UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
ESTUDO QUÍMICO DE RECURSOS NATURAIS
RENOVÁVEIS DO ESTADO DE SERGIPE:
Hancornia speciosa Gomes
WESLEY FARIA GOMES
SÃO CRISTÓVÃO – SERGIPE
2010
WESLEY FARIA GOMES
ESTUDO QUÍMICO DE RECURSOS NATURAIS
RENOVÁVEIS DO ESTADO DE SERGIPE:
Hancornia speciosa GOMES
Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-
Graduação em Química da Universidade
Federal de Sergipe como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre
em Química.
Orientador:
Prof. Dr. Paulo César de Lima Nogueira
Co-orientadora:
Profa. Dra. Valéria Regina de Souza Moraes
SÃO CRISTÓVÃO – SERGIPE
2010
Ao Senhor meu Deus por me conceder o dom da vida e ter
me dado a oportunidade de completar mais uma
etapa da minha vida profissional.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Aos meus pais, Leonildo Pereira Gomes e Elza Faria Gomes, pelo incentivo, amor,
carinho, repreensão. Saibam que vocês são responsáveis por grande parte dessa vitória.
Ao meu irmão Kley, pelo companheirismo, palavras de incentivo, e por sempre me
fazer acreditar que eu poderia chegar mais além do que imaginava.
A toda minha família que, sempre com palavras motivadoras, me ajudou a superar todos
os obstáculos dessa etapa. Sem contar a compreensão por algumas ausências em
reuniões familiares.
A todos os meus amigos por sempre estarem torcendo e orando pelas minhas
conquistas.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Sergipe, através do Departamento de Química pela
oportunidade de execução deste trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela
concessão da bolsa de estudo.
Ao Prof. Dr. Paulo César de Lima Nogueira pela orientação. Sempre com palavras
sábias e motivadoras fez com que o meu estímulo e apreço pela pesquisa se renovasse a
cada dia.
À Profª. Drª Valéria Regina de Souza Moraes, pelos ensinamentos e palavras de
conforto e incentivo no decorrer deste trabalho.
Aos professores da graduação e pós-graduação do Departamento de Química da
Universidade Federal de Sergipe, por compartilharem um pouco de seus conhecimentos.
À Msc. Taís Santos Sampaio, pelos extratos das folhas e dos ramos da mangabeira.
Ao Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos, através do Prof.
Dr. Antônio Gilberto, pela aquisição dos espectros de Ressonância Magnética Nuclear.
À mestranda Maria Helena Verdan do Departamento de Química da Universidade
Federal do Paraná (DQ-UFPR) pela aquisição dos espectros de Infravermelho.
Ao Prof. Dr. Daniel Pereira Bezerra do Departamento de Fisiologia, do Centro de
Ciências Biológicas e da Saúde da UFS, pela análise de citotoxicidade in vitro e pelas
valiosas discussões.
A todos os meus amigos de graduação, em especial, Osmir Fabiano (pastor), Débora,
Alberto Martins, Juliana Paschoetto, Ricardo Carlos, Carla de Oliveira, Sandra Santana,
Márcia, Cléverton, por compartilharem os primeiros passos na Universidade.
Aos meus colegas de pós-graduação, em especial, Danny, Sandrinha, Cláudia, Rogério,
Márcia, Elissandro, Daniela Kubota, Amanda, pela amizade e companheirismo.
Aos meus companheiros de pesquisa, em especial, Hugo César, Adriano Aquino, Alan
Diego, Edenilson Niculau, Paloma Prata, Darlisson, por me auxiliarem nos momentos
em que mais precisei.
A todos os meus amigos do LABORGANICS, Lívia, Eraldo, Romário, Aline, Iara,
Thanany, Charlene, Pablo, pelo apoio e amizade.
E a todos os amigos e funcionários do Departamento de Química - UFS que direta ou
indiretamente, contribuíram para realização deste trabalho.
MOMENTOS
Há momentos na vida, Senhor, que penso em parar
Tantas coisas me abalam e me impedem de a Ti chegar
Noites vão e vem, mas pra mim nada mudou
Não posso esconder esse aperto em meu coração
Não posso mais ficar assim, ergo agora as minhas mãos
Teu servo, Senhor, te chama
Ouve a minha oração:
“Senhor meu Deus em Ti confio
Não me deixes confundido
Se os meus inimigos vierem contra mim
Que eu não tema os perigos que me enfrentam.”
Pr. Frank Sérgio Rodrigues dos Anjos
CURRICULUM VITAE
1. Dados Pessoais
Nome: Wesley Faria Gomes
Nome em citações bibliográficas: Gomes, W. F.
Naturalidade: Aracaju-SE
Data de Nascimento: 28/11/1984
2. Formação Acadêmica/Titulação:
2.1 Graduação
Curso: Licenciatura Plena em Química, Universidade Federal de Sergipe, UFS.
Ano de conclusão: 2007
2.2 Pós-graduação
2.2.1 Especialização
Curso: Didática e Metodologia no Ensino Superior, Faculdade Amadeus,
FAMA.
Ano de conclusão: 2008
3. Área de Atuação
Química Orgânica, Química dos Produtos Naturais
4. Produção Científica
4.1 Trabalhos em eventos
1. SANTOS, A. D. C.; JESUS, A. M.; ANJOS, C. S.; JESUS, J. R.; SILVA, T.
B.; SANTOS, D. S.; RIBEIRO, S. S; GOMES, W. F.; BEZERRA, D. P.;
COSTA, E. V.; MORAES, V. R. S.; ALVES, P. B.; PESSOA, C.;
MORAES, M. O.; COSTA-LOTUFO, L. V.; CARVALHO, A. A.;
NOGUEIRA, P. C. L. Avaliação da atividade citotóxica de plantas
medicinais do Estado de Sergipe. 33ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira
de Química – ASBQ, 2010.
2. GOMES, W. F.; NOGUEIRA, P. C. L.; SANTOS, A. C. D. Seasonal and
Drying Evaluation on Volatile composition from Leaves. In: II Brazilian
Conference on Natural Products and XXVIII Annual Meeting on
Micromolecular Evolution, 2009.
3. SANTOS, A. C. D.; NOGUEIRA, P. C. L.; GOMES, W. F.; SAMPAIO, T.
S. Estudo Químico de Recursos Naturais Renováveis do Estado de Sergipe:
Nutracêuticos da Mangaba. In: 19º Encontro de Iniciação Científica, 2009.
4. GOMES, W. F.; NOGUEIRA, P. C. L. Estudo Químico de Recursos
Naturais Renováveis do Estado de Sergipe: Hancornia speciosa Gomes. II
Encontro Sergipano de Química, 2009.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS........................................................................................................i
LISTA DE TABELAS....................................................................................................vii
LISTA DE FLUXOGRAMAS.........................................................................................ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.......................................................................x
RESUMO.......................................................................................................................xiii
ABSTRACT...................................................................................................................xiv
INTRODUÇÃO
1. PRODUTOS NATURAIS E SUA BIODIVERSIDADE.......................................2
2. FAMÍLIA APOCYNACEAE.................................................................................5
3. HANCORNIA SPECIOSA GOMES......................................................................12
REVISÃO DA LITERATURA.......................................................................................17
OBJETIVOS
1. GERAL................................................................................................................27
2. ESPECÍFICOS.....................................................................................................27
PARTE 1: ESTUDO DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE HANCORNIA
SPECIOSA GOMES
1. CONSIDERAÇÕES GERAIS..............................................................................29
2. OBJETIVOS.........................................................................................................37
3. METODOLOGIA.................................................................................................39
3.1 OBTENÇÃO DO MATERIAL VEGETAL...................................................38
3.2 EXTRAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL.........................................................38
3.3 IDENTIFICAÇÃO DOS COMPONENTES VOLÁTEIS.............................39
3.4 LEVANTAMENTO DOS DADOS METEOROLÓGICOS..........................42
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA.............................................................................42
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................................43
4.1 ANÁLISE DOS COMPONENTES VOLÁTEIS DAS FOLHAS DE H.
SPECIOSA......................................................................................................43
5. CONCLUSÕES....................................................................................................67
PARTE 2: ESTUDO FITOQUÍMICO DAS FOLHAS E DOS RAMOS DE
HANCORNIA SPECIOSA GOMES
1. CONSIDERAÇÕES GERAIS..............................................................................69
1.1 TRITERPENOS..............................................................................................70
2. OBJETIVOS.........................................................................................................77
3. METODOLOGIA.................................................................................................78
3.1 ISOLAMENTO DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DAS
FOLHAS E DOS RAMOS DE H. SPECIOSA...............................................78
3.1.1 EQUIPAMENTOS.............................................................................78
(a) INFRAVERMELHO....................................................................78
(b) RMN 1H E 13C..............................................................................78
(c) PONTO DE FUSÃO....................................................................79
3.1.2 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DAS FOLHAS E DOS RAMOS..79
3.1.3 ISOLAMENTO DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS DAS
FOLHAS E DOS RAMOS................................................................82
(a) PARTIÇÃO HEXÂNICA DO EXTRATO METANÓLICO
DAS FOLHAS.............................................................................82
(b) EXTRATO HEXÂNICO DOS RAMOS.....................................85
3.1.4 IDENTIFICAÇÃO POR CG/EM DA MISTURA DE
HIDROCARBONETOS PRESENTES NA FRAÇÃO HSF1............87
3.1.5 REAÇÃO DE TRANSESTERIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO POR
CG/EM DOS ÉSTERES 3-β-O-ACIL LUPEOL (HSF7)..................88
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES........................................................................90
4.1 SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DE HANCORNIA SPECIOSA GOMES.................90
4.1.1 ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DA FRAÇÃO FV1.......................90
4.1.2 ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DA FRAÇÃO HSF7...................102
4.1.3 ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DA FRAÇÃO HSF1...................120
5. CONCLUSÕES..................................................................................................134
PARTE 3: TESTES DE ATIVIDADE BIOLÓGICA...................................................135
1. CONSIDERAÇÕES GERAIS..........................................................................136
2. OBJETIVOS.....................................................................................................141
3. METODOLOGIA.............................................................................................142
3.1 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE.................................................................142
3.2 CITOTOXICIDADE....................................................................................143
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................145
5. CONCLUSÕES................................................................................................152
CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................................153
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................156
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estruturas da vincristina e vimblastina............................................................7
Figura 2: Fotos de espécimes de (a) Himatanthus sucuuba e (b) Plumeria rubra..........8
Figura 3: Substâncias isoladas do caule de Laseguea erecta..........................................9
Figura 4: Estruturas de triterpenos isolados do látex de Himatanthus sucuuba
(Apocynaceae).................................................................................................................10
Figura 5: Iridóides isolados do látex de H. sucuuba......................................................11
Figura 6: Foto de um espécime de Hancornia speciosa Gomes....................................12
Figura 7: Fotos (a) da Flor; e (b) dos Frutos de H. speciosa........................................13
Figura 8: Frutos com sementes secas da mangabeira....................................................14
Figura 9: Metabólitos secundários encontrados nas cascas de H. speciosa.................19
Figura 10: Estruturas químicas de proantocianidinas diméricas do tipo B: (1)
epicatequina-(4β→8)-catequina, (2) epicatequina-(4β→6)-catequina, e
proantocianidinas diméricas do tipo A: (3) epicatequina-(2β→7; 4β→8)
epicatequina.....................................................................................................................20
Figura 11: Substâncias isoladas do látex dos frutos de H. speciosa..............................21
Figura 12: Estruturas químicas dos ciclitóis..................................................................23
Figura 13: Possível rota biossintética de terpenóides via ácido mevalônico. (1)
Fosforilação sequencial do álcool primário para o difosfato. (2) ATP facilita a
eliminação. Não há nenhuma evidência de fosforilação da hidroxila terciária.............30
Figura 14: Rota biossintética de formação do Pirofosfato de Geranila........................31
Figura 15: Rotas biossintéticas do LPP e NPP.............................................................31
Figura 16: Possível rota biossintética do óxido de linalol. OPP=Difosfato..................33
Figura 17: Estruturas químicas do óxido de linalol na sua forma furânica e
pirânica...........................................................................................................................34
Figura 18: Rota biossintética do geraniol a partir do GPP..........................................34
Figura 19: Rota biossintética do α-terpineol a partir do LPP......................................35
Figura 20: Estruturas químicas do mentol e mentona..................................................35
i
Figura 21: Técnica da hidrodestilação utilizando aparelhagem do tipo Clevenger....39
Figura 22: Principais compostos identificados na análise de óleo essencial das folhas
de H. speciosa variando-se o tempo de secagem e época de colheita............................44
Figura 23: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM
(coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das folhas frescas e secas do mês de
janeiro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos
citados na Tabela 1..........................................................................................................47
Figura 24: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM
(coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das folhas frescas e secas do mês de
fevereiro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos
citados na Tabela 1..........................................................................................................48
Figura 25: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM
(coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das folhas frescas e secas do mês de
março de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos
citados na Tabela 1..........................................................................................................49
Figura 26: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM
(coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das folhas frescas e secas do mês de
abril de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos
citados na Tabela 1..........................................................................................................50
Figura 27: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM
(coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das folhas frescas e secas do mês de
maio de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos
citados na Tabela 1..........................................................................................................51
Figura 28: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM
(coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das folhas frescas e secas do mês de
junho de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos
citados na Tabela 1..........................................................................................................52
ii
Figura 29: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM
(coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das folhas frescas e secas do mês de
julho de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos
citados na Tabela 2..........................................................................................................53
Figura 30: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM
(coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das folhas frescas e secas do mês de
agosto de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos
citados na Tabela 2..........................................................................................................54
Figura 31: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM
(coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das folhas frescas e secas do mês de
setembro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos
compostos citados na Tabela 2........................................................................................55
Figura 32: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM
(coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das folhas frescas e secas do mês de
outubro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos
citados na Tabela 2..........................................................................................................56
Figura 33: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM
(coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das folhas frescas e secas do mês de
novembro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos
compostos citados na Tabela 2........................................................................................57
Figura 34: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM
(coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das folhas frescas e secas do mês de
dezembro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos
compostos citados na Tabela 2........................................................................................58
Figura 35: Rendimento (%) do óleo essencial das folhas frescas e secas de H.
speciosa...........................................................................................................................60
Figura 36: Dados de precipitação total e média das temperaturas máxima e mínima do
município de São Cristóvão fornecidos pela Empresa de Desenvolvimento
Agropecuário de Sergipe (EMDAGRO) e pelo Sistema de Monitoramento
Agrometeorológico (AGRITEMPO), respectivamente....................................................60
iii
Figura 37: Percentagem de teor de água no solo nos meses de 2009 no município de
São Cristóvão, fornecidos pelo Sistema de Monitoramento Agrometeorológico
(AGRITEMPO)................................................................................................................61
Figura 38: Percentagens relativas do (Z)-3-hexenol nas folhas frescas e secas de H.
speciosa...........................................................................................................................62
Figura 39: Percentagens relativas do geraniol nas folhas frescas e secas de H.
speciosa...........................................................................................................................62
Figura 40: Dendograma representando a relação de dissimilaridade da composição
química das folhas frescas (F) e secas (S) de H. speciosa coletadas durante o ano de
2009.................................................................................................................................64
Figura 41: Dispersão dos percentuais dos constituintes químicos do óleo essencial das
folhas frescas de H. speciosa pelos CP-1 e CP-2............................................................65
Figura 42: Dispersão dos percentuais dos constituintes químicos do óleo essencial das
folhas secas de H. speciosa pelos CP-1 e CP-2..............................................................66
Figura 43: Representação esquemática da biossíntese de triterpenos. E1=Esqualeno-
sintase. NADPH=Nicotinamida adenina dinucleotídeo-P [DEWIK, 2009; CABRAL,
2000]................................................................................................................................72
Figura 44: Estruturas químicas da betulina, ácido betunílico e lupeol.........................75
Figura 45: Esquema de fragmentação do lupeol............................................................76
Figura 46: Reação de metanólise ácida dos ésteres 3-β-O acil lupeol (HSF7).............88
Figura 47: Espectro de absorção na região do infravermelho (IV) (pastilha de KBr) da
fração FV1 isolada da partição hexânica do EMF de H. speciosa................................93
Figura 48: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da subfração FV1 isolada da
partição hexânica do EMF de H. speciosa......................................................................94
Figura 49: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da subfração FV1
isolada da partição hexânica do EMF de H. speciosa....................................................95
Figura 50: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da subfração FV1
isolada da partição hexânica do EMF de H. speciosa....................................................96
iv
Figura 51: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da subfração FV1
isolada da partição hexânica do EMF de H. speciosa....................................................97
Figura 52: Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da fração FV1 isolada do EHR de
H. speciosa.......................................................................................................................98
Figura 53: Ampliação do espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da fração FV1
isolada do EHR de H. speciosa.......................................................................................99
Figura 54: Ampliação do espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da fração FV1
isolada do EHR de H. speciosa.....................................................................................100
Figura 55: Estruturas de triterpenos identificados da partição hexânica do extrato
metanólico das folhas de H. speciosa............................................................................101
Figura 56: Espectro de absorção na região do infravermelho (IV) (pastilha de KBr) da
fração HSF7..................................................................................................................105
Figura 57: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF7 isolada do EHR
de H. speciosa................................................................................................................106
Figura 58: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF7
isolada do EHR de H. speciosa.....................................................................................107
Figura 59: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF7
isolada do EHR de H. speciosa.....................................................................................108
Figura 60: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF7
isolada do EHR de H. speciosa.....................................................................................109
Figura 61: Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da fração HSF7 isolada do EHR
de H. speciosa................................................................................................................110
Figura 62: Rearranjo de McLafferty e ésteres metílicos..............................................111
Figura 63: Cromatograma de íons reconstituídos (m/z 74, m/z 103, m/z 426) (CG/EM)
dos ésteres metílicos obtidos após hidrólise da mistura de ésteres 3-β-acil do lupeol. A
numeração dos picos corresponde à tabela 05.............................................................112
Figura 64: Espectro de massas do tetradecanoato de metila (C15H30O2)....................113
Figura 65: Espectro de massas do hexadecanoato de metila (C17H34O2)....................113
Figura 66: Espectro de massas do 3-hidroxihexadecanoato de metila (C17H34O3).....114
Figura 67: Espectro de massas do octadecanoato de metila (C19H38O2).....................114
v
Figura 68: Espectro de massas do 3-hidroxioctadecanoato de metila (C19H38O3)......115
Figura 69: Espectro de massas do 3-hidroxiiocosanoato de metila (C21H42O3)..........115
Figura 70: Espectro de massas do docosanoato de metila (C23H46O2)........................116
Figura 71: Espectro de massas do 3-hidroxidocosanoato de metila (C23H46O3).........116
Figura 72: Espectro de massas do 3-hidroxidocosanoato de metila (C25H50O2).........117
Figura 73: Estruturas dos ésteres 3-β-O-acil lupeol isolados da fração HSF7 do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa..................................................................118
Figura 74: Principais compostos isolados de Parahancornia amapa.........................119
Figura 75: Espectro de absorção na região do infravermelho (IV) (pastilha de KBr) da
fração HSF1..................................................................................................................121
Figura 76: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF1 isolada do EHR
de H. speciosa................................................................................................................122
Figura 77: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF1
isolada do EHR de H. speciosa.....................................................................................123
Figura 78: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 500 MHz) da fração HSF1
isolada do EHR de H. speciosa.....................................................................................124
Figura 79: Cromatograma de íons totais da fração HSF1 isolada do extrato hexânico
de H. speciosa................................................................................................................125
Figura 80: Espectro de massas da estrutura 1 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa..................................................................127
Figura 81: Espectro de massas da estrutura 2 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa..................................................................127
Figura 82: Espectro de massas da estrutura 3 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa..................................................................128
Figura 83: Espectro de massas da estrutura 4 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa..................................................................128
Figura 84: Espectro de massas da estrutura 5 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa..................................................................129
vi
Figura 85: Espectro de massas da estrutura 6 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa..................................................................129
Figura 86: Espectro de massas da estrutura 7 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa..................................................................130
Figura 87: Espectro de massas da estrutura 8 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa..................................................................130
Figura 88: Espectro de massas da estrutura 9 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa..................................................................131
Figura 89: Espectro de massas da estrutura 10 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa..................................................................131
Figura 90: Espectro de massas da estrutura 11 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa..................................................................132
Figura 91: Espectro de massas da estrutura 12 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa..................................................................132
Figura 92: Estruturas das substâncias encontradas na fração HSF1 isolada do
EHR...............................................................................................................................133
Figura 93: Estruturas de substâncias sequestradoras de radicais livres.....................137
Figura 94: Reação de redução do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)..........138
Figura 95: Estruturas do taxol isolado da Taxus brevifolia (Taxaceae) e da
lasiodiplodina isolada da Euphorbia splendus (Euphorbiaceae).................................140
Figura 96: Estrutura química do pirogalol..................................................................142
Figura 97: Capacidade de sequestro de DPPH do óleo essencial das folhas frescas e
secas de H. speciosa......................................................................................................146
Figura 98: Capacidade de sequestro de DPPH dos extratos e partições de H.
speciosa.........................................................................................................................149
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Composição percentual relativa dos constituintes químicos encontrados nos
óleos essenciais das folhas de H. speciosa variando-se o tempo de secagem e época de
colheita nos meses de janeiro a junho/2009, através de CG/DIC...................................45
Tabela 2: Composição percentual relativa dos constituintes químicos encontrados nos
óleos essenciais das folhas de H. speciosa variando-se o tempo de secagem e época de
colheita nos meses de julho a dezembro/2009, através de CG/DIC...............................46
Tabela 3: Massas obtidas das partições dos respectivos extratos.................................81
Tabela 4: Frações reunidas da partição hexânica do EMF...........................................82
Tabela 5: Valores percentuais do gradiente utilizado na eluição da coluna.................83
Tabela 6: Frações reunidas da partição hexânica do EMF...........................................85
Tabela 7: Valores percentuais do gradiente utilizado na eluição da coluna.................86
Tabela 8: Comparação dos dados de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) e 13C (CDCl3, 100
MHz) das substâncias isoladas da fração FV1 com os dados obtidos na
literatura..........................................................................................................................91
Tabela 9: Comparação dos dados de RMN 1H (CDCl3, 500 MHz) e 13C (CDCl3, 100
MHz) das substâncias isoladas da fração HSF2 com os dados obtidos na
literatura........................................................................................................................103
Tabela 10: Substâncias identificadas (ésteres metílicos) após a reação de transesterificação da fração HSF2 isolada do EMR de H. speciosa............................112 Tabela 11: Principais compostos identificados da fração HSF1 isolados do EMR de H.
speciosa.........................................................................................................................126
Tabela 12: Valores percentuais de atividade sequestradora de radicais livres do óleo
essencial das folhas frescas e secas de H. speciosa......................................................146
Tabela 13: Valores percentuais de atividade sequestradora de radicais livres do BHT, dos extratos e suas respectivas partições......................................................................148 Tabela 14: Valores de CI50 do BHT, dos extratos e suas partições.............................148
Tabela 15: Valores percentuais de CI (capacidade inibitória) dos extratos de H.
speciosa frente aos agentes tumorais............................................................................150
viii
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1: Mapa filogenético da família Apocynaceae............................................6
Fluxograma 2: Procedimento para obtenção do óleo essencial de H. speciosa...........41
Fluxograma 3: Metodologia utilizada por SAMPAIO (2008) para obtenção dos
extratos metanólico e hexânico das folhas e dos ramos de H. speciosa.........................80
Fluxograma 4: Procedimento utilizado na obtenção dos extratos particionados das folhas e ramos de H. speciosa.........................................................................................81 Fluxograma 5: Processo de purificação da subfração FV1 da partição hexânica do
EMF de H. speciosa.........................................................................................................84
Fluxograma 6: Processo de purificação das frações HSF1 e HSF7 do EHR de H.
speciosa...........................................................................................................................87
ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
%AA Percentagem de Atividade Antioxidante
ACE Enzima Conversora de Angiotensina (Do inglês “Angiotensin Converting
Enzyme”)
ACP Análise dos Componentes Principais
ADP Difosfato de adenosina (Do inglês “Adenosine Diphosphate”)
ATCC Do inglês “American type culture collection”
ATP Trifosfato de adenosina (Do inglês “Adenosine Triphosphate”)
BHT Hidroxitolueno butilado (Do inglês “Butylated Hydroxytoluene”)
CA Do inglês “Cluster analysis”
CC Coluna cromatográfica
CCDA Cromatografia em Camada Delgada Analítica
CI 50 Concentração inibitória média capaz de provocar 50% do efeito máximo
CG/EM Cromatografia Gasosa acoplada a um Espectrômetro de Massas
CG/DIC Cromatografia Gasosa acoplada a um Detector de Ionização de Chamas
DMAPP Pirofosfato de dimetilalila (Do inglês “Dimethylallyl Pyrophosphate)
DMSO Dimetilsulfóxido
DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (Do inglês “2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl”)
EHF Extrato hexânico das folhas
EHR Extrato hexânico dos ramos
EMF Extrato metanólico das folhas
EMR Extrato metanólico dos ramos
eV Elétron volts
FPP Pirofosfato de farnesila (Do inglês “Farnesyl Pyrophosphate”)
GPP Pirofosfato de geranila (Do inglês “Geranyl Pyrophosphate”)
HCT-8 Célula tumoral humana (Carcinoma de cólon)
Hz Hertz
x
IPP Pirofosfato de isopentenila (Do inglês “Isopentenyl Pyrophosphate”)
IR cal Índice de retenção calculado
IR lit Índice de retenção da literatura
ISO Do inglês “International standard organization”
IV Infravermelho
LPP Difosfato de linalila (Do inglês “Linalyl Diphosphate”)
MDA-MB-435 Célula tumoral humana (Melanoma)
MTT Brometo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólico (Do inglês “(3-
(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide”)
m/z Razão massa/carga
NADPH Fosfato de Nicotinamida adenina dinucleotídeo (Do inglês “Nicotinamide
Adenine Dinucleotide Phosphate”)
NCI Do inglês “National Cancer Institute”
NF-kB Fator de transcrição nuclear kappa B (Do inglês “Nuclear Factor kappa B”)
NPP Difosfato de nerila (Do inglês “Neryl Diphosphate”)
OE Óleo essencial
OMS Organização Mundial de Saúde
PAcEMF Partição Acetato de etila do extrato metanólico das folhas
PAcEMR Partição Acetato de etila do extrato metanólico dos ramos
PBEMF Partição butanólica do extrato metanólico das folhas
PBEMR Partição butanólica do extrato metanólico dos ramos
PDEMF Partição diclorometano do extrato metanólico das folhas
PDEMR Partição diclorometano do extrato metanólico dos ramos
P. F. Ponto de fusão
PHEMF Partição hexânica do extrato metanólico das folhas
PPM Partes por milhão
RDA Retro Diels-Alder
Rf Fator de retenção (do inglês “Retention factor”)
RMN 13C Ressonância magnética nuclear de carbono treze
xi
RMN 1H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
SF-295 Célula tumoral humana (Glioblastoma)
TIC Cromatograma de Íons Totais (do inglês“Total Ion Chromatogram”)
UV Ultravioleta
xii
RESUMO
O presente trabalho descreve o estudo químico dos recursos naturais renováveis do
estado de Sergipe, onde foram analisadas as folhas e ramos da mangabeira, Hancornia
speciosa Gomes (Apocynaceae). Na primeira parte do trabalho foi investigada a
composição química dos voláteis das folhas variando-se o tempo de secagem e a época
de colheita. As análises através de CG/EM e CG/DIC permitiram verificar que, com a
secagem das folhas, houve um aumento significativo nas percentagens relativas de
alguns monoterpenos oxigenados como α-terpineol (0,08±0,20 - 3,89±1,78 nas folhas
frescas para 0,93±0,03 - 5,21±0,65 nas folhas secas), linalol (2,95±1,45 - 12,46±2,24
nas folhas frescas para 2,78±1,08 - 17,16±2,83 nas folhas secas), geraniol (1,04±0,34 -
12,80±1,23 nas folhas frescas para 25,67±6,45- 46,56±4,67 nas folhas secas), assim
como um decréscimo nas percentagens de alcoóis como (Z)-3-hexenol (46,81±3,27 -
78,45±7,75 nas folhas frescas para 10,70±4,87 - 19,15±4,28 nas folhas secas) e 1-
hexanol (1,65±0,33 - 10,15±0,80 nas folhas frescas para 0,07±0,05 - 4,59±1,55 nas
folhas secas). Nos meses com valores de índice de pluviometria e temperatura elevados
observou-se um maior rendimento de óleo essencial de H. speciosa. Na segunda parte
do trabalho, o estudo fitoquímico das folhas e dos ramos desta espécie permitiu a
identificação de 3 misturas. Destas uma mistura de triterpenos contendo α-amirina, β-
amirina e lupeol foi identificada da partição hexânica do extrato metanólico das folhas,
enquanto uma mistura contendo 9 ésteres 3-β-O-acil lupeol e uma outra mistura
contendo 12 n-alcanos foram identificadas do extrato hexânico dos ramos. A
determinação estrutural das substâncias foi baseada na análise dos dados
espectroscópicos obtidos. Na terceira parte do trabalho, foram realizados testes de
atividade antioxidante com os óleos essenciais das folhas frescas e secas, e com o
extrato metanólico das folhas e dos ramos e suas respectivas partições, onde foi
observada a boa capacidade de sequestrar radicais livres da partição butanólica do
extrato metanólico das folhas. Além da investigação da citotoxicidade dos extratos
hexânicos e metanólicos das folhas e dos ramos frente às linhagens de células tumorais
MDA-MB435 (mama - humano) e SF-295 (glioblastoma - humano) e HCT-8 (colon),
onde não foi observado um efeito inibitório.
Palavras-chave: Apocynaceae, Hancornia speciosa Gomes; compostos voláteis;
triterpenos; atividade antioxidante, citotoxicidade.
xiii
ABSTRACT
This work describes the chemical study of renewable natural resources of the State of
Sergipe, Brazil, in that we analyzed the leaves and branches of mangabeira, Hancornia
speciosa Gomes (Apocynaceae).This work is divided into 3 chapters. In the first part of
the research was investigated the volatile chemical composition from leaves varying the
drying time and harvest time. Analysis by GC/MS and GC/FID showed that there was a
significant increase in the content of some oxygenated monoterpenes according to the
drying of leaves, such as α-terpineol (0,08±0,20 - 3,89±1,78 in fresh leaves to 0,93±0,03
- 5,21±0,65 in dried leaves), linalool (2,95±1,45 - 12,46±2,24 in fresh leaves to
2,78±1,08 - 17,16±2,83 in dried leaves), geraniol (1,04±0,34 - 12,80±1,23 in fresh
leaves to 25,67±6,45- 46,56±4,67 in dried leaves), as well and a decrease in the relative
percentage of alcohols such as (Z)-3-hexenol (46,81±3,27 - 78,45±7,75 in fresh leaves
to 10,70±4,87 - 19,15±4,28 in dried leaves) and 1-hexanol (1,65±0,33 - 10,15±0,80 in
fresh leaves to 0,07±0,05 - 4,59±1,55 in dried leaves).In the months with higher rainfall
and temperature we observed a higher yield of essential oils from leaves of H. speciosa.
In the second part of the work, the phytochemical study of the leaves and branches of
this species allowed the isolation of 3 mixtures. Those containing a mixture of
triterpenes α-amyrin, β-amirin and lupeol were isolated from the hexane partition of
methanolic extract of the leaves, while a mixture of 9 3-β-O-acyl lupeol esters and
another mixture of n-alkanes were isolated from hexane extract of the
branches.Structure determination of the isolated compounds was based on analysis of
spectroscopic methods. In the third part, we evaluated the antioxidant activity of
essential oils from fresh and dried leaves, and the methanol extract of leaves and
branches and their partitioned extracts, which was seen to goodability to scavenge free
radicals butanol partition of the mathanol extract of leaves. We also investigate the
cytotoxic activity of hexane and methanol extracts of leaves and branches against cancer
cell lines MDA-MB-435 (melanoma) and SF-295 (brain) and HCT-8 (human colon
carcinoma), which was not observed an inhibitory effect.
Keywords: Apocynaceae; Hancornia speciosa Gomes; volatile compounds; triterpenes,
antioxidant activity, citotoxicity.
xiv
P á g i n a | 1
INTRODUÇÃO
P á g i n a | 2
INTRODUÇÃO
1. PRODUTOS NATURAIS E SUA BIODIVERSIDADE
Nos últimos anos, vem sendo observado um grande interesse no isolamento de
compostos bioativos de plantas, principalmente pela dificuldade de produção e
comercialização de medicamentos úteis na forma sintética além da possibilidade de
serem utilizados como protótipos na síntese de compostos mais eficazes e/ou menos
tóxicos [HOSTETTMANN et al., 2003]. As plantas, fungos, insetos, organismos
marinhos e bactérias são fontes importantes de substâncias biologicamente ativas, sendo
que a maioria dos fármacos em uso clínico ou são de origem natural ou foram
desenvolvidos por síntese química planejada a partir de produtos naturais (metabólitos
secundários). Estes por sua vez são micromoléculas produzidas por um organismo vivo,
mas que não são primordiais para a sua sobrevivência, ao contrário das macromoléculas
(proteínas, ácidos nucléicos e polissacarídeos) que compõem a base de um organismo
[CANNELL, 2008].
Nesse contexto, as plantas produzem centenas de micromoléculas para a sua
defesa, regulação e adaptação, sendo, portanto, biologicamente ativas. Muitas
substâncias produzidas por plantas possuem atividade contra insetos, fungos, bactérias,
patógenos em geral, como uma forma de defesa principalmente nos ambientes tropicais
e equatoriais onde a biodiversidade de microorganismos e insetos é extensa [SANTOS,
2005].
Muitos metabólitos secundários se notabilizaram como matérias-primas valiosas
para a produção de inúmeros medicamentos comprovando que a parceria entre
especialistas na área medicinal e químicos de produtos naturais é estratégica para a
descoberta de fármacos inovadores [CANNELL, 2008]. Sendo assim, muitas pesquisas
estão sendo desenvolvidas com espécies da flora brasileira na busca por novas
substâncias com atividades biológicas, contando com o apoio do NCI (Instituto
Nacional do Câncer - EUA), OMS (Organização Mundial da Saúde) e o Ministério da
Saúde, onde essa parceria torna-se importante no momento atual, quando a idéia de
P á g i n a | 3
modificação genética de plantas para a produção de substâncias de interesse necessita de
equipamentos modernos, novas técnicas e ensaios biológicos práticos, eficientes e de
baixo custo.
A importância dos produtos naturais, entretanto, vai além de sua utilização na
medicina e alcança vastos campos de aplicação, tornando-se importantes fontes de
comercialização agregando valores econômicos cada vez maiores aos produtos finais
que os contém (nutracêuticos, cosmecêuticos, agrocêuticos) [SANTOS, 2005]. Os
modernos avanços das técnicas cromatográficas e espectroscópicas podem ser
considerados uns dos principais responsáveis por esta situação, pois têm fornecido
ferramentas para a purificação e análise estrutural que atingiram níveis extraordinários
de sensibilidade e sofisticação, fazendo com que o estudo da bioatividade de diversos
metabólitos secundários se tornasse importante [COLEGATE et al., 2008].
O Brasil é considerado o país com maior biodiversidade no planeta, com ca.
55.000 espécies nativas distribuídas nos seis biomas. A sua biodiversidade é
considerada uma fonte de substâncias biologicamente ativas e sua preservação é
fundamental tanto pelo valor intrínseco dessa imensa riqueza biológica como pelo seu
enorme potencial como fonte de novos fármacos, a qual vem despertando a cobiça de
laboratórios de pesquisa das empresas farmacêuticas localizadas, em sua ampla maioria,
ao norte do Equador. O país possui cerca de 10% de todos os organismos descritos e
aproximadamente 22% de todas as Angiospermas, distribuídas principalmente nas
regiões Amazônica, Mata Atlântica e Cerrado, e é detentor de uma flora riquíssima,
considerada uma fonte imensa de metabólitos secundários, que podem ser utilizados
para diferentes aplicações [BARREIRO & BOLZANI, 2009].
O nordeste brasileiro é ocupado em sua maioria por uma vegetação típica de
semi-árido, caatinga, possuindo cerca de 600 espécies de plantas registradas, onde 180
são endêmicas, com várias espécies reconhecidas pela população local pelo seu uso
como medicamento natural e alternativo [Da SILVA, 2003]. O estado de Sergipe é
caracterizado não só por vegetação típica de caatinga, mas também por remanescentes
de mata atlântica (incluindo os mangues e as restingas), com muitos elementos do
cerrado do Brasil Central e vegetação de campos rupestres ainda pouco explicada.
Nestes ambientes, encontram-se plantas de reconhecida atividade biológica pela
P á g i n a | 4
população local, bem como espécies de ocorrência endêmica, algumas ainda
desconhecidas pela ciência, tanto do ponto de vista botânico, químico, farmacológico e
econômico. Esses aspectos, aliados à degradação dos ecossistemas, estimulam pesquisas
em produtos naturais e tornam urgente o estabelecimento de programas para promover o
levantamento desta riqueza nativa, na busca de contribuir efetivamente para o
desenvolvimento auto-sustentável da região, oferecendo ao estado uma alternativa de
elevado potencial econômico [DRUMOND et al., 2000].
P á g i n a | 5
2. FAMILIA APOCYNACEAE
A família Apocynaceae foi estabelecida por Adanson em 1768 sob o nome de
Apocyna, a qual englobava Apocynaceae e Asclepiadaceae como uma única família.
Posteriormente Jussieu (1789) modificou o termo “Apocyna” para “Apocineae”, sem
alterar a sua circunscrição e, a partir daí, vem sendo citado como autor da família na
maioria dos trabalhos. Atualmente, com o avanço da biologia molecular, uma nova
fonte de dados foi disponibilizada para os taxonomistas a fim de verificar a consistência
das classificações tradicionais propostas para as diversas famílias de Angiospermas. O
primeiro estudo filogenético para Apocynaceae foi realizado por SENNBLAD &
BREMER (1996) que, ao estudarem gêneros de Apocynaceae e Asclepiadaceae,
verificaram uma proximidade filogenética entre as famílias, demonstrando a
artificialidade das classificações propostas até o momento [AGUIAR, 2009]. Essa
proximidade taxonômica deve-se a presença dos vasos laticíferos e de glicosídeos
cardiotônicos, os quais não são encontrados nas outras famílias dessa ordem [KOCH,
1994].
Com base nas novas propostas de filogenia entre Apocynaceae e Asclepiadaceae,
ENDRESS & BRUYNS, 2000 corroboraram com a união das duas famílias e sugeriram
a divisão da família em cinco subfamílias: Rauvolfioideae Kostel, Apocynoideae
Burnett, Periplocoideae R. Br. ex Endl., Secamonoideae Endl. e Asclepiadoideae R. Br.
ex Burnett. Sendo que a subfamília Rauvolfioideaeestá subdividida em 9 tribos:
Alstonieae, Alyxieae, Carisseae, Hunterieae, Melodineae, Plumerieae,
Tabernaemontaneae, Vinceae e Willughbeieae.A tribo Willughbeieae está representada
por 18 gêneros: Ancylobotrys, Bousigonia, Chamaeclitandra, Clitandra, Couma,
Cyclocotyla, Cylindropsis, Dictyophleba, Hancornia, Lacmellea, Landolphia,
Leuconotis, Orthopichonia, Pacouria, Parahancornia, Saba, Vahadenia e Willughbeia
(Fluxograma 1; p.6) [SIMÕES, 2000].
P á g i n a | 6
SUBFAMÍLIA TRIBO GÊNERO
Fluxograma 1: Mapa filogenético da família Apocynaceae.
APOCYNACEAE
APOCYNOIDEAE
RAUVOLFIOIDEAE
ALSTONIEAE ANCYLOBOTRYS
BOUSIGONIA
CHAMAECLITANDRA
CLITANDRA
COUMA
CYCLOCOTYLA
CYLINDROPSIS
DICTYOPHLEBA
LACMELLEA
WILLUGHBEIEAE
HUNTERIEAE
CARISSEAE
ALYXIEAE
PERIPLOCOIDEAE
HANCORNIA
WILLIGHBEIA
VAHADENIA
SABA
PARAHANCORNIA
PACOURIA
ORTHOPICHONIA
LEUCONOTIS
LANDOLPHIA
ASCLEPIADOIDEAE
SECAMONOIDEAE
VINCEAE
TABERNAEMONTANEAE
PLUMERIEAE
MELODINEAE
FAMÍLIA
Plantas da família Apocynaceae estão incluídas fil
Gentiales e subclasse Asteridae
evoluídas e são caracterizadas normalmente pela presença de látex. Essa família contém
aproximadamente 5100 espécies
predominantemente nos trópicos e subtrópicos e são menos
temperadas. Na flora brasileira são catalogadas como
espécies distribuídas em 41 gêneros, sendo 32 destes encontrados apenas na Amazônia
[PEREIRA et al., 2007]. As plantas pertencentes a esta família são conhecidas pelo seu
potencial como medicamento natural e alternativo
alcalóides em várias espécies
medicina popular [RAHMAN
(Figura 1; p.7), isoladas de
câncer [PHILLIPSON, 2001
(Figura 2a; p.8), popularmente conhecida como
como fungicida, antianêmico,
decocções feitas com cascas de
usadas como purgativo, bactericida, antitumora
[BARRETO et al., 2007].
Vincristina Vimblastina
Figura 1: Estruturas da vincristina e v
P á g i n a |
Apocynaceae estão incluídas filogeneticamente na ordem
Asteridae, sendo consideradas como espécies dicoti
evoluídas e são caracterizadas normalmente pela presença de látex. Essa família contém
espécies distribuídas em 450 gêneros, sendo encontradas
predominantemente nos trópicos e subtrópicos e são menos frequentes em regiões
temperadas. Na flora brasileira são catalogadas como Apocynaceae
em 41 gêneros, sendo 32 destes encontrados apenas na Amazônia
As plantas pertencentes a esta família são conhecidas pelo seu
como medicamento natural e alternativo, sendo caracterizada pela presença de
pécies, sendo que algumas delas com ampla utilização na
RAHMAN et al., 2004]. Como exemplo a vincristina
isoladas de Catharanthus roseus, que são usadas no tratamento de
PHILLIPSON, 2001], além do látex de Himatanthus sucuuba
popularmente conhecida como sucuba, sucuuba e janaguba, utilizada
como fungicida, antianêmico, antiinflamatório e no tratamento de câncer
decocções feitas com cascas de Plumeria rubra (Apocynaceae) (Figura
purgativo, bactericida, antitumoral e no tratamento de doenças venéreas
Vincristina Vimblastina
: Estruturas da vincristina e vimblastina.
P á g i n a | 7
ogeneticamente na ordem
sendo consideradas como espécies dicotiledôneas bem
evoluídas e são caracterizadas normalmente pela presença de látex. Essa família contém
sendo encontradas
entes em regiões
mais de 400
em 41 gêneros, sendo 32 destes encontrados apenas na Amazônia
As plantas pertencentes a esta família são conhecidas pelo seu
, sendo caracterizada pela presença de
algumas delas com ampla utilização na
incristina e vimblastina
que são usadas no tratamento de
(Apocynaceae)
sucuba, sucuuba e janaguba, utilizada
câncer. Infusões e
Figura 2b; p.8) são
tratamento de doenças venéreas
P á g i n a | 8
(a) (b)
Himatanthus sucuuba Plumeria rubra
Figura 2: Fotos de espécimes de (a) Himatanthus sucuuba e (b) Plumeria rubra
[FINDMEACURE].
O estudo fitoquímico de espécies representantes dos gêneros desta família pode
conduzir à descoberta de novas fontes de substâncias naturais ativas uma vez que são
frequentemente citadas em trabalhos de revisão sobre plantas com atividades
farmacológicas e medicinais [De CARVALHO et al., 2006]. Neste sentido, há vários
trabalhos publicados sobre o estudo fitoquímico de espécies da família Apocynaceae,
onde podemos citar estudos realizados por De CARVALHO et al. (2006) que isolaram,
do caule de Laseguea erecta (Apocynaceae), substâncias tais como: lupeol (1), α-L-
tevetosil-digitoxigenina (2), escopoletina (3) e pinoresinol (4) (Figura 3; p.9). Por outro
lado, existem poucos trabalhos publicados que tratam do estudo químico do látex desta
família. De MIRANDA et al. (2000) realizaram um estudo químico e biológico do látex
de H. sucuuba, de onde foram isolados alguns triterpenos, tais como: acetato de
lupeloíla (5), α-amirina (6) e cinamato de lupeoíla (7) (Figura 4; p.10), sendo este
último o que apresentou atividade antiinflamatória. Já BARRETO et al. (2007) isolaram
P á g i n a | 9
alguns iridóides do látex de H. sucuuba, tais como: Ácido 15-desmetilisoplumierídeo
(8), Ácido desmetilplumierídeo (9), plumierídeo (10), isoplumierídeo (11) (Figura 5;
p.11).
HO
H
H
H
O
O
OH
O
O
MeO
HO
OH
O O
MeO
HO
OMe
OH
O
OH
H
HHMeO
HO
(1) (2)
(3) (4)
Figura 3: Substâncias isoladas do caule de Laseguea erecta.
P á g i n a | 1 0
O
HO
H3CH
HH
HO
H
H
H
(5) (6)
O
H
H
O
HH
(7)
Figura 4: Estruturas de triterpenos isolados do látex de Himatanthus sucuuba
(Apocynaceae).
P á g i n a | 1 1
O
COOR
OO
O
OH
O
OH
OHOH
HO
O
COOR
OO
OOH
O
OH
OHOH
HO
(8) R=H (9) R=H
(11) R=CH3 (10) R=CH3
Figura 5: Iridóides isolados do látex de H. sucuuba.
P á g i n a | 1 2
3. HANCORNIA SPECIOSA GOMES
A mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) (Figura 6; p.12) pertence à classe
Dicotyledoneae, ordem Gentianales, família Apocynaceae, subfamília Rauvolfioideae,
tribo Willughbeieae, gênero Hancornia contendo apenas esta espécie, a qual foi descrita
por Gomes em 1812 [LEDERMAN et al., 2000]. São aceitas seis variedades botânicas
de H. speciosa: H. speciosa variedade speciosa, H. speciosa variedade maximilliani A.
DC., H. speciosa variedade lundii A. DC., H. speciosa variedade cuyabensis Malme, H.
speciosa variedade gardneri A. DC. Muell. Arg. e a H. speciosa variedade pubescens
(Nees. et Martius) Muell. Arg. Essas variedades são diferenciadas por características
morfológicas, principalmente relacionadas à folha e à flor. A variedade pubescens e
gardneri diferenciam-se pela primeira possuir folhas pubescentes, e a segunda, folhas
glabras [RIZZO & FERREIRA, 1990].
Figura 6: Foto de um espécime de Hancornia speciosa Gomes [Prof. Dr. Paulo César
de Lima Nogueira].
P á g i n a | 1 3
H. speciosa é uma árvore encontrada naturalmente no Brasil e sua distribuição
ocorre com maior abundância nas áreas de tabuleiros e baixadas litorâneas do Nordeste,
sendo o estado de Sergipe um dos maiores produtores nacionais. Esta espécie é uma
planta arbórea de porte médio, possuindo de 2 a 10 m de altura, podendo chegar até 15
m, dotada de copa irregular, tronco tortuoso, bastante ramificado e áspero; ramos lisos e
avermelhados, exsudando látex em toda a sua extensão [SILVA JUNIOR, 2004]. A
casca da árvore é escura e fendilhada; suas folhas são opostas, simples, pecioladas,
inteiras, oblongas, agudas, coriáceas, brilhantes e glabras; sua inflorescência possui de 1
a 7 flores perfumadas e de coloração branca (Figura 7a; p.13). Seus frutos (Figura 7b;
p.13) do tipo baga são elipsóides ou arredondados, com 2,0 a 6,0 cm de comprimento,
exocarpo amarelo, com manchas avermelhadas, polpa carnoso-viscosa, ácida, bastante
doce com aroma bastante agradável e cheio de suco leitoso quando verdes, contendo
geralmente de 2 a 15 sementes discóides, com 7 a 8 mm de diâmetro, castanho claras,
delgadas e rugosas [SOUSA et al., 2005].
(a) (b)
Figura 7: Fotos (a) da Flor; e (b) dos Frutos de H. speciosa [SAMPAIO, 2008].
As sementes da mangabeira (Figura 8; p.14) são consideradas recalcitrantes, isto
é, não suportam ressecamento, perdendo rapidamente o poder germinativo assim que
são retiradas do fruto; portanto, sua semeadura deverá ser feita no máximo em quatro
P á g i n a | 1 4
dias. Procedendo-se assim, pode-se obter aproximadamente 90% de germinação
[VIEIRA NETO, 2002]. A semente da mangabeira é o único meio que se tem usado
para a obtenção de mudas, devendo-se lavar bem as sementes para remover a polpa,
pois ela tem ação inibidora sobre a germinação e o poder germinativo das sementes
reduz rapidamente entre o quarto e oitavo dia após a extração das mesmas [SILVA,
2010].
A escolha do substrato e da temperatura adequada para o teste de germinação da
maioria das espécies nativas são requisitos ainda desconhecidos, resultando em diversos
trabalhos que tratam da interação do substrato e da temperatura para condução de testes
de germinação e vigor de sementes de espécies frutíferas e florestais. Já SOARES et al.,
2007, utilizando os substratos areia, vermiculita e areia mais vermiculita, na germinação
de sementes de mangaba observaram que as sementes apresentaram elevada taxa de
germinação, independente do tipo de substrato utilizado.
Figura 8: Frutos com sementes secas da mangabeira [SAMPAIO, 2008].
O potencial para o aproveitamento da mangabeira é bastante variado, entretanto,
apenas os frutos apresentam um valor comercial significativo. No Nordeste, é uma das
mais requisitadas produtoras de matéria-prima para a indústria entre as frutas nativas
P á g i n a | 1 5
dessa região, devido aos excelentes aroma e sabor dos seus frutos, sendo utilizada,
sobretudo, para a fabricação de sucos e polpas congeladas. Além dessas formas, o fruto
da mangabeira ainda é consumido in natura e utilizado para a fabricação de doces,
geléias, licores, xaropes, vinhos e vinagres [LEDERMAN et al., 2000].
Nas indústrias de polpa de Sergipe, verifica-se que a mangaba é a mais vendida
dentre os mais de 20 sabores geralmente produzidos, sendo responsável por
aproximadamente 25% das vendas. A polpa de mangaba, juntamente com as de cajá e
graviola são os carros-chefes, impulsionando a venda dos demais sabores. Para não
deixar faltar esse precioso produto na entressafra, há indústrias que possuem câmaras
frias exclusivamente para o armazenamento da mangaba. A mesma medida pode ser
verificada nas sorveterias e lanchonetes, onde o sorvete e o suco desta fruta são os mais
consumidos [ALVES et al., 2003].
A mangaba é uma fruta rica em diversos elementos e em sua composição
encontramos as vitaminas A, B1, B2 e C, além de ferro, fósforo, cálcio e proteína. Ela é
constituída de polpa (77%), casca (11%) e semente (12%). No entanto, apenas a polpa
assume posição de destaque no aspecto comercial, por apresentar um bom valor
nutritivo, com teor protéico (0,7 g/100 g de polpa) superior ao da maioria das espécies
frutíferas. O seu valor energético, em cada 100 g de fruta, é de 43 calorias [SILVA
JUNIOR, 2004; SOUSA et al., 2005].
O número de estudos sobre alimentos que possuem benefícios potenciais para a
saúde tem apresentado um acelerado crescimento em todo o mundo. Pesquisas recentes
têm confirmado o que naturalistas acreditam há muito tempo: existem ingredientes
específicos nos alimentos que apresentam importantes atividades biológicas no
organismo, além do aspecto nutricional [DRUMOND et al., 2000]. Desta forma, muitas
frutas apresentam substâncias com ação medicinal, e seu uso como medicamento é um
hábito utilizado pela humanidade há mais de 5.000 anos [CRAVEIRO & CRAVEIRO,
2003]. Na medicina popular, H. speciosa é usada de várias formas: o decocto da raiz,
junto com o “quiabinho” (Manihot tripartita), para tratar a hipertensão; a infusão das
folhas para cólica menstrual e contra gripe [ALMEIDA et al., 1998]. A casca da árvore
possui propriedades adstringentes, cura doenças internas, protege os pulmões, fígado e
também serve para tratamentos de perda de peso. O suco leitoso do fruto e o látex do
P á g i n a | 1 6
caule são usados como medicamento caseiro para tratamento de tuberculose, úlcera,
dermatose, verrugas, hematomas, inflamações diversas, diarréia e herpes [FRANCO et
al., 2008].
Valendo-se da importância terapêutica da mangabeira, faz-se necessária uma
maior atenção com relação a sua produção. Uma das principais preocupações dos
produtores de frutas da região nordeste do Brasil é a agregação de valor às fruteiras
regionais, as quais são geralmente produzidas em regime extrativista. No entanto, o
potencial deste mercado cresce a cada dia devido à busca de diversificação da oferta, em
virtude do interesse cada vez maior dos consumidores [ALVES et al., 2003]. Desta
forma, acredita-se que o conhecimento químico e bioquímico dos metabólitos
secundários presentes nas partes renováveis da mangabeira (folhas e ramos) e seu
emprego como insumo para as indústrias farmacêutica, de alimentos e/ou de cosméticos
poderia ser uma alternativa para agregar valor ao fruto, melhorar a renda dos produtores
da região e contribuir para diminuição da devastação desta espécie.
P á g i n a | 1 7
REVISÃO DA
LITERATURA
P á g i n a | 1 8
REVISÃO DA LITERATURA
Em nosso levantamento bibliográfico, utilizando-se os “sites” de busca Web of
Science e Chemical Abstracts através do SciFinder, bem como o Banco de Teses da
CAPES, encontramos poucos estudos fitoquímicos sobre H. speciosa. Um deles relata a
análise dos componentes voláteis dos frutos obtidos através da hidrodestilação,
mostrando que os componentes principais variam de acordo com o estádio de
maturação, podendo-se observar o predomínio de ésteres, álcoois e furfural nos frutos
maduros, enquanto que nos frutos verdes, os principais componentes observados foram
o cis-óxido de linalol, trans-óxido de linalol e linalol. Já na composição química dos
voláteis dos frutos “de vez” há um predomínio tanto de ésteres, álcoois e furfural,
quanto de cis-óxido de linalol, trans-óxido de linalol e linalol [SAMPAIO &
NOGUEIRA, 2006]. Já RODRIGUES et al. (2006) isolaram alguns metabólitos
secundários das cascas de H. speciosa, tais como: ácido gálico (12), 2,7-diidroxixantona
(13), ácido 3-cafeoilquínico (14), ácido 5-cafeoilquínico (15), 2,7- dimetoxixantona
(16), cis-clorogenato de metila (17), trans-clorogenato de metila (18), e do ácido 4-
hidroxi-3,5-dimetoxibenzóico (ácido siríngico) (19) (Figura 9; p.19). Além disso,
RODRIGUES et al. (2007) investigaram os compostos polifenólicos (Figura 10; p.20)
presentes na infusão das cascas de H. speciosa na tentativa de realizar uma identificação
direta dos metabólitos secundários presentes nas matrizes, onde foi observada a
presença de proantocianidinas diméricas do tipo B: epicatequina-(4β→8)-catequina
(20), epicatequina-(4β→6)-catequina (21), e proantocianidinas diméricas do tipo A:
epicatequina-(2β→7; 4β→8)-epicatequina (22).
P á g i n a | 1 9
HO O
RO
OH
OR
HO
R3O
OH
OR2
CO2R1
O
O
ORRO
OH
OH
CCC
O
H
H
OH
OH
CCC
O
H H
12 R=H18 R=CH3
13 R=H4 R=CH3
x =
y =
14 R1=H; R2=x; R3=H15 R1=H; R2=H; R3=x16 R1=CH3; R2=y; R3=H17 R1=CH3; R2=x; R3=H
Figura 9: Metabólitos secundários encontrados nas cascas de H. speciosa.
P á g i n a | 2 0
O
OH
O
OH
HO
OH
OH
OH
OH
OH
HOOH
OH
OH
HOOH
OHO
OH
O
OH
HO
OH
OHOH
OH
HO
OHO
O
O
HO
HO
OH
OH
OH
(19)
(20)
(21)
Figura 10: Estruturas químicas de proantocianidinas diméricas do tipo B: (1) epicatequina-(4β→8)-catequina, (2) epicatequina-(4β→6)-catequina, e proantocianidinas diméricas do tipo A: (3) epicatequina-(2β→7; 4β→8)-epicatequina.
Num estudo fitoquímico do látex dos frutos de H. speciosa feito por SAMPAIO
(2008) foram identificadas 12 substâncias: 3-β-O-hexadecanoato de lupeoíla (22), 3-β-
O-3’-hidroxihexadecanoato de lupeoíla (23), 3-β-O-9-octadecenoato de lupeoíla (24), 3-
β-O-octadecanoato de lupeoíla (25), 3-β-O-3’-hidroxioctadecanoato de lupeoíla (26), 3-
β-O-3’-hidroxiicosanoato de lupeoíla (27), 3-β-O-3’-hidroxidocosanoato de lupeoíla
(28), α-amina (29), β-amirina (30), lupeol (31), 3-β-O-3’,5’-diidroxiicosanoato de
lupeoíla (32) e a sacarose na sua forma peracetilada (33) (Figura 11; p.21).
P á g i n a | 2 1
O
H
H
H
OR1
n
(22) R1=H; n=12(25) R1=H; n=14(23) R1=OH; n=12(26) R1=OH; n=14(27) R1=OH; n=16(28) R1=OH; n=18
O
H
H
H
O
7 5
(24)
HO H
H
H
HO H
H
H
HO
H
H
H
(29) (30) (31)
O
H
H
H
OOHOH
14
O
O
OAcO
AcO
CH2OAc
AcO
AcO
OAcCH2OAc
CH2OAc
(32) (33)
Figura 11: Substâncias isoladas do látex dos frutos de H. speciosa.
Também foram poucos, mas recentes, os relatos encontrados sobre os estudos de
atividade biológica desta espécie. Neste sentido, podemos citar um estudo preliminar de
ANDRADE (2002), o qual verificou a atividade gastroprotetora do extrato etanólico das
cascas de H. speciosa. Enquanto que MORAES et al. (2008) estudaram as propriedades
etnofarmacológicas da mangabeira, analisando o extrato hidroalcoólico e infusão das
cascas de H. speciosa, como indicações gastroprotetoras e ações contra
Helicobacterpylori. Já COSTA et al. (2008) estudaram a atividade antimicrobiana do
P á g i n a | 2 2
extrato etanólico das folhas de H. speciosa, onde foi observado efeito inibitório frente
bactérias Gram-positivas: Staphylococcus aureus ATCC 6538 e Staphylococcus
epidermidis ATCC 12228 e Gram-negativas: Escherichia coli B4 e Pseudomonas
aeruginosa B8. BRAGA et al. (2010) estudaram o extrato etanólico das folhas de H.
speciosa como substrato na preparação de medicamentos para tratamento de distúrbios
cardiovasculares, hipertensão arterial, aterosclerose, estenose, isquemia cardíaca e
cerebral, usando a enzima conversora angiotensina I (ACE), onde uma fração do extrato
de H. speciosa foi incorporada na cultura de células endoteliais intactas de ratos. Os
resultados mostraram um efeito vasodilatador de forma significativa apenas na camada
endotelial das artérias, devido à liberação de óxido nítrico. Esses resultados foram
semelhantes aos encontrados por FERREIRA et al. (2007) que demonstraram o efeito
do extrato etanólico das folhas frente à inibição da ACE, bem como sua ação como
vasodilatador. Estudos realizados por SAMPAIO (2008) demonstraram um efeito
antioxidante significativo do látex dos frutos verdes de H. speciosa em ratos. SANTOS
et al. (2006) realizaram testes de ação antimicrobiana com o óleo essencial das folhas de
H. speciosa frente bactérias Gram-positivas: Bacillus subtillis ATCC 6633, Bacillus
bulgaricus ATCC 11842, Enterococcus faecalis ATCC 4883, Staphylococcus aureus
ATCC 29737, Gram-negativas: Pseudomonas aeruginosa ATCC 19424, Salmonella
enteritidis ATCC 13076 Escherichia coli ATCC 10536 e Serratia marcescens, bem
como com o fungo Candida albicans ATCC 10231 pelo método dedifusão em placa,
não se observando nenhuma atividade antimicrobiana. Por outro lado, ENDRINGER et
al. (2009) demonstraram a atividade inibitória de ciclitóis, tais como: L-(+)-bornesitol
(34), ácido quínico (35), per-O-acetil-L-(+)bornesitol (36), mio-inositol (37), xilo-
inositol (38) (Figura 12; p.23), isolados do extrato etanólico das folhas de H. speciosa
frente à enzima NF-kB (Fator de transcrição nuclear kB), sendo o L-(+)-bornesitol e o
ácido quínico, os ciclitóis responsáveis por essa atividade.
P á g i n a | 2 3
HO
HOHO
OH
O
HO
OO
O
O
O
O
O
O
O
HOHO
HO
OHOH
OHHO
HOHO
OH
OH
OH
OH
HO
HO
OH
OH
O
1 23
4 5
Figura 12: Estruturas químicas dos ciclitóis.
Existem alguns trabalhos sobre armazenamento e propagação das sementes de H.
speciosa, onde se tornam importantes devido a sua espécie não ter sido ainda
domesticada. De acordo com KOSTER (1991), os métodos de conservação e
armazenamento de sementes recalcitrantes são baseados na manutenção do teor de água
elevado. Existe um limite para o teor de água valor mínimo abaixo do qual não há dano à
germinação de sementes recalcitrantes. No conteúdo de água elevado, há muitas reações
metabólicas e de desenvolvimento de microrganismos, que impedem a redução da
temperatura. Assim, o teor de água das sementes recalcitrantes e temperatura de
armazenamento deve ser reduzida até perto do teor de água crítico mínimo.
O estudo sobre o armazenamento de sementes de mangabeira em substratos e
temperaturas diferentes onde foram desenvolvidas técnicas de vitrificação e
micropropagação dessa espécie foi realizado por SILVA (2010). SOARES et al. (2009)
estudaram o efeito de diferentes concentrações e valores de pH na germinação in vitro
de sementes dos frutos maduros de H. speciosa, onde o efeito de diferentes meios de
cultura, variando-se a concentração e nível de pH, foi avaliado. Os estudos
demonstraram que a maior porcentagem de germinação de sementes de mangabeira in
vitro foi obtida com a utilização dos meios de cultura WPM e MS/2, suplementados
com 15,0 g/L de sacarose, 0,2 mg/Lde ácido giberélico e com pH corrigido para 5,8.
34 35 36
37 38
P á g i n a | 2 4
Utilizando-se da mesma linha de pesquisa, LÉDO et al. (2007) analisaram as condições
mais favoráveis para o crescimento inicial da mangabeira em diferentes meios de
germinação in vitro, onde as sementes foram inoculadas em tubos de ensaio contendo
tratamentos diferentes, sendo que todos em meio básico, e foi observado que, quanto ao
comprimento da raiz principal, o meio de cultura constituído de 2,0 g/L de carvão
ativado proporcionou maior crescimento quando comparado com os demais
tratamentos. Por outro lado, GANGA et al. (2009) avaliaram a variação genética e
estimaram os parâmetros genéticos de crescimento da mangabeira, onde foi observado
que as variedades botânicas cuyabensis e gardneri apresentaram melhores índices de
crescimento, tanto no diâmetro do caule quanto na altura da planta. Já Da SILVA et al.
(2009) avaliaram o efeito de diferentes substratos na produção de mudas da mangabeira
em sacos plásticos, onde 5 substratos foram avaliados seguindo os seguintes
parâmetros: porcentagem de germinação, índice de velocidade de emergência,
porcentagem de mortalidade, altura da planta (cm), diâmetro do caule (mm),
comprimento da raiz (cm), relação número de folhas/planta, índice de clorofila, massa
seca da parte aérea, raiz e planta inteira (g/planta). Os resultados demonstraram que os
substratos contendo esterco bovino eram recomendados para a produção de mudas de
mangabeira em sacos plásticos.
Com relação aos estudos realizados sobre o armazenamento dos frutos,
CARNELOSSI et al. (2009), avaliaram as variações na qualidade físico-química dos
frutos da mangaba, onde os frutos armazenados diretamente a 24 ºC demonstraram uma
queda acentuada em vitamina C e os frutos que foram mantidos inicialmente em 6 ou 8
ºC não mostraram nenhuma diferença significativa na qualidade físico-química durante
o armazenamento.
Com relação à química do látex desta espécie, MALMONGE et al. (2008)
fizeram um estudo comparativo sobre as propriedades tecnológicas do látex e borracha
natural da mangabeira e Hevea brasiliensis (seringueira), onde foi observado que
valores de plasticidade e viscosidade foram aproximadamente os mesmos para ambas
espécies. Posteriormente, MALMONGE et al. (2010) compararam o látex da
mangabeira e da seringueira no que diz respeito ao seu comportamento térmico, por
termogravimetria (TG), afim de obter parâmetros cinéticos (ordem de reação, fator
exponencial e energia de ativação) do processo de decomposição. Os resultados
P á g i n a | 2 5
indicaram algumas diferenças no comportamento térmico da borracha natural de H.
speciosa comparado ao da borracha natural da H. brasiliensis: a ordem de reação para a
mangabeira no início da degradação foi superior à ordem da seringueira, e a energia de
ativação, bem como o fator pré-exponencial apresentaram a mesma tendência,
aumentando com o aumento do grau de conversão, mantendo-se praticamente constante.
Sendo assim, esses estudos demonstraram que o látex de H. brasiliensis é mais estável
termicamente que o látex de H. speciosa.
P á g i n a | 2 6
OBJETIVOS
P á g i n a | 2 7
OBJETIVOS
O presente trabalho foi dividido em 3 partes, sendo que a primeira trata do estudo
do óleo essencial das folhas de H. speciosa. A parte 2 relata o estudo fitoquímico das
folhas e ramos desta espécie. Por fim, na parte 3 foram realizados testes de atividade
antioxidante e citotoxicidade do óleo essencial das folhas, bem como dos extratos das
folhas e ramos da mangabeira.
1. GERAL
Isolar e identificar os constituintes químicos das partes renováveis (folhas e
ramos) de Hancornia speciosa Gomes, bem como verificar atividade biológica do óleo
essencial, extratos e suas partições.
2. ESPECÍFICOS
• Determinar a composição química dos compostos voláteis das folhas de H. speciosa
de acordo com a época de colheita e o tempo de secagem;
• Isolar e identificar os metabólitos secundários do extrato metanólico das folhas e do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa;
• Determinar o potencial antioxidante do óleo essencial das folhas (frescas e secas), do
extrato metanólico das folhas e dos ramos e suas respectivas partições;
• Verificar a citotoxicidade in vitro dos extratos das folhas e dos ramos da mangabeira
em 3 linhagens de células tumorais;
P á g i n a | 2 8
PARTE 1: ESTUDO DO ÓLEO
ESSENCIAL DAS FOLHAS DE
Hancornia speciosa GOMES
P á g i n a | 2 9
PARTE 1: ESTUDO DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS
DE Hancornia speciosa
1. CONSIDERAÇÕES GERAIS
Os óleos essenciais (OE) são produtos voláteis obtidos por processos físicos e
podem ser encontrados em todas as estruturas vegetais, sendo mais frequente em folhas,
flores, frutos e raízes [YUNES et al., 2009]. Os OE assim eram chamados pelos
alquimistas, pois se acreditava que estes óleos compunham a essência da matéria. Sabe-
se hoje que esses óleos transmitem odores e sabores devido à presença de compostos
químicos voláteis obtidos de tecidos vegetais. Cada componente de um OE tem um
perfil característico e cada aroma e sabor é uma combinação dos perfis de seus
constituintes. Sendo assim, a utilização de OE requer minuciosa caracterização química
e avaliação de possíveis modificações na sua composição, devido a diferentes origens
geográficas e condições climáticas. Esses óleos podem ser constituídos desde um
componente dominante, como no caso do citronelal, no OE de Eucalyptus citriodora, do
linalol no óleo de Aniba roseadora, ou eugenol no óleo de Syzygium aromaticum, ou ser
constituído de algumas centenas de substâncias em quantidades variáveis. A natureza
química dos inúmeros componentes desses óleos é relativamente limitada, mas os
arranjos que podem assumir os esqueletos carbônicos e as posições variáveis de
determinados grupamentos tornam incrível o número de substâncias odoríferas, cada
uma delas assumindo a sua individualidade [SPEZIALI, 2008].
Estes óleos são constituídos por substâncias de baixo peso molecular,
principalmente misturas de fenilpropanóides e terpenóides, especificamente
monoterpenos e sesquiterpenos, embora diterpenos também possam estar presentes.
Além destes, uma variedade de hidrocarbonetos alifáticos (lineares, ramificados,
saturados ou insaturados), ácidos, alcoóis, aldeídos, ésteres acíclicos, lactonas e
compostos com nitrogênio e enxofre também foram identificados em OE [SIANI et al.,
2000].
P á g i n a | 3 0
Os terpenóides encontrados no óleo essencial apresentam grande variabilidade
estrutural e são derivados de unidades de 5 átomos de carbono. A biossíntese dos
terpenos acontece por dois caminhos diferentes: O caminho do mevalonato no
citoplasma das células e o caminho do metil eritritol nos plastídios das células
[DEWICK, 2009].
A redução no número de átomos de carbono do ácido mevalônico para 5 átomos
pode ser explicada por várias reações, começando com a fosforilação do álcool
primário, resultando em difosfato de ácido mevalônico e a descarboxilação-desidratação
seguem então para formação de pirofosfato de isopentenila (IPP) e pirofosfato de
dimetilalila (DMAPP). Apesar de uma terceira molécula de ATP ser necessária para
esta última transformação, não há nenhuma evidência de fosforilaçãoda hidroxila
terciária, embora isso possa converter a hidroxila em um grupo de saída melhor (Figura
13; p.30) [DEWICK, 2009].
HO2COH
OH2x ATP
HO
OOH
PHO
O
OH
O ADP
ATP/-CO2
OPPHH
H
OPP
Ácido mevalônico
Pirofosfato de isopentenila Pirofosfato de dimetilalila
(1) (2)
Figura 13: Possível rota biossintética de terpenóides via ácido mevalônico. (1) Fosforilação seqüencial do álcool primário para o difosfato. (2) ATP facilita a eliminação. Não há nenhuma evidência de fosforilação da hidroxila terciária.
A biossíntese dos terpenos prossegue com a formação da ligação carbono-carbono
que envolve a ionização do DMAPP transformando-o em cátion alílico que é
adicionado sobre a ligação dupla do IPP. Forma-se um carbocátion terciário que perde
um próton e forma uma dupla ligação trans (E). Neste caso o composto formado, que é
IPP DMAPP
OPP
P á g i n a | 3 1
precursor de vários monoterpenos, é o pirofosfato de geranila (GPP), (Figura 14; p.31)
[NICARETA, 2006; DEWICK, 2009].
OPP OPPHH
OPPHH
OPP
OPPE
DMAPP Cátion alílico IPP
GPP
- H+
Figura 14: Rota biossintética de formação do Pirofosfato de Geranila.
O difosfato de linalila (LPP) e o difosfato de nerila (NPP) são isômeros do GPP, e
são susceptíveis de serem formados a partir do mesmo pela ionização do cátion alílico,
permitindo uma mudança na inserção do grupo difosfato (ao carbono terciário em LPP)
ou uma mudança na estereoquímica na dupla ligação (para Z em NPP) (Figura 15;
p.31).
OPP
OPP
OPP
OPP
E Z
GPP LPP NPP
Estabilidade do cátion geranila Estabilidade do cátion nerila
OPP
Figura 15: Rotas biossintéticas do LPP e NPP.
≡
P á g i n a | 3 2
Estes três compostos, por relativamente ligeiras alterações, podem dar origem a
uma série de monoterpenos lineares encontrados como componentes dos óleos voláteis
usados como aromatizantes em perfumaria e cosméticos. A ciclização não seria
esperada em GPP, a estereoquímica E da ligação dupla é desfavorável para a formação
do anel. NPP ou LPP, no entanto, possuem estereoquímica favorável com formação do
carbocátion (α-terpineíla e mentoíla). É conveniente, portanto, considerar as espécies
envolvidas na ciclização como um cátion alílico deslocalizado fortemente vinculado ao
ânion difosfato, e a formação da ligação seguinte devido à proximidadede elétrons π da
dupla ligação [DEWICK, 2009].
O linalol é um dos mais importantes álcoois utilizados como fragrância e
aromatizantes, por ser estável em meio alcalino, também é utilizado como fragrância na
fabricação de sabões e detergentes [SERCHELI, 1996]. A formação do linalol (Figura
16; p.33) se dá pela hidratação do cátion nerila. Uma proposta para a biossíntese do
óxido de linalol consiste na hidroxilação do linalol pela ação das enzimas do citocromo
P-450 via intermediário 6,7 epóxido de linalol. Além desta, outra alternativa que pode
ser levada em consideração é a auto-oxidação do linalol, pela sua exposição ao oxigênio
do ar, que também conduz ao óxido de linalol [De BARROS, 2009].
P á g i n a | 3 3
OPP
OPP
OH
OPP
OH
O(1)
(2)
O
HO
O
HO
H2O
GPP
Cátion nerila Linalol Epóxido de linalol
NPPLPP
(1)
(2)
Óxido de linalol (furanóide)
Óxido de linalol (piranóide)
(1)
(2)
Figura 16: Possível rota biossintética do óxido de linalol. OPP=Difosfato.
O fato de sua biossíntese envolver poucas etapas pode contribuir para sua
presença em concentrações razoáveis no óleo essencial de algumas plantas, fazendo
com que o mesmo apareça em sua forma furânica e pirânica, além de serem largamente
utilizados por seu característico odor de rosas (Figura 17; p.34) [SERCHELI, 1996].
P á g i n a | 3 4
O
HO
OHO
O
HO
OHO
cis-óxido de linalol (piranóide) cis-óxido de linalol (furanóide)
trans-óxido de linalol (piranóide) trans-óxido de linalol (furanóide)
Figura 17: Estruturas químicas do óxido de linalol na sua forma furânica e pirânica.
O geraniol pode ser sintetizado pelas plantas a partir do ácido mevalônico. A
adição de água ao GPP forma o geraniol (Figura 18; p.34).
OPPOHH2O
GPP cátion geranila GeraniolFigura 18: Rota biossintética do geraniol a partir do GPP.
O α-terpineol é um monoterpeno oxigenado que tem sido isolado de uma
variedade de fontes, tais como: óleo de pinho e óleo de petitgrain. A sua formação se dá
pelo ataque da água sofrido pelo cátion mentoíla (Figura 19; p.35).
P á g i n a | 3 5
OPP
OPP
OH
H2O
LPP cátion alílico deslocalizado cátion mentoíla/α-terpineíla α-terpineol
Figura 19: Rota biossintética do α-terpineol a partir do LPP.
Dentre as principais atividades farmacológicas já atribuídas aos OE destacam-se:
antimicrobiana, antiinflamatória, antioxidante, anticolinesterástica, anti-helmíntica,
antiparasitária, analgésica, sedativa, antitumoral, entre outras [SIMÕES et al., 2007].
De acordo com a família as quais pertencem, as diversas espécies de plantas
acumulam esses elementos voláteis em órgãos anatômicos específicos, os quais estão
associados a várias funções necessárias à sobrevivência do vegetal em seu ecossistema,
exercendo um papel fundamental na defesa contra microrganismos e predadores, e
também na atração de insetos e outros agentes polinizadores [SIANI et al., 2000].
Existem alguns trabalhos demonstrando que a toxicidade de alguns compostos
dos OE constitui uma proteção contra predadores. Mentol e mentona (Figura 20; p.35),
por exemplo, são inibidores do crescimento de vários tipos de larvas. Também existem
evidências de que alguns insetos utilizam OE sequestrados de plantas para defenderem-
se de seus predadores [SIMÕES et al., 2007].
OH
H
O
Mentol Mentona
Figura 20: Estruturas químicas do mentol e mentona.
P á g i n a | 3 6
As aplicações fitoterápicas e industriais dos OE e, consequentemente, a
importância econômica de sua produção, têm direcionado os estudos sobre secagem
para a obtenção de composições que atendam às exigências do mercado. Com este
objetivo, BLANK et al. (2002) estudaram o efeito da secagem de folhas de Melissa
officinalis no teor e na composição do OE. Observou-se que a produção desse óleo não
foi significativamente afetada, mas os teores dos seus componentes de interesse,
geranial e neral, foram influenciados positivamente pela secagem. MARTINS et al.
(2000) também recomendam a secagem para maximizar a obtenção de citral a partir de
folhas de capim-limão (Cymbopogon citratus D.C.Stapf.). Por outro lado, EHLERT et
al. (2000) relataram um efeito negativo da secagem de folhas de alfavaca-cravo
(Ocimum gratissimum), a qual provoca perda do OE e de seus constituintes de interesse
comercial. REIS et al. (2006), analisaram o efeito da secagem das folhas no OE de
citronela, demonstrando que houve uma mudança na composição química comparando-
se as plantas frescas e secas. Já a secagem realizada a diferentes condições de
temperatura não provocou mudanças na composição química do óleo de citronela,
observando-se que não houve uma diminuição nas percentagens relativas dos principais
componentes químicos presentes no óleo (citronelal, citronelol, geraniol, eugenol e
elemol).
A composição química dos OE de uma planta é determinada geneticamente, mas
pode ser influenciada por fatores abióticos, tais como luz, sazonalidade, temperatura,
níveis de nutrição e água, entre outros [SIMÕES et al., 2005]. A baixa intensidade
luminosa geralmente diminui a produção de monoterpenos. Pequenas variações diárias
de temperaturas estimulam a produção de terpenóides, enquanto que valores extremos
causam a sua redução. Os índices de precipitação não seguem um padrão, variando sua
influência entre as espécies. A chuva contínua pode resultar na perda de substâncias
hidrossolúveis das folhas e raízes por lixiviação, enquanto que o aumento do teor de
nitrogênio e fósforo no solo pode favorecer o maior rendimento do óleo essencial
[LOPES & NETO GOBBO, 2007].
P á g i n a | 3 7
2. OBJETIVOS
Nesta parte do trabalho objetivamos investigar a composição química do óleo
essencial das folhas frescas e secas da mangabeira em diferentes épocas do ano.
P á g i n a | 3 8
3. METODOLOGIA
3.1. Obtenção do material vegetal
As folhas de H. speciosa foram obtidas a partir de um espécime encontrado no
Campus da Universidade Federal de Sergipe (UFS) no município de São Cristóvão – SE
(S 10º 55’ 43” W 37º 55’ 14”). As coletas ocorreram nos meses de janeiro a dezembro
de 2009, entre 09 e 10 horas da manhã. A espécie foi identificada pelo botânico Clóvis
Roberto Pereira Franco. Material testemunha encontra-se depositado no Herbário do
Departamento de Biologia da UFS, sob o registro ASE n° 13630.
3.2. Extração do óleo essencial
O OE foi extraído das folhas frescas e secas a temperatura ambiente por 5 dias,
através da técnica de hidrodestilação, utilizando-se aparelhagem tipo Clevenger (Figura
21; p.39). As folhas (100 g) foram trituradas e misturadas com 2 L de água destilada em
um balão de fundo redondo (3 L), onde a extração foi realizada em triplicata.
Após 3 horas de extração, os compostos voláteis foram separados da água pela
extração com diclorometano (CH2Cl2) (3x15 mL). A fase orgânica foi seca com sulfato
de sódio anidro (Na2SO4) e logo em seguida foi filtrada. A solução foi inicialmente
concentrada à pressão reduzida em um evaporador rotatório e, posteriormente
submetida a fluxo de gás nitrogênio até volume final de 0,5 mL (Fluxograma 2; p.41).
P á g i n a | 3 9
Figura 21: Técnica da hidrodestilação utilizando aparelhagem do tipo Clevenger
[Wesley Gomes].
3.3. Identificação dos componentes voláteis
Os componentes voláteis foram analisados por CG/EM utilizando um aparelho
Shimadzu-QP5050A equipado com coluna capilar de sílica fundida DB-5 (30 m x 0,25
mm x 0,25 µm) e por CG/DIC utilizando um equipamento Shimadzu GC-17A, sob uma
coluna capilar de sílica fundida DB-5MS com 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm de filme.
A temperatura da coluna foi programada de 40 ºC (4 min) aumentando para 220
°C a 4 °C/min e, em seguida, aquecida até 280 °C a 20 °C/min. As temperaturas do
injetor e detector foram 250 ºC e 280 ºC, respectivamente. O gás de arraste foi o Hélio
(1,2 mL/min). O volume de injeção foi de 0,5 µL. O espectrômetro de massas operou
com velocidade de 0,50 scans.seg-1 na faixa de m/z 40-550.
P á g i n a | 4 0
Os índices de retenção foram obtidos injetando uma mistura de C8-C20 de
hidrocarbonetos lineares (n-alcanos). A identificação dos compostos foi feita com base
nos índices de retenção [VAN DEN DOOL & KRATZ, 1963] e na comparação
computadorizada dos espectros de massas adquiridos com aqueles armazenados no
banco de dados de espectros de massas do sistema CG/EM (NIST107, NIST21,
WILEY8) e com outros espectros de massas da literatura [ADAMS, 2007].
A percentagem de cada componente foi determinada pela área do componente
dividida pela área total de todos os componentes presentes na mistura [ADAMS, 2007].
P á g i n a | 4 1
Fluxograma 2: Procedimento para obtenção do óleo essencial de H. speciosa.
Coleta das folhas
Frescas Secas
(5 dias ao ar)
Óleo/Água
Fase orgânica Solução Aquosa
Óleo essencial Análise CG/EM Identificação
Shimadzu, QP5050A, coluna ZB-5MS 30m
Separação CH2Cl2 (3x15mL)
1.Na2SO4
2.Filtração 3.Rotaevaporador 4.Gás Nitrogênio (0,5mL)
Hidrodestilação 3h Extração em aparelho tipo Clevenger
P á g i n a | 4 2
3.4. Levantamento dos dados meteorológicos
Os dados meteorológicos de temperatura, índice pluviométrico e teor de água no
solo foram obtidos a partir dos registros da Empresa de Desenvolvimento Agropecuário
de Sergipe (EMDAGRO), bem como pelos registros fornecidos pelo Sistema de
Monitoramento Agrometeorológico (AGRITEMPO). Os dados foram tabulados e
utilizados, para fins de comparação, com as variações quantitativas observadas para o
óleo essencial de H. speciosa.
3.5. Análise estatística
As análises multivariadas da composição química do óleo essencial das folhas
frescas e secas de H. speciosa, tais como: análises de arranjos (grupo) baseadas na
dissimilaridade de indivíduos (Cluster Analysis; CA) e Análise dos Componentes
Principais (ACP) foram realizadas utilizando o software comercial XLSTAT versão
2010 (2010) da empresa Microsoft Corporation®, bem como o software comercial
STATISTICA versão 9 (2010) da empresa Statsoft®.
P á g i n a | 4 3
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Análise dos compostos voláteis das folhas de Hancornia speciosa
A análise dos compostos voláteis das folhas nos permitiu verificar que existem
variações tanto no rendimento quanto na composição química do óleo (Figura 23-34;
p.47-58; Tabela 1; p.45; Tabela 2; p.46), levando em consideração o tempo de
secagem e época de colheita.
Com a análise dos constituintes voláteis (Figura 22; p.44) foi possível identificar
22 compostos de diferentes classes (59% alcoóis, 27% aldeídos, 5% cetonas e 9%
ésteres). Com a secagem das folhas verificou-se um aumento significativo nas
percentagens relativas de alguns monoterpenos oxigenados como α-terpineol (0,08±0,20
- 3,89±1,78 nas folhas frescas e 0,93±0,03 - 5,21±0,65 nas folhas secas), linalol
(2,95±1,45 - 12,46±2,24 nas folhas frescas e 2,78±1,08 - 17,16±2,83 nas folhas secas),
geraniol (1,04±0,34 - 12,80±1,23 nas folhas frescas e 25,67±6,45- 46,56±4,67 nas
folhas secas), assim como um decréscimo nas percentagens de alcoóis como (Z)-3-
hexenol (46,81±3,27 - 78,45±7,75 nas folhas frescas e 10,70±4,87 - 19,15±4,28 nas
folhas secas), 1-hexanol (1,65±0,33 - 10,15±0,80 nas folhas frescas e 0,07±0,05 -
4,59±1,55 nas folhas secas).
P á g i n a | 4 4
OH OH
(Z)-3-hexenol 1-hexanol
F. Fresca:46,81±3,27 – 78,45±7,75 F. Fresca:1,65±0,33 – 10,15±0,80
F. Seca:10,24±4,37 – 19,15±4,28 F. Seca:0,07±0,05 – 4,59±1,55
OHOH
Geraniol Linalol
F. Fresca:2,95±1,45 – 12,46±2,24 F. Fresca:1,04±0,34 – 12,80±1,23
F. Seca:2,95±1,45 – 17,16±2,83 F. Seca:25,67±6,45 – 46,56±4,67
O
H
OH
O
H
OH
cis-óxido de linalol trans-óxido de linalol
F. Fresca:0,14±0,04 – 4,33±0,15 F. Fresca:0,31±0,03 – 7,01±0,79
F. Seca:0,88±0,35 – 6,36±1,67 F. Seca:2,33±1,09 – 16,43±4,73
Figura 22: Principais compostos identificados na análise de óleo essencial das folhas de H. speciosa variando-se o tempo de secagem e época de colheita.
P á g i n a | 4 5
Tabela 1: Composição percentual relativa dos constituintes químicos encontrados nos óleos essenciais das folhas de H. speciosa variando-se o
tempo de secagem e época de colheita nos meses de janeiro a junho/2009, através de CG/DIC.
* IRcal= Índice de retenção calculado; IRlit= Índice de retenção da literatura [ADAMS, 2007]. a (forma furânica) b(forma pirânica)
Compostos IRcal IR lit Jan/09 (%) Fev/09 (%) Mar/09 (%) Abr/09 (%) Mai/09 (%) Jun/09 (%)
Frescas Secas Frescas Secas Frescas Secas Frescas Secas Frescas Secas Frescas Secas
1 (Z)-2-Penten-1-ol 760 765 1,69±1,15 0,61±1,16 1,57±1,17 0,99±1,10 1,28±1,06 1,29±1,17 2,01±1,08 0,81±1,05 1,54±1,59 0,70±1,03 2,10±1,25 1,08±1,12
2 Hexanal 801 801 0,42±1,14 0,73±0,39 0,71±1,15 0,55±1,14 0,21±1,08 1,23±1,14 0,65±1,22 0,54±1,03 0,74±1,23 0,85±1,37 1,22±1,04 0,71±1,12
3 (E)-2-Hexenal 850 855 0,31±1,14 2,19±1,75 0,17±1,05 3,42±1,25 0,61±0,31 3,85±0,25 7,34±0,85 0,84±1,05 3,00±2,45 0,87±0,26 1,32±0,81 1,82±0,45
4 Furfural 834 836 0,16±1,14 0,11±1,07 0,08±1,04 0,11±1,05 0,04±1,23 0,08±1,34 0,08±0,23 0,70±1,08 0,12±0,27 0,18±0,05 1,34±2,85 1,02±1,11
5 (Z)-3-Hexenol 853 850 70,87±6,61 14,91±5,35 76,72±1,53 19,15±4,28 78,45±7,75 11,97±1,44 67,89±8,25 10,70±4,87 60,54±5,93 17,20±2,93 46,81±3,27 12,77±1,96
6 (Z)-2-Hexenol 860 859 1,71±1,09 0,17±1,05 1,87±0,44 0,38±0,07 1,29±0,50 1,54±0,24 0,79±0,06 0,18±0,86 1,99±0,95 0,50±0,06 4,44±0,27 0,15±0,26
7 1-Hexanol 868 863 10,15±0,80 1,63±1,40 6,13±2,42 1,88±2,33 3,41±2,35 3,65±2,15 3,19±1,64 1,17±1,17 2,78±0,79 1,85±0,75 4,08±2,16 0,81±0,21
8 (2E, 4E)-Hexadienal 911 907 0,39±0,16 0,15±0,06 0,33±0,04 0,08±1,23 0,26±0,05 0,06±1,33 0,08±0,07 0,17±0,45 0,52±0,23 0,21±0,55 0,76±0,02 1,22±0,11
9 6-metil, 5-hepten-2-ona 985 981 0,56±0,11 1,31±0,14 0,10±0,02 0,07±0,02 0,08±0,04 0,59±0,25 0,16±0,03 0,38±0,17 0,89±0,34 0,48±0,23 0,65±0,03 1,39±0,18
10 Benzenoacetaldeído 1040 1036 0,52±0,15 0,11±0,15 0,72±0,26 0,42±0,27 0,15±0,02 1,90±0,66 0,69±0,60 0,37±0,17 0,27±0,15 0,09±0,06 1,51±0,57 0,12±0,08
11 cis-óxido de linalola 1070 1067 0,27±0,12 4,78±0,03 1,50±0,26 2,18±0,54 0,14±0,04 2,28±0,16 0,22±0,07 5,18±0,69 2,43±0,56 3,43±1,13 2,86±1,10 6,36±1,67
12 trans-óxidode linalola 1086 1084 0,32±0,11 10,21±2,45 0,60±0,05 4,85±1,65 0,31±0,03 4,35±1,06 0,48±0,30 16,43±4,73 5,17±0,02 6,32±2,65 4,19±0,57 10,37±2,44
13 Linalol 1101 1095 8,08±2,68 17,16±2,83 2,95±1,45 7,90±0,62 3,98±0,88 7,19±1,37 7,45±1,11 2,78±1,08 3,09±1,60 6,63±1,24 5,02±2,52 5,90±1,69
14 Álcool feniletílico 1110 1106 0,25±0,38 0,95±1,11 0,15±0,67 1,12±0,56 0,13±0,49 0,82±0,14 0,31±0,12 3,69±0,51 0,29±0,77 0,68±0,13 2,50±0,03 1,11±0,08
15 cis-óxido de linalolb 1169 1170 0,17±0,56 1,00±0,25 0,08±0,17 0,93±0,05 0,04±0,31 0,27±0,13 0,15±0,39 1,28±0,45 0,18±0,56 0,77±0,21 0,08±0,18 1,57±0,04
16 trans-óxido de linalolb 1173 1173 0,28±0,55 1,68±0,09 0,28±0,34 2,35±0,36 0,14±0,45 0,78±0,12 0,16±0,23 4,76±1,75 0,25±0,08 2,85±0,63 0,31±0,11 4,61±2,34
17 Salicilato de metila 1189 1190 0,10±0,18 1,87±0,27 0,08±0,23 1,22±0,11 0,04±0,18 1,44±0,54 0,17±0,22 2,28±0,31 1,09±0,45 2,87±0,90 1,00±0,65 1,85±1,10
18 α-Terpineol 1193 1186 0,21±0,04 1,29±0,21 0,51±0,16 1,15±0,03 0,76±0,23 0,95±0,49 0,32±0,05 1,86±0,32 1,10±0,28 1,17±0,07 1,54±0,56 1,13±0,08
19 Geraniol 1249 1249 1,04±0,34 28,06±5,46 2,57±0,25 43,14±7,95 2,63±0,23 46,56±4,67 1,45±0,43 34,65±3,82 10,96±1,21 44,14±5,27 12,80±1,23 29,98±3,56
20 Antranilato de metila 1338 1337 0,02±0,45 7,40±2,06 0,04±0,15 5,01±0,66 0,04±0,56 1,21±0,24 0,05±0,10 2,61±0,31 0,04±0,08 0,64±0,55 0,06±0,11 13,79±2,35
21 (E)-2-Decenal 1262 1260 0,25±0,05 0,11±0,08 0,22±0,07 0,08±0,04 0,09±0,55 0,03±0,11 0,19±0,35 0,06±0,20 0,06±0,16 0,04±0,17 0,16±0,08 0,05±±0,19
22 Eugenol 1360 1366 0,22±0,10 0,66±0,55 0,18±0,06 0,59±0,15 0,38±0,10 1,04±0,75 0,19±0,11 0,64±0,55 0,08±0,04 0,34±0,22 0,41±0,20 1,01±0,08
TOTAL 97,99 97,09 97,56 97,57 94,46 93,08 93,33 95,91 97,13 92,79 95,16 98,82
P á g i n a | 4 6
Tabela 2: Composição percentual relativa dos constituintes químicos encontrados nos óleos essenciais das folhas de H. speciosa variando-se o
tempo de secagem e época de colheita nos meses de julho a dezembro/2009, através de CG/DIC.
* IRcal= Índice de retenção calculado; IRlit= Índice de retenção da literatura [ADAMS, 2007]. a (forma furânica) b(forma pirânica).
Compostos IRcal IR lit Jul/09 (%) Ago/09 (%) Set/09 (%) Out/09 (%) Nov/09 (%) Dez/09 (%)
Frescas Secas Frescas Secas Frescas Secas Frescas Secas Frescas Secas Frescas Secas
1 (Z)-2-Penten-1-ol 760 765 0,59±0,06 0,90±0,07 0,82±0,74 1,31±0,08 0,72±0,68 0,45±0,35 1,45±0,22 0,81±0,74 1,33±0,12 0,48±0,18 0,70±1,00 0,29±0,47
2 Hexanal 801 801 0,75±0,21
0,27±0,05
0,59±0,55
0,08±0,19 1,58±0,11
0,60±0,52
0,93±0,85
0,21±0,35 0,76±0,65
0,28±0,07
0,76±0,12
0,48±0,08
3 (E)-2-Hexenal 850 855 2,94±0,51
3,11±0,87
1,50±0,39
8,61±1,04
3,71±0,61
3,00±1,55
6,21±1,65
0,34±0,15 0,71±0,27
0,54±0,13
5,13±0,11
3,63±0,63
4 Furfural 834 836 0,06±0,14 0,15±0,23 0,06±0,02
1,66±0,32
0,93±0,84
2,49±0,92
0,31±0,08 0,95±0,85
0,48±0,13
1,31±0,14
1,47±0,95 0,49±0,04
5 (Z)-3-Hexenol 853 850 70,09±9,94
17,34±4,88
65,44±5,71
17,46±4,43
50,94±5,27
14,66±2,25
62,06±3,11
12,75±1,45
61,33±3,66
10,86±0,97
62,83±6,98
10,24±4,37
6 (Z)-2-Hexenol 860 859 3,14±1,07
2,74±0,08
2,84±1,28
3,38±0,83
4,46±2,02
0,92±0,84
3,51±2,16
0,71±0,33 4,18±0,50
1,56±0,20
0,70±1,23
0,30±0,04
7 1-Hexanol 868 863 4,07±0,73
3,88±0,65
3,39±1,85
4,59±1,55
2,67±0,51
0,07±0,05
4,73±2,39
0,08±0,23 1,65±0,33
0,10±0,06
2,15±0,45
0,73±0,85
8 (2E, 4E)-Hexadienal 911 907 0,10±0,05
0,06±0,18 0,55±0,42
0,05±0,19 1,03±0,95
0,03±0,11 1,01±0,22 0,34±0,12 0,67±0,10
0,27±0,22 0,06±0,67
0,14±0,25
9 6-metil, 5-hepten-2-ona 985 981 0,77±0,35 0,41±0,16 1,34±0,11
1,47±0,81 0,31±0,22 0,48±0,14 0,29±0,13 0,11±0,27 0,07±0,02
1,47±0,14
0,05±0,57
0,08±0,16
10 Benzenoacetaldeído 1040 1036 0,69±0,21 1,23±0,55
1,23±0,56
1,31±0,42 0,16±0,04 0,62±0,28
0,81±0,33 1,60±1,55
0,71±0,63
3,16±1,05
1,67±0,87 0,13±0,03
11 cis-óxido de linalola 1070 1067 0,65±0,57
1,29±0,15
0,92±0,84
0,88±0,35
2,28±2,22
3,45±1,99
1,45±0,22
4,70±0,50
0,97±0,67
6,32±2,65
4,33±0,15
6,17±0,85
12 trans-óxidode linalola
1086 1084 2,78±0,67
5,26±0,81
1,55±0,33
2,33±1,09
7,01±0,79
6,95±0,17
2,43±0,12
5,69±0,61
1,48±0,97
2,70±1,50
5,22±0,68
7,24±1,43
13 Linalol 1101 1095 5,12±0,55
9,46±2,87
4,51±0,84
5,92±2,73
12,46±2,24
8,97±0,72
4,12±0,55
6,57±1,72
4,88±2,67
4,84±1,94
5,95±1,52
10,27±3,51
14 Álcool feniletílico 1110 1106 2,02±0,31 0,97±0,17 0,82±0,73
2,15±0,16
1,25±0,25
3,90±0,29
1,69±0,12
3,31±0,09
2,79±0,68
3,89±1,78
2,33±0,15
1,23±0,08
15 cis-óxido de linalolb 1169 1170 0,11±0,18 0,94±0,03
0,30±0,12 0,90±0,86
0,25±0,11 1,51±0,16
0,12±0,25 3,88±0,67
0,27±0,08 3,00±0,66
0,31±0,22 0,77±0,46
16 trans-óxido de linalolb 1173 1173 0,27±0,18 2,79±0,55
0,67±0,35 3,49±1,65
0,81±0,11 3,05±1,65
0,93±0,21 6,77±1,10
0,98±0,22 5,66±1,15
1,01±0,37 3,06±1,25
17 Salicilato de metila 1189 1190 0,28±0,19 2,29±0,08
0,61±0,22 3,80±1,12
0,77±0,30 2,89±1,66
1,16±1,09 7,27±1,61
0,28±0,15
2,91±0,69
1,33±1,07 4,02±1,56
18 α-Terpineol 1193 1186 0,08±0,20 0,93±0,03
0,11±0,22 1,99±1,68
0,89±0,31 2,40±2,95
0,83±0,73
5,21±0,65
3,89±1,78
3,44±2,05
0,22±0,32
1,54±0,55
19 Geraniol 1249 1249 4,09±0,89 37,28±2,35
10,61±1,49
30,60±7,61
4,54±1,13
28,76±4,38
3,31±0,65
25,67±6,45
6,78±1,22
29,61±6,05
2,32±1,05
35,41±2,53
20 Antranilato de metila 1338 1337 0,03±0,09 3,08±0,26
0,02±0,20 5,43±1,89 0,04±0,16 8,44±1,65
0,04±0,22 7,89±4,75
0,05±0,15 9,50±2,73
0,04±0,18 9,79±2,95
21 (E)-2-Decenal 1262 1260 0,34±0,04
0,29±0,08 0,23±0,15
0,31±0,11 1,61±0,19
0,21±0,06 0,06±0,25
0,18±0,04 0,33±0,35
0,11±0,22 0,31±0,18 0,08±0,21
22 Eugenol 1360 1366 0,15±0,20 0,65±0,15
0,11±0,23 0,35±0,11
0,35±0,12 1,67±0,56
0,81±0,20 2,89±1,66
0,34±0,10 1,46±0,71
0,06±0,13 0,11±0,35
TOTAL 98,47 95,32 98,22 98,07 98,77 95,52 98,26 97,47 94,93 93,47 98,95 96,20
P á g i n a | 4 7
5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
1 5 0
1 7 5
2 0 0
Inte
nsid
ade
rela
tiva
(%)
t ( m in )
T IC - F o lh a s f r e s c a s T IC - F o lh a s s e c a s
Figura 23: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM (coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das
folhas frescas e secas do mês de janeiro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 1.
5
7 13
5
7 11
12
13
16
19
20
P á g i n a | 4 8
5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
1 5 0
1 7 5
2 0 0
Inte
nsid
ade
rela
tiva
(%)
t (m in )
T IC - F o lh a s f r e s c a s T IC - F o lh a s s e c a s
Figura 24: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM (coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das
folhas frescas e secas do mês de fevereiro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 1.
5
7
5
13
11 12
13
20
19
7
P á g i n a | 4 9
5 10 15 20 25 30
0
25
50
75
100
125
150
175
200
Inte
nsid
ade
rela
tiva
(%)
t (m in)
Figura 25: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM (coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das
folhas frescas e secas do mês de março de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 1.
5
5
7
7
13
10
13
12 11
19
P á g i n a | 5 0
5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
1 5 0
1 7 5
2 0 0
Inte
nsid
ade
rela
tiva
(%)
t (m in )
T IC - F o lh a s f r e s c a s T IC - F o lh a s s e c a s
Figura 26: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM (coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das
folhas frescas e secas do mês de abril de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 1.
5
7 13
5
7 11
13
12
19
16
20
P á g i n a | 5 1
5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
1 5 0
1 7 5
2 0 0
Inte
nsid
ade
rela
tiva
(%)
t ( m in )
T IC - F o lh a s f r e c a s T IC - F o lh a s s e c a s
Figura 27: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM (coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das
folhas frescas e secas do mês de maio de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 1.
5
5
7
7 10
11 12 13
13 20
19
P á g i n a | 5 2
5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
1 5 0
1 7 5
2 0 0
Inte
nsid
ade
rela
tiva
(%)
t ( m in )
T IC - F o lh a s f r e s c a s T IC - F o lh a s s e c a s
Figura 28: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM (coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das
folhas frescas e secas do mês de junho de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 1.
7
5
5
7
13
13
12 11
19
19
20
16 17
22
P á g i n a | 5 3
Figura 29: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM (coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das
folhas frescas e secas do mês de julho de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 2.
5
7 12
11
13
17
19
22 20
7 13 19
5
5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
1 5 0
1 7 5
2 0 0
Inte
nsid
ade
rela
tiva
(%)
t ( m in )
T I C - F o lh a s f r e s c a s T I C - F o lh a s s e c a s
P á g i n a | 5 4
5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
1 5 0
1 7 5
2 0 0
Inte
nsid
ade
rela
tiva
(%)
t (m in )
T IC - F o lh a s f r e s c a s T IC - F o lh a s s e c a s
Figura 30: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM (coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das
folhas frescas e secas do mês de agosto de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 2.
5
5
7
7 10
11 12
13
13
19
P á g i n a | 5 5
Figura 31: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM (coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das
folhas frescas e secas do mês de setembro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 2.
5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
1 5 0
1 7 5
2 0 0
Inte
nsid
ade
rela
tiva
(%)
t ( m in )
T I C - F o lh a s f r e s c a s T I C - F o lh a s s e c a s
5
5
14
12
13 16
19
11
20
P á g i n a | 5 6
5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
1 5 0
1 7 5
2 0 0
Inte
nsid
ade
rela
tiva
(%)
t (m in )
T IC - F o lh a s f r e s c a s T IC - F o lh a s s e c a s
Figura 32: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM (coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das
folhas frescas e secas do mês de outubro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 2.
5
7
5
7
13
12 11
17
19
20
P á g i n a | 5 7
5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
1 5 0
1 7 5
2 0 0
Inte
nsid
ade
rela
tiva
(%)
t ( m in )
T IC - F o lh a s f r e s c a s T IC - F o lh a s s e c a s
Figura 33: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM (coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das
folhas frescas e secas do mês denovembro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 2.
5
14
5
11 12
13
17 20
19
P á g i n a | 5 8
5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
1 5 0
1 7 5
2 0 0
Inte
nsid
ade
rela
tiva
(%)
t ( m in )
T IC - F o lh a s f r e s c a s T IC - F o lh a s s e c a s
Figura 34: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM (coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das
folhas frescas e secas do mês de dezembro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 2.
5
5
11
12
13
14
16
19
20
P á g i n a | 5 9
Os rendimentos do OE das folhas frescas variaram de 0,11% a 0,53% e das folhas
secas variaram de 0,10% a 0,51% (Figura 35; p.60). Analisando os dados climáticos do
período, observou-se que tanto a diminuição do índice de precipitação (ppm), quanto
temperaturas mais elevadas (Figura 36; p.60) favorecem o aumento do teor do óleo
essencial das folhas de H. speciosa. Na Figura 35; p.60, pôde-se observar que os teores
de óleo essencial foram superiores na estação seca em relação à estação chuvosa. Estes
resultados são semelhantes aos obtidos por MATTOS (2000) e CRUZ (1999), que
trabalharam com hortelã-japonesa (Mentha arvensis) e hortelã-rasteira (Mentha villosa),
respectivamente. Nestes trabalhos, também se considerou a intensidade luminosa e a
temperatura como os principais fatores responsáveis pelo aumento da produção de óleo
essencial na estação seca. Pôde-se atribuir este fato ao aumento da temperatura e,
principalmente, da intensidade luminosa durante a estação seca. Estes fatores ambientais
atuam diretamente em processos primários, como fotossíntese e respiração, e podem
influenciar indiretamente a produção de metabólitos secundários, cuja biossíntese
depende de produtos do metabolismo primário. Foi observado também que os meses de
maio e junho apresentaram maiores valores percentuais de teor de água no solo, sendo
que nesses meses observou-se um menor teor de óleo essencial. Já onde houve uma
menor disponibilidade de água no solo, foi observado um maior teor de óleo essencial
(Figura 37; p.61). Os resultados obtidos com relação à secagem das folhas também se
assemelham aos estudos feitos por De BARROS et al. (2009), onde o maior teor de óleo
essencial de Lippia alba (Mill.) N. E. Brown (Verbenaceae) foi obtido nas estações
com menor índice de precipitação e quando as temperaturas médias se mantiveram
elevadas.
P á g i n a | 6 0
Figura 35: Rendimento (%) do óleo essencial das folhas frescas e secas de H. speciosa.
Figura 36: Dados de precipitação totale média das temperaturas máxima e mínima do município de São Cristóvão fornecidos pela Empresa de Desenvolvimento Agropecuário de Sergipe (EMDAGRO) e pelo Sistema de Monitoramento Agrometeorológico (AGRITEMPO), respectivamente.
0,33
0,38
0,42
0,29
0,15
0,26
0,32
0,11
0,19
0,46 0,46
0,53
0,390,37
0,44
0,26
0,13
0,22
0,29
0,1
0,15
0,51
0,45
0,49
jan/09 fev/09 mar/09 abr/09 mai/09 jun/09 jul/09 ago/09 set/09 out/09 nov/09 dez/09
Folhas Frescas Folhas secas
P á g i n a | 6 1
Figura 37: Percentagem de teor de água no solo nos meses de 2009 no município de São Cristóvão, fornecidos pelo Sistema de Monitoramento Agrometeorológico (AGRITEMPO).
Os nossos resultados mostraram uma variação significativa nas percentagens dos
principais constituintes do OE das folhas de H. speciosa com relação ao tempo de
secagem, tendo-se uma inversão dos componentes majoritários. Nos meses de fevereiro
e março de 2009, onde foram observadas temperaturas consideravelmente elevadas
(32,6 ºC e 33,0 ºC, respectivamente) houve uma maior percentagem do (Z)-3-hexenol
(composto majoritário encontrado no OE das folhas frescas) (76,72±1,53 e 78,45±7,75,
respectivamente) (Figura 38; p.62). Enquanto que no OE das folhas secas, o geraniol
(composto majoritário) obteve maiores percentagens nos meses de março e maio
(45,14±0,95 e 46,56±2,67, respectivamente) (Figura 39; p.62). A volatilização do (Z)-
3-hexenol durante a secagem provavelmente foi o fator responsável por seu baixo
conteúdo frente aos constituintes das folhas secas.
2,3 0,4 0,4
15,6
61,1
51,1
20,7
8,14,4
1,4 0,33,7
jan/09 fev/09 mar/09 abr/09 mai/09 jun/09 jul/09 ago/09 set/09 out/09 nov/09 dez/09
teor de água no solo %
P á g i n a | 6 2
Figura 38: Percentagens relativas do (Z)-3-hexenol nas folhas frescas e secas de H.
speciosa.
Figura 39: Percentagens relativas do geraniol nas folhas frescas e secas de H.
speciosa.
A influência da sazonalidade na composição química dos óleos essenciais varia
de acordo com a espécie. RANDRIANALIJAONA et al. (2005) avaliaram a influência
da sazonalidade na composição química do óleo essencial de Lantana camara L.
(Verbenaceae) coletadas em Madagascar e constatou que, ao longo do ano, a
70,8776,72 78,45
67,89
60,54
46,81
70,0965,44
50,94
62,06 61,33 62,83
14,9119,15
11,97 10,717,2
12,7717,34 17,46 14,66 12,75 10,86 10,24
jan/09 fev/09 mar/09 abr/09 mai/09 jun/09 jul/09 ago/09 set/09 out/09 nov/09 dez/09
Folhas frescas Folhas secas
1,04 2,57 2,63 1,45
10,9612,8
4,09
10,61
4,54 3,316,78
2,32
28,06
43,14
46,56
34,65
44,14
29,98
37,28
30,628,76
25,67
29,61
35,41
jan/09 fev/09 mar/09 abr/09 mai/09 jun/09 jul/09 ago/09 set/09 out/09 nov/09 dez/09
Folhas frescas Folhas secas
P á g i n a | 6 3
composição química do óleo permaneceu estável. Entretanto, estudos sobre óleo
essencial das folhas e cascas do tronco de Aniba canelilla (Kunth) Mez. (Lauraceae)
demonstraram grande influência da sazonalidade [TAVEIRA et al., 2003], onde dos
constituintes majoritários no período chuvoso, o 1-nitro-2-feniletano atingiu valores
próximos a 95%, enquanto que o metileugenol permaneceu abaixo de 18%. Pelo
contrário, no período seco o 1-nitro-2-feniletano decresceu para 39%, enquanto que o
metileugenol atingiu 45%. De maneira semelhante, os óleos de Lippia Alba (Mill.) N. E.
Brown (Verbanaceae) sofreram influência de fatores ambientais relacionados a
diferentes épocas do ano [SILVA et al., 2006].
A análise de agrupamento (cluster analysis) é uma ferramenta excelente para
análise preliminar de dados, sendo útil para determinar a semelhança entre objetos e
identificar amostras anômalas. Esta análise foi realizada através de duas etapas: na
primeira etapa foi gerada uma matriz de distância (dissimilaridade) entre os indivíduos e
na segunda, foi aplicado um algoritmo de agrupamento na matriz que identifica e reúne
grupos homogêneos, os quais podem ser visualizados em forma de dendrograma. Para a
análise foi utilizada a distância euclidiana, pois é a medida de dissimilaridade mais
utilizada para calcular distância genética, sendo sensível às correlações e restrita a
variáveis independentes.
Através da análise multivariada, foram definidos dois grupos classificados e
agrupados de acordo com a composição química e diferenciados pela análise de
agrupamento nos 12 meses de colheita (Figura 40; p.64).
Considerando as dissimilaridades na composição química dos óleos, os
agrupamentos foram subdivididos como Grupo I: Folhas Frescas (G-I) e Grupo II:
Folhas Secas (G-II). Este primeiro foi caracterizado por apresentar maiores
percentagens relativas de (Z)-3-hexenol (G-I: 65,33%; G-II: 15,42%). O Grupo II foi
caracterizado principalmente por apresentar maiores valores percentuais de geraniol (G-
I: 5,09%; G-II: 32,49%).
P á g i n a | 6 4
Figura 40: Dendograma representando a relação de dissimilaridade da composição
química das folhas frescas (F) e secas (S) de H. speciosa coletadas durante o ano de
2009.
Os dados quantitativos da composição química do óleo essencial das folhas
frescas (Figura 41; p.65) e secas (Figura 42; p.66) de H. speciosa foram submetidos à
Análise de Componentes Principais (ACP). A percentagem de informação dos dados
originais das amostras do óleo essencial das folhas frescas, obtida após ACP foi de
34,14% no primeiro componente principal (CP-1), que está positivamente relacionado
ao (Z)-3-hexenol (r = 0,84), antranilato de metila (r = 0,50) e 1-hexenol (r = 0,42) e
relaciona-se negativamente ao hexanal (r = -0,87), trans-óxido de linalol (furanóide; r =
-0,84), e geraniol (r =-0,47). Nas amostras de óleo extraído das folhas secas, o
componente principal primário representa 31,35% das informações e está ligado
positivamente ao 1-hexanol (r = 0,78), geraniol (r = 0,64) e (E)-2-hexenal (r = 0,58). Já
os compostos cis-óxido de linalol (piranóide; r = -0,91), α-terpineol (r = -0,85) e álcool
feniletílico (r = -0,82), projetam-se negativamente ao componente principal primário.
SET F
NOV FJUN F
OUT FJAN F
FEV FMAR F
MAI FJUL F
AGO FABR F
DEZ FAGO S
MAR SJUL S
JAN SDEZ S
FEV SMAI S
SET S
OUT SNOV S
ABR SJUN S
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Dissimilaridade
Dendrograma
P á g i n a | 6 5
O componente principal secundário (CP-2) explica 14,41% e 22,22% das
informações totais nas amostras do óleo essencial das folhas frescas e secas,
respectivamente. Neste primeiro grupo de amostra, o CP-2 está positivamente ligado ao
cis-óxido de linalol (piranóide; r = 0,47), benzenoacetaldeído (r = 0,45) e cis-óxido de
linalol (furanóise; r = 0,43); e negativamente ligado ao (2E, 4E)-hexadienal (r = -0,68),
(Z)-2-hexenol (r = -0,66) e eugenol (r = -0,65). Já nas amostras do óleo essencial das
folhas secas, o CP-2 está positivamente ligado ao trans-óxido de linalol (furanóide; r =
0,79), cis-óxido de linalol (furanóide; r = 0,65) e hexanal (r = 0,59) e negativamente
ligado ao (Z)-2-hexenol (r = -0,90), (E)-2-decenal (r = -0,82) e benzenoacetaldeído (r =
-0,66).
Figura 41: Dispersão dos percentuais dos constituintes químicos do óleo essencial das
folhas frescas de H. speciosa pelos CP-1 e CP-2.
Análise dos Componentes Principais (ACP)
(Z)-2-Penten-1-ol
Hexanal
(E)-2-HexenalFurfural
(Z)-3-Hexenol
(Z)-2-Hexenol
1-Hexanol
(2E, 4E)-Hexadienal
6-metil, 5-hepten-2-ona
Benzenoacetaldeídocis-óxido de linalol (furanóide)
trans-óxido de linalol (furanóide)
LinalolÁlcool feniletílico
cis-óxido de linalol (piranóide)
trans-óxido de linalol (piranóide)
Salicilato de metila
a-Terpineol
Geraniol
Antranilato de metila(E)-2-Decenal
Eugenol
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
CP-1: 34,14%
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
CP
-2: 1
4,41
%
(Z)-2-Penten-1-ol
Hexanal
(E)-2-HexenalFurfural
(Z)-3-Hexenol
(Z)-2-Hexenol
1-Hexanol
(2E, 4E)-Hexadienal
6-metil, 5-hepten-2-ona
Benzenoacetaldeídocis-óxido de linalol (furanóide)
trans-óxido de linalol (furanóide)
LinalolÁlcool feniletílico
cis-óxido de linalol (piranóide)
trans-óxido de linalol (piranóide)
Salicilato de metila
a-Terpineol
Geraniol
Antranilato de metila(E)-2-Decenal
Eugenol
P á g i n a | 6 6
Figura 42: Dispersão dos percentuais dos constituintes químicos do óleo essencial das
folhas secas de H. speciosa pelos CP-1 e CP-2.
Análise dos Componentes Principais
(Z)-2-Penten-1-ol
Hexanal
(E)-2-Hexenal
Furfural
(Z)-3-Hexenol
(Z)-2-Hexenol
1-Hexanol
(2E, 4E)-Hexadienal
6-metil, 5-hepten-2-ona
Benzenoacetaldeído
cis-óxido de linalol (furanóide)
trans-óxido de linalol (furanóide)
Linalol
Álcool feniletilico
-óxido de linalol (piranóide)
-óxido de trans-linalol (piranóide)
Salicilato de metilaa-Terpineol
GeraniolAntranilato de metila
(E)-2-Decenal
Eugenol
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
CP-1: 31,35%
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0C
P-2
: 22,
22%
(Z)-2-Penten-1-ol
Hexanal
(E)-2-Hexenal
Furfural
(Z)-3-Hexenol
(Z)-2-Hexenol
1-Hexanol
(2E, 4E)-Hexadienal
6-metil, 5-hepten-2-ona
Benzenoacetaldeído
cis-óxido de linalol (furanóide)
trans-óxido de linalol (furanóide)
Linalol
Álcool feniletilico
cis-óxido de linalol (piranóide)
trans-óxido de trans-linalol (piranóide)
Salicilato de metilaa-Terpineol
GeraniolAntranilato de metila
(E)-2-Decenal
Eugenol
P á g i n a | 6 7
5. CONCLUSÕES
Os estudos realizados sobre os componentes voláteis das folhas de H. speciosa
nos permitiram observar mudanças na composição química e nas percentagens relativas
de alguns componentes. Com relação ao tempo de secagemverificou-se um aumento
significativo nas percentagens relativas de alguns monoterpenos oxigenados como α-
terpineol (0,08±0,20 - 3,89±1,78 nas folhas frescas e 0,93±0,03 - 5,21±0,65 nas folhas
secas), linalol (2,95±1,45 - 12,46±2,24 nas folhas frescas e 2,78±1,08 - 17,16±2,83 nas
folhas secas), geraniol (1,04±0,34 - 12,80±1,23 nas folhas frescas e 25,67±6,45-
46,56±4,67 nas folhas secas) nas folhas secas, assim como um decréscimo nas
percentagens de alcoóis como (Z)-3-hexenol (46,81±3,27 - 78,45±7,75 nas folhas
frescas e 10,70±4,87 - 19,15±4,28 nas folhas secas), 1-hexanol (1,65±0,33 - 10,15±0,80
nas folhas frescas e 0,07±0,05 - 4,59±1,55 nas folhas secas).
Os dados meteorológicos de índice de precipitação total, temperatura e teor de
água no solo (Figuras 36-37; p.60-61), nos permitiram analisar a variação no teor e nas
percentagens relativas dos componentes voláteis do óleo essencial da mangabeira, onde
observou-se que os teores de óleo essencial foram superiores na estação seca em relação
à estação chuvosa. Nos meses onde foram observadas temperaturas consideravelmente
elevadas houve uma maior percentagem do (Z)-3-hexenol nas folhas frescas.
A análise multivariada nos permitiu verificar a presença de 2 grupos distintos na
análise da composição química do óleo essencial das folhas de H. speciosa: G-I (folhas
frescas) e G-II (folhas secas), sendo caracterizados por seus constituintes majoritários
((Z)-3-hexenol e geraniol, respectivamente). A análise dos Componentes Principais
(ACP) nos permitiu observar a alta correlação dos compostos majoritários [(Z)-3-
hexenol (r = 0,84), geraniol (r = 0,64)] tantos das folhas frescas quanto das secas, com
seus respectivos componentes principais.
P á g i n a | 6 8
PARTE 2: ESTUDO FITOQUÍMICO DAS
FOLHAS E DOS RAMOS DE Hancornia
speciosa GOMES
P á g i n a | 6 9
PARTE 2: ESTUDO FITOQUÍMICO DAS FOLHAS E DOS RAMOS
DE Hancornia speciosa GOMES
1. CONSIDERAÇÕES GERAIS
O uso de espécies vegetais para tratamento e cura de doenças remonta ao início da
civilização, desde que o homem aprendeu a manusear e modificar os produtos naturais
para o próprio benefício. Esta prática milenar ultrapassou todas as barreiras e obstáculos
durante o processo evolutivo e chegou até os dias atuais, sendo amplamente utilizada
por grande parte da população mundial, como fonte eficaz de recurso terapêutico.
As espécies vegetais têm contribuído de forma significativa para o fornecimento
de metabólitos secundários, muitos destes de grande valor agregado devido às suas
aplicações como medicamentos, cosméticos, alimentos e agroquímicos. Vários desses
metabólitos constituem-se em modelos para o desenvolvimento de medicamentos
sintéticos modernos ou de fármacos imprescindíveis. A busca de novas substâncias
bioativas em plantas é a esperança mais concreta para a cura de diversos males e um dos
caminhos mais promissores para a criação de novos medicamentos [PINTO et al.,
2002].
É característica dos vegetais a elevada capacidade biossintética desses
metabólitos secundários, tanto em relação ao número como a diversidade em uma
mesma espécie. Assim por serem fatores de interação entre organismos, os metabólitos
secundários, frequentemente, apresentam atividades biológicas interesantes. Pelo
elevado número e grande diversidade desses metabólitos eles têm despertado interesse
de pesquisadores de vários campos da ciência que vêem neles uma promissora fonte de
novas moléculas potencialmente úteis aos homens [MACHADO, 2007].
Em geral, alguns órgãos de plantas, principalmente as folhas, são recobertos
externamente por uma camada fina de cera, que desempenha grande importância
biológica nas relações entre planta e meio ambiente em que esteja inserida. Por
P á g i n a | 7 0
definição, ceras cuticulares são substâncias hidrofóbicas da superfície das plantas, que
podem ser removidas por uma breve imersão em solvente orgânico, como clorofórmio e
hexano. Elas são misturas complexas de compostos de cadeias longas (>C18), tais como
ácidos graxos, hidrocarbonetos, álcoois, aldeídos, cetonas, ésteres e compotos fenólicos
[SILVA, 2007].
1.1. Triterpenos
Os triterpenos (C30) apresentam diversas propriedades medicinais, destacando-se
os efeitos antiinflamatórios, analgésicos, cardiovasculares e antitumorais e são baseados
em seis unidades de isopreno e biossinteticamente são derivados de esqualeno [CSEKE
et al., 2006], um composto que foi isolado pela primeira vez do fígado de tubarão, e
posteriormente encontrado também no fígado de ratos, em fungos e óleos de sementes
de Amarantáceas. A cadeia de 30 carbonos do esqualeno é formada a partir da
condensação de duas unidades de pirofosfato de farnesila (FPP) e envolve a enzima
esqualeno-sintase. A condensação requer a remoção de dois grupos fosfato e a adição de
um hidreto proveniente de NADPH na posição C-1. Um intermediário desse processo é
o pirofosfato de pré-esqualeno, isolado do fígado de rato cuja formação é representada
como um ataque da ligação dupla (C2’-C3’) de uma molécula de FPP e posterior
formação de um cátion terciário, seguida da perda de um hidrogênio e formação do anel
do ciclopropano, originando o pirofosfato de pré-esqualeno. O cátion ciclobutano é um
intermediário formado a partir da perda de um difosfato de pré-esqualeno gerando assim
um cátion primário desfavorável, que via rearranjo de Wagner-Meerwin causa a
expansão do anel e gera um carbocátion secundário. Por fim, a ligação entre C-1 e C-3’
é rompida e um hidrogênio vindo do NADPH é adicionado em C-1 finalizando-se
assim, a formação do esqualeno (Figura 43; p.72). A formação de sistemas de anéis
triterpênicos cíclicos a partir do esqualeno inicia-se com a oxidação do composto
isoprenóide a esqualeno-2,3-epóxido. O anel epóxido é rompido pela ação de prótons
formando o grupo hidroxila no carbono 3 e uma carga positiva no carbono 2. O 3-
hidroxi-esqualeno formado cicliza-se espontaneamente. O número e a conformação dos
anéis formados dependem das dobras da cadeia do esqualeno. O cátion esteróide sofre
P á g i n a | 7 1
rearranjo de Wagner-Meerwein alargando o anel. Depois fecha-se um anel adicional
seguido de rearranjamento de Wagner-Meerwein, em que novamente ocorre
alargamento construindo o anel. Esta estrutura, cátion lupenil, é o material de partida
para a síntese dos triterpenos pentacíclicos das séries lupano, friedelano, oleano e ursano
por eliminação de prótons. A ciclização do esqueleno também origina o triterpeno
lanosterol, que leva a formação dos esteróides (C27), ou seja, os triterpenos modificados
contendo o anel tetracíclico do sistema lanosterol após a perda a perda dos grupos
metila das posições C-4 e C-14 [DEWIK, 2009; CABRAL, 2000].
P á g i n a | 7 2
PPO
1'
2'
3'
1
FPP
Cátion alílico
FPP
H HOPP
E1
H OPP
H
H
H
N ADPH
HH
Pirofosfato de pré-esqualeno
Esqualeno
1' 2'
31
- H
Figura 43: Representação esquemática da biossíntese de triterpenos. E1=Esqualeno-
sintase. NADPH=Nicotinamida adenina dinucleotídeo-P [DEWIK, 2009; CABRAL,
2000].
P á g i n a | 7 3
CONTINUAÇÃO DA FIGURA 43.
HH
HO
HO
H
H
H
H
HO
H
H
H
HO
H
H
H
HO
H
H
H
HO
H
H
H
Cátion Lupenil
Lanosterol
Cátion esteróide
O2
NADPH
A betulina, o ácido betulínico e o lupeol (Figura 44; p.75), são exemplos de
triterpenos pertencentes à classe dos lupanos. A betulina é o triterpeno mais abundante
na natureza, também é o precursor na biossíntese do ácido betulínico, o composto
biologicamente mais ativo deste grupo. Estes compostos têm apresentado várias
P á g i n a | 7 4
atividades biológicas, entre as quais, vale destacar, a atividade antiinflamatória
[CABRAL, 2000].
Em trabalhos de GEETHAT & VARALAKSHMI (2001), o lupeol e o seu éster,
linoleato de lupeloíla, são citados como sendo os responsáveis pelas atividades:
antiinflamatória, antinoceptiva, antipirética e anti-ulcerogênica. No trabalho em questão
tais compostos foram comparados com o fármaco indometacina (um medicamento
antiinflamatório não esteróide usado no tratamento contra artrite), como controle,
mostrando que os mesmos possuem efeito similar ao que é produzido por esta droga.
Em estudos realizados por SAMPAIO (2008) foi observado o isolamento de uma
mistura de triterpenos contendo lupeol, α-amirina e β-amirina e ésteres 3-β-O-acil
lupeol. Já nos estudos feitos por MACHADO (2007) pôde-se observar o isolamento do
lupeol a partir do extrato etanólico das folhas frescas de Euphorbia tirucalli L., onde
pôde ser identificado pelo seu espectro de massas. O espectro mostrou um pico em m/z
426, que corresponde ao pico do íon molecular. Foram observados outros picos que são
típicos de triterpenos pentacíclicos, principalmente os de maiores intensidades como m/z
218, m/z 207, m/z 203 e m/z 189 (Figura 45; 76)
P á g i n a | 7 5
OH
HO
H
H
HH
COOH
HO H
H
HH
HO
H
H
HH
Betulina Ácido betulínico
Lupeol
Figura 44: Estruturas químicas da betulina, ácido betunílico e lupeol.
P á g i n a | 7 6
HO
H
H
HH
HO
- H2O- CH3
RDA RDA
m/z 426
m/z 207 m/z 218
m/z 189 m/z 203
Figura 45: Esquema de fragmentação do lupeol.
P á g i n a | 7 7
2. OBJETIVOS
Nesta parte do trabalho objetivamos isolar e identificar os metabólitos
secundários presentes no extrato metanólico das folhas e no extrato hexânico dos ramos
de H. speciosa.
P á g i n a | 7 8
3. METODOLOGIA
3.1. ISOLAMENTO DOS METABÓLIOS SECUNDÁRIOS DAS FOLH AS E DOS
RAMOS DE H. SPECIOSA
3.1.1. Equipamentos
(a) INFRAVERMELHO
Os espectros de absorção na região do Infravermelho foram registrados em um
espectrofotômetro Biorad, modelo FTS-3500 GX com transformada de Fourier
utilizando-se pastilhas comprimidas de brometo de potássio anidro (KBr), pertencente
ao Departamento de Química, Setor de Ciências Exatas, Universidade Federal do
Paraná (DQ-UFPR).
(b) RMN 1H e 13C
Os espectros de RMN 1H e 13C (totalmente desaclopado) unidimensionais das
frações HSF1 e HSF7 foram obtidos em um espectrômetro Brucker, modelo DRX400
de 9,4 Tesla (T), observando 1H a 400 MHz e 13C a 100 MHz, pertencente ao
Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos (DQ/UFSCar). Os
experimentos foram realizados a temperatura ambiente, sendo as amostras solubilizadas
em clorofórmio (CDCl3) deuterado, utilizando como referência interna o
tetrametilsilano (TMS). Os deslocamentos químicos (δ) são indicados em ppm e as
constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz).
Os espectros de ressonância magnética nuclear 1D para a subfração FV1 foram
registrados em um aparelho Brucker Avance 400, operando a 9,4 Tesla (T), observando 1H a 400MHz e 13C a 100 MHz, pertencente ao Departamento de Química da
P á g i n a | 7 9
Univesidade Federal do Paraná (DQ/UFPR). A amostra foi solubilizada em clorofórmio
deuterado (CDCl3), utilizando o tetrametilsilano (TMS) como padrão de referência
interna. Os deslocamentos químicos foram expressos em ppm (δ) e as constantes de
acoplamento (J) foram registradas em Hertz (Hz).
(c) PONTO DE FUSÃO
Os valores das faixas de fusão,foram determinados em um aparelho digital da
Microquímica (Modelo MQAPF-301), pertencente ao Departamento de Química da
Universidade Federal de Sergipe (DQI/UFS). Os valores obtidos em graus centígrados
não foram corrigidos.
3.1.2. Obtenção dos extratos das folhas e dos ramos
Do extrato metanólico das folhas (EMF) (5,08 g) e extrato metanólico dos ramos
(EMR) (2,34 g) de H. speciosa, previamente preparado por SAMPAIO (2008)
(Fluxograma 3; p.80), foram obtidos oito extratos a partir da extração líquido-líquido
com solventes de polaridades distintas (Tabela 3; p.81) utilizando a metodologia
modificada de SAMPAIO (2008) (Fluxograma 4; p.81).
P á g i n a | 8 0
Fluxograma 3: Metodologia utilizada por SAMPAIO (2008) para obtenção dos extratos
metanólico e hexânico das folhas e dos ramos de H. speciosa.
Extrato hexânico das folhas (EHF; 13,1 g) e extrato hexânico dos ramos (EHR; 6,5 g)
Posteriormente foram imersos separadamente em metanol (1,0 L)
Folhas (301,9 g) e ramos (235,4 g) de H. speciosa secas em estufa à 40°C (48 h)
As folhas e os ramos foram triturados e imersos separadamente em hexano (1,0 L)
Extrato metanólico das folhas (EMF; 34,3 g) e extrato metanólico dos ramos (EMR; 28,6 g)
P á g i n a | 8 1
1-MeOH/Água(8:2)
2-(3x100 mL) Hexano
1-40% do volume de H2O
2-(3x100 mL) CH2Cl2
1-Evaporador Rotatório
2-(3x100 mL) AcOEt
1-(3x100mL) n-butanol
Fluxograma 4: Procedimento utilizado na obtenção dos extratos particionados das folhas e ramos de H. speciosa.
Tabela 3: Massas obtidas das partições dos respectivos extratos.
Solvente EMR EMF
Hexano 81,3 mg 388,0 mg
Diclorometano 355,7 mg 258,5 mg
Acetato de Etila 330,8 mg 179,9 mg
Butanol 1028,6 mg 274,7 mg
EMF(5,08 g) e EHR (2,34 g)
Extrato Diclometano
Extrato Hidroalcóolico
Extrato Hidroalcóolico Extrato Hexânico
Extrato Acetato de etila
Extrato Hidroalcoólico Extrato Butanólico
Extrato Hidroalcóolico
P á g i n a | 8 2
3.1.3. Isolamento dos constituintes químicos das folhas e dos ramos
(a) Extrato metanólico das folhas (EMF) – Partição hexânica
A partição hexânica do EMF (388 mg) foi submetida a uma coluna
cromatográfica (CC) em sílica-gel (6,98 g), à pressão ambiente. A eluição da coluna
iniciou-se com 100 % de hexano, aumentando-se a polaridade do eluente pela adição de
proporções crescentes de acetato de etila e finalizando com metanol (Tabela 5; p.83).
Foram coletadas 79 frações (5 mL cada), posteriormente reunidas em 9 grupos (Tabela
4; p.82), com base nos seus respectivos valores de RFs (fatores de retenção), quando
analisadas por CCDA (Cromatografia em Camada Delgada Analítica) empregando-se
cromatofolhas de alumínio (20x20 cm) recobertas com sílica gel com indicador de
flurorescência em UV254 e 366 nm, da marca Macherey-Nagel. A revelação das substâncias
presentes nas placas cromatográficas foi feita por irradiação em lâmpada de UV254 e 366
nm, onde as placas foram mergulhadas a uma solução de p-anisaldeído (álcool etítilo
absoluto, ácido sulfúrico, p-anisaldeído e ácido acético na proporção de 90:5:5:1) e
subsequente aquecimento com uma pistola aquecedora (Fluxograma 5; p.84).
Tabela 4: Frações reunidas da partição hexânica do EMF.
Código Frações Massa (mg) Característica morfológica
FH1 1 – 16 5,3 Sólido branco amorfo
FH2 17 – 27 12,7 Sólido branco amorfo
FH3 28 – 32 6,0 Sólido branco amorfo
FH4 33 – 36 4,5 Sólido branco amorfo
FH5 37 – 43 19,2 Sólido branco cristalino
FH6 44 – 46 1,2 Sólido branco amorfo
FH7 47 - 48 5,0 Óleo verde
FH8 49 - 58 8,7 Óleo verde
FH9 59 - 79 11,4 Óleo verde
P á g i n a | 8 3
Tabela 5: Valores percentuais do gradiente utilizado na eluição da coluna.
Frações Reunidas Gradiente
1-11 100% hexano
12-22 1%
23-33 2%
34-44 5%
45-55 10%
56-66 20%
67-77 50%
A fração 37-43 (FH5; 19,2 mg) foi purificada em uma coluna de sílica gel,
obtendo-se a subfração FV1 (sólido branco cristalino; 15,1 mg). A subfração FV1 (p.f.:
155,6-158,3 °C; sólido branco cristalino; 15,1 mg) obtida da partição hexânica do EMF
foi analisada por IV e RMN de 1H e 13C.
P á g i n a | 8 4
Partição Líquido-líquido
Fluxograma 5: Processo de purificação da subfração FV1 da partição hexânica do
EMF de H. speciosa.
Extrato metanólico das folhas de H. speciosa (5,08 g)
Partição hexânica (388,0 mg)
CC em sílica gel (9 frações reunidas)
A fração 37-43 (FH5; 19,2 mg) foi purificada em uma coluna de sílica gel, obtendo-se a subfração FV1
(sólido branco cristalino; 15,1 mg)
A subfração FV1 foi enviada para análise em IV, RMN 13C e 1H
P á g i n a | 8 5
(b) Extrato Hexânico dos Ramos (EHR)
Parte do extrato hexânico dos ramos de H. speciosa (2,50 g) foi purificada
utilizando-se cromatografia em coluna empacotada com sílica gel (110 g), sob as
mesmas condições realizadas no procedimento anterior. A eluição da coluna iniciou-se
com 100% de hexano, aumentando-se a polaridade do eluente pela adição de proporções
crescentes de acetato de etila e finalizando-se com metanol (Tabela 7; p.86;
Fluxograma 6; p.87). Foram coletadas 350 frações (5 mL cada), posteriormente
reunidas em 13 grupos (Tabela 6; p.85), com base nos respectivos valores de RFs,
quando analisadas por CCDA. As frações 1-137 (HSF1; 21,1 mg; p.f.: 54,8-56,2 °C) e
199-215 (HSF7; 157,2; p.f.: 49,1-51,7 °C) obtidas do EHR foram analisadas por IV e
RMN de 1H e 13C.
Tabela 6: Frações reunidas da partição hexânica do EMF.
Código Frações Massa (mg) Característica morfológica
HSF1 1 – 137 21,1 Cera esbranquiçada
HSF2 138 – 166 54,5 Sólido branco amorfo
HSF3 167 – 175 5,9 Sólido branco amorfo
HSF4 176 – 182 4,5 Sólido branco amorfo
HSF5 183 – 190 31,9 Sólido branco cristalino
HSF6 191 – 198 90,9 Sólido branco amorfo
HSF7 199 – 215 157,2 Sólido branco cristalino
HFS8 216 – 221 8,7 Sólido branco amorfo
HSF9 222 – 239 201,2 Sólido branco amorfo
HSF10 240 – 248 17,6 Sólido branco amorfo
HSF11 249 – 277 12,3 Sólido branco amorfo
HSF12 278 – 296 63,8 Óleo verde
HSF13 297 – 350 67,8 Óleo verde
P á g i n a | 8 6
Tabela 7: Valores percentuais do gradiente utilizado na eluição da coluna.
Frações Reunidas Gradiente
1-30 100% hexano
31-60 1%
61-96 2%
97-114 3%
115-156 4%
157-178 5%
178-198 10%
199-237 15%
238-277 20%
278-296 30%
297-332 40%
333-350 50%
P á g i n a | 8 7
Fluxograma 6: Processo de purificação das frações HSF1 e HSF7 do EHR de H.
speciosa.
3.1.4. Identificação por CG/EM da mistura de hidrocarbonetos presentes
na fração HSF1
Os hidrocarbonetos foram identificados através de CG/EM empregando-se um
cromatográfo Shimadzu-QP5050A equipado com coluna capilar de sílica fundida DB-5
(30 m x 0,25 mm x 0,25 µm). A temperatura da coluna foi programada de 260ºC (2
min) aumentando para 320°C a 10°C/min, permanecendo estável nessa temperatura por
7 minutos. As temperaturas do injetor e detector foram 250ºC e 280ºC, respectivamente.
O gás de arraste foi o Hélio (1,2 mL/min). O volume de injeção foi de 0,5 µL. O
espectrômetro de massas operou com velocidade de 0,50 scan.seg-1 na faixa de m/z 40-
600.
Extrato hexânico dos ramos de H. speciosa (2,50 g)
CC em sílica gel (13 frações reunidas)
As frações 1-137 (HSF1; 21,1 mg) e 199-215 (HSF7; 157,2 mg) foram enviadas para análise em IV, RMN
13C e 1H
P á g i n a | 8 8
A identificação dos compostos foi feita com base na comparação
computadorizada dos espectros de massas adquiridos com aqueles armazenados no
banco de dados de espectro de massas do sistema CG/EM (NIST107, NIST21 e
WILEY8) e com outros espectros de massas da literatura [ADAMS, 2007].
3.1.5. Reação de transterificação e identificação por CG/EM dos ésteres 3-
β-O-acil lupeol (HSF7)
Parte da mistura contendo os ésteres 3-β-O-acil lupeol (50,0 mg) foi aquecida à
60 °C sob agitação em 10% HCl/MeOH (3mL) por 8h. Após resfriamento, a solução foi
extraída com CH2Cl2 (3x10 mL). A fase orgânica foi lavada inicialmente com solução
NaHCO3 10% e depois com H2O, seca com Na2SO4 anidro e concentrada em
evaporador rotatório fornecendo lupeol e uma mistura de ésteres metílicos os quais
foram analisados por CG/EM (Figura 46; p.88).
O
H
H
HH
OR1
n
R1= H; OH
n
+
HCl/MeOH
60°C
OMe
OR1
HO
H
H
HH
Figura 46: Reação de metanólise ácida dos ésteres 3-β-O acil lupeol (HSF7).
P á g i n a | 8 9
Os ésteres 3-β-O-acil lupeol foram identificados através de CG-EM empregando-
se um cromatográfo Shimadzu-QP5050A equipado com coluna capilar de sílica fundida
DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm). A temperatura da coluna foi programada de 80 ºC
(2 min) aumentando para 270 °C a 15 °C/min, permanecendo por 15 min. As
temperaturas do injetor e detector foram 250 ºC e 280 ºC, respectivamente. O gás de
arraste foi o Hélio (1,2 mL/min). O volume de injeção foi de 0,5 µL. O espectrômetro
de massas operou com velocidade de 0,50 scan.seg-1 na faixa de m/z 40-550.
A identificação dos compostos foi feita com base na comparação
computadorizada dos espectros de massas adquiridos com aqueles armazenados no
banco de dados de espectro de massas do sistema CG-EM (NIST107, NIST21 e
WILEY8) e com outros espectros de massas da literatura [ROUT et al., 2005; TAKACS
et al., 2001; ZHAO et al., 2006].
P á g i n a | 9 0
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DE HANCORNIA SPECIOSA GOMES
4.1.1. Elucidação estrutural da fração FV1
A fração FV1 foi obtida a partir do fracionamento por cromatografia em coluna
da partição hexânica do EMF de H. speciosa e apresentou-se como um sólido branco
cristalino (15,1 mg), solúvel em clorofórmio e acetato de etila.
Pela análise do espectro de absorção na região do infravermelho (IV) (Figura 47;
p.93), observaram-se as bandas referentes ao estiramento da ligação O-H emν3375 cm-
1; ao estiramento da ligação C-H de grupos metílicos e metilênicos na região de
absorção entre ν2944 cm-1 eν2853 cm-1.
Pela análise do espectro de RMN 1H (Figuras 48-51; p.94-97; Tabela 8; p.91)
observou-se a presença de seis singletos referentes às metilas de esqueleto lupânico em
δ 0,78; 0,83; 0,97; 1,03; 0,95; 0,80 ppm, correspondentes às metilas angulares em C-23,
C-24, C-25, C-26, C-27, C-28, respectivamente, e um singleto em δ 1,68 ppm
correspondendo à metila vinílica em C-30 (Figura 48; p.94). A presença de um
multipleto em δ 3,24-3,17 ppm, refere-se ao hidrogênio carbinólico em C-3 (Figura 49;
p.95). A presença de um triplo dubleto em δ 2,38 ppm refere-se ao hidrogênio do C-19
(Figura 50; p.96). Os hidrogênios da posição C-29 (dupla terminal) foram evidenciados
pela presença de um duplo dubleto em δ 4,57 ppm (1H, J= 2,3 e 1,3 Hz) referente ao H-
29a, e um dubleto em δ 4,69 ppm (1H, J= 1,2 Hz) referente ao H-29b (Figura 51;
p.97). Foram observados 2 tripletos de hidrogênios vinílicos centrados em δ 5,18 ppm
(1H, J= 3,6 Hz) e δ 5,12 ppm (1H, J= 3,5 Hz), atribuídos a hidrogênios ligados a
carbonos olefínicos de esqueleto ursano e oleano, respectivamente.
P á g i n a | 9 1
Em relação ao espectro de RMN 13C totalmente desacoplado (Figuras 52-54;
p.98-100; Tabela 8; p.91), foram observados característicos para estes triterpenos em: δ
145,1 ppm e δ 121,7 ppm para oleanos; em δ 139,6 ppm e δ 124,4 ppm para ursanos.
Além disso, foram observados sinais em δ 19,3 ppm relativo ao grupo metila ligado a
carbono sp2 de esqueleto lupânico. Sinais em δ 79,0; 47,7; 151,0; 109,3 ppm referentes
aos carbonos C-3, C-19, C-20 e C-29 respectivamente, comprovando com mais precisão
a presença de um triterpeno.
Tabela 8: Comparação dos dados de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) e 13C (CDCl3, 100
MHz) das substâncias isoladas da fração FV1 com os dados obtidos na literatura [De
SOUZA et al., 2001; SAMPAIO, 2008].
Carbono 13C(ppm) 1H (ppm) 13C(ppm)Lit 1H (ppm)Lit
1 38,7 38,7 --
2 27,4 27,4 --
3 79,0 (sinal lupânico) 3,24-3,17 78,9 3,25-3,18
4 38,8 38,8 --
5 55,3 55,3 --
6 18,3 18,3 --
7 34,3 34,2 --
8 40,7 40,8 --
9 50,5 50,4 --
10 37,2 37,1 --
11 20,9 20,9 --
12 124,4 5,12 124,4 5,13
13 139,6 139,5 --
14 42,9 43,0 --
15 27,4 27,4 --
16 35,6 35,5 --
17 42,9 42,9 --
18 48,3 48,2 --
19 47,7 (sinal lupânico) 2,38 47,9 2,38
20 151,0 (sinal lupânico) 150,9 --
P á g i n a | 9 2
21 29,8 29,8 --
22 39,6 40,0 --
23 28,0 0,78 28,0 0,77
24 15,4 0,83 15,4 0,84
25 16,2 0,97 16,1 0,97
26 15,7 1,03 15,9 1,02
27 14,6 0,95 14,5 0,95
28 18,0 0,80 18,0 0,80
29a 109,3 (sinal lupânico) 4,57 109,3 4,57
29b 109,3 4,69 109,3 4,69
30 19,3 1,68 19,3 1,69
P á g i n a | 9 3
Figura 47: Espectro de absorção na região do infravermelho (IV) (pastilha de KBr) da fração FV1 isolada da partição hexânica do EMF de H. speciosa.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
60
70
80
90
100
110
120
130
110711
88
1013
880
1042
1380
1456
1600
1638
2360
2871
2853
2944
3375
Tra
nsm
itânc
ia (
%)
Número de onda (cm-1)
P á g i n a | 9 4
HO HO
HO
Figura 48: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da subfração FV1 isolada da partição hexânica do EMF de H. speciosa.
p p m ( f 1 )0 .01 .02 .03 . 04 . 05 .06 .07 .0
7.26
14
4.68
88
4.68
33
4.56
95
4.56
63
4.56
37
4.56
05
3.24
33
3.22
92
3.21
63
3.20
48
3.19
24
3.17
72
3.16
46
2.41
03
2.39
58
2.38
27
2.36
81
2.35
54
2.34
06
1.92
45
1.90
81
1.89
83
1.67
87
1.38
80
1.38
51
1.35
98
1.25
38
1.07
09
1.02
95
1.00
95
0.99
74
0.96
62
0.95
38
0.94
32
0.87
09
0.82
84
0.80
030.
7877
0.75
94-0
.000
5
0.99
0.99
1.74
1.19
4.85
48.07
49.82
P á g i n a | 9 5
Figura 49: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da subfração FV1 isolada da partição hexânica do EMF de H. speciosa.
p p m ( f1 )3 .1 2 53 .1 5 03 .1 7 53 .2 0 03 .2 2 53 .2 5 0
3.2
433
3.2
292
3.2
163
3.2
048
3.1
924
3.1
772
3.1
646
1.74
P á g i n a | 9 6
Figura 50: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da subfração FV1 isolada da partição hexânica do EMF de H. speciosa.
p p m ( f1 )2 .3 2 52 .3 5 02 .3 7 52 .4 0 02 .4 2 5
2.41
03
2.39
58
2.38
27
2.36
81
2.35
54
2.34
06
1.19
P á g i n a | 9 7
Figura 51: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da subfração FV1 isolada da partição hexânica do EMF de H. speciosa.
p p m ( f 1 )4 . 5 2 54 . 5 5 04 . 5 7 54 . 6 0 04 . 6 2 54 . 6 5 04 . 6 7 54 . 7 0 04 . 7 2 5
4.68
88
4.68
33
4.56
95
4.56
63
4.56
37
4.56
05
0.99
0.99
P á g i n a | 9 8
H O H O
H O
Figura 52: Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da fração FV1 isolada do EHR de H. speciosa.
p p m ( t1 )02 55 07 51 0 01 2 51 5 01 7 52 0 0
151.
03
124.
44
109.
35
79.0
4
77.3
6
77.0
4
76.7
3
59.0
9
55.3
2
50.4
7
48.3
3
48.0
2
47.7
4
43.0
4
42.8
6
41.5
6
40.8
6
40.0
4
39.7
0
39.6
4
38.8
1
38.7
3
38.6
1
38.0
8
37.1
7
35.6
1
34.3
1
32.9
6
31.2
9
29.8
8
29.7
4
28.7
9
28.1
3
28.0
2
27.4
5
27.3
1
26.6
5
25.1
723
.40
21.4
420
.96
19.3
418
.35
18.0
417
.51
16.1
616
.01
15.6
615
.41
14.5
8
P á g i n a | 9 9
Figura 53: Ampliação do espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da fração FV1 isolada do EHR de H. speciosa. p p m ( t1 )
3 2 .53 5 .03 7 .54 0 .04 2 .5
43.0
4
42.8
6
41.5
6
40.8
6
40.0
4
39.7
0
39.6
4
38.8
1
38.7
3
38.6
1
38.0
8
37.1
7
35.6
1
34.7
6
34.3
1
33.3
8
32.9
6
P á g i n a | 1 0 0
Figura 54: Ampliação do espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da fração FV1 isolada do EHR de H. speciosa.
p pm ( t1 )22 .525 .027 .530 .0
31.2
9
29.8
8
29.7
4
28.7
9
28.1
3
28.0
2
27.4
5
27.3
1
26.6
5
25.1
7
23.4
0
21.4
4
20.9
6
P á g i n a | 1 0 1
Com base nas análises de infravermelho (Figura 47; p.93) e RMN 1H (Figuras
48-51; p.94-97) e 13C (Figuras 52-54; p.98-100), foi comprovada que a elucidação
estrutural da fração FV1 indica a presença de uma mistura de triterpenos pertencente à
classe dos oleanos, ursanos e lupanos (α-amirina, β-amirina e Lupeol) (Figura 55).
HO HO
HO
Figura 55: Estruturas de triterpenos identificados da partição hexânica do extrato
metanólico das folhas de H. speciosa.
α-amirina β-amirina
Lupeol
P á g i n a | 1 0 2
3.1.2. Elucidação estrutural da fração HSF7
A fração HSF7, obtida através do fracionamento por coluna cromatográfica do
EHR de H. speciosa, apresentou-se como um sólido branco amorfo (157,2 mg), solúvel
em clorofórmio e acetato de etila.
Pela análise do espetro de absorção na região do infravermelho (IV) (Figura 56;
p.105), foram observadas bandas referentes à: O-H ν3504 cm-1; -CH3ν 2920 cm-1; -CH2
ν 2850 cm-1; carbonila de éster em ν 1730 cm-1; C=C ν 1705 cm-1 e (CH2)nν 721 cm-1.
Na análise dos sinais no espectro de RMN 1H (Figuras 57-60; p.106-109
Tabela 9; p.103) foi evidenciada a presença de sete singletos referentes às metilas de
esqueleto do tipo lupânico em δ 0,85; 1,03; 0,84; 0,88; 0,94; 0,79 ppm, correspondentes
às metilas angulares em C-23, C-24, C-25, C-26, C-27, C-28, respectivamente, e uma
metila em δ 1,68 ppm correspondendo à metila vinílica em C-30 (Figura 58; p.107). A
presença de um multipleto em δ 2,52-2,36 ppm (Figura 59; p.108) referente ao
hidrogênio do C-19. A presença de um multipleto em δ 4,57-4,52 ppm (Figura 60;
p.109), indica a presença de diferentes grupos acila ligados ao átomo de carbono
carbinólico em C-3. Os hidrogênios da posição C-29 (dupla terminal) foram
evidenciados pela presença de um multipleto em δ 4,57-4,51 ppm referente ao H-29a, e
um dubleto em δ 4,69 ppm (1H, J= 2,0 Hz) referente ao H-29b (Figura 60; p.109).
Além destes sinais foi observado, um singleto largo em δ 1,25 ppm (Figura 57; p.106)
relativo aos hidrogênios metilênicos da porção acila ligada ao carbono carbinólico em
C-3.
Em relação ao espectro de RMN 13C totalmente desacoplado (Figura 61; p.110
Tabela 9; p.103), foi observado sinais característicos de esqueletos do tipo lupânico em
δ 81,4; 48,0; 150,9 e 109,3 ppm, referentes aos carbonos: C-3, C-19, C-20 e C-29
respectivamente. Além destes, valores em δ 172,9 ppm, referente ao carbono C-1’
(Figura 61; p.110), são característicos de uma carbonila do tipo éster. A presença de
P á g i n a | 1 0 3
ésteres hidroxilados na fração HSF7, pode ser evidenciada pelo sinal em δ 68,2 ppm
(Figura 61; p.110), relativo ao carbono C-3’, contendo um grupo hidroxila.
Tabela 9: Comparação dos dados de RMN 1H (CDCl3, 500 MHz) e 13C (CDCl3, 100 MHz) das substâncias isoladas da fração HSF2 com os dados obtidos na literatura [SAMPAIO, 2008]. Carbono 13C(ppm) 1H (ppm) 13C(ppm)Lit 1H (ppm)Lit
1 38,3 38,3 --
2 23,7 23,7 --
3 81,4 4,57-4,51 81,4 4,57-4,52
4 37,4 37,8 --
5 55,4 55,4 --
6 18,2 18,2 --
7 34,2 34,2 --
8 40,8 40,8 --
9 50,3 50,3 --
10 37,7 37,7 --
11 20,9 20,9 --
12 25,1 25,1 --
13 38,0 38,0 --
14 42,8 42,8 --
15 27,4 27,4 --
16 35,5 35,5 --
17 43,0 43,0 --
18 48,3 48,3 --
19 48,0 2,52-2,36 48,0 2,52-2,32
20 150,9 150,9 --
21 29,8 29,8 --
22 40,0 40,0 --
23 28,0 0,85 28,0 0,85
24 15,9 1,03 15,9 1,03
25 16,1 0,84 16,1 0,84
P á g i n a | 1 0 4
26 16,6 0,88 16,6 0,88
27 14,5 0,94 14,5 0,94
28 18,0 0,78 18,0 0,79
29 a 109,4 4,57-4,51 109,4 4,57-4,52
29 b 109,4 4,68 109,4 4,69
30 19,3 1,68 19,3 1,68
1` 172,9 172,9 --
2` 41,6 41,6 2,34-2,29
3` 68,2 1,25 68,2 1,25
4` 36,6 1,25 36,5 1,25
5` 25,5 1,25 25,5 1,25
6’ 29,7-29,4 1,25 29,7-29,4 1,25
7’ 29,7-29,4 1,25 29,7-29,4 1,25
8’-17’ 29,7-29,4 1,25 29,7-29,4 1,25
18’ 31,9 1,25 31,9 1,25
19’ 22,7 1,25 22,7 1,25
20’ 14,1 0,94 14,1 0,92
P á g i n a | 1 0 5
Figura 56: Espectro de absorção na região do infravermelho (IV) (pastilha de KBr) da fração HSF7.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
40
50
60
70
80
90
100
547
100711
1611
4611
8212
52
1705
1641 72
1
885
979
1381
1465
1730
2360
2850
2920
3504
3558
Tra
nsm
itânc
ia (
%)
Número de onda (cm-1)
P á g i n a | 1 0 6
O
OR1
HH
H
H
n
R1 = H; OH
Figura 57: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF7 isolada do EHR de H. speciosa.
p p m ( f 1 )0 . 01 . 73 . 35 . 06 . 78 . 31 0 . 0
7.26
03
4.68
89
4.68
33
4.57
27
4.56
95
4.56
71
4.56
38
4.55
53
4.53
24
4.51
49
3.98
81
2.90
92
2.90
17
2.52
44
2.51
64
2.48
39
2.47
59
2.4
242
2.40
97
2.40
21
2.38
35
2.36
66
2.36
16
1.92
43
1.91
93
1.91
19
1.89
95
1.89
14
1.68
35
1.65
81
1.65
09
1.59
15
1.39
58
1.28
21
1.25
48
1.03
330.
9439
0.88
000.
8555
0.84
050.
7882
1.00
2.22
1.25
1.03
1.282.31
2.10
73.19
37.79
P á g i n a | 1 0 7
Figura 58: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF7 isolada do EHR de H. speciosa.
p p m ( f1 )0 .6 70 .8 31 .0 01 .1 71 .3 31 .5 01 .6 71 .8 3
1.91
93
1.91
19
1.89
95
1.89
14
1.86
51
1.68
35
1.65
81
1.65
09
1.59
15
1.39
58
1.28
21
1.25
48
1.03
33
0.94
39
0.88
00
0.85
55
0.84
05
0.78
82
2.10
73.19
37.79
P á g i n a | 1 0 8
Figura 59: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF7 isolada do EHR de H. speciosa.
p p m ( f1 )2 .3 02 .4 02 .5 02 .6 02 .7 02 .8 02 .9 0
2.90
92
2.90
17
2.52
44
2.51
64
2.48
39
2.47
59
2.42
42
2.40
97
2.40
21
2.38
35
2.36
66
2.36
16
1.03
1.28
2.31
P á g i n a | 1 0 9
Figura 60: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF7 isolada do EHR de H. speciosa.
p p m ( f1 )3 .9 04 .0 04 .1 04 .2 04 .3 04 .4 04 .5 04 .6 04 .7 0
4.68
89
4.68
33
4.57
27
4.56
95
4.56
71
4.56
38
4.55
53
4.53
24
4.51
49
3.9
881
1.00
2.22
1.25
P á g i n a | 1 1 0
Figura 61: Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da fração HSF7 isolada do EHR de H. speciosa.
SpinWorks 2.5:
PPM 160.0 150.0 140.0 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0
172
.870
4
150
.932
8
109
.352
0
81
.448
5
77
.319
2
77
.001
6
76
.684
4
68
.215
5
55
.372
5
50
.325
4
48
.277
4
47
.992
5
42
.985
7
42
.827
5
41
.614
6
40
.839
7
39
.987
7
38
.346
9
38
.027
9
37
.797
1
37
.073
5
36
.564
0
35
.557
8
34
.180
9
31
.919
6
29
.822
6 29
.689
6 29
.558
4 29
.356
6
28
.016
0
27
.426
4
25
.460
6
25
.079
5
23
.750
2
22
.685
0
20
.941
4
19
.282
3
18
.191
6
17
.991
8
16
.583
8
16
.143
7
15
.965
2
14
.512
5
14
.113
2
-0
.0161
file: E:\Espectros janeiro2010\Valeria_HSF2\2\fid expt: <zgpg30>transmitter freq.: 100.643483 MHztime domain size: 32768 pointswidth: 23474.18 Hz = 233.240919 ppm = 0.716375 Hz/ptnumber of scans: 11711
freq. of 0 ppm: 100.632886 MHzprocessed size: 32768 complex pointsLB: 3.000 GB: 0.0000
O
OR1
HH
H
H
n
R1 = H; OH
P á g i n a | 1 1 1
Os grupos acila nos ésteres (Tabela 10; p.112) foram identificados através de
análise por CG/EM dos ésteres metílicos preparados pela reação de transesterificação do
produto natural. Os espectros de massas (Figura 64-72; p.113-117) dos 9 principais
picos observados no cromatograma (Figura 63; p.112) foram analisados a partir dos
íons característicos: m/z 74 e 87 e m/z 103 usados para caracterizar as porções acila. O
pico mais característico de ésteres alifáticos de cadeia linear (m/z 74) aparece devido ao
rearranjo de McLafferty (Figura 62; p.111), com quebra da ligação β em relação ao
grupo C=O. O pico m/z 87 corresponde ao íon [CH2CH2COOCH3]+. O pico m/z 103
indica a presença de hidroxila na cadeia, evidenciando a presença de ésteres
hidroxilados. O íon RC≡O+ é característico dos ésteres, e no caso de ésteres metílicos
ele é observado em M-31 [SILVERSTEINet al., 2007; PAVIA, et al., 2001]. Na
ausência do íon molecular para ésteres derivados de ácidos graxos contendo um grupo
hidroxila em C-3’ utilizou-se o íon [M-18] correspondente a perda de uma molécula de
água.
RO
RHO
R'
O
RO CH2
H
R'
O+
RO CH
H
R'
-RHC=CH2
m/z 74R'=HR=CH3
Figura 62: Rearranjo de McLafferty e ésteres metílicos.
P á g i n a | 1 1 2
Figura 63: Cromatograma de íons reconstituídos (m/z 74, m/z 103, m/z 426) (CG/EM) dos ésteres metílicos obtidos após hidrólise da mistura de ésteres 3-β-acil do lupeol. A numeração dos picos corresponde à tabela 05.
Tabela 10: Substâncias identificadas (ésteres metílicos) após a reação de transesterificação da fração HSF7 isolada do EMR de H. speciosa.
N° do
pico
Composto TR
(min)
IRCal IRLit m/z
1 Tetradecanoato de metila 7.292 1723 1723a 242
2 Hexadecanoato de metila 9.517 1925 1927b 270
3 3-hidroxihexadecanoato de
metila
11.108 2078 - 286
4 Octadecanoato de metila 11.600 2127 2128a 298
5 3-hidroxioctadecanoato de
metila
13.067 2281 - 314
6 3-hidroxiiocosonoato de
metila
14.883 2483 - 342
7 Docosanoato de metila 15.242 2529 2530c 354
8 3-hidroxidocosanoato de
metila
16.542 2689 - 370
9 Tetracosanoato de metila 16.858 2730 2731c 382 * TR=Tempo de retenção; IRcal= Índice de retenção calculado; IRlit= Índice de retenção da literatura; a[ROUT et al., 2005]; b[TAKACS et al., 2001]; c[ZHAO et al., 2006];
2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.00.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
(x100,000)
1
2
4
5
6
7
3 8 9
P á g i n a | 1 1 3
m/z
Figura 64: Espectro de massas do tetradecanoato de metila (C15H30O2).
m/z
Figura 65: Espectro de massas do hexadecanoato de metila (C17H34O2).
50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 2400
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
74
57
43
87
160 24219997 211136123
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 2700
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
%
74
43 87
55
69 143270
199 227129101 185157 241171115 213 256
P á g i n a | 1 1 4
m/z
Figura 66: Espectro de massas do 3-hidroxihexadecanoato de metila (C17H34O3).
m/z
Figura 67: Espectro de massas do octadecanoato de metila (C19H38O2).
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
43
55
74 2076916487
111115 143 187 286
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
%
74
43
41
1436997 255129 199 298
111 213157 185 227 241 269166
P á g i n a | 1 1 5
m/z
Figura 68: Espectro de massas do 3-hidroxioctadecanoato de metila (C19H38O3).
m/z
Figura 69: Espectro de massas do 3-hidroxiiocosanoato de metila (C21H42O3)
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
43
41
103
7182 96
124 264152 199138 166 180 223213 296243 279
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
%
43
10355
71
83
292113 138 227178 251151 324193 342208
P á g i n a | 1 1 6
m/z
Figura 70: Espectro de massas do docosanoato de metila (C23H46O2).
m/z
Figura 71: Espectro de massas do 3-hidroxidocosanoato de metila (C23H46O3).
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110%
74
43 87
143354129
11049 157 221 323267177 192 251341
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
%
10343
55 7496
123 321166 194151 255 269218 315 368295
P á g i n a | 1 1 7
m/z
Figura 72: Espectro de massas do 3-hidroxidocosanoato de metila (C25H50O2).
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
43
74
57 382143
339119 15316592 199 291271 309241
P á g i n a | 1 1 8
Com base nos dados espectoscópicos (IV, RMN 1H e 13C) e na reação de
transesterificação com posterior análise CG/EM, obtidos na determinação estrutural dos
ésteres do triterpeno lupeol presentes na mistura, sugerimos as estruturas dos 9
compostos da fração HSF7 como sendo: 3-β-O-tetradecanoato de lupeoíla (1), 3-β-O-
hexadecanoato de lupeoíla (2), 3-β-O-3’-hidroxihexadecanoato de lupeoíla (3), 3-β-O-
octadecanoato de lupeoíla (4), 3-β-O-3’-hidroxioctadecanoato de lupeoíla (5), 3-β-O-
3’-hidroxiiocosonoato de lupeoíla (6), 3-β-O-docosanoato de lupeoíla (7), 3-β-O-3’-
hidroxidocosanoato de lupeoíla (8), 3-β-O-tetracosanoato de lupeoíla (9) (Figura 73;
p.118).
H
H
HH
OR
n
R=H(1) n=10(2) n=12(4) n=14(7) n=18(9) n=20
R =OH(3) n=12(5) n=14(6) n=16(8) n=18
Figura 73: Estruturas dos ésteres 3-β-O-acil lupeol isolados da fração HSF7 do extrato hexânico dos ramos de H. speciosa.
Estes resultados são semelhantes aos observados por SOBRINHO et al. (1991) e
CARVALHO et al. (2001), que identificaram vários triterpenos a partir da casca, do
látex e das raízes de Parahancornia, que é um gênero quimiotaxonomicamente mais
próximo de Hancornia, pertencendo à mesma ordem (Gentianales), à mesma família
P á g i n a | 1 1 9
(Apocynaceae), à mesma subfamília (Rauvolfioideae) e a mesma tribo (Willughbeieae).
Esses triterpenos identificados são semelhantes aos que foram isolados por SAMPAIO
et al. (2008), tais como: lupeol (1), ésteres 3-β-O-acil lupeol (3, 4, 4A, 5, 5A, 5B), β-
amirina (6), α-amirina (8), e seus derivados acetilados (2, 7, 9), β-sitosterol (10),
estigmasterol (11) e β-sitosterona (12) (Figura 74; p.119).
RORO
R2R1
HO
HO
O
1 R=H2 R=Ac3R=
O
n(n=20,22,24,26)
4R=
O OR1
(n=16,18,20,22)
R1 =H4A R1=Ac
5R=
O OR1 OR2
n
n
R1=R2=H (n=14,16)5A R1=R2=Ac5B R1, R2=CMe2
6 R=R1=H, R2=Me7 R=Ac, R1=H, R2=Me8 R=R2=H, R1=Me9 R=Ac, R1=Me, R2=H
10
1112
RO
Figura 74: Principais compostos isolados de Parahancornia amapa.
P á g i n a | 1 2 0
3.1.3. Elucidação Estrutural da fração HSF1
A fração HSF1 foi obtida através do fracionamento por cromatografia em coluna
do EHR de H. speciosa e apresentou-se como uma cera esbranquiçada (21,1 mg),
solúvel em hexano e clorofórmio.
No espectro de absorção na região do infravermelho (IV) da fração HSF1,
(Figura 75; p.121), destacaram-se as bandas de absorção em ν2918 cm-1 e ν 2848 cm-1,
característicos de estiramento da ligação C-H de grupos metílicos e metilênicos
(deformação axial). As bandas referentes à deformação angular simétrica da ligação C-
H para grupos metilênicos aparecem na região de absorção entre ν1474 cm-1 e ν1461
cm-1. Absorções em ν 731 cm-1 e ν 719 cm-1 correspondem à deformação angular
assimétrica de ligação C-H de grupamentos metilênicos, onde ocorre com maior
frequência em carbonos de cadeia linear de sete ou mais átomos de carbono.
Com a análise dos sinais no espectro de RMN 1H (Figura 76; p.122) pôde-se
observar a presença de um pico intenso em δ 1,25 ppm, referente a hidrogênios
metilênicos (Figura 77; p.123); e a representação do grupo metílico terminal em δ 0,89-
0,86 ppm (Figura 78; p.124);
P á g i n a | 1 2 1
Figura 75: Espectro de absorção na região do infravermelho (IV) (pastilha de KBr) da fração HSF1.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 50020
30
40
50
60
70
80
90
2957
731
1474
719
1461
2359
2848
2918
Tra
nsm
itânc
ia (
%)
Número de onda (cm-1)
P á g i n a | 1 2 2
Figura 76: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF1 isolada do EHR de H. speciosa.
p p m ( t 1 )0 . 01 . 73 .35 . 06 . 78 .31 0 .01 1 .7
7.25
81
1.54
43
1.25
55
0.89
67
0.88
03
0.86
28
0.00
00
P á g i n a | 1 2 3
Figura 77: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF1 isolada do EHR de H. speciosa.
p p m ( t1 )0 .8 31 .0 01 .1 71 . 3 31 . 5 01 . 6 7
1.5
443
1.2
555
0.8
967
0.8
803
0.8
628
P á g i n a | 1 2 4
Figura 78: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 500 MHz) da fração HSF1 isolada do EHR de H. speciosa.
p p m ( t 1 )0 . 8 31 . 0 01 . 1 71 . 3 31 . 5 01 . 6 7
1.54
43
1.25
55
0.89
67
0.88
03
0.86
28
P á g i n a | 1 2 5
Os espectros de massas (Figuras 80-91; p.127-132) dos 12 principais picos
observados no cromatograma (Figura 79; p.125) foram analisados a partir do íon
molecular de cada componente. O pico de íon molecular de um hidrocarboneto linear
saturado é sempre observado em compostos de cadeia longa, embora com baixa
intensidade. A sequência de fragmentação é caracterizada por aglomerados de picos
afastados uns dos outros por 14 unidades de massa (-CH2) [SILVERSTEIN et al.,
2007].
Figura 79: Cromatograma de íons totais da fração HSF1 isolada do extrato hexânico de H. speciosa.
3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
(x10,000,000)
TIC
12
3 4 5
6 7
8
9
10
11
12
P á g i n a | 1 2 6
Pôde-se identificar pelos espectros de massas os seguintes hidrocarbonetos
alifáticos (Tabela 11; p.126; Figura 92; p.133).
Tabela 11: Principais compostos identificados da fração HSF1 isolados do EMR de H.
speciosa.
N° do pico Nomenclatura Fórmula estrutural Massa molecular
1 Docosano C22H46 310
2 Tricosano C23H48 324
3 Tetracosano C24H50 338
4 Pentacosano C25H52 352
5 Hexacosano C26H54 366
6 Heptacosano C27H56 380
7 Octacosano C28H58 394
8 Nonacosano C29H60 408
9 Triacontano C30H62 422
10 Hentriacontano C31H64 436
11 Dotriacontano C32H66 450
12 Tritriacontano C33H68 464
P á g i n a | 1 2 7
m/z
Figura 80: Espectro de massas da estrutura 1 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa.
m/z
Figura 81: Espectro de massas da estrutura 2 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa.
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
57
4371
85
99113 127 141
155 310169 197183 217 253238 269
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
57
71
8541
99113 127 155141
325217170 201 253239 285267 302
P á g i n a | 1 2 8
m/z
Figura 82: Espectro de massas da estrutura 3 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa.
m/z
Figura 83: Espectro de massas da estrutura 4 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa.
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
57
43
71
85
99113
141 155 183169 338225210 281253239 295 319
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
57
43
71
85
113
126 141 168 225197 352239 267253183 309 338296
P á g i n a | 1 2 9
m/z
Figura 84: Espectro de massas da estrutura 5 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa.
m/z
Figura 85: Espectro de massas da estrutura 6 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa.
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
57
43
71
85
113127 141 169 183 197 211 281 366253 267239 309 324 342
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
%
57
43
71
99
113 127155 211169 183 225 268 380358282253 338311
P á g i n a | 1 3 0
m/z
Figura 86: Espectro de massas da estrutura 7 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa.
m/z
Figura 87: Espectro de massas da estrutura 8 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa.
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
57
43
71
99 113127
169 207183155 253225 394309 356322281 337
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110%
57
43
71
11399141
155169 233 408195 337 357295250
P á g i n a | 1 3 1
m/z
Figura 88: Espectro de massas da estrutura 9 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa.
m/z
Figura 89: Espectro de massas da estrutura 10 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa.
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
57
43
85
99
127141183 281225211 423169 310252 351337 380 401
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
%
57
43
85
99
127141 169183 225211 253 295309267 436379351 393337 417
P á g i n a | 1 3 2
m/z
Figura 90: Espectro de massas da estrutura 11 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa.
m/z
Figura 91: Espectro de massas da estrutura 12 identificada da fração HSF1 isolada do
extrato hexânico dos ramos de H. speciosa.
25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
57
43 71
99
207141 281127 169 225 351249 393308 451415
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
57
43
85
113155 183 211 281253 295 323 379 464421
P á g i n a | 1 3 3
CH3
CH3CH3
CH3CH3CH3
CH3CH3
18
CH3
CH3CH3CH3 29 28
27
26 25 24
23 22 21
20 19
Docosano Tricosano Tetracosano
Pentacosano Hexacosano Heptacosano
Octacosano Nonacosano Triacontano
Hentriacontano Dotriacontano Tritriacontano
(1) (2) (3)
(4) (5) (6)
(7) (8) (9)
(10) (11) (12)
Figura 92: Estruturas das substâncias encontradas na fração HSF1 isolada do EHR.
P á g i n a | 1 3 4
4. CONCLUSÕES
A análise dos metabólitos secundários das folhas e dos ramos de H. speciosa nos
proporcionou a caracterização de 22 substâncias. A identificação de uma mistura de
triterpenos (α-amirina, β-amirina e lupeol), isolada da partição hexânica do EMF, se deu
através de técnicas espectroscópicas (IV, RMN 1H e 13C) e seus resultados foram
comparados com os da literatura [De SOUZA et al., 2001; SAMPAIO, 2008]. Com a
análise dos dados espectroscópicos dos ésteres 3-β-O acil lupeol isolados do EHR,
pôde-se observar um triterpeno possuindo uma cadeia lateral, que foi identificada
através de CG/EM, depois de submetido a uma reação de transesterificação. Esses
compostos foram identificados como sendo: 3-β-O-tetradecanoato de lupeoíla, 3-β-O-
hexadecanoato de lupeoíla, 3-β-O-3’-hidroxihexadecanoato de lupeoíla, 3-β-O-
octadecanoato de lupeoíla, 3-β-O-3’-hidroxioctadecanoato de lupeoíla, 3-β-O-3’-
hidroxiicosanoato de lupeoíla, 3-β-O-docosanoato de lupeoíla, 3-β-O-3’-
hidroxidocosanoato de lupeoíla, 3-β-O-tetracosanoato de lupeoíla. Além disso, uma
mistura de n-alcanos isolada do EHR sendo identificada por CG/EM como sendo:
docosano, tricosano, tetracosano, pentacosano, hexacosano, heptacosano, octacosano,
nonacosano, triacontano, hentriacontano, dotriacontano, tritriacontano.
P á g i n a | 1 3 5
PARTE 3: TESTES DE
ATIVIDADE BIOLÓGICA
P á g i n a | 1 3 6
PARTE 3: TESTES DE ATIVIDADE BIOLÓGICA
1. CONSIDERAÇÕES GERAIS
A atividade antioxidante é de grande utilidade na conservação de alimentos e
também em qualquer outro tipo de produto que contenha em sua composição um
substrato lipídico. A constatação desta atividade em óleos essenciais, além de ser
interessante do ponto de vista de conservação de produtos farmacêuticos ou
alimentícios, também pode representar uma possibilidade de uso na terapêutica. O
potencial antioxidante está relacionado com uma série de atividades farmacológicas,
uma vez que compostos com propriedades antioxidantes exercem um efeito protetor
frente a diferentes danos biológicos [YUNES, et al., 2009].
Sabe-se bem que radicais oxigenados, ou espécies reativas de oxigênio estão
envolvidas em várias doenças patológicas como câncer, problemas cardiovasculares,
artrite, inflamações e doenças do fígado [SILVA et al., 2005].
O estresse oxidativo dentro do organismo se dá quando a geração de radicais
livres é maior que a de substâncias antioxidantes. As consequências deste estresse são
peroxidação dos lipídios da membrana celular e a oxidação de proteínas. Os danos
causados pelas espécies reativas de oxigênio incluem mutação do DNA, oxidação
protéica e peroxidação de lipídios, contribuindo para o desenvolvimento de câncer,
diabetes, arterioclorose, inflamação e envelhecimento precoce [FINKEL &
HOLBROOK, 2000].
As substâncias antioxidantes atuam sobre as espécies reativas de oxigênio e
outros radicais livres, inibindo ou inativando seus efeitos. Estas podem agir bloqueando
a formação dos radicais livres ou interagindo com estes, inativando-os. Portanto, os
antioxidantes são definidos como qualquer substância capaz de doar elétrons para um
radical livre, inativando-o, tornando-o um composto quimicamente estável. Os métodos
P á g i n a | 1 3 7
de avaliação desta atividade avaliam o efeito de diferentes concentrações de substâncias
antioxidantes em concentrações conhecidas de radicais livres ou comparam a ação de
diversos agentes oxidantes em sistemas celulares, usando sempre substâncias de
referência, tais como as vitaminas C e E, o BHT (Hidroxitolueno butilado) (Figura 93;
p.137), a quercitina, a rutina, entre outros. Um método que se destaca pela sua
simplicidade e capacidade de avaliar a atividade antioxidante de determinadas
substâncias, em condições de temperatura ambiente, usando um radical livre estável foi
desenvolvido por BLOIS (1958) e utiliza o radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila)
e tem sido amplamente utilizado como um método químico para a investigação do
potencial antioxidante de produtos naturais, particularmente para extratos de plantas
medicinais.
O
CH3
HO
H3C
CH3
CH3
CH3CH3 CH3 CH3
OH
C(CH3)3(CH3)C
CH3
O
OH
O
HO OHH
H
OH
Vitamina E
BHT Vitamina C
Figura 93: Estruturas de substâncias sequestradoras de radicais livres.
P á g i n a | 1 3 8
O DPPH é um radical livre estável que, na presença de um antioxidante doador de
hidrogênio, pode ser reduzido em meio alcoólico, formando difenil picrilhidrazina
(Figura 94; p.138). Esta redução pode ser verificada mediante espectrofotometria a 517
nm, pela diminuição da absorbância, com simultânea mudança de coloração violeta
escura original, para amarela clara. Ou seja, quanto mais DPPH for reduzido, menor a
coloração violácea, consequentemente maior a atividade antioxidante da solução testada
[CONTRERAS, 2007].
N
N
NO2O2N
NO2
N
NH
NO2O2N
NO2
+ RH
(máxima absorção em 517 nm) (Diminuição na absorção a 517 nm)
2,2-difenil-1-picrilhidrazila 2,2-difenil-1-picrilhidrazina
Figura 94: Reação de redução do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH).
Por ter se tornado um sinônimo de mortalidade e dor, o câncer é uma das doenças
que mais preocupa a população. Na maioria dos países desenvolvidos, se constitui na
segunda causa de morte da população, superado somente pelas doenças
cardiovasculares. Segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS)
surgem a cada ano nove milhões de novos casos e cinco milhões de pessoas vão a óbito
em decorrência do câncer. No entanto esses índices estão subestimados pelas
P á g i n a | 1 3 9
dificuldades de notificação e registro dessa patologia em muitos países
subdesenvolvidos [De CARVALHO, 2006; De ALMEIDA et al., 2005].
Pesquisas realizadas têm demonstrado que algumas plantas apresentam
substâncias com atividade anticâncer, podendo-se citar o taxol isolado da Taxus
brevifolia (Taxaceae) e a lasiodiplodina da Euphorbia splendus (Euphorbiaceae)
(Figura 95; p.140). Entre os medicamentos antitumorais de origem vegetal, destacam-
se os derivados e os correspondentes produtos naturais produzidos pelas espécies
Catharanthus roseus ou Vinca rosea (Apocynaceae), Camptotheca acumata
(Nyssaceae) e Podophyllum peltatum e P. Emodi (Berberidaceae) [BARREIRO, 1990;
BRAZ FILHO, 2010].
A Vinca rosea (Apocynaceae) é utilizada pela população de Madagascar no
tratamento do diabetes. Durante testes de atividade hipoglicemiante, os extratos dessa
espécie produzem granulocitopenia em consequência da supressão da medula óssea dos
animais, sugerindo avaliação em modelos de leucemias e linfomas. A confirmação da
atividade nesses modelos levou ao isolamento dos alcalóides vimblastina e vincristina
que, atualmente, são de grande utilidade no tratamento de leucemias, linfomas e câncer
testicular. Outra descoberta importante na área de câncer foi o paclitaxel (taxol), onde
estudos clínicos revelaram que essa substância era capaz de regredir o câncer de mama e
de ovário, resistentes à terapia tradicional. Como essa substância teria que ser extraída
de espécies que levam décadas para o seu crescimento, a introdução dessa droga na
terapêutica teve que esperar pelo desenvolvimento da síntese química e pela descoberta
de precursores obtidos de fontes renováveis [De CARVALHO, 2006].
P á g i n a | 1 4 0
O
ONHO
OH O
O
O
OHO
OH
O
O
OMe
HO
O
O
Taxol Lasiodiplodina
Figura 95: Estruturas do taxol isolado da Taxus brevifolia (Taxaceae) e da lasiodiplodina isolada da Euphorbia splendus (Euphorbiaceae).
P á g i n a | 1 4 1
2. OBJETIVOS
Nesta parte do trabalho objetivamos verificar o potencial antioxidante do óleo
essencial das folhas de H. speciosa, dos extratos das folhas e dos ramos e suas
respectivas partições; bem como realizar testes de citotoxicidade in vitro em 3 linhagens
de células tumorais com intuito de verificar o potencial antitumoral dos extratos desta
espécie.
P á g i n a | 1 4 2
3. METODOLOGIA
3.1. Atividade Antioxidante
Para a análise da atividade antioxidante foram preparadas soluções metanólicas de
DPPH 22,5 µg/ml, onde foram misturadas com as substâncias testes (óleo essencial das
folhas frescas e secas, EMF, EMR, PDEMR, PDEMF, PAcEMR, PAcEMF, PBEMR, PBEMF)
em 4 concentrações diferentes (10; 5; 2,5 e 1,25 mg/mL para o óleo essencial e 1; 0,5;
0,250; 0,125 mg/mL para os extratos). Neste ensaio utilizou-se pirogalol (Figura 96;
p.142) (0,5% em MeOH) como substância referência com poder de sequestrar 100%
dos radicais. O experimento foi realizado em triplicata.
OH
OH
OH
Pirogalol
Figura 96: Estrutura química do pirogalol.
O espectrofotômetro foi monitorado com uma solução de MeOH e como branco
utilizou-se uma solução metanólica de DPPH. O BHT foi utilizado como substância de
referência da atividade sequestradora de radical livre e o declínio da concentração do
radical foi monitorado por espectrofotometria no visível em λ = 517 nm, após 30 min. A
Equação 1 foi utilizada para calcular a atividade antioxidante (%AA) das amostras, e
com os valores obtidos foi construído um gráfico de %AA X Concentração (mg/mL).
Para o cálculo do CI50 (capacidade de sequestrar 50% dos radicais livres) foi
utilizada a equação da reta, substituindo o valor de y por 50 para obtenção da
P á g i n a | 1 4 3
concentração da amostra com capacidade de reduzir 50% do DPPH [De MIRANDA &
FRAGA, 2006].
% AA = 100 x ∆h Equação 1: Cálculo da capacidade sequestradora de radicais livres.
Onde:
∆h = h2 – h1
h2 = absorbância controle (DPPH + MeOH)
h1 = absorbância teste (DPPH + substância teste)
3.2.Citotoxicidade
O teste de citotoxidade in vitro dos extratos hexânico emetanólico das folhas e
dos ramos de H. speciosa foram realizados em colaboração com o Laboratório de
Oncologia Experimental da UFC (Universidade Federal do Ceará), através da parceria
com o Prof. Dr. Daniel Pereira Bezerra (DFS/UFS). Essa análise faz parte de um
screening inicial para determinação do potencial antitumoral destas amostras.
As linhagens tumorais utilizadas, MDA-MB435 (mama - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) e HCT-8 (colon) foram cedidas pelo Instituto Nacional do
Câncer (EUA), tendo sido cultivadas em meio RPMI 1640, suplementados com 10 % de
soro fetal bovino e 1% de antibióticos, mantidas em estufa a 37 ºC e atmosfera contendo
5% de CO2. As amostras foram diluídas em DMSO puro estéril. Os extratos foram
testados na concentração de 50 µg/mL. Para determinação da CI50, as amostras foram
testadas em concentrações crescentes em diluição seriada [PESSOA, 2000].
P á g i n a | 1 4 4
As células foram plaqueadas na concentração de 0,1 x 106 células/mL para as
linhagens MDA/MB-435 e SF-295, e 0,7 x 105 cél/mL para a linhagem HCT-8. As
placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5% de CO2 a 37 °C. Ao término deste,
as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante removido. Em seguida, foram
adicionados 150 µL da solução de MTT (sal de tetrazolium), e as placas foram
incubadas por 3h. A absorbância foi lida após dissolução do precipitado com 150 µL de
DMSO puro em espectrofotômetro de placa a 595 nm [MOSMANN, 1983].
P á g i n a | 1 4 5
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A verificação da atividade antioxidante foi realizada mediante a medição da
absorbância a 517 nm do extrato ou óleo essencial com solução de DPPH (coloração
violeta intensa). À medida que o DPPH foi reduzido, observou-se a diminuição da
coloração violeta, que é consequência da captura da captura de radicais livres, e
formação de uma coloração amarelada. O radical livre absorve a 517 nm e um
decréscimo nesse comprimento de onda ocorre pela estabilização do radical através do
recebimento de um hidrogênio radicalar da espécie antioxidante, que é indicada pela
mudança de cor. Valores com concentrações maiores sequestram radicais livres com
maior eficiência [SANTOS, 2005].
A utilização de metanol para monitorar o espectofotômetro, pode ser justificada
através de estudos feitos por SHARMA & BHAT (2009), onde analisaram alguns
parâmetros utilizados em trabalhos de atividade antioxidante (branco, tempo de
incubação, concentração das amostras). Foi feita uma comparação com a absorbância do
etanol, do metanol, e uma solução tampão de metanol. Foi constatado que valores de
absorbância das amostras diluídas em metanol e metanol em solução tampão eram
maiores que os das amostras diluídas em etanol.
A Figura 97; p.146 mostra a curva que representa a cinética de consumo do
DPPH pelo óleo essencial das folhas frescas e secas de H. speciosa. Utilizando a
equação desta curva calculou-se o CI50. Para elaborar a curva, utilizaram-se os
resultados das três determinações para cada concentração, visando obter um modelo
estatístico mais confiável. Quanto menor o valor de CI50, maior é a atividade
antioxidante do extrato analisado. Os valores da capacidade sequestradora de radicais
livres (%AA) do óleo essencial das folhas frescas e secas de H. speciosa em diferentes
concentrações podem ser observados na Tabela 12; p.146.
P á g i n a | 1 4 6
Tabela 12: Valores percentuais de atividade sequestradora de radicais livres do óleo
essencial das folhas frescas e secas de H. speciosa.
C (mg/mL) %AA OE Folhas secas %AA OE Folhas frescas
10 28,92 8,53
5 18,43 5,70
2,5 10,31 4,25
1,25 6,31 3,53
Figura 97: Capacidade de sequestro de DPPH do óleo essencial das folhas frescas e secas
de H. speciosa.
y = 2,5636x + 3,9773
R² = 0,9868
y = 0,5728x + 2,8155
R² = 0,9999
0
5
10
15
20
25
30
35
0 2 4 6 8 10
Folhas secas Folhas frescas Linear (Folhas secas) Linear (Folhas frescas)
(%)
AA
C (mg/mL)
P á g i n a | 1 4 7
O CI50, ou seja, a concentração de óleo essencial necessária para reduzir 50% do
DPPH adicionado foi 17,95 mg/mL para as folhas secas e 82,37 mg/mL para as folhas
frescas.
Pôde-se observar na Figura 97; p.146 que as folhas secas (CI50 = 17,95 mg/mL)
apresentaram atividade de sequestro do DPPH expressivamente superior as folhas
frescas (CI50 = 82,37 mg/mL) que pode estar relacionada a presença do antranilato de
metila e de eugenol, que são compostos fenólicos, bons sequestradores de radicais
livres.
A Figura 98; p.148 ilustra o gráfico da capacidade sequestadora de radicais livres
do padrão de BHT, dos extratos e suas respectivas partições. Os valores de %AA das
respectivas amostras, analisadas em diferentes concentrações, podem ser observados na
Tabela 13; p.148. Pode-se observar a proximidade da partição butanólica do EMF em
relação ao padrão BHT e também os elevados valores de CI50 (Tabela 14; p.148) para
as partições de diclorometano.
A análise do potencial antioxidante dos extratos metanólico das folhas e dos
ramos e suas respectivas partições (diclorometano, acetato de etila e butanol) foi
realizada com os mesmos parâmetros utilizados na análise dos óleos essenciais.
Observou-se que as partições de diclorometano (PDEMF e PDEMR) de ambos os extratos
não apresentaram muita atividade em relação ao BHT.
A análise da partição butanólica do extrato metanólico das folhas (PBEMF) pode
ser destacada por apresentar uma maior capacidade antioxidante frente aos extratos e
partições analisadas, sendo um valor de CI50 próximo ao observado para o padrão BHT.
Foi observada uma grande diferença no valor de CI50 entre as partições acetato de etila
dos extratos metanólicos das folhas e dos ramos (PAcEMF e PAcEMR). A partição
butanólica do EMR (PBEMR) apresentou uma boa atividade antioxidante. O extrato
metanólico das folhas (EMF) apresentou uma maior capacidade de sequestrar radicais
livres do que o extrato metanólico dos ramos (EMR) que pode ser explicada pela
presença de um número maior de compostos fenólicos (sequestradores de radicais
P á g i n a | 1 4 8
livres) presentes no EMF e que podem estar relacionados à boa atividade antioxidante
da sua partição butanólica.
Tabela 13: Valores percentuais de atividade sequestradora de radicais livres do BHT, dos extratos e suas respectivas partições.
C (mg/mL) BHT PDEMR PDEMF PAcEMR PAcEMF PBEMR PBEMF EMF EMR
1 73,1 5,8 8,2 50,3 11,1 40,3 65,5 30,1 25,4
0,5 50,7 3,6 4,8 27,2 5,4 22,5 35,3 17,1 12,2
0,25 31,1 2,4 2,5 15,1 3,4 12,2 20,7 9,3 7,8
0,125 16,7 1,9 1,7 7,6 2,4 4,9 11,0 5,0 3,9
Tabela 14: Valores de CI50 do BHT, dos extratos e suas partições.
Amostras CI50 (mg/mL)
BHT 0,58
EMF 1,52
EMR 2,03
PDEMF 6,58
PDEMR 10,77
PAcEMF 4,92
PAcEMR 0,98
PBEMF 0,74
PBEMR 1,23
P á g i n a | 1 4 9
Figura 98: Capacidade de sequestro de DPPH dos extratos e partições de H. speciosa.
y = 62,06x + 13,807
R² = 0,9619
y = 4,5201x + 1,3119
R² = 0,9989
y = 7,4703x + 0,8315
R² = 0,9963
y = 48,19x + 2,5076
R² = 0,9984
y = 9,9757x + 0,9177
R² = 0,9918
y = 39,462x + 1,494
R² = 0,9931
y = 61,47x + 4,3287
R² = 0,9988
y = 28,402x + 2,0855
R² = 0,9965
y = 24,078x + 1,0651
R² = 0,9943
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
(%)
AA
C (mg/mL)
Sequestro do DPPHBHT
PDEMR
PDEMF
PAcEMR
PAcEMF
PBEMR
PBEMF
EMF
EMR
P á g i n a | 1 5 0
A análise de citotoxicidade pelo método do MTT vem sendo utilizada no
programa de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI), que
testa mais de 10.000 amostras a cada ano [SKEHAN et al., 1990]. É um método rápido,
sensível e barato. Foi descrita primeiramente por MOSMAN (1983), tendo a capacidade
de analisar a viabilidade e o estado metabólico da célula. É uma análise colorimétrica
baseada na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de
tetrazolium (MTT) em azul de formazan, a partir de enzimas mitocondriais presentes
somente nas células metabolicamente ativas. O estudo citotóxico pelo método do MTT
permite definir facilmente a citotoxicidade, mas não o mecanismo de ação [BERRIDGE
et al., 1996].
Os valores da capacidade de inibição dos extratos hexânicos e metanólicos das
folhas e dos ramos de H. speciosa não revelaram citotoxicidade frente aos agentes
tumorais testados (Tabela 15; p.150). Segundo o Instituto Nacional do Câncerdos
EUA, o screening inicial para extratos brutos é realizado numa concentração de 50
µg/mL para selecionar os extratos que apresentam substancial efeito antiproliferativo,
com inibição de pelo menos 85% de proliferação da célula tumoral [MESQUITA et al.,
2009].
Dentre os extratos testados, o EHF destaca-se por ter obtido maiores valores
percentuais de inibição do crescimento celular (CI%) frente às linhagens tumorais
MDAMB-435 e SF-295 (19,59% e 29,67%, respectivamente). Já a analise de inibição
percentual frente ao agente tumoral HCT-8, o extrato metanólico das folhas obteve
maiores valores percentuais de inibição (25,61%).
Tabela 15: Valores percentuais de CI (capacidade inibitória) dos extratos de H. speciosa frente aos agentes tumorais.
Amostras MDAMB-435 (CI%) SF-295 (CI%) HCT-8 (CI%)
EHF 19,59% 29,67% 10,33%
EMR -3,47% 15,67% 18,58%
EHR 10,87% 23,67% 2,69%
EMF 17,43% 16,77% 25,61%
P á g i n a | 1 5 1
Os resultados obtidos neste trabalho corroboram com os estudos feitos por
SANTOS (2005), onde o lupeol estava presente na partição hexânica do extrato
etanólico das folhas de Prunus myrtifolia L., e os valores de CI% da partição hexânica
num screening incial frente às celulas tumorais MDAMB-435, SF-295 e HCT-8 foram
muito abaixo de 85%.
P á g i n a | 1 5 2
5. CONCLUSÕES
Os testes de atividade antioxidante nos permitiram verificar que o óleo essencial
das folhas secas de H. speciosa possui uma maior habilidade em sequestrar radicais
livres do que o óleo essencial das folhas frescas. Com relação aos extratos e partições
testadas, pôde-se verificar um potencial antioxidante elevado da partição butanólica do
extrato metanólico das folhas de H. speciosa, onde observou-se valores próximos ao
padrão BHT.
Os valores da capacidade de inibição dos extratos hexânicos e metanólicos das
folhas e dos ramos de H. speciosa não revelaram citotoxicidade frente aos agentes
tumorais testados, onde todas as amostras testadas apresentaram valores de capacidade
inibitória muito abaixo de 85%.
P á g i n a | 1 5 3
CONSIDERAÇÕES
FINAIS
P á g i n a | 1 5 4
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O estudo dos componentes voláteis das folhas frescas e secas de H. speciosa
permitiu verificar mudanças na composição química e nas percentagens relativas de
alguns componentes tanto na secagem das folhas, quanto na variação da época de
colheita. Com relação ao tempo de secagemverificou-se um aumento significativo nas
percentagens relativas de alguns monoterpenos oxigenados como α-terpineol (0,08±0,20
- 3,89±1,78 nas folhas frescas e 0,93±0,03 - 5,21±0,65 nas folhas secas), linalol
(2,95±1,45 - 12,46±2,24 nas folhas frescas e 2,78±1,08 - 17,16±2,83 nas folhas secas),
geraniol (1,04±0,34 - 12,80±1,23 nas folhas frescas e 25,67±6,45- 46,56±4,67 nas
folhas secas) nas folhas secas, assim como um decréscimo nas percentagens de alcoóis
como (Z)-3-hexenol (46,81±3,27 - 78,45±7,75 nas folhas frescas e 10,70±4,87 -
19,15±4,28 nas folhas secas), 1-hexanol (1,65±0,33 - 10,15±0,80 nas folhas frescas e
0,07±0,05 - 4,59±1,55 nas folhas secas). Os dados meteorológicos (índice de
precipitação total, temperatura e teor de água no solo) nos permitiram verificar que
houve mudanças decorrentes no rendimento e nas percentagens relativas dos
componentes majoritários do óleo essencial da mangabeira.
O estudo fitoquímico de H. speciosa permitiu a identificação de 3 misturas, sendo
uma mistura de triterpenos contendo α-amirina, β-amirina e Lupeol da partição hexânica
do EMF e uma mistura de ésteres 3-β-O acil lupeol provenientes do EHR, os quais
foram identificados como sendo: 3-β-O-tetradecanoato de lupeoíla, 3-β-O-
hexadecanoato de lupeoíla, 3-β-O-3’-hidroxihexadecanoato de lupeoíla, 3-β-O-
octadecanoato de lupeoíla, 3-β-O-3’-hidroxioctadecanoato de lupeoíla, 3-β-O-3’
hidroxiicosanoato de lupeoíla, 3-β-O-docosanoato de lupeoíla, 3-β-O-3’
hidroxidocosanoato de lupeoíla, 3-β-O-tetracosanoato de lupeoíla. Além disso, uma
mistura de n-alcanos provenientes do EHR foi identificada por CG/EM como sendo:
docosano, tricosano, tetracosano, pentacosano, hexacosano, heptacosano, octacosano,
nonacosano, triacontano, hentriacontano, dotriacontano, tritriacontano.
P á g i n a | 1 5 5
Nos testes de atividade biológica verificou-se que o óleo essencial das folhas
desta espécie não apresentou uma boa capacidade de sequestrar radicais livres, sendo
que o óleo essencial das folhas secas possui um CI50 maior do que o óleo das folhas
frescas. Com relação aos extratos e suas partições podemos notar que o EMF possui
uma maior atividade antioxidante que o EMR, e que a partição butanólica do EMF
possui boa atividade antioxidante, comparável ao padrão BHT que possui um potencial
antioxidante considerável. Os valores da capacidade de inibição dos extratos hexânicos
e metanólicos das folhas e dos ramos de H. speciosa não revelaram citotoxicidade frente
aos agentes tumorais testados, onde todas as amostras testadas apresentaram valores de
capacidade inibitória muito abaixo de 85%.
P á g i n a | 1 5 6
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
P á g i n a | 1 5 7
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADAMS, R. P. Identification of essential oil components by gas chromatography/mass
spectrometry. 4th ed. Illinois: Allured Publishing Corporation, 804 p., 2007
AGUIAR, S. Morfoanatomia de Frutos e Sementes em Apocynaceae. 2009. Tese
(Doutorado em Biologia) – Instituto de Biologia, UNICAMP.
ALMEIDA, S. P.; PROENÇA, C. E. B.; SANO, S. M.; RIBEIRO, J. F. Cerrado:
espécies vegetais úteis. Planaltina: Embrapa CPAC, 1998. 464 p.
ALVES, R. E.; CARNELOSSI, M. A. G.; SILVA, S. M.; FIGUEIREDO, R. W.
Colheita e pós-colheita de mangaba. In: Simpósio Brasileiro sobre a Cultura da
Mangaba, v.1, 2003, Aracaju. Resumos...Aracaju: Embrapa Tabuleiros Costeiros, 2003.
ANDRADE, F. O. P. Investigação química de chás brasileiros. 2002. Tese (Doutorado
em Química) – Instituto de Química, UNESP.
BARREIRO, E. J. Produtos Naturais Bioativos de origem vegetal e o desenvolvimento
de fármacos. Química. Nova, v.13, n.1, p.29-39, 1990.
BARREIRO, E. J.; BOLZANI, V. Da S. Biodiversidade: fonte potencial para
descoberta de fármacos. Quimica Nova, v. 32, n.3, p.679-688, 2009.
BARRETO, A. De S.; AMARAL, A. C. F.; SILVA, J. R. De A.; SCHRIPSEMA, J.
REZENDE, C. M.; PINTO, A. C. Ácido 15-demetilisoplumierideo, um novo iridoide
isolado das cascas de Plumeria rubra e do látex de Himatanthus sucuuba. Quimica
Nova, v. 30, n.5, p.1133-1135, 2007.
P á g i n a | 1 5 8
BERRIDGE, M. V.; TAN, A. S.; McCOY, K. D.; WANG, R. The Biochemical and
Cellular Basis of Cell Proliferation Assays that Use Tetrazolium Salts.Biochemica, v.4,
p.14-19, 1996.
BLANK, A.F.; ALVES, P.B.; FONTES, S.M.; SANTOS, M.F.; DANTAS, I.B.;
SILVA, P.A.; MENDONÇA, M.C.; ARRIGONI-BLANCK, M.F.; COSTA, A.G.;
SILVA-MANN, R. Efeito do horário de colheita e secagem no teor e na composição
química de óleo essencial de erva cidreira verdadeira (Melissa officinalis L.). In:
Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, v.17, 2002, Cuiabá. Resumos... Cuiabá,
2002.
BLANK, A. F.; FONTES, S. M.; CARVALHO FILHO, J. L. S.; ALVES, P. B.;
SILVA-MANN, R.; MENDONÇA, M. C.; ARRIGONI-BLANK, M. F. Influência do
horário de colheita e secagem de folhas no óleo essencial de melissa (Melissa officinalis
L.) cultivada em dois ambientes. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.8, n.1, p.
73-78, 2005.
BLOIS, M. S. Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature. v.
181, p. 1199-1200, 1958.
BRAGA, F. C., CORTES, S. De F., Da SILVA, G. C., ENDRINGER, D. C., Da
SILVA, G.C. Standardized extract for use in preparing pharmaceutical composition for
treating e.g. arterial hypertension, is extract of leaves of Hancornia speciosa containing
cyclitols and flavonoids particularly e.g. L-d-5 bornesitol and rutin. Universidade
Federal de Minas Gerais., Brasil.WO2009140749, Maio 23, 2009.
BRAZ FILHO, R. Contribuição da fitoquímica para o desenvolvimento de um país
emergente. Química Nova, v.33, n.1, p.229-239, 2010.
CABRAL, A. L. G. S. Constituintes químicos de Erithrina velutina. 2000. Dissertação
(Mestrado em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos) – Instituto de Ciências da
Saúde, Universidade Federal da Paraíba.
P á g i n a | 1 5 9
CANNELL, R. J. P. Natural Products Isolation. Humana Press, 342p., 1998.
CARNELOSSI, M. A. G.; De SENA, H. C.; NARAIN, N.; YAGUIU, P.; Da SILVA,
G. F. Physico-Chemical Quality Changes in Mangaba (Hancornia speciosa Gomes)
Fruit Stored at Different Temperatures. Brazilian Archives of Biology and Technology,
v.52, n.4, p.985-990, 2009.
CARVALHO, M. G.; VELLOSO, C. R. X.; BRAZ-FILHO, R.; COSTA, W. F. Acyl-
lupeol esters from Parahancornia amapa (Apocynaceae). Journal of the Brazilian
Chemical Society, v.12, p.556-559, 2001.
COLEGATE, S. M., MOLYNEUX, R. J. Bioactive Natural Products: Detection,
Isolation, and Structural Determination. 2nd ed. p.11-15, 2008.
CONTRERAS, P. D. Desenvolvimento de Bebida à Base de Subprodutos da Indústria
da Erva-Mate (Ilex Paraguariensis St. Hil.) e Verificação de sua Atividade
Antioxidante. 2007. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Alimentos) – Instituto de
Engenharia de Alimentos, Universidade Federal do Paraná.
COSTA, E. S.; HIRUMA-LIMA, C. A.; LIMA, E. O.; SUCUPIRA, G. C.; BERTOLIN,
A. O.; LOLIS, S. F.; ANDRADE, F. D. P.; VILEGAS, W.; SOUZA-BRITO, A. R. M.
Antimicrobial activity of some medicinal plants of the cerrado, Brazil. Phytotherapy
Research, v.22, p.705-707, 2008.
CRAVEIRO, A. A.; CRAVEIRO, A. C. Alimentos Funcionais: A Nova Revolução. 1ª
ed., 282 p., 2003.
CRUZ, G.F. Desenvolvimento de sistema de cultivo para hortelã-rasteira (Mentha
villosa Huds.). 1999. Dissertação (Mestrado em Agronomia/ Fitotecnia) – Instituto de
Agronomia, Universidade Federal do Ceará.
P á g i n a | 1 6 0
CSEKE, L. J., KIRAKOSYAN, A., KAUFMAN, P. B., WARBER, S. L., DUKE, J. A.,
BRIELMANN, H. L., Natural Products from Plants. 2nd ed., 2006.
Da SILVA, M. S. Uso e avaliação famacológica de plantas medicinais utilizadas na
medicina popular do povoado Colônia Treze em Lagarto/SE. 2003. Disponível em:
<http://www.anppas.org.br/encontro_anual2/GT/GT02/GTMariaSilene.pdf>. Acesso
em 03 de jan. 2009.
Da SILVA, E. A., MARUYAMA, W. I., De OLIVEIRA, A. C., BARDIVIESSO, D. M.
Effect of different substrates on the production of mangabeira seedlings (Hancornia
speciosa). Revista Brasileira de Fruticultura, v.31, p.925-929, 2009.
De ALMEIDA, V. L., LEITÃO, A., REINA, L. D. C. B., MONTANARI, C. A.;
DONNICI, C. L.; LOPES, M. T. P. Câncer e agentes antineoplásicos ciclo-celular
específicos e ciclo-celular não específicos que interagem com o DNA: Uma Introdução.
Química Nova, v.28, n.1, p.118-129, 2005.
De BARROS, F. M. C.; ZAMBARDA, E. O.; HEINZMANN, B. M.; MALLMANN, C.
A. Variabilidade sazonal e biossíntese de terpenóides presentes no óleo essencial de
Lippia alba (Mill.) N. E. Brown (Verbenaceae). Química Nova, v.32, n.4, p.861-867,
2009.
De CARVALHO, J. E. Atividade antiulcerogênica e anticâncer de produtos naturais e
de síntese. MultiCiência, v.7, p.1-18, 2006.
De CARVALHO, M. G.; ALVES, C. C. F.; WERLE, A. A.; BRAZ-FILHO, R.
Metabólitos especiais isolados de Laseguea erecta (Apocynaceae). Revista Brasileira
de Farmacologia, v.16, n.4, p.497-500, 2006.
P á g i n a | 1 6 1
De CARVALHO, M. G.; VELANDIA, J. R.; De OLIVEIRA, L. F.; BEZERRA, F. B.
Triterpenos isolados de Eschweilera longipes Miers (Lecythidaceae). Química. Nova,
v.21, n.6, p.740-743, 1998.
De MIRANDA, A.L.P.; SILVA, J.R.A.; REZENDE, C.M.; NEVES, J.S.; PARRINI,
S.C.; PINHEIRO, M.L.B.; CORDEIRO, M.C.; TAMBORINI, E.; PINTO, A.C. Anti-
inflammatory and analgesic activities of the latex containing triterpenes from
Himatanthus sucuuba. Planta Médica, v.66, p.284-286, 2000.
De MIRANDA, A. L. P.; FRAGA, C. A. M. Atividade sequestradora de radical livre:
determinação do potencial antioxidante de substâncias bioativas. 2006. Disponível em:
<www.iupac.org/publications/cd/medicinal_chemistry/>. Acesso em 05 set. 2009.
DEWICK, P. M. Medicinal Natural Products. 2nd ed. Londres: John Wiley & Son
LTD. 507 p., 2009.
Dos SANTOS, M. R. A.; INNECCO, R. Influência de períodos de secagem de folhas no
óleo essencial de erva-cidreira (quimiotipo limoneno-carvona). Revista Ciência
Agronômica, v.34, n.1, p.5-11, 2003.
De SOUZA, A. D. L., Da ROCHA, A. F. I., PINHEIRO, M. L. B., ANDRADE, C. H. De
S., GALOTTA, A. L. De A. Q., Dos SANTOS, M. Do P. S. S. Constituintes químicos de
Gustavia augusta L. (Lecythidaceae). Química Nova, v.24, n.4, p.439-442, 2001.
DRUMOND, M. A.; KILL, L. H. P.; LIMA, P. C. F.; De OLIVEIRA, M. C. De
OLIVEIRA, V. R.; De ALBUQUERQUE, S. G.; NASCIMENTO, C. E. S.;
CAVALCANTE, J. Avaliação e identificação de ações prioritárias para a conservação,
utilização sustentável e repartição de benefícios da biodiversidade do bioma Caatinga.
2000. Disponível em:
<http://www.biodivesitas.org/caatinga/relatórios/uso_sustentavel.pdf>. Acesso em 08
de mar. 2008.
P á g i n a | 1 6 2
EHLERT, P.A.D.; LUZ, J.M.Q.; INNECCO, R.; MATTOS, S.H. Influência do período
de secagem no teor de óleo essencial de alfavaca-cravo. In: Workshop de Plantas
Medicinais de Botucatu, 2000, Botucatu. Anais... Botucatu: UNESP, 2000. p.26.
ENDRESS, M. E.; BRUYNS, P. V. A Revised Classification of the Apocynaceae s. l.
Botanical Review, v.66, n.1,p.1-56, 2000.
ENDRINGER, D. C.; PEZZUTO, J. M.; BRAGA, F. C. NF-kB inhibitory activity of
cyclitols isolated from Hancornia speciosa. Phytomedicine, v.16, n.11, p.1064-1069,
2009.
Estatística Agropecuária. Pluviosidade mensal (2009). Disponível em
<http://www.emdagro.se.gov.br/modules/tinyd0/index.php?id=57>. Acesso em 12 de
jan. 2010.
FERREIRA, H.C.; SERRA, C.P.; LEMOS, V.S.; BRAGA, F.C.; CORTES, S.F. Nitric
oxide-dependent vasodilatation by ethanolic extract of Hancornia speciosa via
phosphatidyl-inositol 3-kinase. Journal of Ethnopharmacology, v.109, p.161-164, 2007.
FINDEMEACURE. Disponível em < http://findmeacure.com/2011/02/26/bellaco-caspi-
himatanthus-sucuuba/himatanthus_sucuuba_p1-2/>. Acesso em 11 de set. 2009.
FINKEL, T.; HOLBROOK, N. J. Oxidants, oxidative stress and the Biology of ageing.
Nature, v. 408, p.239-247, 2000.
FRANCO, C.F. O.; CAZÉ FILHO, J. BARREIRO NETO, M. ARAÚJO, I.A.;
MATIAS, E.C.; MENINO, I.B.; LIMA, I.X. de; MARINHO, S.J.O. & FONTINÉLLI,
I.S.C. Mangabeira (Hancornia speciosa Gomes). Disponível em: <http://
www.emepa.pb.gov.br/mangaba.php>. Acesso em 13 de dez. 2008.
GANGA, R. M. D., CHAVES, L. J., NAVES, R. V. Parâmetros genéticos em progênies
de Hancornia speciosa Gomes de Cerrado. Scientia Florestalis, v.37, p.395-404, 2009.
P á g i n a | 1 6 3
GEETHAT, T.; VARALAKSHMI, P. Anti-inflamatory activity of lupeol and lupeol
linoleate in rats. Journal Ethnopharmacology, v.76, p.77-80, 2001.
HOSTETTMANN, K., QUEIROZ, E. F. E VIEIRA, P. C. Princípios ativos de plantas
superiores (série de textos da Escola de verão em química, Vol. IV), São Carlos:
EdUFSCar, p.9-33, 2003.
KOCH, I. Caracterização Taxonômica dos Representantes da Família Apocynaceae na
Região de Bauru-SP. 1994. Dissertação (Mestrado em Biologia) – Instituto de Biologia,
UNICAMP.
KOSTER, K. L. Formação de vidro e tolerância à dessecação em sementes. Plant
Physiology,v.96, p.302-304, 1991.
LEDERMAN, I.E.; SILVA JÚNIOR, J.F.; BEZERRA, J.E.F.; ESPÍNDOLA, A.C.M.
Mangaba (Hancornia speciosa Gomes). Jaboticabal: FUNEP (Série Frutas Nativas, 2),
p.35, 2000.
LÉDO, A. Da S., SECA, G. S. V., BARBOZA, S. B. S. C., JUNIOR, J. F. Da S.
Crescimento inicial de mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) em diferentes meios
de germinação in vitro. Ciência Agrotécnica, v.31, p.989-993, 2007.
LOPES, N. P.; NETO-GOBBO, L. Plantas Medicinais: fatores de influência nos
metabólitos secundários. Química Nova, v.30, p.374-381, 2007.
MACHADO, M. M. Perfil fitoquímico e avaliação dos principais efeitos biológicos e
imunológicos in vitro da Euphorbia tirucalli L. 2007. Dissertação (Mestrado em
Ciências Farmacêuticas) – Instituto de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de
Santa Maria.
P á g i n a | 1 6 4
MALMONGE, J. A. A comparative study of the non-isothermal degradation of natural
rubber from Mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) and Seringueira (Hevea
brasiliensis). Jornal of Thermal Analysis and Calorimetry, v.100, p.1045-1050, 2010.
MALMONGE, J. A.; CAMILLO, E. C.; MORENO, R. M. B.; MATTOSO, L. H. C.;
McMAHAN, C. M. Comparative Study on the Technological Properties of Latex and
Natural Rubber from Hancornia speciosa Gomes and Hevea brasiliensis. Journal of
Applied PolymerScience, vol. 111, p.2986-2991, 2008.
MATTOS, S.H. Estudos fitotécnicos da Mentha arvensis L. var. piperacens Holmes
como produtora de mentol no Ceará. 2000. Tese (Doutorado em Agronomia/
Fitotecnia) – Instituto de Agronomia, Universidade Federal do Ceará.
MARTINS, P.M. Influência da temperatura e da velocidade do ar de secagem no teor e
na composição química do óleo essencial de capim-limão (Cymbopogon citratus (D.C.)
Stapf.). 2000. Dissertação (Mestrado em Agronomia). – Instituto de Agronomia,
Universidade Federal de Viçosa.
MESQUITA, M. L. de; PAULA, J. E. de, PESSOA, C.; MORAES, M. O. de, COSTA-
LOTUFO, L. V.; GROUGNET, R.; MICHEL, S.; TILLEQUIN, F.; ESPINDOLA, L. S.
Cytotoxic activity of Brazilian Cerrado plants used in traditional medicine against
cancer cell lines. Journal of Ethnopharmacology, v.123, n.3, p. 439-445, 2009.
MORAES, T. De M.; RODRIGUES, C. M.; KUSHIMA, H.; BAUAB, T. M.;
VILLEGAS, W.; PELLIZZON, C. H.; BRITO, A. R. M. S.; HIRUMA-LIMA, C. A.
Hancornia speciosa: Indications of gastroprotective, healing and anti-Helicobacter
pylor actions. Journal of Ethnopharmacology, v.120, n.2, p.161-168, 2008.
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application
to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods, v.16, p.55-
63, 1983.
P á g i n a | 1 6 5
MOURA, N. F. Estrutura Genética de Subpopulações de Mangabeira (Hancornia
speciosa Gomes) nos Cerrados do Brasil Central. 2003. Dissertação (Mestrado em
Química) – Instituto de Química, Universidade Federal de Goiás.
NICARETA, C. Óleos Essenciais de Solanum e a Interação com Morcegos Frugívoros.
2006. Dissertação (Mestrado em Química) – Instituto de Química, Universidade Federal
do Paraná.
PAVIA, D. L.; LAMPMAN, G. M.; KRIZ, G. S. Introduction to spectroscopy: A guide
for students of organic chemistry. 3th ed. 579 p., 2001.
PEREIRA, M. De M.; JÁCOME, R. L. R. P.; ALCÂNTARA, A. F. De C.; ALVES, R.
B.; RASLAN, D. S. Alcalóides Indólicos Isolados de Espécies do Gênero Aspidosperma
(Apocynaceae). Química Nova, v.30, n.4, p.970-983, 2007.
PESSOA, C. Determinação do mecanismo de ação citotóxica de alguns compostos
extraídos de plantas do nordeste brasileiro. 2000. Tese (Doutorado em Farmacologia) –
Instituto de Farmacologia, Universidade Federal do Ceará.
PHILLIPSON, J.D. Phytochemistry and medicinal plants. Phytochemistry, v.56, p.237-
243, 2001.
PINTO, A. C.; SIQUEIRA, D. H.; BOLZANI, V. Da S.; LOPES, N. P.; EPIFANIO, R.
De A. Produtos naturais: Atualidades, desafios e perspectivas. Química Nova, v.25,
n.1, p.45-61, 2002.
RAHMAN, M. A.; MOSSA, J. S.; AL-SAID, M. S.; AL-YAHVA, M.A. Medicinal
plant diversity in the flora of Saud Arabia 1: a report on seven plant families.
Fitoterapia, v.75, n.2, p.149-161, 2004.
RANDRIANALIJAONA, J. A.; RAMANOELINA, P. A. R.; RASOARAHONA,
J.R.E.; GAYDOU, E. M.; Seasonal and chemotype influences on the chemical
P á g i n a | 1 6 6
composition of Lantana camara L. essential oil from Madagascar. Analytica Chimica
Acta, v.545, p.46-52, 2005.
REIS, G. G.; PEISINO, A. L.; ALBERTO, D. F.; MENDES, M. F.; CALÇADA, L. A.;
Estudo do efeito da secagem em convecção natural e forçada na composição do óleo
essencial de citronela (Cymbopogon nardus). Revista Brasileira de Plantas Medicinais,
v.8, n.4. p.47-55, 2006.
RIZZO, J. A., FERREIRA, H. D. Hancornia Gomes no estado de Goiás. In:
CONGRESSO NACIONAL DE BOTÂNICA, 36, 1985. Curitiba. Anais da Sociedade
Botânica do Brasil. Brasília, v.1, n.36, p.363-368, 1990.
RODRIGUES, C. M.; BRITO, A. R. M. S.; HIRUMA-LIMA, C. A; VILEGAS, W.
Constituintes Químicos das Cascas de Hancornia speciosa Gomes. In: 29ª Reunião
Anual da Sociedade Brasileira de Química. Águas de Lindóia-SP, 2006.
RODRIGUES, C. M.; RINALDO, D.; DOS SANTOS, L. C.; MONTORO, P.;
PIACENTE, S.; PIZZA, C.; HIRUMA-LIMA, C. A.; BRITO, A. R. M. S.; VILEGAS,
V. Metabolic fingerprinting using direct flow injection electrospray ionization tandem
mass spectrometry for the characterization of proanthocyanidins from the barks of
Hanconia speciosa. Rapid Communications in Mass Spectrometry, v.21, p.1907-1914,
2007.
ROUT, P. K.; MIRSA, R.; SAHOO, S.; SREE, A.; RAO, Y. R. Extraction of kewda
(Pandanus fascicularis Lam.) flowers with hexane: composition of concrete, absolute
and wax.Flavour and Fragrance Journal, v.20, p.442-444, 2005.
SAMPAIO, T. S.; Estudo Fitoquímico de Hancornia speciosa Gomes: Isolamento,
Determinação Estrutural e Atividade Biológica. 2008. Dissertação (Mestrado em
Química) – Departamento de Química, Universidade Federal de Sergipe.
P á g i n a | 1 6 7
SAMPAIO, T. S.; NOGUEIRA, P. C. L. Volatile components of mangaba fruit
(Hancornia speciosa Gomes) at three stages of maturuty. Food Chemistry, v.95, n.4, p.
606-610, 2006.
SANTOS, L. De A. Estudo químico e das atividades citotóxica, antioxidante e
antifúngica de Prunus myrtifolia L. (Urban.) (Rosaceae). 2005. Tese (Doutorado em
Química) – Departamento de Química, Universidade Estadual Paulista – UNESP.
SENNBLAD, B.; BREMER, B. Familial and subfamilial relationships in the
Apocynaceae and Asclepiadaceae evaluated with rbcL data. Plant Systematics and
Evolution, v.202, n.3, p.153-175, 1996.
SERCHELI, R. Da S. Conversão Catalítica de Óleo de Pinus em Alcoóis Terpênicos
Usados como Fragâncias e Aromas. 1996. Dissertação (Mestrado em ) – Instituto de
UNICAMP.
SIANI, A. C.; SAMPAIO, A. L. F.; De SOUZA, M. C.; HENRIQUES, M. G. M.;
RAMOS, M. F. S. Óleos essenciais. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, p.38-43,
2000.
SILVA, C. G.; HERDEIRO, R. S.; MATHIAS, C. J.; PANEK, A. D.; SILVEIRA, C. S.,
RODRIGUES, V. P.; RENNÓ, M. N.; FALCÃO, D. Q.; CERQUEIRA, D. M.;
MINTO, A. B. M.; NOGUEIRA, F. L. P.; QUARESMA, C. H.; SILVA, J. F. M.;
MENEZES, F. S.; ELEUTHERIO, E. C. A.. Evaluation of Antioxidant Activity of
Brazilian Plants. Pharmacological research, v.52, p.229-233, 2005.
SILVA, C. A. De M. Contribuição ao Estudo Químico e Biológico de Pouteria
Gardnerii (Mart. & Miq.) Baehni (Sapotaceae). 2007. Dissertação (Mestrado em
Ciências da Saúde) – Instituto de Ciências da Saúde, Universidade de Brasília.
P á g i n a | 1 6 8
SILVA, E. De O.; Propagação e Armazenamento de Sementes de Mangabeira
(Hancornia Speciosa Gomes). 2010. Dissertação (Mestrado em Agronomia) – Instituto
de Agronomia, Universidade Federal da Paraíba.
SILVA, J. R. De A.; AMARAL, A. C. F.; Da SILVEIRA, C. V. REZENDE, C. M.;
PINTO, A. C. Quantitative determination by HPLC of iridoids in the bark and látex of
Himatanthus sucuuba. Acta Amazonica, v.37, n.1, p.119-122, 2007.
SILVA JUNIOR, J. F. A Cultura da Mangaba. Revista Brasileira de Fruticultura, v.26,
n.1, p.1-192, 2004.
SILVA, N. A.; OLIVEIRA, F. F.; COSTA, L. C. B.; BIZZO, H. R.; OLIVEIRA, R. A.;
Caracterização química do óleo essencial de erva cidreira (Lippia Alba (Mill). N. E.
Brown) cultivada em Ilhéus na Bahia. Revista Brasileira de Plantas Medicinais,v.8, p.
52-55, 2006.
SILVERSTEIN, R. M.; WEBSTER, F. X.; KIEMLE, D. J. Identificação
espectrométrica de compostos orgânicos. 7ªed. 490p., 2007.
SIMÕES, A. O. As Apocynaceae s. str. Da Regiao de Carranca, MG. 2000. Tese
(Doutorado em Biologia Vegetal) – Instituto de Biologia, UNICAMP.
SIMÕES, C. M. O., SCHENKEL, E. P., GOSMAN, G., De MELLO, J. C. P., MENTZ,
L. A., PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6thed. Porto
Alegre: UFRGS/EDUFSC. p.467-468, 1104p, 2007.
Sistema de monitoramento Agrometeorológico (Agritempo). Disponível
em:<http://www.agritempo.gov.br/agroclima/sumario>.Acesso em 15 de fev. 2010.
SHARMA, O. P., BHAT, T.K. DPPH antioxidant assay revisited. Food Chemistry,
v.113, n.4, p.1202-1205, 2009.
P á g i n a | 1 6 9
SKEHAN, P., STORENG, R., SCUDIERO, D., MONKS, A., MCMAHON, J.,
VISTICA, D., WARREN, J.T., BODESCH, H., KENNEY, S., BOYD, M. R. New
colorimetric cytotoxicity assay for anticancer – drug screening. Journal of the National
Cancer Institute., v.82, n.13, p.1107-1112, 1990.
SOARES, F. P.; PAIVA, R.; CAMPOS, A. C. A. L.; PORTO, J. M. P.; NOGUEIRA, R. C.;
STEIN, V. C. Germinação de sementes de mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) em
diferentes substratos. Revista Brasileira de Biociências, v.5, n.2, p.1180-1182, 2007.
SOARES, F. P., PAIVA, R., STEIN, V. C., NERY, F. C., NOGUEIRA, R. C., De
OLIVEIRA, L. M. Effect of culture media, GA(3) concentrations and pH on in vitro
germination of Hancornia speciosa Gomes. Ciência e Agrotecnologia., v.33, p.1847-
1852, 2009.
SOBRINHO, D. C.; HAUPTLI, M. B.; APPOLINÁRIO, E.V.; KOLLENZ, C. L.M.;
DE CARVALHO, M.G.; BRAZ-FILHO, R. Triterpenoids isolated from Parahancornia
amapa. Journal of Brazilian Chemical Society, v.2, p.15-20, 1991.
SOUSA, C. Da S.; SILVA, S. A.; COSTA, M. A. P. De C.; DANTAS, A. C. V. L.;
FONSECA, A. A.; COSTA, C. A. L. De C.; De ALMEIDA, W. A. B.; PEIXOTO, C. P.
Mangaba: perspectivas e potencialidades. Bahia Agrícola, v.7, n.1, p. 29-31, 2005.
SPEZIALI, M. G. Síntese de Produtos Fragrantes Através da Oxidação Catalítica de
Olefinas de Origem Natural. 2008. Dissertação (Mestrado em Química) – Instituto de
Química, Universidade Federal de Minas Gerais.
TAKACS, S.; GRIES, G.; GRIES, R. Communication ecology of webbing clothes
moth: Identification of male- and female-produced pheromones. Chemoecology, v.11,
p.153-159, 2001.
P á g i n a | 1 7 0
TAVEIRA, F. S. N.; LIMA, W. N.; ANDRADE E.H.A.; MAIA, J.G.S. Seazonal
essential oil variation of Aniba Canelilla. Biochemical and Systematics and Ecology
v.31, p.69-75, 2003.
VAN DEN DOOL, H.; KRATZ, P.D.J. A generalization of the retention index system
including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. Journal
of Chromatography, v.11, p.463-471, 1963.
VIEIRA NETO, R.D. Cultura da mangabeira. Aracaju: Embrapa-CPATC, 1994. 16p.
(Circular Técnica, 02).
VIEIRA NETO, R. D. Frutíferas potenciais para os tabuleiros costeiros e baixadas
litorâneas. Aracaju: Embrapa Tabuleiros Costeiros/EMDAGRO, 2002. 216p.
ZHAO, C. X.; LI, X. N.; LIANG, Y. Z.; FANG, H. Z.; HUANG, L. F.; GUO, F.
Q.Comparative analysis of chemical components of essential oils from different
samples of Rhododendron with the help of chemometrics methods.Chemometrics and
Intelligent Laboratory Systems,v.82, p.218-228, 2006.
YUNES, R. A., FILHO, V. C. Química de produtos naturais: novos fármacos e a
moderna farmacognosia. 2nd ed., p.221-276. 319p., 2009.
P á g i n a | 1 7 1
Top Related