© Marie-Pier Veilleux, 2019
Effets de fractions d'écorce de cannelle sur Candida albicans et les cellules épithéliales buccales
Mémoire
Marie-Pier Veilleux
Maîtrise en microbiologie - avec mémoire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
Effets de fractions d'écorce de cannelle sur
Candida albicans et les cellules épithéliales buccales
Mémoire
Marie-Pier Veilleux
Sous la direction de :
Dr Daniel Grenier
ii
Résumé
Candida albicans est un mycète pathogène opportuniste associé à des infections
superficielles et systémiques, en particulier chez les individus immunologiquement
ou médicalement compromis. C. albicans est notamment responsable de
candidoses buccales et de stomatites prothétiques. De plus, les lésions buccales
ulcéreuses (mucosites buccales) résultant de traitements de chimiothérapie et de
radiothérapie sont sensibles aux infections secondaires à C. albicans. Ce mycète
possède une multitude de facteurs de virulence lui permettant de coloniser l’hôte,
de déjouer les défenses du système immunitaire et d’induire un phénomène
inflammatoire. Actuellement traitées avec des antifongiques tels que le nystatin et
le fluconazole, les infections à C. albicans sont de plus en plus difficiles à guérir,
en raison de l’augmentation de la résistance du pathogène à ces molécules. Le but
du projet de recherche consiste à évaluer dans un premier temps les effets de
l’huile essentielle et des proanthocyanidines de cannelle sur la croissance et les
principaux facteurs de virulence de C. albicans. En second lieu, les effets des
mêmes composés sur les cellules épithéliales buccales ont été étudiés.
iii
Abstract
Candida albicans is an opportunistic pathogenic fungus associated with superficial
and systemic infections, particularly in immunologically or medically compromised
individuals. C. albicans is particularly responsible for oral candidiasis and denture
stomatitis. In addition, ulcerative oral lesions (oral mucositis) resulting from
chemotherapy and radiotherapy treatments are susceptible to secondary infections
by C. albicans. This fungus has a multitude of virulence factors allowing it to
colonize the host, to counteract the defenses of the immune system and to induce
an inflammatory response. Currently treated with antifungals such as nystatin and
fluconazole, candidiasis infections are increasingly difficult to cure, due to the
increased resistance of the pathogen to these molecules. The purpose of the
research project was to evaluate the effects of cinnamon essential oil and
proanthocyanidins on the growth and major virulence factors of C. albicans.
Moreover, the effect of the same compounds on oral epithelial cells was
investigated.
iv
Table des matières
Résumé .................................................................................................................... ii
Abstract ................................................................................................................... iii
Table des matières .................................................................................................. iv
Liste des figures ...................................................................................................... vi
Liste des tableaux .................................................................................................. vii
Liste des abréviations, sigles, acronymes ............................................................. viii
Remerciements ....................................................................................................... ix
Avant-propos ........................................................................................................... x
Introduction .............................................................................................................. 1
1) Pathologies buccales à Candida albicans .................................................................. 2
1.1) Candidoses buccales ........................................................................................... 2
1.2) Stomatites prothétiques ....................................................................................... 3
1.3) Mucites buccales ................................................................................................. 3
1.3.1) Pathogenèse de la mucite buccale .................................................................. 5
1.4) Traitements.......................................................................................................... 7
2) Muqueuse buccale et jonctions serrées...................................................................... 8
3) Candida albicans ........................................................................................................ 9
3.1) Généralités .......................................................................................................... 9
3.2) Facteurs de virulence .......................................................................................... 9
3.2.1) Dimorphisme. ................................................................................................ 10
3.2.2) Formation de biofilms. ................................................................................... 10
3.2.3) Activité hydrolytique ...................................................................................... 11
3.2.4) Interactions de C. albicans avec les cellules épithéliales ............................... 11
4) Cannelle et ses composantes .................................................................................. 13
4.1) Généralités ........................................................................................................ 13
4.2) Genre Cinnamomum ......................................................................................... 14
4.3) Huiles essentielles ............................................................................................. 14
4.4) Polyphénols ....................................................................................................... 15
5) Propriétés bénéfiques des polyphénols et huiles essentielles dans le contexte de la santé buccodentaire ..................................................................................................... 15
5.1) Candidose buccale ............................................................................................ 16
5.2) Carie dentaire .................................................................................................... 16
5.3) Maladies parodontales ....................................................................................... 17
v
5.4) Halitose ............................................................................................................. 18
6) Hypothèse et objectifs .............................................................................................. 20
6.1) Hypothèse ......................................................................................................... 20
6.2) Objectifs ............................................................................................................ 20
Chapitre 1 Effects of cinnamon bark fractions on Candida albicans and oral epithelial cells ........................................................................................................ 21
Résumé ........................................................................................................................ 21
Abstract ........................................................................................................................ 22
1) Introduction .............................................................................................................. 24
2) Materials and methods ............................................................................................. 26
2.1) Cinnamon fractions ............................................................................................ 26
2.2) C. albicans and culture conditions ..................................................................... 26
2.3) Determination of the minimum inhibitory and minimum fungicidal concentrations ................................................................................................................................. 26
2.4) Membrane permeability ..................................................................................... 27
2.5) Biofilm formation and killing ............................................................................... 27
2.6) Epithelial cell culture conditions and viability assays .......................................... 28
2.7) Adherence to epithelial cells .............................................................................. 28
2.8) Oral epithelial barrier integrity ............................................................................ 29
2.9) Secretion of cytokines by oral epithelial cells ..................................................... 30
2.10) Statistical analysis ........................................................................................... 30
3) Results ..................................................................................................................... 31
4) Discussion ................................................................................................................ 42
References ................................................................................................................... 46
Discussion et conclusion ....................................................................................... 50
Bibliographie .......................................................................................................... 55
vi
Liste des figures
Introduction
Figure 1. Pathogenèse de la mucite buccale ........................................................... 6
Figure 2. Candida albicans ...................................................................................... 9
Figure 3. Schéma représentant les différentes voies de signalisation déclenchées par les deux morphologies de C. albicans. ............................................................ 13
Chapitre 1
1 Figure 1. Effect of cinnamon bark oil on the membrane integrity of C. albicans ATCC 28266. ......................................................................................................... 32
2 Figure 2. Effect of Cinnulin PF® (panel A) and cinnamon bark oil (panel B) on the growth and biofilm formation of C. albicans ATCC 28266. .................................... 33
3 Figure 3. Scanning electron micrographs of biofilms formed by C. albicans ATCC 28366 grown in the absence (panels A and B) or presence of 62.5 µg/mL of Cinnulin PF® (panels C and D) ............................................................................. 34
4 Figure 4. Effect of cinnamon bark oil on the viability and desorption of a C. albicans ATCC 28366 biofilm.. .............................................................................. 35
5 Figure 5. Effect of Cinnulin PF® on the adherence of C. albicans ATCC 28366 to GMSM-K oral epithelial cells.. ............................................................................... 36
6 Figure 6. Effect of Cinnulin PF® (panel A) and cinnamon bark oil (panel B) on the viability of two oral epithelial cell lines (B11 and GMSM-K).. ................................. 38
7 Figure 7. Effect of Cinnulin PF® (panel A) and cinnamon bark oil (panel B) on the integrity of the epithelial barrier (B11 cell line).. ..................................................... 39
8 Figure 8. Effect of Cinnulin PF® on TNF-α-induced IL-6 (panel A) and IL-8 (panel B) secretion by oral epithelial cells (GMSM-K cell line).. ....................................... 41
vii
Liste des tableaux
Introduction
Tableau 1. Échelle de classification des mucites buccales selon l’Organisation
mondiale de la santé………………………………………………………………….…4
Chapitre 1
Table 1. Minimum inhibitory concentrations (MIC) and minimum fungicidal concentrations (MFC) of cinnamon fractions against C. albicans……….………….31
viii
Liste des abréviations, sigles, acronymes
ADN Acide désoxyribonucléique
Als3 Agglutinin-like protein 3 precursor
ALS Agglutinin-like sequence
CMF Concentration minimale fongicide
CMI Concentration minimale inhibitrice
EGF Facteur de croissance épidermique
ERK1/2 Extracellular signal-regulated protein kinase 1 and 2
HSP Protéine de choc thermique
Hwp1 Hyphal wall protein 1
JNK c-Jun N-terminal kinase
MAPK Mitogen-activated protein kinase
MR Récepteur de mannose
NF-κB Facteur nucléaire-κB
PAMP Motifs moléculaires associés aux pathogènes
PI3K Phosphoinositide 3-kinase
PRR Récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires
ROS Espèces réactives de l'oxygène
SAP Aspartyl protéase sécrétée
STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3
TEER Transepithelial electrical resistance
TLR Récepteur toll-like
TNF-α Facteur de nécrose tumorale alpha
ix
Remerciements
Je tiens à exprimer ma gratitude en premier lieu à mon directeur de recherche, le
Dr Daniel Grenier, pour m’avoir permis de me joindre à son équipe de recherche.
Sa disponibilité, sa patience et sa rigueur scientifique ont permis de me guider tout
au long de ma maîtrise. Je tiens à souligner également son soutien énorme qui a
rendu possible pour moi de saisir une opportunité en or pour ma carrière.
Mes remerciements vont également à mes collègues de laboratoire, que je peux
maintenant appeler mes amis, pour leur aide technique, leur transfert de
connaissances ainsi que leur soutien tout au long de ces deux dernières années. À
Ève, Philippe, Jabrane, Katy et Gaëlle qui ont su alimenter ma réflexion
scientifique et divertir mon esprit au besoin. Un merci tout particulier à Amel Ben
Lagha ainsi qu’à Geneviève LeBel, qui m’ont accompagnée du début jusqu’à la
toute fin, qui ont été d’excellentes mentors et exemples de persévérance et qui ont
largement contribué à mon cheminement.
Je veux exprimer ma reconnaissance à mes parents, qui m’ont épaulée et
encouragée lors de l’ensemble de mes années d’études et qui ont toujours cru en
moi. Un grand merci à mon copain qui m’a grandement appuyé dans les moments
plus difficiles et qui a su me motiver à persévérer.
Finalement, j’aimerais remercier mon comité d’encadrement, composé, en plus de
mon directeur de recherche, de la Dre Fatiha Chandad et du Dr Michel Frenette,
pour leur soutien.
x
Avant-propos
Ce présent mémoire est présenté comme exigence partielle de la maîtrise en
microbiologie de l’Université Laval. Il comprend un article intitulé « Effects of
cinnamon bark fractions on Candida albicans and oral epithelial cells » qui a été
soumis le 27 mai 2019 à la revue BCM Complementary and Alternative Medicine.
L’article est signé par deux auteurs : Dr Daniel Grenier, mon directeur de maîtrise
et moi-même, comme auteure principale. J’ai réalisé l’entièreté des
expérimentations de mon projet, sous la supervision du Dr Grenier. J’ai également
écrit le premier jet de l’article, que le Dr Grenier a corrigé et formaté pour
publication. Le Dr Grenier est professeur titulaire à la Faculté de médecine
dentaire de l’Université Laval et chercheur au sein du Groupe de recherche en
écologie buccale (GREB). Ses secteurs d’activités concernent entre autres la
microbiologie buccale, les maladies parodontales, le contrôle de l’infection, les
interactions hôtes-pathogènes lors d’infections buccales et les polyphénols de
plantes et de petits fruits.
1
Introduction
Un vieil adage mentionne que la santé de notre bouche est le miroir de notre
santé. Ce dicton ne ment pas. De nombreuses affections buccales et dentaires
peuvent avoir des incidences sur le bien-être ainsi que sur la santé globale d’un
individu. D’ailleurs, des soins orthodontiques rudimentaires et des plombages
grossiers ont été retrouvés sur la dentition de personnes ayant vécu 8 000 avant
Jésus-Christ, démontrant ainsi que l’intérêt médical envers la cavité buccale était
déjà présent [1]. Nous sommes aujourd’hui conscients de toute la complexité de la
santé bucco-dentaire. Ainsi, plusieurs spécialités médicales s’y consacrent
entièrement.
La cavité buccale est un environnement propice au développement d’une flore
microbienne complexe et diversifiée [2]. Les muqueuses buccales et linguales
abritent principalement des bactéries dites aérobies, alors que les sulcus dentaires
sont plutôt colonisés par des bactéries anaérobies [2]. Plusieurs de ces
microorganismes commensaux peuvent toutefois exprimer un pouvoir pathogène
et devenir nuisibles pour l’homéostasie de la bouche, notamment lorsque l’individu
devient immunosupprimé. Les causes les plus fréquentes d’immunodépression
sont les maladies immunosuppressives et les traitements anticancéreux.
Les cancers font partie des maladies qui marqueront le 21e siècle. Bien que les
traitements aient progressé au fil des ans, ils sont incontestablement reconnus
pour leurs nombreux effets secondaires; perte de cheveux, nausée,
vomissements, fatigue [3]. Un effet secondaire légèrement moins connu, mais
aucunement banal et tout aussi fréquent est la mucite. Ces dommages causés par
les traitements anticancéreux peuvent affecter plusieurs types de muqueuses,
comme les muqueuses intestinales ou encore celles de la cavité buccale [3,4]. Ce
sont les infections liées aux muqueuses de la cavité buccale qui nous intéressent
particulièrement dans le cadre de ce mémoire [4,5], en particulier celles causées par
la levure Candida albicans.
2
1) Pathologies buccales à Candida albicans
1.1) Candidoses buccales
La candidose est une infection provoquée par les levures du genre Candida.
C. albicans est l’espèce la plus souvent associée aux candidoses buccales.
Normalement avirulent chez le sujet en santé et immunocompétent, C. albicans est
un commensal qui fait partie entre autres de la flore normale de la cavité buccale,
du tractus vaginal et intestinal [6,7]. C’est un mycète opportuniste qui peut devenir
pathogène lors d’un changement chez l’hôte, tel qu’un déséquilibre du potentiel
hydrogène (pH), un changement nutritionnel ou encore la prise d’un
antibiotique [8,9]. Les nourrissons en sont souvent atteints en raison de leur système
immunitaire qui n’est pas arrivé complètement à maturité [10]. Ces infections
fongiques sont souvent superficielles et plutôt localisées, mais peuvent également
causer des septicémies sévères et des chocs septiques lorsqu’il y a une invasion
des tissus. Ce stade plus sévère est responsable d’un haut taux de mortalité
pouvant atteindre 30-70% [11–13]. On retrouve fréquemment une colonisation par C.
albicans dans le cas de patients immunodéprimés, comme ceux recevant des
traitements de chimiothérapie ou chez les personnes atteintes du virus de
l’immunodéficience humaine [11,14]. L’usage de corticostéroïdes, qui ont un effet
immunosuppresseur localisé, peut également mener à une candidose buccale [15].
La candidose buccale est reconnaissable par l’apparition de plaques blanchâtres
sur les surfaces buccales comme la langue, les joues intérieures, les gencives et le
palais. La présence de lésions douloureuses et de fendillement aux commissures
des lèvres sont également des symptômes distinctifs [16,17]. De plus, cette infection
peut amener des difficultés à manger ou encore une perte de goût. Lorsque
l’infection devient invasive, elle peut causer de la fièvre, une baisse de la pression
sanguine et de la production d’urine ainsi qu’un souffle cardiaque. La candidose
systémique peut mener jusqu’à l’arrêt du fonctionnement des organes, ce qui
entraîne le décès [18].
3
1.2) Stomatites prothétiques
La stomatite prothétique est une inflammation ainsi qu’un érythème des tissus
chez les porteurs de prothèses dentaires partielles ou complètes amovibles. Il
s’agit de l’affection buccale la plus commune chez les sujets édentés avec une
fréquence qui varie entre 10 et 75 % [19]. La grande variation dans l’estimation de
sa fréquence est probablement due au fait qu’elle soit sous-diagnostiquée
puisqu’elle est souvent asymptomatique. En effet, seulement une minorité ressent
des symptômes comme de la douleur, des démangeaisons, une sensation de
brûlure ou encore un enflement des muqueuses. Plusieurs facteurs étiologiques
sont associés à la stomatite prothétique, quoiqu’elle demeure encore mal
comprise. Un traumatisme des muqueuses causé par à une prothèse dentaire mal
ajustée, une xérostomie, ainsi qu’une hygiène buccale et prothétique déficiente
sont souvent identifiés. Également, lorsque la prothèse est portée de nuit, la
formation de biofilm ainsi que la diminution du flux salivaire empêchent
l’oxygénation optimale des muqueuses, ce qui diminue la résistance de l’hôte à
l’invasion par les microorganismes buccaux. À cet égard, il est souvent rapporté
dans la littérature que C. albicans est un facteur étiologique important de cette
affection, puisqu’il s’agit du microorganisme le plus souvent isolé des personnes
atteintes. De plus, les biofilms de C. albicans sont capables d’adhérer autant à des
substances organiques et inorganiques, comme les muqueuses buccales et les
prothèses dentaires [20–23].
1.3) Mucites buccales
Les mucites, également appelées mucosites, sont des stomatites qui entraînent
une inflammation des muqueuses oropharyngées souvent accompagnée d’une
douleur et parfois d’ulcérations (figure 1) [24]. Elles sont, pour la plupart,
considérées comme un effet secondaire chez les patients recevant des traitements
de chimiothérapie [25,26]. Les personnes souffrant d’un cancer dans la région de la
tête et du cou en sont pratiquement toutes atteintes; environ 89 % des patients
traités par chimiothérapie combinée avec de la radiothérapie, et 40 % des patients
traités par chimiothérapie uniquement [27]. Les caractéristiques de la mucite
4
peuvent différer dans le cas où le patient ne recevrait qu’un seul des deux
traitements [28]. La chimiothérapie est administrée de façon systémique alors que la
radiothérapie agit localement sur une zone précise, ce qui peut impliquer des voies
biologiques légèrement différentes. Aussi, l’incidence des mucites peut augmenter
de façon significative au cours des différents cycles de traitements puisque ses
effets sont cumulatifs [26].
La mucite peut résulter de deux types d’agressions différentes. La première est
l’agression directe sur les cellules des muqueuses par des agents cytotoxiques,
comme les anticancéreux, incluant l’irinotécan [29,30], le fluorouracil [31] ou le
panitumumab, un inhibiteur du récepteur du facteur de croissance épidermique
(EGF) [24,32]. Le deuxième type d’agression, cette fois-ci indirect, est dérivé de la
neutropénie et de la surinfection locale par des agents viraux, fongiques ou
bactériens [24]. Ces patients, immunodéprimés et affaiblis par ces traitements
toxiques, sont plus susceptibles de voir la stomatite primaire infectée par un agent
pathogène opportuniste, dont C. albicans. Les symptômes de la mucite sont très
variables. Certains patients pourraient ne présenter aucun signe clinique alors que
d’autres peuvent ressentir des sensations de brûlure, de picotement ou encore une
altération du goût [33]. L’Organisation mondiale de la santé a mis au point une
échelle de classification des mucites buccales qu’elle a répartie en 5 catégories [34].
Tableau 1. Échelle de classification des mucites buccales selon l’Organisation mondiale de
la santé [34]
Grade Critères
0 Aucune mucite
1 Érythème et douleur
2 Ulcère; capacité à manger solide
3 Ulcère; nécessite un régime liquide
4 Ulcère; alimentation non possible
Cette classification est la plus largement utilisée et se base sur la présence de
lésions, le seuil de douleur ainsi que la capacité du patient à s’alimenter. Plus le
grade est élevé, plus le patient souffrira de la présence des ulcères et plus il aura
5
de la difficulté à s’alimenter. Cette échelle permet entre autres de diriger les
cliniciens vers les traitements pour une prise en charge optimale.
1.3.1) Pathogenèse de la mucite buccale
À l’état d’homéostasie, la muqueuse se renouvelle constamment. Les cellules
basales produisent de nouvelles cellules qui migrent vers le haut pour aller
remplacer celles se trouvant au niveau de la couche superficielle. La durée de ce
remplacement varie entre 5 et 14 jours.
Lorsque le patient entreprend les traitements de chimiothérapie ou de
radiothérapie, la première phase de la pathogenèse s’enclenche. Les agents
anticancéreux ciblent principalement les cellules à division rapide, c’est-à-dire
autant les cellules cancéreuses que les cellules épithéliales. Ces dommages
directs à l’acide désoxyribonucléique (ADN) provoquent la mort cellulaire, soit
mitotique ou apoptotique, ce qui empêche l’épithélium de se renouveler [35]. Ainsi,
la muqueuse buccale s’amincit lentement, ce qui mènera, à terme, à l’ulcération
des tissus [36,37].
La phase d’initiation est également caractérisée par un stress oxydatif causé par la
production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) [38]. La chimiothérapie, la
radiothérapie ainsi que le stress oxydatif amorcent alors une série de cascades de
signalisations que l’on appelle la phase de réponse primaire (phase II). Les ROS
induisent la transcription de plusieurs facteurs cruciaux dans la réponse
inflammatoire, comme le facteur nucléaire-κB (NF-κB) ainsi que le Signal
transducer and activator of transcription 3 (STAT3), tous deux associés à
l’activation de gènes codant pour des cytokines inflammatoires menant à des
dommages tissulaires [35,38]. Physiologiquement, les deux premières phases de la
pathogenèse de la mucite ont des effets quasi immédiats, alors que les signes
cliniques peuvent prendre de quatre à cinq jours avant de faire leur apparition [35].
La phase III, l’amplification, est directement liée à la précédente. De nombreuses
molécules impliquées dans la réponse primaire ont une capacité de rétroaction
6
positive et négative et peuvent ainsi influencer la réponse tissulaire. Les cellules du
système immunitaire libèrent des médiateurs inflammatoires tels que le facteur de
nécrose tumorale alpha (TNF-α), qui peut amplifier l’activation de NF-κB et initier
d’autre voie, de signalisation ce qui déclenche une cascade inflammatoire et un
effet boule de neige [36,39].
L’accumulation de tous ces facteurs entraîne finalement la phase la plus critique
autant pour le patient que son clinicien. La phase d’ulcération résulte en un bris de
la barrière épithéliale. C’est la phase la plus symptomatique. Les ulcères peuvent
traverser l’épaisseur complète de l’épithélium. De plus, la salive, qui joue des rôles
essentiels dans la protection des tissus oraux par ses propriétés antibactériennes
et antifongiques, voit son débit diminué par les traitements du cancer [36,40,41]. La
variété de la flore microbienne additionnée à l’immunodéficience des patients
provoque fréquemment l’infection des plaies par des microorganismes
pathogènes, comme la levure opportuniste C. albicans.
Figure 1. Pathogenèse de la mucite buccale. Image adaptée de Sonis (2004) [42]
7
1.4) Traitements
Les traitements des candidoses buccales sont basés sur l’utilisation
d’antifongiques topiques ou systémiques et doivent être prescrits par le clinicien.
Les patients asthmatiques qui utilisent des inhalateurs de cortisone peuvent se
rincer la bouche après l’inhalation ou encore protéger les muqueuses pendant le
traitement pour éviter que les muqueuses soient exposées trop longtemps aux
corticoïdes. Pour les stomatites prothétiques infectées par C. albicans, des
mesures strictes d’hygiène doivent être instaurées (nettoyage mécanique et
chimique de la prothèse et de la bouche). De plus, éviter le port de la prothèse la
nuit et l’utilisation de solutions de trempage nettoyantes et désinfectantes est
recommandée. Un ajustement adéquat de la prothèse ou encore le remplacement
d’une vieille prothèse par une nouvelle peut également être suggéré si l’atteinte
aux muqueuses était due à celles-ci [21].
Les traitements actuels contre les mucites portent beaucoup sur la prévention et le
soulagement des symptômes. Une hygiène buccale stricte avec une brosse douce,
l’évitement du tabac, des boissons alcoolisées ou acides et des mets épicés ainsi
que l’implantation de rinçages avec des solutions douce (eau pure, solution
physiologique, solutions de bicarbonate de soude) sont fortement suggérés.
Pendant les traitements, la prise de bains de bouche glacée ou l’usage de la
cryothérapie peut induire la vasoconstriction et ainsi diminuer le risque d’exposition
de la muqueuse aux agents toxiques. Concernant la prise en charge de la douleur,
les cliniciens peuvent avoir recours entre autres à des antalgiques topiques
(lidocaïne, morphine) et au laser à basse énergie. D’autres agents peuvent être
également administrés pour protéger au niveau cellulaire, ainsi que pour stimuler
la régénération des muqueuses [24,36,43,44]. C’est lorsque la mucite devient infectée
notamment par C. albicans que le traitement devient plus complexe.
Les molécules thérapeutiques les plus utilisées sont font partie de la classe des
polyènes, comme le nystatin et l’amphotéricine B, et de la classe des azoles,
comme le fluconazole. Les polyènes se lient de façon irréversible à l’ergostérol de
la membrane cellulaire de la levure, ce qui provoque la création de pores dans
8
celle-ci. L’intégrité de la membrane est ainsi perturbée et entraîne la mort du
microorganisme. Les molécules de la classe des azoles agissent quant à elles sur
une enzyme du cytochrome P-450, ce qui empêche la synthèse de l’ergostérol,
une composante essentielle de la membrane cellulaire [45–48]. Cependant,
l’utilisation de ces agents antifongiques s’avère de moins en moins efficace, en
raison de l’émergence d’un grand nombre de mécanismes de résistance face à
ces molécules [49,50].
2) Muqueuse buccale et jonctions serrées
La muqueuse buccale protège les tissus sous-jacents des dommages physiques,
chimiques et microbiens et contribue ainsi activement au maintien d’une santé
bucco-dentaire. Outre son rôle protecteur des tissus, on lui attribue également des
fonctions gustatives et sensorielles. Elle est composée d’un épithélium malpighien
(pavimenteux stratifié) plus ou moins kératinisé selon sa localisation, avec un tissu
conjonctif nommé lamina propria ou encore chorion. La lamina propria est
constituée de cellules, de vaisseaux sanguins et de nerfs [51]. Sur la surface
externe des lèvres, le dos de la langue, la gencive et le palais dur, on retrouve un
épithélium kératinisé [52]. La plus large partie de la muqueuse buccale est la
muqueuse bordante, qui revêt entre autres les joues, le palais mou et la face
ventrale de la langue et qui n’est pas kératinisée [53,54]. L’épithélium buccal se
renouvelle constamment. Les cellules basales se divisent puis se différencient et
migrent vers le haut du tissu, comme une rotation ou communément appelé en
anglais « turnover ». Le temps que nécessite cette rotation est différent selon la
région et diffère si l’épithélium est kératinisé ou non; l’épithélium kératinisé prenant
plus de temps [55]. Certains éléments comme la chimiothérapie ou la radiothérapie
peuvent interférer dans ce renouvellement cellulaire. Ce type de traitement
anticancéreux diminue grandement ce processus, ce qui provoque et fragilise la
muqueuse. Les jonctions serrées scellent les cellules épithéliales entre elles et
assurent une étanchéité. Celles-ci délimitent la frontière entre le domaine
membranaire apicale et basolatérale. On y retrouve entre autres les protéines
nommées claudines et occludines. Ces deux dernières molécules permettent le
9
rapprochement des deux membranes. Elles constituent une barrière semi-
perméable au transport paracellulaire d’ions, de soluté et d’eau [56,57]. Elles sont
dynamiques et changent de formes constamment selon ses interactions avec
différents stimuli internes et externes comme les cytokines ou les
microorganismes [58]. Certains agents pathogènes comme C. albicans peuvent
altérer l’intégrité de ces jonctions, ce qui contribue au phénomène d’invasion
tissulaire [59].
3) Candida albicans
3.1) Généralités
C. albicans est une levure présente dans la flore normale humaine. On la retrouve
chez 45-65% des enfants sains et 30-55% des adultes sains [60]. Tel que mentionné
plus tôt, ce mycète commensal peut exprimer une virulence lors d’un changement
chez l’hôte, comme une prise d’antibiotique, un changement nutritionnel, ou encore
chez les patients immunocompromis. C. albicans est le mycète le plus souvent
impliqué dans les infections fongiques chez l’humain. Sa pathogénicité peut
s’expliquer par ses nombreux facteurs de virulence et sa polyvalence.
Figure 2. Candida albicans. Image de Colm (n.d.) [61]
3.2) Facteurs de virulence
Comme tout agent pathogène, C. albicans possède un vaste éventail de
mécanismes lui permettant de coloniser et d’infecter son hôte. Son
polymorphisme, sa capacité d’adhésion à différentes surfaces, la sécrétion de
10
protéases et d’hydrolases et la formation d’un biofilm font partie des facteurs de
virulence les plus importants de cette levure [62].
3.2.1) Dimorphisme
C. albicans est une levure polymorphe, c’est-à-dire qu’elle croît sous plusieurs
formes : la forme de levure bourgeonnante ovoïde, l’ellipsoïde allongé (pseudo-
hyphe) ainsi que la forme d’hyphe parallèle. [63]. Le rôle précis de chacune des
formes dans la virulence est encore en exploration. Malgré le fait qu’il y ait
présence des deux formes du mycète lors des infections, il est reconnu que C.
albicans est plus virulent sous sa forme hyphe [64]. La capacité d’adhésion,
d’invasion, ainsi que les dommages causés aux cellules épithéliales ont tous été
observés comme étant plus importants lorsque C. albicans était sous sa
morphologie d’hyphes [63,65,66].
3.2.2) Formation de biofilms
Les biofilms consistent en un agrégat de microorganismes enveloppés d’une
matrice polymérique composée d’exopolysaccharides, d’acides nucléiques ainsi
que de protéines [67]. Plusieurs agents pathogènes, tel C. albicans, ont la capacité
de former des biofilms sur plusieurs types de surfaces : abiotiques comme sur des
prothèses dentaires, des cathéters, ou des valves cardiaques, et biotiques telles
que les cellules épithéliales [68]. La National Institutes of Health estime qu’environ
80 % de toutes les infections microbiennes seraient causées directement ou
indirectement par la présence de biofilm [9].
De façon simplifiée, la formation de biofilm peut se résumer en trois étapes. La
première étant l’adhérence des premières cellules planctoniques à une surface.
Ensuite, les cellules prolifèrent et s’agrègent entre elles pour former une couche de
base où s’ancreront les petites colonies (agrégats de cellules planctoniques).
Finalement, il y aura production de la matrice extracellulaire qui viendra encapsuler
et assurer la protection des cellules de C. albicans [69]. Les infections associées
aux biofilms sont plus fastidieuses à traiter que lorsque les microorganismes sont
sous leur forme planctonique, puisqu’ils ont une architecture complexe, une
11
expression accrue des pompes à efflux résultant en une résistance aux
antibiotiques et aux antifongiques, ainsi qu’une souplesse métabolique [68,70]. De
plus, puisque les biofilms agissent comme une communauté complexe,
l’expression des gènes varie également. Ainsi, plusieurs gènes associés à ceux-ci
se retrouvent exprimés, comme les gènes impliqués dans l’adhésion, la résistance
aux antimicrobiens, ainsi que la dispersion des cellules [71]. La dispersion des
cellules de levures provenant d’un biofilm mature a d’ailleurs été démontrée
comme étant directement liée à la virulence. La protéine de choc thermique (HSP)
Hsp90 a été récemment identifiée comme étant un élément clé dans la régulation
de la dispersion des cellules du biofilm de C. albicans. De plus, cette protéine est
également requise dans la résistance aux antifongiques des biofilms [72].
3.2.3) Activité hydrolytique
C. albicans utilise deux différents mécanismes pour envahir les tissus hôtes :
l’endocytose induite ainsi que la pénétration active [73]. L’endocytose est perpétuée
par des protéines spécialisées nommées invasines exprimées à la surface des
levures et servant de médiateurs afin de les lier aux cellules hôtes. C’est ce qui
déclenche l’engloutissement du pathogène à l’intérieur de l’hôte. Deux invasines
ont été identifiées comme jouant un rôle important, soit l’agglutinin-like protein 3
precursor (ALS3), qui jouait également le rôle d’adhésine, ainsi que Ssa1, qui fait
partie de la famille des heat shock protein 70 (Hsp70) [73,74]. De plus, C. albicans a
la capacité de sécréter des hydrolases, qui sont reconnues pour faciliter la
pénétration active dans les cellules qu’il envahit. Trois classes d’hydrolases sont
connues à ce jour : les protéases, les phospholipases et les lipases [75]. Les plus
importantes sont les aspartyls protéases sécrétées (SAPs), qui regroupent 10
membres, soit SAP1 à SAP10. Leurs rôles inclus entre autres l’invasion des tissus
et l’évasion de la réponse immunitaire. Dans un contexte d’invasion, ce sont les
SAPS 1-6 qui jouent un rôle prédominant [7,75,76].
3.2.4) Interactions de C. albicans avec les cellules épithéliales
C. albicans possède à sa surface un ensemble de protéines nommées adhésines,
qui confèrent un pouvoir d’adhérence aux autres microorganismes, à des surfaces
12
abiotiques ainsi qu’aux cellules de l’hôte [70,72]. Les plus étudiées sont les
agglutinin-like sequence (ALS), une famille de 8 protéines, soit les ALS1-7 et la
ASL-9. Particulièrement importante, la protéine ALS-3 joue un rôle déterminant
dans l’adhésion; elle est d’ailleurs surexprimée lors d’infections buccales [77]. Une
autre adhésine importante est appelée Hyphal wall protein 1 (Hwp1). Elle sert de
substrat pour les transglutaminases des mammifères et cette réaction peut lier de
manière covalente les hyphes de C. albicans aux cellules hôtes. D’ailleurs,
quelques études ont conclu qu’une mutation de cette protéine réduisait l’adhérence
aux cellules épithéliales buccales en plus d’atténuer la virulence dans un modèle
de souris [78–80]. De plus, Hpl1 ainsi que ALS-3 ont aussi été identifiées comme des
contributeurs à la formation du biofilm de C. albicans [81].
Les cellules épithéliales de la muqueuse buccale sont la première ligne de défense
contre C. albicans. Malgré le large éventail de réactions biochimiques qui reste à
élucider, plusieurs mécanismes de défense ont été observés. La détection par
l’hôte de la présence de C. albicans est médiée par les récepteurs de
reconnaissance de motifs moléculaires (PRRs) tels que le récepteur de mannose
(MR) et les récepteurs toll-like (TLR) 2 et 4, entre autres. Ce sont les motifs
moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs) comme les mannans, ou les β-
glucans qui vont venir lier les PRRs. Cela permet le l’activation de plusieurs
mécanismes de signalisation cellulaire tels que le mitogen-activated protein kinase
(MAPK), le NF-κB, et phosphoinositide 3-kinase (PI3K). La voie PI3K est impliquée
dans la protection contre le dommage induit par les hyphes. Les hyphes et les
levures activent chacune les 3 voies MAPK (p38, c-Jun N-terminal kinase [JNK],
extracellular signal-regulated protein kinase 1 and 2 [ERK1/2]), en plus des voies
NF-κB et PI3k. Or, à l’instar des levures, les hyphes induisent la transcription d’une
protéine nommée c-Fos, en plus d’activer MAPK phosphatase 1 (MKP1) depuis la
ERK1/2. C’est la combinaison entre c-Fos et MKP1 qui mène à la libération des
cytokines inflammatoires (Figure 3) [82,83].
Comme C. albicans est généralement faiblement virulent lorsqu’il est sous la forme
de levures, cette dernière est reconnue par le système immunitaire sans toutefois
13
déclencher de fortes réactions inflammatoires, à l’instar de la forme hyphe [82]. Un
autre joueur clé dans la réponse immunitaire des cellules épithéliales à C. albicans
est la production de peptides antimicrobiens (β-défensines), qui aident à combattre
l’infection fongique, déclenchent d’autres réponses immunitaires, et participent à la
réparation de la barrière épithéliale. [82–85].
Figure 3. Schéma représentant les différentes voies de signalisation déclenchées par les
deux morphologies de C. albicans. Image adaptée de Naglik et al. (2014) [82]
4) Cannelle et ses composantes
4.1) Généralités
La cannelle est utilisée depuis des lustres dans de multiples domaines. On en
trouve plusieurs références dans la Bible et les Égyptiens l’utilisaient dans leur
processus d’embaumement. En médecine traditionnelle, la cannelle était utilisée
comme antiémétique, antidiarrhée ainsi que comme antiflatulence. Aujourd’hui, on
connaît la cannelle principalement pour son goût ainsi que son odeur distinctive
utilisée en cuisine et en aromathérapie [86]. C’est la partie intérieure de l’écorce qui
est utilisée pour aromatiser les plats, mais elle sert également, avec les feuilles et
les racines, à produire les multiples huiles essentielles de cannelle.
14
4.2) Genre Cinnamomum
Le genre Cinnamomum fait partie de la famille des Lauraceae. Il s’agit d’arbres et
d’arbustes chez lesquels les feuilles, les rameaux et l’écorce sont gorgés de
molécules aromatiques [87]. L’espèce la plus connue est Cinnamomum verum,
aussi appelée Cinnamomum zeylanicum ou cannelier de ceylan. C’est l’écorce de
cette espèce précise qui donne la cannelle « authentique ». Deux autres espèces
sont également utilisées en cuisine, soit Cinnamomum cassia, aussi appelée
cannelle de Chine, qui produit la casse et Cinnamomum burmannii, dont l’écorce
est aussi vendue sous le nom de cannelle, de moindre qualité cependant [87].
4.3) Huiles essentielles
Les huiles essentielles sont des substances aromatiques que l’on retrouve
naturellement dans différentes parties des arbres, des plantes et des épices. Elles
sont concentrées et très volatiles. Elles ont différentes utilisations telles qu’en
aromathérapie, en cosmétique, en médecine traditionnelle et plusieurs autres.
Chaque huile essentielle est reconnue pour avoir ses propres propriétés [88], mais il
est connu qu’une multitude d’huiles essentielles possèdent des activités
antimicrobiennes [89]. Dans le cadre de ce projet, deux huiles essentielles seront
utilisées. L’huile essentielle de l’écorce ainsi que celle provenant des feuilles de
cannelle provenant de l’espèce Cinnamomum verum sera utilisée.
Comme ces huiles sont des composés concentrés contenant plusieurs molécules
différentes, les substances présentes en plus grande proportion dans ces huiles
seront également utilisées. Plus spécifiquement, l’écorce de cannelle contient
majoritairement une substance nommée cinnamaldéhyde, composée d’un anneau
de benzène rattaché à trois chaînes de carbones, alors que ses feuilles
contiennent principalement de l’eugénol, constitué d’un groupement hydroxyle,
d’un groupement méthoxyle rattaché à son anneau, et qui sont tous deux des
phénylpropanoïdes [90]. L’eugénol est d’ailleurs retrouvé en grande concentration
dans le clou de girofle. Des études in vivo et in vitro réalisées sur des sujets
humains et des animaux ont largement démontré des bénéfices anti-
15
inflammatoires, antimicrobiens et réducteurs de maladies cardiovasculaires de la
cannelle et de ses composés chimiques [91–93].
4.4) Polyphénols
Les polyphénols sont une classe de molécules présentes dans d’innombrables
substances végétales. Ils ont tous en commun la présence d’un ou de plusieurs
noyaux benzéniques incluant des fonctions hydroxyles. Ils sont présents en grande
quantité dans notre alimentation et sont reconnus comme d’excellents
antioxydants. Les proanthocyanidines, une classe de flavonoïdes, sont des
oligomères de flavon-3-ol ou des polymères liés par des liaisons interflavones. Les
proanthocyanidines de cannelle ont déjà démontré des bénéfices au niveau du
contrôle de l’hypertension et du taux glycémie [94]. Ils sont également reconnus
pour leurs propriétés anti-inflammatoires, en inhibant la voie de signalisation NF-
κB [92]. De plus, les proanthocyanidines de la cannelle ont démontré des activités
antimicrobiennes vis-à-vis certaines bactéries telles que Bacillus cereus et
Staphylococcus aureus [92]. Les polyphénols de la cannelle, plus précisément la
Cinnulin PFTM qui sera utilisée dans le cadre de ce projet, a également démontré
des bénéfices dans divers champs de la santé comme dans le contrôle du taux de
sucre dans le sang, dans la régulation des hormones féminines, ou encore dans la
santé gastro-intestinale [95].
5) Propriétés bénéfiques des polyphénols et huiles essentielles
dans le contexte de la santé buccodentaire
L’intérêt scientifique pour ces molécules dérivées des plantes et des fruits est
certainement grandissant dans plusieurs domaines de la santé, comme la nutrition.
De nombreuses équipes de recherche se penchent sur les bienfaits d’une
consommation régulière de ces composés. Dans le domaine buccodentaire, les
effets recensés touchent divers aspects des maladies qui affectent la cavité
buccale, notamment la protection des muqueuses dans le cas d’un cancer, la
diminution de l’halitose, la protection contre les caries, contre les biofilms et plus
encore [96–99]. D’innombrables études et revues de littérature ont clairement
16
démontré que les huiles essentielles et les polyphénols pouvaient être non
seulement utiles dans la gestion de la santé buccodentaire, mais également dans
la santé globale.
5.1) Candidose buccale
Divers extraits de plantes (polyphénols ou huiles essentielles) se sont avérés
efficaces sur plusieurs des facteurs de virulence de C. albicans. Une inhibition de
la croissance de C. albicans a été démontrée à l’aide de la technique de
microdilution en plaque utilisant entre autres les huiles essentielles d’origan
(Origanum vulgare), de sarriette (Satureja montana), de menthe (Mentha piperita)
et de lavande (Lavandula angustifolia) [100,101]. L’huile essentielle de lavande ainsi
que des fractions de la réglisse ont également démontré qu’à basse concentration,
la formation du tube germinatif dans le processus d’élongation en hyphes était
inhibée. Ce qui permet de considérer que ces composés pourraient être utiles
contre le dimorphisme de C. albicans [100,102]. Une autre étude a cette fois-ci établi
l’efficacité des proanthocyanidines de canneberges sur certains facteurs de
virulence de C. albicans, comme la croissance, la formation de biofilm et
l’adhérence de la levure aux cellules épithéliales buccales ainsi qu’à des disques
d’acrylique (pour simuler le port de prothèses dentaires). Cette étude a également
apporté des évidence que les polyphénols de canneberges pourraient s’avérer
utiles dans le contrôle de l’inflammation des muqueuses buccales causé par
C. albicans [103].
5.2) Carie dentaire
La carie dentaire est une maladie d’origine infectieuse qui détruit progressivement
les tissus durs (l’émail, puis la dentine) de la dent et qui, lorsque non traitée, mène
à l’inflammation de la pulpe dentaire et ultimement à sa nécrose. Ces lésions
peuvent causer de vives douleurs chez les personnes atteintes. Pour qu’une carie
se forme, trois facteurs sont requis : des bactéries dites cariogènes, des sucres
fermentescibles, et bien entendu une dent. Le quatrième facteur est le temps;
c’est-à-dire que les bactéries doivent rester en place suffisamment longtemps pour
17
qu’elles puissent se nourrir et produire de l’acide [104]. Certaines personnes, en
dépit d’une bonne hygiène buccale, peuvent être plus sujettes à développer des
caries, que ce soit en raison d’une dominance de bactéries cariogènes présente
dans leur flore buccale normale, ou d’un manque de salivation. Effectivement, pour
deux personnes ayant la même l’hygiène buccale ainsi que la même alimentation,
certaines sont plus à risque de développer des caries [105]. Cela amène un intérêt
des professionnels du domaine à identifier les effets préventifs que pourraient
apporter les polyphénols et les huiles essentielles sur le développement des
caries. Une étude en Thaïlande a testé quelques huiles essentielles (le basilic
doux [Ocimum basilicum], l’écorce de cannelle [C. zeylanicum], le fenouil doux
[Foeniculum vulgare], le poivre noir [Piper nigrum] et la menthe poivrée [Mentha
piperita] sur les bactéries cariogènes Streptococcus mutans et Lactobacillus casei.
Wiwattanarattanabut et al. ont démontré que l’ensemble des huiles choisies avait
un effet antimicrobien sur les deux bactéries. De plus, ils ont établi que jusqu’à
80 % de la formation du biofilm de S. mutans était atténuée, particulièrement avec
l’huile de cannelle [106]. D’autres études se sont penchées sur l’adhérence des
bactéries cariogènes, processus déterminant dans le développement des caries.
La quercétine par exemple, un flavonoïde, a réduit l’adhérence de S. mutans [107].
5.3) Maladies parodontales
Les maladies parodontales sont des maladies infectieuses caractérisées par une
inflammation des tissus de soutien de la dent [108]. Il est estimé qu’une très grande
majorité des adultes souffre d’une parodontite faible ou modérée, mais qu’une
proportion d’environ 5 % à 20 % est touchée par ce problème de façon plus
sévère [109]. Bien que ce soit des maladies causées par de multiples facteurs, les
biofilms jouent un rôle déterminant [110]. La forme mineure, la gingivite, peut-être
renversée par une amélioration de l’hygiène buccale alors que la forme la plus
sévère (parodontite) ne peut être totalement résorbée. Si non traitée, la parodontite
chronique mène à la destruction des tissus parodontaux et de l’os alvéolaire, à la
perte des dents et jusqu’à des complications systémiques comme des troubles
cardiovasculaires, des accouchements prématurés, de l’arthrite rhumatoïde et des
18
infections respiratoires [111–113]. Les destructions tissulaires sont le résultat de
l’activation de la réponse immuno-inflammatoire de l’hôte par les
lipopolysaccharides (LPS) des bactéries parodontopathogènes comme
Porphyromonas gingivalis et Fusobacterium nucleatum [109–111]. En réponse à la
stimulation par des bactéries parodontopathogènes, les cellules épithéliales et les
fibroblastes buccaux peuvent sécréter des cytokines pro-inflammatoires telles que
l'interleukine-6 (IL-6) et l'interleukine-8 (IL-8) [109]. Ces bactéries peuvent également
stimuler les macrophages et induire la sécrétion d’interleukine-1β (IL-1 β), IL-6 et
du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) par les macrophages [111]. Outre les
facteurs directs résultants des interactions hôtes–pathogènes, des causes
psychologiques ont également été mises en lumière et suspectées d’augmenter
les risques de parodontites. Des études ont effectivement montré une prévalence
plus élevée de la parodontite sévère chez les individus souffrant de stress
psychologique [108]. Une étude canadienne a évalué l’impact des polyphénols de
bleuets (Vaccinium angustifolium Ait.) sur une des bactéries jouant un rôle crucial
dans les maladies parodontales, soit F. nucleatum [114]. Les auteurs ont démontré
que ces polyphénols arrivaient à inhiber de 87 % la formation de biofilm et que ces
molécules possédaient un effet antibactérien en inhibant la croissance de la
bactérie, probablement par sa capacité à chélater le fer. Dans un modèle de
macrophages humains, les polyphénols de bleuets ont également inhibé
l’activation de la voie NF-κB, une voie de signalisation associée à l’inflammation
ainsi qu’à l’apoptose cellulaire, et à réduire la sécrétion de l’IL-1β, de TNF-α, et de
l'IL-6 induite par F. nucleatum, des médiateurs de l’inflammation [114].
5.4) Halitose
L’halitose est ce que l’on appelle communément la mauvaise haleine, soit le fait
d’avoir une haleine dégageant une odeur désagréable. Il existe plusieurs causes
possibles à l’halitose, comme une pauvre hygiène buccale, une inflammation des
gencives (maladies parodontales), un désordre du tractus gastro-intestinal ou
encore l’alcool et le tabac [115]. La xérostomie, une sécheresse de la bouche
causée par une diminution du flux salivaire, peut également être un facteur
19
contribuant à l’halitose. La xérostomie peut être un symptôme d’une maladie ou
encore un effet secondaire lié à la prise de certains médicaments [116,117]. Lorsque
le problème est d’origine bactérienne, Solobacterium moorei, une bactérie Gram
positif anaérobie stricte, est le plus souvent impliquée. S. moorei produit du sulfure
d’hydrogène, un gaz issu de la dégradation de protéines et responsable en partie
de l’odeur incommodante [118]. Les propriétés anti-S. moorei de
l’épigallocathéchine-3-gallate (EGCG), un composé du thé vert, ont été récemment
rapportées [119]. L’EGCG a démontré des effets sur la formation du biofilm de
S. moorei, ainsi que sur sa capacité d’adhérence aux cellules épithéliales
buccales. De plus, il a également diminué de façon dose dépendante l’activité de
la β-galactosidase, une enzyme clé dans la cascade menant à la production de
composés sulfurés à partir de glycoprotéines. Des résultats semblables ont
également été rapportés en regard de l’huile essentielle de cannelle [120].
20
6) Hypothèse et objectifs
6.1) Hypothèse
L’hypothèse de ce projet est que les composantes de la cannelle (huile essentielle,
proanthocyanidines) auraient un effet antifongique sur C. albicans, en plus
d’atténuer ses propriétés pathogéniques et d’exercer un effet protecteur sur les
cellules épithéliales de la muqueuse buccale.
6.2) Objectifs
1. Démontrer l’effet de composantes de la cannelle sur la croissance et le biofilm de
C. albicans.
2. Évaluer l’impact de composantes de la cannelle sur l’adhérence de C. albicans aux
cellules épithéliales buccales.
3. Déterminer l’activité de composantes de la cannelle sur la sécrétion de cytokines
pro-inflammatoires induite par le TNF-α chez les cellules épithéliales buccales.
4. Étudier l’effet de composantes de la cannelle sur l’intégrité de la barrière
épithéliale buccale.
21
Chapitre 1 Effects of cinnamon bark fractions on
Candida albicans and oral epithelial cells
Résumé
Candida albicans est un agent pathogène opportuniste pouvant causer des
infections superficielles ou systémiques chez les individus immunologiquement ou
médicalement compromis. Nous avons étudié les effets de deux fractions d’écorce
de cannelle, à savoir une huile essentielle et un extrait aqueux enrichi en
proanthocyanidines (Cinnulin PF®) sur la croissance, la formation de biofilms et
sur les propriétés d’adhérence de C. albicans. Nous avons également utilisé un
modèle de cellules épithéliales buccales pour étudier les effets des deux fractions
sur l'intégrité de la barrière épithéliale et la réponse inflammatoire. Bien que la
Cinnulin PF® n'ait pas réduit la croissance de C. albicans, l'huile d'écorce de
cannelle présentait une activité antifongique élevée, avec des valeurs de CMI et de
CMF comprises entre 0,039 % et 0,078 % (v/v). L'huile de cannelle était également
active contre le biofilm préformé de C. albicans. La capacité de l'huile de cannelle
à perturber la membrane cellulaire de C. albicans pourrait expliquer son activité
fongicide. Fait intéressant, la Cinnulin PF® a empêché la formation de biofilm par
C. albicans et a atténué son adhérence aux cellules épithéliales buccales. À leurs
concentrations efficaces, l'huile de cannelle et la Cinnulin PF® ne présentaient
aucune cytotoxicité significative vis-à-vis les cellules épithéliales buccales. Dans
un modèle in vitro, les deux fractions de cannelle ont renforcé l’intégrité de la
barrière épithéliale buccale, tel que démontré par une augmentation de la
résistance électrique transépithéliale. Enfin, la Cinnulin PF® a inhibé la sécrétion
d'interleukine-6 et d'interleukine-8 par les cellules épithéliales buccales stimulées
par le facteur de nécrose tumorale α. En conclusion, les deux fractions de cannelle
étudiées dans la présente étude pourraient être des agents thérapeutiques
prometteurs pour traiter les infections à C. albicans.
22
Abstract
Candida albicans is an opportunistic pathogen that can cause superficial or
systemic infections in immunologically or medically compromised individuals. We
investigated the effects of two cinnamon bark fractions, i.e., an essential oil and an
aqueous extract enriched in proanthocyanidins (Cinnulin PF®) on the growth,
biofilm formation, and adherence properties of C. albicans. We also used an oral
epithelial cell model to study the effects of the two fractions on the integrity of the
epithelial barrier and the inflammatory response. Although Cinnulin PF® did not
reduce the growth of C. albicans, the cinnamon bark oil exhibited high antifungal
activity, with MIC and MFC values in the range of 0.039% to 0.078%. The
cinnamon oil was also active against a pre-formed C. albicans biofilm. The ability of
cinnamon oil to perturb the C. albicans cell membrane may explain its fungicidal
activity. Interestingly, Cinnulin PF® prevented biofilm formation by C. albicans and
attenuated its adherence to oral epithelial cells. At their effective concentrations,
the cinnamon oil and the Cinnulin PF® displayed no significant cytotoxicity against
oral epithelial cells. In an in vitro model, both cinnamon fractions reinforced the
integrity of the oral epithelial barrier as determined by an increase in transepithelial
electrical resistance. Lastly, Cinnulin PF® inhibited the secretion of interleukin-6
and interleukin-8 by oral epithelial cells stimulated with tumor necrosis factor-α. In
conclusion, the two cinnamon fractions investigated in the present study may be
promising therapeutic agents for treating C. albicans infections.
23
Effects of cinnamon bark fractions on Candida albicans and oral
epithelial cells
.Marie-Pier Veilleux and Daniel Grenier*
Oral Ecology Research Group, Faculty of Dentistry,
Université Laval, Quebec City, QC, Canada
* Corresponding author: Oral Ecology Research Group, Faculty of Dentistry,
Université Laval, 2420 Rue de la Terrasse, Quebec City, QC, Canada, G1V 0A6
Telephone: 418-656-7341. Fax: 418-656-2861. E-mail:
Keywords: Biofilm, Candida albicans, candidiasis, cinnamon, cytokine, epithelial
barrier, essential oil, epithelial cells, oral mucositis, polyphenols
24
1) Introduction
Candida albicans is a commensal fungus that colonizes oral mucosal surfaces and
that is normally harmless in healthy individuals as it is maintained at low levels by
specific and non-specific salivary and mucosal defense mechanisms as well as by
competitive inhibition by oral bacteria [1]. However, under certain circumstances,
this opportunistic microorganism can cause a superficial infection called
candidiasis. Oral candidiasis is characterized by the appearance of white plaques
on inflamed and red mucosa (inner cheeks, tongue, throat) and by pain when
eating or swallowing [1, 2]. If the infection becomes invasive, which can occur in
immunologically and medically compromised individuals, it can cause septicemia
leading to organ failure and eventually death [3]. C. albicans has also been
reported to infect oral mucositis lesions [4, 5], causing inflammation of the
oropharyngeal mucosa [6, 7]. Patients who suffer from cancer affecting the head
and neck and who receive chemotherapy and radiotherapy treatments are almost
all affected by oral mucositis [6, 7].
C. albicans produces several virulence factors that play critical roles in the
pathogenic process leading to superficial or systemic infections [8]. The cell
surface adhesins of C. albicans allow initial adhesion to oral epithelial cells, a key
step prior to subsequent tissue invasion and damage [8-10]. C. albicans can form
biofilms on biotic and abiotic oral surfaces, which is key to enabling the fungus to
accumulate in large amounts and to protecting it from antimicrobial agents and the
host immune system [2, 11, 12]. Additional virulence factors produced by C.
albicans include its ability to switch from the yeast form to an invasive hyphae
morphotype and to secrete proteolytic and lipolytic enzymes [8]. These pathogenic
determinants may be potential targets for new antifungal agents that may limit the
appearance of strains resistant to conventional antifungals.
Despite the availability of antifungal agents to treat C. albicans-associated oral
infections, treatment failures are increasingly common due to the emergence of
resistant strains [13-15]. Given this, investigations of the antifungal potential of new
molecules are highly relevant. In recent years, plant-derived compounds with
25
antifungal potential have attracted the interest of researchers [16]. Cinnamon, a
spice derived from the inner bark of the cinnamon tree, has been reported to
possess a number of therapeutic properties, including antimicrobial activity [17,
18]. In the present study, we investigated the effects of two cinnamon bark
fractions, an essential oil and an aqueous extract enriched in proanthocyanidins,
on the growth, biofilm formation, and adherence properties of C. albicans. In
addition, an oral epithelial cell model was used to study the effects of the two
fractions on the integrity of the epithelial barrier and the host inflammatory
response.
26
2) Materials and methods
2.1) Cinnamon fractions
A cinnamon extract commercialized as Cinnulin PF® was kindly provided by IN
Ingredients Inc. (Spring Hill, TN, USA). The aqueous extract, which was prepared
from the bark of Cinnamomum burmannii, contains 531.9 mg/g of
proanthocyanidins according to the datasheet provided by the company. Cinnamon
bark is relatively unusual as it contains proanthocyanidins with a high number of A-
type bonds [19]. A 20 mg/mL stock solution of the extract was prepared in 50%
dimethylsulfoxide and was sterilized by filtration (0.22-μm pore size). Carrier
solvent was used as a control in all assays. A cinnamon bark essential oil extracted
from Cinnamomum verum, was purchased from Hunzaroma (Longueuil, QC,
Canada). Cinnamaldehyde, the major component of cinnamon bark essential oil,
was purchased from Sigma-Aldrich Canada Co. (Oakville, ON, Canada).
2.2) C. albicans and culture conditions
C. albicans ATCC 28366 and LAM-1 were isolated from cases of oral candidiasis
and systemic candidiasis, respectively. They were cultivated in Sabouraud
dextrose medium (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA) at pH 7 and
37°C.
2.3) Determination of the minimum inhibitory and minimum fungicidal
concentrations
The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration
(MFC) were determined using a microplate dilution assay. To determine the MIC
value, a 24-h culture of C. albicans was diluted in fresh culture medium to an
optical density at 660 nm (OD660) of 0.2. Aliquots (100 μL) of C. albicans were
added to an equal volume of serial dilutions in culture medium of the cinnamon
fractions in 96-well microplates. Wells without C. albicans or without the cinnamon
fractions were used as controls. When testing the cinnamon oil, the microplate was
covered with an adhesive film to avoid evaporation of the volatile compounds. After
27
an incubation at 37°C for 24 h, growth was monitored by recording the OD660 using
a microplate reader (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Canada). Lack of
growth was also assessed visually. The MIC value corresponded to the lowest
concentration of the cinnamon fractions that completely inhibited growth. To
determine the MFC, 5 μL from wells showing no visible growth was spotted on
Sabouraud dextrose agar plates, which were incubated at 37°C for 3 days. The
MFC value corresponded to the lowest concentration of the cinnamon fractions
where no colony formation was observed. The antifungal agent nystatin was used
as a reference antifungal. The MFC/MIC ratio was calculated, and a compound or
fraction was considered fungicidal when the ratio was ≤ 4 and fungistatic when the
ratio was > 4. All assays were performed in triplicate to ensure reproducibility.
2.4) Membrane permeability
The ability of the cinnamon oil at MFC to permeabilize the membrane of C.
albicans ATCC 28366 was evaluated using SYTOX Green dye (Life Technologies
Inc., Burlington, ON, Canada), which binds to DNA once the membrane has been
compromised. The assay was performed as previously described [20]. The
fluorescence resulting from the binding of the dye to DNA was recorded using a
Synergy 2 microplate reader (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) every 15
min for 2 h with the excitation wavelength set at 485 nm and the emission
wavelength set at 528 nm. A reaction mixture without essential oil was used as a
negative control.
2.5) Biofilm formation and killing
The effect of the cinnamon fractions on biofilm formation by C. albicans ATCC
28366 was determined using a microplate dilution assay as described above.
Following growth, the medium and free-floating microorganisms were removed by
aspiration using a 26 g needle, and the wells were washed three times with distilled
water. Biofilms were stained with 100 μL of 0.01% crystal violet for 15 min. The
wells were then washed three times with distilled water and were dried at 37°C
overnight, after which 100 μL of 75% ethanol (v/v) was added to each well to
28
release the dye from the biofilm. Absorbance at 550 nm (A550) was then measured
using a microplate reader. The effect of the cinnamon fractions on biofilm formation
was also examined by scanning electron microscopy using the protocol previously
described by Lagha et al. [21]. Samples were examined using a JEOL JSM6360LV
scanning electron microscope operating at 30 kV. The ability of the cinnamon oil to
kill a pre-formed C. albicans biofilm was also investigated. Biofilms (24 h) in 96-well
plates were treated for 1 h with the cinnamon oil at the MFC value. Biofilm viability
was then measured with an XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-sulfophenyl)-2H-
tetrazolium-5-carboxanilide sodium salt] assay, as described previously [22].
2.6) Epithelial cell culture conditions and viability assays
The human oral epithelial cell line B11, which was kindly provided by S. Groeger
(Justus Liebig University Giessen, Germany) and has already been characterized
[23], was cultured in keratinocyte serum-free medium (K-SFM; Life Technologies
Inc.) supplemented with growth factors (50 µg/mL of bovine pituitary extract and 5
ng/mL of human epidermal growth factor) and 100 µg/mL of penicillin G-
streptomycin. The human oral epithelial cell line GMSM-K [24] was kindly provided
by V. Murrah (University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) and was
cultivated in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10%
heat-inactivated inactivated fetal bovine serum (FBS) and 100 µg/mL of penicillin
G-streptomycin. The cell cultures were incubated at 37 °C in a 5 % CO2
atmosphere. Epithelial cells (1 x 105 cells) were seeded into the wells of a 96-well
tissue culture plate and were cultivated until they reached confluence. The cells
were then treated with either Cinnulin PF® or cinnamon oil in the appropriate
culture medium for 24 h. Their viability was then determined using an MTT (3-[4,5-
diethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetrazolium bromide) colorimetric assay (Roche
Diagnostics, Laval, QC, Canada).
2.7) Adherence to epithelial cells
The effect of the cinnamon fractions on the adherence of C. albicans ATCC 28366
to oral epithelial cells was assessed using the human GMSM-K cell line. Epithelial
29
cells were seeded (5 x 104 cells/well) in a 96-well clear bottom black microplate
(Greiner Bio One, Frickenhausen, Germany) and were incubated at 37°C in a 5%
CO2 atmosphere until they reached confluence. The wells were then washed with
DMEM-1% heat-inactivated FBS and were blocked with 1% bovine serum albumin
(BSA) to prevent non-specific fungal adherence, and the cinnamon fractions diluted
in DMEM-1% heat-inactivated FBS medium were added. Wells without the
cinnamon fractions were used as controls. In parallel, cells from an overnight
culture of C. albicans were labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC; Sigma-
Aldrich Canada Co.) according to a protocol routinely used in our laboratory [25].
FITC-labeled C. albicans was added at a multiplicity of infection (MOI) of 100 to
wells containing an epithelial cell monolayer (in the absence or presence of the
cinnamon fractions). Following an incubation for 4 h at 37°C, unbound C. albicans
were aspirated, and the wells were washed three times with 50 mM phosphate-
buffered saline (pH 7; PBS). Adhered C. albicans were determined by monitoring
fluorescence using a Synergy 2 microplate reader with the excitation and emission
wavelengths set at 488 and 522 nm, respectively. Adhered FITC-labeled C.
albicans were also observed using an Olympus FSX100 fluorescence microscope
(Olympus Canada Inc., Richmond Hill, ON, Canada).
2.8) Oral epithelial barrier integrity
The effect of the cinnamon fractions on the integrity of the epithelial barrier was
assessed using the human B11 cell line described above. Epithelial cells (3.5 x 105
cells/insert) were seeded in Costar Transwell™ plates with clear polyester
membrane inserts (6.5-mm diameter, 0.4-μm pore size; Corning Co., Cambridge,
MA, USA). The basolateral and apical compartments were filled with 0.6 mL and
0.1 mL of culture medium, respectively. Following a 3-day incubation to allow the
cells to form tight junctions, the conditioned medium was replaced with antibiotic-
free K-SFM, and the cells were incubated for a further 16 h. The cinnamon
fractions were then added, and the integrity of the epithelial tight junctions was
determined by monitoring the transepithelial electrical resistance (TER) using an
ohmmeter (EVOM2, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA) after 2 and 4
30
h of incubation at 37°C in a 5% CO2 atmosphere. Resistance values were
calculated in Ohms (Ω)/cm2 by multiplying the resistance values by the surface
area of the membrane filter. Results are expressed as a percentage of the basal
control value measured at time 0 (100% value).
2.9) Secretion of cytokines by oral epithelial cells
The effect of the cinnamon fractions on the secretion of the pro-inflammatory
cytokines interleukin 6 (IL-6) and interleukin 8 (IL-8) was investigated using the
GMSM-K epithelial cell line. Cells were seeded in a 6-well plate (106 cells/well in 2
mL) and were cultured overnight at 37°C in a 5% CO2 atmosphere to allow cell
adhesion. The epithelial cells were pre-treated with the cinnamon fractions for 30
min prior to stimulating them with 1 ng/mL of recombinant human TNF-α
(AnaSpec, Fremont, CA, USA). After a 24-h incubation, cell-free supernatants were
collected and were stored at –20°C until used. Commercial enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) kits (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) were
used to quantify IL-6 and IL-8 concentrations according to the manufacturer's
protocols.
2.10) Statistical analysis
Unless indicated otherwise, all assays were performed in triplicate in two
independent experiments, and the means ± standard deviations were calculated.
Statistical analyses were performed using a one-way analysis of variance with a
post hoc Bonferroni multiple comparison (GraphPad Software Inc.; La Jolla, CA,
USA). All results were considered statistically significant at p < 0.01.
31
3) Results
The antifungal activity of the cinnamon fractions is reported in Table 1. While
Cinnulin PF® at concentrations up to 1,000 µg/mL did not reduce the growth of
either strain of C. albicans, the cinnamon bark oil displayed high antifungal activity,
with MIC and MFC values in the range of 0.039% to 0.078% (v/v).
Cinnamaldehyde, the major component of cinnamon bark oil, had a MIC and MFC
value of 0.078%. Nystatin, which was used as a reference antifungal agent, had a
MIC of 50 µg/mL and an MFC of 200 µg/mL. Cinnamon oil and cinnamaldehyde
are fungicidal rather than fungistatic, with an MFC/MIC ratio in the range of 1 to 2.
Table 1. Minimum inhibitory concentrations (MIC) and minimum fungicidal
concentrations (MFC) of cinnamon fractions against C. albicans.
* MFC/MIC Ratio: > 4 means fungistatic activity; ≤ 4 means fungicidal activity.
SYTOX Green dye is a fluorescent molecule that penetrates impaired cytoplasmic
membranes, binds to DNA, and emits fluorescence. When the C. albicans cells
were treated with cinnamon oil, a time-dependent increase in fluorescence
occurred, suggesting that their membranes had been permeabilized due to the
fungicidal activity of the cinnamon oil (Fig. 1). No significant increase in
fluorescence occurred in the negative control over the 2-h incubation period.
Candida albicans
ATCC 28366 LAM-1
Compounds MIC MFC MFC/MIC*
Ratio MIC MFC
MFC/MIC
Ratio
Cinnulin PF® (µg/ml) >1 000 >1 000 - >1 000 >1 000 -
Cinnamon bark oil (% [v/v]) 0,039 0,078 2,0 0,078 0,078 1,0
Cinnamaldehyde (% [v/v]) 0,078 0,078 1,0 0,078 0,078 1,0
Nystatin (µg/ml) 50 200 4,0 50 200 4,0
32
1 Figure 1. Effect of cinnamon bark oil on the membrane integrity of C. albicans
ATCC 28266 as determined using SYTOX® Green dye, which penetrates damaged
cytoplasmic membranes. C. albicans cells were incubated with cinnamon oil at its
MFC and fluorescence was recorded for 2 h.
The effect of Cinnulin PF® and cinnamon bark oil on biofilm formation by C.
albicans was then investigated. Although Cinnulin PF® did not reduce the growth of
C. albicans, it significantly attenuated biofilm formation as determined by crystal
violet staining (Fig. 2A). More specifically, at a Cinnulin PF® concentration of 62.5
μg/mL, biofilm formation was reduced by 91%. The effect of Cinnulin PF® on
biofilm formation by C. albicans was also visualized by scanning electron
microscopy. The control biofilm of C. albicans appeared dense, and hyphae were
an important structural component (Fig. 3A and 3B). Electron micrographs clearly
showed the marked reduction in mature biofilm when C. albicans was grown in the
presence of 62.5 μg/mL of Cinnulin PF® (Fig. 3C and 3D). In addition, no hyphae
were observed. The cinnamon bark oil also attenuated biofilm formation by C.
albicans at concentrations that did not inhibit growth. The formation of biofilm was
reduced by 86% when C. albicans was grown in the presence of 0.0049%
cinnamon oil (Fig. 2B).
33
2 Figure 2. Effect of Cinnulin PF® (panel A) and cinnamon bark oil (panel B) on the
growth and biofilm formation of C. albicans ATCC 28266 A value of 100% was
assigned to the growth and biofilm obtained in the absence of the cinnamon
fractions. Results are expressed as the means ± SD of triplicate assays from two
independent experiments. *: significantly different from the control (p < 0.01).
0 1 5 .6 3 3 1 .2 5 6 2 .5 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
C in n u lin P F (µ g /m l)
Re
lativ
e g
ro
wth
(%
)
Bio
film
fo
rm
ati
on
(%
)
*
*
0 0 .0 0 1 2 0 .0 0 2 4 0 .0 0 4 9 0 .0 0 9 8 0 .0 1 9 5 0 .0 3 9 1
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
C in n a m o n b a rk o il (% [v /v ])
Re
lativ
e g
ro
wth
(%
)
Bio
film
fo
rm
ati
on
(%
)
*
*
*
**
**
34
3 Figure 3. Scanning electron micrographs of biofilms formed by C. albicans ATCC
28366 grown in the absence (panels A and B) or presence of 62.5 µg/mL of
Cinnulin PF® (panels C and D). Magnification: 100 X (panels A and C) and 1,000 X
(panels B and D).
Given the fungicidal activity of the cinnamon bark oil, we determined whether it
could kill C. albicans biofilms. A 24-h pre-formed C. albicans biofilm was treated for
60 min with cinnamon oil at its MFC. Residual viability was determined using an
XTT assay that measures metabolic activity. This treatment reduced biofilm
viability by 48%, but did not cause any desorption of the biofilm biomass (Fig. 4).
A
B
C
D
35
4 Figure 4. Effect of cinnamon bark oil on the viability and desorption of a
C. albicans ATCC 28366 biofilm. A pre-formed (24 h) C. albicans biofilm was
treated for 60 min with cinnamon oil at its MFC, and the residual biomass and
viability were measured by crystal violet staining and an XTT assay, respectively. A
value of 100% was assigned to the pre-formed biofilm exposed to the cinnamon oil
carrier solvent. The assays were performed in triplicate, and the mean ± SD of two
independent experiments was calculated. *: significantly different from the control
(p < 0.01).
The effect of the cinnamon fractions on the adherence of C. albicans to oral
epithelial cells (GMSM-K cell line) was then tested. Cinnulin PF® dose-dependently
reduced the adherence of FITC-labeled C. albicans to epithelial cells (Fig. 5A).
More specifically, in the presence of 1,000 μg/mL of Cinnulin PF®, adherence was
inhibited by 59%. The ability of Cinnulin PF® to reduce the adherence of C.
albicans to oral epithelial cells was confirmed by fluorescence microscopy (Fig.
5B). Cinnamon bark oil had no inhibitory effect on the adherence of C. albicans to
oral epithelial cells (data not shown).
0
20
40
60
80
100
120
Control Cinnamon bark oil
Relative
biofilm
viability (%)
*
36
5 Figure 5. Effect of Cinnulin PF® on the adherence of C. albicans ATCC 28366 to
GMSM-K oral epithelial cells. Panel A: FITC-labeled C. albicans cells adhered to
epithelial cells were quantified by measuring fluorescence using a microplate
reader. A value of 100% was assigned to C. albicans adhered to epithelial cells in
the absence of Cinnulin PF®. Results are expressed as the means ± SD of triplicate
assays from two independent experiments. *: significantly different from the control
(p < 0.01). Panel B: Fluorescence micrograph of FITC-labeled C. albicans cells
adhered to epithelial cells.
0 1 2 5 2 5 0 5 0 0 1 0 0 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
C innu lin P F (µ g /m l)
Re
lati
ve
ad
he
ren
ce
(%
)
*
**
Control + Cinnulin PF® (125 μg/ml)
A)
B)
37
In order to investigate the biocompatibility of the cinnamon fractions, we tested
their effects on the viability of two oral epithelial cell lines. Up to 1,000 µg/mL of
Cinnulin PF® had no cytotoxic effect on B11 epithelial cells (Fig. 6A). However, 500
µg/mL of Cinnulin PF® reduced the viability of GMSM-K epithelial cells by 42.8%.
Treating the B11 and GMSM-K epithelial cell lines with 0.0625% cinnamon bark oil
reduced cell viability by 14% (not significant at p < 0.01) and 73.8%, respectively
(Fig. 6B).
38
6 Figure 6. Effect of Cinnulin PF® (panel A) and cinnamon bark oil (panel B) on the
viability of two oral epithelial cell lines (B11 and GMSM-K). The epithelial cells were
treated for 16 h with the cinnamon fractions prior to determining cell viability ussing
a colorimetric MTT assay. Results are expressed as the means ± SD of triplicate
assays in two independent experiments. *: significantly different from the control
(p < 0.01).
B 1 1 G M S M - K
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
Re
lati
ve
via
bil
ity
(%
)
0
1 2 5
2 5 0
5 0 0
1 0 0 0
µ g /m l
*
*
B 1 1 G M S M - K
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
Re
lati
ve
via
bil
ity
(%
)
0
0 ,0 0 7 8
0 ,0 1 5 6
0 ,0 3 1 3
0 ,0 6 2 5
0 ,1 2 5
% (v /v )
*
**
*
*
A)
B)
39
We then investigated the effect of Cinnulin PF® and cinnamon bark oil on the
integrity of the epithelial barrier by monitoring the TER values of the B11 cell line.
After a 4-h incubation, 62.5 μg/mL and 125 μg/mL of Cinnulin PF® time-
dependently increased the TER values of the B11 cell line by 42.9 % and 39.5 %,
respectively (Fig. 7), while 0.0156 % cinnamon oil increased the TER value by
43.9 %.
7 Figure 7. Effect of Cinnulin PF® (panel A) and cinnamon bark oil (panel B) on the
integrity of the epithelial barrier (B11 cell line). The TER values were determined
after a 6-h incubation. A value of 100% was assigned to the TER values at time 0.
Results are expressed as the means ± SD of triplicate assays. *: significantly
different from the control (p < 0.01).
0 6 2 .5 1 2 5
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
1 6 0
C innu lin P F (µ g /m l)
Re
lati
ve
TE
R (
%)
0
2
4
*
T im e (h )**
*
0 0 .0 0 7 8 0 .0 1 5 6
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
1 6 0
C inn am on b ark o il (% [v /v ])
Re
lati
ve
TE
R (
%)
0
2
4
T im e (h )*
**
A)
B)
40
We assessed the anti-inflammatory properties of Cinnulin PF® using an oral
epithelial cell model (GMSM-K cell line) stimulated with TNF-. Stimulating the
epithelial cells with 1 ng/mL of TNF- induced the secretion of IL-6 (670 pg/mL)
and IL-8 (15,008 pg/mL). A 30-min pre-treatment with 62.5 μg/mL of Cinnulin PF®
prior to stimulating the epithelial cells with TNF- reduced the secretion of IL-6 and
IL-8 by 29% and 57%, respectively (Fig. 8) while 250 μg/mL of Cinnulin PF® almost
totally inhibited the secretion of the two cytokines. The cinnamon bark oil did not
reduce the secretion of IL-6 or IL-8 at non-cytotoxic concentrations (≤ 0.0078%;
data not shown).
41
8 Figure 8. Effect of Cinnulin PF® on TNF-α-induced IL-6 (panel A) and IL-8 (panel
B) secretion by oral epithelial cells (GMSM-K cell line). Results are expressed as
the means ± SD of triplicate assays in two independent experiments. *: significantly
different from the control (p < 0.01).
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
IL
-6 (
pg
/ml)
*
*
*
0
5 0 0 0
1 0 0 0 0
1 5 0 0 0
2 0 0 0 0
IL
-8 (
pg
/ml)
*
*
*
TNF-α - + + + +
Cinnulin PF® (µg/ml) 0 0 62.5 125 250
B)
A)
TNF-α - + + + +
Cinnulin PF® (µg/ml) 0 0 62.5 125 250
42
4) Discussion
C. albicans can be isolated from various sites in humans. It is an opportunistic
pathogen and has been associated with superficial and systemic infections,
especially in immunologically or medically compromised individuals [3, 11]. C.
albicans causes oral candidiasis and denture stomatitis, and may also be involved
in dental caries, periodontal diseases, and refractory endodontic infections [2].
Ulcerative oral lesions (oral mucositis) resulting from chemotherapy and
radiotherapy treatments are susceptible to secondary infections by oral
microorganisms, including C. albicans [4, 5]. For instance, Belazi et al. [26] isolated
Candida spp. from oral mucositis lesions in 77% of patients undergoing
radiotherapy for head and neck cancer.
C. albicans infections can generally be successfully treated with conventional
antifungal agents. However, the emergence of resistance to these therapeutic
agents is of increasing concern [13-15], which is why investigations of the
antifungal potential of new molecules are highly relevant. Plants and their
derivatives are an important source of bioactive molecules. Essential oils extracted
from different parts of certain plants (leaves, flowers, seeds, bark, etc.) possess
numerous therapeutic properties, including antimicrobial activities [27, 28].
Moreover, proanthocyanidins, a family of polyphenols consisting of flavan-3-ol
oligomers and polymers, have been proposed as promising molecules for treating
oral infections given their anti-adherence and anti-inflammatory properties [29].
The present study was designed to evaluate the effects of two cinnamon fractions,
an essential oil and an aqueous extract enriched in proanthocyanidins, on both C.
albicans (growth, biofilm formation, adherence properties) and oral epithelial cells
(barrier integrity, inflammatory response).
We first showed that the growth of C. albicans was inhibited by cinnamon bark oil
as well as cinnamaldehyde, its main constituent. Cinnulin PF®, had no effect on the
growth of C. albicans, even at the highest concentration tested (1,000 µg/mL). The
ability of cinnamon oil to inhibit the growth of several oral microbial pathogens,
43
including Porphyromonas gingivalis [30], Solobacterium moorei [20], Streptococcus
mutans [31], and C. albicans [32] has been previously reported. Moreover, in a
recent study, Essid et al. [32] showed that combining cinnamon oil with the
antifungal drug fluconazole provided a synergistic effect against fluconazole-
resistant Candida strains.
We then explored the mechanism by which the cinnamon bark oil exerts its
antifungal effect against C. albicans. The ability of cinnamon oil to disrupt the cell
membrane was assessed by SYTOX® Green staining, which showed that the
antifungal activity of cinnamon oil may be due to its ability to damage the cell
membrane. This is in agreement with Essid et al. [32], who reported that cinnamon
essential oil inhibits ergosterol biosynthesis in Candida species, an effect that may
have an impact on the integrity of the fungal membrane by permeabilizing the cell.
However, despite the ability of cinnamon oil to cause damage to the cell membrane
of C. albicans, additional mechanisms that may contribute to its fungicidal effect
cannot be ruled out.
C. albicans forms biofilms on many oral surfaces, including tooth enamel, oral
mucosa, implants, and dentures [1, 2]. C. albicans cells embedded in a biofilm are
more resistant to mechanical elimination by saliva and to antifungal agents
compared with their planktonic counterparts [33-36]. Antimicrobial agents have
difficulty penetrating a biofilm, which can reduce their effectiveness. Therapeutic
strategies aimed at inhibiting biofilm formation are thus highly relevant. The present
study showed that cinnamon bark oil at sub-inhibitory concentrations can inhibit C.
albicans biofilm formation. Moreover, the treatment of a preformed C. albicans
biofilm with cinnamon bark oil significantly reduced the viability of the biofilm. A
very low concentration of Cinnulin PF® (≥ 31.25 µg/mL) also significantly inhibited
the formation of a biofilm by C. albicans. These results suggest that Cinnulin PF®
may be a promising anti-C. albicans agent because it specifically acts on biofilm
formation but has no effect on growth. In vivo, biofilm formation by C. albicans
requires initial adherence to the oral mucosa. Interestingly, Cinnulin PF®
44
significantly attenuated the adherence of C. albicans while no such effect was
observed with cinnamon oil.
The oral epithelium protects the underlying tissues from microbial invasion and
thus actively contributes to the maintenance of oral health [37]. This barrier effect is
mediated by the tight junctions that seal the epithelial cells together. We thus
investigated the ability of the cinnamon fractions to strengthen the epithelial barrier.
Our results demonstrated that electrical resistance increased when the epithelial
cells were cultivated in the presence of either cinnamon bark oil or Cinnulin PF®.
These results suggest that these cinnamon fractions, by reinforcing the epithelium,
may potentially prevent the invasion of the oral mucosa by oral pathogens.
Although the host inflammatory response is key to maintaining oral health, an
acute and exacerbated inflammatory reaction as observed in oral candidiasis and
oral mucositis may be deleterious by causing tissue damage. More specifically, the
development of oral mucositis in patients receiving chemotherapy and radiotherapy
treatments involves the stimulation of infiltrating macrophages, resulting in the
activation of NF-κB [6, 7]. This process is associated with the secretion of
inflammatory cytokines, including TNF-α, that promote inflammation and tissue
destruction. In the present study, when epithelial cells were challenged with TNF-α,
they secreted a large quantity of the pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-8. On
the other hand, Cinnulin PF® dampened the secretion of both cytokines.
In conclusion, the two cinnamon fractions (essential oil, Cinnulin PF®) investigated
in the present study may be promising agents for controlling C. albicans infections.
Conflicts of interest
The authors declare that they have no conflict of interest related to this study.
Acknowledgements
We are grateful to IN Ingredients Inc. (Spring Hill, TN, USA) for providing the
Cinnulin PF®, S. Groeger (Department of Periodontology, Justus Liebig University
45
Giessen, Germany) for providing the B11 cell lines, and V. Murrah (University of
North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) for providing the GMSM-K cell line. This
study was supported by funding from the Laboratoire de Contrôle Microbiologique
de l’Université Laval.
46
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50
Discussion et conclusion
C. albicans peut être isolé à partir de divers sites chez l'Homme et est souvent
associé à des affections du tractus intestinal, de la région oropharyngée et des
muqueuses vaginales [121,122]. C'est un agent pathogène opportuniste associé à des
infections superficielles et systémiques, en particulier chez les individus
immunologiquement ou médicalement compromis [18,123]. C. albicans provoque des
candidoses buccales et des stomatites prothétiques et peut également être
impliqué dans les caries dentaires, les maladies parodontales et les infections
endodontiques réfractaires [124]. Les lésions buccales ulcéreuses (mucites
buccales) résultant de traitements de chimiothérapie et de radiothérapie sont
sensibles aux infections secondaires par des microorganismes buccaux, y compris
C. albicans [125,126]. Par exemple, Belazi et al. ont isolé Candida spp. des lésions de
la muqueuse buccale chez 77 % des patients sous radiothérapie pour un cancer
de la tête et du cou [127].
Les infections à C. albicans peuvent généralement être traitées avec succès avec
des antifongiques classiques. Cependant, l'apparition de résistances à ces agents
thérapeutiques est une préoccupation croissante [50,128,129], ce qui explique
pourquoi les recherches sur le potentiel antifongique de nouvelles molécules sont
hautement pertinentes. Les plantes et leurs dérivés constituent une source
importante de molécules bioactives. Les huiles essentielles extraites de différentes
parties de certaines plantes (feuilles, fleurs, graines, écorce, etc.) possèdent de
nombreuses propriétés thérapeutiques, y compris des activités
antimicrobiennes [130,131]. De plus, les proanthocyanidines, une famille de
polyphénols comprenant des oligomères et des polymères de flavan-3-ol, ont été
proposées comme molécules prometteuses pour le traitement des infections
buccales en raison de leurs propriétés anti-adhérence et anti-inflammatoires [132].
La présente étude visait à évaluer les effets de deux fractions de cannelle, une
huile essentielle et un extrait aqueux enrichi en proanthocyanidines, sur
C. albicans (croissance, formation de biofilm, propriétés d'adhérence) et sur les
51
cellules épithéliales buccales (intégrité de la barrière, réponse inflammatoire).
Dans une précédente étude, nous avions démontré que l’huile essentielle d’écorce
de cannelle était efficace pour inhiber la croissance et la formation des biofilms
chez Solobacterium moorei, une bactérie associée à l’halitose [120].
Nous avons d'abord montré que la croissance de C. albicans était inhibée par
l'huile d'écorce de cannelle ainsi que par le cinnamaldéhyde, son constituant
principal. Les proanthocyanidines de la cannelle (Cinnulin PF®) n'ont eu aucun
effet sur la croissance de C. albicans, même à la concentration la plus élevée
testée (1 000 µg / mL). La capacité de l'huile de cannelle à inhiber la croissance de
plusieurs agents pathogènes microbiens buccaux, dont Porphyromonas
gingivalis [133], Solobacterium moorei [120], Streptococcus mutans [134] et
C. albicans [135] a déjà été rapportée. De plus, dans une étude récente, Essid et al.
ont montré que l'association de l'huile de cannelle et du fluconazole, un
antifongique, produisait un effet synergique contre les souches de Candida
résistantes au fluconazole [135]. Aussi, le ratio « concentration minimale
fongicide / concentration minimale inhibitrice » indique si le produit a un effet
fongicide (ratio <4) ou fongistatique (ratio ≥4) [136]. Il est intéressant de constater
que l’huile d’écorce de cannelle ainsi que le cinnamaldéhyde ont démontré un ratio
inférieur à 4 et peuvent donc être classés comme des agents fongicides.
Nous avons ensuite exploré le mécanisme par lequel l'huile d'écorce de cannelle
exerce son effet antifongique contre C. albicans. La capacité de l'huile de cannelle
à compromettre la membrane cellulaire a été évaluée par la coloration SYTOX®
Green, ce qui a démontré que l'activité antifongique de l'huile de cannelle peut être
attribuée à sa capacité à endommager la membrane cellulaire. Ceci est en accord
avec Essid et al., qui ont rapporté que l'huile essentielle de cannelle inhibe la
biosynthèse de l'ergostérol chez les espèces de Candida, un effet qui pourrait avoir
un impact sur l'intégrité de la membrane fongique en perméabilisant la cellule [135].
Cependant, malgré la capacité de l'huile de cannelle à endommager la membrane
cellulaire de C. albicans, des mécanismes supplémentaires susceptibles de
contribuer à son effet fongicide ne peuvent être exclus.
52
La capacité d’un agent pathogène à former des biofilms joue un rôle clé dans le
développement de plusieurs infections, autant dans la région buccodentaire
qu’ailleurs dans le corps humain [137,138]. C. albicans forme des biofilms sur de
nombreuses surfaces buccales, notamment l'émail des dents, la muqueuse
buccale, les implants et les prothèses dentaires [124,139]. Les cellules de C. albicans
au sein d’un biofilm sont plus résistantes à l'élimination mécanique par la salive et
aux antifongiques que leurs homologues planctoniques [140–143]. Les agents
antimicrobiens ont de la difficulté à pénétrer dans un biofilm, ce qui peut réduire
leur efficacité. Les stratégies thérapeutiques visant à inhiber la formation de biofilm
sont donc très pertinentes. La présente étude a montré que l'huile d'écorce de
cannelle à des concentrations sous-inhibitrices peut inhiber la formation de biofilm
de C. albicans. De plus, le traitement d'un biofilm préformé de C. albicans avec de
l'huile d'écorce de cannelle a considérablement réduit la viabilité du biofilm. Une
très faible concentration de Cinnulin PF® (≥ 31,25 µg / mL) a également inhibé de
manière significative la formation d'un biofilm par C. albicans. Ce constat a été
effectué à l’aide d’une méthode semi-quantitative, par coloration au cristal violet,
ainsi qu’à l’aide d’une méthode qualitative, c’est-à-dire visuellement par
microscopie électronique. En présence de 62,5 µg / mL de Cinnulin PF, il était
possible d’observer les levures sous forme planctonique et non organisée en
biofilm. Ce constat permet de supposer que la Cinnulin PF® pourrait empêcher la
formation de la matrice extracellulaire [144]. Ces résultats suggèrent que la Cinnulin
PF® pourrait être un agent anti-C. albicans prometteur, car elle agit spécifiquement
sur la formation de biofilm, mais sans affecter sur la croissance. In vivo, la
formation de biofilms par C. albicans nécessite une adhérence initiale à la
muqueuse buccale. De plus, l’attachement des cellules de C. albicans à la
muqueuse buccale est la première étape à l’invasion des tissus. Fait intéressant, la
Cinnulin PF® a considérablement atténué l’adhérence de C. albicans alors qu’un
tel effet n’a pas été observé avec l’huile de cannelle. L’effet a visuellement été
observé à l’aide de la microscopie à fluorescence. Le mécanisme exact de la
diminution de l’adhérence n’a pas été étudié. Cependant, il serait possible qu’il en
53
résulte de la liaison des polyphénols aux adhésines présentes à la surface de
C. albicans ou aux récepteurs retrouvés sur les cellules épithéliales.
L'épithélium buccal protège les tissus sous-jacents de l'invasion microbienne et
contribue ainsi activement au maintien de la santé bucco-dentaire [145,146]. Cet effet
de barrière est provoqué par les jonctions serrées qui scellent les cellules
épithéliales ensemble. Ces dernières sont dynamiques et changent de formes
constamment selon ses interactions avec différents stimuli internes et externes
comme les cytokines ou les microorganismes [145]. C’est pourquoi nous avons
étudié la capacité des fractions de cannelle à renforcer la barrière épithéliale. Nos
résultats ont montré que la résistance électrique augmentait lorsque les cellules
épithéliales étaient cultivées en présence d’huile d’écorce de cannelle ou de
Cinnulin PF®. Cette résistance transépithéliale est un index de la perméabilité
paracellulaire. Ces résultats suggèrent que ces fractions de cannelle, en renforçant
l'épithélium, pourraient empêcher l'invasion de la muqueuse buccale par des
agents pathogènes oraux et pourraient être de bons agents à des fins de
prévention.
Bien que la réponse inflammatoire de l'hôte soit essentielle au maintien de la santé
bucco-dentaire, une réaction inflammatoire aiguë et exacerbée, telle qu'elle est
observée dans les candidoses et les mucites buccales, peut être délétère en
provoquant des lésions tissulaires. Plus spécifiquement, le développement de la
mucosite buccale chez les patients traités par chimiothérapie et radiothérapie
implique la stimulation de macrophages infiltrant, entraînant l'activation de
NF-kB [26,43]. Ce processus est associé à la sécrétion de cytokines inflammatoires,
y compris le TNF-α, qui favorisent l'inflammation et la destruction des tissus. Dans
la présente étude, lorsque les cellules épithéliales ont été stimulées par le TNF-α,
elles ont sécrété une grande quantité de cytokines pro-inflammatoires IL-6 et IL-8.
Les cytokines IL-6 et IL-8 jouent un rôle crucial dans le processus inflammatoire,
entre autres pour le recrutement des neutrophiles et des macrophages sur le site
d’infection [147]. En revanche, la Cinnulin PF® a atténué la sécrétion des deux
54
cytokines et pourrait ainsi représenter un agent thérapeutique efficace lors d’une
réaction inflammatoire exacerbée.
À la lumière des résultats rapportés dans cette étude, les différentes fractions de la
cannelle pourraient être considérées comme des agents prometteurs dans la
prévention et le traitement de la mucite buccale et de la candidose buccale à
C. albicans.
55
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