Disciplina de Bioquímica Estrutural
Curso de Biologia
Enzimas – Introdução
e Cinética
Prof. Marcos Túlio de Oliveira
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Enzimas
GRANDE maioria formada por proteínas
(algumas enzimas são formadas por RNA)
Composto A (substrato)
Composto B (produto)
Centro ativo ou sítio
catalítico de uma
enzima é a porção da
molécula onde ocorre a
atividade catalítica.
Observe que não há
consumo ou modificação
permanente da enzima
Reação
catalisada
pela enzima
Enzimas
Função: Catalizadores de reações químicas (aceleração das
reações químicas, especificidade pelo substrato, funcionam em
diversas condições de temperatura e pH)
Enzimas
+ +
Enzima holozima
Apoenzima parte proteica
Parte Não proteica (cofator)
metal
coenzima
.
Enzimas
apoenzima holoenzima
Coenzimas participam do ciclo catalítico das enzimas recebendo ou fornecendo grupos químicos para a reação
grupo prostético
Enzimas
Classificação das Enzimas
Normalmente se adiciona o sufixo ase ao nome do substrato ou à atividade realizada: Urease – hidrolisa a uréia DNA-polimerase – polimeriza DNA Agora…. Nomenclatura oficial das enzimas é dada pela Enzyme Comission da International Union for Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) : Exemplo... ATPase: EC 3.6.1.3 - é uma hidrolase.........................3 - atua num anidrido......................3.6 - o anidrido contém fosfato..........3.6.1 - esse anidrido é ATP.....................3.6.1.3
1. Óxido-redutases
( Reações de óxido-
redução).
Transferência de elétrons
Se uma molécula se
reduz, há outra que se
oxida.
2. Transferases
(Transferência de grupos
funcionais)
•grupos aldeído
•gupos acila
•grupos glucosil
•grupos fosfatos (quinases)
3. Hidrolases
(Reações de hidrólise)
•Transformam polímeros em monômeros.
Atuam sobre:
•Ligações éster
•Ligações glicosídicas
•Ligações peptídicas
•Ligações C-N
4. Liases
(Adição a ligações
duplas)
•Entre C e C
•Entre C e O •Entre C e N
5. Isomerases
(Reações de
isomerização)
6. Ligases
(Formação de ligações
covalentes com gasto de
ATP)
•Entre C e O
•Entre C e S
•Entre C e N
•Entre C e C
enzima
sítio ativo
(catalítico)
substrato
Como as enzimas funcionam...
Como as enzimas funcionam...
Como as enzimas funcionam...
como a reação progride
mudança de
energia durante
a reação
variação de energia livre
padrão (bioquímica)
energias de
ativação
Como as enzimas funcionam...
... e não aqui!
É aqui que as enzimas
agem!!!
Como as enzimas funcionam...
energia de
ativação SEM
catalizador
energia de
ativação COM
catalizador
Como as enzimas funcionam...
intermediários da
reação
Como as enzimas funcionam...
passo limitante
da reação
Como as enzimas funcionam...
Enzimas
+ +
A energia de ativação é monstruosa!!!
Enzimas acelaram reações várias
ordens de grandeza
Enzima
Velocidade na
ausência de enzima
“Reações/segundo”
Velocidade da
reação catalisada
“Reações/segundo”
Poder
catalítico
Anidrase carbônica
Triosefosfato isomerase
Carboxipeptidase A
AMP nucleosidase
Nuclease de estafilococos
1.3 X 10 –1
4.3 X 10 –6
3.0 X 10 –9
1.0 X 10 –11
1.7 X 10 -13
1.0 X 106
4.300
578
60
95
7.7 X 106
1.0 X 109
1.9X 1011
6.0 X 1012
5.6 X 1014
Número de “turnover” ou de renovação: quantas vezes a enzima completa
o ciclo da reação em um segundo
Compare esses números !
moles de S catalisado por segundo
moles de enzima
Número
de
turnover
=
Como as Enzimas Funcionam...
enzima
sítio ativo
(catalítico)
substrato formação de
ligações
covalentes
transientes
com o
substrato!
Como as Enzimas Funcionam...
Intermediário
ES
(E e S ligados
covalentemente)
energia de
ligação
Maior fonte
de energia
livre usada
por enzimas
para abaixar
as energias de
ativação das
reações
Como as enzimas funcionam...
Como as Enzimas Funcionam...
enzima
sítio ativo
(catalítico)
substrato
formação de
várias ligações
fracas dão
especificidade
para ES!
sítio de ligação
Como as Enzimas Funcionam...
Como as Enzimas Funcionam...
+
formação de
várias ligações
fracas dão
especificidade
para ES!
Modelo chave-fechadura Nesse modelo,
o sítio ativo da enzima é pre-formado e
tem a forma complementar à molécula
do Substrato, de modo que outras
moléculas não teriam acesso a ela.
Modelo de encaixe induzido Nesse
modelo, o contacto com a molécula do
substrato induz mudanças
conformacio-nais na enzima, que
otimizam as intera-ções com os resíduos
do sítio ativo. Esse é o modelo aceito hoje
em dia.
Modelo Chave-Fechadura
Modelo de encaixe induzido
Como as Enzimas Funcionam...
Exemplo do modelo de encaixe induzido (Carbopeptidase)
A direita: A ligação do substrato L-fenil lactato (em vermelho) causa uma profunda mudança conformacional nas vizinhanças do sítio ativo da carboxipeptidase A.
A esqueda: o sítio catalítico dessa enzima é formado pelos resíduos de Tyr248 (em amarelo) e de Glu270 (azul claro), e um átomo de Zn2+ (cinza).
A B
Exemplo do modelo de encaixe induzido (Carbopeptidase)
A direita: A ligação do substrato L-fenil lactato (em vermelho) causa uma profunda mudança conformacional nas vizinhanças do sítio ativo da carboxipeptidase A.
A esqueda: o sítio catalítico dessa enzima é formado pelos resíduos de Tyr248 (em amarelo) e de Glu270 (azul claro), e um átomo de Zn2+ (cinza).
A B
Como as Enzimas Funcionam...
Determinar a taxa (velocidade) da reação e como esta muda em resposta a
mudanças nos parâmetros experimentais – abordagem central para estudar o
mecanismo de reações catalisadas por enzimas.
Cinética Enzimática Uma abordagem à compressão do mecanismo
Equação de Michaelis-Menten:
Cinética Enzimática
V0 = Vmax [S]
Km + [S]
Michaelis e Menten formularam as bases da cinética enzimática, para explicar como a concentração do substrato [S] afeta a velocidade da reação .
V0 = Vmax [S]
Km + [S]
Para se chegar à equação da hipérbole do gráfico V x S…
[S] muda com o passar do tempo em uma reação
enzimática in vitro. E daí?
Cinética Enzimática
tempo
[S]
1 2 3 4 5 6
Cinética Enzimática
[S] [E]
Enzima funciona a todo vapor e a mudança na [S] é
mínima durante o estágio inicial da reação.
tempo
[S]
15 30 45 60
É por isso que a gente olha para a velocidade inicial (V0)
Cinética Enzimática
Praticamente linear; ou
seja, quanto mais
substrato, maior a V0
Cinética Enzimática
Saturação! Não adianta
adicionar substrato, a V0 não
muda significativamente.
[S] [E],
portanto
[ES] é
favorecido
Cinética Enzimática
[S] [E],
portanto
[E] é
favorecido
[S] [E],
portanto
[ES] é
favorecido
Cinética Enzimática
[S] [E],
portanto
[E] é
favorecido
Cinética Enzimática
Cinética Enzimática
y = m . x + b equação
de reta
Cinética Enzimática
Cinética Enzimática
Cinética Enzimática
Km = k-1 = Kd
k1
Nesta condição, Km mede a afinidade da
enzima pelo substrato
Interação Proteína-Ligante
concentração do ligante
porcentagem dos sítios de ligação ocupados
concentração constante da proteína
Cinética Enzimática
kcat
descreve a taxa do passo limitante da reação
equivalente ao número de moléculas de
substrato convertidas a produto em uma
unidade de tempo em uma molécula de enzima,
quando a enzima está saturada com substrato
Cinética Enzimática
moles de S catalisado por segundo
moles de enzima
Número
de
turnover
=
Eficiência catalítica
Kcat/Km - Parâmetro mais adequado para
comparações cinéticas
Condições do meio que afetam estabilidade protéica
• pH
• temperatura
% a
tivid
ad
e e
nzim
áti
ca
má
xim
a
pH ótimo=1,5 pH ótimo=6,8 pH ótimo=9,9
O pH ótimo de uma enzima reflete
variações no estado de ionização de
resíduos de aminoácidos do sítio
ativo.
Fatores que afetam a atividade enzimática
1. Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimas
• Variações de pH: pH ótimo
• Variações de temperatura: temperatura ótima
100-
50-
0-
% a
tivid
ad
e e
nzim
áti
ca
má
xim
a
Temperatura
ótima
Desnaturação
térmica da
proteína
Pouca energia
para a reação
acontecer Ao contrário da curva em
forma de sino no caso da
atividade enzimática versus
pH, a enzima só está
desnaturada em temperaturas
acima da temperatura ótima.
Fatores que afetam a atividade enzimática
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Próxima aula: Enzimas (continuação)
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