si  evidenzierà  l’amminoacido  prescelto.  Per   confrontare   la   struFura   della   proteina   CFTR   sana   con   la   proteina   che   presenta   la   delezione  della  fenilalanina  nella  posizione  508,  aprite  il  file  1XMJ.pdb  con  il  soRware  Deep  View  (avete  già  aperta   in  3D   la  proteina  sana);   le  due  proteine  si  appaieranno  e,  selezionando,  nel  Control  Panel  con  un   colore  diverso,   gli   amminoacidi   della   zona   intorno  alla   posizione  508,   vi   accorgerete   che  manca   la   fenilalanina.   La   struFura   1XMJ   corrisponde   ai   residui   amminoacidici     389-­‐678.   Per  confrontare   le   due   struFure,   bisogna   affiancarle   nella   stessa   finestra.   Prima   avvicinare   una  struFura  all’altra  bisogna    permeFere  il  movimento  ad  una  sola  delle  due,  spuntando  la  voce  can  move,  in  Control  Panel,  solo  in  quella  che  si  vuole  muovere  ed  avvicinare  (nel  nostro  caso  la  1XMJ).  

 

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 Al  di  soFo  dell’immagine  in  3D  c’è  l’allineamento  tra  le  due  catene  amminoacidiche.  Per  confrontare  meglio  le  due  struFure,  prima  di  sovrapporle  colorate  la  proteina  normale  (2BBO)  omogeneamente   in   rosa   (per  agire   su  una  delle  due  proteine,  per  cambiare   i   colori  ecc.,  dovete  scegliere  il  file  da  modificare  dal  menu  a  tendina  subito  soFo  Control  Panel).  Per   sovrapporre   le   due   struFure,   selezionare   dal   menu   Fit,   la   voce  Magic   Fit.   Noterete   che   la  struFura  3D  della  proteina  mutata  si  sovrappone  quasi  completamente  alla  struFura  della  proteina  normale.  

La  mutazione   F508del   causa   il  mancato   processamento   a   livello   del   re;colo   endoplasmico   della  proteina   CFTR.   La   proteina   non   raggiunge   la   membrana   non   perché   la   sua   struFura   è  dras;camente   alterata   dalla   mutazione,   ma   in   quanto   la   maturazione   post-­‐traduzionale   della  proteina   non   può   essere   completata   a   causa   della   mancanza   di   un   segnale   specifico   in   cui   è  coinvolta  la  F508.  La  proteina  con  la  delezione  F508  non  supera  il  severo  controllo  di  qualità  a  cui  sono   soFoposte   tuFe   le   proteine   a   livello   del   re;colo   endoplasmico;   di   conseguenza,   viene  trasportata  ai  proteasomi  dove  viene  degradata.    

4.  Test  di  autovalutazione

Un  cara_ere  recessivo  presente  sul  cromosoma  X:  A. Si  manifesta  solo  nelle  femmine  B. Si  manifesta  solo  nei  maschi  C. Non  viene  mai  trasmesso  dai  maschi  alle  figlie  femmine  D. Si  manifesta  sempre  nei  maschi  E. Si  manifesta  sempre  nelle  femmine  

La  fibrosi  cis<ca  è  una  malaBa:  A. Non  diagnos;cabile  prima  della  nascita  B. In  cui  vi  è  un  vantaggio  sele:vo  per  gli  omozigo;  C. Guaribile  con  opportune  e  lunghe  terapie  

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D. Causata  da  mutazioni  in  più  di  mille  geni  differen;  E. Con  una  grande  eterogeneità  clinica  

Due  genitori,  eterozigo<  per  due  diverse  mutazioni  del  gene  CFTR,  potranno  avere:  A. Solo  figli  sani  B. Solo  figli  affe:  da  fibrosi  cis;ca  C. 75%  figli  sani  e  25%  affeB  da  fibrosi  cis<ca  D. 25%  figli  sani  e  75%  affe:  da  fibrosi  cis;ca  E. Figli  affe:  da  fibrosi  cis;ca  in  una  percentuale  che  dipende  dalla  frequenza  delle  due  

mutazioni  nella  popolazione  

Quale  tra  le  seguen<  affermazioni  sulla  proteina  CFTR  NON  è  corre_a?  A. Regola  la  secrezione  degli  ioni  Cl-­‐,  Na+  e  HCO3-­‐  B. È  una  proteina  trasportatrice  che  lega  ATP  C. È  coinvolta  nel  processamento  delle  gligoproteine  D. Regola  il  pH  di  organelli  citoplasma;ci  E. Possiede  due  regioni  citoplasma<che  e  una  regione  transmembrana  

La  mutazione  p.F508del  NON:  A. È  localizzata  nell’introne10    B. È  descriFa  nella  proteina  C. Determina  la  delezione  di  tre  paia  di  basi  D. Causa  il  mancato  inserimento  di  una  molecola  di  fenilalanina  nella  proteina  E. È  la  più  diffusa  in  Italia  

Quale  tra  le  seguen<  affermazioni  rela<ve  alla  tecnica  Reverse  Dot  Blot  NON  è  corre_a:  A. È  usata  come  tecnica  di  primo  livello  nella  diagnosi  di  fibrosi  cis;ca  B. Richiede  una  PCR  mul;pla  C. Non  richiede  il  sequenziamento  del  DNA  D. Richiede  più  PCR  su  frammen<  diversi  E. PermeFe  di  analizzare  simultaneamente  circa  ľ85%  delle  mutazioni  più  diffuse  

La  frequenza  di  portatori  sani  per  la  fibrosi  cis<ca  è:  A. 1/25-­‐30  B. 1/100  C. 1/250-­‐300  D. 1/1000  E. 1/2500-­‐3500  

L’anamnesi  di  un  paziente  è:  A. La  rappresentazione  del  suo  albero  genealogico  B. L’insieme  dei  sintomi  della  sua  mala:a  C. La  terapia  che  deve  seguire  D. La  sua  storia  sanitaria  E. La  sua  aspeFa;va  di  vita  

Si  parla  di  una  mutazione  “de  novo”:  A. Quando  due  genitori  sani,  entrambi  eterozigo;,  hanno  un  figlio  malato  

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B. Quando  la  mala:a  compare  una  seconda  volta  nella  stessa  famiglia  C. Quando  due  genitori,  entrambi  eterozigo;,  hanno  un  figlio  sano  D. Quando  la  mala:a  colpisce  un  individuo  con  genitori  e  nonni  tu:  sani  E. Quando  due  genitori  sani,  entrambi  omozigo<,  hanno  un  figlio  malato  

In  seguito  alla  mutazione  p.  F508del  la  proteina  CFTR:  A. Non  viene  prodoFa  B. Viene  prodoFa  in  quan;tà  insufficiente  C. Viene  degradata  nell’apparato  di  Golgi  D. È  presente  sulla  membrana,  ma  non  è  a:va  E. È  a:va  sulla  membrana,  ma  viene  rapidamente  degradata  

Quale  delle  seguen<  affermazioni  rela<ve  ai  nucleo<di  modifica<  u<lizza<  per  il  sequenziamento  del  DNA  NON  è  corre_a?  

A. Possono  contenere  isotopi  radioa:vi  dello  zolfo  o  del  fosforo    B. Interrompono  la  sintesi  del  nuovo  filamento  C. Possono  legare  un  fluorocromo  alla  base  azotata  D. Sos<tuiscono  l’idrogeno  in  posizione  3’  con  un  gruppo  ossidrile  E. Vengono  aggiun;  alla  mix  di  PCR  in  quan;tà  circa  1000  inferiore  a  quella  dei  nucleo;di  non  

modifica;  

Quale  programma  perme_e  di  confrontare  sequenze  nucleo<diche  con  sequenze  amminoacidiche?  

A. Deep  view  B. OMIM  C. BLAST  D. Ensembl  E. PDB  

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5.  Glossario

AmpliconiFrammen;  di  DNA  o  RNA  prodo:  da  amplificazione  naturale  o  ar;ficiale  (PCR)

Bio;naVitamina  (H  o  B7)  solubile  capace  di  legarsi  a  proteine  cellulari  (residui  specifici  di  lisina  nella  struFura  degli  istoni)

CCDCharge-­‐Coupled  Device  -­‐  circuito  integrato  in  grado  di  accumulare  carica  eleFrica  proporzionale  alla  radiazione  eleFromagne;ca  che  lo  colpisce

CFTR Cys%c  fibrosis  transmembrane  regulator  -­‐  proteina  canale  per  il  cloro

ChinasiEnzima  che  catalizza  il  trasferimento  di  un  gruppo  fosfato  dall'ATP  o  da  un  composto  fosforilato  ad  altra  molecola

CodoneTripleFa  di  nucleo;di  che  codifica  per  una  specifico  amminoacido  o  interrompe  la  sintesi  proteica  (codone  di  stop)  alla  base    del  codice  gene;co

Da Dalton  -­‐  unità  di  misura  della  massa  atomica  (uma)

DimerizzazioneReazione  che  coinvolge  due  molecole  iden;che  (monomeri)  per  la  formazione  di  una  singola  en;tà  molecolare  (dimero)

EleFroferogrammaTracciato  oFenuto  dal  sequenziamento  del  DNA  caraFerizzato  da  una  succesione  di  picchi,  di  quaFro  colori  diverdi  ciascuno  corrispondente  a  una  diversa  base  azotata

EndonucleasiEnzimi  idroli;ci  che  scindono  i  legami  fosfodiesterici  degli  acidi  nucleici  all'interno  di  una  molecola

Esoni Sequenza  codificante  del  gene  degli  eucario;

EsonucleasiEnzimi  idroli;ci  che  scindono  i  legami  fosfodiesterici  degli  acidi  nucleici  all'estremità  3'  o  5'  di  una  molecola

Eterogeneità  allelica Esistenza  di  più  mutazioni  in  uno  stesso  gene  che  causano  feno;pi  diversi

Eterogeneità  clinicaVariabilità  individuale  nei  sintomi  di  una  patologia  causata  da  eterogeneità  allelica

Eterogeneità  di  locus Mutazioni  in  geni  diversi  che  causano  una  stessa  alterazione  feno;pica

FluorocromoSostanza  che  emeFe  fluorescenza  se  colpita  da  fotoni  con  una  par;colare  lunghezza  d'onda

Introni Sequenza  non  codificante  del  gene  degli  eucario;

Mosaicismo Presenza  di  geno;pi  diversi  in  cellule  dello  stesso  organismo

Mutazione  frameshiRDetermina  uno  spostamento  della  cornice  di  leFura  e  produzione  di  una  proteina  alterata  a  valle  della  mutazione

Mutazione  missenso Causa  ľinserimento  di  un  amminoacido  diverso  nella  proteina

Mutazione  nonsenso Sos;tuisce  un  codone  rela;vo  ad  un  amminoacido  con  un  codone  di  stop

NIPDTecniche  non  invasive  di  diagnosi  prenatale  basate  su  analisi  del  sangue  materno

Pedigree Albero  genealogico

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6.  Bibliografia  e  Sitografia

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Processamento Modificazioni  post-­‐traduzionali  delle  proteine

ProteasomaComplesso  cellulare  mul;proteico  che  degrada  le  proteine  non  funzionali  o  mal  assemblate

Splicing Rimozione  degli  introni  dal  pre-­‐mRNA

StreptavidinaProteina  estraFa  da  Streptomyces  avidinii,  con  al;ssima  affinità  per  la  bio;na,  usata  in  immunocitochimica

Trasportatori  a  casseFeProteine  transmembrana  formate  da  più  subunità:  due  domini  di  trasporto  e  due  domini  (casseFe)  che  legano  ATP

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hFp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi hFp://spdbv.vital-­‐it.ch/  

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