LUCAS MARCON
EFEITOS DO THIODAN reg EM FIacuteGADO E EM OVAacuteRIOS EM
MATURACcedilAtildeO AVANCcedilADA DE LAMBARIS Astyanax bimaculatus
Tese apresentada agrave Universidade Federal de Viccedilosa como parte das exigecircncias do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Medicina Veterinaacuteria para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doctor Scientiae
VICcedilOSA MINAS GERAIS ndash BRASIL
2013
i
LUCAS MARCON
EFEITOS DO THIODAN reg EM FIacuteGADO E EM OVAacuteRIOS EM
MATURACcedilAtildeO AVANCcedilADA DE LAMBARIS Astyanax bimaculatus
Tese apresentada agrave Universidade Federal de Viccedilosa como parte das exigecircncias do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Medicina Veterinaacuteria para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doctor Scientiae
APROVADA
____________________________________ ______________________________
Profa Dra Marlene Isabel Vargas Viloria Profa Dra Mary Anne Heidi Dolder
(Coorientadora)
____________________________________ _____________________________
Prof Dr Nilo Bazzoli Prof Dr Joseacute Domingos Guimaratildees
_________________________________
Prof Dr Laeacutercio dos Anjos Benjamin
(Orientador)
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus aos meus pais (Carlos e Narcisa) irmatildeos (Luciana e Luacutecio) orientador
(Laeacutercio dos Anjos Benjamin) e minha namorada (Mirlaine Soares) por me
incentivarem acreditarem confiarem e sempre estarem ao meu lado demonstrando
sugestotildees construtivas para a vida e para este trabalho
Aos membros da banca examinadora dessa tese pela disponibilidade e sugestotildees
construtivas para enriquecimento desse trabalho
Agrave CAPES FAPEMIG e Departamento de VeterinaacuteriaUFV pelo apoio financeiro
para o desenvolvimento do presente estudo
Aos professores e funcionaacuterios do Departamento de VeterinaacuteriaUFV e
Departamento de Morfologia - ICBUFMG pelos ensinamentos e paciecircncia para
concretizaccedilatildeo das teacutecnicas utilizadas neste estudo
A todos aqueles que direta ou indiretamente colaboraram para a realizaccedilatildeo deste
estudo e conviveram comigo ao longo desses anos em Viccedilosa-MG
iii
BIOGRAFIA
LUCAS MARCON filho de Carlos Marcon Filho e Narcisa das Dores Marcon
nasceu em 29 de janeiro de 1980 em Campinas-SP
Em fevereiro de 1999 ingressou no curso de Ciecircncias Bioloacutegicas pela Pontifiacutecia
Universidade Catoacutelica de Campinas (PUC-Campinas) onde em janeiro de 2003
graduou-se nesta Instituiccedilatildeo No ano de 2002 foi bolsista de iniciaccedilatildeo cientifica pela
FAPESP no Departamento de Biologia Celular Instituto de BiologiaUNICAMP
Em maio de 2006 ingressou no Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Medicina
Veterinaacuteria na Universidade Federal de Viccedilosa - MG sob orientaccedilatildeo do professor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin na linha de pesquisa Morfofisiologia de Animais
Domeacutesticos e Selvagens (Reproduccedilatildeo e Toxicologia de Peixes) defendendo a
dissertaccedilatildeo de mestrado em fevereiro de 2008 e tese de doutorado em dezembro de
2013 obtendo os tiacutetulos de Magister Scientiae e Doctor Scientiae
iv
IacuteNDICE
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO GERAL
11 O uso de agrotoacutexicos
12 Tipos de inseticidas
13 Inseticidas no meio ambiente rotas de entrada
14 Avaliaccedilatildeo de solubilidade e estudos de toxicidade aquaacutetica
15 Caracterizaccedilatildeo do agrotoacutexico Thiodanreg
16 O uso do endosulfan
17 Toxicidade aguda do endosulfan
18 Efeitos dos inseticidas organoclorados sobre peixes
19 O lambari Astyanax bimaculatus
110 Morfologia hepaacutetica em teleoacutesteos
111 Morfologia ovariana em teleoacutesteos
vi
viii
1
1
2
3
4
5
6
6
7
9
10
12
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
22 Objetivos especiacuteficos
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
31 Animais
32 Agrotoacutexicos
33 Teste de toxidade aguda em sistema estaacutetico - CL50
34 Teste de toxidade subletal em sistema estaacutetico
35 Avaliaccedilatildeo morfoloacutegica
351 Microscopia de luz
352 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos fiacutegados
353 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos ovaacuterios
354 Imunoistoquiacutemica
36 Paracircmetros biomeacutetricos
37 Anaacutelises estastiacuteticas
4 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
15
15
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17
17
18
18
20
21
21
22
25
26
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27
28
v
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 CAPIacuteTULO 1 Efeitos do inseticida Thiodanreg sobre a morfologia
hepaacutetica de fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
52 CAPIacuteTULO 2 Efeitos do inseticida Thiodanreg sobre a morfologia
do desenvolvimento folicular em lambaris Astyanax bimaculatus
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
53 CAPIacuteTULO 3 Relaccedilatildeo entre colaacutegeno tipo IV integrina β1 e
caspase 3 durante o desenvolvimento folicular em Astyanax
bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
6 CONCLUSOtildeES
35
35
35
36
37
42
45
56
62
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92
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103
107
vi
RESUMO
MARCON Lucas D Sc Universidade Federal de Viccedilosa dezembro de 2013 Efeitos do Thiodanreg em fiacutegado e em ovaacuterios em maturaccedilatildeo avanccedilada de lambaris Astyanax bimaculatus Orientador Laeacutercio dos Anjos Benjamin Coorientadoras Ann Honor Mounteer e Marlene Isabel Vargas Viloria
O agrotoacutexico Thiodanreg (350gL de endosulfan) eacute um inseticida organoclorado utilizado
em diversas monoculturas que pode chegar aos ecossistemas aquaacuteticos e afetar a
reproduccedilatildeo e a integridade das populaccedilotildees de peixes O fiacutegado eacute um dos principais
oacutergatildeos para a biotransformaccedilatildeo de diversos xenobioacuteticos Quando os peixes satildeo
expostos a uma concentraccedilatildeo elevada de agentes quiacutemicos podem ocorrer danos
hepaacuteticos Os ovaacuterios de peixes apresentam foliacuteculos em diferentes estaacutedios de
desenvolvimento que satildeo envoltos por zona radiata ceacutelulas foliculares membrana basal
e ceacutelulas da teca formando o complexo folicular Agentes estressores podem causar
aumento ou diminuiccedilatildeo do diacircmetro dos foliacuteculos vitelogecircnicos alterar a quantidade de
foliacuteculos nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento e aumentar a incidecircncia de atresia
Assim o presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos do Thiodanreg sobre o fiacutegado
e ovaacuterios de lambaris Astyanax bimaculatus por meio de anaacutelises morfoloacutegica
morfomeacutetrica e imunoistoquiacutemica Os peixes expostos ao toacutexico foram divididos em
quatro experimentos 1) sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo 2) sem aclimataccedilatildeo e
alimentados 3) com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo 4) com aclimataccedilatildeo de
10 dias e alimentados Em todos os experimentos foram utilizadas trecircs concentraccedilotildees
diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 de 1367microgL preacute-determinada em laboratoacuterio
de acordo com a NBR 15088 (ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas em cada
experimento foram de 115 23 e 56microgL aleacutem de um grupo controle livre de toacutexico
com trecircs repeticcedilotildees contento 10 peixes para cada concentraccedilatildeo Apoacutes as 96h seis peixes
de cada grupo foram capturados e anestesiados com benzocaiacutena (110000) de acordo
com as Normas da Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de VeterinaacuteriaUFV (protocolo
242009) Os fiacutegados e ovaacuterios foram coletados e processados por teacutecnicas histoloacutegicas
rotineiras As lacircminas foram analisadas em microscoacutepio de luz Olympus CX31 Foram
obtidas imagens digitais de 10 campos aleatoacuterios por animal em objetiva de 20X e 40X
para avaliaccedilatildeo histoloacutegica As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada nos testes em sistema
estaacutetico foram mantidas de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT
2007) A anaacutelise histoloacutegica dos fiacutegados mostrou no experimento 1 (sem
vii
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo) na concentraccedilatildeo de 56microgL de Thiodanreg a menor
intensidade (010plusmn00) da reaccedilatildeo ao PAS no citoplasma dos hepatoacutecitos quando
comparada ao grupo controle (133plusmn051) No entanto houve diferenccedila (Plt005) nesse
mesmo experimento quando comparado com as concentraccedilotildees 115microgL (266plusmn081) e
23microgL (300plusmn00) caracterizando depleccedilatildeo de glicogecircnio Aleacutem disso houve
alteraccedilotildees do diacircmetro de nuacutecleos e citoplasma dos hepatoacutecitos nos diferentes
experimentos e maior quantidade de nuacutecleos de hepatoacutecitos nos grupos expostos ao
Thiodanreg associada com a reduccedilatildeo na quantidade de citoplasma O Iacutendice de Alteraccedilatildeo
Histoloacutegica (IAH) dos lambaris coletados manteve-se entre 433 a 833 (para os grupos
controles) 1850 a 2883 (para as concentraccedilotildees de 115microgL) 2033 a 2833 (para as
concentraccedilotildees de 23microgL) e 2366 a 2766 (para as concentraccedilotildees de 56microgL) Os
lambaris coletados nos diferentes experimentos apresentaram valores de IAH para os
grupos controle inferiores (Plt005) aos grupos expostos Estes resultados demonstraram
que o Thiodanreg pode estar influenciando as funccedilotildees hepaacuteticas pela maior mobilizaccedilatildeo
das reservas de glicogecircnio na concentraccedilatildeo 56microgL As alteraccedilotildees observadas nos
fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas sendo alteraccedilotildees de estaacutedio I e II indicando
dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico nos diferentes grupos e experimentos Nos ovaacuterios
percebeu-se que a accedilatildeo do Thiodanreg em niacuteveis subletais natildeo afetou a morfologia dos
diferentes estaacutedios de desenvolvimento folicular Poreacutem os experimentos com
aclimataccedilatildeo demonstraram alteraccedilotildees nas quantidades de foliacuteculos primaacuterios e
secundaacuterios quando comparados com os peixes dos experimentos sem aclimataccedilatildeo
Aleacutem disso houve aumento do nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos e diacircmetro dos foliacuteculos
secundaacuterios nos grupos expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos Estes
resultados sugerem mecanismos compensatoacuterios da perda reprodutiva quando em meio
com condiccedilotildees desfavoraacuteveis As anaacutelises imunoistoquiacutemicas demonstraram marcaccedilatildeo
crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento folicular para integrina β1 e
colaacutegeno tipo IV Entretanto a caspase 3 foi observada somente no complexo folicular
de foliacuteculos secundaacuterios mesmo quando os peixes satildeo expostos a diferentes
concentraccedilotildees de Thiodanreg o que confirma a integridade das ceacutelulas foliculares e da via
apoptoacutetica caspase-3-dependente a qual pode estar sendo ativada para futuros processos
de regressatildeo folicular
viii
ABSTRACT
MARCON Lucas D Sc Universidade Federal de Viccedilosa December 2013 Effects of Thiodanreg in liver and ovaries in advanced maturation of the lambari Astyanax bimaculatus Advisor Laeacutercio dos Anjos Benjamin Co-advisors Ann Honor Mounteer and Marlene Isabel Vargas Viloria
The pesticide Thiodanreg (350gL-1 of endosulfan) is an organochlorine insecticide used
in various monocultures that may reach aquatic ecosystems and affect reproduction and
the health of fish populations The liver is a major organ for the biotransformation of
many xenobiotics and it can be damaged if the fish are exposed to a high level of
chemical substances The fish ovaries have oocytes at different stages of development
that are surrounded by zona radiata follicular basal membrane and teca cells to form the
follicular complex Stressor products may cause an increase or decrease in the diameter
of the secondary follicles vitellogenic depletion a change the number of follicles at
different stages of development and an increase the incidence of atresia The present
study aimed to evaluate the effects of Thiodanreg on the liver and ovaries of Astyanax
bimaculatus through morphological morphometric and immunohistochemistry analysis
The groups of fish were exposed to the toxic substances divided in four experiments
without adaptation and no feeding feeding without adaptation with adaptation and no
feeding with adaptation and feeding All experiments used three different
concentrations of Thiodanreg lower than the LC50 of 1367 microgL-1 previously determined
in the laboratory in accordance with the Brazilian Standard Regulation - NBR 15088
(ABNT 2007) The concentrations used in each experiment were 115 23 and 56
microgL-1 and a control group with three repetitions using ten fish in each aquarium After
96h six fish from each group were captured and anesthetized with benzocaine
(110000) according to the norms of the Ethics Committee of the Veterinary
DepartmentUFV (protocol 242009) Livers and ovaries were collected and processed
by histological techniques The slides were examined under the light microscope
Olympus CX31 Were obtained digital images of 10 random fields per animal at 20X
and 40X objective for evaluation The characteristics of the water used in acute tests
were maintained in a stable system in accordance to the recommendations of NBR
15088 (ABNT 2007) In the experiment 1 (without adaptationno feeding) at the
concentration of 56 mgL-1 of Thiodanreg (010 plusmn 00) the intensity of the PAS reaction
was lower in the cytoplasm of hepatocytes when compared to the control group (133 plusmn
ix
051) In the same experiment differences in glycogen depletion were (Plt005) when
compared to the concentrations 115 gL-1 (266 plusmn 081) and 23 gL-1 (300 plusmn 00) In
addition changes in the diameter of nuclei and cytoplasm of hepatocytes in all
experiments were observed and an increase in the number of hepatocyte nuclei in
groups exposed to Thiodanreg was associated with a reduction in the amount of
cytoplasm However the IHA was maintained between 433 to 833 (control group)
1850 to 2883 (115 mgL-1 group) 2033 to 2833 (23 gL-1 group) and 2366 to 2766
(56 gL-1 group) These results suggest that Thiodanreg may be influencing liver
functions to increase glycogen mobilization according to higher concentrations of
exposition The changes observed in the livers of A bimaculatus were not severe
classified as stage I and II that indicate repairable damage to liver tissue in all
experiments It was observed in the ovaries that the action of Thiodanreg in sublethal
levels did not affect (Plt005) the morphology of the different stages of follicle
development However the experiments demonstrated an adaptation response in the
number of primary and secondary follicles compared to fish without adaptation In
addition there was a growing incidence of atretic follicles and increased diameter of the
secondary follicles in the groups exposed to Thiodanreg in all experiments These results
suggest an adaptive response to offset reproductive loss where in unfavorable
conditions The immunohistochemical analysis showed increasing and uniform labeling
throughout the follicular development for integrin β1 and collagen type IV However
caspase 3 was observed only in the secondary ovarian follicular complex even when
fish were exposed to different concentrations of Thiodanreg which characterizes the
integrity of follicular cells and the apoptotic pathway-dependent caspase-3 which may
be activated for future follicular regression
1
1 INTRODUCcedilAtildeO GERAL
11 O uso de agrotoacutexicos
Agrotoacutexicos satildeo produtos e agentes de processos fiacutesicos quiacutemicos ou bioloacutegicos
destinados ao uso nos setores de produccedilatildeo no armazenamento e beneficiamento de
produtos agriacutecolas nas pastagens na proteccedilatildeo de florestas nativas ou implantadas e de
outros ecossistemas e tambeacutem de ambientes urbanos e industriais cuja finalidade eacute
preservaacute-los da accedilatildeo danosa de seres vivos considerados nocivos (Lei Federal 7802 de
110789) Os agrotoacutexicos satildeo importantes na agricultura todavia exigem precauccedilatildeo no
seu uso visando a proteccedilatildeo dos operaacuterios que os manipulam e aplicam dos
consumidores dos animais de criaccedilatildeo de abelhas peixes de organismos predadores e
parasitas e enfim do meio ambiente
Certas praacuteticas agriacutecolas ligadas ao modelo de produccedilatildeo agriacutecola como o uso
excessivo e inadequado de agrotoacutexicos a destruiccedilatildeo da cobertura vegetal dos solos para
plantio a natildeo preservaccedilatildeo das matas ciliares e das vegetaccedilotildees protetoras de nascentes
dentre outros fatores satildeo responsaacuteveis por grande parte dos problemas com os recursos
hiacutedricos (Matuo 1990)
Os inseticidas constituem importante grupo de praguicidas para o uso agriacutecola
que ano apoacutes ano mostra um aumento progressivo em seu uso na Ameacuterica do Sul
Estes nas uacuteltimas deacutecadas comeccedilaram a substituir inclusive o trabalho mecacircnico e
manual dos agricultores Ruumlegg et al (1987) e Tomita amp Beyruth (2002) relatam que o
modelo de agricultura adotado no Brasil baseia-se no uso de agrotoacutexicos Estes
compostos satildeo empregados haacute muito tempo e a partir da 2deg guerra mundial passaram a
ser mais intensamente utilizados
Nos uacuteltimos 40 anos a agricultura brasileira sofreu inuacutemeras e profundas
transformaccedilotildees que alteraram tanto a composiccedilatildeo das culturas como os processos de
produccedilatildeo e padrotildees tecnoloacutegicos ateacute entatildeo em vigor Ruumlegg et al (1987) enfatizam que
o processo de modernizaccedilatildeo entendido como uma seacuterie de transformaccedilotildees tecnoloacutegicas
nos processos produtivos intensificou o emprego de insumos como maacutequinas
fertilizantes e agrotoacutexicos que contam com preccedilos favoraacuteveis e estiacutemulos como creacutedito
farto a juros subsidiados que facilitaram sua ampla adoccedilatildeo no meio rural Assim
agrotoacutexicos tecircm sido amplamente utilizados como uma das principais ferramentas para
um bom programa de controle de plantas daninhas em culturas que tecircm ganhado espaccedilo
na balanccedila comercial agriacutecola brasileira (Rodrigues amp Almeida 2005) O emprego dos
2
agrotoacutexicos tornou-se de uso rotineiro principalmente pelo menor custo e maior
eficiecircncia de controle das plantas daninhas quando comparados aos demais meacutetodos
convencionais de controle Para Rosa (1998) o modelo baseado no uso intensivo de
insumos quiacutemicos de sementes melhoradas e mecanizaccedilatildeo foi denominado ldquoRevoluccedilatildeo
Verderdquo que na deacutecada de 1980 trouxe ao Brasil um novo alento em relaccedilatildeo agrave
produtividade com grandes esperanccedilas de colheitas fartas e novas tecnologias que
propiciaram o domiacutenio de aacutereas pouco exploradas como por exemplo o cerrado da
Regiatildeo Centro-Oeste De fato muitas destas expectativas se realizaram entretanto o
impacto ambiental resultante implicou custos muitas vezes irremediaacuteveis como por
exemplo a perda de biodiversidade e a exaustatildeo de vaacuterios cursos drsquoaacutegua por
assoreamento aleacutem de contaminaccedilatildeo
12 Tipos de inseticidas
Os inseticidas satildeo classificados em quatro categorias conforme sua foacutermula
quiacutemica organoclorados carbamatos organofosforados e piretroides Os
organoclorados satildeo produtos sinteacuteticos que possuem carbono cloro e hidrogecircnio em sua
estrutura quiacutemica Satildeo persistentes no meio ambiente por vaacuterios anos e pouco soluacuteveis
em aacutegua Esses inseticidas quando mal administrados tecircm accedilatildeo toacutexica para diversos
mamiacuteferos sendo sua accedilatildeo natildeo sistecircmica neurotoacutexica e mutagecircnica (Guedes 1990
Pereira et al 2012) Os carbamatos satildeo inseticidas considerados menos persistentes e
com degradaccedilatildeo raacutepida no meio ambiente natildeo satildeo bioacumulados pouco lipofiacutelicos
satildeo sistecircmicos em plantas e inibidores da acetilcolinesterase (Guedes 1990 Ware
1994 Chatterjee et al 2001) Os organofosforados satildeo outro grupo de inseticida
amplamente utilizado no mercado mundial representando 355 do uso na uacuteltima
deacutecada Esses inseticidas caracterizam-se por pouca solubilidade em aacutegua (mais
soluacuteveis do que os organoclorados) toxicidade variaacutevel em animais vertebrados em
alguns animais e plantas tecircm atividade sistecircmica baixa persistecircncia no ambiente e
facilmente degradados por enzimas e fatores quiacutemicos A accedilatildeo desses toacutexicos eacute
semelhante ao carbamato agindo nas vias sinaacutepticas dos axocircnios inibindo a
acetilcolinesterase (Ware 1994 Albinati et al 2009) O piretroide tambeacutem eacute um
inseticida amplamente utilizado na agricultura representando 21 do mercado mundial
na uacuteltima deacutecada O fator positivo do uso desse pesticida eacute que ele eacute muito toacutexico para
insetos e apresenta baixa toxicidade para mamiacuteferos satildeo fotoestaacuteveis com degradaccedilatildeo
raacutepida no solo A accedilatildeo toacutexica desse inseticida eacute semelhante aos primeiros inseticidas
3
desenvolvidos como o organoclorado DDT possuindo accedilatildeo neurotoacutexica nos axocircnios
(Naumann 1990 Ware 1994 Haverinen amp Vornanen 2014)
Nos uacuteltimos anos aumentou muito a diversidade de inseticidas visando a morte
de insetos e a persistecircncia do agrotoacutexico por periacuteodos curtos por questotildees de seguranccedila
ao meio ambiente Aleacutem desses inseticidas que foram mencionados acima existem
vaacuterios inseticidas organossinteacuteticos e inseticidas naturais de origem vegetal animal e
microbiana (Casida amp Quistad 1998 Ishaaya amp Horowitz 1998 Drevnick et al 2006)
13 Inseticidas no meio ambiente rotas de entrada
Os inseticidas podem entrar no meio ambiente acidental ou deliberadamente A
entrada acidental do inseticida origina-se de rejeitos industriais urbanos vazamentos
durante transporte armazenamento e distribuiccedilatildeo enquanto a entrada deliberada ocorre
pela aplicaccedilatildeo de inseticidas no meio rural e urbano As contaminaccedilotildees por agrotoacutexicos
podem contaminar solos e ateacute mesmo a atmosfera Nesse uacuteltimo a movimentaccedilatildeo do
toacutexico se daacute por meio de gotas partiacuteculas soacutelidas e gases que acabam sendo
transportados por longas distacircncias a partir do local de origem da aplicaccedilatildeo (Walker et
al 1996)
O transporte e destino dos agrotoacutexicos no ambiente aquaacutetico eacute ponto de
discussatildeo Murty (1988) descreveu que os agrotoacutexicos entram no ambiente aquaacutetico por
meio da aplicaccedilatildeo intencional implemento aeacutereo escoamento das aplicaccedilotildees ou
liberaccedilatildeo acidental A descarga dos resiacuteduos da manufatura de agrotoacutexicos constitui a
segunda maior fonte de contaminaccedilotildees dos corpos de aacutegua O efeito mais draacutestico eacute
esperado no ponto de liberaccedilatildeo em lagos e pequenos mares internos Os efeitos nos
oceanos eacute pequeno devido ao grande volume de aacutegua e accedilatildeo de correntes (Walker et al
1996)
Na rota de transporte bioloacutegico o sistema natildeo eacute muito importante em termos de
magnitude pela quantidade do xenobioacutetico acumulado quando comparado com fatores
mencionados acima (transporte abioacutetico) mas eacute importante para o homem e vida
silvestre O padratildeo do transporte bioloacutegico dos toacutexicos acumulados nos organismos
segue da seguinte forma herbiacutevoros carniacutevoros e pisciacutevoros (maior eficiecircncia de
acuacutemulo) Nesses uacuteltimos particularmente as espeacutecies de ambientes aquaacuteticos a
acumulaccedilatildeo e magnificaccedilatildeo satildeo maiores do que nas espeacutecies de ambiente terrestre
devido agrave lipofilicidade dos inseticidas particularmente os organoclorados Duas rotas de
entrada podem comprometer a toxicidade dos organismos aquaacuteticos absorccedilatildeo ou
4
ingestatildeo A bioconcentraccedilatildeo vai ser mais intensa no ambiente aquaacutetico pois a difusatildeo
dos poluentes na aacutegua aumenta a eficiecircncia de sua absorccedilatildeo pelo organismo aquaacutetico
devido agrave lipofilicidade dos organoclorados Dessa forma a transferecircncia ao longo de
cadeias alimentares eacute tambeacutem mais eficiente e a bioconcentraccedilatildeo acontece em todas as
suas etapas Devido a isso os efeitos em predadores podem ser seacuterios pois aleacutem de
grande bioconcentraccedilatildeo e transferecircncia pela cadeia alimentar alguns destes organismos
como aves que se alimentam de peixes e animais marinhos como focas e cetaacuteceos satildeo
deficientes no metabolismo de desintoxicaccedilatildeo particularmente devido ao sistema de
monoxigenases pouco desenvolvido comprometendo mais a toxicidade por
biomagnificaccedilatildeo (Barron 1995 Borgaacute et al 2004)
Aleacutem da bioconcentraccedilatildeo os resiacuteduos destas substacircncias presentes nas aacuteguas
podem ser aderidos ao material orgacircnico em suspensatildeo depositar-se no sedimento ou
serem absorvidos pelos organismos Assim peixes e invertebrados podem bioacumular
tais compostos ligados agrave mateacuteria ingerida ser passivamente absorvidos pela superfiacutecie
corporal ou durante as trocas respiratoacuterias (Vasconcellos amp Verani 2000 Henry amp
Kishimba 2006)
14 Avaliaccedilatildeo de sensibilidade e estudos de toxicidade aquaacutetica
A realizaccedilatildeo de testes de sensibilidade eacute recomendada como meacutetodo de
qualidade dos planteis de organismos cultivados Nestes testes satildeo utilizadas
substacircncias de referecircncias que incluem principalmente os sais dicromato de potaacutessio
cloreto de potaacutessio e cloreto de soacutedio Estes dois uacuteltimos satildeo mais recomendados pois
seus efluentes experimentais oferecem baixo risco de contaminaccedilatildeo ambiental Os testes
de sensibilidade geralmente satildeo de curta duraccedilatildeo (24 horas) e devem ser repetidos com
frequumlecircncia principalmente nos laboratoacuterios que mantecircm planteis de organismos-testes
pois estes dados servem como padratildeo na sensibilidade natural dos organismos Esta
teacutecnica vem sendo utilizada para avaliar os resultados de toxicidade pois a accedilatildeo toacutexica
somente poderaacute ser atribuiacuteda agrave substacircncia teste quando a sensibilidade natural dos
organismos natildeo tiver demonstrado qualquer alteraccedilatildeo ao longo do periacuteodo em que
foram testados (Ranzani-Paiva et al 2004)
O estudo dos efeitos de agentes toacutexicos sobre a vida aquaacutetica pode ser realizado
por meio de ensaios bioloacutegicos na natureza ou em condiccedilotildees laboratoriais controladas
sendo este uacuteltimo os mais utilizados por permitirem um controle mais efetivo de fatores
ocasionais como temperatura pH duraccedilatildeo de exposiccedilatildeo meio concentraccedilatildeo Ao se
5
avaliar a toxicidade de agentes toacutexicos ou misturas destes frente a um reativo bioloacutegico
geralmente se utiliza uma populaccedilatildeo homogecircnea possuindo uma sensibilidade definida
determinando-se a concentraccedilatildeo responsaacutevel por um efeito toacutexico (efeito letal subletal
crocircnico imobilizaccedilatildeo ou modificaccedilatildeo do comportamento entre outros) Estes testes
podem ser realizados utilizando-se sistemas de fluxo contiacutenuo semi estaacuteticos ou
estaacuteticos Quanto ao meio pode-se utilizar meio aquaacutetico do tipo aacutegua continental (aacutegua
dura rica em bicarbonatos e sulfatos dissolvidos ou aacutegua mole isenta de iacuteons caacutelcio e
magneacutesio) marinha ou salobra segundo as necessidades dos organismos avaliados
(CETESB 2008) Com relaccedilatildeo ao organismo-teste por razotildees teacutecnicas e econocircmicas eacute
impossiacutevel testar todas as espeacutecies que fazem parte do ecossistema aquaacutetico Assim
para esses estudos satildeo relacionados normalmente os organismos mais representativos
de cada niacutevel troacutefico na cadeia alimentar como algas microcrustaacuteceos e peixes
15 Caracterizaccedilatildeo do agrotoacutexico Thiodanreg
O endosulfan inseticida desenvolvido pela Hoechst Aktiengesellschaft na
Alemanha foi introduzido no mercado em 1957 com o nome comercial de Thiodan
(Goebel et al 1982 e Stumpf amp Abhaver 1986) O Thiodanreg eacute um inseticida acaricida
organoclorado do grupo quiacutemico eacutester do aacutecido sulfuroso de um diol ciacuteclico Esse
agrotoacutexico eacute classificado toxicologicamente como altamente toacutexico (Classe I)
classificaccedilatildeo ambiental como produto altamente perigoso aleacutem de inflamaacutevel e
corrosivo (Engelhardt amp Sarmento 2008)
O ingrediente ativo do Thiodanreg (350 gL de endosulfan) consiste na mistura de
dois isocircmeros sendo 70 de α-endosulfan e 30 de β-endosulfan Entre os produtos
derivados do metabolismo do endosulfan em mamiacuteferos o sulfato de endosulfan eacute o
principal metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica (Stumpf amp Abhaver 1986)
Os organoclorados como o Thiodanreg atuam nos canais de soacutedio do axocircnio
aumentando o periacuteodo de abertura destes canais O aumento do periacuteodo de abertura dos
canais de soacutedio leva a um aumento do fluxo de soacutedio para o interior da membrana e
acarretando um prolongamento da fase de despolarizaccedilatildeo apoacutes o pico do potencial de
accedilatildeo e devido a isso o inseto morre por hiperexcitaccedilatildeo Consequentemente a
propagaccedilatildeo contiacutenua do impulso nervoso gera tremores convulsotildees prostraccedilatildeo e
posteriormente a morte como observados em insetos Aleacutem disso pode afetar qualquer
tipo de crustaacuteceo peixes e mamiacuteferos inclusive em baixas concentraccedilotildees (Eto 1990
Pereira et al 2012)
6
16 O uso do endosulfan
O endosulfan eacute o uacutenico inseticida organoclorado amplamente utilizado em todo
o mundo (Capkin et al 2006 Chakrabarty et al 2012) Segundo a empresa Bayer
(2010) fabricante do produto o Thiodanreg (endosulfan) eacute um inseticida para o controle
de insetos chupadores e mastigadores com accedilatildeo de contato e ingestatildeo Recomenda-se
seu uso especialmente em cultivos de cafeacute cana hortaliccedilas frutas vinhas e forragens
Adverte tambeacutem que natildeo se devem colher frutos ou vegetais tratados ateacute 21 dias apoacutes a
uacuteltima aplicaccedilatildeo
No Brasil segundo Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) a
importaccedilatildeo do endosulfan estaacute proibida a partir de julho de 2012 e sua utilizaccedilatildeo a partir
de 2013 (Molina 2010) A utilizaccedilatildeo de produtos agrave base de endosulfan no Brasil eacute
estimada em 44 milhotildees de toneladas em uma aacuterea de 22 a 36 milhotildees de hectares
podendo representar cerca de 40 do consumo mundial deste organoclorado segundo
dados do Programa Ambiental das Naccedilotildees Unidas (UNEP 2010) Segundo a Agecircncia
de Proteccedilatildeo Ambiental norte americana (EPA 1980) contaminaccedilotildees humanas por
endosulfan satildeo provenientes em 53 dos casos da ingestatildeo de aacutegua contaminada e em
47 dos casos do consumo de alimentos a base de peixes contaminados A mesma
agecircncia define como CL50 aguda valores de 017microgL-1 para truta arco-iacuteris e 740microgL-1
para Daphnia magna
A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em
consideraccedilatildeo a qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente
Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm 3572007 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo
do referido inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
17 Toxicidade aguda do endosulfan
O endosulfan apesar de pertencer agrave classe toxicoloacutegica I eacute altamente toacutexico
para animais aquaacuteticos e terrestres (espeacutecies natildeo alvo) e segundo a Agency for Toxic
Substances and Disease Registry - ATSDR (2000) possui de moderado a alto risco e
efeitos agudos e crocircnicos
Pinheiro et al (1998) advertem com veemecircncia sobre o perigo de contaminaccedilatildeo
do Pantanal e da Amazocircnia lugares ricos em recursos hiacutedricos por produtos agrave base de
endosulfan pois este produto eacute extremamente toacutexico para peixes e outros organismos
aquaacuteticos mesmo em doses muito pequenas O endosulfan natildeo dissolve facilmente na
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aacutegua e adere agraves partiacuteculas do solo levando anos para sua degradaccedilatildeo (Soares et al
2003)
18 Efeitos dos inseticidas organoclorados sobre peixes
Apesar dos mecanismos de toxicidade do endosulfan serem extensivamente
estudados alguns trabalhos foram conduzidos com o objetivo de se avaliar efeitos
histopatoloacutegicos dos agrotoacutexicos em peixes (Naqvi amp Vaishnavi 1993) especialmente
nas gocircnadas fiacutegados bracircnquias e rins Em um desses estudos Capkin et al (2006)
reportaram uma CL50 de 1978 gL para Oreochromis mikyss para 24 horas de
exposiccedilatildeo ao toacutexico o que causou aleacutem da morte de 50 dos animais convulsotildees nado
erraacutetico edema e separaccedilatildeo das lacircminas branquiais edema e necrose do fiacutegado dos
tuacutebulos renais e do tecido hematopoieacutetico Cengiz et al (2001) reportaram lesotildees
similares em bracircnquias do peixe-mosquito Gambusia affinis aleacutem de congestatildeo e
hipertrofia do fiacutegado com o uso do pesticida Thiodanreg Segundo Capkin et al (2006)
alcalinidade e temperatura da aacutegua aleacutem do tamanho dos peixes afetam a toxicidade do
endosulfan Assim peixes pequenos e meacutedios mantidos em temperatura de 131ordmC com
1978 microgL do toacutexico tiveram uma sobrevivecircncia de 25 e 425 respectivamente
enquanto os peixes grandes tiveram 100 de sobrevivecircncia Quando a temperatura da
aacutegua foi aumentada para 16ordmC nenhum dos peixes pequenos e meacutedios sobreviveu
enquanto os sobreviventes de peixes grandes diminuiacuteram para 775 O aumento da
alcalinidade de 198 mgL para 419 mgL ou superior aumentou (Plt0001) a
sobrevivecircncia dos peixes Em relaccedilatildeo agrave dureza entre 357 mgL e 126 mgL a
sobrevivecircncia dos peixes expostos ao endosulfan natildeo foi afetada Histologicamente as
bracircnquias dos peixes tiveram edema lamelar separaccedilatildeo do epiteacutelio das lamelas fusatildeo
lamelar e hipertrofia das ceacutelulas epiteliais Os fiacutegados apresentaram edemas e necroses
graves
Cengiz amp Uumlnluuml (2002) estudaram os efeitos crocircnicos do endosulfan sob as
bracircnquias nas concentraccedilotildees de 05 e 075 microgL ao longo de 30 dias de experimento O
que se comprovou eacute que a dose mais elevada do endosulfan causou mais mudanccedilas
patoloacutegicas que a menor dose Altinok amp Capkin (2007) natildeo verificaram alteraccedilatildeo
morfoloacutegica nas bracircnquias de truta com 21 dias de exposiccedilatildeo de metiocarb entretanto
uma concentraccedilatildeo superior (375 mgL) causou separaccedilatildeo epitelial das bracircnquias No
mesmo trabalho os peixes expostos ao endosulfan com concentraccedilotildees de 06 e 13 microgL
mostraram mudanccedilas morfoloacutegicas nas bracircnquias como desprendimento do epiteacutelio
8
aparecimento de granuloacutecitos nas lamelas fusatildeo e necrose lamelar hipertrofia e nuacutecleos
picnoacuteticos Essas evidecircncias comprovam o efeito do endosulfan com comprometimento
das bracircnquias levando a reduccedilatildeo do consumo de oxigecircnio e desregulaccedilatildeo da funccedilatildeo de
osmorregulaccedilatildeo em organismos aquaacuteticos Aleacutem disso os efeitos toacutexicos do endosulfan
no fiacutegado induziram modificaccedilotildees estruturais como hipertrofia dos hepatoacutecitos nuacutecleos
picnoacuteticos e necroses
No trabalho de Ballesteros et al (2007) que utilizaram peixes adultos da espeacutecie
Jenynsia multidentata os testes de toxicidade foram realizados durante 96 horas a fim
de determinar a concentraccedilatildeo letal (CL50) do endosulfan As alteraccedilotildees histoloacutegicas
foram determinadas nas bracircnquias e nos fiacutegados A CL50-96 horas foi significativamente
diferentes entre machos (0719 μgL) e fecircmeas (1317 μgL) A diferenccedila entre os sexos
foi atribuiacuteda ao dimorfismo no teor de lipiacutedios no sexo feminino (216) e masculino
(179) As alteraccedilotildees histoloacutegicas nas bracircnquias incluiacuteram hipertrofia e levantamento
do epiteacutelio das lamelas secundaacuterias e aneurismas Essas alteraccedilotildees causaram um
aumento significativo da espessura da lamela secundaacuteria no grupo tratado em relaccedilatildeo
aos peixes do grupo-controle Finalmente as alteraccedilotildees histoloacutegicas reversiacuteveis como
degeneraccedilatildeo hidroacutepica e dilataccedilotildees dos sinusoides foram observadas nos fiacutegados dos
peixes expostos bem como mudanccedila irreversiacutevel como necrose nas concentraccedilotildees
mais elevadas O fiacutegado eacute um oacutergatildeo importante na capacidade de degradar compostos
toacutexicos mas os seus mecanismos de regulaccedilatildeo podem ser comprometidos em
concentraccedilotildees elevadas causando mudanccedilas estruturais como observadas nesses
trabalhos
A qualidade da aacutegua eacute um fator importante para o sucesso da reproduccedilatildeo dos
peixes Quando a qualidade da aacutegua eacute alterada devido a produtos quiacutemicos a estrutura
histoloacutegica das gocircnadas tambeacutem eacute alterada Para Cengiz et al (2001) os efeitos do
Thiodanreg (endosulfan) satildeo tempo e dose dependentes Dutta et al (2006) descreveram
num estudo de toxicidade crocircnica as injuacuterias causadas pelo Thiodanreg sobre os tuacutebulos
seminiacuteferos do peixe ldquobluegillrdquo Lepomis macrochirus e relataram alteraccedilatildeo dos tuacutebulos
seminiacuteferos que mostraram perda dos padrotildees normais de organizaccedilatildeo celular
diminuindo tambeacutem o diacircmetro das espermatogocircnias primaacuterias gradativamente desde as
primeiras 24 horas de exposiccedilatildeo ateacute as duas semanas seguintes Segundo os autores este
tipo de dano pode afetar as espermaacutetides e os espermatozoides apresentando no final
um impacto negativo na espermatogecircnese e fertilidade do macho comprometendo o
nuacutemero da populaccedilatildeo do ldquobluegillrdquo Lepomis macrochirus Em outro trabalho sobre
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reproduccedilatildeo Hazarika amp Das (1998) identificaram mudanccedilas estruturais nos ovaacuterios de
Heteropneustes fossilis exposto ao organoclorado lindano por 72 horas Os resultados
demonstraram que houve ruptura e diminuiccedilatildeo do tamanho dos foliacuteculos maduros
afetando a fertilidade dos peixes
19 O lambari Astyanax bimaculatus
O lambari Astyanax bimaculatus (Linnaeus 1758) eacute conhecido popularmente
pelos nomes de lambari piaba lambari-guaccedilu mojarra pertence agrave famiacutelia Characidae
ordem Characiformes e ateacute entatildeo uma das espeacutecies da subfamiacutelia Tetragonopterinae
(CEMIGCETEC 2000) No entanto revisotildees recentes colocam o gecircnero em ldquoIncertae
sedisrdquo com 88 gecircneros e 620 espeacutecies sendo que 86 espeacutecies pertencem ao gecircnero
Astyanax (Lima et al 2003)
O A bimaculatus eacute um peixe de pequeno porte atingindo aproximadamente 20
cm de comprimento e pesando ateacute 40 gramas Possui corpo irregularmente eliacuteptico com
nadadeiras amarelas quatro a cinco dentes na seacuterie externa e cinco na seacuterie interna do
preacute-maxilar escamas com reflexos prateados mancha umeral ovalada e peduacutenculo
caudal com mancha alongada que se prolonga ateacute a ponta dos raios caudais medianos
(Britiski et al 1988 CEMIGCETEC 2000)
O gecircnero Astyanax possui ampla distribuiccedilatildeo geograacutefica sendo encontrado
desde o sudoeste dos Estados Unidos ateacute a Bacia do rio da Prata (Moreira Filho 1989
citado por Pereira Filho 2000) Os lambaris satildeo encontrados em cabeceiras de riachos
rios e lagos e vivem sempre em cardumes realizando curtas migraccedilotildees na eacutepoca das
cheias para sua reproduccedilatildeo Em relaccedilatildeo ao periacuteodo reprodutivo dos lambaris este pode
variar conforme a espeacutecie e o habitat sendo normalmente de setembro a marccedilo
(Vazzoler amp Menezes 1992 citados por Pereira Filho 2000)
A biologia reprodutiva do lambari pode ser prejudicada pelo desmatamento
ciliar poluiccedilatildeo industrial e domeacutestica e destruiccedilatildeo de vaacuterzeas e lagoas marginais por
projetos agriacutecolas que tambeacutem constituem ameaccedila em vaacuterias regiotildees (CEMIGCETEC
2000) Esses fatores interferem na dinacircmica da populaccedilatildeo desses peixes
Os lambaris satildeo oniacutevoros se alimentando de algas vegetais sementes larvas e
insetos adultos (CEMIGCETEC 2000) Os lambaris satildeo de extrema importacircncia em
diversos habitats por equilibrarem o ecossistema e a cadeia alimentar constituindo fonte
de alimentos para peixes maiores espeacutecies carniacutevoras e aves Em estudo conduzido com
o lambari da espeacutecie Astyanax janeiroensis verificaram-se que os principais haacutebitos
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alimentares se baseavam em algas microcrustaacuteceos pequenos invertebrados e esporos
vegetais (Santin et al 2005) Diversos trabalhos relatam na literatura a importacircncia do
lambari na estrutura troacutefica do ecossistema e sua variaccedilatildeo alimentar diante de
modificaccedilotildees ambientais (Motta amp Uieda 1995 Suarez et al 1995 Esteves 1998)
Trabalho conduzido por Loureiro et al (1995) verificando a dieta alimentar na espeacutecie
Hoplias malabaricus (traiacutera) no reservatoacuterio da UHE de Segredo (PR) mostraram a
ingestatildeo alimentar preferencial de lambaris de diversas espeacutecies Em outro estudo
verificou-se a importacircncia do lambari como alimento para as espeacutecies Hoplias
malabaricus Oligosarcus longirostris e Rhamdia branneri apoacutes o represamento do
Reservatoacuterio de Salto Caxias (PR) demonstrando ser o alimento preferido dessas
espeacutecies (Novakoski 2007) Aleacutem disso na regiatildeo sudoeste do estado de Minas Gerais
existem representantes do gecircnero no Reservatoacuterio de Furnas (MG) caracterizando a
reproduccedilatildeo ao longo do ano para o equiliacutebrio da cadeia alimentar tendo importacircncia
econocircmica na alimentaccedilatildeo e tambeacutem na praacutetica de pesca profissional (Bazzoli et al
1998 Carvalho et al 2009) Portanto os lambaris satildeo de grande importacircncia em
diversos habitats como consumidores secundaacuterios (Esteves 1998) A ecologia alimentar
de uma determinada espeacutecie faz parte e interfere diretamente na dinacircmica de sua
populaccedilatildeo sendo primordial para a conservaccedilatildeo do ecossistema como um todo (Vitule
amp Aranha 2002)
110 Morfologia hepaacutetica em teleoacutesteos
O fiacutegado eacute um oacutergatildeo multifuncional responsaacutevel por uma das etapas do
processo de desenvolvimento folicular principalmente no periacuteodo de formaccedilatildeo dos
gloacutebulos de vitelo momento em que ocorre a transferecircncia de vitelogenina para o
ovaacuterio etapa fisioloacutegica que inicia nas ceacutelulas da teca e ceacutelulas foliculares com
produccedilatildeo do estradiol No fiacutegado o estradiol estimula os hepatoacutecitos a produzirem a
vitelogenina e careogenina que satildeo levadas pela corrente sanguiacutenea ateacute o ovaacuterio onde
participam da formaccedilatildeo do vitelo e zona radiata durante a maturaccedilatildeo folicular
(Senthilkumaran et al 2004) A produccedilatildeo de vitelogenina no fiacutegado pode variar entre as
espeacutecies de teleoacutesteos devido agraves diferenccedilas na capacidade de armazenamento de energia
condiccedilatildeo fisioloacutegica haacutebitos alimentares e contaminaccedilatildeo (Peyon et al 1996 Hull amp
Harvey 2001 Al -Ghais 2013 Silva Barni et al 2014) Aleacutem disso o fiacutegado eacute
responsaacutevel pela conversatildeo do alimento e desintoxicaccedilatildeo de substacircncias estranhas
(Selman amp Walace 1989 Ribeiro et al 2006)
11
O fiacutegado eacute glacircndula digestiva que apresenta superfiacutecie
coberta por uma membrana serosa e o tecido conjuntivo de sua caacutepsula
invagina para o parecircnquima (Takashima amp Hibiya 1995) O fiacutegado de teleoacutesteos eacute
constituiacutedo por hepatoacutecitos ceacutelulas epiteliais dos ductos biliares ceacutelulas endoteliais
ceacutelulas que armazenam gordura (ceacutelulas de Ito) macroacutefagos e ceacutelulas sanguiacuteneas
circulantes (Hinton et al 1984) e em algumas espeacutecies observam-se ceacutelulas do
pacircncreas exoacutecrino (pacircncreas intra-hepaacutetico) distribuiacutedas entre o parecircnquima do oacutergatildeo
assim como descrito para o lambari (Santos et al 2013)
Estruturas lobulares e uma pequena veia central estatildeo presentes em vertebrados
em peixes estas estruturas variam dependendo da espeacutecie e satildeo geralmente obscuras
(Takashima amp Hibyia 1995) Os hepatoacutecitos arranjam-se em fileiras os quais
geralmente apresentam a espessura de duas ceacutelulas O hepatoacutecito possui um nuacutecleo
uacutenico embora ceacutelulas binucleadas possam ser observadas O nuacutecleo se localiza na
regiatildeo central ou no poacutelo celular voltado para o sinusoide e o nucleacuteolo eacute bem evidente
(Arana 1995) A circulaccedilatildeo no fiacutegado eacute realizada pela arteacuteria hepaacutetica veia porta aleacutem
de capilares sinusoides Existem cordotildees de hepatoacutecitos que se arranjam
concentricamente ao redor dos capilares sinusoides (Takashima amp Hibyia 1995)
As vias biliares satildeo formadas por canaliacuteculos biliares preacute-duacutectulo biliar duacutectulo
biliar e ducto biliar O canaliacuteculo biliar eacute formado pela membrana plasmaacutetica dos
hepatoacutecitos e os microvilos dos mesmos preenchem o luacutemen do canaliacuteculo Nos
hepatoacutecitos existem ceacutelulas preacute-ductulares que estabelecem complexos juncionais com
os hepatoacutecitos formando os preacute-duacutectulos biliares A transiccedilatildeo entre preacute-duacutectulo e
duacutectulo ocorre quando o lume biliar estaacute completamente circundado por ceacutelulas
epiteliais biliares O ducto biliar eacute formado por ceacutelulas epiteliais cuacutebicas nos ductos de
menor calibre e ceacutelulas colunares nos grandes ductos sendo a presenccedila de lacircmina basal
o fator diferenciador dos mesmos Nos grandes ductos circundando a lacircmina basal
estatildeo fibroblastos plexo capilar fibras nervosas e ceacutelulas musculares lisas Acredita-se
que estas ceacutelulas musculares promovam os movimentos peristaacutelticos impulsionando a
bile Esse ducto une-se ao ducto ciacutestico dando origem ao ducto coleacutedoco (Arana 1995)
O endoteacutelio eacute fenestrado e a lacircmina basal estaacute ausente No espaccedilo de Disse haacute
ceacutelulas de Ito que em teleoacutesteos se caracterizam por apresentar vesiacuteculas lipiacutedicas
assim como o mesmo tipo celular em mamiacuteferos (Arana 1995) Haacute algumas mudanccedilas
patoloacutegicas que podem ocorrer no fiacutegado de peixes que sofreram exposiccedilatildeo a toacutexicos ou
outras substacircncias irritantes dissolvidas na aacutegua A atrofia eacute caracterizada por
12
diminuiccedilatildeo do tamanho dos hepatoacutecitos com presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos Tambeacutem
podem ocorrer necrose degeneraccedilatildeo vacuolar degeneraccedilatildeo gordurosa estagnaccedilatildeo da
bile inflamaccedilatildeo do parecircnquima hepaacutetico (hepatites) cirrose hepaacutetica e
desenvolvimentos de tumores (Takashima amp Hibyia 1995)
111 Morfologia ovariana em teleoacutesteos
Os ovaacuterios das fecircmeas A bimaculatus seguem os padrotildees descritos para a
maioria dos teleoacutesteos sendo oacutergatildeos pares alongados e foliaacuteceos sofrendo
modificaccedilotildees na espessura volume e coloraccedilatildeo durante as diferentes fases do ciclo
reprodutivo conforme observado tambeacutem em outras espeacutecies do gecircnero (Drummond
1996 Miranda 1996 Melo et al 2005 Mazzoni et al 2005 Rodrigues amp Almeida
2005 Carvalho et al 2009 Prado et al 2011) Nesses peixes o ovaacuterio eacute do tipo
cistovariano onde o lume ovariano se estende ateacute o oviduto como na maioria dos
peixes teleoacutesteos (Nagahama 1983 Selman amp Wallace 1986 Connaughton amp Aida
1998)
Nas observaccedilotildees histoloacutegicas do ovaacuterio de A bimaculatus verificou-se que os
mesmos satildeo envolvidos externamente por uma serosa peritoneal constituiacuteda por
mesoteacutelio e lacircmina do tecido conjuntivo fibroso Profundamente a essa estrutura
observa-se tuacutenica albugiacutenea de natureza conjuntiva contendo fibroacutecitos e vasos
sanguiacuteneos A tuacutenica albugiacutenea emite septos para o interior do oacutergatildeo formando lamelas
ovuliacutegeras nas quais encontram-se ovogocircnias e foliacuteculos em diferentes fases de
desenvolvimento No lambari o tipo de desenvolvimento folicular eacute assincrocircnico com
a presenccedila de foliacuteculos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento (Miranda 1996
Drummmond 1996 Marcon 2008)
Em peixes o desenvolvimento folicular tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Begovac amp Wallace 1988 Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter
1996 Grier 2000 e 2002 Carvalho et al 2009) e como nos animais em geral
compreende os periacuteodos preacute-meioacutetico perinucleolar preacute-vitelogecircnico vitelogecircnico e
maturaccedilatildeo final Os foliacuteculos passam por diversas fases de desenvolvimento
diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo de acordo com o periacuteodo reprodutivo do animal (Wallace amp
Selman 1981) Essas fases ocorrem no interior de foliacuteculos cuja parede constituiacuteda de
zona radiata camada folicular membrana basal e teca (Grier 2000) desempenham um
importante papel durante a ovogecircnese e na fertilizaccedilatildeo
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A foliculogecircnse eacute regulada hormonalmente pelo eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-
gocircnada Em peixes teleoacutesteos estiacutemulos ambientais satildeo convertidos em informaccedilotildees
sensoriais no ceacuterebro associados com a liberaccedilatildeo de hormocircnios liberadores de
gonadotropinas (GnRH) pelo hipotaacutelamo que via corrente sanguiacutenea chegam agrave
adenohipoacutefise que sintetiza e libera hormocircnios gonodotroacutepicos hormocircnio fociacuteculo
estimulante (FSH) e hormocircnio luteinizante (LH) Os hormocircnios FSH e LH se ligam aos
receptores celulares das ceacutelulas tecais (LH-R) e foliculares (LH-R e FSH-R) para
estimularem a produccedilatildeo 17α-hydroxy-pregnesterona (17α-HP) e testosterona (T) Nas
ceacutelulas foliculares os hormocircnios esteroides 17α-HP e T agem como precursor na
produccedilatildeo do 17β-estradiol (17β-E) e do hormocircnio indutor de maturaccedilatildeo (MIH)
substacircncias importantes nas etapas do desenvolvimento folicular e na ovulaccedilatildeo
respectivamente (Dietrich amp Krieger 2009) (Figura 1)
Figura 1 Ceacutelulas somaacuteticas do ovaacuterio e principais produtos (Adaptado de Dietrich amp Krieger 2009)
Muitas das espeacutecies nativas natildeo desovam espontaneamente em ambientes
lecircnticos Algumas espeacutecies nativas quando mantidas em cativeiro se preparam para a
reproduccedilatildeo mas natildeo desovam naturalmente e sofrem regressatildeo ovariana com
consequente atresia dos foliacuteculos A atresia folicular eacute um processo degenerativo de
ocorrecircncia comum nos ovaacuterios de vertebrados e os foliacuteculos podem sofrer atresia em
diferentes fases do desenvolvimento ou diferenciaccedilatildeo (Guraya 1986 Miranda et al
1999 Santos et al 2008b)
A ovulaccedilatildeo refere-se agrave expulsatildeo do foliacuteculo em desenvolvimento maduro
(Redding amp Patintildeo 1993) Na natureza a ovulaccedilatildeo eacute regulada por dois hormocircnios os
quais estimulam o desenvolvimento gonadal em peixes FSH e LH (Connaughton amp
Aida 1998 Klausen et al 2001) Estes hormocircnios gonadotroacutepicos agem nos oacutergatildeos
reprodutores promovendo o desenvolvimento e maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas O
14
processo de transporte dos hormocircnios para as ceacutelulas reprodutoras eacute lento em ambientes
naturais mas na reproduccedilatildeo artificial com a teacutecnica de hipofisaccedilatildeo esse processo
torna-se mais raacutepido em relaccedilatildeo ao processo natural (Woynarovich amp Horvath 1980)
Nos ovaacuterios de peixes teleoacutesteos com fertilizaccedilatildeo externa os foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios estruturas remanescentes da desova satildeo frequentes Um aspecto
interessante eacute saber a duraccedilatildeo da reabsorccedilatildeo dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios nos
procedimentos de desova induzida para as espeacutecies em criaccedilatildeo Drummond (1996) e
Marcon (2008) estudaram a reabsorccedilatildeo dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios no estroma
ovariano em maturaccedilatildeo avanccedilada de lambaris (A bimaculatus lacustris) e observaram
que cinco dias apoacutes a desova os foliacuteculos haviam sido reabsorvidos Durante esse
processo figuras de apoptose satildeo observadas em fecircmeas submetidas agrave hipofisaccedilatildeo
(Drummond et al 2000) o mesmo ocorrendo em Leporinus taeniatus (Anostomidae)
(Santos et al 2003) Santos et al (2008a) registraram por meio das teacutecnicas de TUNEL
e de imunoistoquiacutemica o iacutendice apoptoacutetico em ceacutelulas foliculares dos foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios em Prochilodus argenteus notando que o maior iacutendice de ceacutelulas
foliculares apoptoacuteticas coincidiu com menores valores de integrinas e colaacutegeno tipo IV
no terceiro dia apoacutes a desova induzida Esses achados demonstram a importacircncia dessas
proteiacutenas na integridade das ceacutelulas foliculares nos foliacuteculos
15
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do inseticida organoclorado
endosulfan em sua apresentaccedilatildeo comercial Thiodanreg sobre as caracteriacutesticas
morfoloacutegicas dos ovaacuterios e fiacutegado de fecircmeas adultas de lambaris A bimaculatus apoacutes
exposiccedilatildeo subletal a esse agrotoacutexico durante a maturaccedilatildeo avanccedilada
22 Objetivos especiacuteficos
Estimar a CL50 para fecircmeas adultas de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada
expostas ao inseticida organoclorado Thiodanreg
Avaliar histopatologicamente o fiacutegado dos animais dos grupos controles e tratados
Analisar por morfometria os principais constituintes celulares do fiacutegado nos grupos
controles e tratados
Avaliar diferenccedilas nos valores dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS) e
hepatossomaacutetico (IHS) de animais dos grupos controles e expostos ao toacutexico
Verificar provaacuteveis alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos diferentes estaacutedios de
desenvolvimento de foliacuteculos ovarianos nos grupos submetidos aos efeitos do
toacutexico utilizando-se microscopia de luz
Quantificar os diferentes tipos de foliacuteculos e avaliar por morfometria os diacircmetros
dos foliacuteculos vitelogecircnicos nos grupos controles e tratados
Avaliar e quantificar o processo de atresia folicular nos grupos controles
comparando-os com os grupos tratados
Analisar qualitativamente por imunoistoquiacutemica as proteiacutenas de adesatildeo celular
(integrina β1 e colaacutegeno do tipo IV) nas ceacutelulas foliculares ao longo do
desenvolvimento folicular nos peixes dos grupos controles e tratados e
16
Analisar qualitativamente por imunoistoquiacutemica a proteiacutena caspase 3 nas ceacutelulas
foliculares ao longo do desenvolvimento folicular nos peixes dos grupos controles e
tratados
17
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade Federal
de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste de toxicidade aguda e o teste subletal quanto
as atividades de coleta fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos fiacutegados As etapas de
microtomia coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e
morfomeacutetricas foram realizadas nos Laboratoacuterios de Peixes e de Histopatologia do
Departamento de Veterinaacuteria da UFV (DVTUFV)
31 Animais
Foram utilizadas fecircmeas do lambari A bimaculatus mantidas em tanques de terra
na Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso (g) de 1152 plusmn 201 e comprimento total (cm)
de 912 plusmn 064 As caracteriacutesticas para a escolha dos animais se basearam em aspectos
corporais como ventre abaulado poro genital dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV Os
aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuem capacidade de 50 litros numa
densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro
temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam
um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo contiacutenua de aacutegua para garantir o bem-estar
dos peixes (Figura 2) Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial Purina
contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas de
acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de 255
plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza total
2815 plusmn 594 mgL-1 (CaCO3)
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
18
Figura 2 Principais componentes estruturais dos grupos experimentais (Adaptado de Oliveira Ribeiro et al 2002)
A Bomba para oxigenaccedilatildeo da aacutegua B Termostato para controle da temperatura D Filtro interno L Material contra isolamento de ruiacutedo H-J Trecircs aquaacuterios para cada grupo experimental (Controle e e cada uma das concentraccedilotildees de Thiodanreg )
Os lotes de peixes (120 peixes em cada lote) foram destinados agrave accedilatildeo do toacutexico em
quatro tratamentos diferentes
Experimentos Tratamentos Experimento 1 sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo Experimento 2 sem aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo Experimento 3 com aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo
Experimento 4 com aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo
O periacuteodo de 10 dias para aclimataccedilatildeo dos peixes foi para permitir que as
caracteriacutesticas ovarianas sejam comparadas com os grupos que natildeo foram aclimatados
Dessa forma mostraraacute quais as melhores condiccedilotildees que esses peixes podem ter na
reproduccedilatildeo quando expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
32 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente experimento foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo com 350gL de endosulfan
33 Teste de toxicidade aguda em sistema estaacutetico ndash CL50
A definiccedilatildeo das concentraccedilotildees toacutexicas a serem testadas nem sempre ocorre de
maneira simples Muitas vezes faz-se necessaacuterio uma anaacutelise preliminar para a
definiccedilatildeo da melhor faixa de concentraccedilatildeo a ser considerada nos testes definitivos
Dessa forma a primeira providecircncia desse estudo de toxidade aguda eacute a realizaccedilatildeo de
testes preliminares que devem ser conduzidos com concentraccedilotildees toacutexicas relacionadas
entre si por progressotildees geomeacutetricas de razatildeo 10 calculadas com base em informaccedilotildees
19
obtidas por meio de testes jaacute realizados com outros organismos que mais se assemelham
filogeneticamente ao grupo em questatildeo (Ranzani-Paiva 2004) A partir dos resultados
obtidos nessa fase eacute possiacutevel estabelecer a faixa ideal de concentraccedilatildeo para conduccedilatildeo
dos testes definitivos com o lambari
O teste de concentraccedilatildeo letal (CL50) que avalia a concentraccedilatildeo responsaacutevel pela
mortalidade de metade dos animais foi realizado em sistema de aacutegua estaacutetico de acordo
NBR 15088 (ABNT 2007) com os animais mantidos sob restriccedilatildeo alimentar que se
iniciou 24 horas antes do iniacutecio e perdurou durante o teste Essa restriccedilatildeo alimentar foi
realizada para evitar acuacutemulo de mateacuteria orgacircnica que poderia interferir na accedilatildeo do
agrotoacutexico
Para o teste foram selecionados 120 lambaris fecircmeas adultas em maturaccedilatildeo
avanccedilada com aproximadamente 7cm de comprimento O agrotoacutexico utilizado foi o
Thiodanreg (Bayer) com 350gL-1 de endosulfan Foram utilizadas trecircs repeticcedilotildees com
cinco peixes cada para cada concentraccedilatildeo de Thiodanreg adotada sendo os grupos assim
classificados controle (0microgL-1) 15microgL-1 30microgL-1 60microgL-1 120microgL-1 240microgL-
1 480microgL-1 e 960microgL-1 As concentraccedilotildees foram distribuiacutedas em recipientes plaacutesticos
com 15L de aacutegua dos proacuteprios aquaacuterios (Figura 3) Para obter as diferentes
concentraccedilotildees o Thiodanreg foi diluiacutedo uma primeira vez 1100 (Soluccedilatildeo Padratildeo
Intermediaacuteria contendo 3500mgL-1 de endosulfan) e uma segunda vez 1100 (Soluccedilatildeo
Padratildeo Final contendo 35000microgL-1 de endosulfan) viabilizando a observaccedilatildeo da
toxicidade total do agrotoacutexico e natildeo apenas do princiacutepio ativo (Figura 4)
Figura 3 Recipiente utilizado e distribuiccedilatildeo das concentraccedilotildees
20
Figura 4 Preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo padratildeo final do Thiodanreg
Foram feitas as verificaccedilotildees de mortalidade a cada seis horas (zero 6 12 18 24
30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 e 96 horas) removendo-se os animais mortos o
que proporcionou menores interferecircncias pela decomposiccedilatildeo dos peixes gerando maior
confianccedila da mortalidade apresentada ser em funccedilatildeo da toxicidade do princiacutepio ativo
endosulfan sinergicamente agrave accedilatildeo dos solventes e demais compostos do inseticida Para
acompanhamento da temperatura foi adicionado 15L de aacutegua do mesmo aquaacuterio em
um recipiente idecircntico de forma que qualquer variaccedilatildeo na temperatura pudesse ser
medida sem provocar estresse adicional a nenhum grupo O teste teve iniacutecio no dia
16012010 agraves 1000 horas com teacutermino agraves 1000 horas do dia 20012010 O programa
utilizado para o caacutelculo da CL50 foi o TOXCALC determinando o valor e o intervalo de
confianccedila pelo meacutetodo PROBITUS (Plt005)
34 Teste de toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Depois de estimar a CL50 pelos testes preliminares foi realizada aclimataccedilatildeo de
novos lambaris como descrito no item 31 (Figura 2) onde os peixes se acostumaram
ao seu novo meio e agraves atividades normais de manutenccedilatildeo como alimentaccedilatildeo e limpeza
dos aquaacuterios O teste de toxicidade aguda com o endosulfan foi realizado baseando-se
principalmente nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo com a
NBR 15088 (ABNT 2007)
O teste de toxicidade subletal foi feito com trecircs diferentes dosagens do toacutexico
inferiores agrave CL50 e para fins estatiacutesticos cada concentraccedilatildeo incluindo-se o grupo
controle teve trecircs repeticcedilotildees sob as mesmas condiccedilotildees para depois se avaliar e
Thiodanreg
Soluccedilatildeo padratildeo
intermediaacuteria
(1100)
Soluccedilatildeo
padratildeo final
(1100)
3500mgL de soluccedilatildeo padratildeo
intermediaacuteria 35000 microgL de
soluccedilatildeo padratildeo
final
21
quantificar a mortalidade se for o caso observar o comportamento dos animais que
sobreviveram agrave intoxicaccedilatildeo e os efeitos morfoloacutegicos nos fiacutegados e ovaacuterios dos peixes
expostos Assim como foram trecircs repeticcedilotildees usando-se trecircs diferentes concentraccedilotildees do
toacutexico e um grupo controle para a realizaccedilatildeo do presente experimento foram
necessaacuterias 120 fecircmeas de lambari para cada experimento (Tabela 1)
Tabela 1 Distribuiccedilatildeo das fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus em cada grupo experimental
Repeticcedilatildeo Controle 115microgl 23microgl 56microgl A 10 10 10 10 B 10 10 10 10 C 10 10 10 10
Para cada peixe que sobreviveu agrave intoxicaccedilatildeo pelo periacuteodo de 96 horas (teste de
toxicidade subletal) foram obtidos dados biomeacutetricos como peso corporal comprimento
total e comprimento-padratildeo peso do fiacutegado e peso do ovaacuterio Os ovaacuterios e fiacutegados na
sequecircncia foram fixados para posterior anaacutelise histoloacutegica
35 Avaliaccedilatildeo morfoloacutegica
351 Microscopia de luz
Apoacutes 96 horas de experimento seis animais de cada grupo foram coletados
anestesiados com benzocaiacutena e eutanasiados para coleta dos ovaacuterios e fiacutegados Para o
estudo das caracteriacutesticas morfoloacutegicas de ovaacuterios e fiacutegados os fragmentos foram
fixados em paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo fosfato 01M pH 72 O material foi
fixado por um periacuteodo miacutenimo de 24 horas e preservado em aacutelcool 70 Em seguida os
fragmentos foram transferidos para soluccedilatildeo de aacutelcool 95 por quatro horas Apoacutes isso
os fragmentos de ovaacuterios e fiacutegados foram imersos em soluccedilatildeo de aacutelcool 95 e resina
glicolmetacrilato (Leica Historesin) na proporccedilatildeo de 11 por 12 horas seguida de resina
pura por 24 horas e posterior emblocamento Os fragmentos foram seccionados em
cortes com 3microm de espessura em microacutetomo rotativo com navalha de vidro Foi
preparada uma lacircmina por animal com quatro cortes em cada e em padratildeo semi-seriado
ou seja a cada corte aproveitado eram descartados cinco cortes seguintes para evitar que
a mesma ceacutelula fosse contada duas vezes no momento da anaacutelise baseando-se no
diacircmetro nuclear previamente estabelecido para cada tipo celular em questatildeo
22
As coloraccedilotildees utilizadas foram azul de toluidina e hematoxilinaeosina para
anaacutelises histotoloacutegicas e para morfometria Tambeacutem foi utilizada a reaccedilatildeo histoquiacutemica
com PAS contracorados com hematoxilina para os cortes de fiacutegados As lacircminas foram
montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e
as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
352 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos fiacutegados
Os estudos morfoloacutegicos foram conduzidos em seis animais por concentraccedilatildeo
As lacircminas histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo e fotografadas (ocular
de 10X e objetiva de 40X) em 10 campos ao acaso para anaacutelises morfoloacutegicas e
morfomeacutetricas que pudessem ser representativas dos efeitos do Thiodanreg no tecido
hepaacutetico Estas alteraccedilotildees foram comparadas com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos fiacutegados
das lacircminas do grupo controle
As alteraccedilotildees histoloacutegicas foram avaliadas semiquantitativamente em duas
formas 1) por meio do caacutelculo do Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) com base na
incidecircncia de lesotildees Para tanto atribuiu-se um valor numeacuterico para cada animal
conforme a escala grau 1 (ausecircncia de alteraccedilatildeo histoloacutegica) grau 2 (ocorrecircncia de
lesotildees pontualmente localizadas) e grau 3 (lesotildees amplamente distribuiacutedas pelo oacutergatildeo)
em 10 campos fotografados e 2) por meio do caacutelculo do Iacutendice de Alteraccedilatildeo
Histopatoloacutegica (IAH) com base na severidade de cada lesatildeo de acordo com Schwaiger
et al (1997) Para tanto as alteraccedilotildees foram classificadas em estaacutedios progressivos
quanto ao comprometimento das funccedilotildees do oacutergatildeo alteraccedilotildees de estaacutedio I que natildeo
comprometem o funcionamento do oacutergatildeo de estaacutedio II mais severas e que prejudicam
o funcionamento normal do oacutergatildeo e de estaacutedio III muito severas e irreversiacuteveis
adaptado de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic (1994) (Tabela 2) O valor de IAH foi
calculado para cada animal utilizando a foacutermula IAH =10ordm sumI + 10ˡ sumII + 10sup2 sumIII
sendo I II e III correspondentes ao nuacutemero de alteraccedilotildees de estaacutedio I II e III
respectivamente O valor meacutedio de IAH foi dividido em cinco categorias seguindo
metodologia de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic (1994) 0-10= funcionamento normal do
tecido 11-20= dano leve a moderado do tecido 21-50= dano moderado a severo do
tecido 51-100= dano severo do tecido maior que 100= dano irreparaacutevel do tecido Este
iacutendice permitiu a comparaccedilatildeo da severidade das lesotildees hepaacuteticas entre os peixes
expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
23
Tabela 2 Classificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histoloacutegicas do fiacutegado quanto ao estaacutegio de comprometimento das funccedilotildees teciduais (adaptado de Poleksic amp MitrovicndashTutundzic1994)
Para as anaacutelises morfomeacutetricas foram realizadas dez mediccedilotildees dos diacircmetros de
nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos para cada animal As medidas foram obtidas por
meio do programa Image-Pro Plus traccedilando duas linhas perpendiculares respeitando-se
os limites do nuacutecleo e do citoplasma do hepatoacutecito em anaacutelise (Figura 5) Aleacutem disso
foram quantificados pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleo citoplasma capilar sinusoides e
macroacutefagos em 10 campos (gradiacutecula com 100microm de lado e uma aacuterea de 10000micromsup2)
totalizando 4410 pontosanimal para o caacutelculo da constituiccedilatildeo tecidual hepaacutetica (Figura
6) Estas avaliaccedilotildees foram conduzidas nos grupos controles e grupos de peixes expostos
ao toacutexico nas diferentes concentraccedilotildees
A quantidade de glicogecircnio nos hepatoacutecitos foi avaliada em toda extensatildeo da
lacircmina de forma semiquantitativa sendo evidenciada pela reaccedilatildeo histoquiacutemica de
Periodic Acid Schiff (PAS) segundo Michalany (1980) Para melhor compreensatildeo dos
resultados as marcaccedilotildees foram determinadas na seguinte escala 0- ausecircncia de
glicogecircnio 1- pouco glicogecircnio 2- quantidade moderada de glicogecircnio 3- muito
glicogecircnio Apoacutes esta anaacutelise foi calculada uma meacutedia do conteuacutedo de glicogecircnio dos
hepatoacutecitos nos grupos controles e grupos expostos ao toacutexico nas diferentes
concentraccedilotildees
ALTERACcedilOtildeES HISTOPATOLOacuteGICAS HEPAacuteTICAS ESTAacuteGIO1 Alteraccedilatildeo nos hepatoacutecitosAtrofia nuclear I
Atorfia nuclear I
Deformaccedilatildeo do contorno celular I
Deformaccedilatildeo do contorno nuclear I
Hipertrofia celular I
Hipertrofia nuclear I
Nuacutecleo na periferia da ceacutelula II
Vacuolizaccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo nuclear II
Nuacutecleos picnoacuteticos II
Rompimento celular II
2 Alteraccedilotildees nos vasos sanguiacuteneos
Hiperemia II
Ruptura de vasos II
3 Necrose
Necrose focal III
24
Figura 5 Metodologia para obtenccedilatildeo de medidas de diacircmetro de nuacutecleo e citoplasma de hepatoacutecitos por meio do programa Image-Pro Plus Coloraccedilatildeo Azul de toluidina Barra 5microm
Figura 6 Gradiacutecula utilizada para contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos capilares e macroacutefagos (4410 pontosanimal) Coloraccedilatildeo Azul de toluidina
25
353 Anaacutelises morfomeacutetri cas e morfoloacutegicas dos ovaacuterios
Os estudos foram conduzidos em seis animais de cada grupo em cada
experimento As lacircminas histoloacutegicas foram analisadsas em toda sua extensatildeo em busca
de alteraccedilotildees morfoloacutegicas foliculares (Tabela 3) que pudessem ser representativas dos
efeitos do Thiodanreg no tecido ovariano sempre comparando estas alteraccedilotildees com o
padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios das lacircminas dos grupos controles
Para a avaliaccedilatildeo morfomeacutetrica foram realizadas contagens dos diferentes
estaacutegios de desenvolvimento folicular Para isto foram utilizadas fotografias obtidas a
partir de 10 campos escolhidos ao acaso em objetiva de 10X (campo com 5094microm de
largura por 68120microm de comprimento totalizando uma aacuterea de 1863 mmsup2) Aleacutem
disso foi realizada a contagem de foliacuteculos atreacutesicos e observados eosinoacutefilos
associados aos foliacuteculos vitelogecircnicos utilizando o microscoacutepio com objetiva de 40X
avaliando-se 10 foliacuteculos escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro
experimentos Tambeacutem foram realizadas mediccedilotildees de diacircmetros em 10 foliacuteculos
vitelogecircnicos para cada animal Estas medidas foram obtidas pelo programa Image-Pro
Plus traccedilando-se duas linhas perpendiculares sobre nuacutecleo e central e respeitando-se os
limites do foliacuteculo As mensuraccedilotildees foram realizadas em imagens obtidas com objetiva
de 4X (Figura 7) Em todas as contagens e mediccedilotildees foram calculados os valores
meacutedios e desvios-padratildeo para cada concentraccedilatildeo para se avaliar o desenvolvimento
folicular nos diferentes experimentos
Tabela 3 Alteraccedilotildees histoloacutegicas do ovaacuterio quanto ao comprometimento folicular (adaptado de Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS FOLICULAR ES Alteraccedilatildeo nos foliacuteculos
Descolamento do revestimento folicular
Retraccedilatildeo citoplasmaacutetica
Retraccedilatildeo nuclear
Atresia folicular
Aglutinaccedilatildeo nucleoplasmaacutetica
Aglutinaccedilatildeo citoplasmaacutetica
Aglutinaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo
Foliacuteculos vazios
Granuloacutecitos envolvendo foliacuteculos
26
Figura 7 Metodologia para obtenccedilatildeo de medidas de diacircmetro de ovoacutecitos vitelogecircnicos avanccedilados por meio do programa Image-Pro Plus Coloraccedilatildeo Hematoxilina eosina
354 Imunoistoquiacutemica
Para detectar a possiacutevel imunorreatividade para colaacutegeno tipo IV integrinas β1 e
caspase 3 no tecido conjuntivo ovaacuterios do lambari foram fixados em paraformaldeido a
4 A recuperaccedilatildeo antigecircnica foi realizada em forno microndas por 10 minutos com os
cortes nas lacircminas sendo imersos em tampatildeo citrato 10mM pH 60 As lacircminas foram
incubadas com peroacutexido de hidrogecircnio a 3 em tampatildeo fosfato por 15 minutos em
temperatura ambiente para inativar peroxidase endoacutegena e com soro albumina bovina a
2 por 45 minutos para bloquear marcador antigecircnico inespeciacutefico Anticorpos
primaacuterios anti-colaacutegeno tipo IV anti-integrina β1 e anti-caspase 3 (Santa Cruz
Biotechnology Calif USA) foram aplicados nas secccedilotildees a 4degC na diluiccedilatildeo 1100
(integrina e colaacutegeno tipo IV) e 1200 (Caspase 3) segundo o fabricante ldquoovernightrdquo
Os cortes foram lavados em PBS e incubados por 45 minutos com diluiccedilatildeo de 1200
com anticorpo secundaacuterio IgG anti-coelho (LSAB 2 sistema HRP da Dako Cytomation
kit Dako Cytomation Carpinteria Calif USA) e tratado com peroxidase conjugada
com estreptavidina por 45 minutos A revelaccedilatildeo foi realizada com diaminobenzidina
(DAB) e as lacircminas foram contracoradas com hematoxilina (Santos et al 2008a)
27
36 Paracircmetros biomeacutetricos
Para analisar quantitativamente a atividade reprodutiva do A bimaculatus foram
registrados para cada exemplar os seguintes dados biomeacutetricos peso corporal (em g)
peso dos ovaacuterios (em g) e peso do fiacutegado (em g) Os valores meacutedios e desvios-padratildeo
dos iacutendices gonadossomaacutetico e hepatossomaacutetico foram calculados para cada animal em
cada um dos grupos propostos no presente estudo
a) Iacutendice gonadossomaacutetico (IGS)
IGS=PG x100 PG= peso dos ovaacuterios
PC PC= peso corporal
b) Iacutendice hepatossomaacutetico (IHS)
IHS= PF x100 PF= peso do fiacutegado
PC PC= peso corporal
37 Anaacutelises estatiacutesticas
As variaacuteveis quantitativas foram submetidas aos testes de homocedasticidade
(Levenes) e normalidade (Shapiro-Wilk) e posteriormente agrave anaacutelise de variacircncia para
testar as variaccedilotildees nos valores meacutedios dos iacutendices calculados no momento da coleta (96
horas) entre os grupos controles e os grupos tratados Foi analisado o coeficiente de
variaccedilatildeo para se evitar erros estatiacutesticos tipo I e tipo II e logo apoacutes foi realizado o teste
parameacutetrico de Duncan ou Tukey (Plt005) para comparar os valores meacutedios Quando
natildeo atenderam agraves premissas de normalidade e homocedasticidade mesmo apoacutes as
transformaccedilotildees apropriadas os dados foram submetidos aos testes natildeo-parameacutetricos de
Kruskal-Wallis (ANOVA) Para as variaacuteveis qualititativas quantificadas foi utilizado o
teste de Kruskal-Wallis (ANOVA) Os graacuteficos foram produzidos usando o software
Microsoft Excel 2010
28
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5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 CAPIacuteTULO 1
EFEITOS DO INSETICIDA THIODAN reg SOBRE A MORFOLOGIA HEPAacuteTICA
DE FEcircMEAS DE LAMBARIS Astyanax bimaculatus
RESUMO
O Thiodanreg eacute um toacutexico que pode causar alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos tecidos de peixes
expostos a ele dependendo da concentraccedilatildeo A fim de investigar possiacuteveis alteraccedilotildees
este estudo avaliou a morfologia hepaacutetica de fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus
expostas ao Thiodanreg por 96 horas em quatro diferentes experimentos com trecircs
concentraccedilotildees subletais de 115 23 e 56 microgL de Thiodanreg aleacutem de um grupo
controle livre de toacutexico As fecircmeas foram divididas em quatro experimentos sem
aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem aclimataccedilatildeo e alimentados com aclimataccedilatildeo de 10 dias e
sem alimentaccedilatildeo e com aclimataccedilatildeo de 10 dias e alimentados Foi observado que a accedilatildeo do
Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou a estrutura morfoloacutegica do fiacutegado
como um todo mas foram observadas alteraccedilotildees em locais isolados do parecircnquima
hepaacutetico Houve depleccedilatildeo de glicogecircnio deformaccedilatildeo nuclear e citoplasmaacutetica
hipertrofia nuclear e citoplasmaacutetica hiperemia e degeneraccedilatildeo celular nos hepatoacutecitos
nas diferentes concentraccedilotildees No entanto o Iacutendice de Alteraccedilatildeo Histoloacutegica (IHA) e o
Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) demonstraram que as alteraccedilotildees observadas nos
fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas sendo na maioria alteraccedilotildees de estaacutedio I e II
de forma leve a moderada com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico em todas as
concentraccedilotildees Aleacutem disso houve alteraccedilatildeo do diacircmetro do nuacutecleo e citoplasma dos
hepatoacutecitos nos diferentes experimentos e maior quantidade de nuacutecleos de hepatoacutecitos
nos grupos expostos ao Thiodanreg associada agrave reduccedilatildeo na quantidade de citoplasma
Conclui-se que o Thiodanreg influenciou o metabolismo hepaacutetico como resposta
adaptativa celular A incidecircncia de alteraccedilotildees histoloacutegicas no fiacutegado dos lambaris
coletados nos diferentes experimentos indica o comprometimento da sauacutede destes
peixes e mostra que os paracircmetros analisados podem ser empregados como
biomarcadores da contaminaccedilatildeo ambiental nesta espeacutecie
Palavras-chave histopatologia fiacutegado peixe endosulfan ecotoxicologia
36
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 α-endosulfan e 30 β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo a
partir da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em risco os organismos que ali
residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al 2007)
Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos como jaacute
observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis niloticus A
Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan em gordura o valor de
005mgkg-1 (EPA 2002) e em aacutegua doce 022microgL-1 (EPA 1980) A Legislaccedilatildeo
Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em consideraccedilatildeo a qualidade da
aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm
3572007 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo do referido inseticida e
seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
A sensibilidade ao endosulfan pelos organismos aquaacuteticos tem sido bem descrita
na literatura (Capkin et al 2006 Ballesteros et al 2007 Pereira et al 2012) O
produto eacute extremamente toacutexico para peixes e outros organismos aquaacuteticos mesmo em
concentraccedilotildees muito pequenas (Cengiz et al 2001) No entanto a sensibilidade pode
variar entre os sexos assim como foi observado nos peixes adultos da espeacutecie Jenynsia
multidentata sob efeito do endosulfan por 96 horas (Ballesteros et al 2007) Neste
trabalho a CL50 em peixes machos foi de 072 μgL-1 enquanto nas fecircmeas foi de
131μgL-1 valores atribuiacutedos agraves diferenccedilas de maior reserva de lipiacutedeos nas fecircmeas que
nos machos Em outros estudos Capkin et al (2006) utilizaram 1978gL-1 em
Oreochromis mikyss por 24 horas de exposiccedilatildeo ao toacutexico o que causou aleacutem da morte
de 50 dos peixes convulsotildees nado erraacutetico separaccedilatildeo das lacircminas bracircnquiais e
necrose do fiacutegado e como Cengiz et al (2001) reportaram lesotildees similares no peixe-
mosquito Gambusia affinis
O sulfato de endosulfan eacute um dos produtos derivados do metabolismo do
endosulfan sendo considerado o principal metaboacutelito devido agrave sua importacircncia
toxicoloacutegica (Stumpf amp abhaver 1986) e por ser mais estaacutevel no meio ambiente do que
37
quando estaacute em sua foacutermula original (Ali et al 1984) Decorrente disto os peixes
quando expostos a este inseticida podem apresentar alteraccedilotildees morfoloacutegicas
significativas no fiacutegado (Capkin et al 2006 Coimbra et al 2007 Glover et al 2007)
Estas alteraccedilotildees morfoloacutegicas podem ser o surgimento de vacuolizaccedilatildeo dos hepatoacutecitos
depleccedilatildeo de glicogecircnio alteraccedilatildeo dos vasos sinusoides alteraccedilatildeo do tamanho dos
hepatoacutecitos e necroses o que de acordo com alguns autores pode influenciar a siacutentese
de vitelogenina no fiacutegado para formaccedilatildeo dos foliacuteculos vitelogecircnicos em periacuteodo
reprodutivo (Senthilkumaran et al 2004 Al-Ghais 2013 Silva Barni et al 2014 )
Aleacutem disso as funccedilotildees hepaacuteticas podem ser influenciadas pelas diferenccedilas na
capacidade de exposiccedilatildeo a contaminantes condiccedilatildeo fisioloacutegica armazenamento de
energia e haacutebitos alimentares (Ribeiro et al 2006 Al -Ghais 2013 Silva Barni et al
2014)
O lambari Astyanax bimaculatus foi escolhido como organismo experimental
pois eacute muito representativo no ecossistema sendo encontrado desde o Nordeste
brasileiro ateacute a bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Eacute um peixe de
pequeno porte e de faacutecil manutenccedilatildeo em laboratoacuterio
Este estudo teve como objetivo verificar a ocorrecircncia de alteraccedilotildees histoloacutegicas
no fiacutegado de fecircmeas de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada e avaliar a intensidade
de alteraccedilatildeo deste orgatildeo em peixes alimentados e desprovidos de alimento durante
ensaios subletais agudos com o toacutexico Thiodanreg
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste de toxicidade aguda e o teste subletal As
atividades de coleta fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos fiacutegados microtomia
coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e morfomeacutetricas foram
realizadas nos Laboratoacuterios de Peixes e de Histopatologia do Departamento de
Veterinaacuteria da UFV (DVTUFV)
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
38
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos animais em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado poro genital
dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV Os
aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuem capacidade de 50 litros numa
densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro
temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam
sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo contiacutenua da aacutegua para garantir o bem-estar dos
peixes Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial Purina contendo 35 de
proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste da toxicidade aguda em sistema estaacutetico - CL 50
O teste de concentraccedilatildeo letal (CL50) que avalia a concentraccedilatildeo responsaacutevel pela
mortalidade de 50 dos animais foi realizado em sistema de aacutegua estaacutetico de acordo
com a NBR 15088 (ABNT 2007) com os animais mantidos em restriccedilatildeo alimentar que
se iniciou 24 horas antes do iniacutecio do experimento e perdurou durante todo o teste (96
horas) Essa restriccedilatildeo alimentar foi realizada para evitar acuacutemulo de mateacuteria orgacircnica
que poderia interferir na accedilatildeo do agrotoacutexico
Para o teste foram selecionadas 120 fecircmeas adultas de lambari em maturaccedilatildeo
avanccedilada O agrotoacutexico utilizado foi o Thiodanreg (Bayer) com 350gL-1 de endosulfan
Foram utilizadas trecircs repeticcedilotildees com cinco peixes cada para cada concentraccedilatildeo de
39
Thiodanreg adotada sendo os grupos assim classificados controle (0microgL-1) 15microgL-1
30microgL-1 60microgL-1 120microgL-1 240microgL-1 480microgL-1 e 960microgL-1 As concentraccedilotildees
foram distribuiacutedas em recipientes plaacutesticos com 15L de aacutegua dos proacuteprios aquaacuterios
Foram realizadas verificaccedilotildees de mortalidade a cada seis horas ateacute 96 horas
(zero 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 e 96 horas) removendo-se
os animais mortos o que proporcionou menores interferecircncias pela decomposiccedilatildeo dos
peixes gerando maior confianccedila da mortalidade apresentada ser em funccedilatildeo da
toxicidade do princiacutepio ativo endosulfan sinergicamente agrave accedilatildeo dos solventes e demais
compostos do inseticida Para acompanhamento da temperatura foi acondicionado 15L
de aacutegua do mesmo aquaacuterio em um recipiente idecircntico de forma que qualquer variaccedilatildeo
na temperatura pudesse ser medida sem provocar estresse adicional a nenhum grupo O
programa utilizado para o caacutelculo da CL50 foi o TOXCALC determinando o valor e
intervalo de confianccedila pelo meacutetodo PROBITUS (Plt005)
24 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi realizado baseando-se
principalmente nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo a NBR
15088 (ABNT 2007)
As fecircmeas foram expostas ao Thiodanreg (endosulfan 350gL-1) por 96 horas em
quatro tratamentos diferentes 1) experimento sem aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem
alimentaccedilatildeo 2) experimento sem aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo 3) experimento com
aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e 4) experimento com aclimataccedilatildeo de 10 dias
e com alimentaccedilatildeo Todos os experimentos foram constituiacutedos por trecircs concentraccedilotildees
diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 preacute-determinada em laboratoacuterio de acordo com
a NBR 15088 (ABNT 2007) e um grupo controle sem toacutexico As concentraccedilotildees
utilizadas em cada experimento foram de 115 23 e 56microgL-1 com trecircs repeticcedilotildees sob
as mesmas condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
25 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas
Apoacutes 96 horas de experimento foram coletados 96 peixes sendo seis animais
em cada grupo nos diferentes experimentos Logo em seguida os fiacutegados foram
coletados apoacutes os peixes terem sido anestesiados com benzocaiacutena (110000) e
eutanasiados pela secccedilatildeo transversal da coluna vertebral na regiatildeo do opeacuterculo
40
Para a histologia todas as amostras foram fixadas em paraformaldeiacutedo a 4 em
tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedos em resina glicolmetacrilato
(Leica Historesinreg) Em seguida secccedilotildees com 3microm de espessura foram coradas
utilizando azul de toluidina para as anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas As lacircminas
foram montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31
Olympus e as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software
Analysis GETIT Olympus
As lacircminas histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo e foram
fotografados 10 campos ao acaso em objetiva de 40X para anaacutelises morfoloacutegicas e
morfomeacutetricas que pudessem ser representativas do efeito do Thiodanreg no tecido
hepaacutetico Estas alteraccedilotildees foram comparadas com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos fiacutegados
dos grupos controles
As alteraccedilotildees histoloacutegicas foram avaliadas semiquantitativamente de duas
formas 1) por meio do caacutelculo do Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) com base na
incidecircncia de lesotildees Para tanto atribuiu-se um valor numeacuterico para cada oacutergatildeo
conforme a escala grau 1 (ausecircncia de alteraccedilatildeo histoloacutegica) grau 2 (ocorrecircncia de
lesotildees pontuais) e grau 3 (lesotildees amplamente difusas pelo oacutergatildeo) em 10 campos
fotografados e 2) pelo caacutelculo do Iacutendice de Alteraccedilatildeo Histotoloacutegica (IAH) com base na
severidade de cada lesatildeo de acordo com Schwaiger et al (1997) Para tanto as
alteraccedilotildees foram classificadas em estaacutedios progressivos quanto ao comprometimento
das funccedilotildees do oacutergatildeo alteraccedilotildees de estaacutedio I que natildeo comprometem o funcionamento
do oacutergatildeo de estaacutedio II mais severas e que prejudicam o funcionamento normal do
oacutergatildeo e de estaacutedio III muito severas e irreversiacuteveis (adaptado de Poleksic amp Mitrovic-
Tutundzic 1994) (Tabela 1) O valor de IAH foi calculado para cada animal utilizando a
foacutermula IAH =10ordm sumI + 10ˡ sumII + 10sup2 sumIII sendo I II e III correspondentes agraves
alteraccedilotildees de estaacutedios I II e III respectivamente O valor meacutedio de IAH foi dividido em
cinco categorias que seguiu metodologia de Poleksic amp Mitrovic- Tutundzic (1994) 0-
10= funcionamento normal do tecido 11-20= dano leve a moderado do tecido 21-50=
dano moderado a severo do tecido 51-100= dano severo do tecido maior que 100=
dano irreparaacutevel do tecido Este iacutendice permitiu a comparaccedilatildeo da severidade das lesotildees
hepaacuteticas entre os peixes expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
Para as anaacutelises morfomeacutetricas foram realizadas mediccedilotildees dos diacircmetros de dez
nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos para cada animal As medidas foram obtidas por
meio do programa Image-Pro Plus traccedilando duas linhas perpendiculares respeitando-se
41
os limites do nuacutecleo e do citoplasma do hepatoacutecito em anaacutelise Aleacutem disso foram
quantificados pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleo de hepatoacutecito citoplasma de hepatoacutecito
capilares sinusoides e macroacutefagos em 10 campos utilizando-se gradiacutecula com 441
pontos de interseccedilatildeo com 100microm de lado e uma aacuterea de 10000micromsup2 totalizando 4410
pontosanimal para o caacutelculo da constituiccedilatildeo tecidual hepaacutetica
Tabela 1 Classificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histoloacutegicas do fiacutegado quanto ao estaacutegio de comprometimento das funccedilotildees teciduais (adaptado de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic 1994)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS HEPAacuteTICAS ESTAacuteDIO 1 Alteraccedilotildees nos hepatoacutecitos I Atrofia nuclear I Deformaccedilatildeo do contorno celular I Deformaccedilatildeo do contorno nuclear I Hipertorfia celular I Hipertorfia nuclear I Nuacutecleo na periferia da ceacutelula I Vacuolizaccedilatildeo citoplasmaacutetica I Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II Degeneraccedilatildeo nuclear II Nuacutecleo picnoacuteticos II Rompimento celular II 2 Alteraccedilotildees nos vasos sanguiacuteneos Hiperemia II Ruptura de vasos II 3 Necrose Necrose focal III
A quantidade de glicogecircnio nos hepatoacutecitos foi avaliada em toda extensatildeo da
lacircmina de forma semiquantitativa sendo evidenciada pela reaccedilatildeo histoquiacutemica de
Periodic Acid Schiff (PAS) seguida de contracoloraccedilatildeo com hematoxilina segundo
Michalany (1980) Para melhor compreensatildeo dos resultados as marcaccedilotildees foram
determinadas na seguinte escala 0- ausecircncia de glicogecircnio 1- pouco glicogecircnio 2-
quantidade moderada de glicogecircnio 3- muito glicogecircnio Apoacutes esta anaacutelise foi
calculada uma meacutedia do conteuacutedo de glicogecircnio dos hepatoacutecitos nos grupos controles e
grupos expostos ao toacutexico nas diferentes concentraccedilotildees
42
26 Iacutendice hepatossomaacutetico (IHS)
Para o caacutelculo do IHS foram registrados para cada exemplar os dados
biomeacutetricos de peso corporal (PC em g) e peso do fiacutegado (PF em g) Os valores meacutedios
e os desvios padratildeo do iacutendice hepatossomaacutetico (IHS=PFx100PC) foram calculados
para cada animal em cada um dos grupos nos diferentes experimentos nas diferentes
concentraccedilotildees
27 Anaacutelises estatiacutesticas
Os dados estatildeo apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo
Os dados foram avaliados pelo Software Statistica 70 por meio da anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) Apoacutes o teste de distribuiccedilatildeo normal os dados foram comparados
entre os grupos controle e grupos expostos ao Thiodanreg usando anaacutelise de variacircncia
one-way seguida pelo teste de Tukey ou Duncan Quando os dados natildeo apresentaram
uma distribuiccedilatildeo normal foi utilizado o teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Plt005 foi utilizado como criteacuterio de significacircncia
3 RESULTADOS
31 Determinaccedilatildeo da CL50-96h
Nas primeiras seis horas de experimento observou-se mortalidade de 100 de
peixes na concentraccedilatildeo de 96microgL-1 944 de mortalidade em 48microgL-1 733 de
mortalidade em 24microgL-1 266 de mortalidade em 12microgL-1 e 20 de mortalidade em
6microgL-1 sendo um total de 447 dos peixes que morreram nas diferentes
concentraccedilotildees do Thiodanreg nas primeiras seis horas Na concentraccedilatildeo de 3microgL-1
morreu apenas um peixe no final das 96 horas Foi observado 100 de mortalidade na
concentraccedilatildeo de 48microgL-1 em ateacute 12 horas de exposiccedilatildeo ao toacutexico As menores
mortalidades foram registradas nas concentraccedilotildees de Thiodanreg de 3microgL-1 e 6microgL-1
sendo respectivamente 944 e 80 de sobrevivecircncias A concentraccedilatildeo de 15microgL-1
de Thiodanreg e o grupo controle natildeo tiveram mortalidade A temperatura da aacutegua
apresentou variaccedilatildeo entre 220ordmC e 245 ordmC com meacutedia de 233plusmn072 ordmC
Os valores registrados determinaram CL50-96hs de 1367microgL-1para as fecircmeas de
A bimaculatus com intervalo de confianccedila de 101 a 184microgL-1 (Plt005)
43
32 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Durante a exposiccedilatildeo ao Thiodanreg por 96 horas foi observado comportamento
anormal dos peixes com nado erraacutetico tentativa de fuga dos aquaacuterios demonstraccedilatildeo de
agressividade com os demais peixes busca de oxigecircnio na superfiacutecie e respiraccedilatildeo
branquial acelerada Apoacutes 24 horas do iacutenicio os animais apresentavam comportamento
normal e procuravam pelo alimento Estas mudanccedilas comportamentais ocorreram em
todas as concentraccedilotildees do agrotoacutexico utilizadas com maior intensidade na concentraccedilatildeo
de 56microgL do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo cuja temperatura meacutedia
foi superior agrave dos demais experimentos (Tabela 2)
33 Morfologia e frequecircncia das alteraccedilotildees histoloacutegicas nos fiacutegados
Morfologicamente o fiacutegado dos lambaris apresentou hepatoacutecitos hexagonais
com citoplasma de aspecto granular e vacuolizado nuacutecleo arredondado central nucleacuteolo
evidente e presenccedila de hepatopacircncreas Os hepatoacutecitos estavam dispostos em cordotildees
margeando os sinusoides (Figura 1 A)
Os infiltrados leucocitaacuterios foram observados nos grupos controles e nos grupos
expostos ao Thiodanreg (Figura 1 B)
A vacuolizaccedilatildeo foi evidente nos hepatoacutecitos das fecircmeas analisadas (Figura 1 A)
No fiacutegado das fecircmeas do experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve a presenccedila caracteriacutestica de acuacutemulos de lipiacutedios nos
hepatoacutecitos com a presenccedila de vesiacuteculas claras grandes e envolvidas por glicogecircnio
marcado positivamente pela reaccedilatildeo de PAS (Figura 1 C) Aleacutem disso foram observados
nuacutecleos deslocados para a periferia celular No experimento sem aclimataccedilatildeosem
alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve reaccedilatildeo negativa pelo PAS no
citoplasma dos hepatoacutecitos (Figura 1 D)
As alteraccedilotildees de estaacutedio I como deformaccedilatildeo do contorno nuclear nuacutecleo na
periferia da ceacutelula atrofia nuclear desarranjo dos cordotildees hepaacuteticos hipertrofia celular
e nuclear (Figuras 1 E-G Figuras 2 A-B) foram observadas nos grupos controles e
naqueles expostos ao Thiodanreg sendo que nos grupos tratados houve maior frequecircncia
O deslocamento do nuacutecleo para a periferia do hepatoacutecito foi observado nas fecircmeas do
experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 56microgL-1
Quanto agraves alteraccedilotildees de estaacutedio II a degeneraccedilatildeo nuclear (Figura 2 C) foi
raramente presente na maioria das concentraccedilotildees nos diferentes experimentos A
degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica (Figura 2 D) foi pouco frequente em todos os experimentos
44
assim como a hiperemia (Figura 2 E) A presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos (Figura 2 F) foi
mais frequente no experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e no experimento
com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
Os VMAs variaram entre 125 e 228 nas fecircmeas analisadas sendo a menor
meacutedia observada nos grupos controles e as maiores nos grupos expostos ao Thiodanreg o
que mostra incidecircncia maior de alteraccedilotildees pontuais no fiacutegado nos animais dos grupos
tratados Os VMAs do fiacutegado na espeacutecie estudada foram superiores (Plt005) nos peixes
expostos ao agrotoacutexico quando comparado aos peixes dos grupos controles (Tabela 3)
O IAH das fecircmeas nos diferentes experimentos apresentaram valores superiores
(Plt005) nos grupos expostos ao Thiodanreg quando comparados como os grupos
controles (Tabela 4) com exceccedilatildeo do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 115microgL-1 de endosulfan que natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
34 Diacircmetro dos nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos
Os resultados demonstraram aumento (Plt005) no diacircmetro dos nuacutecleos de
hepatoacutecitos dos peixes expostos ao Thiodanreg nas concentraccedilotildees de 115microgL-1 e
23microgL-1 quando comparados ao grupo controle no experimento sem aclimataccedilatildeosem
alimentaccedilatildeo Por outro lado foi registrada diminuiccedilatildeo (Plt005) do diacircmetro dos nuacutecleos
de hepatoacutecitos no experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo quando comparados
aos peixes expostos ao Thiodanreg na concentraccedilatildeo 115 e 23microgL-1 em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Tabela 5)
O diacircmetro do citoplasma apresentou aumento no experimento sem
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e no experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo com
diferenccedila (Plt005) registrada entre os peixes do grupos controles e expostos ao
agrotoacutexico com exceccedilatildeo do experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 23microgL-1 (Tabela 6) Entretanto houve diminuiccedilatildeo nos citoplasmas de
hepatoacutecitos nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo ao grupos controles (Plt005)
nos experimentos sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e no experimento com
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Tabela 6)
35 Quantificaccedilatildeo de nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos macroacutefagos e capilares
sanguiacuteneos no tecido hepaacutetico
Nas contagens de pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleos de hepatoacutecitos (Tabela 7)
foram observadas quantidades superiores nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo
45
aos grupos controles (Plt005) Na quantificaccedilatildeo dos citoplasmas de hepatoacutecitos foram
registradas contagens inferiores (Plt005) nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo
aos grupos controles exceto no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Tabela
8)
Na contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre macroacutefagos natildeo houve aumento
significativo (Pgt005) nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo ao controle (Tabela
9) Em relaccedilatildeo agrave contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre capilares sinusoides a
contagem foi igual na maioria dos peixes expostos ao agrotoacutexico quando comparados
com os controles apresentando diferenccedila significativa (Plt005) entre os grupos
expostos do experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo nas concentraccedilotildees de 115 e
56microgL-1 (Tabela 10)
36 Quantificaccedilatildeo do glicogecircnio hepaacutetico
Em todos os grupos controles e tratados nos diferentes experimentos foram
registrados valores meacutedios para o glicogecircnio variando entre 010 e 300 No
experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo no grupo tratado da concentraccedilatildeo de
56microgL-1 de Thiodanreg foi registrada a menor meacutedia (Tabela 11) No entanto houve
diferenccedila (Plt005) do glicogecircnio hepaacutetico na concentraccedilatildeo de 56microgL quando
comparada com as concentraccedilotildees de 115 e 23microgL-1 (Tabela 11 e Figura 1 D)
37 Iacutendice hepatossomaacutetico
As fecircmeas dos grupos experimentais expostos ao Thiodanreg natildeo apresentaram
diferenccedilas (Pgt005) nos valores do IHS quando comparados com os grupos controles
(Tabelas 12) Entretanto houve diferenccedila (Plt005) do IHS na concentraccedilatildeo de 56microgL-1
quando comparada com as concentraccedilotildees de 115 e 23microgL-1 no experimento sem
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Tabela 12)
4 DISCUSSAtildeO
No presente estudo o lambari apesar de ser de pequeno porte apresentou uma
CL50 de 1367microgL-1 em 96 horas sendo mais resistente que adultos de tilaacutepia niloacutetica
Musanhi (1987) determinou a CL50 96 48 e 24 horas de exposiccedilatildeo ao endosulfan para
tilaacutepia niloacutetica adulta encontrando valores de 142 380 e 103 microgL-1 Nas primeiras 24
horas de accedilatildeo do Thiodanreg nas concentraccedilotildees subletais de 115 23 e 56microgL-1 as
fecircmeas do presente estudo apresentaram comportamentos alterados assim como foi
46
observado na espeacutecie Danio rerio exposta ao endosulfan por 96 horas na concentraccedilatildeo
de 24microgL-1 aleacutem desta espeacutecie ter apresentado uma diminuiccedilatildeo do niacutevel de
acetilcolinesterase (AChE) (Pereira et al 2012) Por outro lado em estudo realizado
por Hernan da Cuntildea et al (2011) com a espeacutecie Cichlasoma dimerus exposta ao
endosulfan por 96 horas nas concentraccedilotildees de 025 1 2 3 4 e 16microgL-1 os peixes
exibiram comportamento indicativo de neurotoxicidade mas natildeo foram encontradas
diferenccedilas na atividade da AChE Estes estudos fornecem evidecircncias adicionais de
efeitos deleteacuterios da exposiccedilatildeo ao endosulfan sobre o sistema nervoso o que contribui
para as observaccedilotildees obtidas no presente estudo
As descriccedilotildees histoloacutegicas hepaacuteticas nas fecircmeas do presente estudo foram
semelhantes ao que foi caracterizado em outros peixes onde os hepatoacutecitos organizam-
se em fileiras ou cordotildees duplos em formato de placas representando um sistema de
fundo-cego anastomosado e de tuacutebulos ramificados (Metcalfe 1998 Hinton et al
2001)
A histologia e a fisiologia do fiacutegado satildeo similares nos vertebrados Ferguson
(1989) e Gingerich (1982) descrevem que existem algumas diferenccedilas estruturais
marcadas no parecircnquima hepaacutetico de peixes em especial pela ausecircncia de lobulaccedilatildeo
espaccedilo porta claacutessico e ausecircncia de zonaccedilatildeo no parecircnquima hepaacutetico o que permite
fluxo lento de sangue nos sinusoides com penetraccedilatildeo diminuiacuteda de quiacutemicos nos
hepatoacutecitos
A presenccedila de porccedilotildees pancreaacuteticas dentro do fiacutegado do lambari eacute descrita na
literatura (Santos et al 2013) Uma das funccedilotildees das ceacutelulas pancreaacuteticas distribuiacutedas
pelo fiacutegado eacute a produccedilatildeo da enzima de biotransformaccedilatildeo citocromo P450 diferente do
que eacute observado para mamiacuteferos onde esta enzima eacute ausente (Hahn et al 1994
Stegeman 1991) A presenccedila de ceacutelulas pancreaacuteticas em estruturas do tecido hepaacutetico
de A bimaculatus sugere a provaacutevel funccedilatildeo dessas ceacutelulas em auxiliar na
desintoxicaccedilatildeo Outra importante estrutura na detoxificaccedilatildeo eacute a presenccedila das ceacutelulas dos
endoteacutelios capilares nas quais tem sido confirmada e identificada a presenccedila de enzimas
citocromo P450 por meio de teacutecnicas de imunomarcaccedilatildeo (Lorenzana et al 1986)
Sendo assim a integridade estrutural dos capilares permanece intacta e sem
comprometimento das possiacuteveis funccedilotildees celulares que estas estruturas podem
desempenhar no tecido hepaacutetico de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
A ausecircncia de estagnaccedilatildeo biliar nos fiacutegados das fecircmeas de A bimaculatus eacute um
fator importante de que o Thiodanreg natildeo interferiu na fisiologia de excreccedilatildeo biliar nos
47
diferentes experimentos Histopatologicamente este tipo de alteraccedilatildeo eacute observado nos
citoplasmas dos hepatoacutecitos com a presenccedila de gracircnulos castanho-amarelados Esta
alteraccedilatildeo consiste na manifestaccedilatildeo fisiopatoloacutegica de uma condiccedilatildeo causada pela falta
de metabolismo e excreccedilatildeo biliar (Pacheco amp Santos 2002) uma vez que a bile
sintetizada pelos hepatoacutecitos permanece no interior das ceacutelulas natildeo sendo liberada para
o tubo digestivo (Simonato et al 2008) Este tipo de alteraccedilatildeo pode ser encontrado em
peixes expostos a toacutexicos (Pacheco amp Santos 2002) e tambeacutem em peixes que
apresentam algum problema nutricional quando satildeo mantidos em cativeiros (Langiano
amp Martinez 2008) No entanto no presente estudo natildeo foram registradas essas
evidecircncias o que sugere que a alimentaccedilatildeo nos grupos tratados com raccedilatildeo comercial de
todos os experimentos natildeo interferiu nas funccedilotildees biliares
Os agregados macrofaacutegicos estatildeo relacionados agrave quebra de eritroacutecitos (Herraez
amp Zapata 1986) apresentaccedilatildeo de antiacutegeno (Ellis 1980) armazenamento de ferro e
detoxicaccedilatildeo de substacircncias endoacutegenas e exoacutegenas (Herraez amp Zapata 1986) Hartley et
al (1996) propuseram a utilizaccedilatildeo do agregado macrofaacutegico como biomarcador de
poluiccedilatildeo aquaacutetica a partir da quantificaccedilatildeo destas estruturas Existem alguns estudos
comparativos em diferentes espeacutecies que tecircm demonstrado variaccedilotildees no nuacutemero
tamanho e pigmentaccedilatildeo destas estruturas em relaccedilatildeo agrave idade nutriccedilatildeo e estado de sauacutede
(Blazer et al 1987 Ferguson 1989 Agius et al 2003) Nos agregados podem ser
observados pigmentos do tipo lipofuscina ceroide hemossiderina e melanina (Wolke
1992 Wolf amp Wolfe 2005) mas no presente estudo natildeo foram evidenciadas nenhuma
destas estruturas
No fiacutegado das fecircmeas do grupo experimental sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
na maior concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve a presenccedila caracteriacutestica de acuacutemulos de
lipiacutedios nos hepatoacutecitos de dois peixes No entanto existem vaacuterias condiccedilotildees de
acuacutemulos de lipiacutedios nos hepatoacutecitos associados com a exposiccedilatildeo aos toacutexicos
(Thiyagarajah et al 1985 Biagianti-Risbourg et al 1995 Lumbertdacha et al 1995
Handy et al 1999 Fanta et al 2003) Glover et al (2007) submeteram o peixe salmatildeo
do Atlacircntico a dieta de 4microgkg de endosulfan por 14 e 35 dias sendo observadas
evidecircncias de lipidoses nos hepatoacutecitos O aparecimento destas estruturas nas fecircmeas de
A bimaculatus foi insignificante nos tecidos hepaacuteticos mas foram contabilizadas como
respostas individuais sugerindo uma disfunccedilatildeo hepaacutetica causada pelo Thiodanreg que
pode comprometer a fisiologia hepaacutetica destas fecircmeas
48
No presente estudo as frequecircncias de alteraccedilotildees morfoloacutegicas indicam que a
accedilatildeo toacutexica do Thiodanreg provocou uma distribuiccedilatildeo de lesotildees de incidecircncia leve a
moderada no tecido hepaacutetico nos diferentes experimentos sendo que nas maiores
concentraccedilotildees do toacutexico houve mais incidecircncias de alteraccedilotildees As alteraccedilotildees observadas
nos fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas isto eacute natildeo apresentaram necrose sendo que
a maioria das alteraccedilotildees satildeo de estaacutedios I e II com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico
As alteraccedilotildees histoloacutegicas tecircm sido relatadas em peixes expostos a ambientes poluiacutedos
(Braunbeck et al 1990 Takashima et al 1995 Schwaiger et al 1997) Da mesma
forma a frequecircncia das alteraccedilotildees pode indicar disfunccedilotildees induzidas por agentes
toacutexicos uma vez que aacutereas metabolicamente ativas do fiacutegado ficam reduzidas levando a
uma possiacutevel reduccedilatildeo geral nas funccedilotildees desempenhadas por este oacutergatildeo (Hinton amp
Laureacuten 1990 Oliveira Ribeiro et al 2002 Pacheco amp Santos 2002 Langiano amp
Martinez 2008) Este resultado sugere que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees
hepaacuteticas mesmo em concentraccedilotildees muito baixas nos diferentes experimentos
independentemente do peixe estar sendo alimentado ou natildeo
As alteraccedilotildees dos diacircmetros de nuacutecleos de hepatoacutecitos podem ser consideradas
resposta ao agente estressor sendo indicativo da ativaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica em
decorrecircncia do aumento da atividade metaboacutelica contra as condiccedilotildees adversas (Stephen
et al 1993 Takashima amp Hibyia 1995 Langiano amp Martinez 2008) Por outro lado a
diminuiccedilatildeo nuclear pode estar relacionada possivelmente com a multiplicaccedilatildeo de
hepatoacutecitos na reposiccedilatildeo de ceacutelulas lesadas em funccedilatildeo da multiplicaccedilatildeo celular (Gul et
al 2004) No trabalho realizado por Oliveira Ribeiro et al (2002) observaccedilotildees
qualitativas por microscopia de luz demonstraram diminuiccedilatildeo no diacircmetro dos nuacutecleos
de hepatoacutecitos na espeacutecie A bimaculatus com alimentaccedilatildeo controlada associada agrave
exposiccedilatildeo ao toacutexico tributiltin Este tipo de alteraccedilatildeo eacute um indicativo de processo
degenerativo celular uma vez que inicia com a condensaccedilatildeo e reduccedilatildeo do diacircmetro do
nuacutecleo (Oliveira Ribeiro et al 2002) No presente estudo as alteraccedilotildees nos diacircmetros
de nuacutecleo de hepatoacutecitos demostraram que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees
hepaacuteticas das fecircmeas
A hipertrofia dos hepatoacutecitos tambeacutem pode ser causada por contaminantes
(Arnold et al 1985) por mudanccedilas estruturais do hepatoacutecito relacionadas ao
funcionamento da ceacutelula (Hinton et al 1992) condiccedilotildees fisioloacutegicas ligadas agrave
reproduccedilatildeo (Wester et al 2003) e pela maior atividade metaboacutelica (Takashima amp
Hibyia 1995) Portanto o aumento do diacircmetro citoplasmaacutetico nos experimentos sem
49
adaptaccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e no experimento com adaptaccedilatildeosem alimentaccedilatildeo mesmo
natildeo apresentando caracteriacutestica de hipertrofia morfoloacutegica evidente mas morfomeacutetrica
sugere indiacutecios de maior metabolizaccedilatildeo pelos hepatoacutecitos nestes grupos experimentais
As alteraccedilotildees dos diacircmetros de citoplasmas dos hepatoacutecitos nos experimentos
demonstraram que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees hepaacuteticas
Na quantificaccedilatildeo de nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos nos diferentes
experimentos foram observados indiacutecios de proliferaccedilatildeo de hepatoacutecitos que pode ser
indicativo da accedilatildeo toacutexica dos hepatoacutecitos contra detoxificaccedilatildeo do Thiodanreg assim como
observado no trabalho por Gul et al (2004) O percentual do tecido hepaacutetico ocupado
por ceacutelulas do tipo hepatoacutecito variou entre 8742 a 9088 na constituiccedilatildeo do
parecircnquima hepaacutetico de A bimaculatus Poucos trabalhos citam a constituiccedilatildeo celular
em fiacutegados de peixes sendo 845 a 873 de hepatoacutecitos ocupando o parecircnquima
hepaacutetico na truta (Hampton et al 1989) e 899 no peixe Golden (Rocha et al 1997)
Estes valores demonstram que a maior parte das ceacutelulas dos fiacutegados nas fecircmeas de A
bimaculatus satildeo hepatoacutecitos como descrito em outras espeacutecies de peixes
O aumento da quantidade de macroacutefagos na concentraccedilatildeo 115microgL-1 dos
experimentos foi superior quando comparado aos demais grupos sugerindo que essa
mobilizaccedilatildeo pode estar ajudando na detoxicaccedilatildeo do fiacutegado (Herraez et al 1986)
Assim a presenccedila de maior quantidade de macroacutefagos e sinusoides podem ser
consideradas indicadoras de estresse em peixes decorrentes da presenccedila de agentes
quiacutemicos (Anderson amp Zeeman 1995 Rabitto et al 2005) Essas ceacutelulas satildeo
observadas frequentemente nas regiotildees proacuteximas aos sinusoides e desprovidas de
pigmentaccedilatildeo Foram observados macroacutefagos em trutas Oncorhynchus mykiss e Salmo
trutta fario na proporccedilatildeo de 02 e 07 respectivamente (Hampton et al 1985
Rocha et al 1997) enquanto no presente estudo variou entre 021 a 029 Meseguer
et al (1994) observaram macroacutefagos livres abundantes no parecircnquima do fiacutegado
sugerindo que estes se movem livremente dentro do parecircnquima formando os
agregados macrofaacutegicos quando haacute um aumento na atividade fagociacutetica como resposta
imune a lesotildees em indiviacuteduos expostos a contaminantes Entretanto no presente estudo
natildeo foram observadas estas caracteriacutesticas
Ainda vale ressaltar que esse toacutexico potencializa sua accedilatildeo em temperaturas mais
elevadas como aquelas observadas no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo
Estudando o efeito dos ciclodienos Correa et al (2001) Coutinho et al (2005) e
Capkin et al (2006) relataram que as alteraccedilotildees satildeo diretamente proporcionais agrave
50
temperatura da aacutegua ou seja quanto mais alta a temperatura mais toacutexicos os produtos
se tornam O experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
56microgL-1 registrou temperatura meacutedia da aacutegua em 269ordmC superior aos demais
experimentos Devido a isso uma resposta comum na intoxicaccedilatildeo em fiacutegados de peixes
eacute a diminuiccedilatildeo das reservas de glicogecircnio hepaacutetico (Seinen et al 1981 Ferguson 1989
Cyrino et al 2000) e iacutendice hepatossomaacutetico (Wester et al 1987 Wester et al 1988
Wester et al 2003 Glover et al 2007) evidenciada no presente estudo
No presente estudo percebeu-se que a accedilatildeo do Thiodanreg em concentraccedilotildees
subletais natildeo afetou o fiacutegado como um todo mas na forma de focos no parecircnquima
hepaacutetico nos diferentes experimentos Este tipo de lesatildeo pode estar associado agrave
concentraccedilatildeo do toacutexico utilizado tempo de exposiccedilatildeo e a via de contaminaccedilatildeo A
ventilaccedilatildeo branquial acelerada e a natildeo procura por alimentos nas primeiras 24 horas
observadas nos diferentes experimentos sugere que a entrada de aacutegua pela via branquial
foi a causa mais direta da absorccedilatildeo e difusatildeo do toacutexico para corrente sanguiacutenea ateacute
chegar ao fiacutegado No entanto a via epideacutermica tambeacutem poder ser considerada via de
entrada do toacutexico para os tecidos (Mckim et al 1999)
As alteraccedilotildees observadas nos fiacutegados podem afetar diretamente o metabolismo
das fecircmeas causando diminuiccedilatildeo da capacidade fisica e tornar os peixes uma presa faacutecil
para seus predadores Neste sentido os peixes poderatildeo ter menor sucesso reprodutivo e
se tornarem menos competitivos pelo alimento Do ponto de vista ecoloacutegico isso pode
acarretar alteraccedilotildees na populaccedilatildeo e na cadeia alimentar (Rodrigues amp Fanta 1998)
Nas condiccedilotildees que o estudo foi realizado como as concentraccedilotildees do inseticida
Thiodanreg que foram utilizadas o periacuteodo de exposiccedilatildeo e a espeacutecie de estudo conclui-se
que as fecircmeas podem estar em um processo inicial de intoxicaccedilatildeo um processo
patoloacutegico de recuperaccedilatildeo reversiacutevel
51
Figura 1 A Organizaccedilatildeo histoloacutegica do tecido hepaacutetico normal de A bimaculatus B Infiltrado leucocitaacuterio (IL) no tecido hepaacutetico de A bimaculatus C Hepatoacutecito com vesiacutecula clara (Vc) envolvida por glicogecircnio (G) marcado positivamente pela reaccedilatildeo de PAS e nuacutecleo (seta) deslocado na periferia da ceacutelula no experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo 56microgL-1 D Hepatoacutecito com ausecircncia de glicogecircnio evidenciada pela reaccedilatildeo negativa de PAS no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo 56microgL-1 Alteraccedilotildees de estaacutedio I - E Hepatoacutecito com nuacutecleo (seta) na perifieria F Atrofia nuclear (an) G Deformaccedilatildeo nuclear (dn) Nuacutecleo (N) e citoplasma (C) do hepatoacutecito sinusoacuteide (S) capilar (P) com hemaacutecias no interior acuacutemulo de glicogecircnio (G) no citoplasma e macroacutefagos (M) Barras A (30) B (65 microm) C e D (20 microm) E F e G (28 microm) Coloraccedilatildeo Azul de toluiacutedina em A-B e E-G e PAS em C e D
G S G
N
C
M
M
an
F E
Vc
IL G
B
C
A
D
G
dn
N
C
G
52
Dn
A
E
B
F
Figura 2 Alteraccedilotildees histoloacutegicas do tecido hepaacutetico de A bimaculatus Alteraccedilotildees de estaacutedio I-A Hipertrofia celular (seta) B Hipertrofia nuclear (seta) Alteraccedilotildees de estaacutedio II - C Degeneraccedilatildeo nuclear (Dn) D Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica (Dc) E Hiperemia () F Presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos (setas) Barras A B e E (30 microm) C D e F (25 microm) Coloraccedilatildeo Azul de toluiacutedina
C
A
Dc
D
53
Tabela 2 Valores meacutedios das temperaturas durante a realizaccedilatildeo dos experimentos
Tratamento Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Experimento 4 Controle 268plusmn105 254plusmn049 248plusmn069 250plusmn049
115mgL-1 271plusmn104 256plusmn059 247plusmn045 245plusmn040 23mgL-1 269plusmn117 255plusmn048 244plusmn062 247plusmn043 56mgL-1 269plusmn118 254plusmn048 244plusmn063 247plusmn038
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Legenda Experimento 1 - sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo Experimento 2 - sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo Experimento 3 - com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo Experimento 4 ndash com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
Tabela 3 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquantitativa das alteraccedilotildees
histoloacutegicas (VMA) em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 130 plusmn 020a 210 plusmn 030b 215 plusmn 019b 216 plusmn 011b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 130 plusmn 012a 190 plusmn 020b 190 plusmn 008aᵇ 228 plusmn 056b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 125 plusmn 012a 210 plusmn 021b 206 plusmn 017b 218 plusmn 027b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 130 plusmn 014a 200 plusmn 025b 221 plusmn 035b 228 plusmn 021b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 4 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquantitativa dos iacutendices das
alteraccedilotildees histoloacutegicas (IAH) em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 883plusmn1034a 1850plusmn1009aᵇ 2883plusmn832b 2566plusmn550aᵇ
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 433plusmn557a 2883plusmn 810b 2780plusmn1388b 2766plusmn571b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 566plusmn 585a 2600plusmn773b 2550plusmn1078b 2733plusmn920b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 750plusmn512a 2217plusmn780b 2033plusmn875b 2366plusmn880b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Duncan
54
Tabela 5 Diacircmetro meacutedio (microm) de nuacutecleos de hepatoacutecitos em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 461 plusmn 040aᶜ 498 plusmn 020b 487 plusmn 028b 439 plusmn 027c
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 516 plusmn 071a 501plusmn 040a 502 plusmn 020a 515plusmn025a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 494 plusmn 019a 496 plusmn 036a 492 plusmn 082a 508 plusmn 033a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 561 plusmn 044aᶜ 524 plusmn 040b ᶜ 509 plusmn 028b 533 plusmn 019c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 6 Diacircmetro meacutedio (microm) de citoplasmas de hepatoacutecitos de fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 885 plusmn 099a 1022 plusmn 109b 974 plusmn 080b 1005plusmn129b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1084 plusmn 136a 987 plusmn 153b 975 plusmn 081b 931 plusmn 080b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 960 plusmn 095a 1022 plusmn 094b 1003plusmn120aᵇ 1033 plusmn 108b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1086plusmn130aᵇ 104 plusmn 135b ᶜ 1022 plusmn 138c 1022 plusmn 106c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 7 Quantificaccedilatildeo meacutedia de nuacutecleos de hepatoacutecitos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 2553 plusmn 494a 298 plusmn 464b 284 plusmn 459b 291 plusmn 374b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 2371 plusmn 490a 289 plusmn 541b 289 plusmn 545b 290 plusmn 514b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 2560 plusmn 538a 294 plusmn 480b 286 plusmn 555b 293 plusmn 552b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 2770 plusmn 594a 314 plusmn 1028b 347 plusmn 664b ᶜ 322 plusmn 654c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
55
Tabela 8 Quantificaccedilatildeo meacutedia de citoplasmas no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 39551 plusmn 1056a 39666 plusmn 877a 39360 plusmn 1526a 40080 plusmn 727a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 39996 plusmn 1307a 39830 plusmn 722a 39618 plusmn 1143ab 38865 plusmn 1954b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 39603 plusmn 1755a 39011 plusmn 1620b 39445 plusmn 1388aᵇ 39205 plusmn 2212aᵇ
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 39381 plusmn 3025a 38555 plusmn 2723b 39036 plusmn 2275aᵇ 39136 plusmn 1892b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Tabela 9 Quantificaccedilatildeo meacutedia de macroacutefagos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2
de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 120 plusmn 113a 125 plusmn 089a 101 plusmn 100a 106 plusmn 094a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 101 plusmn 101a 124 plusmn 079a 102 plusmn 084a 131 plusmn 092a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 098 plusmn 089a 128 plusmn 097a 115 plusmn 095a 096 plusmn 090a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 101 plusmn 094a 128 plusmn 109a 086 plusmn 079a 101 plusmn 079a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Tabela 10 Quantificaccedilatildeo meacutedia de vasos sanguiacuteneos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 1875 plusmn 239a 133 plusmn 346a 1796 plusmn 1210a 1103 plusmn 465a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1603 plusmn 784aᵇ 1260 plusmn 532a 1409 plusmn 631aᵇ 2203 plusmn 685b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 1830 plusmn 579a 2036 plusmn 773a 1681 plusmn 560a 1865 plusmn 964a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1850 plusmn 1400a 1831 plusmn 1326a 1510 plusmn 774a 1645 plusmn 739a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
56
Tabela 11 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquatitativa de glicogecircnio nos hepatoacutecitos de fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 133 plusmn 051aᵇ 266 plusmn 081a 300 plusmn 000a 010plusmn 010b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 133 plusmn 051a 180 plusmn 109a 200 plusmn 109a 233 plusmn 103a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 216 plusmn 098a 116 plusmn 040a 216 plusmn 098a 233 plusmn 103a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 266 plusmn 081a 233 plusmn 103a 233 plusmn 103a 216 plusmn 098a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis Tabela 12 Iacutendice hepatossomaacutetico de fecircmeas de lambaris A bimaculatus nos grupos
controles e grupos expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 070 plusmn 014aᵇ 088 plusmn 03a 084 plusmn 038a 038 plusmn 031b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 113 plusmn 054a 104 plusmn 061a 102 plusmn 050a 102 plusmn 051a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 066 plusmn 029a 073 plusmn 020a 092 plusmn 017a 091 plusmn 012a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 074 plusmn 034a 072 plusmn 029a 094 plusmn 040a 063 plusmn 018a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Duncan
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52 CAPIacuteTULO 2
EFEITOS DO INSETICIDA THIODAN reg SOBRE A MORFOLOGIA DO
DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM LAMBARIS Astyanax bimaculatus
RESUMO
O Thiodanreg eacute um toacutexico que pode causar alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos tecidos de peixes
expostos dependendo da concentraccedilatildeo A fim de investigar possiacuteveis alteraccedilotildees este
estudo avaliou a morfologia ovariana de lambaris Astyanax bimaculatus expostos ao
Thiodanreg (endosulfan 350gL) por 96 horas em quatro diferentes experimentos com trecircs
concentraccedilotildees subletais 115 23 e 56 microgL As fecircmeas expostas ao Thiodanreg foram
divididas em quatro experimentos sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem
aclimataccedilatildeo e alimentados com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e com
aclimataccedilatildeo de 10 dias e alimentados No presente estudo percebeu-se que a accedilatildeo do
Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou a morfologia do desenvolvimento
folicular Poreacutem os experimentos com aclimataccedilatildeo demonstraram quantidades
inferiores de foliacuteculos primaacuterios e secundaacuterios quando comparados aos peixes dos
experimentos sem aclimataccedilatildeo Houve maior quantidade de foliacuteculos atreacutesicos nos
grupos expostos ao Thiodanreg em relaccedilatildeo ao grupo controle O diacircmetro folicular nos
foliacuteculos secundaacuterios dos peixes expostos ao Thiodanreg no experimento com
adaptaccedilatildeocom alimentaccedilatildeo foi maior em relaccedilatildeo ao grupo controle Aleacutem disso as
meacutedias dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS) e hepatossomaacutetico (IHS) dos experimentos
com aclimataccedilatildeo foram inferiores aos experimentos sem aclimataccedilatildeo Esses dados
sugerem que o eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-ovaacuterio pode estar sendo afetado pelo ambiente
ao qual o peixe foi submetido podendo causar comprometimento na fisiologia do
desenvolvimento folicular
Palavras-chave histopatologia ovaacuterio peixe contaminaccedilatildeo aquaacutetica
63
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 α-endosulfan e 30 β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo
por meio da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em riscos os organismos que ali
residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al 2007)
Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos como jaacute
observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis niloticus
No entanto a Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan em
gordura valores de 005mgkg-1 (EPA 2002) e para aacutegua doce 022microgL-1 (EPA 1980)
A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em consideraccedilatildeo a
qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente Resoluccedilatildeo
CONAMA - nordm 3572005 estabelece o valor limite de 0056gL de resiacuteduo do referido
inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
Muitos inseticidas apresentam baixa toxicidade antes de serem transformados
em substacircncias toacutexicas metabolicamente ativas O sulfato de endosulfan eacute um dos
produtos derivados do metabolismo do endosulfan sendo considerado o principal
metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica por ser mais estaacutevel no meio
ambiente do que em sua foacutermula original (Ali et al 1984) A sensibilidade ao
endosulfan em organismos aquaacuteticos tem sido descrita na literatura (Capkin et al 2006
Ballesteros et al 2007 Pereira et al 2012) O produto eacute extremamente toacutexico para os
peixes e outros organismos aquaacuteticos mesmo em concentraccedilotildees muito pequenas
(Cengiz et al 2001) como verificado tambeacutem por Ballesteros et al (2007) com peixes
adultos da espeacutecie Jenynsia multidentata sob o efeito do endosulfan por 96 horas
utilizando concentraccedilotildees de 072 μgL e 131 μgL em machos e fecircmeas
respectivamente
Em peixes o desenvolvimento folicular tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Begovac amp Wallace 1988 Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter
1996 Grier 2000 2002 e 2007) e como nos animais em geral compreende os periacuteodos
preacute-meioacutetico perinucleolar vitelogecircnico e maturaccedilatildeo final Estas fases ocorrem no
64
interior de foliacuteculos cuja parede eacute constituiacuteda por zona radiata camada folicular
membrana basal e teca (Grier 2000) e que desempenham importante papel durante a
ovogecircnese e fertilizaccedilatildeo Quando a qualidade da aacutegua eacute alterada devido a xenobioacuteticos
a gametogecircnese pode ser alterada comprometendo a fertilizaccedilatildeo e a qualidade do ovo
(Chatterjee et al 1997) Assim os peixes quando expostos a inseticidas podem
apresentar alteraccedilotildees morfoloacutegicas significativas no ovaacuterio
Alguns trabalhos mostram diversas alteraccedilotildees provocadas nos foliacuteculos por
contaminantes como por exemplo retraccedilatildeo citoplasmaacutetica degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica
adesatildeo folicular aparecimento de foliacuteculos anucleados necrose e alteraccedilatildeo no diacircmetro
dos foliacuteculos (Hazarika amp Das 1998 Dutta et al 2003 Maxwell amp Dutta 2005) Aleacutem
disso pode ocorrer a atresia folicular que eacute um processo frequentemente observado nos
ovaacuterios dos vertebrados (Saidapur 1978) sendo causada por diversos fatores como
agrotoacutexicos temperatura luz alimentaccedilatildeo inadequada e confinamento (Nagahama
1983 Guraya 1986) Outro fator importante eacute a concentraccedilatildeo hormonal que pode
interferir na siacutentese de vitelogenina e causar efeitos negativos associados com a
quantidade de foliacuteculos preacute-vitelogecircnicos e vitelogecircnicos durante o desenvolvimento
folicular (Chatterjee et al 1997) No entanto alteraccedilotildees no estado de sauacutede provocadas
por concentraccedilotildees de contaminamtes que natildeo matam os peixes em curto prazo e que
podem ser consideradas seguras podem sugerir consequecircncias na reproduccedilatildeo e
interferecircncia na cadeia alimentar Esse tipo de estudo eacute de grande importacircncia para se
avaliar impactos provocados por diferentes tratamentos sobre o desenvolvimento de
foliacuteculos que poderiam interferir na reproduccedilatildeo de peixes
O lambari Astyanax bimaculatus foi escolhido como organismo experimental
pois eacute representativo no ecossistema sendo encontrado desde Nordeste brasileiro ateacute a
bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Eacute um peixe de pequeno porte e
de faacutecil manutenccedilatildeo em laboratoacuterio
Este estudo teve como objetivo analisar as alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos
diferentes estaacutedios do desenvolvimento folicular em ensaios subletais com o toacutexico
Thiodanreg
65
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste subletal e as atividades de coleta As etapas
de fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos ovaacuterios microtomia coloraccedilatildeo de lacircminas
histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e morfomeacutetricas foram realizadas nos
Laboratoacuterios de Biologia de Peixes e de Histopatologia do Departamento de Veterinaacuteria
da UFV
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos animais em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado e poro genital
dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV e
mantidos em aquaacuterios com capacidade de 50 litros numa densidade de 05g de peixe por
litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro temperatura controlada e monitoramento
duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e
aeraccedilatildeo continua de aacutegua para garantir o bem-estar dos peixes Os peixes foram
alimentados com raccedilatildeo comercial Purina contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia
de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
66
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste de toxicidade subletal em sistema estaacutetico
O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi realizado utilizando-se 120
lambaris tendo por base as normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico (NBR 15088
- ABNT 2007)
As fecircmeas foram expostas ao Thiodanreg (endosulfan 350gL) por 96 horas em
quatro diferentes experimentos sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem aclimataccedilatildeo e
com alimentaccedilatildeo com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e com aclimataccedilatildeo de
10 dias e com alimentaccedilatildeo Foram utilizadas trecircs concentraccedilotildees do Thiodanreg inferiores
agrave CL50 preacute-determinada (137microgL) em laboratoacuterio de acordo com a NBR 15088
(ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas em cada experimento foram de 115 23 e
56microgL-1 aleacutem de um grupo controle sem toacutexico com trecircs repeticcedilotildees nas mesmas
condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
24 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas
Apoacutes 96 horas de experimento foram coletados 96 peixes sendo seis animais de
cada grupo nos diferentes experimentos Os ovaacuterios foram coletados apoacutes os peixes
terem sido anestesiados com benzocaiacutena (110000) e eutanasiados pela secccedilatildeo
transversal da coluna vertebral na regiatildeo do opeacuterculo
Para a histologia os ovaacuterios foram fixados em paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo
fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedos em resina glicolmetacrilato (Leica
Historesin) Em seguida secccedilotildees 3microm de espessura foram coradas utilizando
hematoxilinaeosina para anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas As lacircminas foram
montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e
as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
Para os estudos morfoloacutegicos foram analisadas lacircminas de seis animais por
concentraccedilatildeo As secccedilotildees histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo em busca
de alteraccedilotildees morfoloacutegicas foliculares (Tabela 1) que pudessem ser representativas da
67
accedilatildeo do Thiodanreg no tecido ovariano sempre comparando estas alteraccedilotildees com o
padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios das lacircminas dos grupos controles
Para a avaliaccedilatildeo morfomeacutetrica foram realizadas contagens dos diferentes
estaacutedios de desenvolvimento folicular Para isto foram fotografados ao acaso 10
campos com objetiva de 10X (cada campo com 5094 microm de largura por 6812 microm de
comprimento totalizando uma aacuterea de 347 mmsup2) As contagens foram realizadas em 10
campos escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro experimentos Aleacutem disso foi
realizada a contagem de foliacuteculos atreacutesicos e observados eosinoacutefilos associados aos
foliacuteculos vitelogecircnicos utilizando o microscoacutepio com objetiva de 40X em 10 foliacuteculos
escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro tratamentos experimentais Tambeacutem
foram realizadas mediccedilotildees de diacircmetros em 10 foliacuteculos vitelogecircnicos para cada animal
Foram escolhidos foliacuteculos o mais esfeacutericos possiacutevel com corte passando pelo nuacutecleo
Estas medidas foram obtidas por meio do programa Image-Pro Plus traccedilando-se duas
linhas perpendiculares sobre nuacutecleo e respeitando-se os limites do foliacuteculo Em todas as
contagens e mediccedilotildees foram calculados os valores meacutedios e desvios-padratildeo para cada
concentraccedilatildeo para se avaliar o desenvolvimento folicular nos diferentes experimentos
Tabela 1 Alteraccedilotildees histoloacutegicas quanto ao comprometimento do desenvolvimento folicular (adaptado de Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS FOLICULARES Alteraccedilatildeo nos foliacuteculos Descolamento do revestimento folicular Retraccedilatildeo citoplasmaacutetica Retraccedilatildeo nuclear Atresia folicular Aglutinaccedilatildeo nucleoplasmaacutetica Aglutinaccedilatildeo citoplasmaacutetica Aglutinaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo Foliacuteculos com ausecircncia de citoplasma e nuacutecleo Granuloacutecitos envolvendo foliculos
25 Paracircmetros biomeacutetricos
Foram registrados para cada exemplar os seguintes dados biomeacutetricos peso
corporal (PC em g) peso dos ovaacuterios (PO em g) e peso do fiacutegado (PF em g) Os
valores meacutedios e os desvios padratildeo dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS=POx100PC) e
68
hepatossomaacutetico (IHS=PFx100PC) foram calculados para cada animal em cada um
dos grupos nos diferentes experimentos
26 Anaacutelises estatiacutesticas
Os dados foram apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo e avaliados pelo
Software Statistica 70 por meio da anaacutelise de variacircncia (ANOVA) Apoacutes o teste de
distribuiccedilatildeo normal os dados foram comparados entres os grupos controle e grupos
expostos ao Thiodanreg usando anaacutelise de variacircncia one-way seguida do teste de Tukey
ou Duncan Quando os dados natildeo apresentaram uma distribuiccedilatildeo normal foi utilizado o
teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis Plt005 foi utilizado como criteacuterio de
significacircncia
3 RESULTADOS
31 Desenvolvimento folicular
O desenvolvimento folicular de A bimaculatus do presente estudo foi dividido em
duas etapas desenvolvimento primaacuterio e desenvolvimento secundaacuterio
Para facilitar a compreensatildeo o desenvolvimento primaacuterio em A bimaculatus foi
subdividido em dois estaacutedios desenvolvimento primaacuterio inicial e desenvolvimento
primaacuterio avanccedilado (Figuras 1 A e B) No desenvolvimento primaacuterio inicial os foliacuteculos
apresentaram citoplasma fortemente basoacutefilo nuacutecleo esfeacuterico um ou mais nucleacuteolos
dispersos pelo nucleoplasma e estavam envoltos por ceacutelulas foliculares pavimentosas
(Figura 1 A) Durante o desenvolvimento primaacuterio avanccedilado o citoplasma do foliacuteculo
torna-se menos basoacutefilo que a etapa anterior o nuacutecleo eacute esfeacuterico um ou mais nucleacuteolos
dispersos que estatildeo associados ao envoltoacuterio nuclear (Figura 1 B) A camada de ceacutelulas
foliculares eacute pavimentosa com o nuacutecleo alongado Entre as ceacutelulas foliculares e o
citoplasma do foliacuteculo aparece a zona radiata como uma fina camada (Figura 1 B) Na
regiatildeo mais externa do foliacuteculo aparecem associadas ao mesmo as ceacutelulas da teca
O desenvolvimento secundaacuterio em A bimaculatus foi subdividido em trecircs
estaacutedios desenvolvimento secundaacuterio inicial desenvolvimento intermediaacuterio e
desenvolvimento avanccedilado No desenvolvimento secundaacuterio inicial o volume
citoplasmaacutetico aumentou mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo e o foliacuteculo neste estaacutedio
apresentou um diacircmetro maior que o estaacutedio anterior O nuacutecleo eacute central ligeiramente
acidoacutefilo com nucleacuteolos pequenos e dispersos pelo nucleoplasma O citoplasma eacute
69
granular e fracamente basoacutefilo com a presenccedila de vesiacuteculas corticais pequenas e claras
na periferia do citoplasma (Figura 1 C) Em seguida ocorre um aumento no diacircmetro do
foliacuteculo e inicia-se a deposiccedilatildeo de vitelo a partir da regiatildeo perifeacuterica o que permitiu
classificar esse estaacutedio como desenvolvimento secundaacuterio intermediaacuterio (Figura 1 D)
No estaacutedio de desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado o volume citoplasmaacutetico
aumentou mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo tendo o foliacuteculo neste estaacutedio um diacircmetro maior
quando comparado aos estaacutedios anteriores Nessa etapa do desenvolvimento o
citoplasma do foliacuteculo estaacute preenchido com gloacutebulos de vitelo (Figura 1 D) A
maturaccedilatildeo final eacute caracterizada pela formaccedilatildeo do aparelho micropilar zona radiata
espessa e nuacutecleo deslocado em direccedilatildeo ao aparelho micropilar
Os foliacuteculos ovarianos dos lambaris apresentaram morfologia normal nas
diferentes concentraccedilotildees de Thiodanreg (Figuras 1 A-D)
32 Atresia folicular
A atresia folicular foi caracterizada em trecircs diferentes etapas nos ovaacuterios de A
bimaculatus atresia inicial intermediaacuteria e avanccedilada A atresia folicular inicial eacute
caracterizada pela descontinuidade da zona radiata e hipertrofia das ceacutelulas foliculares
(Figura 2 A) Nesse momento da atresia folicular foram evidenciadas ceacutelulas do tipo
granuloacutecito entre a membrana basal e ceacutelulas da teca na maioria dos foliacuteculos
observados (Figura 2 B) Na sequecircncia do processo atresia folicular intermediaacuteria
ocorre o iniacutecio da fusatildeo e liquefaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo desintegraccedilatildeo e
fragmentaccedilatildeo da zona radiata hipertrofia das ceacutelulas foliculares que se tornam
vacuolizadas e contecircm material granular de aspecto similar aos gloacutebulos de vitelo e
invasatildeo do citoplasma pelas ceacutelulas foliculares (Figura 2 C) Na atresia avanccedilada as
ceacutelulas foliculares absorvem os resiacuteduos finais do foliacuteculo levando a uma diminuiccedilatildeo
do tamanho do foliacuteculo atreacutesico (Figura 2 D)
33 Quantificaccedilatildeo dos foliacuteculos ovarianos
A quantidade de foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio inicial entre as fecircmeas
do mesmo experimento natildeo mostrou diferenccedilas entre si (Pgt005) (Figura 3) Quando
foram comparados os diferentes experimentos nos mesmos grupos foi registrada maior
quantidade de foliacuteculos primaacuterios iniciais nas fecircmeas do grupo controle do experimento
com aclimataccedilatildeoalimentaccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo agraves fecircmeas dos grupos controle dos
70
experimentos sem aclimataccedilatildeo (Figura 3) Aleacutem disso foi observada maior quantidade
de foliacuteculos primaacuterios iniciais na concentraccedilatildeo de 23microgL do experimento com
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo em relaccedilatildeo ao experimento sem aclimataccedilatildeocom
alimentaccedilatildeo (Plt005) (Figura 3)
Na contagem de foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado entre fecircmeas
do mesmo experimento natildeo houve diferenccedilas nas meacutedias obtidas (Figura 4) No entanto
quando comparados os mesmos grupos entre os diferentes experimentos verificou-se
que no estaacutedio de desenvolvimento primaacuterio avanccedilado houve maior quantidade de
foliacuteculos no grupo controle do experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Plt005)
em relaccedilatildeo ao experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo assim como no
experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Figura 4) Quando comparados os
grupos da concentraccedilatildeo 115microgL registrou-se maior quantidade de foliacuteculos no
experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo ao experimento
sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Figura 4) Entre as fecircmeas dos grupos da
concentraccedilatildeo 23microgL foi registrada maior quantidade de foliacuteculos nos experimentos
com aclimataccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo agraves fecircmeas dos experimentos sem aclimataccedilatildeo
(Figura 4)
Na contagem de foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio inicial nas fecircmeas do
experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo houve maior quantidade de foliacuteculos na
concentraccedilatildeo 56microgL (Plt005) em relaccedilatildeo agrave concentraccedilatildeo de 115microgL (Figura 5) mas
natildeo com o controle Ao comparar as fecircmeas dos diferentes experimentos dos mesmos
grupos houve maior quantidade de foliacuteculos secundaacuterios iniciais (Plt005) na
concentraccedilatildeo 115microgL do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e
experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo em relaccedilatildeo ao experimento sem
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Figura
5)
Em relaccedilatildeo as contagens de foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio
intermediaacuterio e avanccedilado natildeo houve diferenccedilas entre as fecircmeas (Pgt005) (Figuras 6 e 7)
34 Quantificaccedilatildeo dos foliacuteculos atreacutesicos
Nas contagens de foliacuteculos atreacutesicos iniciais nas fecircmeas de A bimaculatus dos
diferentes experimentos natildeo foram constatadas diferenccedilas (Pgt005) (Figura 8) As
contagens de atresia total representaram as somas das contagens de atresias inicial
intermediaacuteria e avanccedilada As contagens de atresia total natildeo mostraram diferenccedilas nos
71
experimentos embora o nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos mostrasse tendecircncia crescente
nos grupos tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos (Figura 9) Entretanto
foi observado maior nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos nas fecircmeas dos experimentos com
aclimataccedilatildeo de 10 dias em relaccedilatildeo aos experimentos sem aclimataccedilatildeo (Figura 9)
35 Diacircmetro dos foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado
Os valores meacutedios nos diacircmetros dos foliacuteculos secundaacuterio avanccedilado nas fecircmeas
do experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo demonstraram aumento (Plt005) nas
concentraccedilotildees 115microgL (57837plusmn5977microm) e 56microgL (57311plusmn6178microm) de Thiodanreg
em relaccedilatildeo agraves fecircmeas do grupo controle (51606plusmn5757 microm) Nos demais experimentos
natildeo foram registradas diferenccedilas entre os foliacuteculos (Pgt005) apesar de ter sido
observado na maioria dos grupos essa mesma tendecircncia de aumento do diacircmetro dos
foliacuteculos (Tabela 2)
36 Paracircmetros biomeacutetricos
As fecircmeas de A bimaculatus dos grupos expostos ao Thiodanreg natildeo apresentaram
diferenccedilas (Pgt005) nos valores dos IGS e IHS quando comparados com os grupos
controles (Tabelas 3 e 4) No entanto as fecircmeas dos experimentos com aclimataccedilatildeo
apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores dos IGS e IHS quando comparados aos
experimentos sem aclimataccedilatildeo (Tabelas 3 e 4)
4 DISCUSSAtildeO
Em peixes teleoacutesteos o tipo de desenvolvimento folicular pode ser assincrocircnico
com a presenccedila de foliacuteculos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento (Nagahama
1983 Connaughton et al 1998 Selman et al 1986) assim como na presente espeacutecie
deste estudo Os ovaacuterios das fecircmeas de A bimaculatus submetidas ao efeito do
Thiodanreg apresentaram foliacuteculos ovarianos em diferentes fases de desenvolvimento com
variaccedilotildees na estrutura do foliacuteculo como diacircmetro caracteriacutesticas do nuacutecleo camadas
envoltoacuterias composiccedilatildeo e distribuiccedilatildeo do vitelo conforme observado em outras
espeacutecies do gecircnero (Miranda 1996 Miranda et al 1999 Melo et al 2005 Mazzoni et
al 2005 Rodrigues et al 2005 Hernan Da Cuntildea et al 2011)
Ao contraacuterio do presente estudo Dutta et al (2008) ao submeterem as fecircmeas da
espeacutecie Lepomis macrochirus a trecircs concentraccedilotildees diferentes (025 075 e 1 microgL) de
endosulfan observaram comprometimento do desenvolvimento folicular com retraccedilatildeo
72
nuclear e citoplasmaacutetica na menor concentraccedilatildeo enquanto nos foliacuteculos em maturaccedilatildeo
avanccedilada foi observado um aspecto vazio sem conteuacutedo citoplasmaacutetico na
concentraccedilatildeo de 075 microgL Aleacutem disso na concentraccedilatildeo de 1microgL os autores
encontraram maior grau de deformaccedilotildees com foliacuteculos vazios sem a presenccedila de
foliacuteculos ou alteraccedilotildees do nuacutecleo e perda do material nuclear que eacute relatado como
necrose nuclear No trabalho conduzido por Chartterjee et al (1997) foi avaliada a accedilatildeo
do carbofuram no desenvolvimento folicular na espeacutecie Heteropneustes fossilis
encontrando-se degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica e na camada folicular de foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio Entretanto Hernan Da Cuntildea et al (2011) natildeo
observaram alteraccedilotildees nos ovaacuterios em peixes expostos ao endosulfan No estudo
realizado por Ballesteros et al (2007) utilizando peixes machos e fecircmeas da espeacutecie
Jenynsia multidentata foi verificado que o maior teor de lipiacutedeos nas fecircmeas eacute um fator
importante para esclarecer a maior resistecircncia contra o endosulfan ao contraacuterio dos
machos que satildeo mais suceptiacuteveis neste caso De acordo com este resultado descrito na
literatura pode-se inferir que este fator poder ter interferido na maior resistecircncia das
fecircmeas de A bimaculatus em periacuteodo reprodutivo agraves concentraccedilotildees de Thiodanreg
testadas
Alguns estudos tecircm esclarecido a interferecircncia de poluentes na quantidade de
foliacuteculos nos diferentes estaacutedios do desenvolvimento folicular em peixes Os trabalhos
de Chartterjee et al (1997) Jensen et al (2004) Dutta amp Dalal (2008) e Chakrabarty et
al (2012) avaliaram os efeitos de pesticidas encontrando maior quantidade de foliacuteculos
primaacuterios no grupo tratado em relaccedilatildeo ao grupo controle assim como em peixes
mantidos em cativeiros (Honji et al 2009) Em outro estudo (Chatterjee et al 2001) os
pesquisadores encontraram por meio de anaacutelises histoloacutegicas da hipoacutefise a
possibilidade do carbofuran afetar as ceacutelulas produtoras de GnRH do hipotaacutelamo
prejudicando o eixo hipoacutefise-gocircnada e comprometendo a viabilidade no
desenvolvimento folicular jaacute Chakrabarty et al (2012) verificaram em peixes tratados
com endosulfan concentraccedilatildeo inferior de GnRH e superior da aromatase quando
comparados com o gurupo controle caracterizando que o endosulfan pode atuar como
disruptor endoacutecrino (Lemaire et al 2006) que pode aumentar a biossiacutentese do estradiol
para promover um raacutepido desenvolvimento folicular (Chakrabarty et al 2012) Estes
resultados podem ajudar a esclarecer os resultados do presente trabalho onde se
observou maior quantidade de foliacuteculos primaacuterios iniciais e primaacuterios avanccedilados nos
experimentos com aclimataccedilatildeo quando comparados com os experimentos sem
73
aclimataccedilatildeo sugerindo uma possiacutevel desregulaccedilatildeo endoacutecrina no eixo hipoacutefise-gocircnada
nos peixes aclimatados em aquaacuterios por 10 dias Aleacutem disso as concetraccedilotildees hormonais
e enzimaacuteticas relacionadas ao desenvolvimento folicular podem estar supostamente
alteradas em A bimaculatus mas satildeo necessaacuterios estudos fisioloacutegicos para essa
provaacutevel confirmaccedilatildeo
O processo de atresia folicular no lambari A bimaculatus foi semelhante ao
descrito por Miranda et al (1999) Munoz et al (2002) Melo et al (2005) e Santos et
al (2005) O processo da atresia que ocorre nos foliacuteculos secundaacuterios eacute do tipo
hipertroacutefico devido agrave hipertrofia e hiperplasia das ceacutelulas foliculares (Vizziano amp
Berois 1990) No trabalho realizado por Coward amp Bromage (1998) na espeacutecie Tilapia
zilli foi verificado aumento de foliacuteculos atreacutesicos em experimento com duraccedilatildeo entre 18
e 26 dias assim como verificado no trabalho de Jensen et al (2004) quando utilizaram a
substacircncia flutamida De acordo com estes autores isto pode reduzir a fecundidade e
tambeacutem influenciar na qualidade do foliacuteculo Linares-Casenave et al (2002) explicam
que o processo de atresia estaacute associado com desregulaccedilatildeo das concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de estradiol testosterona e vitelogenina Portanto o aumento da quantidade
dos foliacuteculos atreacutesicos nos grupos expostos ao Thiodanreg e a maior quantidade de atresia
nos experimentos com aclimataccedilatildeo mesmo natildeo apresentando diferenccedilas estatiacutesticas
sugerem que pode estar iniciando desregulaccedilatildeo hormonal nestes peixes
A presenccedila de granuloacutecitos associados aos foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados em
lambari A bimaculatus nos diferentes experimentos pode ser associada agrave reaccedilatildeo
imunoloacutegica em conjunto com as ceacutelulas foliculares assim como observado por alguns
autores (Drummond et al 2000 Santos et al 2005 Santos et al 2008) Aleacutem disso no
trabalho realizado por Santos et al (2008) foi detectada a presenccedila de proliferaccedilatildeo
celular (PCNA) nas ceacutelulas da teca de foliacuteculos em processo de atresia confirmando
que estas ceacutelulas podem estar se preparando para o processo de remodelaccedilatildeo ovariana
No entanto essas evidecircncias de granuloacutecitos associados aos foliacuteculos estatildeo de acordo
com o que jaacute foi observado em outros trabalhos caracterizando um processo fisioloacutegico
importante na regressatildeo folicular das fecircmeas de A bimaculatus expostas ao Thiodanreg
O diacircmetro dos foliacuteculos vitelogecircnicos eacute espeacutecie-especiacutefico poreacutem o Thiodanreg
alterou o diacircmetro folicular no experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo Esta
alteraccedilatildeo do diacircmetro que leva os foliacuteculos vitelogecircnicos a atingirem a maturaccedilatildeo pode
ser causada pelas diferenccedilas nas concentraccedilotildees de vitelogenina estradiol e aromatase
(Jensen et al 2004 Corriero et al 2007 Chakrabarty et al 2012) ou a mesma sendo
74
ligada aos receptores especiacuteficos nos foliacuteculos (Patintildeo amp Sullivan 2002 Bugel et al
2010) Bugel et al (2010) relataram a diminuiccedilatildeo da expressatildeo da vitelogenina no peixe
Fundulus heteroclitus em rio contaminado com pesticidas orgacircnicos persistentes o que
resultou na diminuiccedilatildeo da quantidade de foliacuteculos vitelogecircnicos enquanto Honji et al
(2009) relataram a baixa fecundidade e aumento do diacircmetro dos foliacuteculos nos peixes
Salminus hilari mantidos em cativeiro quando comparados com peixes de ambientes
naturais Contudo eacute necessaacuterio estudar as vias que conduzem a esta alteraccedilatildeo Estes
resultados mostram que diferentes vias podem afetar a reproduccedilatildeo dos peixes e que o
Thiodanreg pode estar agindo como desregulador endoacutecrino nos foliacuteculos secundaacuterios
avanccedilados de A bimaculatus
O IGS e IHS podem variar entre os peixes devido agraves diferenccedilas na sensibilidade
frente agrave exposiccedilatildeo a contaminantes periacuteodo reprodutivo e peixes mantidos em cativeiro
(Chatterjee et al 1997 Cyrino et al 2000 Jensen et al 2004 Honji et al 2009) No
entanto o fato das meacutedias dos IGS e IHS nos experimentos com aclimataccedilatildeo terem sido
menores quando comparadas com os experimentos sem aclimataccedilatildeo sugere associaccedilatildeo
entre quantidade inferior de foliacuteculos secundaacuterios e quantidade superior de atresia nos
experimentos com aclimataccedilatildeo assim como no trabalho de Chatterjee et al (1997) e
Bugel et al (2010) que verificaram diminuiccedilatildeo na taxa de foliacuteculos vitelogecircnicos e
IGS
A ventilaccedilatildeo branquial acelerada e a natildeo procura por alimentos nas primeiras 24
horas observadas nos diferentes experimentos sugere que a entrada de aacutegua pela via
branquial foi causa direta da absorccedilatildeo e difusatildeo do toacutexico no organismo No entanto a
via epideacutermica tambeacutem poder ser considerada via de entrada do toacutexico para os tecidos
(Mckim et al 1999) Portanto a exposiccedilatildeo dos peixes ao Thiodanreg e a aclimataccedilatildeo
foram fatores mais que afetaram o diacircmetro e a quantidade de foliacuteculos em A
bimaculatus Conforme as condiccedilotildees em que o estudo foi realizado levando-se em
consideraccedilatildeo as concentraccedilotildees do inseticida Thiodanreg utilizadas periacuteodo de exposiccedilatildeo e
espeacutecie de estudo demonstram que as fecircmeas analisadas podem estar em processo
inicial de intoxicaccedilatildeo com possiacutevel alteraccedilatildeo fisioloacutegica
75
A
opa
opi opa
vs
D
osint
osa
osa
gv gv
gv
osi
C
B
opa
opa
zr
vc
Figura 1 Desenvolvimento folicular ovariano de Astyanax bimaculatus A Estroma ovariano com foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio inicial (opi) e primaacuterio avanccedilado (opa) B Foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (opa) com ceacutelulas foliculares pavimentosas e zona radiata delgada (zr) C Foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio inicial (osi) possuindo ceacutelulas foliculares pavimentosas com zona radiata espessa (zr) e vesiacuteculas corticais claras (vc) na periferia do foliacuteculo D Foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio intermediaacuterio iniciando deposiccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo (osint) e foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (osa) com gloacutebulos de vitelo (gv) por todo o citoplasma vs vaso sanguiacuteneo Coloraccedilatildeo Hematoxilina-eosina Barra A e B (50 m) C (30 m) D (100 m)
zr
76
ai
gr gr
zr
h
av
A
ait
Figura 2 Foliacuteculos ovarianos de Astyanax bimaculatus em atresia A Atresia folicular inicial (ai) caracterizada pela quebra da zona radiata (zr) hipertrofia de ceacutelulas foliculares (cf) e presenccedila de granuloacutecitos (gr) B Detalhe de granuloacutecito (gr) sobre a regiatildeo de ceacutelulas foliculares C Atresia folicular intermediaacuteria (ait) caracterizada pela liquefaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo (gv) desintegraccedilatildeo da zona radiata e invasatildeo do citoplasma pelas ceacutelulas foliculares D Atresia folicular avanccedilada (av) caracterizada pela ausecircncia de gloacutebulos de vitelo Ceacutelulas da teca (t) hemaacutecias (h) Coloraccedilatildeo Hematoxilina-eosina Barra A (25 m) B (10 m) C (150 m) D (100 m)
gv
ai
B
C D
t
gv
77
Figura 3 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos primaacuterios iniciais por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e expostos ao Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dentro dos grupos (Plt005) pelo teste de Duncan Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
0
5
10
15
20
25
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
A A
AB
B
AB
A
AB
B
0
1
2
3
4
5
6
7
8
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 4 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos primaacuterios avanccedilados por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dentro dos grupos (Plt005) pelo teste de Duncan Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
A
BC AC
BD
AC
BC
AB A A
B
B
A
78
0
02
04
06
08
1
12
14
16
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedilas entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dos grupos com as mesmas concentraccedilotildees nos diferentes experimentos (Plt005) ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) Teste de Duncan
A
B
A
B
ab b
a ab
Figura 5 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios iniciais por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e d
e o
voacuteci
tos Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 6 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Plt005) pelo teste de Duncan
79
0
05
1
15
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3
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4
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 7 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Duncan
Figura 8 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos atreacutesicos iniciais em ovaacuterios de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Kruskall Wallis
0
005
01
015
02
025
03
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e a
tre
sia
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
80
Figura 9 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos atreacutesicos totais em ovaacuterios de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
0
005
01
015
02
025
03
035
04
045
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e a
tre
sia
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Kruskall Wallis
81
Tabela 2 Diacircmetro meacutedio (microm) de foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados de lambaris A bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
53443 plusmn 7414a 53796 plusmn 7746a 53273 plusmn 8300a 50046 plusmn 5610a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
56807 plusmn 6647a 57517 plusmn 5849a 5904 plusmn 5889a 58449 plusmn 6849a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
53816 plusmn 5684a 51894 plusmn 6065a 55393 plusmn 6193a 54749 plusmn 6849a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
51606 plusmn 5757a 57837 plusmn 5977b 55774 plusmn 7870aᵇ 57311 plusmn 6178b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Tukey
Tabela 3 Iacutendice gonadossomaacutetico de fecircmeas de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
790 plusmn 318a 747 plusmn 221a 505 plusmn 263a 432 plusmn 255a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
856 plusmn 473a 813 plusmn 690a 702 plusmn 430a 683 plusmn 361a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
373 plusmn 213a 270 plusmn 147a 323 plusmn 189a 399 plusmn 201a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
227 plusmn 147a 303 plusmn 106a 305 plusmn 192a 293 plusmn 167a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Duncan
Tabela 4 Iacutendice hepatossomaacutetico de fecircmeas de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
07 plusmn 014aᵇ 088 plusmn 03a 084 plusmn 038a 038 plusmn 031b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
113 plusmn 054a 104 plusmn 061a 102 plusmn 050a 102 plusmn 051a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
066 plusmn 029a 073 plusmn 020a 092 plusmn 017a 091 plusmn 012a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
074 plusmn 034a 072 plusmn 029a 094 plusmn 040a 063 plusmn 018a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Duncan
82
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53 CAPIacuteTULO 3
RELACcedilAtildeO ENTRE COLAacuteGENO TIPO IV INTEGRINA β1 E CASPASE 3
DURANTE O DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM Astyanax bimaculatus
EXPOSTOS AO THIODAN reg
RESUMO
O agrotoacutexico Thiodanreg (350gL de endosulfan) eacute um inseticida organoclorado utilizado
em diversas monoculturas e pode chegar aos ecossistemas aquaacuteticos afetando a
reproduccedilatildeo e a integridade das populaccedilotildees de peixes Ovaacuterios de peixes apresentam
ovoacutecitos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento os quais satildeo envoltos por zona
radiata ceacutelulas foliculares membrana basal e ceacutelulas da teca formando o complexo
folicular A integridade do complexo folicular estaacute associada com a presenccedila de
colaacutegeno tipo IV e integrina β1 enquanto a caspase 3 eacute uma protease importante na via
apoptoacutetica participando ativamente nos processos de regressatildeo ovariana Pela carecircncia
de estudos que avaliam tais proteiacutenas no complexo folicular este estudo teve por
objetivo avaliar por meio de anaacutelise imunoistoquiacutemica a expressatildeo das proteiacutenas
colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspases 3 durante o desenvolvimento folicular do
lambari Astyanax bimaculatus exposto ao Thiodanreg Os peixes foram aclimatados
durante 10 dias em aquaacuterios de 50L com aeraccedilatildeo contiacutenua aacutegua sem cloro filtro
mecacircnico fotoperiacuteodo (12h) e temperatura (26plusmn1ordmC) controlados Para a exposiccedilatildeo ao
Thiodanreg os peixes foram divididos em quatro grupos controle 115 23 e 56 microgL
com trecircs repeticcedilotildees em cada concentraccedilatildeo Apoacutes 96 h seis peixes de cada grupo foram
anestesiados (benzocaiacutena110000) eutanasiados e seus ovaacuterios coletados para detecccedilatildeo
de colaacutegeno de tipo IV integrina β1 e caspase 3 Fragmentos dos ovaacuterios foram fixados
em paraformaldeiacutedo a 4 e incluiacutedos em parafina Os procedimentos de
imunomarcaccedilatildeo seguiram protocolos jaacute padronizados para os anticorpos empregados A
reaccedilatildeo foi revelada com diaminobenzidina e os cortes foram contracorados com
hematoxilina para avaliaccedilatildeo qualitativa em microscoacutepio de luz Os foliacuteculos primordiais
natildeo apresentaram marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 Nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio observou-se reaccedilatildeo fracamente positiva no citoplasma das
ceacutelulas foliculares enquanto foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio foram mais
intensamente marcados para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV A imunomarcaccedilatildeo para
caspase 3 foi evidenciada nas ceacutelulas foliculares durante o desenvolvimento secundaacuterio
sendo mais intensa no estaacutedio avanccedilado Qualitativamente essas anaacutelises demonstraram
87
marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento folicular mesmo com os
peixes expostos a diferentes concentraccedilotildees de Thiodanreg o que caracteriza a integridade
das ceacutelulas foliculares e da via apoptoacutetica caspase-3-dependente que pode estar sendo
ativada para futuros processos de regressatildeo folicular
Palavras-chave ecotoxicologia aquaacutetica ovaacuterio peixes e reproduccedilatildeo
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 de α-endosulfan e 30 de β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo
por meio da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em riscos toxicoloacutegicos os
organismos que ali residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al
2007) Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos
como jaacute observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis
niloticus No entanto a Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan
em gordura o valor de 005mgkg-1 (EPA 2002) e em aacutegua doce 022microgL-1 (EPA
1980) A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em
consideraccedilatildeo a qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente
Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm 3572005 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo
do referido inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
Muitos inseticidas apresentam baixa toxicidade antes de serem transformados
em substacircncias toacutexicas metabolicamente ativas O sulfato de endosulfan eacute um dos
produtos derivados do metabolismo do endosulfan sendo considerado o principal
metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica por ser mais estaacutevel no meio
ambiente em relaccedilatildeo a sua formula original (Ali et al 1984) A sensibilidade dos
organismos aquaacuteticos ao endosulfan eacute baixa e tem sido bem descrita na literatura por
alguns autores (Cengiz et al 2001 Capkin et al 2006 Ballesteros et al 2007 Pereira
et al 2012) sendo os machos geralmente mais sensiacuteveis que as fecircmeas pelo
armazenamento de lipiacutedeos para produccedilatildeo do vitelo e fornecimento de energia e pelo
tamanho maior da fecircmea em relaccedilatildeo ao macho (Ballesteros et al 2007)
88
O desenvolvimento folicular em peixes tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter 1996 Begovac amp Wallace
1988 Grier 2000 2002 e 2007) e como nos animais em geral compreende os periacuteodos
preacute-meioacutetico perinucleolar vitelogecircnico e maturaccedilatildeo final Estas fases ocorrem no
interior de foliacuteculos cujo complexo folicular eacute constituiacutedo por zona radiata camada
folicular membrana basal e teca (Grier 2000) as quais desempenham importante papel
durante a foliculogecircnese e fertilizaccedilatildeo
Entretanto os peixes quando satildeo expostos aos poluentes podem sofrer influecircncia
na foliculogecircnese e assim acarretar prejuiacutezos reprodutivos para as espeacutecies expostas aos
contaminantes Alguns estudos mostram diversas alteraccedilotildees provocadas nos foliacuteculos de
peixes por contaminantes (Hazarika amp Das 1998 Dutta et al 2003 Maxwell amp Dutta
2005 Chakrabarty et al 2012) inclusive a atresia folicular que eacute um processo
frequentemente observado nos ovaacuterios dos vertebrados (Saidapur 1978 Santos et al
2008a Santos et al 2008b) e que pode ser causada por diversos fatores dentre os
quais os agrotoacutexicos (Nagahama 1983 Guraya 1986 Chatterjee et al 1997 e 2001
Dutta amp Dalal 2008)
No desenvolvimento folicular a formaccedilatildeo do complexo folicular eacute importante
no suporte e na sobrevivecircncia das ceacutelulas foliculares No entanto jaacute foram identificadas
vaacuterias proteiacutenas que contribuem para a integridade do complexo folicular como
laminina integrina β1 fibronectina colaacutegeno tipo IV e de metaloproteinases (MMM-P)
em foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios e atreacutesicos (Rodgers et al 1998 Grier 2002 Le Bellego
et al 2002 Berkholtz et al 2006 Santos et al 2008a Thomeacute et al 2010) O colaacutegeno
tipo IV eacute uma proteiacutena especializada da matrix extracelular e membrana basal assim
como a laminina Essas proteacuteinas estatildeo envolvidas em favorecer um microambiente para
sobrevivecircncia das ceacutelulas do epiteacutelio (Rodgers et al 2003) As integrinas compreendem
uma grande famiacutelia de recepetores celulares composto de subnidades α e β que tem
funccedilatildeo importante na adesatildeo e transmissatildeo de sinais na ceacutelula Aleacutem disso as integrinas
estatildeo envolvidas na proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e morte celular
A caspase 3 eacute uma moleacutecula efetora de grande importacircncia no processo de
apoptose na ativaccedilatildeo de endonucleases e na clivagem das proteiacutenas celulares causando
mudanccedilas morfoloacutegicas celulares (Huettenbrenner et al 2003) Este processo de
apoptose envolve uma cascata de eventos bioquiacutemicos com a liberaccedilatildeo de fatores
mitocondriais de morte celular ativaccedilatildeo caspases e mudanccedila na caracteriacutestica
morfoloacutegica no nuacutecleo da ceacutelula assim como fragmentaccedilatildeo do DNA (Huettenbrenner et
89
al 2003) No entanto alguns trabalho citam a importacircncia da integridade do complexo
folicular com a presenccedila de integrina β1 e colaacutegeno tipo IV que em caso de atresia
folicular e ovulaccedilatildeo na formaccedilatildeo de foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios culminam em processo
da ativaccedilatildeo das caspases nas ceacutelulas foliculares Sendo assim a incidecircncia de apoptose
nas ceacutelulas foliculares aumenta nas etapas de regressatildeo ovariana (Drummond et al
2000 Santos et al 2003 2005 2008)
O lambari A bimaculatus foi escolhido como organismo experimental pois eacute
muito representativo no ecossistema sendo encontrado desde o nordeste brasileiro ateacute a
Bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Tambeacutem eacute um peixe de
pequeno porte e faacutecil de manter em laboratoacuterio O complexo folicular associado agrave
siacutentese dessas proteiacutenas ao longo do desenvolvimento folicular eacute algo a ser discutido
Poreacutem nenhum trabalho relata estas proteiacutenas em peixes expostos ao Thiodanreg Devido
agrave carecircncia de estudos que avaliem tais proteiacutenas no complexo folicular o presente
trabalho tem como objetivo avaliar as proteiacutenas colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase
3 durante o desenvolvimento folicular do lambari A bimaculatus exposto ou natildeo ao
Thiodanreg por meio de anaacutelise imunoistoquiacutemica
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria (DVT) da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste subletal e as atividades de coleta fixaccedilatildeo e
inclusatildeo dos fragmentos de ovaacuterios As etapas de microtomia imunoistoquiacutemica
coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas foram realizadas no
DVTUFV e no Laboratoacuterio de Ictiohistologia do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas (ICB)
da Universidade Federal de Minas Gerais
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos peixes em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado poro genital
dilatado e vascularizado
90
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV onde
foram aclimatados por 10 dias Os aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuiacuteam
capacidade de 50 litros numa densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada
aacutegua livre de cloro temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos
os aquaacuterios possuiacuteam um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo continua da aacutegua para
garantir o bem-estar dos peixes Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial
Purina contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da
piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Foram aclimatados 96 lambaris como descrito no item 21 onde os peixes se
acostumaram ao seu novo meio e agraves atividades normais de manutenccedilatildeo como
alimentaccedilatildeo e limpeza dos aquaacuterios O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi
realizado baseando-se nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo com
a NBR 15088 (ABNT 2007)
Logo apoacutes aclimataccedilatildeo os peixes foram submetidos ao toacutexico Thiodanreg
(endosulfan 350gL) por 96 horas Em todos os experimentos foram utilizadas trecircs
concentraccedilotildees diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 (137microgL) preacute-determinada em
laboratoacuterio de acordo com a NBR 15088 (ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas
em cada experimento foram de 115 23 e 56microgL aleacutem de um grupo controle sem
toacutexico com trecircs repeticcedilotildees sob as mesmas condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
91
24 Anaacutelises histoloacutegicas e imunoistoquiacutemicas
Apoacutes 96 horas de experimento seis fecircmeas de cada grupo foram coletadas
anestesiadas com benzocaiacutena (110000) e eutanasiadas para coleta dos ovaacuterios Para a
descriccedilatildeo histoloacutegica todas as amostras foram fixadas em paraformaldeiacutedo a 4 em
tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedas em parafina Em seguida
secccedilotildees com 5 microm de espessura foram coradas utilizando hematoxilinaeosina para
anaacutelises morfoloacutegicas do desenvolvimento folicular
Para detectar a imunorreatividade para colaacutegeno tipo IV integrinas β1 e caspase
3 nos ovaacuterios do lambari trecircs espeacutecimes de cada grupo foram fixados em
paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas incluiacutedas em
parafina e seccionadas com 5 microm de espessura A recuperaccedilatildeo antigecircnica foi realizada
em forno de microondas por 10 minutos com os cortes nas lacircminas sendo imersos em
tampatildeo citrato 10mM pH 60 As lacircminas foram incubadas com peroacutexido de hidrogecircnio
a 3 em tampatildeo fosfato por 15 minutos em temperatura ambiente para inativar
peroxidase endoacutegena e com soro albumina bovina a 2 por 45 minutos para bloquear
marcador antigecircnico inespeciacutefico Anticorpos primaacuterios (policlonais de coelho) anti-
colaacutegeno tipo IV anti-integrina β1 e anti-caspase 3 (Santa Cruz Biotechnology Calif
USA) foram aplicados nas secccedilotildees a 4degC na diluiccedilatildeo 1100 (integrina β1 e colaacutegeno tipo
IV) e 1200 (caspase 3) segundo o fabricante por 12 horas Os cortes foram lavados
em PBS e incubados por 45 minutos com anticorpo secundaacuterio na diluiccedilatildeo de 1200
anti-IgG de coelho (LSAB 2 sistema HRP DakoCymation Carpinteria Calif USA) e
tratados com peroxidase conjugada com estreptavidina por 45 minutos A revelaccedilatildeo foi
realizada com diaminobenzidina (DAB) e as lacircminas foram contracoradas com
hematoxilina (Santos et al 2008)
As lacircminas foram analisadas em toda sua extensatildeo em busca de alteraccedilotildees na
imunomarcaccedilatildeo no complexo folicular que pudessem ser representativas do efeito do
Thiodanreg sempre comparando com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios do grupo
controle As lacircminas foram analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e as
imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
92
3 RESULTADOS
31 Desenvolvimento folicular
O desenvolvimento folicular de A bimaculatus foi dividido em desenvolvimento
primaacuterio inicial e avanccedilado O desenvolvimento secundaacuterio foi dividido em
desenvolvimento secundaacuterio inicial intermediaacuterio e avanccedilado (Tabela 1) A regressatildeo
ovariana tambeacutem foi caracterizada (Tabela 1)
Tabela 1 Aspectos morfoloacutegicos do desenvolvimento folicular e da regressatildeo ovariana de Astyanax bimaculatus
Foliacuteculos primordiais Estaacutedio que antecede o desenvolvimento de foliacuteculos primaacuterios Satildeo ceacutelulas menores apresentando citoplasma volumoso nuacutecleo esfeacuterico e grande e ceacutelulas preacute-foliculares (Figura 1 B) Foliacuteculos primaacuterios iniciais e primaacuterios avanccedilados (perinucleolares) No desenvolvimento primaacuterio inicial os ovoacutecitos apresentam citoplasma fortemente basoacutefilo nuacutecleo esfeacuterico e nucleacuteolos dispersos pelo nucleoplasma Estatildeo envoltos por ceacutelulas foliculares pavimentosas (Figuras 1 C-encarte) No foliacuteculo primaacuterio avanccedilado a camada de ceacutelulas foliculares eacute pavimentosa e com o nuacutecleo eliacuteptico Entre as ceacutelulas foliculares e o ooplasma surge a zona radiata como uma fina camada (Figura 1 E-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios iniciais O citoplasma ovocitaacuterio eacute granular e fracamente basoacutefilo com presenccedila de vesiacuteculas corticais pequenas e claras na periferia do citoplasma O nuacutecleo eacute central ligeiramente acidoacutefilo com nucleacuteolos pequenos e dispersos pelo nucleoplasma (Figura 1 G-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios Assim como na etapa anterior os foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios possuem ovoacutecito com nuacutecleo central e acidoacutefilo No citoplasma inicia-se a deposiccedilatildeo de vitelo a partir da regiatildeo perifeacuterica (Figura 1 H-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados (vitelogecircnicos) No foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado o diacircmetro e o volume citoplasmaacutetico aumentam mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo apresentando os foliacuteculos neste estaacutedio vesiacuteculas corticais na periferia e gloacutebulos de vitelo disperso por todo citoplasma No complexo folicular a membrana basal eacute delgada e a zona radiada mais espessa que nas fases anteriores com ceacutelulas foliculares pavimentosas e cuacutebicas (Figura 1 H-encarte) Foliacuteculos atreacutesicos Apresenta formato irregular com estruturas descontiacutenuas ou desorganizadas com aspecto de grumos devido agrave liquefaccedilatildeo dos gracircnulos de vitelo ou com perda da conectividade entre suas partes fragmentaccedilatildeo da zona radiata (atresia inicial) e absorccedilatildeo total do conteuacutedo ovocitaacuterio pelas ceacutelulas foliculares (atresia avanccedilada) (Figuras 3 A e B-encarte) Foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios O foliacuteculo poacutes-ovulatoacuterio possue lume amplo irregular e contiacutenuo com o lume do ovaacuterio Apresenta parede constituiacuteda por camada uacutenica de ceacutelulas foliculares membrana basal e teca (Figuras 3 E e F)
93
32 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 no desenvolvimento
folicular de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Os foliacuteculos nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento apresentaram diferentes
graus de marcaccedilatildeo para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV Em foliacuteculo primordial natildeo se
observou marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 (Figura 1 B) Nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio inicial foram evidenciadas reaccedilotildees positivas com marcaccedilatildeo
fraca para colaacutegeno e integrina (Figuras 1 C e D) enquanto nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio avanccedilado as marcaccedilotildees foram mais niacutetidas (Figuras 1 E e F)
Nos desenvolvimento secundaacuterio foram evidenciadas marcaccedilotildees positivas para integrina
β1 e colaacutegeno tipo IV no citoplasma das ceacutelulas foliculares com mais intensidade que
nos estaacutedios anteriores (Figuras 1 G e H) Estas marcaccedilotildees natildeo mostraram diferenccedilas
entre os grupos expostos ao Thiodanreg quando comparados com os mesmos estaacutedios de
desenvolvimento folicular dos grupos controle A marcaccedilatildeo para caspase 3 foi
evidenciada no citoplasma e nuacutecleos de ceacutelulas foliculares de foliacuteculos com
desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado apresentando maior intensidade nos estaacutedios de
desenvolvimento secundaacuterio inicial A marcaccedilatildeo foi ausente nos estaacutedios de
desenvolvimento primaacuterio (Figuras 2 A-D) Quando comparadas estas marcaccedilotildees entre
os grupos controle e expostos ao Thiodanreg natildeo houve diferenccedilas nas marcaccedilotildees entre
os mesmos estaacutedios de desenvolvimento folicular
33 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 na atresia folicular de
A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
A marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 foi evidente nos foliacuteculos
atreacutesicos iniciais poreacutem menos intensa em relaccedilatildeo aos foliacuteculos normais (Figuras 3 A e
C) As fases mais avanccediladas da atresia folicular satildeo caracterizadas pela desorganizaccedilatildeo
espalhamento das proteiacutenas no ooplasma com reaccedilatildeo mais fraca da imunomarcaccedilatildeo
para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 (Figuras 3 B e D) Para a caspase 3 foi observada a
marcaccedilatildeo positiva nas ceacutelulas foliculares em foliacuteculos atreacutesicos iniciais e avanccedilados
(Figuras 4 A e B)
94
34 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 em foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Foram evidenciados desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV e
integrina β1 entre as ceacutelulas foliculares com marcaccedilatildeo positiva (Figuras 3 E e F) Em
foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios tambeacutem foi observada marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 nas
ceacutelulas foliculares (Figuras 4 C e D)
4 DISCUSSAtildeO
As fecircmeas de A bimaculatus submetidas agrave accedilatildeo do toacutexico apresentaram ovaacuterios
com padrotildees normais do desenvolvimento folicular sendo as variaccedilotildees na estrutura do
foliacuteculo como diacircmetro caracteriacutesticas do nuacutecleo camadas envoltoacuterias composiccedilatildeo e
distribuiccedilatildeo do vitelo observadas em outras espeacutecies do gecircnero do presente estudo
(Miranda 1996 Miranda et al 1999 Melo et al 2005 Mazzoni et al 2005 Rodrigues
et al 2005) Em outros trabalhos (Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008) satildeo
demonstrados que pequena concentraccedilatildeo de contaminantes pode ser suficiente para
causar alteraccedilotildees na morfologia dos foliacuteculos Entretanto Ballesteros et al (2007)
utilizando peixes machos e fecircmeas da espeacutecie Jenynsia multidentata verificaram que o
maior teor de lipiacutedeos nas fecircmeas foi importante para conferir maior resistecircncia contra o
endosulfan ao contraacuterio dos machos que satildeo mais suceptiacuteveis Estudo realizado por
Hernan Da Cuntildea et al (2011) mostrou que a espeacutecie Cichlasoma dimerus exposta ao
endosulfan nas concentraccedilotildees de zero 025 1 2 3 4 e 16μgL natildeo apresentou
alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos foliacuteculos assim como no presente trabalho com A
bimaculatus
No presente estudo a ausecircncia de marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV em foliacuteculos
primordiais pode ter ocorrido em funccedilatildeo da quantidade reduzida de ceacutelulas foliculares e
pela pequena espessura da membrana basal nesta fase de desenvolvimento folicular Na
literatura eacute mencionado que a espessura da membrana basal em foliacuteculos secundaacuterios
avanccedilados de A bimaculatus eacute de aproximadamente 03 microm caracterizada por ser uma
estrutura muito mais delgada quando comparada a outras espeacutecies de teleoacutesteos
(Drummond et al 2000) Outros autores no entanto observaram positividade para
colaacutegeno tipo IV na membrana basal envolvendo ovogocircnias no estroma ovariano de
peixes (Grier 2002 Thomeacute et al 2010) fase que antecede o ovoacutecito primordial
95
A siacutentese de membrana basal tem sido atribuiacuteda agraves ceacutelulas foliculares (Le Mim
et al 2007) mas ainda faltam investigaccedilotildees que evidenciem esta funccedilatildeo A anaacutelise por
hibridizaccedilatildeo in situ na cadeia α1 do colaacutegeno tipo IV revelou a presenccedila de mRNA
localizada na camada folicular de todos os foliacuteculos em crescimento no peixe medaka
Oryzias latipes (Kato et al 2010) enquanto para integrinas Itami et al (2011) natildeo
identificaram marcaccedilatildeo em foliacuteculos primordiais em ratos Estes estudos confirmam que
durante o desenvolvimento do foliacuteculo primordial poderia estar ocorrendo o inicio da
organizaccedilatildeo e siacutentese do colaacutegeno tipo IV para as fecircmeas do presente estudo
Logo em seguida o desenvolvimento folicular primaacuterio inicial e avanccedilado foi
caracterizado por alteraccedilotildees no complexo folicular com marcaccedilatildeo positiva para
integrina β1 e colaacutegeno tipo IV foi positiva Em outro estudo realizado para marcaccedilatildeo
de vaacuterias subunidades do colaacutegeno tipo IV em foliacuteculos de bovinos a expressatildeo das
cadeias α3 e α6 diminuiacuteram durante o desenvolvimento folicular enquanto as cadeias
α1 e α2 continuaram a ser expressas ao longo do desenvolvimento (Rodgers et al
1998) Em estudo com ratos foi verificado o decliacutenio de colaacutegeno tipo IV α3 ao longo
do desenvolvimento folicular mas foi possiacutevel detectar o colaacutegeno tipo IV α4 e α5 em
foliacuteculos desenvolvidos (Frojdman et al 1998) Entretanto Berkholtz (2006) observou
aumento da marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV ao longo do desenvolvimento folicular em
ratos Aleacutem disso outra caracteriacutestica importante eacute presenccedila de perlecan e nidogen que
fazem parte das ligaccedilotildees cruzadas em foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio mas
natildeo em foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio (McArthur et al 2000) Poreacutem as
diferentes ligaccedilotildees cruzadas entre os colaacutegenos e lamininas nas membranas basais
tambeacutem garantem maior expansatildeo no alargamento do foliacuteculo (Rodgers et al 2003)
Portanto eacute de grande importacircncia nesta etapa de desenvolvimento folicular a evidecircncia
do colaacutegeno tipo IV e integrinas o que pode contribuir na organizaccedilatildeo coordenada no
desenvolvimento folicular de A bimaculatus com estas proteiacutenas da matriz extracelular
Em relaccedilatildeo agraves fases de desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio foram observadas
marcaccedilotildees positivas para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 o que parece caracterizar
maior siacutentese destas proteiacutenas nestes estaacutedios do desenvolvimento folicular Entretanto
deve-se considerar que nas fases mais avanccediladas a quantidade de ceacutelulas foliculares e
ceacutelulas da teca satildeo mais numerosas sendo assim exercem funccedilatildeo importante na
integridade folicular No presente estudo a marcaccedilatildeo contiacutenua de colaacutegeno tipo IV e
integrina β1 nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento folicular em 96 horas de
experimento indicou que natildeo houve desorganizaccedilatildeo na membrana basal e nas ceacutelulas
96
foliculares Thomeacute et al (2010) identificaram por teacutecnicas de imonoistoquiacutemica e
imunofluorescecircncia a presenccedila de laminina β2 integrinas e colaacutegeno tipo IV na
membrana basal demonstrando a importacircncia destes constituintes na integridade da
membrana basal ao longo do desenvolvimento folicular resultados observados tambeacutem
em foliacuteculos de mamiacuteferos (Le Bellego et al 2002 Berkholtz et al 2006)
Em foliacuteculos de ratos tambeacutem foi evidenciada a presenccedila de integrinas ao longo
do desenvolvimento folicular apresentando marcaccedilatildeo positiva no desenvolvimento
primaacuterio e marcaccedilatildeo mais intensa no desenvolvimento secundaacuterio (Itami et al 2011)
Portanto a marcaccedilatildeo positiva nas ceacutelulas foliculares em lambaris A bimaculatus nos
grupos controle e expostos ao Thiodanreg mostrou que a integridade dos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio natildeo foi afetada pelas concentraccedilotildees de
Thiodanreg utilizadas
Em relaccedilatildeo agrave caspase 3 ao longo do desenvolvimento folicular foi possiacutevel
evidenciar sua expressatildeo nos estaacutedios de desenvolvimento secundaacuterio mas natildeo a
presenccedila de condensaccedilatildeo de nuacutecleos e corpos apoptoacuteticos nas ceacutelulas foliculares No
entanto a presenccedila de caspase 3 nas ceacutelulas foliculares de A bimaculatus indica que
estas ceacutelulas podem estar em via apoptoacutetica poreacutem outros trabalhos demonstram que a
via para caspase 3 eacute observada em foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios atresias iniciais e
principalmente nas atresias avanccediladas com a presenccedila de fragmentaccedilatildeo de DNA
condensaccedilatildeo nuclear e formaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos (Hsueh et al 1994 Santos et
al 2008) A ausecircncia destas caracteriacutesticas morfoloacutegicas nos foliacuteculos de A
bimaculatus do presente estudo pode ser explicada por inibidores de apoptose (Salvesen
amp Duckett 2002) que podem estar ativos e protegendo as ceacutelulas contra apoptose
Outros exemplos citados satildeo os fatores hormonais como as gonadotropinas 17β
estradiol e fator de crescimento epideacutermico que agem como fatores de sobrevivecircncia
para suprimir a morte celular por apoptose em foliacuteculos ovarianos de ratos em cultura
(Chun et al 1994) e tambeacutem no peixe truta arco-iacuteris Oncorhynchus mykiss (Janz amp Van
Der Kraak 1997) Segundo Salvesen amp Duckett (2002) poucos estudos tecircm tentado
esclarecer se uma determinada ceacutelula consegue se recuperar de um efeito fisioloacutegico de
caspases quando estatildeo sendo processadas e ativadas
Um grupo de proteiacutenas estruturalmente relacionadas agrave inibiccedilatildeo da apoptose eacute o
inibidor de apoptose (IAP) (Deveraux amp Reed 1999) Satildeo descritos pelo menos oito
IAPs em humanos localizados no citoplasma e que se ligam na forma ativa da caspase
3 ou na forma zimogecircnio das caspases para inibir a sua funccedilatildeo (Salvesen amp Duckett
97
2002) Janz et al (1997) mencionam forte relaccedilatildeo com o aumento da apoptose e
expressatildeo de proteiacutena do choque teacutermico HSP70 em peixes expostos agrave celulose
afetando o tamanho do ovaacuterio provocanado queda da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
testosterona e induccedilatildeo nas concentraccedilotildees plasmaacuteticas de 17β estradiol Em relaccedilatildeo agrave
HSP70 ela pode estar relacionada com a proteccedilatildeo das ceacutelulas foliculares antes da
reabsorccedilatildeo do vitelo em foliacuteculos atreacutesicos (Santos et al 2008) A relaccedilatildeo mais
consistente da viabilidade dos foliacuteculos de A bimaculatus no presente estudo segundo a
literatura pode ser a relaccedilatildeo dos inibidores de apoptose associado com os fatores
hormonais agindo como prevenccedilatildeo na sobrevivecircncia das ceacutelulas foliculares no
desenvolvimento folicular secundaacuterio
Nas fecircmeas do lambari A bimaculatus o processo de atresia foi semelhante ao
descrito por Miranda et al (1999) Munoz et al (2002) Melo et al (2005) e Santos et
al (2005) A maior frequecircncia de atresia foi observada em foliacuteculos secundaacuterios
Observaccedilotildees semelhantes foram feitas por Drummond (1996) em A bimaculatus
lacustris e Melo et al (2005) em A scabripinnis Em relaccedilatildeo aos foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios ocorre perda de contato entre as membranas das ceacutelulas foliculares
adjacentes evento observado por Santos et al (2005) entre 48 e 72 horas poacutes-desova em
Leporinus taeniatus Essas estruturas foram raramente encontradas no presente estudo
indicando que o grau de contaminaccedilatildeo pelo Thiodanreg natildeo interferiu na eliminaccedilatildeo dos
foliacuteculos de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada
Nos processos de atresias e nos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios ocorreram a
desorganizaccedilatildeo e a perda da positividade da imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e
integrinas nas fases avanccediladas quando comparadas com as fases iniciais da regressatildeo
ovariana sendo esta caracteriacutestica tambeacutem observada por outros autores (Santos et al
2008 Thomeacute et al 2010) Relatos importantes sobre a integridade dos foliacuteculos estatildeo
na diminuiccedilatildeo da integrina β1 e colaacutegeno do tipo IV contribuindo para o aumento da
apoptose em ceacutelulas foliculares de foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios e nas atresias avanccediladas
(Santos et al 2008) Aleacutem disso outros fatores contribuem para o aumento da
apoptose como a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 17β estradiol logo apoacutes a desova
favorecendo a regressatildeo ovariana dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios (Kaptaner amp Ural 2006)
Portanto o presente estudo com as fecircmeas de A bimaculatus evidencia a caspase 3 e a
diminuiccedilatildeo da marcaccedilatildeo com integrina β1 e colaacutegeno tipo IV nas ceacutelulas foliculares nos
foliacuteculos atreacutesicos e poacutes-ovulatoacuterios o que sugere a provaacutevel accedilatildeo destas proteiacutenas na
regressatildeo folicular em lambaris expostos ao Thiodanreg
98
De acordo com os resultados obtidos pode-se inferir que os ovaacuterios A
bimaculatus foram resistentes ao Thiodanreg nas concentraccedilotildees testadas e no periacuteodo
experimental proposto pois tais concentraccedilotildees natildeo interferiram de modo significativo
na estrutura do complexo folicular e no desenvolvimento folicular Qualitativamente
essas anaacutelises demonstraram a marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do
desenvolvimento folicular mesmo quando os peixes foram expostos a diferentes
concentraccedilotildees de Thiodanreg o que caracteriza a integridade das ceacutelulas foliculares e da
via apoptoacutetica caspase-3-dependente que pode estar sendo ativada para futuros
processos de regressatildeo folicular
99
A
DC
B
fsa fp
fpi
fpi
mc
mi
fpa
fpa
fsa
fsa
zr
zr
zr zr
H
E
G
F
mc
m
mi
mc
fsa
fpi
fpa
fsi
vc fsa
fst
v
v
Figura 1 Imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 ao longo do desenvolvimento folicular em A bimaculatus A Controle negativo para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV B Foliacuteculo primordial (fp) sem marcaccedilatildeo para colaacutegeno (setas) C e D Marcaccedilatildeo positiva para colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) respectivamente em folliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio inicial (fpi) E e F Marcaccedilatildeo positiva para colaacutegeno (mc) e integrina (mi) em foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (fpa) Encarte-C Foliacuteculo primaacuterio inicial (fpi) G e H Marcaccedilatildeo para colaacutegeno (mc) e integrina (mi) mais fortemente evidenciada em foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (fsa) Encartes-G e H Foliacuteculo secundaacuterio inicial (fsi) foliacuteculo secundaacuterio intermediaacuterio (fst) foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado (fsa) vesiacuteculas corticais (vc) vitelo (v) zona radiata (zr) Encartes C E G e H corados com hematoxilinaeosina Barras 20 m encartes C e E (80 m) G (100m) e H (200m)
A B
C D
E F
G H
100
fpi
fpa
fsa
fsa
fsa
zr
zr
zr zr
D
A
C
B
Figura 2 Imunomarcaccedilatildeo para caspase 3 ao longo do desenvolvimento folicular em A bimaculatus A Imagem do controle negativo para caspase 3 (setas) B Ausecircncia de marcaccedilatildeo para caspase 3 (setas) em foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio inicial (fpi) C e D Marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) em foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (fsa) e ausente (setas) em foliacuteculo desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (fpa) zr zona radiata fsa foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado Barras 20 m
101
A
mc
mi
mc
mi
mi mc
fpo fpo
ai av
av
B
C D
E F
Figura 3 Imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 de atresia e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterio em A bimaculatus A e C Foliacuteculo secundaacuterio em atresia inicial (ai) caracterizando a presenccedila da zona radiata (zr) e iniacutecio da desorganizaccedilatildeo da marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) no complexo folicular (setas) B e D Imunomarcaccedilatildeo menos intensa do que na etapa anterior em atresia avanccedilada caracterizando a desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) no citoplasma (setas) E e F Foliacuteculo poacutes-ovulatoacuterio (fpo) caracterizando a desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) entre as ceacutelulas
foliculares (setas) Encartes A e B Atresia inicial (ai) e atresia avanccedilada (av) ceacutelula folicular (cf) zona radiata (zr) Encartes A e B corados com hematoxilinaeosina Barras A B C E e F
(20 m) D (200 m) encartes A (25 m) e B (100 m)
ai av zr cf cf
102
A
ai av
fpo fpo
B
C D
Figura 4 Imunomarcaccedilatildeo para caspase 3 em atresia folicular e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios em A bimaculatus A e B Imunomarcaccedilatildeo em atresia inicial (ai) e atresia avanccedilada (av) caracterizando a presenccedila de marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) C e D Imunomarcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) nas ceacutelulas dos foliacuteculos poacutes-ovulatorios (fpo) Barras A B e D (20 m) C (200 m)
103
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107
6 CONCLUSOtildeES A CL50 estimada para fecircmeas adultas de Astyanax bimaculatus em maturaccedilatildeo
avanccedilada expostas ao Thiodanreg eacute de 136microgL com intervalo de confianccedila de 101 a
184 microgL
A accedilatildeo do Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou o fiacutegado como um todo
mas locais isolados do parecircnquima hepaacutetico sendo a maioria alteraccedilotildees de estaacutegio I e
II com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico
As alteraccedilotildees na quantidade de glicogecircnio hepaacutetico no experimento sem aclimataccedilatildeo
sem alimentaccedilatildeo demonstraram que o Thiodanreg influenciou na maior mobilizaccedilatildeo
das reservas de glicogecircnio em funccedilatildeo das condiccedilotildees ambientais oferecidas aos
animais
As alteraccedilotildees ocorridas no nuacutecleo e citoplasma dos hepatoacutecitos demonstram que o
Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees hepaacuteticas confirmando que o Thiodanreg
influenciou no metabolismo celular como resposta adaptativa celular
Natildeo foram observadas diferenccedilas morfoloacutegicas que comprometessem diretamente os
estaacutedios de desenvolvimento folicular ovariano seja no grupo controle ou nos grupos
tratados com Thiodanreg
Os experimentos com aclimataccedilatildeo apresentaram alteraccedilotildees na quantidade de
foliacuteculos primaacuterios e secundaacuterios quando comparadas com os peixes sem
aclimataccedilatildeo sugerindo que o eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-ovaacuterio pode estar sendo
afetado
Houve maior diacircmetro nos foliacuteculos vitelogecircnicos e maior frequecircncia de atresia
folicular no experimento com aclimataccedilatildeo seguida de exposiccedilatildeo ao Thiodanreg o que
sugere mecanismo adaptativo com maiores diacircmetros de foliacuteculos no meio
impactado
108
As meacutedias dos IGS e IHS nos experimentos aclimatados foram menores quando
comparadas com os experimentos sem aclimataccedilatildeo sugerindo que a espeacutecie A
bimaculatus previamente aclimatada em aquaacuterios pode sofrer comprometimento da
reproduccedilatildeo
As reaccedilotildees imunohistoquiacutemicas para integrina β1 colaacutegeno IV e caspase-3 em
foliacuteculos atreacutesicos e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios sugerem possiacutevel relaccedilatildeo com a
regressatildeo ovariana poacutes-desova
As anaacutelises por imunohistoquiacutemica para integrina β1 colaacutegeno IV e caspase-3 nas
ceacutelulas foliculares ao longo do desenvolvimento folicular demonstraram
qualitativamente marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento
folicular mesmo quando os peixes foram expostos a diferentes concentraccedilotildees de
Thiodanreg o que caracteriza a integridade das ceacutelulas foliculares e da via apoptoacutetica
caspase-3-dependente que pode estar sendo ativada para futuros processos de
regressatildeo folicular
i
LUCAS MARCON
EFEITOS DO THIODAN reg EM FIacuteGADO E EM OVAacuteRIOS EM
MATURACcedilAtildeO AVANCcedilADA DE LAMBARIS Astyanax bimaculatus
Tese apresentada agrave Universidade Federal de Viccedilosa como parte das exigecircncias do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Medicina Veterinaacuteria para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doctor Scientiae
APROVADA
____________________________________ ______________________________
Profa Dra Marlene Isabel Vargas Viloria Profa Dra Mary Anne Heidi Dolder
(Coorientadora)
____________________________________ _____________________________
Prof Dr Nilo Bazzoli Prof Dr Joseacute Domingos Guimaratildees
_________________________________
Prof Dr Laeacutercio dos Anjos Benjamin
(Orientador)
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus aos meus pais (Carlos e Narcisa) irmatildeos (Luciana e Luacutecio) orientador
(Laeacutercio dos Anjos Benjamin) e minha namorada (Mirlaine Soares) por me
incentivarem acreditarem confiarem e sempre estarem ao meu lado demonstrando
sugestotildees construtivas para a vida e para este trabalho
Aos membros da banca examinadora dessa tese pela disponibilidade e sugestotildees
construtivas para enriquecimento desse trabalho
Agrave CAPES FAPEMIG e Departamento de VeterinaacuteriaUFV pelo apoio financeiro
para o desenvolvimento do presente estudo
Aos professores e funcionaacuterios do Departamento de VeterinaacuteriaUFV e
Departamento de Morfologia - ICBUFMG pelos ensinamentos e paciecircncia para
concretizaccedilatildeo das teacutecnicas utilizadas neste estudo
A todos aqueles que direta ou indiretamente colaboraram para a realizaccedilatildeo deste
estudo e conviveram comigo ao longo desses anos em Viccedilosa-MG
iii
BIOGRAFIA
LUCAS MARCON filho de Carlos Marcon Filho e Narcisa das Dores Marcon
nasceu em 29 de janeiro de 1980 em Campinas-SP
Em fevereiro de 1999 ingressou no curso de Ciecircncias Bioloacutegicas pela Pontifiacutecia
Universidade Catoacutelica de Campinas (PUC-Campinas) onde em janeiro de 2003
graduou-se nesta Instituiccedilatildeo No ano de 2002 foi bolsista de iniciaccedilatildeo cientifica pela
FAPESP no Departamento de Biologia Celular Instituto de BiologiaUNICAMP
Em maio de 2006 ingressou no Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Medicina
Veterinaacuteria na Universidade Federal de Viccedilosa - MG sob orientaccedilatildeo do professor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin na linha de pesquisa Morfofisiologia de Animais
Domeacutesticos e Selvagens (Reproduccedilatildeo e Toxicologia de Peixes) defendendo a
dissertaccedilatildeo de mestrado em fevereiro de 2008 e tese de doutorado em dezembro de
2013 obtendo os tiacutetulos de Magister Scientiae e Doctor Scientiae
iv
IacuteNDICE
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO GERAL
11 O uso de agrotoacutexicos
12 Tipos de inseticidas
13 Inseticidas no meio ambiente rotas de entrada
14 Avaliaccedilatildeo de solubilidade e estudos de toxicidade aquaacutetica
15 Caracterizaccedilatildeo do agrotoacutexico Thiodanreg
16 O uso do endosulfan
17 Toxicidade aguda do endosulfan
18 Efeitos dos inseticidas organoclorados sobre peixes
19 O lambari Astyanax bimaculatus
110 Morfologia hepaacutetica em teleoacutesteos
111 Morfologia ovariana em teleoacutesteos
vi
viii
1
1
2
3
4
5
6
6
7
9
10
12
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
22 Objetivos especiacuteficos
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
31 Animais
32 Agrotoacutexicos
33 Teste de toxidade aguda em sistema estaacutetico - CL50
34 Teste de toxidade subletal em sistema estaacutetico
35 Avaliaccedilatildeo morfoloacutegica
351 Microscopia de luz
352 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos fiacutegados
353 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos ovaacuterios
354 Imunoistoquiacutemica
36 Paracircmetros biomeacutetricos
37 Anaacutelises estastiacuteticas
4 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
15
15
15
17
17
18
18
20
21
21
22
25
26
27
27
28
v
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 CAPIacuteTULO 1 Efeitos do inseticida Thiodanreg sobre a morfologia
hepaacutetica de fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
52 CAPIacuteTULO 2 Efeitos do inseticida Thiodanreg sobre a morfologia
do desenvolvimento folicular em lambaris Astyanax bimaculatus
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
53 CAPIacuteTULO 3 Relaccedilatildeo entre colaacutegeno tipo IV integrina β1 e
caspase 3 durante o desenvolvimento folicular em Astyanax
bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
6 CONCLUSOtildeES
35
35
35
36
37
42
45
56
62
62
63
65
68
71
82
86
86
87
89
92
94
103
107
vi
RESUMO
MARCON Lucas D Sc Universidade Federal de Viccedilosa dezembro de 2013 Efeitos do Thiodanreg em fiacutegado e em ovaacuterios em maturaccedilatildeo avanccedilada de lambaris Astyanax bimaculatus Orientador Laeacutercio dos Anjos Benjamin Coorientadoras Ann Honor Mounteer e Marlene Isabel Vargas Viloria
O agrotoacutexico Thiodanreg (350gL de endosulfan) eacute um inseticida organoclorado utilizado
em diversas monoculturas que pode chegar aos ecossistemas aquaacuteticos e afetar a
reproduccedilatildeo e a integridade das populaccedilotildees de peixes O fiacutegado eacute um dos principais
oacutergatildeos para a biotransformaccedilatildeo de diversos xenobioacuteticos Quando os peixes satildeo
expostos a uma concentraccedilatildeo elevada de agentes quiacutemicos podem ocorrer danos
hepaacuteticos Os ovaacuterios de peixes apresentam foliacuteculos em diferentes estaacutedios de
desenvolvimento que satildeo envoltos por zona radiata ceacutelulas foliculares membrana basal
e ceacutelulas da teca formando o complexo folicular Agentes estressores podem causar
aumento ou diminuiccedilatildeo do diacircmetro dos foliacuteculos vitelogecircnicos alterar a quantidade de
foliacuteculos nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento e aumentar a incidecircncia de atresia
Assim o presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos do Thiodanreg sobre o fiacutegado
e ovaacuterios de lambaris Astyanax bimaculatus por meio de anaacutelises morfoloacutegica
morfomeacutetrica e imunoistoquiacutemica Os peixes expostos ao toacutexico foram divididos em
quatro experimentos 1) sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo 2) sem aclimataccedilatildeo e
alimentados 3) com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo 4) com aclimataccedilatildeo de
10 dias e alimentados Em todos os experimentos foram utilizadas trecircs concentraccedilotildees
diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 de 1367microgL preacute-determinada em laboratoacuterio
de acordo com a NBR 15088 (ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas em cada
experimento foram de 115 23 e 56microgL aleacutem de um grupo controle livre de toacutexico
com trecircs repeticcedilotildees contento 10 peixes para cada concentraccedilatildeo Apoacutes as 96h seis peixes
de cada grupo foram capturados e anestesiados com benzocaiacutena (110000) de acordo
com as Normas da Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de VeterinaacuteriaUFV (protocolo
242009) Os fiacutegados e ovaacuterios foram coletados e processados por teacutecnicas histoloacutegicas
rotineiras As lacircminas foram analisadas em microscoacutepio de luz Olympus CX31 Foram
obtidas imagens digitais de 10 campos aleatoacuterios por animal em objetiva de 20X e 40X
para avaliaccedilatildeo histoloacutegica As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada nos testes em sistema
estaacutetico foram mantidas de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT
2007) A anaacutelise histoloacutegica dos fiacutegados mostrou no experimento 1 (sem
vii
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo) na concentraccedilatildeo de 56microgL de Thiodanreg a menor
intensidade (010plusmn00) da reaccedilatildeo ao PAS no citoplasma dos hepatoacutecitos quando
comparada ao grupo controle (133plusmn051) No entanto houve diferenccedila (Plt005) nesse
mesmo experimento quando comparado com as concentraccedilotildees 115microgL (266plusmn081) e
23microgL (300plusmn00) caracterizando depleccedilatildeo de glicogecircnio Aleacutem disso houve
alteraccedilotildees do diacircmetro de nuacutecleos e citoplasma dos hepatoacutecitos nos diferentes
experimentos e maior quantidade de nuacutecleos de hepatoacutecitos nos grupos expostos ao
Thiodanreg associada com a reduccedilatildeo na quantidade de citoplasma O Iacutendice de Alteraccedilatildeo
Histoloacutegica (IAH) dos lambaris coletados manteve-se entre 433 a 833 (para os grupos
controles) 1850 a 2883 (para as concentraccedilotildees de 115microgL) 2033 a 2833 (para as
concentraccedilotildees de 23microgL) e 2366 a 2766 (para as concentraccedilotildees de 56microgL) Os
lambaris coletados nos diferentes experimentos apresentaram valores de IAH para os
grupos controle inferiores (Plt005) aos grupos expostos Estes resultados demonstraram
que o Thiodanreg pode estar influenciando as funccedilotildees hepaacuteticas pela maior mobilizaccedilatildeo
das reservas de glicogecircnio na concentraccedilatildeo 56microgL As alteraccedilotildees observadas nos
fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas sendo alteraccedilotildees de estaacutedio I e II indicando
dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico nos diferentes grupos e experimentos Nos ovaacuterios
percebeu-se que a accedilatildeo do Thiodanreg em niacuteveis subletais natildeo afetou a morfologia dos
diferentes estaacutedios de desenvolvimento folicular Poreacutem os experimentos com
aclimataccedilatildeo demonstraram alteraccedilotildees nas quantidades de foliacuteculos primaacuterios e
secundaacuterios quando comparados com os peixes dos experimentos sem aclimataccedilatildeo
Aleacutem disso houve aumento do nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos e diacircmetro dos foliacuteculos
secundaacuterios nos grupos expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos Estes
resultados sugerem mecanismos compensatoacuterios da perda reprodutiva quando em meio
com condiccedilotildees desfavoraacuteveis As anaacutelises imunoistoquiacutemicas demonstraram marcaccedilatildeo
crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento folicular para integrina β1 e
colaacutegeno tipo IV Entretanto a caspase 3 foi observada somente no complexo folicular
de foliacuteculos secundaacuterios mesmo quando os peixes satildeo expostos a diferentes
concentraccedilotildees de Thiodanreg o que confirma a integridade das ceacutelulas foliculares e da via
apoptoacutetica caspase-3-dependente a qual pode estar sendo ativada para futuros processos
de regressatildeo folicular
viii
ABSTRACT
MARCON Lucas D Sc Universidade Federal de Viccedilosa December 2013 Effects of Thiodanreg in liver and ovaries in advanced maturation of the lambari Astyanax bimaculatus Advisor Laeacutercio dos Anjos Benjamin Co-advisors Ann Honor Mounteer and Marlene Isabel Vargas Viloria
The pesticide Thiodanreg (350gL-1 of endosulfan) is an organochlorine insecticide used
in various monocultures that may reach aquatic ecosystems and affect reproduction and
the health of fish populations The liver is a major organ for the biotransformation of
many xenobiotics and it can be damaged if the fish are exposed to a high level of
chemical substances The fish ovaries have oocytes at different stages of development
that are surrounded by zona radiata follicular basal membrane and teca cells to form the
follicular complex Stressor products may cause an increase or decrease in the diameter
of the secondary follicles vitellogenic depletion a change the number of follicles at
different stages of development and an increase the incidence of atresia The present
study aimed to evaluate the effects of Thiodanreg on the liver and ovaries of Astyanax
bimaculatus through morphological morphometric and immunohistochemistry analysis
The groups of fish were exposed to the toxic substances divided in four experiments
without adaptation and no feeding feeding without adaptation with adaptation and no
feeding with adaptation and feeding All experiments used three different
concentrations of Thiodanreg lower than the LC50 of 1367 microgL-1 previously determined
in the laboratory in accordance with the Brazilian Standard Regulation - NBR 15088
(ABNT 2007) The concentrations used in each experiment were 115 23 and 56
microgL-1 and a control group with three repetitions using ten fish in each aquarium After
96h six fish from each group were captured and anesthetized with benzocaine
(110000) according to the norms of the Ethics Committee of the Veterinary
DepartmentUFV (protocol 242009) Livers and ovaries were collected and processed
by histological techniques The slides were examined under the light microscope
Olympus CX31 Were obtained digital images of 10 random fields per animal at 20X
and 40X objective for evaluation The characteristics of the water used in acute tests
were maintained in a stable system in accordance to the recommendations of NBR
15088 (ABNT 2007) In the experiment 1 (without adaptationno feeding) at the
concentration of 56 mgL-1 of Thiodanreg (010 plusmn 00) the intensity of the PAS reaction
was lower in the cytoplasm of hepatocytes when compared to the control group (133 plusmn
ix
051) In the same experiment differences in glycogen depletion were (Plt005) when
compared to the concentrations 115 gL-1 (266 plusmn 081) and 23 gL-1 (300 plusmn 00) In
addition changes in the diameter of nuclei and cytoplasm of hepatocytes in all
experiments were observed and an increase in the number of hepatocyte nuclei in
groups exposed to Thiodanreg was associated with a reduction in the amount of
cytoplasm However the IHA was maintained between 433 to 833 (control group)
1850 to 2883 (115 mgL-1 group) 2033 to 2833 (23 gL-1 group) and 2366 to 2766
(56 gL-1 group) These results suggest that Thiodanreg may be influencing liver
functions to increase glycogen mobilization according to higher concentrations of
exposition The changes observed in the livers of A bimaculatus were not severe
classified as stage I and II that indicate repairable damage to liver tissue in all
experiments It was observed in the ovaries that the action of Thiodanreg in sublethal
levels did not affect (Plt005) the morphology of the different stages of follicle
development However the experiments demonstrated an adaptation response in the
number of primary and secondary follicles compared to fish without adaptation In
addition there was a growing incidence of atretic follicles and increased diameter of the
secondary follicles in the groups exposed to Thiodanreg in all experiments These results
suggest an adaptive response to offset reproductive loss where in unfavorable
conditions The immunohistochemical analysis showed increasing and uniform labeling
throughout the follicular development for integrin β1 and collagen type IV However
caspase 3 was observed only in the secondary ovarian follicular complex even when
fish were exposed to different concentrations of Thiodanreg which characterizes the
integrity of follicular cells and the apoptotic pathway-dependent caspase-3 which may
be activated for future follicular regression
1
1 INTRODUCcedilAtildeO GERAL
11 O uso de agrotoacutexicos
Agrotoacutexicos satildeo produtos e agentes de processos fiacutesicos quiacutemicos ou bioloacutegicos
destinados ao uso nos setores de produccedilatildeo no armazenamento e beneficiamento de
produtos agriacutecolas nas pastagens na proteccedilatildeo de florestas nativas ou implantadas e de
outros ecossistemas e tambeacutem de ambientes urbanos e industriais cuja finalidade eacute
preservaacute-los da accedilatildeo danosa de seres vivos considerados nocivos (Lei Federal 7802 de
110789) Os agrotoacutexicos satildeo importantes na agricultura todavia exigem precauccedilatildeo no
seu uso visando a proteccedilatildeo dos operaacuterios que os manipulam e aplicam dos
consumidores dos animais de criaccedilatildeo de abelhas peixes de organismos predadores e
parasitas e enfim do meio ambiente
Certas praacuteticas agriacutecolas ligadas ao modelo de produccedilatildeo agriacutecola como o uso
excessivo e inadequado de agrotoacutexicos a destruiccedilatildeo da cobertura vegetal dos solos para
plantio a natildeo preservaccedilatildeo das matas ciliares e das vegetaccedilotildees protetoras de nascentes
dentre outros fatores satildeo responsaacuteveis por grande parte dos problemas com os recursos
hiacutedricos (Matuo 1990)
Os inseticidas constituem importante grupo de praguicidas para o uso agriacutecola
que ano apoacutes ano mostra um aumento progressivo em seu uso na Ameacuterica do Sul
Estes nas uacuteltimas deacutecadas comeccedilaram a substituir inclusive o trabalho mecacircnico e
manual dos agricultores Ruumlegg et al (1987) e Tomita amp Beyruth (2002) relatam que o
modelo de agricultura adotado no Brasil baseia-se no uso de agrotoacutexicos Estes
compostos satildeo empregados haacute muito tempo e a partir da 2deg guerra mundial passaram a
ser mais intensamente utilizados
Nos uacuteltimos 40 anos a agricultura brasileira sofreu inuacutemeras e profundas
transformaccedilotildees que alteraram tanto a composiccedilatildeo das culturas como os processos de
produccedilatildeo e padrotildees tecnoloacutegicos ateacute entatildeo em vigor Ruumlegg et al (1987) enfatizam que
o processo de modernizaccedilatildeo entendido como uma seacuterie de transformaccedilotildees tecnoloacutegicas
nos processos produtivos intensificou o emprego de insumos como maacutequinas
fertilizantes e agrotoacutexicos que contam com preccedilos favoraacuteveis e estiacutemulos como creacutedito
farto a juros subsidiados que facilitaram sua ampla adoccedilatildeo no meio rural Assim
agrotoacutexicos tecircm sido amplamente utilizados como uma das principais ferramentas para
um bom programa de controle de plantas daninhas em culturas que tecircm ganhado espaccedilo
na balanccedila comercial agriacutecola brasileira (Rodrigues amp Almeida 2005) O emprego dos
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agrotoacutexicos tornou-se de uso rotineiro principalmente pelo menor custo e maior
eficiecircncia de controle das plantas daninhas quando comparados aos demais meacutetodos
convencionais de controle Para Rosa (1998) o modelo baseado no uso intensivo de
insumos quiacutemicos de sementes melhoradas e mecanizaccedilatildeo foi denominado ldquoRevoluccedilatildeo
Verderdquo que na deacutecada de 1980 trouxe ao Brasil um novo alento em relaccedilatildeo agrave
produtividade com grandes esperanccedilas de colheitas fartas e novas tecnologias que
propiciaram o domiacutenio de aacutereas pouco exploradas como por exemplo o cerrado da
Regiatildeo Centro-Oeste De fato muitas destas expectativas se realizaram entretanto o
impacto ambiental resultante implicou custos muitas vezes irremediaacuteveis como por
exemplo a perda de biodiversidade e a exaustatildeo de vaacuterios cursos drsquoaacutegua por
assoreamento aleacutem de contaminaccedilatildeo
12 Tipos de inseticidas
Os inseticidas satildeo classificados em quatro categorias conforme sua foacutermula
quiacutemica organoclorados carbamatos organofosforados e piretroides Os
organoclorados satildeo produtos sinteacuteticos que possuem carbono cloro e hidrogecircnio em sua
estrutura quiacutemica Satildeo persistentes no meio ambiente por vaacuterios anos e pouco soluacuteveis
em aacutegua Esses inseticidas quando mal administrados tecircm accedilatildeo toacutexica para diversos
mamiacuteferos sendo sua accedilatildeo natildeo sistecircmica neurotoacutexica e mutagecircnica (Guedes 1990
Pereira et al 2012) Os carbamatos satildeo inseticidas considerados menos persistentes e
com degradaccedilatildeo raacutepida no meio ambiente natildeo satildeo bioacumulados pouco lipofiacutelicos
satildeo sistecircmicos em plantas e inibidores da acetilcolinesterase (Guedes 1990 Ware
1994 Chatterjee et al 2001) Os organofosforados satildeo outro grupo de inseticida
amplamente utilizado no mercado mundial representando 355 do uso na uacuteltima
deacutecada Esses inseticidas caracterizam-se por pouca solubilidade em aacutegua (mais
soluacuteveis do que os organoclorados) toxicidade variaacutevel em animais vertebrados em
alguns animais e plantas tecircm atividade sistecircmica baixa persistecircncia no ambiente e
facilmente degradados por enzimas e fatores quiacutemicos A accedilatildeo desses toacutexicos eacute
semelhante ao carbamato agindo nas vias sinaacutepticas dos axocircnios inibindo a
acetilcolinesterase (Ware 1994 Albinati et al 2009) O piretroide tambeacutem eacute um
inseticida amplamente utilizado na agricultura representando 21 do mercado mundial
na uacuteltima deacutecada O fator positivo do uso desse pesticida eacute que ele eacute muito toacutexico para
insetos e apresenta baixa toxicidade para mamiacuteferos satildeo fotoestaacuteveis com degradaccedilatildeo
raacutepida no solo A accedilatildeo toacutexica desse inseticida eacute semelhante aos primeiros inseticidas
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desenvolvidos como o organoclorado DDT possuindo accedilatildeo neurotoacutexica nos axocircnios
(Naumann 1990 Ware 1994 Haverinen amp Vornanen 2014)
Nos uacuteltimos anos aumentou muito a diversidade de inseticidas visando a morte
de insetos e a persistecircncia do agrotoacutexico por periacuteodos curtos por questotildees de seguranccedila
ao meio ambiente Aleacutem desses inseticidas que foram mencionados acima existem
vaacuterios inseticidas organossinteacuteticos e inseticidas naturais de origem vegetal animal e
microbiana (Casida amp Quistad 1998 Ishaaya amp Horowitz 1998 Drevnick et al 2006)
13 Inseticidas no meio ambiente rotas de entrada
Os inseticidas podem entrar no meio ambiente acidental ou deliberadamente A
entrada acidental do inseticida origina-se de rejeitos industriais urbanos vazamentos
durante transporte armazenamento e distribuiccedilatildeo enquanto a entrada deliberada ocorre
pela aplicaccedilatildeo de inseticidas no meio rural e urbano As contaminaccedilotildees por agrotoacutexicos
podem contaminar solos e ateacute mesmo a atmosfera Nesse uacuteltimo a movimentaccedilatildeo do
toacutexico se daacute por meio de gotas partiacuteculas soacutelidas e gases que acabam sendo
transportados por longas distacircncias a partir do local de origem da aplicaccedilatildeo (Walker et
al 1996)
O transporte e destino dos agrotoacutexicos no ambiente aquaacutetico eacute ponto de
discussatildeo Murty (1988) descreveu que os agrotoacutexicos entram no ambiente aquaacutetico por
meio da aplicaccedilatildeo intencional implemento aeacutereo escoamento das aplicaccedilotildees ou
liberaccedilatildeo acidental A descarga dos resiacuteduos da manufatura de agrotoacutexicos constitui a
segunda maior fonte de contaminaccedilotildees dos corpos de aacutegua O efeito mais draacutestico eacute
esperado no ponto de liberaccedilatildeo em lagos e pequenos mares internos Os efeitos nos
oceanos eacute pequeno devido ao grande volume de aacutegua e accedilatildeo de correntes (Walker et al
1996)
Na rota de transporte bioloacutegico o sistema natildeo eacute muito importante em termos de
magnitude pela quantidade do xenobioacutetico acumulado quando comparado com fatores
mencionados acima (transporte abioacutetico) mas eacute importante para o homem e vida
silvestre O padratildeo do transporte bioloacutegico dos toacutexicos acumulados nos organismos
segue da seguinte forma herbiacutevoros carniacutevoros e pisciacutevoros (maior eficiecircncia de
acuacutemulo) Nesses uacuteltimos particularmente as espeacutecies de ambientes aquaacuteticos a
acumulaccedilatildeo e magnificaccedilatildeo satildeo maiores do que nas espeacutecies de ambiente terrestre
devido agrave lipofilicidade dos inseticidas particularmente os organoclorados Duas rotas de
entrada podem comprometer a toxicidade dos organismos aquaacuteticos absorccedilatildeo ou
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ingestatildeo A bioconcentraccedilatildeo vai ser mais intensa no ambiente aquaacutetico pois a difusatildeo
dos poluentes na aacutegua aumenta a eficiecircncia de sua absorccedilatildeo pelo organismo aquaacutetico
devido agrave lipofilicidade dos organoclorados Dessa forma a transferecircncia ao longo de
cadeias alimentares eacute tambeacutem mais eficiente e a bioconcentraccedilatildeo acontece em todas as
suas etapas Devido a isso os efeitos em predadores podem ser seacuterios pois aleacutem de
grande bioconcentraccedilatildeo e transferecircncia pela cadeia alimentar alguns destes organismos
como aves que se alimentam de peixes e animais marinhos como focas e cetaacuteceos satildeo
deficientes no metabolismo de desintoxicaccedilatildeo particularmente devido ao sistema de
monoxigenases pouco desenvolvido comprometendo mais a toxicidade por
biomagnificaccedilatildeo (Barron 1995 Borgaacute et al 2004)
Aleacutem da bioconcentraccedilatildeo os resiacuteduos destas substacircncias presentes nas aacuteguas
podem ser aderidos ao material orgacircnico em suspensatildeo depositar-se no sedimento ou
serem absorvidos pelos organismos Assim peixes e invertebrados podem bioacumular
tais compostos ligados agrave mateacuteria ingerida ser passivamente absorvidos pela superfiacutecie
corporal ou durante as trocas respiratoacuterias (Vasconcellos amp Verani 2000 Henry amp
Kishimba 2006)
14 Avaliaccedilatildeo de sensibilidade e estudos de toxicidade aquaacutetica
A realizaccedilatildeo de testes de sensibilidade eacute recomendada como meacutetodo de
qualidade dos planteis de organismos cultivados Nestes testes satildeo utilizadas
substacircncias de referecircncias que incluem principalmente os sais dicromato de potaacutessio
cloreto de potaacutessio e cloreto de soacutedio Estes dois uacuteltimos satildeo mais recomendados pois
seus efluentes experimentais oferecem baixo risco de contaminaccedilatildeo ambiental Os testes
de sensibilidade geralmente satildeo de curta duraccedilatildeo (24 horas) e devem ser repetidos com
frequumlecircncia principalmente nos laboratoacuterios que mantecircm planteis de organismos-testes
pois estes dados servem como padratildeo na sensibilidade natural dos organismos Esta
teacutecnica vem sendo utilizada para avaliar os resultados de toxicidade pois a accedilatildeo toacutexica
somente poderaacute ser atribuiacuteda agrave substacircncia teste quando a sensibilidade natural dos
organismos natildeo tiver demonstrado qualquer alteraccedilatildeo ao longo do periacuteodo em que
foram testados (Ranzani-Paiva et al 2004)
O estudo dos efeitos de agentes toacutexicos sobre a vida aquaacutetica pode ser realizado
por meio de ensaios bioloacutegicos na natureza ou em condiccedilotildees laboratoriais controladas
sendo este uacuteltimo os mais utilizados por permitirem um controle mais efetivo de fatores
ocasionais como temperatura pH duraccedilatildeo de exposiccedilatildeo meio concentraccedilatildeo Ao se
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avaliar a toxicidade de agentes toacutexicos ou misturas destes frente a um reativo bioloacutegico
geralmente se utiliza uma populaccedilatildeo homogecircnea possuindo uma sensibilidade definida
determinando-se a concentraccedilatildeo responsaacutevel por um efeito toacutexico (efeito letal subletal
crocircnico imobilizaccedilatildeo ou modificaccedilatildeo do comportamento entre outros) Estes testes
podem ser realizados utilizando-se sistemas de fluxo contiacutenuo semi estaacuteticos ou
estaacuteticos Quanto ao meio pode-se utilizar meio aquaacutetico do tipo aacutegua continental (aacutegua
dura rica em bicarbonatos e sulfatos dissolvidos ou aacutegua mole isenta de iacuteons caacutelcio e
magneacutesio) marinha ou salobra segundo as necessidades dos organismos avaliados
(CETESB 2008) Com relaccedilatildeo ao organismo-teste por razotildees teacutecnicas e econocircmicas eacute
impossiacutevel testar todas as espeacutecies que fazem parte do ecossistema aquaacutetico Assim
para esses estudos satildeo relacionados normalmente os organismos mais representativos
de cada niacutevel troacutefico na cadeia alimentar como algas microcrustaacuteceos e peixes
15 Caracterizaccedilatildeo do agrotoacutexico Thiodanreg
O endosulfan inseticida desenvolvido pela Hoechst Aktiengesellschaft na
Alemanha foi introduzido no mercado em 1957 com o nome comercial de Thiodan
(Goebel et al 1982 e Stumpf amp Abhaver 1986) O Thiodanreg eacute um inseticida acaricida
organoclorado do grupo quiacutemico eacutester do aacutecido sulfuroso de um diol ciacuteclico Esse
agrotoacutexico eacute classificado toxicologicamente como altamente toacutexico (Classe I)
classificaccedilatildeo ambiental como produto altamente perigoso aleacutem de inflamaacutevel e
corrosivo (Engelhardt amp Sarmento 2008)
O ingrediente ativo do Thiodanreg (350 gL de endosulfan) consiste na mistura de
dois isocircmeros sendo 70 de α-endosulfan e 30 de β-endosulfan Entre os produtos
derivados do metabolismo do endosulfan em mamiacuteferos o sulfato de endosulfan eacute o
principal metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica (Stumpf amp Abhaver 1986)
Os organoclorados como o Thiodanreg atuam nos canais de soacutedio do axocircnio
aumentando o periacuteodo de abertura destes canais O aumento do periacuteodo de abertura dos
canais de soacutedio leva a um aumento do fluxo de soacutedio para o interior da membrana e
acarretando um prolongamento da fase de despolarizaccedilatildeo apoacutes o pico do potencial de
accedilatildeo e devido a isso o inseto morre por hiperexcitaccedilatildeo Consequentemente a
propagaccedilatildeo contiacutenua do impulso nervoso gera tremores convulsotildees prostraccedilatildeo e
posteriormente a morte como observados em insetos Aleacutem disso pode afetar qualquer
tipo de crustaacuteceo peixes e mamiacuteferos inclusive em baixas concentraccedilotildees (Eto 1990
Pereira et al 2012)
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16 O uso do endosulfan
O endosulfan eacute o uacutenico inseticida organoclorado amplamente utilizado em todo
o mundo (Capkin et al 2006 Chakrabarty et al 2012) Segundo a empresa Bayer
(2010) fabricante do produto o Thiodanreg (endosulfan) eacute um inseticida para o controle
de insetos chupadores e mastigadores com accedilatildeo de contato e ingestatildeo Recomenda-se
seu uso especialmente em cultivos de cafeacute cana hortaliccedilas frutas vinhas e forragens
Adverte tambeacutem que natildeo se devem colher frutos ou vegetais tratados ateacute 21 dias apoacutes a
uacuteltima aplicaccedilatildeo
No Brasil segundo Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) a
importaccedilatildeo do endosulfan estaacute proibida a partir de julho de 2012 e sua utilizaccedilatildeo a partir
de 2013 (Molina 2010) A utilizaccedilatildeo de produtos agrave base de endosulfan no Brasil eacute
estimada em 44 milhotildees de toneladas em uma aacuterea de 22 a 36 milhotildees de hectares
podendo representar cerca de 40 do consumo mundial deste organoclorado segundo
dados do Programa Ambiental das Naccedilotildees Unidas (UNEP 2010) Segundo a Agecircncia
de Proteccedilatildeo Ambiental norte americana (EPA 1980) contaminaccedilotildees humanas por
endosulfan satildeo provenientes em 53 dos casos da ingestatildeo de aacutegua contaminada e em
47 dos casos do consumo de alimentos a base de peixes contaminados A mesma
agecircncia define como CL50 aguda valores de 017microgL-1 para truta arco-iacuteris e 740microgL-1
para Daphnia magna
A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em
consideraccedilatildeo a qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente
Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm 3572007 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo
do referido inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
17 Toxicidade aguda do endosulfan
O endosulfan apesar de pertencer agrave classe toxicoloacutegica I eacute altamente toacutexico
para animais aquaacuteticos e terrestres (espeacutecies natildeo alvo) e segundo a Agency for Toxic
Substances and Disease Registry - ATSDR (2000) possui de moderado a alto risco e
efeitos agudos e crocircnicos
Pinheiro et al (1998) advertem com veemecircncia sobre o perigo de contaminaccedilatildeo
do Pantanal e da Amazocircnia lugares ricos em recursos hiacutedricos por produtos agrave base de
endosulfan pois este produto eacute extremamente toacutexico para peixes e outros organismos
aquaacuteticos mesmo em doses muito pequenas O endosulfan natildeo dissolve facilmente na
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aacutegua e adere agraves partiacuteculas do solo levando anos para sua degradaccedilatildeo (Soares et al
2003)
18 Efeitos dos inseticidas organoclorados sobre peixes
Apesar dos mecanismos de toxicidade do endosulfan serem extensivamente
estudados alguns trabalhos foram conduzidos com o objetivo de se avaliar efeitos
histopatoloacutegicos dos agrotoacutexicos em peixes (Naqvi amp Vaishnavi 1993) especialmente
nas gocircnadas fiacutegados bracircnquias e rins Em um desses estudos Capkin et al (2006)
reportaram uma CL50 de 1978 gL para Oreochromis mikyss para 24 horas de
exposiccedilatildeo ao toacutexico o que causou aleacutem da morte de 50 dos animais convulsotildees nado
erraacutetico edema e separaccedilatildeo das lacircminas branquiais edema e necrose do fiacutegado dos
tuacutebulos renais e do tecido hematopoieacutetico Cengiz et al (2001) reportaram lesotildees
similares em bracircnquias do peixe-mosquito Gambusia affinis aleacutem de congestatildeo e
hipertrofia do fiacutegado com o uso do pesticida Thiodanreg Segundo Capkin et al (2006)
alcalinidade e temperatura da aacutegua aleacutem do tamanho dos peixes afetam a toxicidade do
endosulfan Assim peixes pequenos e meacutedios mantidos em temperatura de 131ordmC com
1978 microgL do toacutexico tiveram uma sobrevivecircncia de 25 e 425 respectivamente
enquanto os peixes grandes tiveram 100 de sobrevivecircncia Quando a temperatura da
aacutegua foi aumentada para 16ordmC nenhum dos peixes pequenos e meacutedios sobreviveu
enquanto os sobreviventes de peixes grandes diminuiacuteram para 775 O aumento da
alcalinidade de 198 mgL para 419 mgL ou superior aumentou (Plt0001) a
sobrevivecircncia dos peixes Em relaccedilatildeo agrave dureza entre 357 mgL e 126 mgL a
sobrevivecircncia dos peixes expostos ao endosulfan natildeo foi afetada Histologicamente as
bracircnquias dos peixes tiveram edema lamelar separaccedilatildeo do epiteacutelio das lamelas fusatildeo
lamelar e hipertrofia das ceacutelulas epiteliais Os fiacutegados apresentaram edemas e necroses
graves
Cengiz amp Uumlnluuml (2002) estudaram os efeitos crocircnicos do endosulfan sob as
bracircnquias nas concentraccedilotildees de 05 e 075 microgL ao longo de 30 dias de experimento O
que se comprovou eacute que a dose mais elevada do endosulfan causou mais mudanccedilas
patoloacutegicas que a menor dose Altinok amp Capkin (2007) natildeo verificaram alteraccedilatildeo
morfoloacutegica nas bracircnquias de truta com 21 dias de exposiccedilatildeo de metiocarb entretanto
uma concentraccedilatildeo superior (375 mgL) causou separaccedilatildeo epitelial das bracircnquias No
mesmo trabalho os peixes expostos ao endosulfan com concentraccedilotildees de 06 e 13 microgL
mostraram mudanccedilas morfoloacutegicas nas bracircnquias como desprendimento do epiteacutelio
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aparecimento de granuloacutecitos nas lamelas fusatildeo e necrose lamelar hipertrofia e nuacutecleos
picnoacuteticos Essas evidecircncias comprovam o efeito do endosulfan com comprometimento
das bracircnquias levando a reduccedilatildeo do consumo de oxigecircnio e desregulaccedilatildeo da funccedilatildeo de
osmorregulaccedilatildeo em organismos aquaacuteticos Aleacutem disso os efeitos toacutexicos do endosulfan
no fiacutegado induziram modificaccedilotildees estruturais como hipertrofia dos hepatoacutecitos nuacutecleos
picnoacuteticos e necroses
No trabalho de Ballesteros et al (2007) que utilizaram peixes adultos da espeacutecie
Jenynsia multidentata os testes de toxicidade foram realizados durante 96 horas a fim
de determinar a concentraccedilatildeo letal (CL50) do endosulfan As alteraccedilotildees histoloacutegicas
foram determinadas nas bracircnquias e nos fiacutegados A CL50-96 horas foi significativamente
diferentes entre machos (0719 μgL) e fecircmeas (1317 μgL) A diferenccedila entre os sexos
foi atribuiacuteda ao dimorfismo no teor de lipiacutedios no sexo feminino (216) e masculino
(179) As alteraccedilotildees histoloacutegicas nas bracircnquias incluiacuteram hipertrofia e levantamento
do epiteacutelio das lamelas secundaacuterias e aneurismas Essas alteraccedilotildees causaram um
aumento significativo da espessura da lamela secundaacuteria no grupo tratado em relaccedilatildeo
aos peixes do grupo-controle Finalmente as alteraccedilotildees histoloacutegicas reversiacuteveis como
degeneraccedilatildeo hidroacutepica e dilataccedilotildees dos sinusoides foram observadas nos fiacutegados dos
peixes expostos bem como mudanccedila irreversiacutevel como necrose nas concentraccedilotildees
mais elevadas O fiacutegado eacute um oacutergatildeo importante na capacidade de degradar compostos
toacutexicos mas os seus mecanismos de regulaccedilatildeo podem ser comprometidos em
concentraccedilotildees elevadas causando mudanccedilas estruturais como observadas nesses
trabalhos
A qualidade da aacutegua eacute um fator importante para o sucesso da reproduccedilatildeo dos
peixes Quando a qualidade da aacutegua eacute alterada devido a produtos quiacutemicos a estrutura
histoloacutegica das gocircnadas tambeacutem eacute alterada Para Cengiz et al (2001) os efeitos do
Thiodanreg (endosulfan) satildeo tempo e dose dependentes Dutta et al (2006) descreveram
num estudo de toxicidade crocircnica as injuacuterias causadas pelo Thiodanreg sobre os tuacutebulos
seminiacuteferos do peixe ldquobluegillrdquo Lepomis macrochirus e relataram alteraccedilatildeo dos tuacutebulos
seminiacuteferos que mostraram perda dos padrotildees normais de organizaccedilatildeo celular
diminuindo tambeacutem o diacircmetro das espermatogocircnias primaacuterias gradativamente desde as
primeiras 24 horas de exposiccedilatildeo ateacute as duas semanas seguintes Segundo os autores este
tipo de dano pode afetar as espermaacutetides e os espermatozoides apresentando no final
um impacto negativo na espermatogecircnese e fertilidade do macho comprometendo o
nuacutemero da populaccedilatildeo do ldquobluegillrdquo Lepomis macrochirus Em outro trabalho sobre
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reproduccedilatildeo Hazarika amp Das (1998) identificaram mudanccedilas estruturais nos ovaacuterios de
Heteropneustes fossilis exposto ao organoclorado lindano por 72 horas Os resultados
demonstraram que houve ruptura e diminuiccedilatildeo do tamanho dos foliacuteculos maduros
afetando a fertilidade dos peixes
19 O lambari Astyanax bimaculatus
O lambari Astyanax bimaculatus (Linnaeus 1758) eacute conhecido popularmente
pelos nomes de lambari piaba lambari-guaccedilu mojarra pertence agrave famiacutelia Characidae
ordem Characiformes e ateacute entatildeo uma das espeacutecies da subfamiacutelia Tetragonopterinae
(CEMIGCETEC 2000) No entanto revisotildees recentes colocam o gecircnero em ldquoIncertae
sedisrdquo com 88 gecircneros e 620 espeacutecies sendo que 86 espeacutecies pertencem ao gecircnero
Astyanax (Lima et al 2003)
O A bimaculatus eacute um peixe de pequeno porte atingindo aproximadamente 20
cm de comprimento e pesando ateacute 40 gramas Possui corpo irregularmente eliacuteptico com
nadadeiras amarelas quatro a cinco dentes na seacuterie externa e cinco na seacuterie interna do
preacute-maxilar escamas com reflexos prateados mancha umeral ovalada e peduacutenculo
caudal com mancha alongada que se prolonga ateacute a ponta dos raios caudais medianos
(Britiski et al 1988 CEMIGCETEC 2000)
O gecircnero Astyanax possui ampla distribuiccedilatildeo geograacutefica sendo encontrado
desde o sudoeste dos Estados Unidos ateacute a Bacia do rio da Prata (Moreira Filho 1989
citado por Pereira Filho 2000) Os lambaris satildeo encontrados em cabeceiras de riachos
rios e lagos e vivem sempre em cardumes realizando curtas migraccedilotildees na eacutepoca das
cheias para sua reproduccedilatildeo Em relaccedilatildeo ao periacuteodo reprodutivo dos lambaris este pode
variar conforme a espeacutecie e o habitat sendo normalmente de setembro a marccedilo
(Vazzoler amp Menezes 1992 citados por Pereira Filho 2000)
A biologia reprodutiva do lambari pode ser prejudicada pelo desmatamento
ciliar poluiccedilatildeo industrial e domeacutestica e destruiccedilatildeo de vaacuterzeas e lagoas marginais por
projetos agriacutecolas que tambeacutem constituem ameaccedila em vaacuterias regiotildees (CEMIGCETEC
2000) Esses fatores interferem na dinacircmica da populaccedilatildeo desses peixes
Os lambaris satildeo oniacutevoros se alimentando de algas vegetais sementes larvas e
insetos adultos (CEMIGCETEC 2000) Os lambaris satildeo de extrema importacircncia em
diversos habitats por equilibrarem o ecossistema e a cadeia alimentar constituindo fonte
de alimentos para peixes maiores espeacutecies carniacutevoras e aves Em estudo conduzido com
o lambari da espeacutecie Astyanax janeiroensis verificaram-se que os principais haacutebitos
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alimentares se baseavam em algas microcrustaacuteceos pequenos invertebrados e esporos
vegetais (Santin et al 2005) Diversos trabalhos relatam na literatura a importacircncia do
lambari na estrutura troacutefica do ecossistema e sua variaccedilatildeo alimentar diante de
modificaccedilotildees ambientais (Motta amp Uieda 1995 Suarez et al 1995 Esteves 1998)
Trabalho conduzido por Loureiro et al (1995) verificando a dieta alimentar na espeacutecie
Hoplias malabaricus (traiacutera) no reservatoacuterio da UHE de Segredo (PR) mostraram a
ingestatildeo alimentar preferencial de lambaris de diversas espeacutecies Em outro estudo
verificou-se a importacircncia do lambari como alimento para as espeacutecies Hoplias
malabaricus Oligosarcus longirostris e Rhamdia branneri apoacutes o represamento do
Reservatoacuterio de Salto Caxias (PR) demonstrando ser o alimento preferido dessas
espeacutecies (Novakoski 2007) Aleacutem disso na regiatildeo sudoeste do estado de Minas Gerais
existem representantes do gecircnero no Reservatoacuterio de Furnas (MG) caracterizando a
reproduccedilatildeo ao longo do ano para o equiliacutebrio da cadeia alimentar tendo importacircncia
econocircmica na alimentaccedilatildeo e tambeacutem na praacutetica de pesca profissional (Bazzoli et al
1998 Carvalho et al 2009) Portanto os lambaris satildeo de grande importacircncia em
diversos habitats como consumidores secundaacuterios (Esteves 1998) A ecologia alimentar
de uma determinada espeacutecie faz parte e interfere diretamente na dinacircmica de sua
populaccedilatildeo sendo primordial para a conservaccedilatildeo do ecossistema como um todo (Vitule
amp Aranha 2002)
110 Morfologia hepaacutetica em teleoacutesteos
O fiacutegado eacute um oacutergatildeo multifuncional responsaacutevel por uma das etapas do
processo de desenvolvimento folicular principalmente no periacuteodo de formaccedilatildeo dos
gloacutebulos de vitelo momento em que ocorre a transferecircncia de vitelogenina para o
ovaacuterio etapa fisioloacutegica que inicia nas ceacutelulas da teca e ceacutelulas foliculares com
produccedilatildeo do estradiol No fiacutegado o estradiol estimula os hepatoacutecitos a produzirem a
vitelogenina e careogenina que satildeo levadas pela corrente sanguiacutenea ateacute o ovaacuterio onde
participam da formaccedilatildeo do vitelo e zona radiata durante a maturaccedilatildeo folicular
(Senthilkumaran et al 2004) A produccedilatildeo de vitelogenina no fiacutegado pode variar entre as
espeacutecies de teleoacutesteos devido agraves diferenccedilas na capacidade de armazenamento de energia
condiccedilatildeo fisioloacutegica haacutebitos alimentares e contaminaccedilatildeo (Peyon et al 1996 Hull amp
Harvey 2001 Al -Ghais 2013 Silva Barni et al 2014) Aleacutem disso o fiacutegado eacute
responsaacutevel pela conversatildeo do alimento e desintoxicaccedilatildeo de substacircncias estranhas
(Selman amp Walace 1989 Ribeiro et al 2006)
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O fiacutegado eacute glacircndula digestiva que apresenta superfiacutecie
coberta por uma membrana serosa e o tecido conjuntivo de sua caacutepsula
invagina para o parecircnquima (Takashima amp Hibiya 1995) O fiacutegado de teleoacutesteos eacute
constituiacutedo por hepatoacutecitos ceacutelulas epiteliais dos ductos biliares ceacutelulas endoteliais
ceacutelulas que armazenam gordura (ceacutelulas de Ito) macroacutefagos e ceacutelulas sanguiacuteneas
circulantes (Hinton et al 1984) e em algumas espeacutecies observam-se ceacutelulas do
pacircncreas exoacutecrino (pacircncreas intra-hepaacutetico) distribuiacutedas entre o parecircnquima do oacutergatildeo
assim como descrito para o lambari (Santos et al 2013)
Estruturas lobulares e uma pequena veia central estatildeo presentes em vertebrados
em peixes estas estruturas variam dependendo da espeacutecie e satildeo geralmente obscuras
(Takashima amp Hibyia 1995) Os hepatoacutecitos arranjam-se em fileiras os quais
geralmente apresentam a espessura de duas ceacutelulas O hepatoacutecito possui um nuacutecleo
uacutenico embora ceacutelulas binucleadas possam ser observadas O nuacutecleo se localiza na
regiatildeo central ou no poacutelo celular voltado para o sinusoide e o nucleacuteolo eacute bem evidente
(Arana 1995) A circulaccedilatildeo no fiacutegado eacute realizada pela arteacuteria hepaacutetica veia porta aleacutem
de capilares sinusoides Existem cordotildees de hepatoacutecitos que se arranjam
concentricamente ao redor dos capilares sinusoides (Takashima amp Hibyia 1995)
As vias biliares satildeo formadas por canaliacuteculos biliares preacute-duacutectulo biliar duacutectulo
biliar e ducto biliar O canaliacuteculo biliar eacute formado pela membrana plasmaacutetica dos
hepatoacutecitos e os microvilos dos mesmos preenchem o luacutemen do canaliacuteculo Nos
hepatoacutecitos existem ceacutelulas preacute-ductulares que estabelecem complexos juncionais com
os hepatoacutecitos formando os preacute-duacutectulos biliares A transiccedilatildeo entre preacute-duacutectulo e
duacutectulo ocorre quando o lume biliar estaacute completamente circundado por ceacutelulas
epiteliais biliares O ducto biliar eacute formado por ceacutelulas epiteliais cuacutebicas nos ductos de
menor calibre e ceacutelulas colunares nos grandes ductos sendo a presenccedila de lacircmina basal
o fator diferenciador dos mesmos Nos grandes ductos circundando a lacircmina basal
estatildeo fibroblastos plexo capilar fibras nervosas e ceacutelulas musculares lisas Acredita-se
que estas ceacutelulas musculares promovam os movimentos peristaacutelticos impulsionando a
bile Esse ducto une-se ao ducto ciacutestico dando origem ao ducto coleacutedoco (Arana 1995)
O endoteacutelio eacute fenestrado e a lacircmina basal estaacute ausente No espaccedilo de Disse haacute
ceacutelulas de Ito que em teleoacutesteos se caracterizam por apresentar vesiacuteculas lipiacutedicas
assim como o mesmo tipo celular em mamiacuteferos (Arana 1995) Haacute algumas mudanccedilas
patoloacutegicas que podem ocorrer no fiacutegado de peixes que sofreram exposiccedilatildeo a toacutexicos ou
outras substacircncias irritantes dissolvidas na aacutegua A atrofia eacute caracterizada por
12
diminuiccedilatildeo do tamanho dos hepatoacutecitos com presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos Tambeacutem
podem ocorrer necrose degeneraccedilatildeo vacuolar degeneraccedilatildeo gordurosa estagnaccedilatildeo da
bile inflamaccedilatildeo do parecircnquima hepaacutetico (hepatites) cirrose hepaacutetica e
desenvolvimentos de tumores (Takashima amp Hibyia 1995)
111 Morfologia ovariana em teleoacutesteos
Os ovaacuterios das fecircmeas A bimaculatus seguem os padrotildees descritos para a
maioria dos teleoacutesteos sendo oacutergatildeos pares alongados e foliaacuteceos sofrendo
modificaccedilotildees na espessura volume e coloraccedilatildeo durante as diferentes fases do ciclo
reprodutivo conforme observado tambeacutem em outras espeacutecies do gecircnero (Drummond
1996 Miranda 1996 Melo et al 2005 Mazzoni et al 2005 Rodrigues amp Almeida
2005 Carvalho et al 2009 Prado et al 2011) Nesses peixes o ovaacuterio eacute do tipo
cistovariano onde o lume ovariano se estende ateacute o oviduto como na maioria dos
peixes teleoacutesteos (Nagahama 1983 Selman amp Wallace 1986 Connaughton amp Aida
1998)
Nas observaccedilotildees histoloacutegicas do ovaacuterio de A bimaculatus verificou-se que os
mesmos satildeo envolvidos externamente por uma serosa peritoneal constituiacuteda por
mesoteacutelio e lacircmina do tecido conjuntivo fibroso Profundamente a essa estrutura
observa-se tuacutenica albugiacutenea de natureza conjuntiva contendo fibroacutecitos e vasos
sanguiacuteneos A tuacutenica albugiacutenea emite septos para o interior do oacutergatildeo formando lamelas
ovuliacutegeras nas quais encontram-se ovogocircnias e foliacuteculos em diferentes fases de
desenvolvimento No lambari o tipo de desenvolvimento folicular eacute assincrocircnico com
a presenccedila de foliacuteculos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento (Miranda 1996
Drummmond 1996 Marcon 2008)
Em peixes o desenvolvimento folicular tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Begovac amp Wallace 1988 Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter
1996 Grier 2000 e 2002 Carvalho et al 2009) e como nos animais em geral
compreende os periacuteodos preacute-meioacutetico perinucleolar preacute-vitelogecircnico vitelogecircnico e
maturaccedilatildeo final Os foliacuteculos passam por diversas fases de desenvolvimento
diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo de acordo com o periacuteodo reprodutivo do animal (Wallace amp
Selman 1981) Essas fases ocorrem no interior de foliacuteculos cuja parede constituiacuteda de
zona radiata camada folicular membrana basal e teca (Grier 2000) desempenham um
importante papel durante a ovogecircnese e na fertilizaccedilatildeo
13
A foliculogecircnse eacute regulada hormonalmente pelo eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-
gocircnada Em peixes teleoacutesteos estiacutemulos ambientais satildeo convertidos em informaccedilotildees
sensoriais no ceacuterebro associados com a liberaccedilatildeo de hormocircnios liberadores de
gonadotropinas (GnRH) pelo hipotaacutelamo que via corrente sanguiacutenea chegam agrave
adenohipoacutefise que sintetiza e libera hormocircnios gonodotroacutepicos hormocircnio fociacuteculo
estimulante (FSH) e hormocircnio luteinizante (LH) Os hormocircnios FSH e LH se ligam aos
receptores celulares das ceacutelulas tecais (LH-R) e foliculares (LH-R e FSH-R) para
estimularem a produccedilatildeo 17α-hydroxy-pregnesterona (17α-HP) e testosterona (T) Nas
ceacutelulas foliculares os hormocircnios esteroides 17α-HP e T agem como precursor na
produccedilatildeo do 17β-estradiol (17β-E) e do hormocircnio indutor de maturaccedilatildeo (MIH)
substacircncias importantes nas etapas do desenvolvimento folicular e na ovulaccedilatildeo
respectivamente (Dietrich amp Krieger 2009) (Figura 1)
Figura 1 Ceacutelulas somaacuteticas do ovaacuterio e principais produtos (Adaptado de Dietrich amp Krieger 2009)
Muitas das espeacutecies nativas natildeo desovam espontaneamente em ambientes
lecircnticos Algumas espeacutecies nativas quando mantidas em cativeiro se preparam para a
reproduccedilatildeo mas natildeo desovam naturalmente e sofrem regressatildeo ovariana com
consequente atresia dos foliacuteculos A atresia folicular eacute um processo degenerativo de
ocorrecircncia comum nos ovaacuterios de vertebrados e os foliacuteculos podem sofrer atresia em
diferentes fases do desenvolvimento ou diferenciaccedilatildeo (Guraya 1986 Miranda et al
1999 Santos et al 2008b)
A ovulaccedilatildeo refere-se agrave expulsatildeo do foliacuteculo em desenvolvimento maduro
(Redding amp Patintildeo 1993) Na natureza a ovulaccedilatildeo eacute regulada por dois hormocircnios os
quais estimulam o desenvolvimento gonadal em peixes FSH e LH (Connaughton amp
Aida 1998 Klausen et al 2001) Estes hormocircnios gonadotroacutepicos agem nos oacutergatildeos
reprodutores promovendo o desenvolvimento e maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas O
14
processo de transporte dos hormocircnios para as ceacutelulas reprodutoras eacute lento em ambientes
naturais mas na reproduccedilatildeo artificial com a teacutecnica de hipofisaccedilatildeo esse processo
torna-se mais raacutepido em relaccedilatildeo ao processo natural (Woynarovich amp Horvath 1980)
Nos ovaacuterios de peixes teleoacutesteos com fertilizaccedilatildeo externa os foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios estruturas remanescentes da desova satildeo frequentes Um aspecto
interessante eacute saber a duraccedilatildeo da reabsorccedilatildeo dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios nos
procedimentos de desova induzida para as espeacutecies em criaccedilatildeo Drummond (1996) e
Marcon (2008) estudaram a reabsorccedilatildeo dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios no estroma
ovariano em maturaccedilatildeo avanccedilada de lambaris (A bimaculatus lacustris) e observaram
que cinco dias apoacutes a desova os foliacuteculos haviam sido reabsorvidos Durante esse
processo figuras de apoptose satildeo observadas em fecircmeas submetidas agrave hipofisaccedilatildeo
(Drummond et al 2000) o mesmo ocorrendo em Leporinus taeniatus (Anostomidae)
(Santos et al 2003) Santos et al (2008a) registraram por meio das teacutecnicas de TUNEL
e de imunoistoquiacutemica o iacutendice apoptoacutetico em ceacutelulas foliculares dos foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios em Prochilodus argenteus notando que o maior iacutendice de ceacutelulas
foliculares apoptoacuteticas coincidiu com menores valores de integrinas e colaacutegeno tipo IV
no terceiro dia apoacutes a desova induzida Esses achados demonstram a importacircncia dessas
proteiacutenas na integridade das ceacutelulas foliculares nos foliacuteculos
15
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do inseticida organoclorado
endosulfan em sua apresentaccedilatildeo comercial Thiodanreg sobre as caracteriacutesticas
morfoloacutegicas dos ovaacuterios e fiacutegado de fecircmeas adultas de lambaris A bimaculatus apoacutes
exposiccedilatildeo subletal a esse agrotoacutexico durante a maturaccedilatildeo avanccedilada
22 Objetivos especiacuteficos
Estimar a CL50 para fecircmeas adultas de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada
expostas ao inseticida organoclorado Thiodanreg
Avaliar histopatologicamente o fiacutegado dos animais dos grupos controles e tratados
Analisar por morfometria os principais constituintes celulares do fiacutegado nos grupos
controles e tratados
Avaliar diferenccedilas nos valores dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS) e
hepatossomaacutetico (IHS) de animais dos grupos controles e expostos ao toacutexico
Verificar provaacuteveis alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos diferentes estaacutedios de
desenvolvimento de foliacuteculos ovarianos nos grupos submetidos aos efeitos do
toacutexico utilizando-se microscopia de luz
Quantificar os diferentes tipos de foliacuteculos e avaliar por morfometria os diacircmetros
dos foliacuteculos vitelogecircnicos nos grupos controles e tratados
Avaliar e quantificar o processo de atresia folicular nos grupos controles
comparando-os com os grupos tratados
Analisar qualitativamente por imunoistoquiacutemica as proteiacutenas de adesatildeo celular
(integrina β1 e colaacutegeno do tipo IV) nas ceacutelulas foliculares ao longo do
desenvolvimento folicular nos peixes dos grupos controles e tratados e
16
Analisar qualitativamente por imunoistoquiacutemica a proteiacutena caspase 3 nas ceacutelulas
foliculares ao longo do desenvolvimento folicular nos peixes dos grupos controles e
tratados
17
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade Federal
de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste de toxicidade aguda e o teste subletal quanto
as atividades de coleta fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos fiacutegados As etapas de
microtomia coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e
morfomeacutetricas foram realizadas nos Laboratoacuterios de Peixes e de Histopatologia do
Departamento de Veterinaacuteria da UFV (DVTUFV)
31 Animais
Foram utilizadas fecircmeas do lambari A bimaculatus mantidas em tanques de terra
na Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso (g) de 1152 plusmn 201 e comprimento total (cm)
de 912 plusmn 064 As caracteriacutesticas para a escolha dos animais se basearam em aspectos
corporais como ventre abaulado poro genital dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV Os
aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuem capacidade de 50 litros numa
densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro
temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam
um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo contiacutenua de aacutegua para garantir o bem-estar
dos peixes (Figura 2) Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial Purina
contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas de
acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de 255
plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza total
2815 plusmn 594 mgL-1 (CaCO3)
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
18
Figura 2 Principais componentes estruturais dos grupos experimentais (Adaptado de Oliveira Ribeiro et al 2002)
A Bomba para oxigenaccedilatildeo da aacutegua B Termostato para controle da temperatura D Filtro interno L Material contra isolamento de ruiacutedo H-J Trecircs aquaacuterios para cada grupo experimental (Controle e e cada uma das concentraccedilotildees de Thiodanreg )
Os lotes de peixes (120 peixes em cada lote) foram destinados agrave accedilatildeo do toacutexico em
quatro tratamentos diferentes
Experimentos Tratamentos Experimento 1 sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo Experimento 2 sem aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo Experimento 3 com aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo
Experimento 4 com aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo
O periacuteodo de 10 dias para aclimataccedilatildeo dos peixes foi para permitir que as
caracteriacutesticas ovarianas sejam comparadas com os grupos que natildeo foram aclimatados
Dessa forma mostraraacute quais as melhores condiccedilotildees que esses peixes podem ter na
reproduccedilatildeo quando expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
32 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente experimento foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo com 350gL de endosulfan
33 Teste de toxicidade aguda em sistema estaacutetico ndash CL50
A definiccedilatildeo das concentraccedilotildees toacutexicas a serem testadas nem sempre ocorre de
maneira simples Muitas vezes faz-se necessaacuterio uma anaacutelise preliminar para a
definiccedilatildeo da melhor faixa de concentraccedilatildeo a ser considerada nos testes definitivos
Dessa forma a primeira providecircncia desse estudo de toxidade aguda eacute a realizaccedilatildeo de
testes preliminares que devem ser conduzidos com concentraccedilotildees toacutexicas relacionadas
entre si por progressotildees geomeacutetricas de razatildeo 10 calculadas com base em informaccedilotildees
19
obtidas por meio de testes jaacute realizados com outros organismos que mais se assemelham
filogeneticamente ao grupo em questatildeo (Ranzani-Paiva 2004) A partir dos resultados
obtidos nessa fase eacute possiacutevel estabelecer a faixa ideal de concentraccedilatildeo para conduccedilatildeo
dos testes definitivos com o lambari
O teste de concentraccedilatildeo letal (CL50) que avalia a concentraccedilatildeo responsaacutevel pela
mortalidade de metade dos animais foi realizado em sistema de aacutegua estaacutetico de acordo
NBR 15088 (ABNT 2007) com os animais mantidos sob restriccedilatildeo alimentar que se
iniciou 24 horas antes do iniacutecio e perdurou durante o teste Essa restriccedilatildeo alimentar foi
realizada para evitar acuacutemulo de mateacuteria orgacircnica que poderia interferir na accedilatildeo do
agrotoacutexico
Para o teste foram selecionados 120 lambaris fecircmeas adultas em maturaccedilatildeo
avanccedilada com aproximadamente 7cm de comprimento O agrotoacutexico utilizado foi o
Thiodanreg (Bayer) com 350gL-1 de endosulfan Foram utilizadas trecircs repeticcedilotildees com
cinco peixes cada para cada concentraccedilatildeo de Thiodanreg adotada sendo os grupos assim
classificados controle (0microgL-1) 15microgL-1 30microgL-1 60microgL-1 120microgL-1 240microgL-
1 480microgL-1 e 960microgL-1 As concentraccedilotildees foram distribuiacutedas em recipientes plaacutesticos
com 15L de aacutegua dos proacuteprios aquaacuterios (Figura 3) Para obter as diferentes
concentraccedilotildees o Thiodanreg foi diluiacutedo uma primeira vez 1100 (Soluccedilatildeo Padratildeo
Intermediaacuteria contendo 3500mgL-1 de endosulfan) e uma segunda vez 1100 (Soluccedilatildeo
Padratildeo Final contendo 35000microgL-1 de endosulfan) viabilizando a observaccedilatildeo da
toxicidade total do agrotoacutexico e natildeo apenas do princiacutepio ativo (Figura 4)
Figura 3 Recipiente utilizado e distribuiccedilatildeo das concentraccedilotildees
20
Figura 4 Preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo padratildeo final do Thiodanreg
Foram feitas as verificaccedilotildees de mortalidade a cada seis horas (zero 6 12 18 24
30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 e 96 horas) removendo-se os animais mortos o
que proporcionou menores interferecircncias pela decomposiccedilatildeo dos peixes gerando maior
confianccedila da mortalidade apresentada ser em funccedilatildeo da toxicidade do princiacutepio ativo
endosulfan sinergicamente agrave accedilatildeo dos solventes e demais compostos do inseticida Para
acompanhamento da temperatura foi adicionado 15L de aacutegua do mesmo aquaacuterio em
um recipiente idecircntico de forma que qualquer variaccedilatildeo na temperatura pudesse ser
medida sem provocar estresse adicional a nenhum grupo O teste teve iniacutecio no dia
16012010 agraves 1000 horas com teacutermino agraves 1000 horas do dia 20012010 O programa
utilizado para o caacutelculo da CL50 foi o TOXCALC determinando o valor e o intervalo de
confianccedila pelo meacutetodo PROBITUS (Plt005)
34 Teste de toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Depois de estimar a CL50 pelos testes preliminares foi realizada aclimataccedilatildeo de
novos lambaris como descrito no item 31 (Figura 2) onde os peixes se acostumaram
ao seu novo meio e agraves atividades normais de manutenccedilatildeo como alimentaccedilatildeo e limpeza
dos aquaacuterios O teste de toxicidade aguda com o endosulfan foi realizado baseando-se
principalmente nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo com a
NBR 15088 (ABNT 2007)
O teste de toxicidade subletal foi feito com trecircs diferentes dosagens do toacutexico
inferiores agrave CL50 e para fins estatiacutesticos cada concentraccedilatildeo incluindo-se o grupo
controle teve trecircs repeticcedilotildees sob as mesmas condiccedilotildees para depois se avaliar e
Thiodanreg
Soluccedilatildeo padratildeo
intermediaacuteria
(1100)
Soluccedilatildeo
padratildeo final
(1100)
3500mgL de soluccedilatildeo padratildeo
intermediaacuteria 35000 microgL de
soluccedilatildeo padratildeo
final
21
quantificar a mortalidade se for o caso observar o comportamento dos animais que
sobreviveram agrave intoxicaccedilatildeo e os efeitos morfoloacutegicos nos fiacutegados e ovaacuterios dos peixes
expostos Assim como foram trecircs repeticcedilotildees usando-se trecircs diferentes concentraccedilotildees do
toacutexico e um grupo controle para a realizaccedilatildeo do presente experimento foram
necessaacuterias 120 fecircmeas de lambari para cada experimento (Tabela 1)
Tabela 1 Distribuiccedilatildeo das fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus em cada grupo experimental
Repeticcedilatildeo Controle 115microgl 23microgl 56microgl A 10 10 10 10 B 10 10 10 10 C 10 10 10 10
Para cada peixe que sobreviveu agrave intoxicaccedilatildeo pelo periacuteodo de 96 horas (teste de
toxicidade subletal) foram obtidos dados biomeacutetricos como peso corporal comprimento
total e comprimento-padratildeo peso do fiacutegado e peso do ovaacuterio Os ovaacuterios e fiacutegados na
sequecircncia foram fixados para posterior anaacutelise histoloacutegica
35 Avaliaccedilatildeo morfoloacutegica
351 Microscopia de luz
Apoacutes 96 horas de experimento seis animais de cada grupo foram coletados
anestesiados com benzocaiacutena e eutanasiados para coleta dos ovaacuterios e fiacutegados Para o
estudo das caracteriacutesticas morfoloacutegicas de ovaacuterios e fiacutegados os fragmentos foram
fixados em paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo fosfato 01M pH 72 O material foi
fixado por um periacuteodo miacutenimo de 24 horas e preservado em aacutelcool 70 Em seguida os
fragmentos foram transferidos para soluccedilatildeo de aacutelcool 95 por quatro horas Apoacutes isso
os fragmentos de ovaacuterios e fiacutegados foram imersos em soluccedilatildeo de aacutelcool 95 e resina
glicolmetacrilato (Leica Historesin) na proporccedilatildeo de 11 por 12 horas seguida de resina
pura por 24 horas e posterior emblocamento Os fragmentos foram seccionados em
cortes com 3microm de espessura em microacutetomo rotativo com navalha de vidro Foi
preparada uma lacircmina por animal com quatro cortes em cada e em padratildeo semi-seriado
ou seja a cada corte aproveitado eram descartados cinco cortes seguintes para evitar que
a mesma ceacutelula fosse contada duas vezes no momento da anaacutelise baseando-se no
diacircmetro nuclear previamente estabelecido para cada tipo celular em questatildeo
22
As coloraccedilotildees utilizadas foram azul de toluidina e hematoxilinaeosina para
anaacutelises histotoloacutegicas e para morfometria Tambeacutem foi utilizada a reaccedilatildeo histoquiacutemica
com PAS contracorados com hematoxilina para os cortes de fiacutegados As lacircminas foram
montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e
as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
352 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos fiacutegados
Os estudos morfoloacutegicos foram conduzidos em seis animais por concentraccedilatildeo
As lacircminas histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo e fotografadas (ocular
de 10X e objetiva de 40X) em 10 campos ao acaso para anaacutelises morfoloacutegicas e
morfomeacutetricas que pudessem ser representativas dos efeitos do Thiodanreg no tecido
hepaacutetico Estas alteraccedilotildees foram comparadas com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos fiacutegados
das lacircminas do grupo controle
As alteraccedilotildees histoloacutegicas foram avaliadas semiquantitativamente em duas
formas 1) por meio do caacutelculo do Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) com base na
incidecircncia de lesotildees Para tanto atribuiu-se um valor numeacuterico para cada animal
conforme a escala grau 1 (ausecircncia de alteraccedilatildeo histoloacutegica) grau 2 (ocorrecircncia de
lesotildees pontualmente localizadas) e grau 3 (lesotildees amplamente distribuiacutedas pelo oacutergatildeo)
em 10 campos fotografados e 2) por meio do caacutelculo do Iacutendice de Alteraccedilatildeo
Histopatoloacutegica (IAH) com base na severidade de cada lesatildeo de acordo com Schwaiger
et al (1997) Para tanto as alteraccedilotildees foram classificadas em estaacutedios progressivos
quanto ao comprometimento das funccedilotildees do oacutergatildeo alteraccedilotildees de estaacutedio I que natildeo
comprometem o funcionamento do oacutergatildeo de estaacutedio II mais severas e que prejudicam
o funcionamento normal do oacutergatildeo e de estaacutedio III muito severas e irreversiacuteveis
adaptado de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic (1994) (Tabela 2) O valor de IAH foi
calculado para cada animal utilizando a foacutermula IAH =10ordm sumI + 10ˡ sumII + 10sup2 sumIII
sendo I II e III correspondentes ao nuacutemero de alteraccedilotildees de estaacutedio I II e III
respectivamente O valor meacutedio de IAH foi dividido em cinco categorias seguindo
metodologia de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic (1994) 0-10= funcionamento normal do
tecido 11-20= dano leve a moderado do tecido 21-50= dano moderado a severo do
tecido 51-100= dano severo do tecido maior que 100= dano irreparaacutevel do tecido Este
iacutendice permitiu a comparaccedilatildeo da severidade das lesotildees hepaacuteticas entre os peixes
expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
23
Tabela 2 Classificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histoloacutegicas do fiacutegado quanto ao estaacutegio de comprometimento das funccedilotildees teciduais (adaptado de Poleksic amp MitrovicndashTutundzic1994)
Para as anaacutelises morfomeacutetricas foram realizadas dez mediccedilotildees dos diacircmetros de
nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos para cada animal As medidas foram obtidas por
meio do programa Image-Pro Plus traccedilando duas linhas perpendiculares respeitando-se
os limites do nuacutecleo e do citoplasma do hepatoacutecito em anaacutelise (Figura 5) Aleacutem disso
foram quantificados pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleo citoplasma capilar sinusoides e
macroacutefagos em 10 campos (gradiacutecula com 100microm de lado e uma aacuterea de 10000micromsup2)
totalizando 4410 pontosanimal para o caacutelculo da constituiccedilatildeo tecidual hepaacutetica (Figura
6) Estas avaliaccedilotildees foram conduzidas nos grupos controles e grupos de peixes expostos
ao toacutexico nas diferentes concentraccedilotildees
A quantidade de glicogecircnio nos hepatoacutecitos foi avaliada em toda extensatildeo da
lacircmina de forma semiquantitativa sendo evidenciada pela reaccedilatildeo histoquiacutemica de
Periodic Acid Schiff (PAS) segundo Michalany (1980) Para melhor compreensatildeo dos
resultados as marcaccedilotildees foram determinadas na seguinte escala 0- ausecircncia de
glicogecircnio 1- pouco glicogecircnio 2- quantidade moderada de glicogecircnio 3- muito
glicogecircnio Apoacutes esta anaacutelise foi calculada uma meacutedia do conteuacutedo de glicogecircnio dos
hepatoacutecitos nos grupos controles e grupos expostos ao toacutexico nas diferentes
concentraccedilotildees
ALTERACcedilOtildeES HISTOPATOLOacuteGICAS HEPAacuteTICAS ESTAacuteGIO1 Alteraccedilatildeo nos hepatoacutecitosAtrofia nuclear I
Atorfia nuclear I
Deformaccedilatildeo do contorno celular I
Deformaccedilatildeo do contorno nuclear I
Hipertrofia celular I
Hipertrofia nuclear I
Nuacutecleo na periferia da ceacutelula II
Vacuolizaccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo nuclear II
Nuacutecleos picnoacuteticos II
Rompimento celular II
2 Alteraccedilotildees nos vasos sanguiacuteneos
Hiperemia II
Ruptura de vasos II
3 Necrose
Necrose focal III
24
Figura 5 Metodologia para obtenccedilatildeo de medidas de diacircmetro de nuacutecleo e citoplasma de hepatoacutecitos por meio do programa Image-Pro Plus Coloraccedilatildeo Azul de toluidina Barra 5microm
Figura 6 Gradiacutecula utilizada para contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos capilares e macroacutefagos (4410 pontosanimal) Coloraccedilatildeo Azul de toluidina
25
353 Anaacutelises morfomeacutetri cas e morfoloacutegicas dos ovaacuterios
Os estudos foram conduzidos em seis animais de cada grupo em cada
experimento As lacircminas histoloacutegicas foram analisadsas em toda sua extensatildeo em busca
de alteraccedilotildees morfoloacutegicas foliculares (Tabela 3) que pudessem ser representativas dos
efeitos do Thiodanreg no tecido ovariano sempre comparando estas alteraccedilotildees com o
padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios das lacircminas dos grupos controles
Para a avaliaccedilatildeo morfomeacutetrica foram realizadas contagens dos diferentes
estaacutegios de desenvolvimento folicular Para isto foram utilizadas fotografias obtidas a
partir de 10 campos escolhidos ao acaso em objetiva de 10X (campo com 5094microm de
largura por 68120microm de comprimento totalizando uma aacuterea de 1863 mmsup2) Aleacutem
disso foi realizada a contagem de foliacuteculos atreacutesicos e observados eosinoacutefilos
associados aos foliacuteculos vitelogecircnicos utilizando o microscoacutepio com objetiva de 40X
avaliando-se 10 foliacuteculos escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro
experimentos Tambeacutem foram realizadas mediccedilotildees de diacircmetros em 10 foliacuteculos
vitelogecircnicos para cada animal Estas medidas foram obtidas pelo programa Image-Pro
Plus traccedilando-se duas linhas perpendiculares sobre nuacutecleo e central e respeitando-se os
limites do foliacuteculo As mensuraccedilotildees foram realizadas em imagens obtidas com objetiva
de 4X (Figura 7) Em todas as contagens e mediccedilotildees foram calculados os valores
meacutedios e desvios-padratildeo para cada concentraccedilatildeo para se avaliar o desenvolvimento
folicular nos diferentes experimentos
Tabela 3 Alteraccedilotildees histoloacutegicas do ovaacuterio quanto ao comprometimento folicular (adaptado de Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS FOLICULAR ES Alteraccedilatildeo nos foliacuteculos
Descolamento do revestimento folicular
Retraccedilatildeo citoplasmaacutetica
Retraccedilatildeo nuclear
Atresia folicular
Aglutinaccedilatildeo nucleoplasmaacutetica
Aglutinaccedilatildeo citoplasmaacutetica
Aglutinaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo
Foliacuteculos vazios
Granuloacutecitos envolvendo foliacuteculos
26
Figura 7 Metodologia para obtenccedilatildeo de medidas de diacircmetro de ovoacutecitos vitelogecircnicos avanccedilados por meio do programa Image-Pro Plus Coloraccedilatildeo Hematoxilina eosina
354 Imunoistoquiacutemica
Para detectar a possiacutevel imunorreatividade para colaacutegeno tipo IV integrinas β1 e
caspase 3 no tecido conjuntivo ovaacuterios do lambari foram fixados em paraformaldeido a
4 A recuperaccedilatildeo antigecircnica foi realizada em forno microndas por 10 minutos com os
cortes nas lacircminas sendo imersos em tampatildeo citrato 10mM pH 60 As lacircminas foram
incubadas com peroacutexido de hidrogecircnio a 3 em tampatildeo fosfato por 15 minutos em
temperatura ambiente para inativar peroxidase endoacutegena e com soro albumina bovina a
2 por 45 minutos para bloquear marcador antigecircnico inespeciacutefico Anticorpos
primaacuterios anti-colaacutegeno tipo IV anti-integrina β1 e anti-caspase 3 (Santa Cruz
Biotechnology Calif USA) foram aplicados nas secccedilotildees a 4degC na diluiccedilatildeo 1100
(integrina e colaacutegeno tipo IV) e 1200 (Caspase 3) segundo o fabricante ldquoovernightrdquo
Os cortes foram lavados em PBS e incubados por 45 minutos com diluiccedilatildeo de 1200
com anticorpo secundaacuterio IgG anti-coelho (LSAB 2 sistema HRP da Dako Cytomation
kit Dako Cytomation Carpinteria Calif USA) e tratado com peroxidase conjugada
com estreptavidina por 45 minutos A revelaccedilatildeo foi realizada com diaminobenzidina
(DAB) e as lacircminas foram contracoradas com hematoxilina (Santos et al 2008a)
27
36 Paracircmetros biomeacutetricos
Para analisar quantitativamente a atividade reprodutiva do A bimaculatus foram
registrados para cada exemplar os seguintes dados biomeacutetricos peso corporal (em g)
peso dos ovaacuterios (em g) e peso do fiacutegado (em g) Os valores meacutedios e desvios-padratildeo
dos iacutendices gonadossomaacutetico e hepatossomaacutetico foram calculados para cada animal em
cada um dos grupos propostos no presente estudo
a) Iacutendice gonadossomaacutetico (IGS)
IGS=PG x100 PG= peso dos ovaacuterios
PC PC= peso corporal
b) Iacutendice hepatossomaacutetico (IHS)
IHS= PF x100 PF= peso do fiacutegado
PC PC= peso corporal
37 Anaacutelises estatiacutesticas
As variaacuteveis quantitativas foram submetidas aos testes de homocedasticidade
(Levenes) e normalidade (Shapiro-Wilk) e posteriormente agrave anaacutelise de variacircncia para
testar as variaccedilotildees nos valores meacutedios dos iacutendices calculados no momento da coleta (96
horas) entre os grupos controles e os grupos tratados Foi analisado o coeficiente de
variaccedilatildeo para se evitar erros estatiacutesticos tipo I e tipo II e logo apoacutes foi realizado o teste
parameacutetrico de Duncan ou Tukey (Plt005) para comparar os valores meacutedios Quando
natildeo atenderam agraves premissas de normalidade e homocedasticidade mesmo apoacutes as
transformaccedilotildees apropriadas os dados foram submetidos aos testes natildeo-parameacutetricos de
Kruskal-Wallis (ANOVA) Para as variaacuteveis qualititativas quantificadas foi utilizado o
teste de Kruskal-Wallis (ANOVA) Os graacuteficos foram produzidos usando o software
Microsoft Excel 2010
28
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5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 CAPIacuteTULO 1
EFEITOS DO INSETICIDA THIODAN reg SOBRE A MORFOLOGIA HEPAacuteTICA
DE FEcircMEAS DE LAMBARIS Astyanax bimaculatus
RESUMO
O Thiodanreg eacute um toacutexico que pode causar alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos tecidos de peixes
expostos a ele dependendo da concentraccedilatildeo A fim de investigar possiacuteveis alteraccedilotildees
este estudo avaliou a morfologia hepaacutetica de fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus
expostas ao Thiodanreg por 96 horas em quatro diferentes experimentos com trecircs
concentraccedilotildees subletais de 115 23 e 56 microgL de Thiodanreg aleacutem de um grupo
controle livre de toacutexico As fecircmeas foram divididas em quatro experimentos sem
aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem aclimataccedilatildeo e alimentados com aclimataccedilatildeo de 10 dias e
sem alimentaccedilatildeo e com aclimataccedilatildeo de 10 dias e alimentados Foi observado que a accedilatildeo do
Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou a estrutura morfoloacutegica do fiacutegado
como um todo mas foram observadas alteraccedilotildees em locais isolados do parecircnquima
hepaacutetico Houve depleccedilatildeo de glicogecircnio deformaccedilatildeo nuclear e citoplasmaacutetica
hipertrofia nuclear e citoplasmaacutetica hiperemia e degeneraccedilatildeo celular nos hepatoacutecitos
nas diferentes concentraccedilotildees No entanto o Iacutendice de Alteraccedilatildeo Histoloacutegica (IHA) e o
Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) demonstraram que as alteraccedilotildees observadas nos
fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas sendo na maioria alteraccedilotildees de estaacutedio I e II
de forma leve a moderada com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico em todas as
concentraccedilotildees Aleacutem disso houve alteraccedilatildeo do diacircmetro do nuacutecleo e citoplasma dos
hepatoacutecitos nos diferentes experimentos e maior quantidade de nuacutecleos de hepatoacutecitos
nos grupos expostos ao Thiodanreg associada agrave reduccedilatildeo na quantidade de citoplasma
Conclui-se que o Thiodanreg influenciou o metabolismo hepaacutetico como resposta
adaptativa celular A incidecircncia de alteraccedilotildees histoloacutegicas no fiacutegado dos lambaris
coletados nos diferentes experimentos indica o comprometimento da sauacutede destes
peixes e mostra que os paracircmetros analisados podem ser empregados como
biomarcadores da contaminaccedilatildeo ambiental nesta espeacutecie
Palavras-chave histopatologia fiacutegado peixe endosulfan ecotoxicologia
36
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 α-endosulfan e 30 β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo a
partir da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em risco os organismos que ali
residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al 2007)
Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos como jaacute
observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis niloticus A
Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan em gordura o valor de
005mgkg-1 (EPA 2002) e em aacutegua doce 022microgL-1 (EPA 1980) A Legislaccedilatildeo
Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em consideraccedilatildeo a qualidade da
aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm
3572007 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo do referido inseticida e
seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
A sensibilidade ao endosulfan pelos organismos aquaacuteticos tem sido bem descrita
na literatura (Capkin et al 2006 Ballesteros et al 2007 Pereira et al 2012) O
produto eacute extremamente toacutexico para peixes e outros organismos aquaacuteticos mesmo em
concentraccedilotildees muito pequenas (Cengiz et al 2001) No entanto a sensibilidade pode
variar entre os sexos assim como foi observado nos peixes adultos da espeacutecie Jenynsia
multidentata sob efeito do endosulfan por 96 horas (Ballesteros et al 2007) Neste
trabalho a CL50 em peixes machos foi de 072 μgL-1 enquanto nas fecircmeas foi de
131μgL-1 valores atribuiacutedos agraves diferenccedilas de maior reserva de lipiacutedeos nas fecircmeas que
nos machos Em outros estudos Capkin et al (2006) utilizaram 1978gL-1 em
Oreochromis mikyss por 24 horas de exposiccedilatildeo ao toacutexico o que causou aleacutem da morte
de 50 dos peixes convulsotildees nado erraacutetico separaccedilatildeo das lacircminas bracircnquiais e
necrose do fiacutegado e como Cengiz et al (2001) reportaram lesotildees similares no peixe-
mosquito Gambusia affinis
O sulfato de endosulfan eacute um dos produtos derivados do metabolismo do
endosulfan sendo considerado o principal metaboacutelito devido agrave sua importacircncia
toxicoloacutegica (Stumpf amp abhaver 1986) e por ser mais estaacutevel no meio ambiente do que
37
quando estaacute em sua foacutermula original (Ali et al 1984) Decorrente disto os peixes
quando expostos a este inseticida podem apresentar alteraccedilotildees morfoloacutegicas
significativas no fiacutegado (Capkin et al 2006 Coimbra et al 2007 Glover et al 2007)
Estas alteraccedilotildees morfoloacutegicas podem ser o surgimento de vacuolizaccedilatildeo dos hepatoacutecitos
depleccedilatildeo de glicogecircnio alteraccedilatildeo dos vasos sinusoides alteraccedilatildeo do tamanho dos
hepatoacutecitos e necroses o que de acordo com alguns autores pode influenciar a siacutentese
de vitelogenina no fiacutegado para formaccedilatildeo dos foliacuteculos vitelogecircnicos em periacuteodo
reprodutivo (Senthilkumaran et al 2004 Al-Ghais 2013 Silva Barni et al 2014 )
Aleacutem disso as funccedilotildees hepaacuteticas podem ser influenciadas pelas diferenccedilas na
capacidade de exposiccedilatildeo a contaminantes condiccedilatildeo fisioloacutegica armazenamento de
energia e haacutebitos alimentares (Ribeiro et al 2006 Al -Ghais 2013 Silva Barni et al
2014)
O lambari Astyanax bimaculatus foi escolhido como organismo experimental
pois eacute muito representativo no ecossistema sendo encontrado desde o Nordeste
brasileiro ateacute a bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Eacute um peixe de
pequeno porte e de faacutecil manutenccedilatildeo em laboratoacuterio
Este estudo teve como objetivo verificar a ocorrecircncia de alteraccedilotildees histoloacutegicas
no fiacutegado de fecircmeas de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada e avaliar a intensidade
de alteraccedilatildeo deste orgatildeo em peixes alimentados e desprovidos de alimento durante
ensaios subletais agudos com o toacutexico Thiodanreg
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste de toxicidade aguda e o teste subletal As
atividades de coleta fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos fiacutegados microtomia
coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e morfomeacutetricas foram
realizadas nos Laboratoacuterios de Peixes e de Histopatologia do Departamento de
Veterinaacuteria da UFV (DVTUFV)
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
38
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos animais em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado poro genital
dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV Os
aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuem capacidade de 50 litros numa
densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro
temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam
sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo contiacutenua da aacutegua para garantir o bem-estar dos
peixes Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial Purina contendo 35 de
proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste da toxicidade aguda em sistema estaacutetico - CL 50
O teste de concentraccedilatildeo letal (CL50) que avalia a concentraccedilatildeo responsaacutevel pela
mortalidade de 50 dos animais foi realizado em sistema de aacutegua estaacutetico de acordo
com a NBR 15088 (ABNT 2007) com os animais mantidos em restriccedilatildeo alimentar que
se iniciou 24 horas antes do iniacutecio do experimento e perdurou durante todo o teste (96
horas) Essa restriccedilatildeo alimentar foi realizada para evitar acuacutemulo de mateacuteria orgacircnica
que poderia interferir na accedilatildeo do agrotoacutexico
Para o teste foram selecionadas 120 fecircmeas adultas de lambari em maturaccedilatildeo
avanccedilada O agrotoacutexico utilizado foi o Thiodanreg (Bayer) com 350gL-1 de endosulfan
Foram utilizadas trecircs repeticcedilotildees com cinco peixes cada para cada concentraccedilatildeo de
39
Thiodanreg adotada sendo os grupos assim classificados controle (0microgL-1) 15microgL-1
30microgL-1 60microgL-1 120microgL-1 240microgL-1 480microgL-1 e 960microgL-1 As concentraccedilotildees
foram distribuiacutedas em recipientes plaacutesticos com 15L de aacutegua dos proacuteprios aquaacuterios
Foram realizadas verificaccedilotildees de mortalidade a cada seis horas ateacute 96 horas
(zero 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 e 96 horas) removendo-se
os animais mortos o que proporcionou menores interferecircncias pela decomposiccedilatildeo dos
peixes gerando maior confianccedila da mortalidade apresentada ser em funccedilatildeo da
toxicidade do princiacutepio ativo endosulfan sinergicamente agrave accedilatildeo dos solventes e demais
compostos do inseticida Para acompanhamento da temperatura foi acondicionado 15L
de aacutegua do mesmo aquaacuterio em um recipiente idecircntico de forma que qualquer variaccedilatildeo
na temperatura pudesse ser medida sem provocar estresse adicional a nenhum grupo O
programa utilizado para o caacutelculo da CL50 foi o TOXCALC determinando o valor e
intervalo de confianccedila pelo meacutetodo PROBITUS (Plt005)
24 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi realizado baseando-se
principalmente nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo a NBR
15088 (ABNT 2007)
As fecircmeas foram expostas ao Thiodanreg (endosulfan 350gL-1) por 96 horas em
quatro tratamentos diferentes 1) experimento sem aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem
alimentaccedilatildeo 2) experimento sem aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo 3) experimento com
aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e 4) experimento com aclimataccedilatildeo de 10 dias
e com alimentaccedilatildeo Todos os experimentos foram constituiacutedos por trecircs concentraccedilotildees
diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 preacute-determinada em laboratoacuterio de acordo com
a NBR 15088 (ABNT 2007) e um grupo controle sem toacutexico As concentraccedilotildees
utilizadas em cada experimento foram de 115 23 e 56microgL-1 com trecircs repeticcedilotildees sob
as mesmas condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
25 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas
Apoacutes 96 horas de experimento foram coletados 96 peixes sendo seis animais
em cada grupo nos diferentes experimentos Logo em seguida os fiacutegados foram
coletados apoacutes os peixes terem sido anestesiados com benzocaiacutena (110000) e
eutanasiados pela secccedilatildeo transversal da coluna vertebral na regiatildeo do opeacuterculo
40
Para a histologia todas as amostras foram fixadas em paraformaldeiacutedo a 4 em
tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedos em resina glicolmetacrilato
(Leica Historesinreg) Em seguida secccedilotildees com 3microm de espessura foram coradas
utilizando azul de toluidina para as anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas As lacircminas
foram montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31
Olympus e as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software
Analysis GETIT Olympus
As lacircminas histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo e foram
fotografados 10 campos ao acaso em objetiva de 40X para anaacutelises morfoloacutegicas e
morfomeacutetricas que pudessem ser representativas do efeito do Thiodanreg no tecido
hepaacutetico Estas alteraccedilotildees foram comparadas com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos fiacutegados
dos grupos controles
As alteraccedilotildees histoloacutegicas foram avaliadas semiquantitativamente de duas
formas 1) por meio do caacutelculo do Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) com base na
incidecircncia de lesotildees Para tanto atribuiu-se um valor numeacuterico para cada oacutergatildeo
conforme a escala grau 1 (ausecircncia de alteraccedilatildeo histoloacutegica) grau 2 (ocorrecircncia de
lesotildees pontuais) e grau 3 (lesotildees amplamente difusas pelo oacutergatildeo) em 10 campos
fotografados e 2) pelo caacutelculo do Iacutendice de Alteraccedilatildeo Histotoloacutegica (IAH) com base na
severidade de cada lesatildeo de acordo com Schwaiger et al (1997) Para tanto as
alteraccedilotildees foram classificadas em estaacutedios progressivos quanto ao comprometimento
das funccedilotildees do oacutergatildeo alteraccedilotildees de estaacutedio I que natildeo comprometem o funcionamento
do oacutergatildeo de estaacutedio II mais severas e que prejudicam o funcionamento normal do
oacutergatildeo e de estaacutedio III muito severas e irreversiacuteveis (adaptado de Poleksic amp Mitrovic-
Tutundzic 1994) (Tabela 1) O valor de IAH foi calculado para cada animal utilizando a
foacutermula IAH =10ordm sumI + 10ˡ sumII + 10sup2 sumIII sendo I II e III correspondentes agraves
alteraccedilotildees de estaacutedios I II e III respectivamente O valor meacutedio de IAH foi dividido em
cinco categorias que seguiu metodologia de Poleksic amp Mitrovic- Tutundzic (1994) 0-
10= funcionamento normal do tecido 11-20= dano leve a moderado do tecido 21-50=
dano moderado a severo do tecido 51-100= dano severo do tecido maior que 100=
dano irreparaacutevel do tecido Este iacutendice permitiu a comparaccedilatildeo da severidade das lesotildees
hepaacuteticas entre os peixes expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
Para as anaacutelises morfomeacutetricas foram realizadas mediccedilotildees dos diacircmetros de dez
nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos para cada animal As medidas foram obtidas por
meio do programa Image-Pro Plus traccedilando duas linhas perpendiculares respeitando-se
41
os limites do nuacutecleo e do citoplasma do hepatoacutecito em anaacutelise Aleacutem disso foram
quantificados pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleo de hepatoacutecito citoplasma de hepatoacutecito
capilares sinusoides e macroacutefagos em 10 campos utilizando-se gradiacutecula com 441
pontos de interseccedilatildeo com 100microm de lado e uma aacuterea de 10000micromsup2 totalizando 4410
pontosanimal para o caacutelculo da constituiccedilatildeo tecidual hepaacutetica
Tabela 1 Classificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histoloacutegicas do fiacutegado quanto ao estaacutegio de comprometimento das funccedilotildees teciduais (adaptado de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic 1994)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS HEPAacuteTICAS ESTAacuteDIO 1 Alteraccedilotildees nos hepatoacutecitos I Atrofia nuclear I Deformaccedilatildeo do contorno celular I Deformaccedilatildeo do contorno nuclear I Hipertorfia celular I Hipertorfia nuclear I Nuacutecleo na periferia da ceacutelula I Vacuolizaccedilatildeo citoplasmaacutetica I Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II Degeneraccedilatildeo nuclear II Nuacutecleo picnoacuteticos II Rompimento celular II 2 Alteraccedilotildees nos vasos sanguiacuteneos Hiperemia II Ruptura de vasos II 3 Necrose Necrose focal III
A quantidade de glicogecircnio nos hepatoacutecitos foi avaliada em toda extensatildeo da
lacircmina de forma semiquantitativa sendo evidenciada pela reaccedilatildeo histoquiacutemica de
Periodic Acid Schiff (PAS) seguida de contracoloraccedilatildeo com hematoxilina segundo
Michalany (1980) Para melhor compreensatildeo dos resultados as marcaccedilotildees foram
determinadas na seguinte escala 0- ausecircncia de glicogecircnio 1- pouco glicogecircnio 2-
quantidade moderada de glicogecircnio 3- muito glicogecircnio Apoacutes esta anaacutelise foi
calculada uma meacutedia do conteuacutedo de glicogecircnio dos hepatoacutecitos nos grupos controles e
grupos expostos ao toacutexico nas diferentes concentraccedilotildees
42
26 Iacutendice hepatossomaacutetico (IHS)
Para o caacutelculo do IHS foram registrados para cada exemplar os dados
biomeacutetricos de peso corporal (PC em g) e peso do fiacutegado (PF em g) Os valores meacutedios
e os desvios padratildeo do iacutendice hepatossomaacutetico (IHS=PFx100PC) foram calculados
para cada animal em cada um dos grupos nos diferentes experimentos nas diferentes
concentraccedilotildees
27 Anaacutelises estatiacutesticas
Os dados estatildeo apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo
Os dados foram avaliados pelo Software Statistica 70 por meio da anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) Apoacutes o teste de distribuiccedilatildeo normal os dados foram comparados
entre os grupos controle e grupos expostos ao Thiodanreg usando anaacutelise de variacircncia
one-way seguida pelo teste de Tukey ou Duncan Quando os dados natildeo apresentaram
uma distribuiccedilatildeo normal foi utilizado o teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Plt005 foi utilizado como criteacuterio de significacircncia
3 RESULTADOS
31 Determinaccedilatildeo da CL50-96h
Nas primeiras seis horas de experimento observou-se mortalidade de 100 de
peixes na concentraccedilatildeo de 96microgL-1 944 de mortalidade em 48microgL-1 733 de
mortalidade em 24microgL-1 266 de mortalidade em 12microgL-1 e 20 de mortalidade em
6microgL-1 sendo um total de 447 dos peixes que morreram nas diferentes
concentraccedilotildees do Thiodanreg nas primeiras seis horas Na concentraccedilatildeo de 3microgL-1
morreu apenas um peixe no final das 96 horas Foi observado 100 de mortalidade na
concentraccedilatildeo de 48microgL-1 em ateacute 12 horas de exposiccedilatildeo ao toacutexico As menores
mortalidades foram registradas nas concentraccedilotildees de Thiodanreg de 3microgL-1 e 6microgL-1
sendo respectivamente 944 e 80 de sobrevivecircncias A concentraccedilatildeo de 15microgL-1
de Thiodanreg e o grupo controle natildeo tiveram mortalidade A temperatura da aacutegua
apresentou variaccedilatildeo entre 220ordmC e 245 ordmC com meacutedia de 233plusmn072 ordmC
Os valores registrados determinaram CL50-96hs de 1367microgL-1para as fecircmeas de
A bimaculatus com intervalo de confianccedila de 101 a 184microgL-1 (Plt005)
43
32 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Durante a exposiccedilatildeo ao Thiodanreg por 96 horas foi observado comportamento
anormal dos peixes com nado erraacutetico tentativa de fuga dos aquaacuterios demonstraccedilatildeo de
agressividade com os demais peixes busca de oxigecircnio na superfiacutecie e respiraccedilatildeo
branquial acelerada Apoacutes 24 horas do iacutenicio os animais apresentavam comportamento
normal e procuravam pelo alimento Estas mudanccedilas comportamentais ocorreram em
todas as concentraccedilotildees do agrotoacutexico utilizadas com maior intensidade na concentraccedilatildeo
de 56microgL do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo cuja temperatura meacutedia
foi superior agrave dos demais experimentos (Tabela 2)
33 Morfologia e frequecircncia das alteraccedilotildees histoloacutegicas nos fiacutegados
Morfologicamente o fiacutegado dos lambaris apresentou hepatoacutecitos hexagonais
com citoplasma de aspecto granular e vacuolizado nuacutecleo arredondado central nucleacuteolo
evidente e presenccedila de hepatopacircncreas Os hepatoacutecitos estavam dispostos em cordotildees
margeando os sinusoides (Figura 1 A)
Os infiltrados leucocitaacuterios foram observados nos grupos controles e nos grupos
expostos ao Thiodanreg (Figura 1 B)
A vacuolizaccedilatildeo foi evidente nos hepatoacutecitos das fecircmeas analisadas (Figura 1 A)
No fiacutegado das fecircmeas do experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve a presenccedila caracteriacutestica de acuacutemulos de lipiacutedios nos
hepatoacutecitos com a presenccedila de vesiacuteculas claras grandes e envolvidas por glicogecircnio
marcado positivamente pela reaccedilatildeo de PAS (Figura 1 C) Aleacutem disso foram observados
nuacutecleos deslocados para a periferia celular No experimento sem aclimataccedilatildeosem
alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve reaccedilatildeo negativa pelo PAS no
citoplasma dos hepatoacutecitos (Figura 1 D)
As alteraccedilotildees de estaacutedio I como deformaccedilatildeo do contorno nuclear nuacutecleo na
periferia da ceacutelula atrofia nuclear desarranjo dos cordotildees hepaacuteticos hipertrofia celular
e nuclear (Figuras 1 E-G Figuras 2 A-B) foram observadas nos grupos controles e
naqueles expostos ao Thiodanreg sendo que nos grupos tratados houve maior frequecircncia
O deslocamento do nuacutecleo para a periferia do hepatoacutecito foi observado nas fecircmeas do
experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 56microgL-1
Quanto agraves alteraccedilotildees de estaacutedio II a degeneraccedilatildeo nuclear (Figura 2 C) foi
raramente presente na maioria das concentraccedilotildees nos diferentes experimentos A
degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica (Figura 2 D) foi pouco frequente em todos os experimentos
44
assim como a hiperemia (Figura 2 E) A presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos (Figura 2 F) foi
mais frequente no experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e no experimento
com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
Os VMAs variaram entre 125 e 228 nas fecircmeas analisadas sendo a menor
meacutedia observada nos grupos controles e as maiores nos grupos expostos ao Thiodanreg o
que mostra incidecircncia maior de alteraccedilotildees pontuais no fiacutegado nos animais dos grupos
tratados Os VMAs do fiacutegado na espeacutecie estudada foram superiores (Plt005) nos peixes
expostos ao agrotoacutexico quando comparado aos peixes dos grupos controles (Tabela 3)
O IAH das fecircmeas nos diferentes experimentos apresentaram valores superiores
(Plt005) nos grupos expostos ao Thiodanreg quando comparados como os grupos
controles (Tabela 4) com exceccedilatildeo do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 115microgL-1 de endosulfan que natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
34 Diacircmetro dos nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos
Os resultados demonstraram aumento (Plt005) no diacircmetro dos nuacutecleos de
hepatoacutecitos dos peixes expostos ao Thiodanreg nas concentraccedilotildees de 115microgL-1 e
23microgL-1 quando comparados ao grupo controle no experimento sem aclimataccedilatildeosem
alimentaccedilatildeo Por outro lado foi registrada diminuiccedilatildeo (Plt005) do diacircmetro dos nuacutecleos
de hepatoacutecitos no experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo quando comparados
aos peixes expostos ao Thiodanreg na concentraccedilatildeo 115 e 23microgL-1 em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Tabela 5)
O diacircmetro do citoplasma apresentou aumento no experimento sem
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e no experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo com
diferenccedila (Plt005) registrada entre os peixes do grupos controles e expostos ao
agrotoacutexico com exceccedilatildeo do experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 23microgL-1 (Tabela 6) Entretanto houve diminuiccedilatildeo nos citoplasmas de
hepatoacutecitos nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo ao grupos controles (Plt005)
nos experimentos sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e no experimento com
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Tabela 6)
35 Quantificaccedilatildeo de nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos macroacutefagos e capilares
sanguiacuteneos no tecido hepaacutetico
Nas contagens de pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleos de hepatoacutecitos (Tabela 7)
foram observadas quantidades superiores nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo
45
aos grupos controles (Plt005) Na quantificaccedilatildeo dos citoplasmas de hepatoacutecitos foram
registradas contagens inferiores (Plt005) nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo
aos grupos controles exceto no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Tabela
8)
Na contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre macroacutefagos natildeo houve aumento
significativo (Pgt005) nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo ao controle (Tabela
9) Em relaccedilatildeo agrave contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre capilares sinusoides a
contagem foi igual na maioria dos peixes expostos ao agrotoacutexico quando comparados
com os controles apresentando diferenccedila significativa (Plt005) entre os grupos
expostos do experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo nas concentraccedilotildees de 115 e
56microgL-1 (Tabela 10)
36 Quantificaccedilatildeo do glicogecircnio hepaacutetico
Em todos os grupos controles e tratados nos diferentes experimentos foram
registrados valores meacutedios para o glicogecircnio variando entre 010 e 300 No
experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo no grupo tratado da concentraccedilatildeo de
56microgL-1 de Thiodanreg foi registrada a menor meacutedia (Tabela 11) No entanto houve
diferenccedila (Plt005) do glicogecircnio hepaacutetico na concentraccedilatildeo de 56microgL quando
comparada com as concentraccedilotildees de 115 e 23microgL-1 (Tabela 11 e Figura 1 D)
37 Iacutendice hepatossomaacutetico
As fecircmeas dos grupos experimentais expostos ao Thiodanreg natildeo apresentaram
diferenccedilas (Pgt005) nos valores do IHS quando comparados com os grupos controles
(Tabelas 12) Entretanto houve diferenccedila (Plt005) do IHS na concentraccedilatildeo de 56microgL-1
quando comparada com as concentraccedilotildees de 115 e 23microgL-1 no experimento sem
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Tabela 12)
4 DISCUSSAtildeO
No presente estudo o lambari apesar de ser de pequeno porte apresentou uma
CL50 de 1367microgL-1 em 96 horas sendo mais resistente que adultos de tilaacutepia niloacutetica
Musanhi (1987) determinou a CL50 96 48 e 24 horas de exposiccedilatildeo ao endosulfan para
tilaacutepia niloacutetica adulta encontrando valores de 142 380 e 103 microgL-1 Nas primeiras 24
horas de accedilatildeo do Thiodanreg nas concentraccedilotildees subletais de 115 23 e 56microgL-1 as
fecircmeas do presente estudo apresentaram comportamentos alterados assim como foi
46
observado na espeacutecie Danio rerio exposta ao endosulfan por 96 horas na concentraccedilatildeo
de 24microgL-1 aleacutem desta espeacutecie ter apresentado uma diminuiccedilatildeo do niacutevel de
acetilcolinesterase (AChE) (Pereira et al 2012) Por outro lado em estudo realizado
por Hernan da Cuntildea et al (2011) com a espeacutecie Cichlasoma dimerus exposta ao
endosulfan por 96 horas nas concentraccedilotildees de 025 1 2 3 4 e 16microgL-1 os peixes
exibiram comportamento indicativo de neurotoxicidade mas natildeo foram encontradas
diferenccedilas na atividade da AChE Estes estudos fornecem evidecircncias adicionais de
efeitos deleteacuterios da exposiccedilatildeo ao endosulfan sobre o sistema nervoso o que contribui
para as observaccedilotildees obtidas no presente estudo
As descriccedilotildees histoloacutegicas hepaacuteticas nas fecircmeas do presente estudo foram
semelhantes ao que foi caracterizado em outros peixes onde os hepatoacutecitos organizam-
se em fileiras ou cordotildees duplos em formato de placas representando um sistema de
fundo-cego anastomosado e de tuacutebulos ramificados (Metcalfe 1998 Hinton et al
2001)
A histologia e a fisiologia do fiacutegado satildeo similares nos vertebrados Ferguson
(1989) e Gingerich (1982) descrevem que existem algumas diferenccedilas estruturais
marcadas no parecircnquima hepaacutetico de peixes em especial pela ausecircncia de lobulaccedilatildeo
espaccedilo porta claacutessico e ausecircncia de zonaccedilatildeo no parecircnquima hepaacutetico o que permite
fluxo lento de sangue nos sinusoides com penetraccedilatildeo diminuiacuteda de quiacutemicos nos
hepatoacutecitos
A presenccedila de porccedilotildees pancreaacuteticas dentro do fiacutegado do lambari eacute descrita na
literatura (Santos et al 2013) Uma das funccedilotildees das ceacutelulas pancreaacuteticas distribuiacutedas
pelo fiacutegado eacute a produccedilatildeo da enzima de biotransformaccedilatildeo citocromo P450 diferente do
que eacute observado para mamiacuteferos onde esta enzima eacute ausente (Hahn et al 1994
Stegeman 1991) A presenccedila de ceacutelulas pancreaacuteticas em estruturas do tecido hepaacutetico
de A bimaculatus sugere a provaacutevel funccedilatildeo dessas ceacutelulas em auxiliar na
desintoxicaccedilatildeo Outra importante estrutura na detoxificaccedilatildeo eacute a presenccedila das ceacutelulas dos
endoteacutelios capilares nas quais tem sido confirmada e identificada a presenccedila de enzimas
citocromo P450 por meio de teacutecnicas de imunomarcaccedilatildeo (Lorenzana et al 1986)
Sendo assim a integridade estrutural dos capilares permanece intacta e sem
comprometimento das possiacuteveis funccedilotildees celulares que estas estruturas podem
desempenhar no tecido hepaacutetico de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
A ausecircncia de estagnaccedilatildeo biliar nos fiacutegados das fecircmeas de A bimaculatus eacute um
fator importante de que o Thiodanreg natildeo interferiu na fisiologia de excreccedilatildeo biliar nos
47
diferentes experimentos Histopatologicamente este tipo de alteraccedilatildeo eacute observado nos
citoplasmas dos hepatoacutecitos com a presenccedila de gracircnulos castanho-amarelados Esta
alteraccedilatildeo consiste na manifestaccedilatildeo fisiopatoloacutegica de uma condiccedilatildeo causada pela falta
de metabolismo e excreccedilatildeo biliar (Pacheco amp Santos 2002) uma vez que a bile
sintetizada pelos hepatoacutecitos permanece no interior das ceacutelulas natildeo sendo liberada para
o tubo digestivo (Simonato et al 2008) Este tipo de alteraccedilatildeo pode ser encontrado em
peixes expostos a toacutexicos (Pacheco amp Santos 2002) e tambeacutem em peixes que
apresentam algum problema nutricional quando satildeo mantidos em cativeiros (Langiano
amp Martinez 2008) No entanto no presente estudo natildeo foram registradas essas
evidecircncias o que sugere que a alimentaccedilatildeo nos grupos tratados com raccedilatildeo comercial de
todos os experimentos natildeo interferiu nas funccedilotildees biliares
Os agregados macrofaacutegicos estatildeo relacionados agrave quebra de eritroacutecitos (Herraez
amp Zapata 1986) apresentaccedilatildeo de antiacutegeno (Ellis 1980) armazenamento de ferro e
detoxicaccedilatildeo de substacircncias endoacutegenas e exoacutegenas (Herraez amp Zapata 1986) Hartley et
al (1996) propuseram a utilizaccedilatildeo do agregado macrofaacutegico como biomarcador de
poluiccedilatildeo aquaacutetica a partir da quantificaccedilatildeo destas estruturas Existem alguns estudos
comparativos em diferentes espeacutecies que tecircm demonstrado variaccedilotildees no nuacutemero
tamanho e pigmentaccedilatildeo destas estruturas em relaccedilatildeo agrave idade nutriccedilatildeo e estado de sauacutede
(Blazer et al 1987 Ferguson 1989 Agius et al 2003) Nos agregados podem ser
observados pigmentos do tipo lipofuscina ceroide hemossiderina e melanina (Wolke
1992 Wolf amp Wolfe 2005) mas no presente estudo natildeo foram evidenciadas nenhuma
destas estruturas
No fiacutegado das fecircmeas do grupo experimental sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
na maior concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve a presenccedila caracteriacutestica de acuacutemulos de
lipiacutedios nos hepatoacutecitos de dois peixes No entanto existem vaacuterias condiccedilotildees de
acuacutemulos de lipiacutedios nos hepatoacutecitos associados com a exposiccedilatildeo aos toacutexicos
(Thiyagarajah et al 1985 Biagianti-Risbourg et al 1995 Lumbertdacha et al 1995
Handy et al 1999 Fanta et al 2003) Glover et al (2007) submeteram o peixe salmatildeo
do Atlacircntico a dieta de 4microgkg de endosulfan por 14 e 35 dias sendo observadas
evidecircncias de lipidoses nos hepatoacutecitos O aparecimento destas estruturas nas fecircmeas de
A bimaculatus foi insignificante nos tecidos hepaacuteticos mas foram contabilizadas como
respostas individuais sugerindo uma disfunccedilatildeo hepaacutetica causada pelo Thiodanreg que
pode comprometer a fisiologia hepaacutetica destas fecircmeas
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No presente estudo as frequecircncias de alteraccedilotildees morfoloacutegicas indicam que a
accedilatildeo toacutexica do Thiodanreg provocou uma distribuiccedilatildeo de lesotildees de incidecircncia leve a
moderada no tecido hepaacutetico nos diferentes experimentos sendo que nas maiores
concentraccedilotildees do toacutexico houve mais incidecircncias de alteraccedilotildees As alteraccedilotildees observadas
nos fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas isto eacute natildeo apresentaram necrose sendo que
a maioria das alteraccedilotildees satildeo de estaacutedios I e II com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico
As alteraccedilotildees histoloacutegicas tecircm sido relatadas em peixes expostos a ambientes poluiacutedos
(Braunbeck et al 1990 Takashima et al 1995 Schwaiger et al 1997) Da mesma
forma a frequecircncia das alteraccedilotildees pode indicar disfunccedilotildees induzidas por agentes
toacutexicos uma vez que aacutereas metabolicamente ativas do fiacutegado ficam reduzidas levando a
uma possiacutevel reduccedilatildeo geral nas funccedilotildees desempenhadas por este oacutergatildeo (Hinton amp
Laureacuten 1990 Oliveira Ribeiro et al 2002 Pacheco amp Santos 2002 Langiano amp
Martinez 2008) Este resultado sugere que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees
hepaacuteticas mesmo em concentraccedilotildees muito baixas nos diferentes experimentos
independentemente do peixe estar sendo alimentado ou natildeo
As alteraccedilotildees dos diacircmetros de nuacutecleos de hepatoacutecitos podem ser consideradas
resposta ao agente estressor sendo indicativo da ativaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica em
decorrecircncia do aumento da atividade metaboacutelica contra as condiccedilotildees adversas (Stephen
et al 1993 Takashima amp Hibyia 1995 Langiano amp Martinez 2008) Por outro lado a
diminuiccedilatildeo nuclear pode estar relacionada possivelmente com a multiplicaccedilatildeo de
hepatoacutecitos na reposiccedilatildeo de ceacutelulas lesadas em funccedilatildeo da multiplicaccedilatildeo celular (Gul et
al 2004) No trabalho realizado por Oliveira Ribeiro et al (2002) observaccedilotildees
qualitativas por microscopia de luz demonstraram diminuiccedilatildeo no diacircmetro dos nuacutecleos
de hepatoacutecitos na espeacutecie A bimaculatus com alimentaccedilatildeo controlada associada agrave
exposiccedilatildeo ao toacutexico tributiltin Este tipo de alteraccedilatildeo eacute um indicativo de processo
degenerativo celular uma vez que inicia com a condensaccedilatildeo e reduccedilatildeo do diacircmetro do
nuacutecleo (Oliveira Ribeiro et al 2002) No presente estudo as alteraccedilotildees nos diacircmetros
de nuacutecleo de hepatoacutecitos demostraram que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees
hepaacuteticas das fecircmeas
A hipertrofia dos hepatoacutecitos tambeacutem pode ser causada por contaminantes
(Arnold et al 1985) por mudanccedilas estruturais do hepatoacutecito relacionadas ao
funcionamento da ceacutelula (Hinton et al 1992) condiccedilotildees fisioloacutegicas ligadas agrave
reproduccedilatildeo (Wester et al 2003) e pela maior atividade metaboacutelica (Takashima amp
Hibyia 1995) Portanto o aumento do diacircmetro citoplasmaacutetico nos experimentos sem
49
adaptaccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e no experimento com adaptaccedilatildeosem alimentaccedilatildeo mesmo
natildeo apresentando caracteriacutestica de hipertrofia morfoloacutegica evidente mas morfomeacutetrica
sugere indiacutecios de maior metabolizaccedilatildeo pelos hepatoacutecitos nestes grupos experimentais
As alteraccedilotildees dos diacircmetros de citoplasmas dos hepatoacutecitos nos experimentos
demonstraram que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees hepaacuteticas
Na quantificaccedilatildeo de nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos nos diferentes
experimentos foram observados indiacutecios de proliferaccedilatildeo de hepatoacutecitos que pode ser
indicativo da accedilatildeo toacutexica dos hepatoacutecitos contra detoxificaccedilatildeo do Thiodanreg assim como
observado no trabalho por Gul et al (2004) O percentual do tecido hepaacutetico ocupado
por ceacutelulas do tipo hepatoacutecito variou entre 8742 a 9088 na constituiccedilatildeo do
parecircnquima hepaacutetico de A bimaculatus Poucos trabalhos citam a constituiccedilatildeo celular
em fiacutegados de peixes sendo 845 a 873 de hepatoacutecitos ocupando o parecircnquima
hepaacutetico na truta (Hampton et al 1989) e 899 no peixe Golden (Rocha et al 1997)
Estes valores demonstram que a maior parte das ceacutelulas dos fiacutegados nas fecircmeas de A
bimaculatus satildeo hepatoacutecitos como descrito em outras espeacutecies de peixes
O aumento da quantidade de macroacutefagos na concentraccedilatildeo 115microgL-1 dos
experimentos foi superior quando comparado aos demais grupos sugerindo que essa
mobilizaccedilatildeo pode estar ajudando na detoxicaccedilatildeo do fiacutegado (Herraez et al 1986)
Assim a presenccedila de maior quantidade de macroacutefagos e sinusoides podem ser
consideradas indicadoras de estresse em peixes decorrentes da presenccedila de agentes
quiacutemicos (Anderson amp Zeeman 1995 Rabitto et al 2005) Essas ceacutelulas satildeo
observadas frequentemente nas regiotildees proacuteximas aos sinusoides e desprovidas de
pigmentaccedilatildeo Foram observados macroacutefagos em trutas Oncorhynchus mykiss e Salmo
trutta fario na proporccedilatildeo de 02 e 07 respectivamente (Hampton et al 1985
Rocha et al 1997) enquanto no presente estudo variou entre 021 a 029 Meseguer
et al (1994) observaram macroacutefagos livres abundantes no parecircnquima do fiacutegado
sugerindo que estes se movem livremente dentro do parecircnquima formando os
agregados macrofaacutegicos quando haacute um aumento na atividade fagociacutetica como resposta
imune a lesotildees em indiviacuteduos expostos a contaminantes Entretanto no presente estudo
natildeo foram observadas estas caracteriacutesticas
Ainda vale ressaltar que esse toacutexico potencializa sua accedilatildeo em temperaturas mais
elevadas como aquelas observadas no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo
Estudando o efeito dos ciclodienos Correa et al (2001) Coutinho et al (2005) e
Capkin et al (2006) relataram que as alteraccedilotildees satildeo diretamente proporcionais agrave
50
temperatura da aacutegua ou seja quanto mais alta a temperatura mais toacutexicos os produtos
se tornam O experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
56microgL-1 registrou temperatura meacutedia da aacutegua em 269ordmC superior aos demais
experimentos Devido a isso uma resposta comum na intoxicaccedilatildeo em fiacutegados de peixes
eacute a diminuiccedilatildeo das reservas de glicogecircnio hepaacutetico (Seinen et al 1981 Ferguson 1989
Cyrino et al 2000) e iacutendice hepatossomaacutetico (Wester et al 1987 Wester et al 1988
Wester et al 2003 Glover et al 2007) evidenciada no presente estudo
No presente estudo percebeu-se que a accedilatildeo do Thiodanreg em concentraccedilotildees
subletais natildeo afetou o fiacutegado como um todo mas na forma de focos no parecircnquima
hepaacutetico nos diferentes experimentos Este tipo de lesatildeo pode estar associado agrave
concentraccedilatildeo do toacutexico utilizado tempo de exposiccedilatildeo e a via de contaminaccedilatildeo A
ventilaccedilatildeo branquial acelerada e a natildeo procura por alimentos nas primeiras 24 horas
observadas nos diferentes experimentos sugere que a entrada de aacutegua pela via branquial
foi a causa mais direta da absorccedilatildeo e difusatildeo do toacutexico para corrente sanguiacutenea ateacute
chegar ao fiacutegado No entanto a via epideacutermica tambeacutem poder ser considerada via de
entrada do toacutexico para os tecidos (Mckim et al 1999)
As alteraccedilotildees observadas nos fiacutegados podem afetar diretamente o metabolismo
das fecircmeas causando diminuiccedilatildeo da capacidade fisica e tornar os peixes uma presa faacutecil
para seus predadores Neste sentido os peixes poderatildeo ter menor sucesso reprodutivo e
se tornarem menos competitivos pelo alimento Do ponto de vista ecoloacutegico isso pode
acarretar alteraccedilotildees na populaccedilatildeo e na cadeia alimentar (Rodrigues amp Fanta 1998)
Nas condiccedilotildees que o estudo foi realizado como as concentraccedilotildees do inseticida
Thiodanreg que foram utilizadas o periacuteodo de exposiccedilatildeo e a espeacutecie de estudo conclui-se
que as fecircmeas podem estar em um processo inicial de intoxicaccedilatildeo um processo
patoloacutegico de recuperaccedilatildeo reversiacutevel
51
Figura 1 A Organizaccedilatildeo histoloacutegica do tecido hepaacutetico normal de A bimaculatus B Infiltrado leucocitaacuterio (IL) no tecido hepaacutetico de A bimaculatus C Hepatoacutecito com vesiacutecula clara (Vc) envolvida por glicogecircnio (G) marcado positivamente pela reaccedilatildeo de PAS e nuacutecleo (seta) deslocado na periferia da ceacutelula no experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo 56microgL-1 D Hepatoacutecito com ausecircncia de glicogecircnio evidenciada pela reaccedilatildeo negativa de PAS no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo 56microgL-1 Alteraccedilotildees de estaacutedio I - E Hepatoacutecito com nuacutecleo (seta) na perifieria F Atrofia nuclear (an) G Deformaccedilatildeo nuclear (dn) Nuacutecleo (N) e citoplasma (C) do hepatoacutecito sinusoacuteide (S) capilar (P) com hemaacutecias no interior acuacutemulo de glicogecircnio (G) no citoplasma e macroacutefagos (M) Barras A (30) B (65 microm) C e D (20 microm) E F e G (28 microm) Coloraccedilatildeo Azul de toluiacutedina em A-B e E-G e PAS em C e D
G S G
N
C
M
M
an
F E
Vc
IL G
B
C
A
D
G
dn
N
C
G
52
Dn
A
E
B
F
Figura 2 Alteraccedilotildees histoloacutegicas do tecido hepaacutetico de A bimaculatus Alteraccedilotildees de estaacutedio I-A Hipertrofia celular (seta) B Hipertrofia nuclear (seta) Alteraccedilotildees de estaacutedio II - C Degeneraccedilatildeo nuclear (Dn) D Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica (Dc) E Hiperemia () F Presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos (setas) Barras A B e E (30 microm) C D e F (25 microm) Coloraccedilatildeo Azul de toluiacutedina
C
A
Dc
D
53
Tabela 2 Valores meacutedios das temperaturas durante a realizaccedilatildeo dos experimentos
Tratamento Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Experimento 4 Controle 268plusmn105 254plusmn049 248plusmn069 250plusmn049
115mgL-1 271plusmn104 256plusmn059 247plusmn045 245plusmn040 23mgL-1 269plusmn117 255plusmn048 244plusmn062 247plusmn043 56mgL-1 269plusmn118 254plusmn048 244plusmn063 247plusmn038
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Legenda Experimento 1 - sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo Experimento 2 - sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo Experimento 3 - com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo Experimento 4 ndash com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
Tabela 3 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquantitativa das alteraccedilotildees
histoloacutegicas (VMA) em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 130 plusmn 020a 210 plusmn 030b 215 plusmn 019b 216 plusmn 011b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 130 plusmn 012a 190 plusmn 020b 190 plusmn 008aᵇ 228 plusmn 056b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 125 plusmn 012a 210 plusmn 021b 206 plusmn 017b 218 plusmn 027b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 130 plusmn 014a 200 plusmn 025b 221 plusmn 035b 228 plusmn 021b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 4 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquantitativa dos iacutendices das
alteraccedilotildees histoloacutegicas (IAH) em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 883plusmn1034a 1850plusmn1009aᵇ 2883plusmn832b 2566plusmn550aᵇ
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 433plusmn557a 2883plusmn 810b 2780plusmn1388b 2766plusmn571b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 566plusmn 585a 2600plusmn773b 2550plusmn1078b 2733plusmn920b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 750plusmn512a 2217plusmn780b 2033plusmn875b 2366plusmn880b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Duncan
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Tabela 5 Diacircmetro meacutedio (microm) de nuacutecleos de hepatoacutecitos em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 461 plusmn 040aᶜ 498 plusmn 020b 487 plusmn 028b 439 plusmn 027c
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 516 plusmn 071a 501plusmn 040a 502 plusmn 020a 515plusmn025a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 494 plusmn 019a 496 plusmn 036a 492 plusmn 082a 508 plusmn 033a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 561 plusmn 044aᶜ 524 plusmn 040b ᶜ 509 plusmn 028b 533 plusmn 019c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 6 Diacircmetro meacutedio (microm) de citoplasmas de hepatoacutecitos de fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 885 plusmn 099a 1022 plusmn 109b 974 plusmn 080b 1005plusmn129b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1084 plusmn 136a 987 plusmn 153b 975 plusmn 081b 931 plusmn 080b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 960 plusmn 095a 1022 plusmn 094b 1003plusmn120aᵇ 1033 plusmn 108b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1086plusmn130aᵇ 104 plusmn 135b ᶜ 1022 plusmn 138c 1022 plusmn 106c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 7 Quantificaccedilatildeo meacutedia de nuacutecleos de hepatoacutecitos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 2553 plusmn 494a 298 plusmn 464b 284 plusmn 459b 291 plusmn 374b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 2371 plusmn 490a 289 plusmn 541b 289 plusmn 545b 290 plusmn 514b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 2560 plusmn 538a 294 plusmn 480b 286 plusmn 555b 293 plusmn 552b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 2770 plusmn 594a 314 plusmn 1028b 347 plusmn 664b ᶜ 322 plusmn 654c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
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Tabela 8 Quantificaccedilatildeo meacutedia de citoplasmas no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 39551 plusmn 1056a 39666 plusmn 877a 39360 plusmn 1526a 40080 plusmn 727a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 39996 plusmn 1307a 39830 plusmn 722a 39618 plusmn 1143ab 38865 plusmn 1954b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 39603 plusmn 1755a 39011 plusmn 1620b 39445 plusmn 1388aᵇ 39205 plusmn 2212aᵇ
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 39381 plusmn 3025a 38555 plusmn 2723b 39036 plusmn 2275aᵇ 39136 plusmn 1892b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Tabela 9 Quantificaccedilatildeo meacutedia de macroacutefagos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2
de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 120 plusmn 113a 125 plusmn 089a 101 plusmn 100a 106 plusmn 094a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 101 plusmn 101a 124 plusmn 079a 102 plusmn 084a 131 plusmn 092a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 098 plusmn 089a 128 plusmn 097a 115 plusmn 095a 096 plusmn 090a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 101 plusmn 094a 128 plusmn 109a 086 plusmn 079a 101 plusmn 079a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Tabela 10 Quantificaccedilatildeo meacutedia de vasos sanguiacuteneos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 1875 plusmn 239a 133 plusmn 346a 1796 plusmn 1210a 1103 plusmn 465a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1603 plusmn 784aᵇ 1260 plusmn 532a 1409 plusmn 631aᵇ 2203 plusmn 685b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 1830 plusmn 579a 2036 plusmn 773a 1681 plusmn 560a 1865 plusmn 964a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1850 plusmn 1400a 1831 plusmn 1326a 1510 plusmn 774a 1645 plusmn 739a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
56
Tabela 11 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquatitativa de glicogecircnio nos hepatoacutecitos de fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 133 plusmn 051aᵇ 266 plusmn 081a 300 plusmn 000a 010plusmn 010b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 133 plusmn 051a 180 plusmn 109a 200 plusmn 109a 233 plusmn 103a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 216 plusmn 098a 116 plusmn 040a 216 plusmn 098a 233 plusmn 103a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 266 plusmn 081a 233 plusmn 103a 233 plusmn 103a 216 plusmn 098a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis Tabela 12 Iacutendice hepatossomaacutetico de fecircmeas de lambaris A bimaculatus nos grupos
controles e grupos expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 070 plusmn 014aᵇ 088 plusmn 03a 084 plusmn 038a 038 plusmn 031b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 113 plusmn 054a 104 plusmn 061a 102 plusmn 050a 102 plusmn 051a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 066 plusmn 029a 073 plusmn 020a 092 plusmn 017a 091 plusmn 012a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 074 plusmn 034a 072 plusmn 029a 094 plusmn 040a 063 plusmn 018a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Duncan
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52 CAPIacuteTULO 2
EFEITOS DO INSETICIDA THIODAN reg SOBRE A MORFOLOGIA DO
DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM LAMBARIS Astyanax bimaculatus
RESUMO
O Thiodanreg eacute um toacutexico que pode causar alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos tecidos de peixes
expostos dependendo da concentraccedilatildeo A fim de investigar possiacuteveis alteraccedilotildees este
estudo avaliou a morfologia ovariana de lambaris Astyanax bimaculatus expostos ao
Thiodanreg (endosulfan 350gL) por 96 horas em quatro diferentes experimentos com trecircs
concentraccedilotildees subletais 115 23 e 56 microgL As fecircmeas expostas ao Thiodanreg foram
divididas em quatro experimentos sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem
aclimataccedilatildeo e alimentados com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e com
aclimataccedilatildeo de 10 dias e alimentados No presente estudo percebeu-se que a accedilatildeo do
Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou a morfologia do desenvolvimento
folicular Poreacutem os experimentos com aclimataccedilatildeo demonstraram quantidades
inferiores de foliacuteculos primaacuterios e secundaacuterios quando comparados aos peixes dos
experimentos sem aclimataccedilatildeo Houve maior quantidade de foliacuteculos atreacutesicos nos
grupos expostos ao Thiodanreg em relaccedilatildeo ao grupo controle O diacircmetro folicular nos
foliacuteculos secundaacuterios dos peixes expostos ao Thiodanreg no experimento com
adaptaccedilatildeocom alimentaccedilatildeo foi maior em relaccedilatildeo ao grupo controle Aleacutem disso as
meacutedias dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS) e hepatossomaacutetico (IHS) dos experimentos
com aclimataccedilatildeo foram inferiores aos experimentos sem aclimataccedilatildeo Esses dados
sugerem que o eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-ovaacuterio pode estar sendo afetado pelo ambiente
ao qual o peixe foi submetido podendo causar comprometimento na fisiologia do
desenvolvimento folicular
Palavras-chave histopatologia ovaacuterio peixe contaminaccedilatildeo aquaacutetica
63
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 α-endosulfan e 30 β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo
por meio da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em riscos os organismos que ali
residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al 2007)
Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos como jaacute
observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis niloticus
No entanto a Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan em
gordura valores de 005mgkg-1 (EPA 2002) e para aacutegua doce 022microgL-1 (EPA 1980)
A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em consideraccedilatildeo a
qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente Resoluccedilatildeo
CONAMA - nordm 3572005 estabelece o valor limite de 0056gL de resiacuteduo do referido
inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
Muitos inseticidas apresentam baixa toxicidade antes de serem transformados
em substacircncias toacutexicas metabolicamente ativas O sulfato de endosulfan eacute um dos
produtos derivados do metabolismo do endosulfan sendo considerado o principal
metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica por ser mais estaacutevel no meio
ambiente do que em sua foacutermula original (Ali et al 1984) A sensibilidade ao
endosulfan em organismos aquaacuteticos tem sido descrita na literatura (Capkin et al 2006
Ballesteros et al 2007 Pereira et al 2012) O produto eacute extremamente toacutexico para os
peixes e outros organismos aquaacuteticos mesmo em concentraccedilotildees muito pequenas
(Cengiz et al 2001) como verificado tambeacutem por Ballesteros et al (2007) com peixes
adultos da espeacutecie Jenynsia multidentata sob o efeito do endosulfan por 96 horas
utilizando concentraccedilotildees de 072 μgL e 131 μgL em machos e fecircmeas
respectivamente
Em peixes o desenvolvimento folicular tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Begovac amp Wallace 1988 Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter
1996 Grier 2000 2002 e 2007) e como nos animais em geral compreende os periacuteodos
preacute-meioacutetico perinucleolar vitelogecircnico e maturaccedilatildeo final Estas fases ocorrem no
64
interior de foliacuteculos cuja parede eacute constituiacuteda por zona radiata camada folicular
membrana basal e teca (Grier 2000) e que desempenham importante papel durante a
ovogecircnese e fertilizaccedilatildeo Quando a qualidade da aacutegua eacute alterada devido a xenobioacuteticos
a gametogecircnese pode ser alterada comprometendo a fertilizaccedilatildeo e a qualidade do ovo
(Chatterjee et al 1997) Assim os peixes quando expostos a inseticidas podem
apresentar alteraccedilotildees morfoloacutegicas significativas no ovaacuterio
Alguns trabalhos mostram diversas alteraccedilotildees provocadas nos foliacuteculos por
contaminantes como por exemplo retraccedilatildeo citoplasmaacutetica degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica
adesatildeo folicular aparecimento de foliacuteculos anucleados necrose e alteraccedilatildeo no diacircmetro
dos foliacuteculos (Hazarika amp Das 1998 Dutta et al 2003 Maxwell amp Dutta 2005) Aleacutem
disso pode ocorrer a atresia folicular que eacute um processo frequentemente observado nos
ovaacuterios dos vertebrados (Saidapur 1978) sendo causada por diversos fatores como
agrotoacutexicos temperatura luz alimentaccedilatildeo inadequada e confinamento (Nagahama
1983 Guraya 1986) Outro fator importante eacute a concentraccedilatildeo hormonal que pode
interferir na siacutentese de vitelogenina e causar efeitos negativos associados com a
quantidade de foliacuteculos preacute-vitelogecircnicos e vitelogecircnicos durante o desenvolvimento
folicular (Chatterjee et al 1997) No entanto alteraccedilotildees no estado de sauacutede provocadas
por concentraccedilotildees de contaminamtes que natildeo matam os peixes em curto prazo e que
podem ser consideradas seguras podem sugerir consequecircncias na reproduccedilatildeo e
interferecircncia na cadeia alimentar Esse tipo de estudo eacute de grande importacircncia para se
avaliar impactos provocados por diferentes tratamentos sobre o desenvolvimento de
foliacuteculos que poderiam interferir na reproduccedilatildeo de peixes
O lambari Astyanax bimaculatus foi escolhido como organismo experimental
pois eacute representativo no ecossistema sendo encontrado desde Nordeste brasileiro ateacute a
bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Eacute um peixe de pequeno porte e
de faacutecil manutenccedilatildeo em laboratoacuterio
Este estudo teve como objetivo analisar as alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos
diferentes estaacutedios do desenvolvimento folicular em ensaios subletais com o toacutexico
Thiodanreg
65
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste subletal e as atividades de coleta As etapas
de fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos ovaacuterios microtomia coloraccedilatildeo de lacircminas
histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e morfomeacutetricas foram realizadas nos
Laboratoacuterios de Biologia de Peixes e de Histopatologia do Departamento de Veterinaacuteria
da UFV
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos animais em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado e poro genital
dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV e
mantidos em aquaacuterios com capacidade de 50 litros numa densidade de 05g de peixe por
litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro temperatura controlada e monitoramento
duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e
aeraccedilatildeo continua de aacutegua para garantir o bem-estar dos peixes Os peixes foram
alimentados com raccedilatildeo comercial Purina contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia
de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
66
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste de toxicidade subletal em sistema estaacutetico
O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi realizado utilizando-se 120
lambaris tendo por base as normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico (NBR 15088
- ABNT 2007)
As fecircmeas foram expostas ao Thiodanreg (endosulfan 350gL) por 96 horas em
quatro diferentes experimentos sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem aclimataccedilatildeo e
com alimentaccedilatildeo com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e com aclimataccedilatildeo de
10 dias e com alimentaccedilatildeo Foram utilizadas trecircs concentraccedilotildees do Thiodanreg inferiores
agrave CL50 preacute-determinada (137microgL) em laboratoacuterio de acordo com a NBR 15088
(ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas em cada experimento foram de 115 23 e
56microgL-1 aleacutem de um grupo controle sem toacutexico com trecircs repeticcedilotildees nas mesmas
condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
24 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas
Apoacutes 96 horas de experimento foram coletados 96 peixes sendo seis animais de
cada grupo nos diferentes experimentos Os ovaacuterios foram coletados apoacutes os peixes
terem sido anestesiados com benzocaiacutena (110000) e eutanasiados pela secccedilatildeo
transversal da coluna vertebral na regiatildeo do opeacuterculo
Para a histologia os ovaacuterios foram fixados em paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo
fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedos em resina glicolmetacrilato (Leica
Historesin) Em seguida secccedilotildees 3microm de espessura foram coradas utilizando
hematoxilinaeosina para anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas As lacircminas foram
montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e
as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
Para os estudos morfoloacutegicos foram analisadas lacircminas de seis animais por
concentraccedilatildeo As secccedilotildees histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo em busca
de alteraccedilotildees morfoloacutegicas foliculares (Tabela 1) que pudessem ser representativas da
67
accedilatildeo do Thiodanreg no tecido ovariano sempre comparando estas alteraccedilotildees com o
padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios das lacircminas dos grupos controles
Para a avaliaccedilatildeo morfomeacutetrica foram realizadas contagens dos diferentes
estaacutedios de desenvolvimento folicular Para isto foram fotografados ao acaso 10
campos com objetiva de 10X (cada campo com 5094 microm de largura por 6812 microm de
comprimento totalizando uma aacuterea de 347 mmsup2) As contagens foram realizadas em 10
campos escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro experimentos Aleacutem disso foi
realizada a contagem de foliacuteculos atreacutesicos e observados eosinoacutefilos associados aos
foliacuteculos vitelogecircnicos utilizando o microscoacutepio com objetiva de 40X em 10 foliacuteculos
escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro tratamentos experimentais Tambeacutem
foram realizadas mediccedilotildees de diacircmetros em 10 foliacuteculos vitelogecircnicos para cada animal
Foram escolhidos foliacuteculos o mais esfeacutericos possiacutevel com corte passando pelo nuacutecleo
Estas medidas foram obtidas por meio do programa Image-Pro Plus traccedilando-se duas
linhas perpendiculares sobre nuacutecleo e respeitando-se os limites do foliacuteculo Em todas as
contagens e mediccedilotildees foram calculados os valores meacutedios e desvios-padratildeo para cada
concentraccedilatildeo para se avaliar o desenvolvimento folicular nos diferentes experimentos
Tabela 1 Alteraccedilotildees histoloacutegicas quanto ao comprometimento do desenvolvimento folicular (adaptado de Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS FOLICULARES Alteraccedilatildeo nos foliacuteculos Descolamento do revestimento folicular Retraccedilatildeo citoplasmaacutetica Retraccedilatildeo nuclear Atresia folicular Aglutinaccedilatildeo nucleoplasmaacutetica Aglutinaccedilatildeo citoplasmaacutetica Aglutinaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo Foliacuteculos com ausecircncia de citoplasma e nuacutecleo Granuloacutecitos envolvendo foliculos
25 Paracircmetros biomeacutetricos
Foram registrados para cada exemplar os seguintes dados biomeacutetricos peso
corporal (PC em g) peso dos ovaacuterios (PO em g) e peso do fiacutegado (PF em g) Os
valores meacutedios e os desvios padratildeo dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS=POx100PC) e
68
hepatossomaacutetico (IHS=PFx100PC) foram calculados para cada animal em cada um
dos grupos nos diferentes experimentos
26 Anaacutelises estatiacutesticas
Os dados foram apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo e avaliados pelo
Software Statistica 70 por meio da anaacutelise de variacircncia (ANOVA) Apoacutes o teste de
distribuiccedilatildeo normal os dados foram comparados entres os grupos controle e grupos
expostos ao Thiodanreg usando anaacutelise de variacircncia one-way seguida do teste de Tukey
ou Duncan Quando os dados natildeo apresentaram uma distribuiccedilatildeo normal foi utilizado o
teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis Plt005 foi utilizado como criteacuterio de
significacircncia
3 RESULTADOS
31 Desenvolvimento folicular
O desenvolvimento folicular de A bimaculatus do presente estudo foi dividido em
duas etapas desenvolvimento primaacuterio e desenvolvimento secundaacuterio
Para facilitar a compreensatildeo o desenvolvimento primaacuterio em A bimaculatus foi
subdividido em dois estaacutedios desenvolvimento primaacuterio inicial e desenvolvimento
primaacuterio avanccedilado (Figuras 1 A e B) No desenvolvimento primaacuterio inicial os foliacuteculos
apresentaram citoplasma fortemente basoacutefilo nuacutecleo esfeacuterico um ou mais nucleacuteolos
dispersos pelo nucleoplasma e estavam envoltos por ceacutelulas foliculares pavimentosas
(Figura 1 A) Durante o desenvolvimento primaacuterio avanccedilado o citoplasma do foliacuteculo
torna-se menos basoacutefilo que a etapa anterior o nuacutecleo eacute esfeacuterico um ou mais nucleacuteolos
dispersos que estatildeo associados ao envoltoacuterio nuclear (Figura 1 B) A camada de ceacutelulas
foliculares eacute pavimentosa com o nuacutecleo alongado Entre as ceacutelulas foliculares e o
citoplasma do foliacuteculo aparece a zona radiata como uma fina camada (Figura 1 B) Na
regiatildeo mais externa do foliacuteculo aparecem associadas ao mesmo as ceacutelulas da teca
O desenvolvimento secundaacuterio em A bimaculatus foi subdividido em trecircs
estaacutedios desenvolvimento secundaacuterio inicial desenvolvimento intermediaacuterio e
desenvolvimento avanccedilado No desenvolvimento secundaacuterio inicial o volume
citoplasmaacutetico aumentou mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo e o foliacuteculo neste estaacutedio
apresentou um diacircmetro maior que o estaacutedio anterior O nuacutecleo eacute central ligeiramente
acidoacutefilo com nucleacuteolos pequenos e dispersos pelo nucleoplasma O citoplasma eacute
69
granular e fracamente basoacutefilo com a presenccedila de vesiacuteculas corticais pequenas e claras
na periferia do citoplasma (Figura 1 C) Em seguida ocorre um aumento no diacircmetro do
foliacuteculo e inicia-se a deposiccedilatildeo de vitelo a partir da regiatildeo perifeacuterica o que permitiu
classificar esse estaacutedio como desenvolvimento secundaacuterio intermediaacuterio (Figura 1 D)
No estaacutedio de desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado o volume citoplasmaacutetico
aumentou mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo tendo o foliacuteculo neste estaacutedio um diacircmetro maior
quando comparado aos estaacutedios anteriores Nessa etapa do desenvolvimento o
citoplasma do foliacuteculo estaacute preenchido com gloacutebulos de vitelo (Figura 1 D) A
maturaccedilatildeo final eacute caracterizada pela formaccedilatildeo do aparelho micropilar zona radiata
espessa e nuacutecleo deslocado em direccedilatildeo ao aparelho micropilar
Os foliacuteculos ovarianos dos lambaris apresentaram morfologia normal nas
diferentes concentraccedilotildees de Thiodanreg (Figuras 1 A-D)
32 Atresia folicular
A atresia folicular foi caracterizada em trecircs diferentes etapas nos ovaacuterios de A
bimaculatus atresia inicial intermediaacuteria e avanccedilada A atresia folicular inicial eacute
caracterizada pela descontinuidade da zona radiata e hipertrofia das ceacutelulas foliculares
(Figura 2 A) Nesse momento da atresia folicular foram evidenciadas ceacutelulas do tipo
granuloacutecito entre a membrana basal e ceacutelulas da teca na maioria dos foliacuteculos
observados (Figura 2 B) Na sequecircncia do processo atresia folicular intermediaacuteria
ocorre o iniacutecio da fusatildeo e liquefaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo desintegraccedilatildeo e
fragmentaccedilatildeo da zona radiata hipertrofia das ceacutelulas foliculares que se tornam
vacuolizadas e contecircm material granular de aspecto similar aos gloacutebulos de vitelo e
invasatildeo do citoplasma pelas ceacutelulas foliculares (Figura 2 C) Na atresia avanccedilada as
ceacutelulas foliculares absorvem os resiacuteduos finais do foliacuteculo levando a uma diminuiccedilatildeo
do tamanho do foliacuteculo atreacutesico (Figura 2 D)
33 Quantificaccedilatildeo dos foliacuteculos ovarianos
A quantidade de foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio inicial entre as fecircmeas
do mesmo experimento natildeo mostrou diferenccedilas entre si (Pgt005) (Figura 3) Quando
foram comparados os diferentes experimentos nos mesmos grupos foi registrada maior
quantidade de foliacuteculos primaacuterios iniciais nas fecircmeas do grupo controle do experimento
com aclimataccedilatildeoalimentaccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo agraves fecircmeas dos grupos controle dos
70
experimentos sem aclimataccedilatildeo (Figura 3) Aleacutem disso foi observada maior quantidade
de foliacuteculos primaacuterios iniciais na concentraccedilatildeo de 23microgL do experimento com
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo em relaccedilatildeo ao experimento sem aclimataccedilatildeocom
alimentaccedilatildeo (Plt005) (Figura 3)
Na contagem de foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado entre fecircmeas
do mesmo experimento natildeo houve diferenccedilas nas meacutedias obtidas (Figura 4) No entanto
quando comparados os mesmos grupos entre os diferentes experimentos verificou-se
que no estaacutedio de desenvolvimento primaacuterio avanccedilado houve maior quantidade de
foliacuteculos no grupo controle do experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Plt005)
em relaccedilatildeo ao experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo assim como no
experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Figura 4) Quando comparados os
grupos da concentraccedilatildeo 115microgL registrou-se maior quantidade de foliacuteculos no
experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo ao experimento
sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Figura 4) Entre as fecircmeas dos grupos da
concentraccedilatildeo 23microgL foi registrada maior quantidade de foliacuteculos nos experimentos
com aclimataccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo agraves fecircmeas dos experimentos sem aclimataccedilatildeo
(Figura 4)
Na contagem de foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio inicial nas fecircmeas do
experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo houve maior quantidade de foliacuteculos na
concentraccedilatildeo 56microgL (Plt005) em relaccedilatildeo agrave concentraccedilatildeo de 115microgL (Figura 5) mas
natildeo com o controle Ao comparar as fecircmeas dos diferentes experimentos dos mesmos
grupos houve maior quantidade de foliacuteculos secundaacuterios iniciais (Plt005) na
concentraccedilatildeo 115microgL do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e
experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo em relaccedilatildeo ao experimento sem
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Figura
5)
Em relaccedilatildeo as contagens de foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio
intermediaacuterio e avanccedilado natildeo houve diferenccedilas entre as fecircmeas (Pgt005) (Figuras 6 e 7)
34 Quantificaccedilatildeo dos foliacuteculos atreacutesicos
Nas contagens de foliacuteculos atreacutesicos iniciais nas fecircmeas de A bimaculatus dos
diferentes experimentos natildeo foram constatadas diferenccedilas (Pgt005) (Figura 8) As
contagens de atresia total representaram as somas das contagens de atresias inicial
intermediaacuteria e avanccedilada As contagens de atresia total natildeo mostraram diferenccedilas nos
71
experimentos embora o nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos mostrasse tendecircncia crescente
nos grupos tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos (Figura 9) Entretanto
foi observado maior nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos nas fecircmeas dos experimentos com
aclimataccedilatildeo de 10 dias em relaccedilatildeo aos experimentos sem aclimataccedilatildeo (Figura 9)
35 Diacircmetro dos foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado
Os valores meacutedios nos diacircmetros dos foliacuteculos secundaacuterio avanccedilado nas fecircmeas
do experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo demonstraram aumento (Plt005) nas
concentraccedilotildees 115microgL (57837plusmn5977microm) e 56microgL (57311plusmn6178microm) de Thiodanreg
em relaccedilatildeo agraves fecircmeas do grupo controle (51606plusmn5757 microm) Nos demais experimentos
natildeo foram registradas diferenccedilas entre os foliacuteculos (Pgt005) apesar de ter sido
observado na maioria dos grupos essa mesma tendecircncia de aumento do diacircmetro dos
foliacuteculos (Tabela 2)
36 Paracircmetros biomeacutetricos
As fecircmeas de A bimaculatus dos grupos expostos ao Thiodanreg natildeo apresentaram
diferenccedilas (Pgt005) nos valores dos IGS e IHS quando comparados com os grupos
controles (Tabelas 3 e 4) No entanto as fecircmeas dos experimentos com aclimataccedilatildeo
apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores dos IGS e IHS quando comparados aos
experimentos sem aclimataccedilatildeo (Tabelas 3 e 4)
4 DISCUSSAtildeO
Em peixes teleoacutesteos o tipo de desenvolvimento folicular pode ser assincrocircnico
com a presenccedila de foliacuteculos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento (Nagahama
1983 Connaughton et al 1998 Selman et al 1986) assim como na presente espeacutecie
deste estudo Os ovaacuterios das fecircmeas de A bimaculatus submetidas ao efeito do
Thiodanreg apresentaram foliacuteculos ovarianos em diferentes fases de desenvolvimento com
variaccedilotildees na estrutura do foliacuteculo como diacircmetro caracteriacutesticas do nuacutecleo camadas
envoltoacuterias composiccedilatildeo e distribuiccedilatildeo do vitelo conforme observado em outras
espeacutecies do gecircnero (Miranda 1996 Miranda et al 1999 Melo et al 2005 Mazzoni et
al 2005 Rodrigues et al 2005 Hernan Da Cuntildea et al 2011)
Ao contraacuterio do presente estudo Dutta et al (2008) ao submeterem as fecircmeas da
espeacutecie Lepomis macrochirus a trecircs concentraccedilotildees diferentes (025 075 e 1 microgL) de
endosulfan observaram comprometimento do desenvolvimento folicular com retraccedilatildeo
72
nuclear e citoplasmaacutetica na menor concentraccedilatildeo enquanto nos foliacuteculos em maturaccedilatildeo
avanccedilada foi observado um aspecto vazio sem conteuacutedo citoplasmaacutetico na
concentraccedilatildeo de 075 microgL Aleacutem disso na concentraccedilatildeo de 1microgL os autores
encontraram maior grau de deformaccedilotildees com foliacuteculos vazios sem a presenccedila de
foliacuteculos ou alteraccedilotildees do nuacutecleo e perda do material nuclear que eacute relatado como
necrose nuclear No trabalho conduzido por Chartterjee et al (1997) foi avaliada a accedilatildeo
do carbofuram no desenvolvimento folicular na espeacutecie Heteropneustes fossilis
encontrando-se degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica e na camada folicular de foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio Entretanto Hernan Da Cuntildea et al (2011) natildeo
observaram alteraccedilotildees nos ovaacuterios em peixes expostos ao endosulfan No estudo
realizado por Ballesteros et al (2007) utilizando peixes machos e fecircmeas da espeacutecie
Jenynsia multidentata foi verificado que o maior teor de lipiacutedeos nas fecircmeas eacute um fator
importante para esclarecer a maior resistecircncia contra o endosulfan ao contraacuterio dos
machos que satildeo mais suceptiacuteveis neste caso De acordo com este resultado descrito na
literatura pode-se inferir que este fator poder ter interferido na maior resistecircncia das
fecircmeas de A bimaculatus em periacuteodo reprodutivo agraves concentraccedilotildees de Thiodanreg
testadas
Alguns estudos tecircm esclarecido a interferecircncia de poluentes na quantidade de
foliacuteculos nos diferentes estaacutedios do desenvolvimento folicular em peixes Os trabalhos
de Chartterjee et al (1997) Jensen et al (2004) Dutta amp Dalal (2008) e Chakrabarty et
al (2012) avaliaram os efeitos de pesticidas encontrando maior quantidade de foliacuteculos
primaacuterios no grupo tratado em relaccedilatildeo ao grupo controle assim como em peixes
mantidos em cativeiros (Honji et al 2009) Em outro estudo (Chatterjee et al 2001) os
pesquisadores encontraram por meio de anaacutelises histoloacutegicas da hipoacutefise a
possibilidade do carbofuran afetar as ceacutelulas produtoras de GnRH do hipotaacutelamo
prejudicando o eixo hipoacutefise-gocircnada e comprometendo a viabilidade no
desenvolvimento folicular jaacute Chakrabarty et al (2012) verificaram em peixes tratados
com endosulfan concentraccedilatildeo inferior de GnRH e superior da aromatase quando
comparados com o gurupo controle caracterizando que o endosulfan pode atuar como
disruptor endoacutecrino (Lemaire et al 2006) que pode aumentar a biossiacutentese do estradiol
para promover um raacutepido desenvolvimento folicular (Chakrabarty et al 2012) Estes
resultados podem ajudar a esclarecer os resultados do presente trabalho onde se
observou maior quantidade de foliacuteculos primaacuterios iniciais e primaacuterios avanccedilados nos
experimentos com aclimataccedilatildeo quando comparados com os experimentos sem
73
aclimataccedilatildeo sugerindo uma possiacutevel desregulaccedilatildeo endoacutecrina no eixo hipoacutefise-gocircnada
nos peixes aclimatados em aquaacuterios por 10 dias Aleacutem disso as concetraccedilotildees hormonais
e enzimaacuteticas relacionadas ao desenvolvimento folicular podem estar supostamente
alteradas em A bimaculatus mas satildeo necessaacuterios estudos fisioloacutegicos para essa
provaacutevel confirmaccedilatildeo
O processo de atresia folicular no lambari A bimaculatus foi semelhante ao
descrito por Miranda et al (1999) Munoz et al (2002) Melo et al (2005) e Santos et
al (2005) O processo da atresia que ocorre nos foliacuteculos secundaacuterios eacute do tipo
hipertroacutefico devido agrave hipertrofia e hiperplasia das ceacutelulas foliculares (Vizziano amp
Berois 1990) No trabalho realizado por Coward amp Bromage (1998) na espeacutecie Tilapia
zilli foi verificado aumento de foliacuteculos atreacutesicos em experimento com duraccedilatildeo entre 18
e 26 dias assim como verificado no trabalho de Jensen et al (2004) quando utilizaram a
substacircncia flutamida De acordo com estes autores isto pode reduzir a fecundidade e
tambeacutem influenciar na qualidade do foliacuteculo Linares-Casenave et al (2002) explicam
que o processo de atresia estaacute associado com desregulaccedilatildeo das concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de estradiol testosterona e vitelogenina Portanto o aumento da quantidade
dos foliacuteculos atreacutesicos nos grupos expostos ao Thiodanreg e a maior quantidade de atresia
nos experimentos com aclimataccedilatildeo mesmo natildeo apresentando diferenccedilas estatiacutesticas
sugerem que pode estar iniciando desregulaccedilatildeo hormonal nestes peixes
A presenccedila de granuloacutecitos associados aos foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados em
lambari A bimaculatus nos diferentes experimentos pode ser associada agrave reaccedilatildeo
imunoloacutegica em conjunto com as ceacutelulas foliculares assim como observado por alguns
autores (Drummond et al 2000 Santos et al 2005 Santos et al 2008) Aleacutem disso no
trabalho realizado por Santos et al (2008) foi detectada a presenccedila de proliferaccedilatildeo
celular (PCNA) nas ceacutelulas da teca de foliacuteculos em processo de atresia confirmando
que estas ceacutelulas podem estar se preparando para o processo de remodelaccedilatildeo ovariana
No entanto essas evidecircncias de granuloacutecitos associados aos foliacuteculos estatildeo de acordo
com o que jaacute foi observado em outros trabalhos caracterizando um processo fisioloacutegico
importante na regressatildeo folicular das fecircmeas de A bimaculatus expostas ao Thiodanreg
O diacircmetro dos foliacuteculos vitelogecircnicos eacute espeacutecie-especiacutefico poreacutem o Thiodanreg
alterou o diacircmetro folicular no experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo Esta
alteraccedilatildeo do diacircmetro que leva os foliacuteculos vitelogecircnicos a atingirem a maturaccedilatildeo pode
ser causada pelas diferenccedilas nas concentraccedilotildees de vitelogenina estradiol e aromatase
(Jensen et al 2004 Corriero et al 2007 Chakrabarty et al 2012) ou a mesma sendo
74
ligada aos receptores especiacuteficos nos foliacuteculos (Patintildeo amp Sullivan 2002 Bugel et al
2010) Bugel et al (2010) relataram a diminuiccedilatildeo da expressatildeo da vitelogenina no peixe
Fundulus heteroclitus em rio contaminado com pesticidas orgacircnicos persistentes o que
resultou na diminuiccedilatildeo da quantidade de foliacuteculos vitelogecircnicos enquanto Honji et al
(2009) relataram a baixa fecundidade e aumento do diacircmetro dos foliacuteculos nos peixes
Salminus hilari mantidos em cativeiro quando comparados com peixes de ambientes
naturais Contudo eacute necessaacuterio estudar as vias que conduzem a esta alteraccedilatildeo Estes
resultados mostram que diferentes vias podem afetar a reproduccedilatildeo dos peixes e que o
Thiodanreg pode estar agindo como desregulador endoacutecrino nos foliacuteculos secundaacuterios
avanccedilados de A bimaculatus
O IGS e IHS podem variar entre os peixes devido agraves diferenccedilas na sensibilidade
frente agrave exposiccedilatildeo a contaminantes periacuteodo reprodutivo e peixes mantidos em cativeiro
(Chatterjee et al 1997 Cyrino et al 2000 Jensen et al 2004 Honji et al 2009) No
entanto o fato das meacutedias dos IGS e IHS nos experimentos com aclimataccedilatildeo terem sido
menores quando comparadas com os experimentos sem aclimataccedilatildeo sugere associaccedilatildeo
entre quantidade inferior de foliacuteculos secundaacuterios e quantidade superior de atresia nos
experimentos com aclimataccedilatildeo assim como no trabalho de Chatterjee et al (1997) e
Bugel et al (2010) que verificaram diminuiccedilatildeo na taxa de foliacuteculos vitelogecircnicos e
IGS
A ventilaccedilatildeo branquial acelerada e a natildeo procura por alimentos nas primeiras 24
horas observadas nos diferentes experimentos sugere que a entrada de aacutegua pela via
branquial foi causa direta da absorccedilatildeo e difusatildeo do toacutexico no organismo No entanto a
via epideacutermica tambeacutem poder ser considerada via de entrada do toacutexico para os tecidos
(Mckim et al 1999) Portanto a exposiccedilatildeo dos peixes ao Thiodanreg e a aclimataccedilatildeo
foram fatores mais que afetaram o diacircmetro e a quantidade de foliacuteculos em A
bimaculatus Conforme as condiccedilotildees em que o estudo foi realizado levando-se em
consideraccedilatildeo as concentraccedilotildees do inseticida Thiodanreg utilizadas periacuteodo de exposiccedilatildeo e
espeacutecie de estudo demonstram que as fecircmeas analisadas podem estar em processo
inicial de intoxicaccedilatildeo com possiacutevel alteraccedilatildeo fisioloacutegica
75
A
opa
opi opa
vs
D
osint
osa
osa
gv gv
gv
osi
C
B
opa
opa
zr
vc
Figura 1 Desenvolvimento folicular ovariano de Astyanax bimaculatus A Estroma ovariano com foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio inicial (opi) e primaacuterio avanccedilado (opa) B Foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (opa) com ceacutelulas foliculares pavimentosas e zona radiata delgada (zr) C Foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio inicial (osi) possuindo ceacutelulas foliculares pavimentosas com zona radiata espessa (zr) e vesiacuteculas corticais claras (vc) na periferia do foliacuteculo D Foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio intermediaacuterio iniciando deposiccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo (osint) e foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (osa) com gloacutebulos de vitelo (gv) por todo o citoplasma vs vaso sanguiacuteneo Coloraccedilatildeo Hematoxilina-eosina Barra A e B (50 m) C (30 m) D (100 m)
zr
76
ai
gr gr
zr
h
av
A
ait
Figura 2 Foliacuteculos ovarianos de Astyanax bimaculatus em atresia A Atresia folicular inicial (ai) caracterizada pela quebra da zona radiata (zr) hipertrofia de ceacutelulas foliculares (cf) e presenccedila de granuloacutecitos (gr) B Detalhe de granuloacutecito (gr) sobre a regiatildeo de ceacutelulas foliculares C Atresia folicular intermediaacuteria (ait) caracterizada pela liquefaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo (gv) desintegraccedilatildeo da zona radiata e invasatildeo do citoplasma pelas ceacutelulas foliculares D Atresia folicular avanccedilada (av) caracterizada pela ausecircncia de gloacutebulos de vitelo Ceacutelulas da teca (t) hemaacutecias (h) Coloraccedilatildeo Hematoxilina-eosina Barra A (25 m) B (10 m) C (150 m) D (100 m)
gv
ai
B
C D
t
gv
77
Figura 3 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos primaacuterios iniciais por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e expostos ao Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dentro dos grupos (Plt005) pelo teste de Duncan Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
0
5
10
15
20
25
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
A A
AB
B
AB
A
AB
B
0
1
2
3
4
5
6
7
8
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 4 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos primaacuterios avanccedilados por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dentro dos grupos (Plt005) pelo teste de Duncan Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
A
BC AC
BD
AC
BC
AB A A
B
B
A
78
0
02
04
06
08
1
12
14
16
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedilas entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dos grupos com as mesmas concentraccedilotildees nos diferentes experimentos (Plt005) ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) Teste de Duncan
A
B
A
B
ab b
a ab
Figura 5 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios iniciais por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
0
01
02
03
04
05
06
07
08
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controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
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ad
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voacuteci
tos Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 6 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Plt005) pelo teste de Duncan
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1
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controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
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Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 7 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Duncan
Figura 8 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos atreacutesicos iniciais em ovaacuterios de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Kruskall Wallis
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03
controle 115microgL 23microgL 56microgL
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ad
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Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
80
Figura 9 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos atreacutesicos totais em ovaacuterios de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
0
005
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controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
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ad
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eacuted
ia d
e a
tre
sia
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Kruskall Wallis
81
Tabela 2 Diacircmetro meacutedio (microm) de foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados de lambaris A bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
53443 plusmn 7414a 53796 plusmn 7746a 53273 plusmn 8300a 50046 plusmn 5610a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
56807 plusmn 6647a 57517 plusmn 5849a 5904 plusmn 5889a 58449 plusmn 6849a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
53816 plusmn 5684a 51894 plusmn 6065a 55393 plusmn 6193a 54749 plusmn 6849a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
51606 plusmn 5757a 57837 plusmn 5977b 55774 plusmn 7870aᵇ 57311 plusmn 6178b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Tukey
Tabela 3 Iacutendice gonadossomaacutetico de fecircmeas de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
790 plusmn 318a 747 plusmn 221a 505 plusmn 263a 432 plusmn 255a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
856 plusmn 473a 813 plusmn 690a 702 plusmn 430a 683 plusmn 361a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
373 plusmn 213a 270 plusmn 147a 323 plusmn 189a 399 plusmn 201a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
227 plusmn 147a 303 plusmn 106a 305 plusmn 192a 293 plusmn 167a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Duncan
Tabela 4 Iacutendice hepatossomaacutetico de fecircmeas de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
07 plusmn 014aᵇ 088 plusmn 03a 084 plusmn 038a 038 plusmn 031b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
113 plusmn 054a 104 plusmn 061a 102 plusmn 050a 102 plusmn 051a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
066 plusmn 029a 073 plusmn 020a 092 plusmn 017a 091 plusmn 012a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
074 plusmn 034a 072 plusmn 029a 094 plusmn 040a 063 plusmn 018a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Duncan
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53 CAPIacuteTULO 3
RELACcedilAtildeO ENTRE COLAacuteGENO TIPO IV INTEGRINA β1 E CASPASE 3
DURANTE O DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM Astyanax bimaculatus
EXPOSTOS AO THIODAN reg
RESUMO
O agrotoacutexico Thiodanreg (350gL de endosulfan) eacute um inseticida organoclorado utilizado
em diversas monoculturas e pode chegar aos ecossistemas aquaacuteticos afetando a
reproduccedilatildeo e a integridade das populaccedilotildees de peixes Ovaacuterios de peixes apresentam
ovoacutecitos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento os quais satildeo envoltos por zona
radiata ceacutelulas foliculares membrana basal e ceacutelulas da teca formando o complexo
folicular A integridade do complexo folicular estaacute associada com a presenccedila de
colaacutegeno tipo IV e integrina β1 enquanto a caspase 3 eacute uma protease importante na via
apoptoacutetica participando ativamente nos processos de regressatildeo ovariana Pela carecircncia
de estudos que avaliam tais proteiacutenas no complexo folicular este estudo teve por
objetivo avaliar por meio de anaacutelise imunoistoquiacutemica a expressatildeo das proteiacutenas
colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspases 3 durante o desenvolvimento folicular do
lambari Astyanax bimaculatus exposto ao Thiodanreg Os peixes foram aclimatados
durante 10 dias em aquaacuterios de 50L com aeraccedilatildeo contiacutenua aacutegua sem cloro filtro
mecacircnico fotoperiacuteodo (12h) e temperatura (26plusmn1ordmC) controlados Para a exposiccedilatildeo ao
Thiodanreg os peixes foram divididos em quatro grupos controle 115 23 e 56 microgL
com trecircs repeticcedilotildees em cada concentraccedilatildeo Apoacutes 96 h seis peixes de cada grupo foram
anestesiados (benzocaiacutena110000) eutanasiados e seus ovaacuterios coletados para detecccedilatildeo
de colaacutegeno de tipo IV integrina β1 e caspase 3 Fragmentos dos ovaacuterios foram fixados
em paraformaldeiacutedo a 4 e incluiacutedos em parafina Os procedimentos de
imunomarcaccedilatildeo seguiram protocolos jaacute padronizados para os anticorpos empregados A
reaccedilatildeo foi revelada com diaminobenzidina e os cortes foram contracorados com
hematoxilina para avaliaccedilatildeo qualitativa em microscoacutepio de luz Os foliacuteculos primordiais
natildeo apresentaram marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 Nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio observou-se reaccedilatildeo fracamente positiva no citoplasma das
ceacutelulas foliculares enquanto foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio foram mais
intensamente marcados para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV A imunomarcaccedilatildeo para
caspase 3 foi evidenciada nas ceacutelulas foliculares durante o desenvolvimento secundaacuterio
sendo mais intensa no estaacutedio avanccedilado Qualitativamente essas anaacutelises demonstraram
87
marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento folicular mesmo com os
peixes expostos a diferentes concentraccedilotildees de Thiodanreg o que caracteriza a integridade
das ceacutelulas foliculares e da via apoptoacutetica caspase-3-dependente que pode estar sendo
ativada para futuros processos de regressatildeo folicular
Palavras-chave ecotoxicologia aquaacutetica ovaacuterio peixes e reproduccedilatildeo
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 de α-endosulfan e 30 de β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo
por meio da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em riscos toxicoloacutegicos os
organismos que ali residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al
2007) Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos
como jaacute observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis
niloticus No entanto a Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan
em gordura o valor de 005mgkg-1 (EPA 2002) e em aacutegua doce 022microgL-1 (EPA
1980) A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em
consideraccedilatildeo a qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente
Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm 3572005 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo
do referido inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
Muitos inseticidas apresentam baixa toxicidade antes de serem transformados
em substacircncias toacutexicas metabolicamente ativas O sulfato de endosulfan eacute um dos
produtos derivados do metabolismo do endosulfan sendo considerado o principal
metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica por ser mais estaacutevel no meio
ambiente em relaccedilatildeo a sua formula original (Ali et al 1984) A sensibilidade dos
organismos aquaacuteticos ao endosulfan eacute baixa e tem sido bem descrita na literatura por
alguns autores (Cengiz et al 2001 Capkin et al 2006 Ballesteros et al 2007 Pereira
et al 2012) sendo os machos geralmente mais sensiacuteveis que as fecircmeas pelo
armazenamento de lipiacutedeos para produccedilatildeo do vitelo e fornecimento de energia e pelo
tamanho maior da fecircmea em relaccedilatildeo ao macho (Ballesteros et al 2007)
88
O desenvolvimento folicular em peixes tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter 1996 Begovac amp Wallace
1988 Grier 2000 2002 e 2007) e como nos animais em geral compreende os periacuteodos
preacute-meioacutetico perinucleolar vitelogecircnico e maturaccedilatildeo final Estas fases ocorrem no
interior de foliacuteculos cujo complexo folicular eacute constituiacutedo por zona radiata camada
folicular membrana basal e teca (Grier 2000) as quais desempenham importante papel
durante a foliculogecircnese e fertilizaccedilatildeo
Entretanto os peixes quando satildeo expostos aos poluentes podem sofrer influecircncia
na foliculogecircnese e assim acarretar prejuiacutezos reprodutivos para as espeacutecies expostas aos
contaminantes Alguns estudos mostram diversas alteraccedilotildees provocadas nos foliacuteculos de
peixes por contaminantes (Hazarika amp Das 1998 Dutta et al 2003 Maxwell amp Dutta
2005 Chakrabarty et al 2012) inclusive a atresia folicular que eacute um processo
frequentemente observado nos ovaacuterios dos vertebrados (Saidapur 1978 Santos et al
2008a Santos et al 2008b) e que pode ser causada por diversos fatores dentre os
quais os agrotoacutexicos (Nagahama 1983 Guraya 1986 Chatterjee et al 1997 e 2001
Dutta amp Dalal 2008)
No desenvolvimento folicular a formaccedilatildeo do complexo folicular eacute importante
no suporte e na sobrevivecircncia das ceacutelulas foliculares No entanto jaacute foram identificadas
vaacuterias proteiacutenas que contribuem para a integridade do complexo folicular como
laminina integrina β1 fibronectina colaacutegeno tipo IV e de metaloproteinases (MMM-P)
em foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios e atreacutesicos (Rodgers et al 1998 Grier 2002 Le Bellego
et al 2002 Berkholtz et al 2006 Santos et al 2008a Thomeacute et al 2010) O colaacutegeno
tipo IV eacute uma proteiacutena especializada da matrix extracelular e membrana basal assim
como a laminina Essas proteacuteinas estatildeo envolvidas em favorecer um microambiente para
sobrevivecircncia das ceacutelulas do epiteacutelio (Rodgers et al 2003) As integrinas compreendem
uma grande famiacutelia de recepetores celulares composto de subnidades α e β que tem
funccedilatildeo importante na adesatildeo e transmissatildeo de sinais na ceacutelula Aleacutem disso as integrinas
estatildeo envolvidas na proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e morte celular
A caspase 3 eacute uma moleacutecula efetora de grande importacircncia no processo de
apoptose na ativaccedilatildeo de endonucleases e na clivagem das proteiacutenas celulares causando
mudanccedilas morfoloacutegicas celulares (Huettenbrenner et al 2003) Este processo de
apoptose envolve uma cascata de eventos bioquiacutemicos com a liberaccedilatildeo de fatores
mitocondriais de morte celular ativaccedilatildeo caspases e mudanccedila na caracteriacutestica
morfoloacutegica no nuacutecleo da ceacutelula assim como fragmentaccedilatildeo do DNA (Huettenbrenner et
89
al 2003) No entanto alguns trabalho citam a importacircncia da integridade do complexo
folicular com a presenccedila de integrina β1 e colaacutegeno tipo IV que em caso de atresia
folicular e ovulaccedilatildeo na formaccedilatildeo de foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios culminam em processo
da ativaccedilatildeo das caspases nas ceacutelulas foliculares Sendo assim a incidecircncia de apoptose
nas ceacutelulas foliculares aumenta nas etapas de regressatildeo ovariana (Drummond et al
2000 Santos et al 2003 2005 2008)
O lambari A bimaculatus foi escolhido como organismo experimental pois eacute
muito representativo no ecossistema sendo encontrado desde o nordeste brasileiro ateacute a
Bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Tambeacutem eacute um peixe de
pequeno porte e faacutecil de manter em laboratoacuterio O complexo folicular associado agrave
siacutentese dessas proteiacutenas ao longo do desenvolvimento folicular eacute algo a ser discutido
Poreacutem nenhum trabalho relata estas proteiacutenas em peixes expostos ao Thiodanreg Devido
agrave carecircncia de estudos que avaliem tais proteiacutenas no complexo folicular o presente
trabalho tem como objetivo avaliar as proteiacutenas colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase
3 durante o desenvolvimento folicular do lambari A bimaculatus exposto ou natildeo ao
Thiodanreg por meio de anaacutelise imunoistoquiacutemica
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria (DVT) da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste subletal e as atividades de coleta fixaccedilatildeo e
inclusatildeo dos fragmentos de ovaacuterios As etapas de microtomia imunoistoquiacutemica
coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas foram realizadas no
DVTUFV e no Laboratoacuterio de Ictiohistologia do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas (ICB)
da Universidade Federal de Minas Gerais
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos peixes em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado poro genital
dilatado e vascularizado
90
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV onde
foram aclimatados por 10 dias Os aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuiacuteam
capacidade de 50 litros numa densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada
aacutegua livre de cloro temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos
os aquaacuterios possuiacuteam um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo continua da aacutegua para
garantir o bem-estar dos peixes Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial
Purina contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da
piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Foram aclimatados 96 lambaris como descrito no item 21 onde os peixes se
acostumaram ao seu novo meio e agraves atividades normais de manutenccedilatildeo como
alimentaccedilatildeo e limpeza dos aquaacuterios O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi
realizado baseando-se nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo com
a NBR 15088 (ABNT 2007)
Logo apoacutes aclimataccedilatildeo os peixes foram submetidos ao toacutexico Thiodanreg
(endosulfan 350gL) por 96 horas Em todos os experimentos foram utilizadas trecircs
concentraccedilotildees diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 (137microgL) preacute-determinada em
laboratoacuterio de acordo com a NBR 15088 (ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas
em cada experimento foram de 115 23 e 56microgL aleacutem de um grupo controle sem
toacutexico com trecircs repeticcedilotildees sob as mesmas condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
91
24 Anaacutelises histoloacutegicas e imunoistoquiacutemicas
Apoacutes 96 horas de experimento seis fecircmeas de cada grupo foram coletadas
anestesiadas com benzocaiacutena (110000) e eutanasiadas para coleta dos ovaacuterios Para a
descriccedilatildeo histoloacutegica todas as amostras foram fixadas em paraformaldeiacutedo a 4 em
tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedas em parafina Em seguida
secccedilotildees com 5 microm de espessura foram coradas utilizando hematoxilinaeosina para
anaacutelises morfoloacutegicas do desenvolvimento folicular
Para detectar a imunorreatividade para colaacutegeno tipo IV integrinas β1 e caspase
3 nos ovaacuterios do lambari trecircs espeacutecimes de cada grupo foram fixados em
paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas incluiacutedas em
parafina e seccionadas com 5 microm de espessura A recuperaccedilatildeo antigecircnica foi realizada
em forno de microondas por 10 minutos com os cortes nas lacircminas sendo imersos em
tampatildeo citrato 10mM pH 60 As lacircminas foram incubadas com peroacutexido de hidrogecircnio
a 3 em tampatildeo fosfato por 15 minutos em temperatura ambiente para inativar
peroxidase endoacutegena e com soro albumina bovina a 2 por 45 minutos para bloquear
marcador antigecircnico inespeciacutefico Anticorpos primaacuterios (policlonais de coelho) anti-
colaacutegeno tipo IV anti-integrina β1 e anti-caspase 3 (Santa Cruz Biotechnology Calif
USA) foram aplicados nas secccedilotildees a 4degC na diluiccedilatildeo 1100 (integrina β1 e colaacutegeno tipo
IV) e 1200 (caspase 3) segundo o fabricante por 12 horas Os cortes foram lavados
em PBS e incubados por 45 minutos com anticorpo secundaacuterio na diluiccedilatildeo de 1200
anti-IgG de coelho (LSAB 2 sistema HRP DakoCymation Carpinteria Calif USA) e
tratados com peroxidase conjugada com estreptavidina por 45 minutos A revelaccedilatildeo foi
realizada com diaminobenzidina (DAB) e as lacircminas foram contracoradas com
hematoxilina (Santos et al 2008)
As lacircminas foram analisadas em toda sua extensatildeo em busca de alteraccedilotildees na
imunomarcaccedilatildeo no complexo folicular que pudessem ser representativas do efeito do
Thiodanreg sempre comparando com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios do grupo
controle As lacircminas foram analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e as
imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
92
3 RESULTADOS
31 Desenvolvimento folicular
O desenvolvimento folicular de A bimaculatus foi dividido em desenvolvimento
primaacuterio inicial e avanccedilado O desenvolvimento secundaacuterio foi dividido em
desenvolvimento secundaacuterio inicial intermediaacuterio e avanccedilado (Tabela 1) A regressatildeo
ovariana tambeacutem foi caracterizada (Tabela 1)
Tabela 1 Aspectos morfoloacutegicos do desenvolvimento folicular e da regressatildeo ovariana de Astyanax bimaculatus
Foliacuteculos primordiais Estaacutedio que antecede o desenvolvimento de foliacuteculos primaacuterios Satildeo ceacutelulas menores apresentando citoplasma volumoso nuacutecleo esfeacuterico e grande e ceacutelulas preacute-foliculares (Figura 1 B) Foliacuteculos primaacuterios iniciais e primaacuterios avanccedilados (perinucleolares) No desenvolvimento primaacuterio inicial os ovoacutecitos apresentam citoplasma fortemente basoacutefilo nuacutecleo esfeacuterico e nucleacuteolos dispersos pelo nucleoplasma Estatildeo envoltos por ceacutelulas foliculares pavimentosas (Figuras 1 C-encarte) No foliacuteculo primaacuterio avanccedilado a camada de ceacutelulas foliculares eacute pavimentosa e com o nuacutecleo eliacuteptico Entre as ceacutelulas foliculares e o ooplasma surge a zona radiata como uma fina camada (Figura 1 E-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios iniciais O citoplasma ovocitaacuterio eacute granular e fracamente basoacutefilo com presenccedila de vesiacuteculas corticais pequenas e claras na periferia do citoplasma O nuacutecleo eacute central ligeiramente acidoacutefilo com nucleacuteolos pequenos e dispersos pelo nucleoplasma (Figura 1 G-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios Assim como na etapa anterior os foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios possuem ovoacutecito com nuacutecleo central e acidoacutefilo No citoplasma inicia-se a deposiccedilatildeo de vitelo a partir da regiatildeo perifeacuterica (Figura 1 H-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados (vitelogecircnicos) No foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado o diacircmetro e o volume citoplasmaacutetico aumentam mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo apresentando os foliacuteculos neste estaacutedio vesiacuteculas corticais na periferia e gloacutebulos de vitelo disperso por todo citoplasma No complexo folicular a membrana basal eacute delgada e a zona radiada mais espessa que nas fases anteriores com ceacutelulas foliculares pavimentosas e cuacutebicas (Figura 1 H-encarte) Foliacuteculos atreacutesicos Apresenta formato irregular com estruturas descontiacutenuas ou desorganizadas com aspecto de grumos devido agrave liquefaccedilatildeo dos gracircnulos de vitelo ou com perda da conectividade entre suas partes fragmentaccedilatildeo da zona radiata (atresia inicial) e absorccedilatildeo total do conteuacutedo ovocitaacuterio pelas ceacutelulas foliculares (atresia avanccedilada) (Figuras 3 A e B-encarte) Foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios O foliacuteculo poacutes-ovulatoacuterio possue lume amplo irregular e contiacutenuo com o lume do ovaacuterio Apresenta parede constituiacuteda por camada uacutenica de ceacutelulas foliculares membrana basal e teca (Figuras 3 E e F)
93
32 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 no desenvolvimento
folicular de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Os foliacuteculos nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento apresentaram diferentes
graus de marcaccedilatildeo para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV Em foliacuteculo primordial natildeo se
observou marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 (Figura 1 B) Nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio inicial foram evidenciadas reaccedilotildees positivas com marcaccedilatildeo
fraca para colaacutegeno e integrina (Figuras 1 C e D) enquanto nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio avanccedilado as marcaccedilotildees foram mais niacutetidas (Figuras 1 E e F)
Nos desenvolvimento secundaacuterio foram evidenciadas marcaccedilotildees positivas para integrina
β1 e colaacutegeno tipo IV no citoplasma das ceacutelulas foliculares com mais intensidade que
nos estaacutedios anteriores (Figuras 1 G e H) Estas marcaccedilotildees natildeo mostraram diferenccedilas
entre os grupos expostos ao Thiodanreg quando comparados com os mesmos estaacutedios de
desenvolvimento folicular dos grupos controle A marcaccedilatildeo para caspase 3 foi
evidenciada no citoplasma e nuacutecleos de ceacutelulas foliculares de foliacuteculos com
desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado apresentando maior intensidade nos estaacutedios de
desenvolvimento secundaacuterio inicial A marcaccedilatildeo foi ausente nos estaacutedios de
desenvolvimento primaacuterio (Figuras 2 A-D) Quando comparadas estas marcaccedilotildees entre
os grupos controle e expostos ao Thiodanreg natildeo houve diferenccedilas nas marcaccedilotildees entre
os mesmos estaacutedios de desenvolvimento folicular
33 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 na atresia folicular de
A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
A marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 foi evidente nos foliacuteculos
atreacutesicos iniciais poreacutem menos intensa em relaccedilatildeo aos foliacuteculos normais (Figuras 3 A e
C) As fases mais avanccediladas da atresia folicular satildeo caracterizadas pela desorganizaccedilatildeo
espalhamento das proteiacutenas no ooplasma com reaccedilatildeo mais fraca da imunomarcaccedilatildeo
para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 (Figuras 3 B e D) Para a caspase 3 foi observada a
marcaccedilatildeo positiva nas ceacutelulas foliculares em foliacuteculos atreacutesicos iniciais e avanccedilados
(Figuras 4 A e B)
94
34 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 em foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Foram evidenciados desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV e
integrina β1 entre as ceacutelulas foliculares com marcaccedilatildeo positiva (Figuras 3 E e F) Em
foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios tambeacutem foi observada marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 nas
ceacutelulas foliculares (Figuras 4 C e D)
4 DISCUSSAtildeO
As fecircmeas de A bimaculatus submetidas agrave accedilatildeo do toacutexico apresentaram ovaacuterios
com padrotildees normais do desenvolvimento folicular sendo as variaccedilotildees na estrutura do
foliacuteculo como diacircmetro caracteriacutesticas do nuacutecleo camadas envoltoacuterias composiccedilatildeo e
distribuiccedilatildeo do vitelo observadas em outras espeacutecies do gecircnero do presente estudo
(Miranda 1996 Miranda et al 1999 Melo et al 2005 Mazzoni et al 2005 Rodrigues
et al 2005) Em outros trabalhos (Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008) satildeo
demonstrados que pequena concentraccedilatildeo de contaminantes pode ser suficiente para
causar alteraccedilotildees na morfologia dos foliacuteculos Entretanto Ballesteros et al (2007)
utilizando peixes machos e fecircmeas da espeacutecie Jenynsia multidentata verificaram que o
maior teor de lipiacutedeos nas fecircmeas foi importante para conferir maior resistecircncia contra o
endosulfan ao contraacuterio dos machos que satildeo mais suceptiacuteveis Estudo realizado por
Hernan Da Cuntildea et al (2011) mostrou que a espeacutecie Cichlasoma dimerus exposta ao
endosulfan nas concentraccedilotildees de zero 025 1 2 3 4 e 16μgL natildeo apresentou
alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos foliacuteculos assim como no presente trabalho com A
bimaculatus
No presente estudo a ausecircncia de marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV em foliacuteculos
primordiais pode ter ocorrido em funccedilatildeo da quantidade reduzida de ceacutelulas foliculares e
pela pequena espessura da membrana basal nesta fase de desenvolvimento folicular Na
literatura eacute mencionado que a espessura da membrana basal em foliacuteculos secundaacuterios
avanccedilados de A bimaculatus eacute de aproximadamente 03 microm caracterizada por ser uma
estrutura muito mais delgada quando comparada a outras espeacutecies de teleoacutesteos
(Drummond et al 2000) Outros autores no entanto observaram positividade para
colaacutegeno tipo IV na membrana basal envolvendo ovogocircnias no estroma ovariano de
peixes (Grier 2002 Thomeacute et al 2010) fase que antecede o ovoacutecito primordial
95
A siacutentese de membrana basal tem sido atribuiacuteda agraves ceacutelulas foliculares (Le Mim
et al 2007) mas ainda faltam investigaccedilotildees que evidenciem esta funccedilatildeo A anaacutelise por
hibridizaccedilatildeo in situ na cadeia α1 do colaacutegeno tipo IV revelou a presenccedila de mRNA
localizada na camada folicular de todos os foliacuteculos em crescimento no peixe medaka
Oryzias latipes (Kato et al 2010) enquanto para integrinas Itami et al (2011) natildeo
identificaram marcaccedilatildeo em foliacuteculos primordiais em ratos Estes estudos confirmam que
durante o desenvolvimento do foliacuteculo primordial poderia estar ocorrendo o inicio da
organizaccedilatildeo e siacutentese do colaacutegeno tipo IV para as fecircmeas do presente estudo
Logo em seguida o desenvolvimento folicular primaacuterio inicial e avanccedilado foi
caracterizado por alteraccedilotildees no complexo folicular com marcaccedilatildeo positiva para
integrina β1 e colaacutegeno tipo IV foi positiva Em outro estudo realizado para marcaccedilatildeo
de vaacuterias subunidades do colaacutegeno tipo IV em foliacuteculos de bovinos a expressatildeo das
cadeias α3 e α6 diminuiacuteram durante o desenvolvimento folicular enquanto as cadeias
α1 e α2 continuaram a ser expressas ao longo do desenvolvimento (Rodgers et al
1998) Em estudo com ratos foi verificado o decliacutenio de colaacutegeno tipo IV α3 ao longo
do desenvolvimento folicular mas foi possiacutevel detectar o colaacutegeno tipo IV α4 e α5 em
foliacuteculos desenvolvidos (Frojdman et al 1998) Entretanto Berkholtz (2006) observou
aumento da marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV ao longo do desenvolvimento folicular em
ratos Aleacutem disso outra caracteriacutestica importante eacute presenccedila de perlecan e nidogen que
fazem parte das ligaccedilotildees cruzadas em foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio mas
natildeo em foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio (McArthur et al 2000) Poreacutem as
diferentes ligaccedilotildees cruzadas entre os colaacutegenos e lamininas nas membranas basais
tambeacutem garantem maior expansatildeo no alargamento do foliacuteculo (Rodgers et al 2003)
Portanto eacute de grande importacircncia nesta etapa de desenvolvimento folicular a evidecircncia
do colaacutegeno tipo IV e integrinas o que pode contribuir na organizaccedilatildeo coordenada no
desenvolvimento folicular de A bimaculatus com estas proteiacutenas da matriz extracelular
Em relaccedilatildeo agraves fases de desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio foram observadas
marcaccedilotildees positivas para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 o que parece caracterizar
maior siacutentese destas proteiacutenas nestes estaacutedios do desenvolvimento folicular Entretanto
deve-se considerar que nas fases mais avanccediladas a quantidade de ceacutelulas foliculares e
ceacutelulas da teca satildeo mais numerosas sendo assim exercem funccedilatildeo importante na
integridade folicular No presente estudo a marcaccedilatildeo contiacutenua de colaacutegeno tipo IV e
integrina β1 nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento folicular em 96 horas de
experimento indicou que natildeo houve desorganizaccedilatildeo na membrana basal e nas ceacutelulas
96
foliculares Thomeacute et al (2010) identificaram por teacutecnicas de imonoistoquiacutemica e
imunofluorescecircncia a presenccedila de laminina β2 integrinas e colaacutegeno tipo IV na
membrana basal demonstrando a importacircncia destes constituintes na integridade da
membrana basal ao longo do desenvolvimento folicular resultados observados tambeacutem
em foliacuteculos de mamiacuteferos (Le Bellego et al 2002 Berkholtz et al 2006)
Em foliacuteculos de ratos tambeacutem foi evidenciada a presenccedila de integrinas ao longo
do desenvolvimento folicular apresentando marcaccedilatildeo positiva no desenvolvimento
primaacuterio e marcaccedilatildeo mais intensa no desenvolvimento secundaacuterio (Itami et al 2011)
Portanto a marcaccedilatildeo positiva nas ceacutelulas foliculares em lambaris A bimaculatus nos
grupos controle e expostos ao Thiodanreg mostrou que a integridade dos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio natildeo foi afetada pelas concentraccedilotildees de
Thiodanreg utilizadas
Em relaccedilatildeo agrave caspase 3 ao longo do desenvolvimento folicular foi possiacutevel
evidenciar sua expressatildeo nos estaacutedios de desenvolvimento secundaacuterio mas natildeo a
presenccedila de condensaccedilatildeo de nuacutecleos e corpos apoptoacuteticos nas ceacutelulas foliculares No
entanto a presenccedila de caspase 3 nas ceacutelulas foliculares de A bimaculatus indica que
estas ceacutelulas podem estar em via apoptoacutetica poreacutem outros trabalhos demonstram que a
via para caspase 3 eacute observada em foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios atresias iniciais e
principalmente nas atresias avanccediladas com a presenccedila de fragmentaccedilatildeo de DNA
condensaccedilatildeo nuclear e formaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos (Hsueh et al 1994 Santos et
al 2008) A ausecircncia destas caracteriacutesticas morfoloacutegicas nos foliacuteculos de A
bimaculatus do presente estudo pode ser explicada por inibidores de apoptose (Salvesen
amp Duckett 2002) que podem estar ativos e protegendo as ceacutelulas contra apoptose
Outros exemplos citados satildeo os fatores hormonais como as gonadotropinas 17β
estradiol e fator de crescimento epideacutermico que agem como fatores de sobrevivecircncia
para suprimir a morte celular por apoptose em foliacuteculos ovarianos de ratos em cultura
(Chun et al 1994) e tambeacutem no peixe truta arco-iacuteris Oncorhynchus mykiss (Janz amp Van
Der Kraak 1997) Segundo Salvesen amp Duckett (2002) poucos estudos tecircm tentado
esclarecer se uma determinada ceacutelula consegue se recuperar de um efeito fisioloacutegico de
caspases quando estatildeo sendo processadas e ativadas
Um grupo de proteiacutenas estruturalmente relacionadas agrave inibiccedilatildeo da apoptose eacute o
inibidor de apoptose (IAP) (Deveraux amp Reed 1999) Satildeo descritos pelo menos oito
IAPs em humanos localizados no citoplasma e que se ligam na forma ativa da caspase
3 ou na forma zimogecircnio das caspases para inibir a sua funccedilatildeo (Salvesen amp Duckett
97
2002) Janz et al (1997) mencionam forte relaccedilatildeo com o aumento da apoptose e
expressatildeo de proteiacutena do choque teacutermico HSP70 em peixes expostos agrave celulose
afetando o tamanho do ovaacuterio provocanado queda da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
testosterona e induccedilatildeo nas concentraccedilotildees plasmaacuteticas de 17β estradiol Em relaccedilatildeo agrave
HSP70 ela pode estar relacionada com a proteccedilatildeo das ceacutelulas foliculares antes da
reabsorccedilatildeo do vitelo em foliacuteculos atreacutesicos (Santos et al 2008) A relaccedilatildeo mais
consistente da viabilidade dos foliacuteculos de A bimaculatus no presente estudo segundo a
literatura pode ser a relaccedilatildeo dos inibidores de apoptose associado com os fatores
hormonais agindo como prevenccedilatildeo na sobrevivecircncia das ceacutelulas foliculares no
desenvolvimento folicular secundaacuterio
Nas fecircmeas do lambari A bimaculatus o processo de atresia foi semelhante ao
descrito por Miranda et al (1999) Munoz et al (2002) Melo et al (2005) e Santos et
al (2005) A maior frequecircncia de atresia foi observada em foliacuteculos secundaacuterios
Observaccedilotildees semelhantes foram feitas por Drummond (1996) em A bimaculatus
lacustris e Melo et al (2005) em A scabripinnis Em relaccedilatildeo aos foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios ocorre perda de contato entre as membranas das ceacutelulas foliculares
adjacentes evento observado por Santos et al (2005) entre 48 e 72 horas poacutes-desova em
Leporinus taeniatus Essas estruturas foram raramente encontradas no presente estudo
indicando que o grau de contaminaccedilatildeo pelo Thiodanreg natildeo interferiu na eliminaccedilatildeo dos
foliacuteculos de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada
Nos processos de atresias e nos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios ocorreram a
desorganizaccedilatildeo e a perda da positividade da imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e
integrinas nas fases avanccediladas quando comparadas com as fases iniciais da regressatildeo
ovariana sendo esta caracteriacutestica tambeacutem observada por outros autores (Santos et al
2008 Thomeacute et al 2010) Relatos importantes sobre a integridade dos foliacuteculos estatildeo
na diminuiccedilatildeo da integrina β1 e colaacutegeno do tipo IV contribuindo para o aumento da
apoptose em ceacutelulas foliculares de foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios e nas atresias avanccediladas
(Santos et al 2008) Aleacutem disso outros fatores contribuem para o aumento da
apoptose como a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 17β estradiol logo apoacutes a desova
favorecendo a regressatildeo ovariana dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios (Kaptaner amp Ural 2006)
Portanto o presente estudo com as fecircmeas de A bimaculatus evidencia a caspase 3 e a
diminuiccedilatildeo da marcaccedilatildeo com integrina β1 e colaacutegeno tipo IV nas ceacutelulas foliculares nos
foliacuteculos atreacutesicos e poacutes-ovulatoacuterios o que sugere a provaacutevel accedilatildeo destas proteiacutenas na
regressatildeo folicular em lambaris expostos ao Thiodanreg
98
De acordo com os resultados obtidos pode-se inferir que os ovaacuterios A
bimaculatus foram resistentes ao Thiodanreg nas concentraccedilotildees testadas e no periacuteodo
experimental proposto pois tais concentraccedilotildees natildeo interferiram de modo significativo
na estrutura do complexo folicular e no desenvolvimento folicular Qualitativamente
essas anaacutelises demonstraram a marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do
desenvolvimento folicular mesmo quando os peixes foram expostos a diferentes
concentraccedilotildees de Thiodanreg o que caracteriza a integridade das ceacutelulas foliculares e da
via apoptoacutetica caspase-3-dependente que pode estar sendo ativada para futuros
processos de regressatildeo folicular
99
A
DC
B
fsa fp
fpi
fpi
mc
mi
fpa
fpa
fsa
fsa
zr
zr
zr zr
H
E
G
F
mc
m
mi
mc
fsa
fpi
fpa
fsi
vc fsa
fst
v
v
Figura 1 Imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 ao longo do desenvolvimento folicular em A bimaculatus A Controle negativo para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV B Foliacuteculo primordial (fp) sem marcaccedilatildeo para colaacutegeno (setas) C e D Marcaccedilatildeo positiva para colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) respectivamente em folliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio inicial (fpi) E e F Marcaccedilatildeo positiva para colaacutegeno (mc) e integrina (mi) em foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (fpa) Encarte-C Foliacuteculo primaacuterio inicial (fpi) G e H Marcaccedilatildeo para colaacutegeno (mc) e integrina (mi) mais fortemente evidenciada em foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (fsa) Encartes-G e H Foliacuteculo secundaacuterio inicial (fsi) foliacuteculo secundaacuterio intermediaacuterio (fst) foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado (fsa) vesiacuteculas corticais (vc) vitelo (v) zona radiata (zr) Encartes C E G e H corados com hematoxilinaeosina Barras 20 m encartes C e E (80 m) G (100m) e H (200m)
A B
C D
E F
G H
100
fpi
fpa
fsa
fsa
fsa
zr
zr
zr zr
D
A
C
B
Figura 2 Imunomarcaccedilatildeo para caspase 3 ao longo do desenvolvimento folicular em A bimaculatus A Imagem do controle negativo para caspase 3 (setas) B Ausecircncia de marcaccedilatildeo para caspase 3 (setas) em foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio inicial (fpi) C e D Marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) em foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (fsa) e ausente (setas) em foliacuteculo desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (fpa) zr zona radiata fsa foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado Barras 20 m
101
A
mc
mi
mc
mi
mi mc
fpo fpo
ai av
av
B
C D
E F
Figura 3 Imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 de atresia e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterio em A bimaculatus A e C Foliacuteculo secundaacuterio em atresia inicial (ai) caracterizando a presenccedila da zona radiata (zr) e iniacutecio da desorganizaccedilatildeo da marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) no complexo folicular (setas) B e D Imunomarcaccedilatildeo menos intensa do que na etapa anterior em atresia avanccedilada caracterizando a desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) no citoplasma (setas) E e F Foliacuteculo poacutes-ovulatoacuterio (fpo) caracterizando a desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) entre as ceacutelulas
foliculares (setas) Encartes A e B Atresia inicial (ai) e atresia avanccedilada (av) ceacutelula folicular (cf) zona radiata (zr) Encartes A e B corados com hematoxilinaeosina Barras A B C E e F
(20 m) D (200 m) encartes A (25 m) e B (100 m)
ai av zr cf cf
102
A
ai av
fpo fpo
B
C D
Figura 4 Imunomarcaccedilatildeo para caspase 3 em atresia folicular e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios em A bimaculatus A e B Imunomarcaccedilatildeo em atresia inicial (ai) e atresia avanccedilada (av) caracterizando a presenccedila de marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) C e D Imunomarcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) nas ceacutelulas dos foliacuteculos poacutes-ovulatorios (fpo) Barras A B e D (20 m) C (200 m)
103
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107
6 CONCLUSOtildeES A CL50 estimada para fecircmeas adultas de Astyanax bimaculatus em maturaccedilatildeo
avanccedilada expostas ao Thiodanreg eacute de 136microgL com intervalo de confianccedila de 101 a
184 microgL
A accedilatildeo do Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou o fiacutegado como um todo
mas locais isolados do parecircnquima hepaacutetico sendo a maioria alteraccedilotildees de estaacutegio I e
II com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico
As alteraccedilotildees na quantidade de glicogecircnio hepaacutetico no experimento sem aclimataccedilatildeo
sem alimentaccedilatildeo demonstraram que o Thiodanreg influenciou na maior mobilizaccedilatildeo
das reservas de glicogecircnio em funccedilatildeo das condiccedilotildees ambientais oferecidas aos
animais
As alteraccedilotildees ocorridas no nuacutecleo e citoplasma dos hepatoacutecitos demonstram que o
Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees hepaacuteticas confirmando que o Thiodanreg
influenciou no metabolismo celular como resposta adaptativa celular
Natildeo foram observadas diferenccedilas morfoloacutegicas que comprometessem diretamente os
estaacutedios de desenvolvimento folicular ovariano seja no grupo controle ou nos grupos
tratados com Thiodanreg
Os experimentos com aclimataccedilatildeo apresentaram alteraccedilotildees na quantidade de
foliacuteculos primaacuterios e secundaacuterios quando comparadas com os peixes sem
aclimataccedilatildeo sugerindo que o eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-ovaacuterio pode estar sendo
afetado
Houve maior diacircmetro nos foliacuteculos vitelogecircnicos e maior frequecircncia de atresia
folicular no experimento com aclimataccedilatildeo seguida de exposiccedilatildeo ao Thiodanreg o que
sugere mecanismo adaptativo com maiores diacircmetros de foliacuteculos no meio
impactado
108
As meacutedias dos IGS e IHS nos experimentos aclimatados foram menores quando
comparadas com os experimentos sem aclimataccedilatildeo sugerindo que a espeacutecie A
bimaculatus previamente aclimatada em aquaacuterios pode sofrer comprometimento da
reproduccedilatildeo
As reaccedilotildees imunohistoquiacutemicas para integrina β1 colaacutegeno IV e caspase-3 em
foliacuteculos atreacutesicos e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios sugerem possiacutevel relaccedilatildeo com a
regressatildeo ovariana poacutes-desova
As anaacutelises por imunohistoquiacutemica para integrina β1 colaacutegeno IV e caspase-3 nas
ceacutelulas foliculares ao longo do desenvolvimento folicular demonstraram
qualitativamente marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento
folicular mesmo quando os peixes foram expostos a diferentes concentraccedilotildees de
Thiodanreg o que caracteriza a integridade das ceacutelulas foliculares e da via apoptoacutetica
caspase-3-dependente que pode estar sendo ativada para futuros processos de
regressatildeo folicular
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus aos meus pais (Carlos e Narcisa) irmatildeos (Luciana e Luacutecio) orientador
(Laeacutercio dos Anjos Benjamin) e minha namorada (Mirlaine Soares) por me
incentivarem acreditarem confiarem e sempre estarem ao meu lado demonstrando
sugestotildees construtivas para a vida e para este trabalho
Aos membros da banca examinadora dessa tese pela disponibilidade e sugestotildees
construtivas para enriquecimento desse trabalho
Agrave CAPES FAPEMIG e Departamento de VeterinaacuteriaUFV pelo apoio financeiro
para o desenvolvimento do presente estudo
Aos professores e funcionaacuterios do Departamento de VeterinaacuteriaUFV e
Departamento de Morfologia - ICBUFMG pelos ensinamentos e paciecircncia para
concretizaccedilatildeo das teacutecnicas utilizadas neste estudo
A todos aqueles que direta ou indiretamente colaboraram para a realizaccedilatildeo deste
estudo e conviveram comigo ao longo desses anos em Viccedilosa-MG
iii
BIOGRAFIA
LUCAS MARCON filho de Carlos Marcon Filho e Narcisa das Dores Marcon
nasceu em 29 de janeiro de 1980 em Campinas-SP
Em fevereiro de 1999 ingressou no curso de Ciecircncias Bioloacutegicas pela Pontifiacutecia
Universidade Catoacutelica de Campinas (PUC-Campinas) onde em janeiro de 2003
graduou-se nesta Instituiccedilatildeo No ano de 2002 foi bolsista de iniciaccedilatildeo cientifica pela
FAPESP no Departamento de Biologia Celular Instituto de BiologiaUNICAMP
Em maio de 2006 ingressou no Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Medicina
Veterinaacuteria na Universidade Federal de Viccedilosa - MG sob orientaccedilatildeo do professor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin na linha de pesquisa Morfofisiologia de Animais
Domeacutesticos e Selvagens (Reproduccedilatildeo e Toxicologia de Peixes) defendendo a
dissertaccedilatildeo de mestrado em fevereiro de 2008 e tese de doutorado em dezembro de
2013 obtendo os tiacutetulos de Magister Scientiae e Doctor Scientiae
iv
IacuteNDICE
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO GERAL
11 O uso de agrotoacutexicos
12 Tipos de inseticidas
13 Inseticidas no meio ambiente rotas de entrada
14 Avaliaccedilatildeo de solubilidade e estudos de toxicidade aquaacutetica
15 Caracterizaccedilatildeo do agrotoacutexico Thiodanreg
16 O uso do endosulfan
17 Toxicidade aguda do endosulfan
18 Efeitos dos inseticidas organoclorados sobre peixes
19 O lambari Astyanax bimaculatus
110 Morfologia hepaacutetica em teleoacutesteos
111 Morfologia ovariana em teleoacutesteos
vi
viii
1
1
2
3
4
5
6
6
7
9
10
12
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
22 Objetivos especiacuteficos
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
31 Animais
32 Agrotoacutexicos
33 Teste de toxidade aguda em sistema estaacutetico - CL50
34 Teste de toxidade subletal em sistema estaacutetico
35 Avaliaccedilatildeo morfoloacutegica
351 Microscopia de luz
352 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos fiacutegados
353 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos ovaacuterios
354 Imunoistoquiacutemica
36 Paracircmetros biomeacutetricos
37 Anaacutelises estastiacuteticas
4 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
15
15
15
17
17
18
18
20
21
21
22
25
26
27
27
28
v
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 CAPIacuteTULO 1 Efeitos do inseticida Thiodanreg sobre a morfologia
hepaacutetica de fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
52 CAPIacuteTULO 2 Efeitos do inseticida Thiodanreg sobre a morfologia
do desenvolvimento folicular em lambaris Astyanax bimaculatus
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
53 CAPIacuteTULO 3 Relaccedilatildeo entre colaacutegeno tipo IV integrina β1 e
caspase 3 durante o desenvolvimento folicular em Astyanax
bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
6 CONCLUSOtildeES
35
35
35
36
37
42
45
56
62
62
63
65
68
71
82
86
86
87
89
92
94
103
107
vi
RESUMO
MARCON Lucas D Sc Universidade Federal de Viccedilosa dezembro de 2013 Efeitos do Thiodanreg em fiacutegado e em ovaacuterios em maturaccedilatildeo avanccedilada de lambaris Astyanax bimaculatus Orientador Laeacutercio dos Anjos Benjamin Coorientadoras Ann Honor Mounteer e Marlene Isabel Vargas Viloria
O agrotoacutexico Thiodanreg (350gL de endosulfan) eacute um inseticida organoclorado utilizado
em diversas monoculturas que pode chegar aos ecossistemas aquaacuteticos e afetar a
reproduccedilatildeo e a integridade das populaccedilotildees de peixes O fiacutegado eacute um dos principais
oacutergatildeos para a biotransformaccedilatildeo de diversos xenobioacuteticos Quando os peixes satildeo
expostos a uma concentraccedilatildeo elevada de agentes quiacutemicos podem ocorrer danos
hepaacuteticos Os ovaacuterios de peixes apresentam foliacuteculos em diferentes estaacutedios de
desenvolvimento que satildeo envoltos por zona radiata ceacutelulas foliculares membrana basal
e ceacutelulas da teca formando o complexo folicular Agentes estressores podem causar
aumento ou diminuiccedilatildeo do diacircmetro dos foliacuteculos vitelogecircnicos alterar a quantidade de
foliacuteculos nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento e aumentar a incidecircncia de atresia
Assim o presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos do Thiodanreg sobre o fiacutegado
e ovaacuterios de lambaris Astyanax bimaculatus por meio de anaacutelises morfoloacutegica
morfomeacutetrica e imunoistoquiacutemica Os peixes expostos ao toacutexico foram divididos em
quatro experimentos 1) sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo 2) sem aclimataccedilatildeo e
alimentados 3) com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo 4) com aclimataccedilatildeo de
10 dias e alimentados Em todos os experimentos foram utilizadas trecircs concentraccedilotildees
diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 de 1367microgL preacute-determinada em laboratoacuterio
de acordo com a NBR 15088 (ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas em cada
experimento foram de 115 23 e 56microgL aleacutem de um grupo controle livre de toacutexico
com trecircs repeticcedilotildees contento 10 peixes para cada concentraccedilatildeo Apoacutes as 96h seis peixes
de cada grupo foram capturados e anestesiados com benzocaiacutena (110000) de acordo
com as Normas da Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de VeterinaacuteriaUFV (protocolo
242009) Os fiacutegados e ovaacuterios foram coletados e processados por teacutecnicas histoloacutegicas
rotineiras As lacircminas foram analisadas em microscoacutepio de luz Olympus CX31 Foram
obtidas imagens digitais de 10 campos aleatoacuterios por animal em objetiva de 20X e 40X
para avaliaccedilatildeo histoloacutegica As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada nos testes em sistema
estaacutetico foram mantidas de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT
2007) A anaacutelise histoloacutegica dos fiacutegados mostrou no experimento 1 (sem
vii
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo) na concentraccedilatildeo de 56microgL de Thiodanreg a menor
intensidade (010plusmn00) da reaccedilatildeo ao PAS no citoplasma dos hepatoacutecitos quando
comparada ao grupo controle (133plusmn051) No entanto houve diferenccedila (Plt005) nesse
mesmo experimento quando comparado com as concentraccedilotildees 115microgL (266plusmn081) e
23microgL (300plusmn00) caracterizando depleccedilatildeo de glicogecircnio Aleacutem disso houve
alteraccedilotildees do diacircmetro de nuacutecleos e citoplasma dos hepatoacutecitos nos diferentes
experimentos e maior quantidade de nuacutecleos de hepatoacutecitos nos grupos expostos ao
Thiodanreg associada com a reduccedilatildeo na quantidade de citoplasma O Iacutendice de Alteraccedilatildeo
Histoloacutegica (IAH) dos lambaris coletados manteve-se entre 433 a 833 (para os grupos
controles) 1850 a 2883 (para as concentraccedilotildees de 115microgL) 2033 a 2833 (para as
concentraccedilotildees de 23microgL) e 2366 a 2766 (para as concentraccedilotildees de 56microgL) Os
lambaris coletados nos diferentes experimentos apresentaram valores de IAH para os
grupos controle inferiores (Plt005) aos grupos expostos Estes resultados demonstraram
que o Thiodanreg pode estar influenciando as funccedilotildees hepaacuteticas pela maior mobilizaccedilatildeo
das reservas de glicogecircnio na concentraccedilatildeo 56microgL As alteraccedilotildees observadas nos
fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas sendo alteraccedilotildees de estaacutedio I e II indicando
dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico nos diferentes grupos e experimentos Nos ovaacuterios
percebeu-se que a accedilatildeo do Thiodanreg em niacuteveis subletais natildeo afetou a morfologia dos
diferentes estaacutedios de desenvolvimento folicular Poreacutem os experimentos com
aclimataccedilatildeo demonstraram alteraccedilotildees nas quantidades de foliacuteculos primaacuterios e
secundaacuterios quando comparados com os peixes dos experimentos sem aclimataccedilatildeo
Aleacutem disso houve aumento do nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos e diacircmetro dos foliacuteculos
secundaacuterios nos grupos expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos Estes
resultados sugerem mecanismos compensatoacuterios da perda reprodutiva quando em meio
com condiccedilotildees desfavoraacuteveis As anaacutelises imunoistoquiacutemicas demonstraram marcaccedilatildeo
crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento folicular para integrina β1 e
colaacutegeno tipo IV Entretanto a caspase 3 foi observada somente no complexo folicular
de foliacuteculos secundaacuterios mesmo quando os peixes satildeo expostos a diferentes
concentraccedilotildees de Thiodanreg o que confirma a integridade das ceacutelulas foliculares e da via
apoptoacutetica caspase-3-dependente a qual pode estar sendo ativada para futuros processos
de regressatildeo folicular
viii
ABSTRACT
MARCON Lucas D Sc Universidade Federal de Viccedilosa December 2013 Effects of Thiodanreg in liver and ovaries in advanced maturation of the lambari Astyanax bimaculatus Advisor Laeacutercio dos Anjos Benjamin Co-advisors Ann Honor Mounteer and Marlene Isabel Vargas Viloria
The pesticide Thiodanreg (350gL-1 of endosulfan) is an organochlorine insecticide used
in various monocultures that may reach aquatic ecosystems and affect reproduction and
the health of fish populations The liver is a major organ for the biotransformation of
many xenobiotics and it can be damaged if the fish are exposed to a high level of
chemical substances The fish ovaries have oocytes at different stages of development
that are surrounded by zona radiata follicular basal membrane and teca cells to form the
follicular complex Stressor products may cause an increase or decrease in the diameter
of the secondary follicles vitellogenic depletion a change the number of follicles at
different stages of development and an increase the incidence of atresia The present
study aimed to evaluate the effects of Thiodanreg on the liver and ovaries of Astyanax
bimaculatus through morphological morphometric and immunohistochemistry analysis
The groups of fish were exposed to the toxic substances divided in four experiments
without adaptation and no feeding feeding without adaptation with adaptation and no
feeding with adaptation and feeding All experiments used three different
concentrations of Thiodanreg lower than the LC50 of 1367 microgL-1 previously determined
in the laboratory in accordance with the Brazilian Standard Regulation - NBR 15088
(ABNT 2007) The concentrations used in each experiment were 115 23 and 56
microgL-1 and a control group with three repetitions using ten fish in each aquarium After
96h six fish from each group were captured and anesthetized with benzocaine
(110000) according to the norms of the Ethics Committee of the Veterinary
DepartmentUFV (protocol 242009) Livers and ovaries were collected and processed
by histological techniques The slides were examined under the light microscope
Olympus CX31 Were obtained digital images of 10 random fields per animal at 20X
and 40X objective for evaluation The characteristics of the water used in acute tests
were maintained in a stable system in accordance to the recommendations of NBR
15088 (ABNT 2007) In the experiment 1 (without adaptationno feeding) at the
concentration of 56 mgL-1 of Thiodanreg (010 plusmn 00) the intensity of the PAS reaction
was lower in the cytoplasm of hepatocytes when compared to the control group (133 plusmn
ix
051) In the same experiment differences in glycogen depletion were (Plt005) when
compared to the concentrations 115 gL-1 (266 plusmn 081) and 23 gL-1 (300 plusmn 00) In
addition changes in the diameter of nuclei and cytoplasm of hepatocytes in all
experiments were observed and an increase in the number of hepatocyte nuclei in
groups exposed to Thiodanreg was associated with a reduction in the amount of
cytoplasm However the IHA was maintained between 433 to 833 (control group)
1850 to 2883 (115 mgL-1 group) 2033 to 2833 (23 gL-1 group) and 2366 to 2766
(56 gL-1 group) These results suggest that Thiodanreg may be influencing liver
functions to increase glycogen mobilization according to higher concentrations of
exposition The changes observed in the livers of A bimaculatus were not severe
classified as stage I and II that indicate repairable damage to liver tissue in all
experiments It was observed in the ovaries that the action of Thiodanreg in sublethal
levels did not affect (Plt005) the morphology of the different stages of follicle
development However the experiments demonstrated an adaptation response in the
number of primary and secondary follicles compared to fish without adaptation In
addition there was a growing incidence of atretic follicles and increased diameter of the
secondary follicles in the groups exposed to Thiodanreg in all experiments These results
suggest an adaptive response to offset reproductive loss where in unfavorable
conditions The immunohistochemical analysis showed increasing and uniform labeling
throughout the follicular development for integrin β1 and collagen type IV However
caspase 3 was observed only in the secondary ovarian follicular complex even when
fish were exposed to different concentrations of Thiodanreg which characterizes the
integrity of follicular cells and the apoptotic pathway-dependent caspase-3 which may
be activated for future follicular regression
1
1 INTRODUCcedilAtildeO GERAL
11 O uso de agrotoacutexicos
Agrotoacutexicos satildeo produtos e agentes de processos fiacutesicos quiacutemicos ou bioloacutegicos
destinados ao uso nos setores de produccedilatildeo no armazenamento e beneficiamento de
produtos agriacutecolas nas pastagens na proteccedilatildeo de florestas nativas ou implantadas e de
outros ecossistemas e tambeacutem de ambientes urbanos e industriais cuja finalidade eacute
preservaacute-los da accedilatildeo danosa de seres vivos considerados nocivos (Lei Federal 7802 de
110789) Os agrotoacutexicos satildeo importantes na agricultura todavia exigem precauccedilatildeo no
seu uso visando a proteccedilatildeo dos operaacuterios que os manipulam e aplicam dos
consumidores dos animais de criaccedilatildeo de abelhas peixes de organismos predadores e
parasitas e enfim do meio ambiente
Certas praacuteticas agriacutecolas ligadas ao modelo de produccedilatildeo agriacutecola como o uso
excessivo e inadequado de agrotoacutexicos a destruiccedilatildeo da cobertura vegetal dos solos para
plantio a natildeo preservaccedilatildeo das matas ciliares e das vegetaccedilotildees protetoras de nascentes
dentre outros fatores satildeo responsaacuteveis por grande parte dos problemas com os recursos
hiacutedricos (Matuo 1990)
Os inseticidas constituem importante grupo de praguicidas para o uso agriacutecola
que ano apoacutes ano mostra um aumento progressivo em seu uso na Ameacuterica do Sul
Estes nas uacuteltimas deacutecadas comeccedilaram a substituir inclusive o trabalho mecacircnico e
manual dos agricultores Ruumlegg et al (1987) e Tomita amp Beyruth (2002) relatam que o
modelo de agricultura adotado no Brasil baseia-se no uso de agrotoacutexicos Estes
compostos satildeo empregados haacute muito tempo e a partir da 2deg guerra mundial passaram a
ser mais intensamente utilizados
Nos uacuteltimos 40 anos a agricultura brasileira sofreu inuacutemeras e profundas
transformaccedilotildees que alteraram tanto a composiccedilatildeo das culturas como os processos de
produccedilatildeo e padrotildees tecnoloacutegicos ateacute entatildeo em vigor Ruumlegg et al (1987) enfatizam que
o processo de modernizaccedilatildeo entendido como uma seacuterie de transformaccedilotildees tecnoloacutegicas
nos processos produtivos intensificou o emprego de insumos como maacutequinas
fertilizantes e agrotoacutexicos que contam com preccedilos favoraacuteveis e estiacutemulos como creacutedito
farto a juros subsidiados que facilitaram sua ampla adoccedilatildeo no meio rural Assim
agrotoacutexicos tecircm sido amplamente utilizados como uma das principais ferramentas para
um bom programa de controle de plantas daninhas em culturas que tecircm ganhado espaccedilo
na balanccedila comercial agriacutecola brasileira (Rodrigues amp Almeida 2005) O emprego dos
2
agrotoacutexicos tornou-se de uso rotineiro principalmente pelo menor custo e maior
eficiecircncia de controle das plantas daninhas quando comparados aos demais meacutetodos
convencionais de controle Para Rosa (1998) o modelo baseado no uso intensivo de
insumos quiacutemicos de sementes melhoradas e mecanizaccedilatildeo foi denominado ldquoRevoluccedilatildeo
Verderdquo que na deacutecada de 1980 trouxe ao Brasil um novo alento em relaccedilatildeo agrave
produtividade com grandes esperanccedilas de colheitas fartas e novas tecnologias que
propiciaram o domiacutenio de aacutereas pouco exploradas como por exemplo o cerrado da
Regiatildeo Centro-Oeste De fato muitas destas expectativas se realizaram entretanto o
impacto ambiental resultante implicou custos muitas vezes irremediaacuteveis como por
exemplo a perda de biodiversidade e a exaustatildeo de vaacuterios cursos drsquoaacutegua por
assoreamento aleacutem de contaminaccedilatildeo
12 Tipos de inseticidas
Os inseticidas satildeo classificados em quatro categorias conforme sua foacutermula
quiacutemica organoclorados carbamatos organofosforados e piretroides Os
organoclorados satildeo produtos sinteacuteticos que possuem carbono cloro e hidrogecircnio em sua
estrutura quiacutemica Satildeo persistentes no meio ambiente por vaacuterios anos e pouco soluacuteveis
em aacutegua Esses inseticidas quando mal administrados tecircm accedilatildeo toacutexica para diversos
mamiacuteferos sendo sua accedilatildeo natildeo sistecircmica neurotoacutexica e mutagecircnica (Guedes 1990
Pereira et al 2012) Os carbamatos satildeo inseticidas considerados menos persistentes e
com degradaccedilatildeo raacutepida no meio ambiente natildeo satildeo bioacumulados pouco lipofiacutelicos
satildeo sistecircmicos em plantas e inibidores da acetilcolinesterase (Guedes 1990 Ware
1994 Chatterjee et al 2001) Os organofosforados satildeo outro grupo de inseticida
amplamente utilizado no mercado mundial representando 355 do uso na uacuteltima
deacutecada Esses inseticidas caracterizam-se por pouca solubilidade em aacutegua (mais
soluacuteveis do que os organoclorados) toxicidade variaacutevel em animais vertebrados em
alguns animais e plantas tecircm atividade sistecircmica baixa persistecircncia no ambiente e
facilmente degradados por enzimas e fatores quiacutemicos A accedilatildeo desses toacutexicos eacute
semelhante ao carbamato agindo nas vias sinaacutepticas dos axocircnios inibindo a
acetilcolinesterase (Ware 1994 Albinati et al 2009) O piretroide tambeacutem eacute um
inseticida amplamente utilizado na agricultura representando 21 do mercado mundial
na uacuteltima deacutecada O fator positivo do uso desse pesticida eacute que ele eacute muito toacutexico para
insetos e apresenta baixa toxicidade para mamiacuteferos satildeo fotoestaacuteveis com degradaccedilatildeo
raacutepida no solo A accedilatildeo toacutexica desse inseticida eacute semelhante aos primeiros inseticidas
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desenvolvidos como o organoclorado DDT possuindo accedilatildeo neurotoacutexica nos axocircnios
(Naumann 1990 Ware 1994 Haverinen amp Vornanen 2014)
Nos uacuteltimos anos aumentou muito a diversidade de inseticidas visando a morte
de insetos e a persistecircncia do agrotoacutexico por periacuteodos curtos por questotildees de seguranccedila
ao meio ambiente Aleacutem desses inseticidas que foram mencionados acima existem
vaacuterios inseticidas organossinteacuteticos e inseticidas naturais de origem vegetal animal e
microbiana (Casida amp Quistad 1998 Ishaaya amp Horowitz 1998 Drevnick et al 2006)
13 Inseticidas no meio ambiente rotas de entrada
Os inseticidas podem entrar no meio ambiente acidental ou deliberadamente A
entrada acidental do inseticida origina-se de rejeitos industriais urbanos vazamentos
durante transporte armazenamento e distribuiccedilatildeo enquanto a entrada deliberada ocorre
pela aplicaccedilatildeo de inseticidas no meio rural e urbano As contaminaccedilotildees por agrotoacutexicos
podem contaminar solos e ateacute mesmo a atmosfera Nesse uacuteltimo a movimentaccedilatildeo do
toacutexico se daacute por meio de gotas partiacuteculas soacutelidas e gases que acabam sendo
transportados por longas distacircncias a partir do local de origem da aplicaccedilatildeo (Walker et
al 1996)
O transporte e destino dos agrotoacutexicos no ambiente aquaacutetico eacute ponto de
discussatildeo Murty (1988) descreveu que os agrotoacutexicos entram no ambiente aquaacutetico por
meio da aplicaccedilatildeo intencional implemento aeacutereo escoamento das aplicaccedilotildees ou
liberaccedilatildeo acidental A descarga dos resiacuteduos da manufatura de agrotoacutexicos constitui a
segunda maior fonte de contaminaccedilotildees dos corpos de aacutegua O efeito mais draacutestico eacute
esperado no ponto de liberaccedilatildeo em lagos e pequenos mares internos Os efeitos nos
oceanos eacute pequeno devido ao grande volume de aacutegua e accedilatildeo de correntes (Walker et al
1996)
Na rota de transporte bioloacutegico o sistema natildeo eacute muito importante em termos de
magnitude pela quantidade do xenobioacutetico acumulado quando comparado com fatores
mencionados acima (transporte abioacutetico) mas eacute importante para o homem e vida
silvestre O padratildeo do transporte bioloacutegico dos toacutexicos acumulados nos organismos
segue da seguinte forma herbiacutevoros carniacutevoros e pisciacutevoros (maior eficiecircncia de
acuacutemulo) Nesses uacuteltimos particularmente as espeacutecies de ambientes aquaacuteticos a
acumulaccedilatildeo e magnificaccedilatildeo satildeo maiores do que nas espeacutecies de ambiente terrestre
devido agrave lipofilicidade dos inseticidas particularmente os organoclorados Duas rotas de
entrada podem comprometer a toxicidade dos organismos aquaacuteticos absorccedilatildeo ou
4
ingestatildeo A bioconcentraccedilatildeo vai ser mais intensa no ambiente aquaacutetico pois a difusatildeo
dos poluentes na aacutegua aumenta a eficiecircncia de sua absorccedilatildeo pelo organismo aquaacutetico
devido agrave lipofilicidade dos organoclorados Dessa forma a transferecircncia ao longo de
cadeias alimentares eacute tambeacutem mais eficiente e a bioconcentraccedilatildeo acontece em todas as
suas etapas Devido a isso os efeitos em predadores podem ser seacuterios pois aleacutem de
grande bioconcentraccedilatildeo e transferecircncia pela cadeia alimentar alguns destes organismos
como aves que se alimentam de peixes e animais marinhos como focas e cetaacuteceos satildeo
deficientes no metabolismo de desintoxicaccedilatildeo particularmente devido ao sistema de
monoxigenases pouco desenvolvido comprometendo mais a toxicidade por
biomagnificaccedilatildeo (Barron 1995 Borgaacute et al 2004)
Aleacutem da bioconcentraccedilatildeo os resiacuteduos destas substacircncias presentes nas aacuteguas
podem ser aderidos ao material orgacircnico em suspensatildeo depositar-se no sedimento ou
serem absorvidos pelos organismos Assim peixes e invertebrados podem bioacumular
tais compostos ligados agrave mateacuteria ingerida ser passivamente absorvidos pela superfiacutecie
corporal ou durante as trocas respiratoacuterias (Vasconcellos amp Verani 2000 Henry amp
Kishimba 2006)
14 Avaliaccedilatildeo de sensibilidade e estudos de toxicidade aquaacutetica
A realizaccedilatildeo de testes de sensibilidade eacute recomendada como meacutetodo de
qualidade dos planteis de organismos cultivados Nestes testes satildeo utilizadas
substacircncias de referecircncias que incluem principalmente os sais dicromato de potaacutessio
cloreto de potaacutessio e cloreto de soacutedio Estes dois uacuteltimos satildeo mais recomendados pois
seus efluentes experimentais oferecem baixo risco de contaminaccedilatildeo ambiental Os testes
de sensibilidade geralmente satildeo de curta duraccedilatildeo (24 horas) e devem ser repetidos com
frequumlecircncia principalmente nos laboratoacuterios que mantecircm planteis de organismos-testes
pois estes dados servem como padratildeo na sensibilidade natural dos organismos Esta
teacutecnica vem sendo utilizada para avaliar os resultados de toxicidade pois a accedilatildeo toacutexica
somente poderaacute ser atribuiacuteda agrave substacircncia teste quando a sensibilidade natural dos
organismos natildeo tiver demonstrado qualquer alteraccedilatildeo ao longo do periacuteodo em que
foram testados (Ranzani-Paiva et al 2004)
O estudo dos efeitos de agentes toacutexicos sobre a vida aquaacutetica pode ser realizado
por meio de ensaios bioloacutegicos na natureza ou em condiccedilotildees laboratoriais controladas
sendo este uacuteltimo os mais utilizados por permitirem um controle mais efetivo de fatores
ocasionais como temperatura pH duraccedilatildeo de exposiccedilatildeo meio concentraccedilatildeo Ao se
5
avaliar a toxicidade de agentes toacutexicos ou misturas destes frente a um reativo bioloacutegico
geralmente se utiliza uma populaccedilatildeo homogecircnea possuindo uma sensibilidade definida
determinando-se a concentraccedilatildeo responsaacutevel por um efeito toacutexico (efeito letal subletal
crocircnico imobilizaccedilatildeo ou modificaccedilatildeo do comportamento entre outros) Estes testes
podem ser realizados utilizando-se sistemas de fluxo contiacutenuo semi estaacuteticos ou
estaacuteticos Quanto ao meio pode-se utilizar meio aquaacutetico do tipo aacutegua continental (aacutegua
dura rica em bicarbonatos e sulfatos dissolvidos ou aacutegua mole isenta de iacuteons caacutelcio e
magneacutesio) marinha ou salobra segundo as necessidades dos organismos avaliados
(CETESB 2008) Com relaccedilatildeo ao organismo-teste por razotildees teacutecnicas e econocircmicas eacute
impossiacutevel testar todas as espeacutecies que fazem parte do ecossistema aquaacutetico Assim
para esses estudos satildeo relacionados normalmente os organismos mais representativos
de cada niacutevel troacutefico na cadeia alimentar como algas microcrustaacuteceos e peixes
15 Caracterizaccedilatildeo do agrotoacutexico Thiodanreg
O endosulfan inseticida desenvolvido pela Hoechst Aktiengesellschaft na
Alemanha foi introduzido no mercado em 1957 com o nome comercial de Thiodan
(Goebel et al 1982 e Stumpf amp Abhaver 1986) O Thiodanreg eacute um inseticida acaricida
organoclorado do grupo quiacutemico eacutester do aacutecido sulfuroso de um diol ciacuteclico Esse
agrotoacutexico eacute classificado toxicologicamente como altamente toacutexico (Classe I)
classificaccedilatildeo ambiental como produto altamente perigoso aleacutem de inflamaacutevel e
corrosivo (Engelhardt amp Sarmento 2008)
O ingrediente ativo do Thiodanreg (350 gL de endosulfan) consiste na mistura de
dois isocircmeros sendo 70 de α-endosulfan e 30 de β-endosulfan Entre os produtos
derivados do metabolismo do endosulfan em mamiacuteferos o sulfato de endosulfan eacute o
principal metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica (Stumpf amp Abhaver 1986)
Os organoclorados como o Thiodanreg atuam nos canais de soacutedio do axocircnio
aumentando o periacuteodo de abertura destes canais O aumento do periacuteodo de abertura dos
canais de soacutedio leva a um aumento do fluxo de soacutedio para o interior da membrana e
acarretando um prolongamento da fase de despolarizaccedilatildeo apoacutes o pico do potencial de
accedilatildeo e devido a isso o inseto morre por hiperexcitaccedilatildeo Consequentemente a
propagaccedilatildeo contiacutenua do impulso nervoso gera tremores convulsotildees prostraccedilatildeo e
posteriormente a morte como observados em insetos Aleacutem disso pode afetar qualquer
tipo de crustaacuteceo peixes e mamiacuteferos inclusive em baixas concentraccedilotildees (Eto 1990
Pereira et al 2012)
6
16 O uso do endosulfan
O endosulfan eacute o uacutenico inseticida organoclorado amplamente utilizado em todo
o mundo (Capkin et al 2006 Chakrabarty et al 2012) Segundo a empresa Bayer
(2010) fabricante do produto o Thiodanreg (endosulfan) eacute um inseticida para o controle
de insetos chupadores e mastigadores com accedilatildeo de contato e ingestatildeo Recomenda-se
seu uso especialmente em cultivos de cafeacute cana hortaliccedilas frutas vinhas e forragens
Adverte tambeacutem que natildeo se devem colher frutos ou vegetais tratados ateacute 21 dias apoacutes a
uacuteltima aplicaccedilatildeo
No Brasil segundo Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) a
importaccedilatildeo do endosulfan estaacute proibida a partir de julho de 2012 e sua utilizaccedilatildeo a partir
de 2013 (Molina 2010) A utilizaccedilatildeo de produtos agrave base de endosulfan no Brasil eacute
estimada em 44 milhotildees de toneladas em uma aacuterea de 22 a 36 milhotildees de hectares
podendo representar cerca de 40 do consumo mundial deste organoclorado segundo
dados do Programa Ambiental das Naccedilotildees Unidas (UNEP 2010) Segundo a Agecircncia
de Proteccedilatildeo Ambiental norte americana (EPA 1980) contaminaccedilotildees humanas por
endosulfan satildeo provenientes em 53 dos casos da ingestatildeo de aacutegua contaminada e em
47 dos casos do consumo de alimentos a base de peixes contaminados A mesma
agecircncia define como CL50 aguda valores de 017microgL-1 para truta arco-iacuteris e 740microgL-1
para Daphnia magna
A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em
consideraccedilatildeo a qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente
Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm 3572007 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo
do referido inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
17 Toxicidade aguda do endosulfan
O endosulfan apesar de pertencer agrave classe toxicoloacutegica I eacute altamente toacutexico
para animais aquaacuteticos e terrestres (espeacutecies natildeo alvo) e segundo a Agency for Toxic
Substances and Disease Registry - ATSDR (2000) possui de moderado a alto risco e
efeitos agudos e crocircnicos
Pinheiro et al (1998) advertem com veemecircncia sobre o perigo de contaminaccedilatildeo
do Pantanal e da Amazocircnia lugares ricos em recursos hiacutedricos por produtos agrave base de
endosulfan pois este produto eacute extremamente toacutexico para peixes e outros organismos
aquaacuteticos mesmo em doses muito pequenas O endosulfan natildeo dissolve facilmente na
7
aacutegua e adere agraves partiacuteculas do solo levando anos para sua degradaccedilatildeo (Soares et al
2003)
18 Efeitos dos inseticidas organoclorados sobre peixes
Apesar dos mecanismos de toxicidade do endosulfan serem extensivamente
estudados alguns trabalhos foram conduzidos com o objetivo de se avaliar efeitos
histopatoloacutegicos dos agrotoacutexicos em peixes (Naqvi amp Vaishnavi 1993) especialmente
nas gocircnadas fiacutegados bracircnquias e rins Em um desses estudos Capkin et al (2006)
reportaram uma CL50 de 1978 gL para Oreochromis mikyss para 24 horas de
exposiccedilatildeo ao toacutexico o que causou aleacutem da morte de 50 dos animais convulsotildees nado
erraacutetico edema e separaccedilatildeo das lacircminas branquiais edema e necrose do fiacutegado dos
tuacutebulos renais e do tecido hematopoieacutetico Cengiz et al (2001) reportaram lesotildees
similares em bracircnquias do peixe-mosquito Gambusia affinis aleacutem de congestatildeo e
hipertrofia do fiacutegado com o uso do pesticida Thiodanreg Segundo Capkin et al (2006)
alcalinidade e temperatura da aacutegua aleacutem do tamanho dos peixes afetam a toxicidade do
endosulfan Assim peixes pequenos e meacutedios mantidos em temperatura de 131ordmC com
1978 microgL do toacutexico tiveram uma sobrevivecircncia de 25 e 425 respectivamente
enquanto os peixes grandes tiveram 100 de sobrevivecircncia Quando a temperatura da
aacutegua foi aumentada para 16ordmC nenhum dos peixes pequenos e meacutedios sobreviveu
enquanto os sobreviventes de peixes grandes diminuiacuteram para 775 O aumento da
alcalinidade de 198 mgL para 419 mgL ou superior aumentou (Plt0001) a
sobrevivecircncia dos peixes Em relaccedilatildeo agrave dureza entre 357 mgL e 126 mgL a
sobrevivecircncia dos peixes expostos ao endosulfan natildeo foi afetada Histologicamente as
bracircnquias dos peixes tiveram edema lamelar separaccedilatildeo do epiteacutelio das lamelas fusatildeo
lamelar e hipertrofia das ceacutelulas epiteliais Os fiacutegados apresentaram edemas e necroses
graves
Cengiz amp Uumlnluuml (2002) estudaram os efeitos crocircnicos do endosulfan sob as
bracircnquias nas concentraccedilotildees de 05 e 075 microgL ao longo de 30 dias de experimento O
que se comprovou eacute que a dose mais elevada do endosulfan causou mais mudanccedilas
patoloacutegicas que a menor dose Altinok amp Capkin (2007) natildeo verificaram alteraccedilatildeo
morfoloacutegica nas bracircnquias de truta com 21 dias de exposiccedilatildeo de metiocarb entretanto
uma concentraccedilatildeo superior (375 mgL) causou separaccedilatildeo epitelial das bracircnquias No
mesmo trabalho os peixes expostos ao endosulfan com concentraccedilotildees de 06 e 13 microgL
mostraram mudanccedilas morfoloacutegicas nas bracircnquias como desprendimento do epiteacutelio
8
aparecimento de granuloacutecitos nas lamelas fusatildeo e necrose lamelar hipertrofia e nuacutecleos
picnoacuteticos Essas evidecircncias comprovam o efeito do endosulfan com comprometimento
das bracircnquias levando a reduccedilatildeo do consumo de oxigecircnio e desregulaccedilatildeo da funccedilatildeo de
osmorregulaccedilatildeo em organismos aquaacuteticos Aleacutem disso os efeitos toacutexicos do endosulfan
no fiacutegado induziram modificaccedilotildees estruturais como hipertrofia dos hepatoacutecitos nuacutecleos
picnoacuteticos e necroses
No trabalho de Ballesteros et al (2007) que utilizaram peixes adultos da espeacutecie
Jenynsia multidentata os testes de toxicidade foram realizados durante 96 horas a fim
de determinar a concentraccedilatildeo letal (CL50) do endosulfan As alteraccedilotildees histoloacutegicas
foram determinadas nas bracircnquias e nos fiacutegados A CL50-96 horas foi significativamente
diferentes entre machos (0719 μgL) e fecircmeas (1317 μgL) A diferenccedila entre os sexos
foi atribuiacuteda ao dimorfismo no teor de lipiacutedios no sexo feminino (216) e masculino
(179) As alteraccedilotildees histoloacutegicas nas bracircnquias incluiacuteram hipertrofia e levantamento
do epiteacutelio das lamelas secundaacuterias e aneurismas Essas alteraccedilotildees causaram um
aumento significativo da espessura da lamela secundaacuteria no grupo tratado em relaccedilatildeo
aos peixes do grupo-controle Finalmente as alteraccedilotildees histoloacutegicas reversiacuteveis como
degeneraccedilatildeo hidroacutepica e dilataccedilotildees dos sinusoides foram observadas nos fiacutegados dos
peixes expostos bem como mudanccedila irreversiacutevel como necrose nas concentraccedilotildees
mais elevadas O fiacutegado eacute um oacutergatildeo importante na capacidade de degradar compostos
toacutexicos mas os seus mecanismos de regulaccedilatildeo podem ser comprometidos em
concentraccedilotildees elevadas causando mudanccedilas estruturais como observadas nesses
trabalhos
A qualidade da aacutegua eacute um fator importante para o sucesso da reproduccedilatildeo dos
peixes Quando a qualidade da aacutegua eacute alterada devido a produtos quiacutemicos a estrutura
histoloacutegica das gocircnadas tambeacutem eacute alterada Para Cengiz et al (2001) os efeitos do
Thiodanreg (endosulfan) satildeo tempo e dose dependentes Dutta et al (2006) descreveram
num estudo de toxicidade crocircnica as injuacuterias causadas pelo Thiodanreg sobre os tuacutebulos
seminiacuteferos do peixe ldquobluegillrdquo Lepomis macrochirus e relataram alteraccedilatildeo dos tuacutebulos
seminiacuteferos que mostraram perda dos padrotildees normais de organizaccedilatildeo celular
diminuindo tambeacutem o diacircmetro das espermatogocircnias primaacuterias gradativamente desde as
primeiras 24 horas de exposiccedilatildeo ateacute as duas semanas seguintes Segundo os autores este
tipo de dano pode afetar as espermaacutetides e os espermatozoides apresentando no final
um impacto negativo na espermatogecircnese e fertilidade do macho comprometendo o
nuacutemero da populaccedilatildeo do ldquobluegillrdquo Lepomis macrochirus Em outro trabalho sobre
9
reproduccedilatildeo Hazarika amp Das (1998) identificaram mudanccedilas estruturais nos ovaacuterios de
Heteropneustes fossilis exposto ao organoclorado lindano por 72 horas Os resultados
demonstraram que houve ruptura e diminuiccedilatildeo do tamanho dos foliacuteculos maduros
afetando a fertilidade dos peixes
19 O lambari Astyanax bimaculatus
O lambari Astyanax bimaculatus (Linnaeus 1758) eacute conhecido popularmente
pelos nomes de lambari piaba lambari-guaccedilu mojarra pertence agrave famiacutelia Characidae
ordem Characiformes e ateacute entatildeo uma das espeacutecies da subfamiacutelia Tetragonopterinae
(CEMIGCETEC 2000) No entanto revisotildees recentes colocam o gecircnero em ldquoIncertae
sedisrdquo com 88 gecircneros e 620 espeacutecies sendo que 86 espeacutecies pertencem ao gecircnero
Astyanax (Lima et al 2003)
O A bimaculatus eacute um peixe de pequeno porte atingindo aproximadamente 20
cm de comprimento e pesando ateacute 40 gramas Possui corpo irregularmente eliacuteptico com
nadadeiras amarelas quatro a cinco dentes na seacuterie externa e cinco na seacuterie interna do
preacute-maxilar escamas com reflexos prateados mancha umeral ovalada e peduacutenculo
caudal com mancha alongada que se prolonga ateacute a ponta dos raios caudais medianos
(Britiski et al 1988 CEMIGCETEC 2000)
O gecircnero Astyanax possui ampla distribuiccedilatildeo geograacutefica sendo encontrado
desde o sudoeste dos Estados Unidos ateacute a Bacia do rio da Prata (Moreira Filho 1989
citado por Pereira Filho 2000) Os lambaris satildeo encontrados em cabeceiras de riachos
rios e lagos e vivem sempre em cardumes realizando curtas migraccedilotildees na eacutepoca das
cheias para sua reproduccedilatildeo Em relaccedilatildeo ao periacuteodo reprodutivo dos lambaris este pode
variar conforme a espeacutecie e o habitat sendo normalmente de setembro a marccedilo
(Vazzoler amp Menezes 1992 citados por Pereira Filho 2000)
A biologia reprodutiva do lambari pode ser prejudicada pelo desmatamento
ciliar poluiccedilatildeo industrial e domeacutestica e destruiccedilatildeo de vaacuterzeas e lagoas marginais por
projetos agriacutecolas que tambeacutem constituem ameaccedila em vaacuterias regiotildees (CEMIGCETEC
2000) Esses fatores interferem na dinacircmica da populaccedilatildeo desses peixes
Os lambaris satildeo oniacutevoros se alimentando de algas vegetais sementes larvas e
insetos adultos (CEMIGCETEC 2000) Os lambaris satildeo de extrema importacircncia em
diversos habitats por equilibrarem o ecossistema e a cadeia alimentar constituindo fonte
de alimentos para peixes maiores espeacutecies carniacutevoras e aves Em estudo conduzido com
o lambari da espeacutecie Astyanax janeiroensis verificaram-se que os principais haacutebitos
10
alimentares se baseavam em algas microcrustaacuteceos pequenos invertebrados e esporos
vegetais (Santin et al 2005) Diversos trabalhos relatam na literatura a importacircncia do
lambari na estrutura troacutefica do ecossistema e sua variaccedilatildeo alimentar diante de
modificaccedilotildees ambientais (Motta amp Uieda 1995 Suarez et al 1995 Esteves 1998)
Trabalho conduzido por Loureiro et al (1995) verificando a dieta alimentar na espeacutecie
Hoplias malabaricus (traiacutera) no reservatoacuterio da UHE de Segredo (PR) mostraram a
ingestatildeo alimentar preferencial de lambaris de diversas espeacutecies Em outro estudo
verificou-se a importacircncia do lambari como alimento para as espeacutecies Hoplias
malabaricus Oligosarcus longirostris e Rhamdia branneri apoacutes o represamento do
Reservatoacuterio de Salto Caxias (PR) demonstrando ser o alimento preferido dessas
espeacutecies (Novakoski 2007) Aleacutem disso na regiatildeo sudoeste do estado de Minas Gerais
existem representantes do gecircnero no Reservatoacuterio de Furnas (MG) caracterizando a
reproduccedilatildeo ao longo do ano para o equiliacutebrio da cadeia alimentar tendo importacircncia
econocircmica na alimentaccedilatildeo e tambeacutem na praacutetica de pesca profissional (Bazzoli et al
1998 Carvalho et al 2009) Portanto os lambaris satildeo de grande importacircncia em
diversos habitats como consumidores secundaacuterios (Esteves 1998) A ecologia alimentar
de uma determinada espeacutecie faz parte e interfere diretamente na dinacircmica de sua
populaccedilatildeo sendo primordial para a conservaccedilatildeo do ecossistema como um todo (Vitule
amp Aranha 2002)
110 Morfologia hepaacutetica em teleoacutesteos
O fiacutegado eacute um oacutergatildeo multifuncional responsaacutevel por uma das etapas do
processo de desenvolvimento folicular principalmente no periacuteodo de formaccedilatildeo dos
gloacutebulos de vitelo momento em que ocorre a transferecircncia de vitelogenina para o
ovaacuterio etapa fisioloacutegica que inicia nas ceacutelulas da teca e ceacutelulas foliculares com
produccedilatildeo do estradiol No fiacutegado o estradiol estimula os hepatoacutecitos a produzirem a
vitelogenina e careogenina que satildeo levadas pela corrente sanguiacutenea ateacute o ovaacuterio onde
participam da formaccedilatildeo do vitelo e zona radiata durante a maturaccedilatildeo folicular
(Senthilkumaran et al 2004) A produccedilatildeo de vitelogenina no fiacutegado pode variar entre as
espeacutecies de teleoacutesteos devido agraves diferenccedilas na capacidade de armazenamento de energia
condiccedilatildeo fisioloacutegica haacutebitos alimentares e contaminaccedilatildeo (Peyon et al 1996 Hull amp
Harvey 2001 Al -Ghais 2013 Silva Barni et al 2014) Aleacutem disso o fiacutegado eacute
responsaacutevel pela conversatildeo do alimento e desintoxicaccedilatildeo de substacircncias estranhas
(Selman amp Walace 1989 Ribeiro et al 2006)
11
O fiacutegado eacute glacircndula digestiva que apresenta superfiacutecie
coberta por uma membrana serosa e o tecido conjuntivo de sua caacutepsula
invagina para o parecircnquima (Takashima amp Hibiya 1995) O fiacutegado de teleoacutesteos eacute
constituiacutedo por hepatoacutecitos ceacutelulas epiteliais dos ductos biliares ceacutelulas endoteliais
ceacutelulas que armazenam gordura (ceacutelulas de Ito) macroacutefagos e ceacutelulas sanguiacuteneas
circulantes (Hinton et al 1984) e em algumas espeacutecies observam-se ceacutelulas do
pacircncreas exoacutecrino (pacircncreas intra-hepaacutetico) distribuiacutedas entre o parecircnquima do oacutergatildeo
assim como descrito para o lambari (Santos et al 2013)
Estruturas lobulares e uma pequena veia central estatildeo presentes em vertebrados
em peixes estas estruturas variam dependendo da espeacutecie e satildeo geralmente obscuras
(Takashima amp Hibyia 1995) Os hepatoacutecitos arranjam-se em fileiras os quais
geralmente apresentam a espessura de duas ceacutelulas O hepatoacutecito possui um nuacutecleo
uacutenico embora ceacutelulas binucleadas possam ser observadas O nuacutecleo se localiza na
regiatildeo central ou no poacutelo celular voltado para o sinusoide e o nucleacuteolo eacute bem evidente
(Arana 1995) A circulaccedilatildeo no fiacutegado eacute realizada pela arteacuteria hepaacutetica veia porta aleacutem
de capilares sinusoides Existem cordotildees de hepatoacutecitos que se arranjam
concentricamente ao redor dos capilares sinusoides (Takashima amp Hibyia 1995)
As vias biliares satildeo formadas por canaliacuteculos biliares preacute-duacutectulo biliar duacutectulo
biliar e ducto biliar O canaliacuteculo biliar eacute formado pela membrana plasmaacutetica dos
hepatoacutecitos e os microvilos dos mesmos preenchem o luacutemen do canaliacuteculo Nos
hepatoacutecitos existem ceacutelulas preacute-ductulares que estabelecem complexos juncionais com
os hepatoacutecitos formando os preacute-duacutectulos biliares A transiccedilatildeo entre preacute-duacutectulo e
duacutectulo ocorre quando o lume biliar estaacute completamente circundado por ceacutelulas
epiteliais biliares O ducto biliar eacute formado por ceacutelulas epiteliais cuacutebicas nos ductos de
menor calibre e ceacutelulas colunares nos grandes ductos sendo a presenccedila de lacircmina basal
o fator diferenciador dos mesmos Nos grandes ductos circundando a lacircmina basal
estatildeo fibroblastos plexo capilar fibras nervosas e ceacutelulas musculares lisas Acredita-se
que estas ceacutelulas musculares promovam os movimentos peristaacutelticos impulsionando a
bile Esse ducto une-se ao ducto ciacutestico dando origem ao ducto coleacutedoco (Arana 1995)
O endoteacutelio eacute fenestrado e a lacircmina basal estaacute ausente No espaccedilo de Disse haacute
ceacutelulas de Ito que em teleoacutesteos se caracterizam por apresentar vesiacuteculas lipiacutedicas
assim como o mesmo tipo celular em mamiacuteferos (Arana 1995) Haacute algumas mudanccedilas
patoloacutegicas que podem ocorrer no fiacutegado de peixes que sofreram exposiccedilatildeo a toacutexicos ou
outras substacircncias irritantes dissolvidas na aacutegua A atrofia eacute caracterizada por
12
diminuiccedilatildeo do tamanho dos hepatoacutecitos com presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos Tambeacutem
podem ocorrer necrose degeneraccedilatildeo vacuolar degeneraccedilatildeo gordurosa estagnaccedilatildeo da
bile inflamaccedilatildeo do parecircnquima hepaacutetico (hepatites) cirrose hepaacutetica e
desenvolvimentos de tumores (Takashima amp Hibyia 1995)
111 Morfologia ovariana em teleoacutesteos
Os ovaacuterios das fecircmeas A bimaculatus seguem os padrotildees descritos para a
maioria dos teleoacutesteos sendo oacutergatildeos pares alongados e foliaacuteceos sofrendo
modificaccedilotildees na espessura volume e coloraccedilatildeo durante as diferentes fases do ciclo
reprodutivo conforme observado tambeacutem em outras espeacutecies do gecircnero (Drummond
1996 Miranda 1996 Melo et al 2005 Mazzoni et al 2005 Rodrigues amp Almeida
2005 Carvalho et al 2009 Prado et al 2011) Nesses peixes o ovaacuterio eacute do tipo
cistovariano onde o lume ovariano se estende ateacute o oviduto como na maioria dos
peixes teleoacutesteos (Nagahama 1983 Selman amp Wallace 1986 Connaughton amp Aida
1998)
Nas observaccedilotildees histoloacutegicas do ovaacuterio de A bimaculatus verificou-se que os
mesmos satildeo envolvidos externamente por uma serosa peritoneal constituiacuteda por
mesoteacutelio e lacircmina do tecido conjuntivo fibroso Profundamente a essa estrutura
observa-se tuacutenica albugiacutenea de natureza conjuntiva contendo fibroacutecitos e vasos
sanguiacuteneos A tuacutenica albugiacutenea emite septos para o interior do oacutergatildeo formando lamelas
ovuliacutegeras nas quais encontram-se ovogocircnias e foliacuteculos em diferentes fases de
desenvolvimento No lambari o tipo de desenvolvimento folicular eacute assincrocircnico com
a presenccedila de foliacuteculos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento (Miranda 1996
Drummmond 1996 Marcon 2008)
Em peixes o desenvolvimento folicular tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Begovac amp Wallace 1988 Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter
1996 Grier 2000 e 2002 Carvalho et al 2009) e como nos animais em geral
compreende os periacuteodos preacute-meioacutetico perinucleolar preacute-vitelogecircnico vitelogecircnico e
maturaccedilatildeo final Os foliacuteculos passam por diversas fases de desenvolvimento
diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo de acordo com o periacuteodo reprodutivo do animal (Wallace amp
Selman 1981) Essas fases ocorrem no interior de foliacuteculos cuja parede constituiacuteda de
zona radiata camada folicular membrana basal e teca (Grier 2000) desempenham um
importante papel durante a ovogecircnese e na fertilizaccedilatildeo
13
A foliculogecircnse eacute regulada hormonalmente pelo eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-
gocircnada Em peixes teleoacutesteos estiacutemulos ambientais satildeo convertidos em informaccedilotildees
sensoriais no ceacuterebro associados com a liberaccedilatildeo de hormocircnios liberadores de
gonadotropinas (GnRH) pelo hipotaacutelamo que via corrente sanguiacutenea chegam agrave
adenohipoacutefise que sintetiza e libera hormocircnios gonodotroacutepicos hormocircnio fociacuteculo
estimulante (FSH) e hormocircnio luteinizante (LH) Os hormocircnios FSH e LH se ligam aos
receptores celulares das ceacutelulas tecais (LH-R) e foliculares (LH-R e FSH-R) para
estimularem a produccedilatildeo 17α-hydroxy-pregnesterona (17α-HP) e testosterona (T) Nas
ceacutelulas foliculares os hormocircnios esteroides 17α-HP e T agem como precursor na
produccedilatildeo do 17β-estradiol (17β-E) e do hormocircnio indutor de maturaccedilatildeo (MIH)
substacircncias importantes nas etapas do desenvolvimento folicular e na ovulaccedilatildeo
respectivamente (Dietrich amp Krieger 2009) (Figura 1)
Figura 1 Ceacutelulas somaacuteticas do ovaacuterio e principais produtos (Adaptado de Dietrich amp Krieger 2009)
Muitas das espeacutecies nativas natildeo desovam espontaneamente em ambientes
lecircnticos Algumas espeacutecies nativas quando mantidas em cativeiro se preparam para a
reproduccedilatildeo mas natildeo desovam naturalmente e sofrem regressatildeo ovariana com
consequente atresia dos foliacuteculos A atresia folicular eacute um processo degenerativo de
ocorrecircncia comum nos ovaacuterios de vertebrados e os foliacuteculos podem sofrer atresia em
diferentes fases do desenvolvimento ou diferenciaccedilatildeo (Guraya 1986 Miranda et al
1999 Santos et al 2008b)
A ovulaccedilatildeo refere-se agrave expulsatildeo do foliacuteculo em desenvolvimento maduro
(Redding amp Patintildeo 1993) Na natureza a ovulaccedilatildeo eacute regulada por dois hormocircnios os
quais estimulam o desenvolvimento gonadal em peixes FSH e LH (Connaughton amp
Aida 1998 Klausen et al 2001) Estes hormocircnios gonadotroacutepicos agem nos oacutergatildeos
reprodutores promovendo o desenvolvimento e maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas O
14
processo de transporte dos hormocircnios para as ceacutelulas reprodutoras eacute lento em ambientes
naturais mas na reproduccedilatildeo artificial com a teacutecnica de hipofisaccedilatildeo esse processo
torna-se mais raacutepido em relaccedilatildeo ao processo natural (Woynarovich amp Horvath 1980)
Nos ovaacuterios de peixes teleoacutesteos com fertilizaccedilatildeo externa os foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios estruturas remanescentes da desova satildeo frequentes Um aspecto
interessante eacute saber a duraccedilatildeo da reabsorccedilatildeo dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios nos
procedimentos de desova induzida para as espeacutecies em criaccedilatildeo Drummond (1996) e
Marcon (2008) estudaram a reabsorccedilatildeo dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios no estroma
ovariano em maturaccedilatildeo avanccedilada de lambaris (A bimaculatus lacustris) e observaram
que cinco dias apoacutes a desova os foliacuteculos haviam sido reabsorvidos Durante esse
processo figuras de apoptose satildeo observadas em fecircmeas submetidas agrave hipofisaccedilatildeo
(Drummond et al 2000) o mesmo ocorrendo em Leporinus taeniatus (Anostomidae)
(Santos et al 2003) Santos et al (2008a) registraram por meio das teacutecnicas de TUNEL
e de imunoistoquiacutemica o iacutendice apoptoacutetico em ceacutelulas foliculares dos foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios em Prochilodus argenteus notando que o maior iacutendice de ceacutelulas
foliculares apoptoacuteticas coincidiu com menores valores de integrinas e colaacutegeno tipo IV
no terceiro dia apoacutes a desova induzida Esses achados demonstram a importacircncia dessas
proteiacutenas na integridade das ceacutelulas foliculares nos foliacuteculos
15
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do inseticida organoclorado
endosulfan em sua apresentaccedilatildeo comercial Thiodanreg sobre as caracteriacutesticas
morfoloacutegicas dos ovaacuterios e fiacutegado de fecircmeas adultas de lambaris A bimaculatus apoacutes
exposiccedilatildeo subletal a esse agrotoacutexico durante a maturaccedilatildeo avanccedilada
22 Objetivos especiacuteficos
Estimar a CL50 para fecircmeas adultas de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada
expostas ao inseticida organoclorado Thiodanreg
Avaliar histopatologicamente o fiacutegado dos animais dos grupos controles e tratados
Analisar por morfometria os principais constituintes celulares do fiacutegado nos grupos
controles e tratados
Avaliar diferenccedilas nos valores dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS) e
hepatossomaacutetico (IHS) de animais dos grupos controles e expostos ao toacutexico
Verificar provaacuteveis alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos diferentes estaacutedios de
desenvolvimento de foliacuteculos ovarianos nos grupos submetidos aos efeitos do
toacutexico utilizando-se microscopia de luz
Quantificar os diferentes tipos de foliacuteculos e avaliar por morfometria os diacircmetros
dos foliacuteculos vitelogecircnicos nos grupos controles e tratados
Avaliar e quantificar o processo de atresia folicular nos grupos controles
comparando-os com os grupos tratados
Analisar qualitativamente por imunoistoquiacutemica as proteiacutenas de adesatildeo celular
(integrina β1 e colaacutegeno do tipo IV) nas ceacutelulas foliculares ao longo do
desenvolvimento folicular nos peixes dos grupos controles e tratados e
16
Analisar qualitativamente por imunoistoquiacutemica a proteiacutena caspase 3 nas ceacutelulas
foliculares ao longo do desenvolvimento folicular nos peixes dos grupos controles e
tratados
17
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade Federal
de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste de toxicidade aguda e o teste subletal quanto
as atividades de coleta fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos fiacutegados As etapas de
microtomia coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e
morfomeacutetricas foram realizadas nos Laboratoacuterios de Peixes e de Histopatologia do
Departamento de Veterinaacuteria da UFV (DVTUFV)
31 Animais
Foram utilizadas fecircmeas do lambari A bimaculatus mantidas em tanques de terra
na Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso (g) de 1152 plusmn 201 e comprimento total (cm)
de 912 plusmn 064 As caracteriacutesticas para a escolha dos animais se basearam em aspectos
corporais como ventre abaulado poro genital dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV Os
aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuem capacidade de 50 litros numa
densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro
temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam
um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo contiacutenua de aacutegua para garantir o bem-estar
dos peixes (Figura 2) Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial Purina
contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas de
acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de 255
plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza total
2815 plusmn 594 mgL-1 (CaCO3)
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
18
Figura 2 Principais componentes estruturais dos grupos experimentais (Adaptado de Oliveira Ribeiro et al 2002)
A Bomba para oxigenaccedilatildeo da aacutegua B Termostato para controle da temperatura D Filtro interno L Material contra isolamento de ruiacutedo H-J Trecircs aquaacuterios para cada grupo experimental (Controle e e cada uma das concentraccedilotildees de Thiodanreg )
Os lotes de peixes (120 peixes em cada lote) foram destinados agrave accedilatildeo do toacutexico em
quatro tratamentos diferentes
Experimentos Tratamentos Experimento 1 sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo Experimento 2 sem aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo Experimento 3 com aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo
Experimento 4 com aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo
O periacuteodo de 10 dias para aclimataccedilatildeo dos peixes foi para permitir que as
caracteriacutesticas ovarianas sejam comparadas com os grupos que natildeo foram aclimatados
Dessa forma mostraraacute quais as melhores condiccedilotildees que esses peixes podem ter na
reproduccedilatildeo quando expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
32 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente experimento foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo com 350gL de endosulfan
33 Teste de toxicidade aguda em sistema estaacutetico ndash CL50
A definiccedilatildeo das concentraccedilotildees toacutexicas a serem testadas nem sempre ocorre de
maneira simples Muitas vezes faz-se necessaacuterio uma anaacutelise preliminar para a
definiccedilatildeo da melhor faixa de concentraccedilatildeo a ser considerada nos testes definitivos
Dessa forma a primeira providecircncia desse estudo de toxidade aguda eacute a realizaccedilatildeo de
testes preliminares que devem ser conduzidos com concentraccedilotildees toacutexicas relacionadas
entre si por progressotildees geomeacutetricas de razatildeo 10 calculadas com base em informaccedilotildees
19
obtidas por meio de testes jaacute realizados com outros organismos que mais se assemelham
filogeneticamente ao grupo em questatildeo (Ranzani-Paiva 2004) A partir dos resultados
obtidos nessa fase eacute possiacutevel estabelecer a faixa ideal de concentraccedilatildeo para conduccedilatildeo
dos testes definitivos com o lambari
O teste de concentraccedilatildeo letal (CL50) que avalia a concentraccedilatildeo responsaacutevel pela
mortalidade de metade dos animais foi realizado em sistema de aacutegua estaacutetico de acordo
NBR 15088 (ABNT 2007) com os animais mantidos sob restriccedilatildeo alimentar que se
iniciou 24 horas antes do iniacutecio e perdurou durante o teste Essa restriccedilatildeo alimentar foi
realizada para evitar acuacutemulo de mateacuteria orgacircnica que poderia interferir na accedilatildeo do
agrotoacutexico
Para o teste foram selecionados 120 lambaris fecircmeas adultas em maturaccedilatildeo
avanccedilada com aproximadamente 7cm de comprimento O agrotoacutexico utilizado foi o
Thiodanreg (Bayer) com 350gL-1 de endosulfan Foram utilizadas trecircs repeticcedilotildees com
cinco peixes cada para cada concentraccedilatildeo de Thiodanreg adotada sendo os grupos assim
classificados controle (0microgL-1) 15microgL-1 30microgL-1 60microgL-1 120microgL-1 240microgL-
1 480microgL-1 e 960microgL-1 As concentraccedilotildees foram distribuiacutedas em recipientes plaacutesticos
com 15L de aacutegua dos proacuteprios aquaacuterios (Figura 3) Para obter as diferentes
concentraccedilotildees o Thiodanreg foi diluiacutedo uma primeira vez 1100 (Soluccedilatildeo Padratildeo
Intermediaacuteria contendo 3500mgL-1 de endosulfan) e uma segunda vez 1100 (Soluccedilatildeo
Padratildeo Final contendo 35000microgL-1 de endosulfan) viabilizando a observaccedilatildeo da
toxicidade total do agrotoacutexico e natildeo apenas do princiacutepio ativo (Figura 4)
Figura 3 Recipiente utilizado e distribuiccedilatildeo das concentraccedilotildees
20
Figura 4 Preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo padratildeo final do Thiodanreg
Foram feitas as verificaccedilotildees de mortalidade a cada seis horas (zero 6 12 18 24
30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 e 96 horas) removendo-se os animais mortos o
que proporcionou menores interferecircncias pela decomposiccedilatildeo dos peixes gerando maior
confianccedila da mortalidade apresentada ser em funccedilatildeo da toxicidade do princiacutepio ativo
endosulfan sinergicamente agrave accedilatildeo dos solventes e demais compostos do inseticida Para
acompanhamento da temperatura foi adicionado 15L de aacutegua do mesmo aquaacuterio em
um recipiente idecircntico de forma que qualquer variaccedilatildeo na temperatura pudesse ser
medida sem provocar estresse adicional a nenhum grupo O teste teve iniacutecio no dia
16012010 agraves 1000 horas com teacutermino agraves 1000 horas do dia 20012010 O programa
utilizado para o caacutelculo da CL50 foi o TOXCALC determinando o valor e o intervalo de
confianccedila pelo meacutetodo PROBITUS (Plt005)
34 Teste de toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Depois de estimar a CL50 pelos testes preliminares foi realizada aclimataccedilatildeo de
novos lambaris como descrito no item 31 (Figura 2) onde os peixes se acostumaram
ao seu novo meio e agraves atividades normais de manutenccedilatildeo como alimentaccedilatildeo e limpeza
dos aquaacuterios O teste de toxicidade aguda com o endosulfan foi realizado baseando-se
principalmente nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo com a
NBR 15088 (ABNT 2007)
O teste de toxicidade subletal foi feito com trecircs diferentes dosagens do toacutexico
inferiores agrave CL50 e para fins estatiacutesticos cada concentraccedilatildeo incluindo-se o grupo
controle teve trecircs repeticcedilotildees sob as mesmas condiccedilotildees para depois se avaliar e
Thiodanreg
Soluccedilatildeo padratildeo
intermediaacuteria
(1100)
Soluccedilatildeo
padratildeo final
(1100)
3500mgL de soluccedilatildeo padratildeo
intermediaacuteria 35000 microgL de
soluccedilatildeo padratildeo
final
21
quantificar a mortalidade se for o caso observar o comportamento dos animais que
sobreviveram agrave intoxicaccedilatildeo e os efeitos morfoloacutegicos nos fiacutegados e ovaacuterios dos peixes
expostos Assim como foram trecircs repeticcedilotildees usando-se trecircs diferentes concentraccedilotildees do
toacutexico e um grupo controle para a realizaccedilatildeo do presente experimento foram
necessaacuterias 120 fecircmeas de lambari para cada experimento (Tabela 1)
Tabela 1 Distribuiccedilatildeo das fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus em cada grupo experimental
Repeticcedilatildeo Controle 115microgl 23microgl 56microgl A 10 10 10 10 B 10 10 10 10 C 10 10 10 10
Para cada peixe que sobreviveu agrave intoxicaccedilatildeo pelo periacuteodo de 96 horas (teste de
toxicidade subletal) foram obtidos dados biomeacutetricos como peso corporal comprimento
total e comprimento-padratildeo peso do fiacutegado e peso do ovaacuterio Os ovaacuterios e fiacutegados na
sequecircncia foram fixados para posterior anaacutelise histoloacutegica
35 Avaliaccedilatildeo morfoloacutegica
351 Microscopia de luz
Apoacutes 96 horas de experimento seis animais de cada grupo foram coletados
anestesiados com benzocaiacutena e eutanasiados para coleta dos ovaacuterios e fiacutegados Para o
estudo das caracteriacutesticas morfoloacutegicas de ovaacuterios e fiacutegados os fragmentos foram
fixados em paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo fosfato 01M pH 72 O material foi
fixado por um periacuteodo miacutenimo de 24 horas e preservado em aacutelcool 70 Em seguida os
fragmentos foram transferidos para soluccedilatildeo de aacutelcool 95 por quatro horas Apoacutes isso
os fragmentos de ovaacuterios e fiacutegados foram imersos em soluccedilatildeo de aacutelcool 95 e resina
glicolmetacrilato (Leica Historesin) na proporccedilatildeo de 11 por 12 horas seguida de resina
pura por 24 horas e posterior emblocamento Os fragmentos foram seccionados em
cortes com 3microm de espessura em microacutetomo rotativo com navalha de vidro Foi
preparada uma lacircmina por animal com quatro cortes em cada e em padratildeo semi-seriado
ou seja a cada corte aproveitado eram descartados cinco cortes seguintes para evitar que
a mesma ceacutelula fosse contada duas vezes no momento da anaacutelise baseando-se no
diacircmetro nuclear previamente estabelecido para cada tipo celular em questatildeo
22
As coloraccedilotildees utilizadas foram azul de toluidina e hematoxilinaeosina para
anaacutelises histotoloacutegicas e para morfometria Tambeacutem foi utilizada a reaccedilatildeo histoquiacutemica
com PAS contracorados com hematoxilina para os cortes de fiacutegados As lacircminas foram
montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e
as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
352 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos fiacutegados
Os estudos morfoloacutegicos foram conduzidos em seis animais por concentraccedilatildeo
As lacircminas histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo e fotografadas (ocular
de 10X e objetiva de 40X) em 10 campos ao acaso para anaacutelises morfoloacutegicas e
morfomeacutetricas que pudessem ser representativas dos efeitos do Thiodanreg no tecido
hepaacutetico Estas alteraccedilotildees foram comparadas com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos fiacutegados
das lacircminas do grupo controle
As alteraccedilotildees histoloacutegicas foram avaliadas semiquantitativamente em duas
formas 1) por meio do caacutelculo do Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) com base na
incidecircncia de lesotildees Para tanto atribuiu-se um valor numeacuterico para cada animal
conforme a escala grau 1 (ausecircncia de alteraccedilatildeo histoloacutegica) grau 2 (ocorrecircncia de
lesotildees pontualmente localizadas) e grau 3 (lesotildees amplamente distribuiacutedas pelo oacutergatildeo)
em 10 campos fotografados e 2) por meio do caacutelculo do Iacutendice de Alteraccedilatildeo
Histopatoloacutegica (IAH) com base na severidade de cada lesatildeo de acordo com Schwaiger
et al (1997) Para tanto as alteraccedilotildees foram classificadas em estaacutedios progressivos
quanto ao comprometimento das funccedilotildees do oacutergatildeo alteraccedilotildees de estaacutedio I que natildeo
comprometem o funcionamento do oacutergatildeo de estaacutedio II mais severas e que prejudicam
o funcionamento normal do oacutergatildeo e de estaacutedio III muito severas e irreversiacuteveis
adaptado de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic (1994) (Tabela 2) O valor de IAH foi
calculado para cada animal utilizando a foacutermula IAH =10ordm sumI + 10ˡ sumII + 10sup2 sumIII
sendo I II e III correspondentes ao nuacutemero de alteraccedilotildees de estaacutedio I II e III
respectivamente O valor meacutedio de IAH foi dividido em cinco categorias seguindo
metodologia de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic (1994) 0-10= funcionamento normal do
tecido 11-20= dano leve a moderado do tecido 21-50= dano moderado a severo do
tecido 51-100= dano severo do tecido maior que 100= dano irreparaacutevel do tecido Este
iacutendice permitiu a comparaccedilatildeo da severidade das lesotildees hepaacuteticas entre os peixes
expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
23
Tabela 2 Classificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histoloacutegicas do fiacutegado quanto ao estaacutegio de comprometimento das funccedilotildees teciduais (adaptado de Poleksic amp MitrovicndashTutundzic1994)
Para as anaacutelises morfomeacutetricas foram realizadas dez mediccedilotildees dos diacircmetros de
nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos para cada animal As medidas foram obtidas por
meio do programa Image-Pro Plus traccedilando duas linhas perpendiculares respeitando-se
os limites do nuacutecleo e do citoplasma do hepatoacutecito em anaacutelise (Figura 5) Aleacutem disso
foram quantificados pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleo citoplasma capilar sinusoides e
macroacutefagos em 10 campos (gradiacutecula com 100microm de lado e uma aacuterea de 10000micromsup2)
totalizando 4410 pontosanimal para o caacutelculo da constituiccedilatildeo tecidual hepaacutetica (Figura
6) Estas avaliaccedilotildees foram conduzidas nos grupos controles e grupos de peixes expostos
ao toacutexico nas diferentes concentraccedilotildees
A quantidade de glicogecircnio nos hepatoacutecitos foi avaliada em toda extensatildeo da
lacircmina de forma semiquantitativa sendo evidenciada pela reaccedilatildeo histoquiacutemica de
Periodic Acid Schiff (PAS) segundo Michalany (1980) Para melhor compreensatildeo dos
resultados as marcaccedilotildees foram determinadas na seguinte escala 0- ausecircncia de
glicogecircnio 1- pouco glicogecircnio 2- quantidade moderada de glicogecircnio 3- muito
glicogecircnio Apoacutes esta anaacutelise foi calculada uma meacutedia do conteuacutedo de glicogecircnio dos
hepatoacutecitos nos grupos controles e grupos expostos ao toacutexico nas diferentes
concentraccedilotildees
ALTERACcedilOtildeES HISTOPATOLOacuteGICAS HEPAacuteTICAS ESTAacuteGIO1 Alteraccedilatildeo nos hepatoacutecitosAtrofia nuclear I
Atorfia nuclear I
Deformaccedilatildeo do contorno celular I
Deformaccedilatildeo do contorno nuclear I
Hipertrofia celular I
Hipertrofia nuclear I
Nuacutecleo na periferia da ceacutelula II
Vacuolizaccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo nuclear II
Nuacutecleos picnoacuteticos II
Rompimento celular II
2 Alteraccedilotildees nos vasos sanguiacuteneos
Hiperemia II
Ruptura de vasos II
3 Necrose
Necrose focal III
24
Figura 5 Metodologia para obtenccedilatildeo de medidas de diacircmetro de nuacutecleo e citoplasma de hepatoacutecitos por meio do programa Image-Pro Plus Coloraccedilatildeo Azul de toluidina Barra 5microm
Figura 6 Gradiacutecula utilizada para contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos capilares e macroacutefagos (4410 pontosanimal) Coloraccedilatildeo Azul de toluidina
25
353 Anaacutelises morfomeacutetri cas e morfoloacutegicas dos ovaacuterios
Os estudos foram conduzidos em seis animais de cada grupo em cada
experimento As lacircminas histoloacutegicas foram analisadsas em toda sua extensatildeo em busca
de alteraccedilotildees morfoloacutegicas foliculares (Tabela 3) que pudessem ser representativas dos
efeitos do Thiodanreg no tecido ovariano sempre comparando estas alteraccedilotildees com o
padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios das lacircminas dos grupos controles
Para a avaliaccedilatildeo morfomeacutetrica foram realizadas contagens dos diferentes
estaacutegios de desenvolvimento folicular Para isto foram utilizadas fotografias obtidas a
partir de 10 campos escolhidos ao acaso em objetiva de 10X (campo com 5094microm de
largura por 68120microm de comprimento totalizando uma aacuterea de 1863 mmsup2) Aleacutem
disso foi realizada a contagem de foliacuteculos atreacutesicos e observados eosinoacutefilos
associados aos foliacuteculos vitelogecircnicos utilizando o microscoacutepio com objetiva de 40X
avaliando-se 10 foliacuteculos escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro
experimentos Tambeacutem foram realizadas mediccedilotildees de diacircmetros em 10 foliacuteculos
vitelogecircnicos para cada animal Estas medidas foram obtidas pelo programa Image-Pro
Plus traccedilando-se duas linhas perpendiculares sobre nuacutecleo e central e respeitando-se os
limites do foliacuteculo As mensuraccedilotildees foram realizadas em imagens obtidas com objetiva
de 4X (Figura 7) Em todas as contagens e mediccedilotildees foram calculados os valores
meacutedios e desvios-padratildeo para cada concentraccedilatildeo para se avaliar o desenvolvimento
folicular nos diferentes experimentos
Tabela 3 Alteraccedilotildees histoloacutegicas do ovaacuterio quanto ao comprometimento folicular (adaptado de Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS FOLICULAR ES Alteraccedilatildeo nos foliacuteculos
Descolamento do revestimento folicular
Retraccedilatildeo citoplasmaacutetica
Retraccedilatildeo nuclear
Atresia folicular
Aglutinaccedilatildeo nucleoplasmaacutetica
Aglutinaccedilatildeo citoplasmaacutetica
Aglutinaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo
Foliacuteculos vazios
Granuloacutecitos envolvendo foliacuteculos
26
Figura 7 Metodologia para obtenccedilatildeo de medidas de diacircmetro de ovoacutecitos vitelogecircnicos avanccedilados por meio do programa Image-Pro Plus Coloraccedilatildeo Hematoxilina eosina
354 Imunoistoquiacutemica
Para detectar a possiacutevel imunorreatividade para colaacutegeno tipo IV integrinas β1 e
caspase 3 no tecido conjuntivo ovaacuterios do lambari foram fixados em paraformaldeido a
4 A recuperaccedilatildeo antigecircnica foi realizada em forno microndas por 10 minutos com os
cortes nas lacircminas sendo imersos em tampatildeo citrato 10mM pH 60 As lacircminas foram
incubadas com peroacutexido de hidrogecircnio a 3 em tampatildeo fosfato por 15 minutos em
temperatura ambiente para inativar peroxidase endoacutegena e com soro albumina bovina a
2 por 45 minutos para bloquear marcador antigecircnico inespeciacutefico Anticorpos
primaacuterios anti-colaacutegeno tipo IV anti-integrina β1 e anti-caspase 3 (Santa Cruz
Biotechnology Calif USA) foram aplicados nas secccedilotildees a 4degC na diluiccedilatildeo 1100
(integrina e colaacutegeno tipo IV) e 1200 (Caspase 3) segundo o fabricante ldquoovernightrdquo
Os cortes foram lavados em PBS e incubados por 45 minutos com diluiccedilatildeo de 1200
com anticorpo secundaacuterio IgG anti-coelho (LSAB 2 sistema HRP da Dako Cytomation
kit Dako Cytomation Carpinteria Calif USA) e tratado com peroxidase conjugada
com estreptavidina por 45 minutos A revelaccedilatildeo foi realizada com diaminobenzidina
(DAB) e as lacircminas foram contracoradas com hematoxilina (Santos et al 2008a)
27
36 Paracircmetros biomeacutetricos
Para analisar quantitativamente a atividade reprodutiva do A bimaculatus foram
registrados para cada exemplar os seguintes dados biomeacutetricos peso corporal (em g)
peso dos ovaacuterios (em g) e peso do fiacutegado (em g) Os valores meacutedios e desvios-padratildeo
dos iacutendices gonadossomaacutetico e hepatossomaacutetico foram calculados para cada animal em
cada um dos grupos propostos no presente estudo
a) Iacutendice gonadossomaacutetico (IGS)
IGS=PG x100 PG= peso dos ovaacuterios
PC PC= peso corporal
b) Iacutendice hepatossomaacutetico (IHS)
IHS= PF x100 PF= peso do fiacutegado
PC PC= peso corporal
37 Anaacutelises estatiacutesticas
As variaacuteveis quantitativas foram submetidas aos testes de homocedasticidade
(Levenes) e normalidade (Shapiro-Wilk) e posteriormente agrave anaacutelise de variacircncia para
testar as variaccedilotildees nos valores meacutedios dos iacutendices calculados no momento da coleta (96
horas) entre os grupos controles e os grupos tratados Foi analisado o coeficiente de
variaccedilatildeo para se evitar erros estatiacutesticos tipo I e tipo II e logo apoacutes foi realizado o teste
parameacutetrico de Duncan ou Tukey (Plt005) para comparar os valores meacutedios Quando
natildeo atenderam agraves premissas de normalidade e homocedasticidade mesmo apoacutes as
transformaccedilotildees apropriadas os dados foram submetidos aos testes natildeo-parameacutetricos de
Kruskal-Wallis (ANOVA) Para as variaacuteveis qualititativas quantificadas foi utilizado o
teste de Kruskal-Wallis (ANOVA) Os graacuteficos foram produzidos usando o software
Microsoft Excel 2010
28
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35
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 CAPIacuteTULO 1
EFEITOS DO INSETICIDA THIODAN reg SOBRE A MORFOLOGIA HEPAacuteTICA
DE FEcircMEAS DE LAMBARIS Astyanax bimaculatus
RESUMO
O Thiodanreg eacute um toacutexico que pode causar alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos tecidos de peixes
expostos a ele dependendo da concentraccedilatildeo A fim de investigar possiacuteveis alteraccedilotildees
este estudo avaliou a morfologia hepaacutetica de fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus
expostas ao Thiodanreg por 96 horas em quatro diferentes experimentos com trecircs
concentraccedilotildees subletais de 115 23 e 56 microgL de Thiodanreg aleacutem de um grupo
controle livre de toacutexico As fecircmeas foram divididas em quatro experimentos sem
aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem aclimataccedilatildeo e alimentados com aclimataccedilatildeo de 10 dias e
sem alimentaccedilatildeo e com aclimataccedilatildeo de 10 dias e alimentados Foi observado que a accedilatildeo do
Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou a estrutura morfoloacutegica do fiacutegado
como um todo mas foram observadas alteraccedilotildees em locais isolados do parecircnquima
hepaacutetico Houve depleccedilatildeo de glicogecircnio deformaccedilatildeo nuclear e citoplasmaacutetica
hipertrofia nuclear e citoplasmaacutetica hiperemia e degeneraccedilatildeo celular nos hepatoacutecitos
nas diferentes concentraccedilotildees No entanto o Iacutendice de Alteraccedilatildeo Histoloacutegica (IHA) e o
Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) demonstraram que as alteraccedilotildees observadas nos
fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas sendo na maioria alteraccedilotildees de estaacutedio I e II
de forma leve a moderada com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico em todas as
concentraccedilotildees Aleacutem disso houve alteraccedilatildeo do diacircmetro do nuacutecleo e citoplasma dos
hepatoacutecitos nos diferentes experimentos e maior quantidade de nuacutecleos de hepatoacutecitos
nos grupos expostos ao Thiodanreg associada agrave reduccedilatildeo na quantidade de citoplasma
Conclui-se que o Thiodanreg influenciou o metabolismo hepaacutetico como resposta
adaptativa celular A incidecircncia de alteraccedilotildees histoloacutegicas no fiacutegado dos lambaris
coletados nos diferentes experimentos indica o comprometimento da sauacutede destes
peixes e mostra que os paracircmetros analisados podem ser empregados como
biomarcadores da contaminaccedilatildeo ambiental nesta espeacutecie
Palavras-chave histopatologia fiacutegado peixe endosulfan ecotoxicologia
36
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 α-endosulfan e 30 β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo a
partir da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em risco os organismos que ali
residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al 2007)
Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos como jaacute
observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis niloticus A
Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan em gordura o valor de
005mgkg-1 (EPA 2002) e em aacutegua doce 022microgL-1 (EPA 1980) A Legislaccedilatildeo
Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em consideraccedilatildeo a qualidade da
aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm
3572007 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo do referido inseticida e
seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
A sensibilidade ao endosulfan pelos organismos aquaacuteticos tem sido bem descrita
na literatura (Capkin et al 2006 Ballesteros et al 2007 Pereira et al 2012) O
produto eacute extremamente toacutexico para peixes e outros organismos aquaacuteticos mesmo em
concentraccedilotildees muito pequenas (Cengiz et al 2001) No entanto a sensibilidade pode
variar entre os sexos assim como foi observado nos peixes adultos da espeacutecie Jenynsia
multidentata sob efeito do endosulfan por 96 horas (Ballesteros et al 2007) Neste
trabalho a CL50 em peixes machos foi de 072 μgL-1 enquanto nas fecircmeas foi de
131μgL-1 valores atribuiacutedos agraves diferenccedilas de maior reserva de lipiacutedeos nas fecircmeas que
nos machos Em outros estudos Capkin et al (2006) utilizaram 1978gL-1 em
Oreochromis mikyss por 24 horas de exposiccedilatildeo ao toacutexico o que causou aleacutem da morte
de 50 dos peixes convulsotildees nado erraacutetico separaccedilatildeo das lacircminas bracircnquiais e
necrose do fiacutegado e como Cengiz et al (2001) reportaram lesotildees similares no peixe-
mosquito Gambusia affinis
O sulfato de endosulfan eacute um dos produtos derivados do metabolismo do
endosulfan sendo considerado o principal metaboacutelito devido agrave sua importacircncia
toxicoloacutegica (Stumpf amp abhaver 1986) e por ser mais estaacutevel no meio ambiente do que
37
quando estaacute em sua foacutermula original (Ali et al 1984) Decorrente disto os peixes
quando expostos a este inseticida podem apresentar alteraccedilotildees morfoloacutegicas
significativas no fiacutegado (Capkin et al 2006 Coimbra et al 2007 Glover et al 2007)
Estas alteraccedilotildees morfoloacutegicas podem ser o surgimento de vacuolizaccedilatildeo dos hepatoacutecitos
depleccedilatildeo de glicogecircnio alteraccedilatildeo dos vasos sinusoides alteraccedilatildeo do tamanho dos
hepatoacutecitos e necroses o que de acordo com alguns autores pode influenciar a siacutentese
de vitelogenina no fiacutegado para formaccedilatildeo dos foliacuteculos vitelogecircnicos em periacuteodo
reprodutivo (Senthilkumaran et al 2004 Al-Ghais 2013 Silva Barni et al 2014 )
Aleacutem disso as funccedilotildees hepaacuteticas podem ser influenciadas pelas diferenccedilas na
capacidade de exposiccedilatildeo a contaminantes condiccedilatildeo fisioloacutegica armazenamento de
energia e haacutebitos alimentares (Ribeiro et al 2006 Al -Ghais 2013 Silva Barni et al
2014)
O lambari Astyanax bimaculatus foi escolhido como organismo experimental
pois eacute muito representativo no ecossistema sendo encontrado desde o Nordeste
brasileiro ateacute a bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Eacute um peixe de
pequeno porte e de faacutecil manutenccedilatildeo em laboratoacuterio
Este estudo teve como objetivo verificar a ocorrecircncia de alteraccedilotildees histoloacutegicas
no fiacutegado de fecircmeas de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada e avaliar a intensidade
de alteraccedilatildeo deste orgatildeo em peixes alimentados e desprovidos de alimento durante
ensaios subletais agudos com o toacutexico Thiodanreg
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste de toxicidade aguda e o teste subletal As
atividades de coleta fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos fiacutegados microtomia
coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e morfomeacutetricas foram
realizadas nos Laboratoacuterios de Peixes e de Histopatologia do Departamento de
Veterinaacuteria da UFV (DVTUFV)
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
38
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos animais em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado poro genital
dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV Os
aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuem capacidade de 50 litros numa
densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro
temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam
sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo contiacutenua da aacutegua para garantir o bem-estar dos
peixes Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial Purina contendo 35 de
proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste da toxicidade aguda em sistema estaacutetico - CL 50
O teste de concentraccedilatildeo letal (CL50) que avalia a concentraccedilatildeo responsaacutevel pela
mortalidade de 50 dos animais foi realizado em sistema de aacutegua estaacutetico de acordo
com a NBR 15088 (ABNT 2007) com os animais mantidos em restriccedilatildeo alimentar que
se iniciou 24 horas antes do iniacutecio do experimento e perdurou durante todo o teste (96
horas) Essa restriccedilatildeo alimentar foi realizada para evitar acuacutemulo de mateacuteria orgacircnica
que poderia interferir na accedilatildeo do agrotoacutexico
Para o teste foram selecionadas 120 fecircmeas adultas de lambari em maturaccedilatildeo
avanccedilada O agrotoacutexico utilizado foi o Thiodanreg (Bayer) com 350gL-1 de endosulfan
Foram utilizadas trecircs repeticcedilotildees com cinco peixes cada para cada concentraccedilatildeo de
39
Thiodanreg adotada sendo os grupos assim classificados controle (0microgL-1) 15microgL-1
30microgL-1 60microgL-1 120microgL-1 240microgL-1 480microgL-1 e 960microgL-1 As concentraccedilotildees
foram distribuiacutedas em recipientes plaacutesticos com 15L de aacutegua dos proacuteprios aquaacuterios
Foram realizadas verificaccedilotildees de mortalidade a cada seis horas ateacute 96 horas
(zero 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 e 96 horas) removendo-se
os animais mortos o que proporcionou menores interferecircncias pela decomposiccedilatildeo dos
peixes gerando maior confianccedila da mortalidade apresentada ser em funccedilatildeo da
toxicidade do princiacutepio ativo endosulfan sinergicamente agrave accedilatildeo dos solventes e demais
compostos do inseticida Para acompanhamento da temperatura foi acondicionado 15L
de aacutegua do mesmo aquaacuterio em um recipiente idecircntico de forma que qualquer variaccedilatildeo
na temperatura pudesse ser medida sem provocar estresse adicional a nenhum grupo O
programa utilizado para o caacutelculo da CL50 foi o TOXCALC determinando o valor e
intervalo de confianccedila pelo meacutetodo PROBITUS (Plt005)
24 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi realizado baseando-se
principalmente nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo a NBR
15088 (ABNT 2007)
As fecircmeas foram expostas ao Thiodanreg (endosulfan 350gL-1) por 96 horas em
quatro tratamentos diferentes 1) experimento sem aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem
alimentaccedilatildeo 2) experimento sem aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo 3) experimento com
aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e 4) experimento com aclimataccedilatildeo de 10 dias
e com alimentaccedilatildeo Todos os experimentos foram constituiacutedos por trecircs concentraccedilotildees
diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 preacute-determinada em laboratoacuterio de acordo com
a NBR 15088 (ABNT 2007) e um grupo controle sem toacutexico As concentraccedilotildees
utilizadas em cada experimento foram de 115 23 e 56microgL-1 com trecircs repeticcedilotildees sob
as mesmas condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
25 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas
Apoacutes 96 horas de experimento foram coletados 96 peixes sendo seis animais
em cada grupo nos diferentes experimentos Logo em seguida os fiacutegados foram
coletados apoacutes os peixes terem sido anestesiados com benzocaiacutena (110000) e
eutanasiados pela secccedilatildeo transversal da coluna vertebral na regiatildeo do opeacuterculo
40
Para a histologia todas as amostras foram fixadas em paraformaldeiacutedo a 4 em
tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedos em resina glicolmetacrilato
(Leica Historesinreg) Em seguida secccedilotildees com 3microm de espessura foram coradas
utilizando azul de toluidina para as anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas As lacircminas
foram montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31
Olympus e as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software
Analysis GETIT Olympus
As lacircminas histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo e foram
fotografados 10 campos ao acaso em objetiva de 40X para anaacutelises morfoloacutegicas e
morfomeacutetricas que pudessem ser representativas do efeito do Thiodanreg no tecido
hepaacutetico Estas alteraccedilotildees foram comparadas com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos fiacutegados
dos grupos controles
As alteraccedilotildees histoloacutegicas foram avaliadas semiquantitativamente de duas
formas 1) por meio do caacutelculo do Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) com base na
incidecircncia de lesotildees Para tanto atribuiu-se um valor numeacuterico para cada oacutergatildeo
conforme a escala grau 1 (ausecircncia de alteraccedilatildeo histoloacutegica) grau 2 (ocorrecircncia de
lesotildees pontuais) e grau 3 (lesotildees amplamente difusas pelo oacutergatildeo) em 10 campos
fotografados e 2) pelo caacutelculo do Iacutendice de Alteraccedilatildeo Histotoloacutegica (IAH) com base na
severidade de cada lesatildeo de acordo com Schwaiger et al (1997) Para tanto as
alteraccedilotildees foram classificadas em estaacutedios progressivos quanto ao comprometimento
das funccedilotildees do oacutergatildeo alteraccedilotildees de estaacutedio I que natildeo comprometem o funcionamento
do oacutergatildeo de estaacutedio II mais severas e que prejudicam o funcionamento normal do
oacutergatildeo e de estaacutedio III muito severas e irreversiacuteveis (adaptado de Poleksic amp Mitrovic-
Tutundzic 1994) (Tabela 1) O valor de IAH foi calculado para cada animal utilizando a
foacutermula IAH =10ordm sumI + 10ˡ sumII + 10sup2 sumIII sendo I II e III correspondentes agraves
alteraccedilotildees de estaacutedios I II e III respectivamente O valor meacutedio de IAH foi dividido em
cinco categorias que seguiu metodologia de Poleksic amp Mitrovic- Tutundzic (1994) 0-
10= funcionamento normal do tecido 11-20= dano leve a moderado do tecido 21-50=
dano moderado a severo do tecido 51-100= dano severo do tecido maior que 100=
dano irreparaacutevel do tecido Este iacutendice permitiu a comparaccedilatildeo da severidade das lesotildees
hepaacuteticas entre os peixes expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
Para as anaacutelises morfomeacutetricas foram realizadas mediccedilotildees dos diacircmetros de dez
nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos para cada animal As medidas foram obtidas por
meio do programa Image-Pro Plus traccedilando duas linhas perpendiculares respeitando-se
41
os limites do nuacutecleo e do citoplasma do hepatoacutecito em anaacutelise Aleacutem disso foram
quantificados pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleo de hepatoacutecito citoplasma de hepatoacutecito
capilares sinusoides e macroacutefagos em 10 campos utilizando-se gradiacutecula com 441
pontos de interseccedilatildeo com 100microm de lado e uma aacuterea de 10000micromsup2 totalizando 4410
pontosanimal para o caacutelculo da constituiccedilatildeo tecidual hepaacutetica
Tabela 1 Classificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histoloacutegicas do fiacutegado quanto ao estaacutegio de comprometimento das funccedilotildees teciduais (adaptado de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic 1994)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS HEPAacuteTICAS ESTAacuteDIO 1 Alteraccedilotildees nos hepatoacutecitos I Atrofia nuclear I Deformaccedilatildeo do contorno celular I Deformaccedilatildeo do contorno nuclear I Hipertorfia celular I Hipertorfia nuclear I Nuacutecleo na periferia da ceacutelula I Vacuolizaccedilatildeo citoplasmaacutetica I Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II Degeneraccedilatildeo nuclear II Nuacutecleo picnoacuteticos II Rompimento celular II 2 Alteraccedilotildees nos vasos sanguiacuteneos Hiperemia II Ruptura de vasos II 3 Necrose Necrose focal III
A quantidade de glicogecircnio nos hepatoacutecitos foi avaliada em toda extensatildeo da
lacircmina de forma semiquantitativa sendo evidenciada pela reaccedilatildeo histoquiacutemica de
Periodic Acid Schiff (PAS) seguida de contracoloraccedilatildeo com hematoxilina segundo
Michalany (1980) Para melhor compreensatildeo dos resultados as marcaccedilotildees foram
determinadas na seguinte escala 0- ausecircncia de glicogecircnio 1- pouco glicogecircnio 2-
quantidade moderada de glicogecircnio 3- muito glicogecircnio Apoacutes esta anaacutelise foi
calculada uma meacutedia do conteuacutedo de glicogecircnio dos hepatoacutecitos nos grupos controles e
grupos expostos ao toacutexico nas diferentes concentraccedilotildees
42
26 Iacutendice hepatossomaacutetico (IHS)
Para o caacutelculo do IHS foram registrados para cada exemplar os dados
biomeacutetricos de peso corporal (PC em g) e peso do fiacutegado (PF em g) Os valores meacutedios
e os desvios padratildeo do iacutendice hepatossomaacutetico (IHS=PFx100PC) foram calculados
para cada animal em cada um dos grupos nos diferentes experimentos nas diferentes
concentraccedilotildees
27 Anaacutelises estatiacutesticas
Os dados estatildeo apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo
Os dados foram avaliados pelo Software Statistica 70 por meio da anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) Apoacutes o teste de distribuiccedilatildeo normal os dados foram comparados
entre os grupos controle e grupos expostos ao Thiodanreg usando anaacutelise de variacircncia
one-way seguida pelo teste de Tukey ou Duncan Quando os dados natildeo apresentaram
uma distribuiccedilatildeo normal foi utilizado o teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Plt005 foi utilizado como criteacuterio de significacircncia
3 RESULTADOS
31 Determinaccedilatildeo da CL50-96h
Nas primeiras seis horas de experimento observou-se mortalidade de 100 de
peixes na concentraccedilatildeo de 96microgL-1 944 de mortalidade em 48microgL-1 733 de
mortalidade em 24microgL-1 266 de mortalidade em 12microgL-1 e 20 de mortalidade em
6microgL-1 sendo um total de 447 dos peixes que morreram nas diferentes
concentraccedilotildees do Thiodanreg nas primeiras seis horas Na concentraccedilatildeo de 3microgL-1
morreu apenas um peixe no final das 96 horas Foi observado 100 de mortalidade na
concentraccedilatildeo de 48microgL-1 em ateacute 12 horas de exposiccedilatildeo ao toacutexico As menores
mortalidades foram registradas nas concentraccedilotildees de Thiodanreg de 3microgL-1 e 6microgL-1
sendo respectivamente 944 e 80 de sobrevivecircncias A concentraccedilatildeo de 15microgL-1
de Thiodanreg e o grupo controle natildeo tiveram mortalidade A temperatura da aacutegua
apresentou variaccedilatildeo entre 220ordmC e 245 ordmC com meacutedia de 233plusmn072 ordmC
Os valores registrados determinaram CL50-96hs de 1367microgL-1para as fecircmeas de
A bimaculatus com intervalo de confianccedila de 101 a 184microgL-1 (Plt005)
43
32 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Durante a exposiccedilatildeo ao Thiodanreg por 96 horas foi observado comportamento
anormal dos peixes com nado erraacutetico tentativa de fuga dos aquaacuterios demonstraccedilatildeo de
agressividade com os demais peixes busca de oxigecircnio na superfiacutecie e respiraccedilatildeo
branquial acelerada Apoacutes 24 horas do iacutenicio os animais apresentavam comportamento
normal e procuravam pelo alimento Estas mudanccedilas comportamentais ocorreram em
todas as concentraccedilotildees do agrotoacutexico utilizadas com maior intensidade na concentraccedilatildeo
de 56microgL do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo cuja temperatura meacutedia
foi superior agrave dos demais experimentos (Tabela 2)
33 Morfologia e frequecircncia das alteraccedilotildees histoloacutegicas nos fiacutegados
Morfologicamente o fiacutegado dos lambaris apresentou hepatoacutecitos hexagonais
com citoplasma de aspecto granular e vacuolizado nuacutecleo arredondado central nucleacuteolo
evidente e presenccedila de hepatopacircncreas Os hepatoacutecitos estavam dispostos em cordotildees
margeando os sinusoides (Figura 1 A)
Os infiltrados leucocitaacuterios foram observados nos grupos controles e nos grupos
expostos ao Thiodanreg (Figura 1 B)
A vacuolizaccedilatildeo foi evidente nos hepatoacutecitos das fecircmeas analisadas (Figura 1 A)
No fiacutegado das fecircmeas do experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve a presenccedila caracteriacutestica de acuacutemulos de lipiacutedios nos
hepatoacutecitos com a presenccedila de vesiacuteculas claras grandes e envolvidas por glicogecircnio
marcado positivamente pela reaccedilatildeo de PAS (Figura 1 C) Aleacutem disso foram observados
nuacutecleos deslocados para a periferia celular No experimento sem aclimataccedilatildeosem
alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve reaccedilatildeo negativa pelo PAS no
citoplasma dos hepatoacutecitos (Figura 1 D)
As alteraccedilotildees de estaacutedio I como deformaccedilatildeo do contorno nuclear nuacutecleo na
periferia da ceacutelula atrofia nuclear desarranjo dos cordotildees hepaacuteticos hipertrofia celular
e nuclear (Figuras 1 E-G Figuras 2 A-B) foram observadas nos grupos controles e
naqueles expostos ao Thiodanreg sendo que nos grupos tratados houve maior frequecircncia
O deslocamento do nuacutecleo para a periferia do hepatoacutecito foi observado nas fecircmeas do
experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 56microgL-1
Quanto agraves alteraccedilotildees de estaacutedio II a degeneraccedilatildeo nuclear (Figura 2 C) foi
raramente presente na maioria das concentraccedilotildees nos diferentes experimentos A
degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica (Figura 2 D) foi pouco frequente em todos os experimentos
44
assim como a hiperemia (Figura 2 E) A presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos (Figura 2 F) foi
mais frequente no experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e no experimento
com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
Os VMAs variaram entre 125 e 228 nas fecircmeas analisadas sendo a menor
meacutedia observada nos grupos controles e as maiores nos grupos expostos ao Thiodanreg o
que mostra incidecircncia maior de alteraccedilotildees pontuais no fiacutegado nos animais dos grupos
tratados Os VMAs do fiacutegado na espeacutecie estudada foram superiores (Plt005) nos peixes
expostos ao agrotoacutexico quando comparado aos peixes dos grupos controles (Tabela 3)
O IAH das fecircmeas nos diferentes experimentos apresentaram valores superiores
(Plt005) nos grupos expostos ao Thiodanreg quando comparados como os grupos
controles (Tabela 4) com exceccedilatildeo do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 115microgL-1 de endosulfan que natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
34 Diacircmetro dos nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos
Os resultados demonstraram aumento (Plt005) no diacircmetro dos nuacutecleos de
hepatoacutecitos dos peixes expostos ao Thiodanreg nas concentraccedilotildees de 115microgL-1 e
23microgL-1 quando comparados ao grupo controle no experimento sem aclimataccedilatildeosem
alimentaccedilatildeo Por outro lado foi registrada diminuiccedilatildeo (Plt005) do diacircmetro dos nuacutecleos
de hepatoacutecitos no experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo quando comparados
aos peixes expostos ao Thiodanreg na concentraccedilatildeo 115 e 23microgL-1 em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Tabela 5)
O diacircmetro do citoplasma apresentou aumento no experimento sem
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e no experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo com
diferenccedila (Plt005) registrada entre os peixes do grupos controles e expostos ao
agrotoacutexico com exceccedilatildeo do experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 23microgL-1 (Tabela 6) Entretanto houve diminuiccedilatildeo nos citoplasmas de
hepatoacutecitos nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo ao grupos controles (Plt005)
nos experimentos sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e no experimento com
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Tabela 6)
35 Quantificaccedilatildeo de nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos macroacutefagos e capilares
sanguiacuteneos no tecido hepaacutetico
Nas contagens de pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleos de hepatoacutecitos (Tabela 7)
foram observadas quantidades superiores nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo
45
aos grupos controles (Plt005) Na quantificaccedilatildeo dos citoplasmas de hepatoacutecitos foram
registradas contagens inferiores (Plt005) nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo
aos grupos controles exceto no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Tabela
8)
Na contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre macroacutefagos natildeo houve aumento
significativo (Pgt005) nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo ao controle (Tabela
9) Em relaccedilatildeo agrave contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre capilares sinusoides a
contagem foi igual na maioria dos peixes expostos ao agrotoacutexico quando comparados
com os controles apresentando diferenccedila significativa (Plt005) entre os grupos
expostos do experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo nas concentraccedilotildees de 115 e
56microgL-1 (Tabela 10)
36 Quantificaccedilatildeo do glicogecircnio hepaacutetico
Em todos os grupos controles e tratados nos diferentes experimentos foram
registrados valores meacutedios para o glicogecircnio variando entre 010 e 300 No
experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo no grupo tratado da concentraccedilatildeo de
56microgL-1 de Thiodanreg foi registrada a menor meacutedia (Tabela 11) No entanto houve
diferenccedila (Plt005) do glicogecircnio hepaacutetico na concentraccedilatildeo de 56microgL quando
comparada com as concentraccedilotildees de 115 e 23microgL-1 (Tabela 11 e Figura 1 D)
37 Iacutendice hepatossomaacutetico
As fecircmeas dos grupos experimentais expostos ao Thiodanreg natildeo apresentaram
diferenccedilas (Pgt005) nos valores do IHS quando comparados com os grupos controles
(Tabelas 12) Entretanto houve diferenccedila (Plt005) do IHS na concentraccedilatildeo de 56microgL-1
quando comparada com as concentraccedilotildees de 115 e 23microgL-1 no experimento sem
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Tabela 12)
4 DISCUSSAtildeO
No presente estudo o lambari apesar de ser de pequeno porte apresentou uma
CL50 de 1367microgL-1 em 96 horas sendo mais resistente que adultos de tilaacutepia niloacutetica
Musanhi (1987) determinou a CL50 96 48 e 24 horas de exposiccedilatildeo ao endosulfan para
tilaacutepia niloacutetica adulta encontrando valores de 142 380 e 103 microgL-1 Nas primeiras 24
horas de accedilatildeo do Thiodanreg nas concentraccedilotildees subletais de 115 23 e 56microgL-1 as
fecircmeas do presente estudo apresentaram comportamentos alterados assim como foi
46
observado na espeacutecie Danio rerio exposta ao endosulfan por 96 horas na concentraccedilatildeo
de 24microgL-1 aleacutem desta espeacutecie ter apresentado uma diminuiccedilatildeo do niacutevel de
acetilcolinesterase (AChE) (Pereira et al 2012) Por outro lado em estudo realizado
por Hernan da Cuntildea et al (2011) com a espeacutecie Cichlasoma dimerus exposta ao
endosulfan por 96 horas nas concentraccedilotildees de 025 1 2 3 4 e 16microgL-1 os peixes
exibiram comportamento indicativo de neurotoxicidade mas natildeo foram encontradas
diferenccedilas na atividade da AChE Estes estudos fornecem evidecircncias adicionais de
efeitos deleteacuterios da exposiccedilatildeo ao endosulfan sobre o sistema nervoso o que contribui
para as observaccedilotildees obtidas no presente estudo
As descriccedilotildees histoloacutegicas hepaacuteticas nas fecircmeas do presente estudo foram
semelhantes ao que foi caracterizado em outros peixes onde os hepatoacutecitos organizam-
se em fileiras ou cordotildees duplos em formato de placas representando um sistema de
fundo-cego anastomosado e de tuacutebulos ramificados (Metcalfe 1998 Hinton et al
2001)
A histologia e a fisiologia do fiacutegado satildeo similares nos vertebrados Ferguson
(1989) e Gingerich (1982) descrevem que existem algumas diferenccedilas estruturais
marcadas no parecircnquima hepaacutetico de peixes em especial pela ausecircncia de lobulaccedilatildeo
espaccedilo porta claacutessico e ausecircncia de zonaccedilatildeo no parecircnquima hepaacutetico o que permite
fluxo lento de sangue nos sinusoides com penetraccedilatildeo diminuiacuteda de quiacutemicos nos
hepatoacutecitos
A presenccedila de porccedilotildees pancreaacuteticas dentro do fiacutegado do lambari eacute descrita na
literatura (Santos et al 2013) Uma das funccedilotildees das ceacutelulas pancreaacuteticas distribuiacutedas
pelo fiacutegado eacute a produccedilatildeo da enzima de biotransformaccedilatildeo citocromo P450 diferente do
que eacute observado para mamiacuteferos onde esta enzima eacute ausente (Hahn et al 1994
Stegeman 1991) A presenccedila de ceacutelulas pancreaacuteticas em estruturas do tecido hepaacutetico
de A bimaculatus sugere a provaacutevel funccedilatildeo dessas ceacutelulas em auxiliar na
desintoxicaccedilatildeo Outra importante estrutura na detoxificaccedilatildeo eacute a presenccedila das ceacutelulas dos
endoteacutelios capilares nas quais tem sido confirmada e identificada a presenccedila de enzimas
citocromo P450 por meio de teacutecnicas de imunomarcaccedilatildeo (Lorenzana et al 1986)
Sendo assim a integridade estrutural dos capilares permanece intacta e sem
comprometimento das possiacuteveis funccedilotildees celulares que estas estruturas podem
desempenhar no tecido hepaacutetico de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
A ausecircncia de estagnaccedilatildeo biliar nos fiacutegados das fecircmeas de A bimaculatus eacute um
fator importante de que o Thiodanreg natildeo interferiu na fisiologia de excreccedilatildeo biliar nos
47
diferentes experimentos Histopatologicamente este tipo de alteraccedilatildeo eacute observado nos
citoplasmas dos hepatoacutecitos com a presenccedila de gracircnulos castanho-amarelados Esta
alteraccedilatildeo consiste na manifestaccedilatildeo fisiopatoloacutegica de uma condiccedilatildeo causada pela falta
de metabolismo e excreccedilatildeo biliar (Pacheco amp Santos 2002) uma vez que a bile
sintetizada pelos hepatoacutecitos permanece no interior das ceacutelulas natildeo sendo liberada para
o tubo digestivo (Simonato et al 2008) Este tipo de alteraccedilatildeo pode ser encontrado em
peixes expostos a toacutexicos (Pacheco amp Santos 2002) e tambeacutem em peixes que
apresentam algum problema nutricional quando satildeo mantidos em cativeiros (Langiano
amp Martinez 2008) No entanto no presente estudo natildeo foram registradas essas
evidecircncias o que sugere que a alimentaccedilatildeo nos grupos tratados com raccedilatildeo comercial de
todos os experimentos natildeo interferiu nas funccedilotildees biliares
Os agregados macrofaacutegicos estatildeo relacionados agrave quebra de eritroacutecitos (Herraez
amp Zapata 1986) apresentaccedilatildeo de antiacutegeno (Ellis 1980) armazenamento de ferro e
detoxicaccedilatildeo de substacircncias endoacutegenas e exoacutegenas (Herraez amp Zapata 1986) Hartley et
al (1996) propuseram a utilizaccedilatildeo do agregado macrofaacutegico como biomarcador de
poluiccedilatildeo aquaacutetica a partir da quantificaccedilatildeo destas estruturas Existem alguns estudos
comparativos em diferentes espeacutecies que tecircm demonstrado variaccedilotildees no nuacutemero
tamanho e pigmentaccedilatildeo destas estruturas em relaccedilatildeo agrave idade nutriccedilatildeo e estado de sauacutede
(Blazer et al 1987 Ferguson 1989 Agius et al 2003) Nos agregados podem ser
observados pigmentos do tipo lipofuscina ceroide hemossiderina e melanina (Wolke
1992 Wolf amp Wolfe 2005) mas no presente estudo natildeo foram evidenciadas nenhuma
destas estruturas
No fiacutegado das fecircmeas do grupo experimental sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
na maior concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve a presenccedila caracteriacutestica de acuacutemulos de
lipiacutedios nos hepatoacutecitos de dois peixes No entanto existem vaacuterias condiccedilotildees de
acuacutemulos de lipiacutedios nos hepatoacutecitos associados com a exposiccedilatildeo aos toacutexicos
(Thiyagarajah et al 1985 Biagianti-Risbourg et al 1995 Lumbertdacha et al 1995
Handy et al 1999 Fanta et al 2003) Glover et al (2007) submeteram o peixe salmatildeo
do Atlacircntico a dieta de 4microgkg de endosulfan por 14 e 35 dias sendo observadas
evidecircncias de lipidoses nos hepatoacutecitos O aparecimento destas estruturas nas fecircmeas de
A bimaculatus foi insignificante nos tecidos hepaacuteticos mas foram contabilizadas como
respostas individuais sugerindo uma disfunccedilatildeo hepaacutetica causada pelo Thiodanreg que
pode comprometer a fisiologia hepaacutetica destas fecircmeas
48
No presente estudo as frequecircncias de alteraccedilotildees morfoloacutegicas indicam que a
accedilatildeo toacutexica do Thiodanreg provocou uma distribuiccedilatildeo de lesotildees de incidecircncia leve a
moderada no tecido hepaacutetico nos diferentes experimentos sendo que nas maiores
concentraccedilotildees do toacutexico houve mais incidecircncias de alteraccedilotildees As alteraccedilotildees observadas
nos fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas isto eacute natildeo apresentaram necrose sendo que
a maioria das alteraccedilotildees satildeo de estaacutedios I e II com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico
As alteraccedilotildees histoloacutegicas tecircm sido relatadas em peixes expostos a ambientes poluiacutedos
(Braunbeck et al 1990 Takashima et al 1995 Schwaiger et al 1997) Da mesma
forma a frequecircncia das alteraccedilotildees pode indicar disfunccedilotildees induzidas por agentes
toacutexicos uma vez que aacutereas metabolicamente ativas do fiacutegado ficam reduzidas levando a
uma possiacutevel reduccedilatildeo geral nas funccedilotildees desempenhadas por este oacutergatildeo (Hinton amp
Laureacuten 1990 Oliveira Ribeiro et al 2002 Pacheco amp Santos 2002 Langiano amp
Martinez 2008) Este resultado sugere que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees
hepaacuteticas mesmo em concentraccedilotildees muito baixas nos diferentes experimentos
independentemente do peixe estar sendo alimentado ou natildeo
As alteraccedilotildees dos diacircmetros de nuacutecleos de hepatoacutecitos podem ser consideradas
resposta ao agente estressor sendo indicativo da ativaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica em
decorrecircncia do aumento da atividade metaboacutelica contra as condiccedilotildees adversas (Stephen
et al 1993 Takashima amp Hibyia 1995 Langiano amp Martinez 2008) Por outro lado a
diminuiccedilatildeo nuclear pode estar relacionada possivelmente com a multiplicaccedilatildeo de
hepatoacutecitos na reposiccedilatildeo de ceacutelulas lesadas em funccedilatildeo da multiplicaccedilatildeo celular (Gul et
al 2004) No trabalho realizado por Oliveira Ribeiro et al (2002) observaccedilotildees
qualitativas por microscopia de luz demonstraram diminuiccedilatildeo no diacircmetro dos nuacutecleos
de hepatoacutecitos na espeacutecie A bimaculatus com alimentaccedilatildeo controlada associada agrave
exposiccedilatildeo ao toacutexico tributiltin Este tipo de alteraccedilatildeo eacute um indicativo de processo
degenerativo celular uma vez que inicia com a condensaccedilatildeo e reduccedilatildeo do diacircmetro do
nuacutecleo (Oliveira Ribeiro et al 2002) No presente estudo as alteraccedilotildees nos diacircmetros
de nuacutecleo de hepatoacutecitos demostraram que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees
hepaacuteticas das fecircmeas
A hipertrofia dos hepatoacutecitos tambeacutem pode ser causada por contaminantes
(Arnold et al 1985) por mudanccedilas estruturais do hepatoacutecito relacionadas ao
funcionamento da ceacutelula (Hinton et al 1992) condiccedilotildees fisioloacutegicas ligadas agrave
reproduccedilatildeo (Wester et al 2003) e pela maior atividade metaboacutelica (Takashima amp
Hibyia 1995) Portanto o aumento do diacircmetro citoplasmaacutetico nos experimentos sem
49
adaptaccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e no experimento com adaptaccedilatildeosem alimentaccedilatildeo mesmo
natildeo apresentando caracteriacutestica de hipertrofia morfoloacutegica evidente mas morfomeacutetrica
sugere indiacutecios de maior metabolizaccedilatildeo pelos hepatoacutecitos nestes grupos experimentais
As alteraccedilotildees dos diacircmetros de citoplasmas dos hepatoacutecitos nos experimentos
demonstraram que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees hepaacuteticas
Na quantificaccedilatildeo de nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos nos diferentes
experimentos foram observados indiacutecios de proliferaccedilatildeo de hepatoacutecitos que pode ser
indicativo da accedilatildeo toacutexica dos hepatoacutecitos contra detoxificaccedilatildeo do Thiodanreg assim como
observado no trabalho por Gul et al (2004) O percentual do tecido hepaacutetico ocupado
por ceacutelulas do tipo hepatoacutecito variou entre 8742 a 9088 na constituiccedilatildeo do
parecircnquima hepaacutetico de A bimaculatus Poucos trabalhos citam a constituiccedilatildeo celular
em fiacutegados de peixes sendo 845 a 873 de hepatoacutecitos ocupando o parecircnquima
hepaacutetico na truta (Hampton et al 1989) e 899 no peixe Golden (Rocha et al 1997)
Estes valores demonstram que a maior parte das ceacutelulas dos fiacutegados nas fecircmeas de A
bimaculatus satildeo hepatoacutecitos como descrito em outras espeacutecies de peixes
O aumento da quantidade de macroacutefagos na concentraccedilatildeo 115microgL-1 dos
experimentos foi superior quando comparado aos demais grupos sugerindo que essa
mobilizaccedilatildeo pode estar ajudando na detoxicaccedilatildeo do fiacutegado (Herraez et al 1986)
Assim a presenccedila de maior quantidade de macroacutefagos e sinusoides podem ser
consideradas indicadoras de estresse em peixes decorrentes da presenccedila de agentes
quiacutemicos (Anderson amp Zeeman 1995 Rabitto et al 2005) Essas ceacutelulas satildeo
observadas frequentemente nas regiotildees proacuteximas aos sinusoides e desprovidas de
pigmentaccedilatildeo Foram observados macroacutefagos em trutas Oncorhynchus mykiss e Salmo
trutta fario na proporccedilatildeo de 02 e 07 respectivamente (Hampton et al 1985
Rocha et al 1997) enquanto no presente estudo variou entre 021 a 029 Meseguer
et al (1994) observaram macroacutefagos livres abundantes no parecircnquima do fiacutegado
sugerindo que estes se movem livremente dentro do parecircnquima formando os
agregados macrofaacutegicos quando haacute um aumento na atividade fagociacutetica como resposta
imune a lesotildees em indiviacuteduos expostos a contaminantes Entretanto no presente estudo
natildeo foram observadas estas caracteriacutesticas
Ainda vale ressaltar que esse toacutexico potencializa sua accedilatildeo em temperaturas mais
elevadas como aquelas observadas no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo
Estudando o efeito dos ciclodienos Correa et al (2001) Coutinho et al (2005) e
Capkin et al (2006) relataram que as alteraccedilotildees satildeo diretamente proporcionais agrave
50
temperatura da aacutegua ou seja quanto mais alta a temperatura mais toacutexicos os produtos
se tornam O experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
56microgL-1 registrou temperatura meacutedia da aacutegua em 269ordmC superior aos demais
experimentos Devido a isso uma resposta comum na intoxicaccedilatildeo em fiacutegados de peixes
eacute a diminuiccedilatildeo das reservas de glicogecircnio hepaacutetico (Seinen et al 1981 Ferguson 1989
Cyrino et al 2000) e iacutendice hepatossomaacutetico (Wester et al 1987 Wester et al 1988
Wester et al 2003 Glover et al 2007) evidenciada no presente estudo
No presente estudo percebeu-se que a accedilatildeo do Thiodanreg em concentraccedilotildees
subletais natildeo afetou o fiacutegado como um todo mas na forma de focos no parecircnquima
hepaacutetico nos diferentes experimentos Este tipo de lesatildeo pode estar associado agrave
concentraccedilatildeo do toacutexico utilizado tempo de exposiccedilatildeo e a via de contaminaccedilatildeo A
ventilaccedilatildeo branquial acelerada e a natildeo procura por alimentos nas primeiras 24 horas
observadas nos diferentes experimentos sugere que a entrada de aacutegua pela via branquial
foi a causa mais direta da absorccedilatildeo e difusatildeo do toacutexico para corrente sanguiacutenea ateacute
chegar ao fiacutegado No entanto a via epideacutermica tambeacutem poder ser considerada via de
entrada do toacutexico para os tecidos (Mckim et al 1999)
As alteraccedilotildees observadas nos fiacutegados podem afetar diretamente o metabolismo
das fecircmeas causando diminuiccedilatildeo da capacidade fisica e tornar os peixes uma presa faacutecil
para seus predadores Neste sentido os peixes poderatildeo ter menor sucesso reprodutivo e
se tornarem menos competitivos pelo alimento Do ponto de vista ecoloacutegico isso pode
acarretar alteraccedilotildees na populaccedilatildeo e na cadeia alimentar (Rodrigues amp Fanta 1998)
Nas condiccedilotildees que o estudo foi realizado como as concentraccedilotildees do inseticida
Thiodanreg que foram utilizadas o periacuteodo de exposiccedilatildeo e a espeacutecie de estudo conclui-se
que as fecircmeas podem estar em um processo inicial de intoxicaccedilatildeo um processo
patoloacutegico de recuperaccedilatildeo reversiacutevel
51
Figura 1 A Organizaccedilatildeo histoloacutegica do tecido hepaacutetico normal de A bimaculatus B Infiltrado leucocitaacuterio (IL) no tecido hepaacutetico de A bimaculatus C Hepatoacutecito com vesiacutecula clara (Vc) envolvida por glicogecircnio (G) marcado positivamente pela reaccedilatildeo de PAS e nuacutecleo (seta) deslocado na periferia da ceacutelula no experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo 56microgL-1 D Hepatoacutecito com ausecircncia de glicogecircnio evidenciada pela reaccedilatildeo negativa de PAS no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo 56microgL-1 Alteraccedilotildees de estaacutedio I - E Hepatoacutecito com nuacutecleo (seta) na perifieria F Atrofia nuclear (an) G Deformaccedilatildeo nuclear (dn) Nuacutecleo (N) e citoplasma (C) do hepatoacutecito sinusoacuteide (S) capilar (P) com hemaacutecias no interior acuacutemulo de glicogecircnio (G) no citoplasma e macroacutefagos (M) Barras A (30) B (65 microm) C e D (20 microm) E F e G (28 microm) Coloraccedilatildeo Azul de toluiacutedina em A-B e E-G e PAS em C e D
G S G
N
C
M
M
an
F E
Vc
IL G
B
C
A
D
G
dn
N
C
G
52
Dn
A
E
B
F
Figura 2 Alteraccedilotildees histoloacutegicas do tecido hepaacutetico de A bimaculatus Alteraccedilotildees de estaacutedio I-A Hipertrofia celular (seta) B Hipertrofia nuclear (seta) Alteraccedilotildees de estaacutedio II - C Degeneraccedilatildeo nuclear (Dn) D Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica (Dc) E Hiperemia () F Presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos (setas) Barras A B e E (30 microm) C D e F (25 microm) Coloraccedilatildeo Azul de toluiacutedina
C
A
Dc
D
53
Tabela 2 Valores meacutedios das temperaturas durante a realizaccedilatildeo dos experimentos
Tratamento Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Experimento 4 Controle 268plusmn105 254plusmn049 248plusmn069 250plusmn049
115mgL-1 271plusmn104 256plusmn059 247plusmn045 245plusmn040 23mgL-1 269plusmn117 255plusmn048 244plusmn062 247plusmn043 56mgL-1 269plusmn118 254plusmn048 244plusmn063 247plusmn038
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Legenda Experimento 1 - sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo Experimento 2 - sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo Experimento 3 - com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo Experimento 4 ndash com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
Tabela 3 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquantitativa das alteraccedilotildees
histoloacutegicas (VMA) em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 130 plusmn 020a 210 plusmn 030b 215 plusmn 019b 216 plusmn 011b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 130 plusmn 012a 190 plusmn 020b 190 plusmn 008aᵇ 228 plusmn 056b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 125 plusmn 012a 210 plusmn 021b 206 plusmn 017b 218 plusmn 027b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 130 plusmn 014a 200 plusmn 025b 221 plusmn 035b 228 plusmn 021b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 4 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquantitativa dos iacutendices das
alteraccedilotildees histoloacutegicas (IAH) em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 883plusmn1034a 1850plusmn1009aᵇ 2883plusmn832b 2566plusmn550aᵇ
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 433plusmn557a 2883plusmn 810b 2780plusmn1388b 2766plusmn571b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 566plusmn 585a 2600plusmn773b 2550plusmn1078b 2733plusmn920b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 750plusmn512a 2217plusmn780b 2033plusmn875b 2366plusmn880b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Duncan
54
Tabela 5 Diacircmetro meacutedio (microm) de nuacutecleos de hepatoacutecitos em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 461 plusmn 040aᶜ 498 plusmn 020b 487 plusmn 028b 439 plusmn 027c
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 516 plusmn 071a 501plusmn 040a 502 plusmn 020a 515plusmn025a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 494 plusmn 019a 496 plusmn 036a 492 plusmn 082a 508 plusmn 033a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 561 plusmn 044aᶜ 524 plusmn 040b ᶜ 509 plusmn 028b 533 plusmn 019c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 6 Diacircmetro meacutedio (microm) de citoplasmas de hepatoacutecitos de fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 885 plusmn 099a 1022 plusmn 109b 974 plusmn 080b 1005plusmn129b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1084 plusmn 136a 987 plusmn 153b 975 plusmn 081b 931 plusmn 080b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 960 plusmn 095a 1022 plusmn 094b 1003plusmn120aᵇ 1033 plusmn 108b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1086plusmn130aᵇ 104 plusmn 135b ᶜ 1022 plusmn 138c 1022 plusmn 106c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 7 Quantificaccedilatildeo meacutedia de nuacutecleos de hepatoacutecitos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 2553 plusmn 494a 298 plusmn 464b 284 plusmn 459b 291 plusmn 374b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 2371 plusmn 490a 289 plusmn 541b 289 plusmn 545b 290 plusmn 514b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 2560 plusmn 538a 294 plusmn 480b 286 plusmn 555b 293 plusmn 552b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 2770 plusmn 594a 314 plusmn 1028b 347 plusmn 664b ᶜ 322 plusmn 654c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
55
Tabela 8 Quantificaccedilatildeo meacutedia de citoplasmas no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 39551 plusmn 1056a 39666 plusmn 877a 39360 plusmn 1526a 40080 plusmn 727a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 39996 plusmn 1307a 39830 plusmn 722a 39618 plusmn 1143ab 38865 plusmn 1954b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 39603 plusmn 1755a 39011 plusmn 1620b 39445 plusmn 1388aᵇ 39205 plusmn 2212aᵇ
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 39381 plusmn 3025a 38555 plusmn 2723b 39036 plusmn 2275aᵇ 39136 plusmn 1892b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Tabela 9 Quantificaccedilatildeo meacutedia de macroacutefagos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2
de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 120 plusmn 113a 125 plusmn 089a 101 plusmn 100a 106 plusmn 094a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 101 plusmn 101a 124 plusmn 079a 102 plusmn 084a 131 plusmn 092a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 098 plusmn 089a 128 plusmn 097a 115 plusmn 095a 096 plusmn 090a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 101 plusmn 094a 128 plusmn 109a 086 plusmn 079a 101 plusmn 079a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Tabela 10 Quantificaccedilatildeo meacutedia de vasos sanguiacuteneos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 1875 plusmn 239a 133 plusmn 346a 1796 plusmn 1210a 1103 plusmn 465a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1603 plusmn 784aᵇ 1260 plusmn 532a 1409 plusmn 631aᵇ 2203 plusmn 685b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 1830 plusmn 579a 2036 plusmn 773a 1681 plusmn 560a 1865 plusmn 964a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1850 plusmn 1400a 1831 plusmn 1326a 1510 plusmn 774a 1645 plusmn 739a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
56
Tabela 11 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquatitativa de glicogecircnio nos hepatoacutecitos de fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 133 plusmn 051aᵇ 266 plusmn 081a 300 plusmn 000a 010plusmn 010b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 133 plusmn 051a 180 plusmn 109a 200 plusmn 109a 233 plusmn 103a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 216 plusmn 098a 116 plusmn 040a 216 plusmn 098a 233 plusmn 103a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 266 plusmn 081a 233 plusmn 103a 233 plusmn 103a 216 plusmn 098a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis Tabela 12 Iacutendice hepatossomaacutetico de fecircmeas de lambaris A bimaculatus nos grupos
controles e grupos expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 070 plusmn 014aᵇ 088 plusmn 03a 084 plusmn 038a 038 plusmn 031b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 113 plusmn 054a 104 plusmn 061a 102 plusmn 050a 102 plusmn 051a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 066 plusmn 029a 073 plusmn 020a 092 plusmn 017a 091 plusmn 012a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 074 plusmn 034a 072 plusmn 029a 094 plusmn 040a 063 plusmn 018a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Duncan
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52 CAPIacuteTULO 2
EFEITOS DO INSETICIDA THIODAN reg SOBRE A MORFOLOGIA DO
DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM LAMBARIS Astyanax bimaculatus
RESUMO
O Thiodanreg eacute um toacutexico que pode causar alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos tecidos de peixes
expostos dependendo da concentraccedilatildeo A fim de investigar possiacuteveis alteraccedilotildees este
estudo avaliou a morfologia ovariana de lambaris Astyanax bimaculatus expostos ao
Thiodanreg (endosulfan 350gL) por 96 horas em quatro diferentes experimentos com trecircs
concentraccedilotildees subletais 115 23 e 56 microgL As fecircmeas expostas ao Thiodanreg foram
divididas em quatro experimentos sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem
aclimataccedilatildeo e alimentados com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e com
aclimataccedilatildeo de 10 dias e alimentados No presente estudo percebeu-se que a accedilatildeo do
Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou a morfologia do desenvolvimento
folicular Poreacutem os experimentos com aclimataccedilatildeo demonstraram quantidades
inferiores de foliacuteculos primaacuterios e secundaacuterios quando comparados aos peixes dos
experimentos sem aclimataccedilatildeo Houve maior quantidade de foliacuteculos atreacutesicos nos
grupos expostos ao Thiodanreg em relaccedilatildeo ao grupo controle O diacircmetro folicular nos
foliacuteculos secundaacuterios dos peixes expostos ao Thiodanreg no experimento com
adaptaccedilatildeocom alimentaccedilatildeo foi maior em relaccedilatildeo ao grupo controle Aleacutem disso as
meacutedias dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS) e hepatossomaacutetico (IHS) dos experimentos
com aclimataccedilatildeo foram inferiores aos experimentos sem aclimataccedilatildeo Esses dados
sugerem que o eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-ovaacuterio pode estar sendo afetado pelo ambiente
ao qual o peixe foi submetido podendo causar comprometimento na fisiologia do
desenvolvimento folicular
Palavras-chave histopatologia ovaacuterio peixe contaminaccedilatildeo aquaacutetica
63
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 α-endosulfan e 30 β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo
por meio da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em riscos os organismos que ali
residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al 2007)
Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos como jaacute
observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis niloticus
No entanto a Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan em
gordura valores de 005mgkg-1 (EPA 2002) e para aacutegua doce 022microgL-1 (EPA 1980)
A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em consideraccedilatildeo a
qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente Resoluccedilatildeo
CONAMA - nordm 3572005 estabelece o valor limite de 0056gL de resiacuteduo do referido
inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
Muitos inseticidas apresentam baixa toxicidade antes de serem transformados
em substacircncias toacutexicas metabolicamente ativas O sulfato de endosulfan eacute um dos
produtos derivados do metabolismo do endosulfan sendo considerado o principal
metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica por ser mais estaacutevel no meio
ambiente do que em sua foacutermula original (Ali et al 1984) A sensibilidade ao
endosulfan em organismos aquaacuteticos tem sido descrita na literatura (Capkin et al 2006
Ballesteros et al 2007 Pereira et al 2012) O produto eacute extremamente toacutexico para os
peixes e outros organismos aquaacuteticos mesmo em concentraccedilotildees muito pequenas
(Cengiz et al 2001) como verificado tambeacutem por Ballesteros et al (2007) com peixes
adultos da espeacutecie Jenynsia multidentata sob o efeito do endosulfan por 96 horas
utilizando concentraccedilotildees de 072 μgL e 131 μgL em machos e fecircmeas
respectivamente
Em peixes o desenvolvimento folicular tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Begovac amp Wallace 1988 Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter
1996 Grier 2000 2002 e 2007) e como nos animais em geral compreende os periacuteodos
preacute-meioacutetico perinucleolar vitelogecircnico e maturaccedilatildeo final Estas fases ocorrem no
64
interior de foliacuteculos cuja parede eacute constituiacuteda por zona radiata camada folicular
membrana basal e teca (Grier 2000) e que desempenham importante papel durante a
ovogecircnese e fertilizaccedilatildeo Quando a qualidade da aacutegua eacute alterada devido a xenobioacuteticos
a gametogecircnese pode ser alterada comprometendo a fertilizaccedilatildeo e a qualidade do ovo
(Chatterjee et al 1997) Assim os peixes quando expostos a inseticidas podem
apresentar alteraccedilotildees morfoloacutegicas significativas no ovaacuterio
Alguns trabalhos mostram diversas alteraccedilotildees provocadas nos foliacuteculos por
contaminantes como por exemplo retraccedilatildeo citoplasmaacutetica degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica
adesatildeo folicular aparecimento de foliacuteculos anucleados necrose e alteraccedilatildeo no diacircmetro
dos foliacuteculos (Hazarika amp Das 1998 Dutta et al 2003 Maxwell amp Dutta 2005) Aleacutem
disso pode ocorrer a atresia folicular que eacute um processo frequentemente observado nos
ovaacuterios dos vertebrados (Saidapur 1978) sendo causada por diversos fatores como
agrotoacutexicos temperatura luz alimentaccedilatildeo inadequada e confinamento (Nagahama
1983 Guraya 1986) Outro fator importante eacute a concentraccedilatildeo hormonal que pode
interferir na siacutentese de vitelogenina e causar efeitos negativos associados com a
quantidade de foliacuteculos preacute-vitelogecircnicos e vitelogecircnicos durante o desenvolvimento
folicular (Chatterjee et al 1997) No entanto alteraccedilotildees no estado de sauacutede provocadas
por concentraccedilotildees de contaminamtes que natildeo matam os peixes em curto prazo e que
podem ser consideradas seguras podem sugerir consequecircncias na reproduccedilatildeo e
interferecircncia na cadeia alimentar Esse tipo de estudo eacute de grande importacircncia para se
avaliar impactos provocados por diferentes tratamentos sobre o desenvolvimento de
foliacuteculos que poderiam interferir na reproduccedilatildeo de peixes
O lambari Astyanax bimaculatus foi escolhido como organismo experimental
pois eacute representativo no ecossistema sendo encontrado desde Nordeste brasileiro ateacute a
bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Eacute um peixe de pequeno porte e
de faacutecil manutenccedilatildeo em laboratoacuterio
Este estudo teve como objetivo analisar as alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos
diferentes estaacutedios do desenvolvimento folicular em ensaios subletais com o toacutexico
Thiodanreg
65
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste subletal e as atividades de coleta As etapas
de fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos ovaacuterios microtomia coloraccedilatildeo de lacircminas
histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e morfomeacutetricas foram realizadas nos
Laboratoacuterios de Biologia de Peixes e de Histopatologia do Departamento de Veterinaacuteria
da UFV
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos animais em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado e poro genital
dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV e
mantidos em aquaacuterios com capacidade de 50 litros numa densidade de 05g de peixe por
litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro temperatura controlada e monitoramento
duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e
aeraccedilatildeo continua de aacutegua para garantir o bem-estar dos peixes Os peixes foram
alimentados com raccedilatildeo comercial Purina contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia
de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
66
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste de toxicidade subletal em sistema estaacutetico
O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi realizado utilizando-se 120
lambaris tendo por base as normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico (NBR 15088
- ABNT 2007)
As fecircmeas foram expostas ao Thiodanreg (endosulfan 350gL) por 96 horas em
quatro diferentes experimentos sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem aclimataccedilatildeo e
com alimentaccedilatildeo com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e com aclimataccedilatildeo de
10 dias e com alimentaccedilatildeo Foram utilizadas trecircs concentraccedilotildees do Thiodanreg inferiores
agrave CL50 preacute-determinada (137microgL) em laboratoacuterio de acordo com a NBR 15088
(ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas em cada experimento foram de 115 23 e
56microgL-1 aleacutem de um grupo controle sem toacutexico com trecircs repeticcedilotildees nas mesmas
condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
24 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas
Apoacutes 96 horas de experimento foram coletados 96 peixes sendo seis animais de
cada grupo nos diferentes experimentos Os ovaacuterios foram coletados apoacutes os peixes
terem sido anestesiados com benzocaiacutena (110000) e eutanasiados pela secccedilatildeo
transversal da coluna vertebral na regiatildeo do opeacuterculo
Para a histologia os ovaacuterios foram fixados em paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo
fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedos em resina glicolmetacrilato (Leica
Historesin) Em seguida secccedilotildees 3microm de espessura foram coradas utilizando
hematoxilinaeosina para anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas As lacircminas foram
montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e
as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
Para os estudos morfoloacutegicos foram analisadas lacircminas de seis animais por
concentraccedilatildeo As secccedilotildees histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo em busca
de alteraccedilotildees morfoloacutegicas foliculares (Tabela 1) que pudessem ser representativas da
67
accedilatildeo do Thiodanreg no tecido ovariano sempre comparando estas alteraccedilotildees com o
padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios das lacircminas dos grupos controles
Para a avaliaccedilatildeo morfomeacutetrica foram realizadas contagens dos diferentes
estaacutedios de desenvolvimento folicular Para isto foram fotografados ao acaso 10
campos com objetiva de 10X (cada campo com 5094 microm de largura por 6812 microm de
comprimento totalizando uma aacuterea de 347 mmsup2) As contagens foram realizadas em 10
campos escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro experimentos Aleacutem disso foi
realizada a contagem de foliacuteculos atreacutesicos e observados eosinoacutefilos associados aos
foliacuteculos vitelogecircnicos utilizando o microscoacutepio com objetiva de 40X em 10 foliacuteculos
escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro tratamentos experimentais Tambeacutem
foram realizadas mediccedilotildees de diacircmetros em 10 foliacuteculos vitelogecircnicos para cada animal
Foram escolhidos foliacuteculos o mais esfeacutericos possiacutevel com corte passando pelo nuacutecleo
Estas medidas foram obtidas por meio do programa Image-Pro Plus traccedilando-se duas
linhas perpendiculares sobre nuacutecleo e respeitando-se os limites do foliacuteculo Em todas as
contagens e mediccedilotildees foram calculados os valores meacutedios e desvios-padratildeo para cada
concentraccedilatildeo para se avaliar o desenvolvimento folicular nos diferentes experimentos
Tabela 1 Alteraccedilotildees histoloacutegicas quanto ao comprometimento do desenvolvimento folicular (adaptado de Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS FOLICULARES Alteraccedilatildeo nos foliacuteculos Descolamento do revestimento folicular Retraccedilatildeo citoplasmaacutetica Retraccedilatildeo nuclear Atresia folicular Aglutinaccedilatildeo nucleoplasmaacutetica Aglutinaccedilatildeo citoplasmaacutetica Aglutinaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo Foliacuteculos com ausecircncia de citoplasma e nuacutecleo Granuloacutecitos envolvendo foliculos
25 Paracircmetros biomeacutetricos
Foram registrados para cada exemplar os seguintes dados biomeacutetricos peso
corporal (PC em g) peso dos ovaacuterios (PO em g) e peso do fiacutegado (PF em g) Os
valores meacutedios e os desvios padratildeo dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS=POx100PC) e
68
hepatossomaacutetico (IHS=PFx100PC) foram calculados para cada animal em cada um
dos grupos nos diferentes experimentos
26 Anaacutelises estatiacutesticas
Os dados foram apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo e avaliados pelo
Software Statistica 70 por meio da anaacutelise de variacircncia (ANOVA) Apoacutes o teste de
distribuiccedilatildeo normal os dados foram comparados entres os grupos controle e grupos
expostos ao Thiodanreg usando anaacutelise de variacircncia one-way seguida do teste de Tukey
ou Duncan Quando os dados natildeo apresentaram uma distribuiccedilatildeo normal foi utilizado o
teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis Plt005 foi utilizado como criteacuterio de
significacircncia
3 RESULTADOS
31 Desenvolvimento folicular
O desenvolvimento folicular de A bimaculatus do presente estudo foi dividido em
duas etapas desenvolvimento primaacuterio e desenvolvimento secundaacuterio
Para facilitar a compreensatildeo o desenvolvimento primaacuterio em A bimaculatus foi
subdividido em dois estaacutedios desenvolvimento primaacuterio inicial e desenvolvimento
primaacuterio avanccedilado (Figuras 1 A e B) No desenvolvimento primaacuterio inicial os foliacuteculos
apresentaram citoplasma fortemente basoacutefilo nuacutecleo esfeacuterico um ou mais nucleacuteolos
dispersos pelo nucleoplasma e estavam envoltos por ceacutelulas foliculares pavimentosas
(Figura 1 A) Durante o desenvolvimento primaacuterio avanccedilado o citoplasma do foliacuteculo
torna-se menos basoacutefilo que a etapa anterior o nuacutecleo eacute esfeacuterico um ou mais nucleacuteolos
dispersos que estatildeo associados ao envoltoacuterio nuclear (Figura 1 B) A camada de ceacutelulas
foliculares eacute pavimentosa com o nuacutecleo alongado Entre as ceacutelulas foliculares e o
citoplasma do foliacuteculo aparece a zona radiata como uma fina camada (Figura 1 B) Na
regiatildeo mais externa do foliacuteculo aparecem associadas ao mesmo as ceacutelulas da teca
O desenvolvimento secundaacuterio em A bimaculatus foi subdividido em trecircs
estaacutedios desenvolvimento secundaacuterio inicial desenvolvimento intermediaacuterio e
desenvolvimento avanccedilado No desenvolvimento secundaacuterio inicial o volume
citoplasmaacutetico aumentou mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo e o foliacuteculo neste estaacutedio
apresentou um diacircmetro maior que o estaacutedio anterior O nuacutecleo eacute central ligeiramente
acidoacutefilo com nucleacuteolos pequenos e dispersos pelo nucleoplasma O citoplasma eacute
69
granular e fracamente basoacutefilo com a presenccedila de vesiacuteculas corticais pequenas e claras
na periferia do citoplasma (Figura 1 C) Em seguida ocorre um aumento no diacircmetro do
foliacuteculo e inicia-se a deposiccedilatildeo de vitelo a partir da regiatildeo perifeacuterica o que permitiu
classificar esse estaacutedio como desenvolvimento secundaacuterio intermediaacuterio (Figura 1 D)
No estaacutedio de desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado o volume citoplasmaacutetico
aumentou mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo tendo o foliacuteculo neste estaacutedio um diacircmetro maior
quando comparado aos estaacutedios anteriores Nessa etapa do desenvolvimento o
citoplasma do foliacuteculo estaacute preenchido com gloacutebulos de vitelo (Figura 1 D) A
maturaccedilatildeo final eacute caracterizada pela formaccedilatildeo do aparelho micropilar zona radiata
espessa e nuacutecleo deslocado em direccedilatildeo ao aparelho micropilar
Os foliacuteculos ovarianos dos lambaris apresentaram morfologia normal nas
diferentes concentraccedilotildees de Thiodanreg (Figuras 1 A-D)
32 Atresia folicular
A atresia folicular foi caracterizada em trecircs diferentes etapas nos ovaacuterios de A
bimaculatus atresia inicial intermediaacuteria e avanccedilada A atresia folicular inicial eacute
caracterizada pela descontinuidade da zona radiata e hipertrofia das ceacutelulas foliculares
(Figura 2 A) Nesse momento da atresia folicular foram evidenciadas ceacutelulas do tipo
granuloacutecito entre a membrana basal e ceacutelulas da teca na maioria dos foliacuteculos
observados (Figura 2 B) Na sequecircncia do processo atresia folicular intermediaacuteria
ocorre o iniacutecio da fusatildeo e liquefaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo desintegraccedilatildeo e
fragmentaccedilatildeo da zona radiata hipertrofia das ceacutelulas foliculares que se tornam
vacuolizadas e contecircm material granular de aspecto similar aos gloacutebulos de vitelo e
invasatildeo do citoplasma pelas ceacutelulas foliculares (Figura 2 C) Na atresia avanccedilada as
ceacutelulas foliculares absorvem os resiacuteduos finais do foliacuteculo levando a uma diminuiccedilatildeo
do tamanho do foliacuteculo atreacutesico (Figura 2 D)
33 Quantificaccedilatildeo dos foliacuteculos ovarianos
A quantidade de foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio inicial entre as fecircmeas
do mesmo experimento natildeo mostrou diferenccedilas entre si (Pgt005) (Figura 3) Quando
foram comparados os diferentes experimentos nos mesmos grupos foi registrada maior
quantidade de foliacuteculos primaacuterios iniciais nas fecircmeas do grupo controle do experimento
com aclimataccedilatildeoalimentaccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo agraves fecircmeas dos grupos controle dos
70
experimentos sem aclimataccedilatildeo (Figura 3) Aleacutem disso foi observada maior quantidade
de foliacuteculos primaacuterios iniciais na concentraccedilatildeo de 23microgL do experimento com
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo em relaccedilatildeo ao experimento sem aclimataccedilatildeocom
alimentaccedilatildeo (Plt005) (Figura 3)
Na contagem de foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado entre fecircmeas
do mesmo experimento natildeo houve diferenccedilas nas meacutedias obtidas (Figura 4) No entanto
quando comparados os mesmos grupos entre os diferentes experimentos verificou-se
que no estaacutedio de desenvolvimento primaacuterio avanccedilado houve maior quantidade de
foliacuteculos no grupo controle do experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Plt005)
em relaccedilatildeo ao experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo assim como no
experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Figura 4) Quando comparados os
grupos da concentraccedilatildeo 115microgL registrou-se maior quantidade de foliacuteculos no
experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo ao experimento
sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Figura 4) Entre as fecircmeas dos grupos da
concentraccedilatildeo 23microgL foi registrada maior quantidade de foliacuteculos nos experimentos
com aclimataccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo agraves fecircmeas dos experimentos sem aclimataccedilatildeo
(Figura 4)
Na contagem de foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio inicial nas fecircmeas do
experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo houve maior quantidade de foliacuteculos na
concentraccedilatildeo 56microgL (Plt005) em relaccedilatildeo agrave concentraccedilatildeo de 115microgL (Figura 5) mas
natildeo com o controle Ao comparar as fecircmeas dos diferentes experimentos dos mesmos
grupos houve maior quantidade de foliacuteculos secundaacuterios iniciais (Plt005) na
concentraccedilatildeo 115microgL do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e
experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo em relaccedilatildeo ao experimento sem
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Figura
5)
Em relaccedilatildeo as contagens de foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio
intermediaacuterio e avanccedilado natildeo houve diferenccedilas entre as fecircmeas (Pgt005) (Figuras 6 e 7)
34 Quantificaccedilatildeo dos foliacuteculos atreacutesicos
Nas contagens de foliacuteculos atreacutesicos iniciais nas fecircmeas de A bimaculatus dos
diferentes experimentos natildeo foram constatadas diferenccedilas (Pgt005) (Figura 8) As
contagens de atresia total representaram as somas das contagens de atresias inicial
intermediaacuteria e avanccedilada As contagens de atresia total natildeo mostraram diferenccedilas nos
71
experimentos embora o nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos mostrasse tendecircncia crescente
nos grupos tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos (Figura 9) Entretanto
foi observado maior nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos nas fecircmeas dos experimentos com
aclimataccedilatildeo de 10 dias em relaccedilatildeo aos experimentos sem aclimataccedilatildeo (Figura 9)
35 Diacircmetro dos foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado
Os valores meacutedios nos diacircmetros dos foliacuteculos secundaacuterio avanccedilado nas fecircmeas
do experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo demonstraram aumento (Plt005) nas
concentraccedilotildees 115microgL (57837plusmn5977microm) e 56microgL (57311plusmn6178microm) de Thiodanreg
em relaccedilatildeo agraves fecircmeas do grupo controle (51606plusmn5757 microm) Nos demais experimentos
natildeo foram registradas diferenccedilas entre os foliacuteculos (Pgt005) apesar de ter sido
observado na maioria dos grupos essa mesma tendecircncia de aumento do diacircmetro dos
foliacuteculos (Tabela 2)
36 Paracircmetros biomeacutetricos
As fecircmeas de A bimaculatus dos grupos expostos ao Thiodanreg natildeo apresentaram
diferenccedilas (Pgt005) nos valores dos IGS e IHS quando comparados com os grupos
controles (Tabelas 3 e 4) No entanto as fecircmeas dos experimentos com aclimataccedilatildeo
apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores dos IGS e IHS quando comparados aos
experimentos sem aclimataccedilatildeo (Tabelas 3 e 4)
4 DISCUSSAtildeO
Em peixes teleoacutesteos o tipo de desenvolvimento folicular pode ser assincrocircnico
com a presenccedila de foliacuteculos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento (Nagahama
1983 Connaughton et al 1998 Selman et al 1986) assim como na presente espeacutecie
deste estudo Os ovaacuterios das fecircmeas de A bimaculatus submetidas ao efeito do
Thiodanreg apresentaram foliacuteculos ovarianos em diferentes fases de desenvolvimento com
variaccedilotildees na estrutura do foliacuteculo como diacircmetro caracteriacutesticas do nuacutecleo camadas
envoltoacuterias composiccedilatildeo e distribuiccedilatildeo do vitelo conforme observado em outras
espeacutecies do gecircnero (Miranda 1996 Miranda et al 1999 Melo et al 2005 Mazzoni et
al 2005 Rodrigues et al 2005 Hernan Da Cuntildea et al 2011)
Ao contraacuterio do presente estudo Dutta et al (2008) ao submeterem as fecircmeas da
espeacutecie Lepomis macrochirus a trecircs concentraccedilotildees diferentes (025 075 e 1 microgL) de
endosulfan observaram comprometimento do desenvolvimento folicular com retraccedilatildeo
72
nuclear e citoplasmaacutetica na menor concentraccedilatildeo enquanto nos foliacuteculos em maturaccedilatildeo
avanccedilada foi observado um aspecto vazio sem conteuacutedo citoplasmaacutetico na
concentraccedilatildeo de 075 microgL Aleacutem disso na concentraccedilatildeo de 1microgL os autores
encontraram maior grau de deformaccedilotildees com foliacuteculos vazios sem a presenccedila de
foliacuteculos ou alteraccedilotildees do nuacutecleo e perda do material nuclear que eacute relatado como
necrose nuclear No trabalho conduzido por Chartterjee et al (1997) foi avaliada a accedilatildeo
do carbofuram no desenvolvimento folicular na espeacutecie Heteropneustes fossilis
encontrando-se degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica e na camada folicular de foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio Entretanto Hernan Da Cuntildea et al (2011) natildeo
observaram alteraccedilotildees nos ovaacuterios em peixes expostos ao endosulfan No estudo
realizado por Ballesteros et al (2007) utilizando peixes machos e fecircmeas da espeacutecie
Jenynsia multidentata foi verificado que o maior teor de lipiacutedeos nas fecircmeas eacute um fator
importante para esclarecer a maior resistecircncia contra o endosulfan ao contraacuterio dos
machos que satildeo mais suceptiacuteveis neste caso De acordo com este resultado descrito na
literatura pode-se inferir que este fator poder ter interferido na maior resistecircncia das
fecircmeas de A bimaculatus em periacuteodo reprodutivo agraves concentraccedilotildees de Thiodanreg
testadas
Alguns estudos tecircm esclarecido a interferecircncia de poluentes na quantidade de
foliacuteculos nos diferentes estaacutedios do desenvolvimento folicular em peixes Os trabalhos
de Chartterjee et al (1997) Jensen et al (2004) Dutta amp Dalal (2008) e Chakrabarty et
al (2012) avaliaram os efeitos de pesticidas encontrando maior quantidade de foliacuteculos
primaacuterios no grupo tratado em relaccedilatildeo ao grupo controle assim como em peixes
mantidos em cativeiros (Honji et al 2009) Em outro estudo (Chatterjee et al 2001) os
pesquisadores encontraram por meio de anaacutelises histoloacutegicas da hipoacutefise a
possibilidade do carbofuran afetar as ceacutelulas produtoras de GnRH do hipotaacutelamo
prejudicando o eixo hipoacutefise-gocircnada e comprometendo a viabilidade no
desenvolvimento folicular jaacute Chakrabarty et al (2012) verificaram em peixes tratados
com endosulfan concentraccedilatildeo inferior de GnRH e superior da aromatase quando
comparados com o gurupo controle caracterizando que o endosulfan pode atuar como
disruptor endoacutecrino (Lemaire et al 2006) que pode aumentar a biossiacutentese do estradiol
para promover um raacutepido desenvolvimento folicular (Chakrabarty et al 2012) Estes
resultados podem ajudar a esclarecer os resultados do presente trabalho onde se
observou maior quantidade de foliacuteculos primaacuterios iniciais e primaacuterios avanccedilados nos
experimentos com aclimataccedilatildeo quando comparados com os experimentos sem
73
aclimataccedilatildeo sugerindo uma possiacutevel desregulaccedilatildeo endoacutecrina no eixo hipoacutefise-gocircnada
nos peixes aclimatados em aquaacuterios por 10 dias Aleacutem disso as concetraccedilotildees hormonais
e enzimaacuteticas relacionadas ao desenvolvimento folicular podem estar supostamente
alteradas em A bimaculatus mas satildeo necessaacuterios estudos fisioloacutegicos para essa
provaacutevel confirmaccedilatildeo
O processo de atresia folicular no lambari A bimaculatus foi semelhante ao
descrito por Miranda et al (1999) Munoz et al (2002) Melo et al (2005) e Santos et
al (2005) O processo da atresia que ocorre nos foliacuteculos secundaacuterios eacute do tipo
hipertroacutefico devido agrave hipertrofia e hiperplasia das ceacutelulas foliculares (Vizziano amp
Berois 1990) No trabalho realizado por Coward amp Bromage (1998) na espeacutecie Tilapia
zilli foi verificado aumento de foliacuteculos atreacutesicos em experimento com duraccedilatildeo entre 18
e 26 dias assim como verificado no trabalho de Jensen et al (2004) quando utilizaram a
substacircncia flutamida De acordo com estes autores isto pode reduzir a fecundidade e
tambeacutem influenciar na qualidade do foliacuteculo Linares-Casenave et al (2002) explicam
que o processo de atresia estaacute associado com desregulaccedilatildeo das concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de estradiol testosterona e vitelogenina Portanto o aumento da quantidade
dos foliacuteculos atreacutesicos nos grupos expostos ao Thiodanreg e a maior quantidade de atresia
nos experimentos com aclimataccedilatildeo mesmo natildeo apresentando diferenccedilas estatiacutesticas
sugerem que pode estar iniciando desregulaccedilatildeo hormonal nestes peixes
A presenccedila de granuloacutecitos associados aos foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados em
lambari A bimaculatus nos diferentes experimentos pode ser associada agrave reaccedilatildeo
imunoloacutegica em conjunto com as ceacutelulas foliculares assim como observado por alguns
autores (Drummond et al 2000 Santos et al 2005 Santos et al 2008) Aleacutem disso no
trabalho realizado por Santos et al (2008) foi detectada a presenccedila de proliferaccedilatildeo
celular (PCNA) nas ceacutelulas da teca de foliacuteculos em processo de atresia confirmando
que estas ceacutelulas podem estar se preparando para o processo de remodelaccedilatildeo ovariana
No entanto essas evidecircncias de granuloacutecitos associados aos foliacuteculos estatildeo de acordo
com o que jaacute foi observado em outros trabalhos caracterizando um processo fisioloacutegico
importante na regressatildeo folicular das fecircmeas de A bimaculatus expostas ao Thiodanreg
O diacircmetro dos foliacuteculos vitelogecircnicos eacute espeacutecie-especiacutefico poreacutem o Thiodanreg
alterou o diacircmetro folicular no experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo Esta
alteraccedilatildeo do diacircmetro que leva os foliacuteculos vitelogecircnicos a atingirem a maturaccedilatildeo pode
ser causada pelas diferenccedilas nas concentraccedilotildees de vitelogenina estradiol e aromatase
(Jensen et al 2004 Corriero et al 2007 Chakrabarty et al 2012) ou a mesma sendo
74
ligada aos receptores especiacuteficos nos foliacuteculos (Patintildeo amp Sullivan 2002 Bugel et al
2010) Bugel et al (2010) relataram a diminuiccedilatildeo da expressatildeo da vitelogenina no peixe
Fundulus heteroclitus em rio contaminado com pesticidas orgacircnicos persistentes o que
resultou na diminuiccedilatildeo da quantidade de foliacuteculos vitelogecircnicos enquanto Honji et al
(2009) relataram a baixa fecundidade e aumento do diacircmetro dos foliacuteculos nos peixes
Salminus hilari mantidos em cativeiro quando comparados com peixes de ambientes
naturais Contudo eacute necessaacuterio estudar as vias que conduzem a esta alteraccedilatildeo Estes
resultados mostram que diferentes vias podem afetar a reproduccedilatildeo dos peixes e que o
Thiodanreg pode estar agindo como desregulador endoacutecrino nos foliacuteculos secundaacuterios
avanccedilados de A bimaculatus
O IGS e IHS podem variar entre os peixes devido agraves diferenccedilas na sensibilidade
frente agrave exposiccedilatildeo a contaminantes periacuteodo reprodutivo e peixes mantidos em cativeiro
(Chatterjee et al 1997 Cyrino et al 2000 Jensen et al 2004 Honji et al 2009) No
entanto o fato das meacutedias dos IGS e IHS nos experimentos com aclimataccedilatildeo terem sido
menores quando comparadas com os experimentos sem aclimataccedilatildeo sugere associaccedilatildeo
entre quantidade inferior de foliacuteculos secundaacuterios e quantidade superior de atresia nos
experimentos com aclimataccedilatildeo assim como no trabalho de Chatterjee et al (1997) e
Bugel et al (2010) que verificaram diminuiccedilatildeo na taxa de foliacuteculos vitelogecircnicos e
IGS
A ventilaccedilatildeo branquial acelerada e a natildeo procura por alimentos nas primeiras 24
horas observadas nos diferentes experimentos sugere que a entrada de aacutegua pela via
branquial foi causa direta da absorccedilatildeo e difusatildeo do toacutexico no organismo No entanto a
via epideacutermica tambeacutem poder ser considerada via de entrada do toacutexico para os tecidos
(Mckim et al 1999) Portanto a exposiccedilatildeo dos peixes ao Thiodanreg e a aclimataccedilatildeo
foram fatores mais que afetaram o diacircmetro e a quantidade de foliacuteculos em A
bimaculatus Conforme as condiccedilotildees em que o estudo foi realizado levando-se em
consideraccedilatildeo as concentraccedilotildees do inseticida Thiodanreg utilizadas periacuteodo de exposiccedilatildeo e
espeacutecie de estudo demonstram que as fecircmeas analisadas podem estar em processo
inicial de intoxicaccedilatildeo com possiacutevel alteraccedilatildeo fisioloacutegica
75
A
opa
opi opa
vs
D
osint
osa
osa
gv gv
gv
osi
C
B
opa
opa
zr
vc
Figura 1 Desenvolvimento folicular ovariano de Astyanax bimaculatus A Estroma ovariano com foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio inicial (opi) e primaacuterio avanccedilado (opa) B Foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (opa) com ceacutelulas foliculares pavimentosas e zona radiata delgada (zr) C Foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio inicial (osi) possuindo ceacutelulas foliculares pavimentosas com zona radiata espessa (zr) e vesiacuteculas corticais claras (vc) na periferia do foliacuteculo D Foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio intermediaacuterio iniciando deposiccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo (osint) e foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (osa) com gloacutebulos de vitelo (gv) por todo o citoplasma vs vaso sanguiacuteneo Coloraccedilatildeo Hematoxilina-eosina Barra A e B (50 m) C (30 m) D (100 m)
zr
76
ai
gr gr
zr
h
av
A
ait
Figura 2 Foliacuteculos ovarianos de Astyanax bimaculatus em atresia A Atresia folicular inicial (ai) caracterizada pela quebra da zona radiata (zr) hipertrofia de ceacutelulas foliculares (cf) e presenccedila de granuloacutecitos (gr) B Detalhe de granuloacutecito (gr) sobre a regiatildeo de ceacutelulas foliculares C Atresia folicular intermediaacuteria (ait) caracterizada pela liquefaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo (gv) desintegraccedilatildeo da zona radiata e invasatildeo do citoplasma pelas ceacutelulas foliculares D Atresia folicular avanccedilada (av) caracterizada pela ausecircncia de gloacutebulos de vitelo Ceacutelulas da teca (t) hemaacutecias (h) Coloraccedilatildeo Hematoxilina-eosina Barra A (25 m) B (10 m) C (150 m) D (100 m)
gv
ai
B
C D
t
gv
77
Figura 3 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos primaacuterios iniciais por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e expostos ao Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dentro dos grupos (Plt005) pelo teste de Duncan Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
0
5
10
15
20
25
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
A A
AB
B
AB
A
AB
B
0
1
2
3
4
5
6
7
8
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 4 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos primaacuterios avanccedilados por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dentro dos grupos (Plt005) pelo teste de Duncan Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
A
BC AC
BD
AC
BC
AB A A
B
B
A
78
0
02
04
06
08
1
12
14
16
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedilas entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dos grupos com as mesmas concentraccedilotildees nos diferentes experimentos (Plt005) ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) Teste de Duncan
A
B
A
B
ab b
a ab
Figura 5 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios iniciais por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e d
e o
voacuteci
tos Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 6 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Plt005) pelo teste de Duncan
79
0
05
1
15
2
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3
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4
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 7 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Duncan
Figura 8 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos atreacutesicos iniciais em ovaacuterios de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Kruskall Wallis
0
005
01
015
02
025
03
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e a
tre
sia
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
80
Figura 9 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos atreacutesicos totais em ovaacuterios de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
0
005
01
015
02
025
03
035
04
045
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e a
tre
sia
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Kruskall Wallis
81
Tabela 2 Diacircmetro meacutedio (microm) de foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados de lambaris A bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
53443 plusmn 7414a 53796 plusmn 7746a 53273 plusmn 8300a 50046 plusmn 5610a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
56807 plusmn 6647a 57517 plusmn 5849a 5904 plusmn 5889a 58449 plusmn 6849a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
53816 plusmn 5684a 51894 plusmn 6065a 55393 plusmn 6193a 54749 plusmn 6849a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
51606 plusmn 5757a 57837 plusmn 5977b 55774 plusmn 7870aᵇ 57311 plusmn 6178b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Tukey
Tabela 3 Iacutendice gonadossomaacutetico de fecircmeas de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
790 plusmn 318a 747 plusmn 221a 505 plusmn 263a 432 plusmn 255a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
856 plusmn 473a 813 plusmn 690a 702 plusmn 430a 683 plusmn 361a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
373 plusmn 213a 270 plusmn 147a 323 plusmn 189a 399 plusmn 201a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
227 plusmn 147a 303 plusmn 106a 305 plusmn 192a 293 plusmn 167a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Duncan
Tabela 4 Iacutendice hepatossomaacutetico de fecircmeas de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
07 plusmn 014aᵇ 088 plusmn 03a 084 plusmn 038a 038 plusmn 031b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
113 plusmn 054a 104 plusmn 061a 102 plusmn 050a 102 plusmn 051a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
066 plusmn 029a 073 plusmn 020a 092 plusmn 017a 091 plusmn 012a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
074 plusmn 034a 072 plusmn 029a 094 plusmn 040a 063 plusmn 018a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Duncan
82
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53 CAPIacuteTULO 3
RELACcedilAtildeO ENTRE COLAacuteGENO TIPO IV INTEGRINA β1 E CASPASE 3
DURANTE O DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM Astyanax bimaculatus
EXPOSTOS AO THIODAN reg
RESUMO
O agrotoacutexico Thiodanreg (350gL de endosulfan) eacute um inseticida organoclorado utilizado
em diversas monoculturas e pode chegar aos ecossistemas aquaacuteticos afetando a
reproduccedilatildeo e a integridade das populaccedilotildees de peixes Ovaacuterios de peixes apresentam
ovoacutecitos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento os quais satildeo envoltos por zona
radiata ceacutelulas foliculares membrana basal e ceacutelulas da teca formando o complexo
folicular A integridade do complexo folicular estaacute associada com a presenccedila de
colaacutegeno tipo IV e integrina β1 enquanto a caspase 3 eacute uma protease importante na via
apoptoacutetica participando ativamente nos processos de regressatildeo ovariana Pela carecircncia
de estudos que avaliam tais proteiacutenas no complexo folicular este estudo teve por
objetivo avaliar por meio de anaacutelise imunoistoquiacutemica a expressatildeo das proteiacutenas
colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspases 3 durante o desenvolvimento folicular do
lambari Astyanax bimaculatus exposto ao Thiodanreg Os peixes foram aclimatados
durante 10 dias em aquaacuterios de 50L com aeraccedilatildeo contiacutenua aacutegua sem cloro filtro
mecacircnico fotoperiacuteodo (12h) e temperatura (26plusmn1ordmC) controlados Para a exposiccedilatildeo ao
Thiodanreg os peixes foram divididos em quatro grupos controle 115 23 e 56 microgL
com trecircs repeticcedilotildees em cada concentraccedilatildeo Apoacutes 96 h seis peixes de cada grupo foram
anestesiados (benzocaiacutena110000) eutanasiados e seus ovaacuterios coletados para detecccedilatildeo
de colaacutegeno de tipo IV integrina β1 e caspase 3 Fragmentos dos ovaacuterios foram fixados
em paraformaldeiacutedo a 4 e incluiacutedos em parafina Os procedimentos de
imunomarcaccedilatildeo seguiram protocolos jaacute padronizados para os anticorpos empregados A
reaccedilatildeo foi revelada com diaminobenzidina e os cortes foram contracorados com
hematoxilina para avaliaccedilatildeo qualitativa em microscoacutepio de luz Os foliacuteculos primordiais
natildeo apresentaram marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 Nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio observou-se reaccedilatildeo fracamente positiva no citoplasma das
ceacutelulas foliculares enquanto foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio foram mais
intensamente marcados para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV A imunomarcaccedilatildeo para
caspase 3 foi evidenciada nas ceacutelulas foliculares durante o desenvolvimento secundaacuterio
sendo mais intensa no estaacutedio avanccedilado Qualitativamente essas anaacutelises demonstraram
87
marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento folicular mesmo com os
peixes expostos a diferentes concentraccedilotildees de Thiodanreg o que caracteriza a integridade
das ceacutelulas foliculares e da via apoptoacutetica caspase-3-dependente que pode estar sendo
ativada para futuros processos de regressatildeo folicular
Palavras-chave ecotoxicologia aquaacutetica ovaacuterio peixes e reproduccedilatildeo
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 de α-endosulfan e 30 de β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo
por meio da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em riscos toxicoloacutegicos os
organismos que ali residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al
2007) Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos
como jaacute observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis
niloticus No entanto a Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan
em gordura o valor de 005mgkg-1 (EPA 2002) e em aacutegua doce 022microgL-1 (EPA
1980) A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em
consideraccedilatildeo a qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente
Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm 3572005 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo
do referido inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
Muitos inseticidas apresentam baixa toxicidade antes de serem transformados
em substacircncias toacutexicas metabolicamente ativas O sulfato de endosulfan eacute um dos
produtos derivados do metabolismo do endosulfan sendo considerado o principal
metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica por ser mais estaacutevel no meio
ambiente em relaccedilatildeo a sua formula original (Ali et al 1984) A sensibilidade dos
organismos aquaacuteticos ao endosulfan eacute baixa e tem sido bem descrita na literatura por
alguns autores (Cengiz et al 2001 Capkin et al 2006 Ballesteros et al 2007 Pereira
et al 2012) sendo os machos geralmente mais sensiacuteveis que as fecircmeas pelo
armazenamento de lipiacutedeos para produccedilatildeo do vitelo e fornecimento de energia e pelo
tamanho maior da fecircmea em relaccedilatildeo ao macho (Ballesteros et al 2007)
88
O desenvolvimento folicular em peixes tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter 1996 Begovac amp Wallace
1988 Grier 2000 2002 e 2007) e como nos animais em geral compreende os periacuteodos
preacute-meioacutetico perinucleolar vitelogecircnico e maturaccedilatildeo final Estas fases ocorrem no
interior de foliacuteculos cujo complexo folicular eacute constituiacutedo por zona radiata camada
folicular membrana basal e teca (Grier 2000) as quais desempenham importante papel
durante a foliculogecircnese e fertilizaccedilatildeo
Entretanto os peixes quando satildeo expostos aos poluentes podem sofrer influecircncia
na foliculogecircnese e assim acarretar prejuiacutezos reprodutivos para as espeacutecies expostas aos
contaminantes Alguns estudos mostram diversas alteraccedilotildees provocadas nos foliacuteculos de
peixes por contaminantes (Hazarika amp Das 1998 Dutta et al 2003 Maxwell amp Dutta
2005 Chakrabarty et al 2012) inclusive a atresia folicular que eacute um processo
frequentemente observado nos ovaacuterios dos vertebrados (Saidapur 1978 Santos et al
2008a Santos et al 2008b) e que pode ser causada por diversos fatores dentre os
quais os agrotoacutexicos (Nagahama 1983 Guraya 1986 Chatterjee et al 1997 e 2001
Dutta amp Dalal 2008)
No desenvolvimento folicular a formaccedilatildeo do complexo folicular eacute importante
no suporte e na sobrevivecircncia das ceacutelulas foliculares No entanto jaacute foram identificadas
vaacuterias proteiacutenas que contribuem para a integridade do complexo folicular como
laminina integrina β1 fibronectina colaacutegeno tipo IV e de metaloproteinases (MMM-P)
em foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios e atreacutesicos (Rodgers et al 1998 Grier 2002 Le Bellego
et al 2002 Berkholtz et al 2006 Santos et al 2008a Thomeacute et al 2010) O colaacutegeno
tipo IV eacute uma proteiacutena especializada da matrix extracelular e membrana basal assim
como a laminina Essas proteacuteinas estatildeo envolvidas em favorecer um microambiente para
sobrevivecircncia das ceacutelulas do epiteacutelio (Rodgers et al 2003) As integrinas compreendem
uma grande famiacutelia de recepetores celulares composto de subnidades α e β que tem
funccedilatildeo importante na adesatildeo e transmissatildeo de sinais na ceacutelula Aleacutem disso as integrinas
estatildeo envolvidas na proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e morte celular
A caspase 3 eacute uma moleacutecula efetora de grande importacircncia no processo de
apoptose na ativaccedilatildeo de endonucleases e na clivagem das proteiacutenas celulares causando
mudanccedilas morfoloacutegicas celulares (Huettenbrenner et al 2003) Este processo de
apoptose envolve uma cascata de eventos bioquiacutemicos com a liberaccedilatildeo de fatores
mitocondriais de morte celular ativaccedilatildeo caspases e mudanccedila na caracteriacutestica
morfoloacutegica no nuacutecleo da ceacutelula assim como fragmentaccedilatildeo do DNA (Huettenbrenner et
89
al 2003) No entanto alguns trabalho citam a importacircncia da integridade do complexo
folicular com a presenccedila de integrina β1 e colaacutegeno tipo IV que em caso de atresia
folicular e ovulaccedilatildeo na formaccedilatildeo de foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios culminam em processo
da ativaccedilatildeo das caspases nas ceacutelulas foliculares Sendo assim a incidecircncia de apoptose
nas ceacutelulas foliculares aumenta nas etapas de regressatildeo ovariana (Drummond et al
2000 Santos et al 2003 2005 2008)
O lambari A bimaculatus foi escolhido como organismo experimental pois eacute
muito representativo no ecossistema sendo encontrado desde o nordeste brasileiro ateacute a
Bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Tambeacutem eacute um peixe de
pequeno porte e faacutecil de manter em laboratoacuterio O complexo folicular associado agrave
siacutentese dessas proteiacutenas ao longo do desenvolvimento folicular eacute algo a ser discutido
Poreacutem nenhum trabalho relata estas proteiacutenas em peixes expostos ao Thiodanreg Devido
agrave carecircncia de estudos que avaliem tais proteiacutenas no complexo folicular o presente
trabalho tem como objetivo avaliar as proteiacutenas colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase
3 durante o desenvolvimento folicular do lambari A bimaculatus exposto ou natildeo ao
Thiodanreg por meio de anaacutelise imunoistoquiacutemica
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria (DVT) da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste subletal e as atividades de coleta fixaccedilatildeo e
inclusatildeo dos fragmentos de ovaacuterios As etapas de microtomia imunoistoquiacutemica
coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas foram realizadas no
DVTUFV e no Laboratoacuterio de Ictiohistologia do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas (ICB)
da Universidade Federal de Minas Gerais
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos peixes em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado poro genital
dilatado e vascularizado
90
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV onde
foram aclimatados por 10 dias Os aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuiacuteam
capacidade de 50 litros numa densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada
aacutegua livre de cloro temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos
os aquaacuterios possuiacuteam um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo continua da aacutegua para
garantir o bem-estar dos peixes Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial
Purina contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da
piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Foram aclimatados 96 lambaris como descrito no item 21 onde os peixes se
acostumaram ao seu novo meio e agraves atividades normais de manutenccedilatildeo como
alimentaccedilatildeo e limpeza dos aquaacuterios O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi
realizado baseando-se nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo com
a NBR 15088 (ABNT 2007)
Logo apoacutes aclimataccedilatildeo os peixes foram submetidos ao toacutexico Thiodanreg
(endosulfan 350gL) por 96 horas Em todos os experimentos foram utilizadas trecircs
concentraccedilotildees diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 (137microgL) preacute-determinada em
laboratoacuterio de acordo com a NBR 15088 (ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas
em cada experimento foram de 115 23 e 56microgL aleacutem de um grupo controle sem
toacutexico com trecircs repeticcedilotildees sob as mesmas condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
91
24 Anaacutelises histoloacutegicas e imunoistoquiacutemicas
Apoacutes 96 horas de experimento seis fecircmeas de cada grupo foram coletadas
anestesiadas com benzocaiacutena (110000) e eutanasiadas para coleta dos ovaacuterios Para a
descriccedilatildeo histoloacutegica todas as amostras foram fixadas em paraformaldeiacutedo a 4 em
tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedas em parafina Em seguida
secccedilotildees com 5 microm de espessura foram coradas utilizando hematoxilinaeosina para
anaacutelises morfoloacutegicas do desenvolvimento folicular
Para detectar a imunorreatividade para colaacutegeno tipo IV integrinas β1 e caspase
3 nos ovaacuterios do lambari trecircs espeacutecimes de cada grupo foram fixados em
paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas incluiacutedas em
parafina e seccionadas com 5 microm de espessura A recuperaccedilatildeo antigecircnica foi realizada
em forno de microondas por 10 minutos com os cortes nas lacircminas sendo imersos em
tampatildeo citrato 10mM pH 60 As lacircminas foram incubadas com peroacutexido de hidrogecircnio
a 3 em tampatildeo fosfato por 15 minutos em temperatura ambiente para inativar
peroxidase endoacutegena e com soro albumina bovina a 2 por 45 minutos para bloquear
marcador antigecircnico inespeciacutefico Anticorpos primaacuterios (policlonais de coelho) anti-
colaacutegeno tipo IV anti-integrina β1 e anti-caspase 3 (Santa Cruz Biotechnology Calif
USA) foram aplicados nas secccedilotildees a 4degC na diluiccedilatildeo 1100 (integrina β1 e colaacutegeno tipo
IV) e 1200 (caspase 3) segundo o fabricante por 12 horas Os cortes foram lavados
em PBS e incubados por 45 minutos com anticorpo secundaacuterio na diluiccedilatildeo de 1200
anti-IgG de coelho (LSAB 2 sistema HRP DakoCymation Carpinteria Calif USA) e
tratados com peroxidase conjugada com estreptavidina por 45 minutos A revelaccedilatildeo foi
realizada com diaminobenzidina (DAB) e as lacircminas foram contracoradas com
hematoxilina (Santos et al 2008)
As lacircminas foram analisadas em toda sua extensatildeo em busca de alteraccedilotildees na
imunomarcaccedilatildeo no complexo folicular que pudessem ser representativas do efeito do
Thiodanreg sempre comparando com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios do grupo
controle As lacircminas foram analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e as
imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
92
3 RESULTADOS
31 Desenvolvimento folicular
O desenvolvimento folicular de A bimaculatus foi dividido em desenvolvimento
primaacuterio inicial e avanccedilado O desenvolvimento secundaacuterio foi dividido em
desenvolvimento secundaacuterio inicial intermediaacuterio e avanccedilado (Tabela 1) A regressatildeo
ovariana tambeacutem foi caracterizada (Tabela 1)
Tabela 1 Aspectos morfoloacutegicos do desenvolvimento folicular e da regressatildeo ovariana de Astyanax bimaculatus
Foliacuteculos primordiais Estaacutedio que antecede o desenvolvimento de foliacuteculos primaacuterios Satildeo ceacutelulas menores apresentando citoplasma volumoso nuacutecleo esfeacuterico e grande e ceacutelulas preacute-foliculares (Figura 1 B) Foliacuteculos primaacuterios iniciais e primaacuterios avanccedilados (perinucleolares) No desenvolvimento primaacuterio inicial os ovoacutecitos apresentam citoplasma fortemente basoacutefilo nuacutecleo esfeacuterico e nucleacuteolos dispersos pelo nucleoplasma Estatildeo envoltos por ceacutelulas foliculares pavimentosas (Figuras 1 C-encarte) No foliacuteculo primaacuterio avanccedilado a camada de ceacutelulas foliculares eacute pavimentosa e com o nuacutecleo eliacuteptico Entre as ceacutelulas foliculares e o ooplasma surge a zona radiata como uma fina camada (Figura 1 E-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios iniciais O citoplasma ovocitaacuterio eacute granular e fracamente basoacutefilo com presenccedila de vesiacuteculas corticais pequenas e claras na periferia do citoplasma O nuacutecleo eacute central ligeiramente acidoacutefilo com nucleacuteolos pequenos e dispersos pelo nucleoplasma (Figura 1 G-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios Assim como na etapa anterior os foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios possuem ovoacutecito com nuacutecleo central e acidoacutefilo No citoplasma inicia-se a deposiccedilatildeo de vitelo a partir da regiatildeo perifeacuterica (Figura 1 H-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados (vitelogecircnicos) No foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado o diacircmetro e o volume citoplasmaacutetico aumentam mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo apresentando os foliacuteculos neste estaacutedio vesiacuteculas corticais na periferia e gloacutebulos de vitelo disperso por todo citoplasma No complexo folicular a membrana basal eacute delgada e a zona radiada mais espessa que nas fases anteriores com ceacutelulas foliculares pavimentosas e cuacutebicas (Figura 1 H-encarte) Foliacuteculos atreacutesicos Apresenta formato irregular com estruturas descontiacutenuas ou desorganizadas com aspecto de grumos devido agrave liquefaccedilatildeo dos gracircnulos de vitelo ou com perda da conectividade entre suas partes fragmentaccedilatildeo da zona radiata (atresia inicial) e absorccedilatildeo total do conteuacutedo ovocitaacuterio pelas ceacutelulas foliculares (atresia avanccedilada) (Figuras 3 A e B-encarte) Foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios O foliacuteculo poacutes-ovulatoacuterio possue lume amplo irregular e contiacutenuo com o lume do ovaacuterio Apresenta parede constituiacuteda por camada uacutenica de ceacutelulas foliculares membrana basal e teca (Figuras 3 E e F)
93
32 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 no desenvolvimento
folicular de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Os foliacuteculos nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento apresentaram diferentes
graus de marcaccedilatildeo para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV Em foliacuteculo primordial natildeo se
observou marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 (Figura 1 B) Nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio inicial foram evidenciadas reaccedilotildees positivas com marcaccedilatildeo
fraca para colaacutegeno e integrina (Figuras 1 C e D) enquanto nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio avanccedilado as marcaccedilotildees foram mais niacutetidas (Figuras 1 E e F)
Nos desenvolvimento secundaacuterio foram evidenciadas marcaccedilotildees positivas para integrina
β1 e colaacutegeno tipo IV no citoplasma das ceacutelulas foliculares com mais intensidade que
nos estaacutedios anteriores (Figuras 1 G e H) Estas marcaccedilotildees natildeo mostraram diferenccedilas
entre os grupos expostos ao Thiodanreg quando comparados com os mesmos estaacutedios de
desenvolvimento folicular dos grupos controle A marcaccedilatildeo para caspase 3 foi
evidenciada no citoplasma e nuacutecleos de ceacutelulas foliculares de foliacuteculos com
desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado apresentando maior intensidade nos estaacutedios de
desenvolvimento secundaacuterio inicial A marcaccedilatildeo foi ausente nos estaacutedios de
desenvolvimento primaacuterio (Figuras 2 A-D) Quando comparadas estas marcaccedilotildees entre
os grupos controle e expostos ao Thiodanreg natildeo houve diferenccedilas nas marcaccedilotildees entre
os mesmos estaacutedios de desenvolvimento folicular
33 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 na atresia folicular de
A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
A marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 foi evidente nos foliacuteculos
atreacutesicos iniciais poreacutem menos intensa em relaccedilatildeo aos foliacuteculos normais (Figuras 3 A e
C) As fases mais avanccediladas da atresia folicular satildeo caracterizadas pela desorganizaccedilatildeo
espalhamento das proteiacutenas no ooplasma com reaccedilatildeo mais fraca da imunomarcaccedilatildeo
para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 (Figuras 3 B e D) Para a caspase 3 foi observada a
marcaccedilatildeo positiva nas ceacutelulas foliculares em foliacuteculos atreacutesicos iniciais e avanccedilados
(Figuras 4 A e B)
94
34 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 em foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Foram evidenciados desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV e
integrina β1 entre as ceacutelulas foliculares com marcaccedilatildeo positiva (Figuras 3 E e F) Em
foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios tambeacutem foi observada marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 nas
ceacutelulas foliculares (Figuras 4 C e D)
4 DISCUSSAtildeO
As fecircmeas de A bimaculatus submetidas agrave accedilatildeo do toacutexico apresentaram ovaacuterios
com padrotildees normais do desenvolvimento folicular sendo as variaccedilotildees na estrutura do
foliacuteculo como diacircmetro caracteriacutesticas do nuacutecleo camadas envoltoacuterias composiccedilatildeo e
distribuiccedilatildeo do vitelo observadas em outras espeacutecies do gecircnero do presente estudo
(Miranda 1996 Miranda et al 1999 Melo et al 2005 Mazzoni et al 2005 Rodrigues
et al 2005) Em outros trabalhos (Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008) satildeo
demonstrados que pequena concentraccedilatildeo de contaminantes pode ser suficiente para
causar alteraccedilotildees na morfologia dos foliacuteculos Entretanto Ballesteros et al (2007)
utilizando peixes machos e fecircmeas da espeacutecie Jenynsia multidentata verificaram que o
maior teor de lipiacutedeos nas fecircmeas foi importante para conferir maior resistecircncia contra o
endosulfan ao contraacuterio dos machos que satildeo mais suceptiacuteveis Estudo realizado por
Hernan Da Cuntildea et al (2011) mostrou que a espeacutecie Cichlasoma dimerus exposta ao
endosulfan nas concentraccedilotildees de zero 025 1 2 3 4 e 16μgL natildeo apresentou
alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos foliacuteculos assim como no presente trabalho com A
bimaculatus
No presente estudo a ausecircncia de marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV em foliacuteculos
primordiais pode ter ocorrido em funccedilatildeo da quantidade reduzida de ceacutelulas foliculares e
pela pequena espessura da membrana basal nesta fase de desenvolvimento folicular Na
literatura eacute mencionado que a espessura da membrana basal em foliacuteculos secundaacuterios
avanccedilados de A bimaculatus eacute de aproximadamente 03 microm caracterizada por ser uma
estrutura muito mais delgada quando comparada a outras espeacutecies de teleoacutesteos
(Drummond et al 2000) Outros autores no entanto observaram positividade para
colaacutegeno tipo IV na membrana basal envolvendo ovogocircnias no estroma ovariano de
peixes (Grier 2002 Thomeacute et al 2010) fase que antecede o ovoacutecito primordial
95
A siacutentese de membrana basal tem sido atribuiacuteda agraves ceacutelulas foliculares (Le Mim
et al 2007) mas ainda faltam investigaccedilotildees que evidenciem esta funccedilatildeo A anaacutelise por
hibridizaccedilatildeo in situ na cadeia α1 do colaacutegeno tipo IV revelou a presenccedila de mRNA
localizada na camada folicular de todos os foliacuteculos em crescimento no peixe medaka
Oryzias latipes (Kato et al 2010) enquanto para integrinas Itami et al (2011) natildeo
identificaram marcaccedilatildeo em foliacuteculos primordiais em ratos Estes estudos confirmam que
durante o desenvolvimento do foliacuteculo primordial poderia estar ocorrendo o inicio da
organizaccedilatildeo e siacutentese do colaacutegeno tipo IV para as fecircmeas do presente estudo
Logo em seguida o desenvolvimento folicular primaacuterio inicial e avanccedilado foi
caracterizado por alteraccedilotildees no complexo folicular com marcaccedilatildeo positiva para
integrina β1 e colaacutegeno tipo IV foi positiva Em outro estudo realizado para marcaccedilatildeo
de vaacuterias subunidades do colaacutegeno tipo IV em foliacuteculos de bovinos a expressatildeo das
cadeias α3 e α6 diminuiacuteram durante o desenvolvimento folicular enquanto as cadeias
α1 e α2 continuaram a ser expressas ao longo do desenvolvimento (Rodgers et al
1998) Em estudo com ratos foi verificado o decliacutenio de colaacutegeno tipo IV α3 ao longo
do desenvolvimento folicular mas foi possiacutevel detectar o colaacutegeno tipo IV α4 e α5 em
foliacuteculos desenvolvidos (Frojdman et al 1998) Entretanto Berkholtz (2006) observou
aumento da marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV ao longo do desenvolvimento folicular em
ratos Aleacutem disso outra caracteriacutestica importante eacute presenccedila de perlecan e nidogen que
fazem parte das ligaccedilotildees cruzadas em foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio mas
natildeo em foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio (McArthur et al 2000) Poreacutem as
diferentes ligaccedilotildees cruzadas entre os colaacutegenos e lamininas nas membranas basais
tambeacutem garantem maior expansatildeo no alargamento do foliacuteculo (Rodgers et al 2003)
Portanto eacute de grande importacircncia nesta etapa de desenvolvimento folicular a evidecircncia
do colaacutegeno tipo IV e integrinas o que pode contribuir na organizaccedilatildeo coordenada no
desenvolvimento folicular de A bimaculatus com estas proteiacutenas da matriz extracelular
Em relaccedilatildeo agraves fases de desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio foram observadas
marcaccedilotildees positivas para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 o que parece caracterizar
maior siacutentese destas proteiacutenas nestes estaacutedios do desenvolvimento folicular Entretanto
deve-se considerar que nas fases mais avanccediladas a quantidade de ceacutelulas foliculares e
ceacutelulas da teca satildeo mais numerosas sendo assim exercem funccedilatildeo importante na
integridade folicular No presente estudo a marcaccedilatildeo contiacutenua de colaacutegeno tipo IV e
integrina β1 nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento folicular em 96 horas de
experimento indicou que natildeo houve desorganizaccedilatildeo na membrana basal e nas ceacutelulas
96
foliculares Thomeacute et al (2010) identificaram por teacutecnicas de imonoistoquiacutemica e
imunofluorescecircncia a presenccedila de laminina β2 integrinas e colaacutegeno tipo IV na
membrana basal demonstrando a importacircncia destes constituintes na integridade da
membrana basal ao longo do desenvolvimento folicular resultados observados tambeacutem
em foliacuteculos de mamiacuteferos (Le Bellego et al 2002 Berkholtz et al 2006)
Em foliacuteculos de ratos tambeacutem foi evidenciada a presenccedila de integrinas ao longo
do desenvolvimento folicular apresentando marcaccedilatildeo positiva no desenvolvimento
primaacuterio e marcaccedilatildeo mais intensa no desenvolvimento secundaacuterio (Itami et al 2011)
Portanto a marcaccedilatildeo positiva nas ceacutelulas foliculares em lambaris A bimaculatus nos
grupos controle e expostos ao Thiodanreg mostrou que a integridade dos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio natildeo foi afetada pelas concentraccedilotildees de
Thiodanreg utilizadas
Em relaccedilatildeo agrave caspase 3 ao longo do desenvolvimento folicular foi possiacutevel
evidenciar sua expressatildeo nos estaacutedios de desenvolvimento secundaacuterio mas natildeo a
presenccedila de condensaccedilatildeo de nuacutecleos e corpos apoptoacuteticos nas ceacutelulas foliculares No
entanto a presenccedila de caspase 3 nas ceacutelulas foliculares de A bimaculatus indica que
estas ceacutelulas podem estar em via apoptoacutetica poreacutem outros trabalhos demonstram que a
via para caspase 3 eacute observada em foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios atresias iniciais e
principalmente nas atresias avanccediladas com a presenccedila de fragmentaccedilatildeo de DNA
condensaccedilatildeo nuclear e formaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos (Hsueh et al 1994 Santos et
al 2008) A ausecircncia destas caracteriacutesticas morfoloacutegicas nos foliacuteculos de A
bimaculatus do presente estudo pode ser explicada por inibidores de apoptose (Salvesen
amp Duckett 2002) que podem estar ativos e protegendo as ceacutelulas contra apoptose
Outros exemplos citados satildeo os fatores hormonais como as gonadotropinas 17β
estradiol e fator de crescimento epideacutermico que agem como fatores de sobrevivecircncia
para suprimir a morte celular por apoptose em foliacuteculos ovarianos de ratos em cultura
(Chun et al 1994) e tambeacutem no peixe truta arco-iacuteris Oncorhynchus mykiss (Janz amp Van
Der Kraak 1997) Segundo Salvesen amp Duckett (2002) poucos estudos tecircm tentado
esclarecer se uma determinada ceacutelula consegue se recuperar de um efeito fisioloacutegico de
caspases quando estatildeo sendo processadas e ativadas
Um grupo de proteiacutenas estruturalmente relacionadas agrave inibiccedilatildeo da apoptose eacute o
inibidor de apoptose (IAP) (Deveraux amp Reed 1999) Satildeo descritos pelo menos oito
IAPs em humanos localizados no citoplasma e que se ligam na forma ativa da caspase
3 ou na forma zimogecircnio das caspases para inibir a sua funccedilatildeo (Salvesen amp Duckett
97
2002) Janz et al (1997) mencionam forte relaccedilatildeo com o aumento da apoptose e
expressatildeo de proteiacutena do choque teacutermico HSP70 em peixes expostos agrave celulose
afetando o tamanho do ovaacuterio provocanado queda da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
testosterona e induccedilatildeo nas concentraccedilotildees plasmaacuteticas de 17β estradiol Em relaccedilatildeo agrave
HSP70 ela pode estar relacionada com a proteccedilatildeo das ceacutelulas foliculares antes da
reabsorccedilatildeo do vitelo em foliacuteculos atreacutesicos (Santos et al 2008) A relaccedilatildeo mais
consistente da viabilidade dos foliacuteculos de A bimaculatus no presente estudo segundo a
literatura pode ser a relaccedilatildeo dos inibidores de apoptose associado com os fatores
hormonais agindo como prevenccedilatildeo na sobrevivecircncia das ceacutelulas foliculares no
desenvolvimento folicular secundaacuterio
Nas fecircmeas do lambari A bimaculatus o processo de atresia foi semelhante ao
descrito por Miranda et al (1999) Munoz et al (2002) Melo et al (2005) e Santos et
al (2005) A maior frequecircncia de atresia foi observada em foliacuteculos secundaacuterios
Observaccedilotildees semelhantes foram feitas por Drummond (1996) em A bimaculatus
lacustris e Melo et al (2005) em A scabripinnis Em relaccedilatildeo aos foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios ocorre perda de contato entre as membranas das ceacutelulas foliculares
adjacentes evento observado por Santos et al (2005) entre 48 e 72 horas poacutes-desova em
Leporinus taeniatus Essas estruturas foram raramente encontradas no presente estudo
indicando que o grau de contaminaccedilatildeo pelo Thiodanreg natildeo interferiu na eliminaccedilatildeo dos
foliacuteculos de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada
Nos processos de atresias e nos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios ocorreram a
desorganizaccedilatildeo e a perda da positividade da imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e
integrinas nas fases avanccediladas quando comparadas com as fases iniciais da regressatildeo
ovariana sendo esta caracteriacutestica tambeacutem observada por outros autores (Santos et al
2008 Thomeacute et al 2010) Relatos importantes sobre a integridade dos foliacuteculos estatildeo
na diminuiccedilatildeo da integrina β1 e colaacutegeno do tipo IV contribuindo para o aumento da
apoptose em ceacutelulas foliculares de foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios e nas atresias avanccediladas
(Santos et al 2008) Aleacutem disso outros fatores contribuem para o aumento da
apoptose como a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 17β estradiol logo apoacutes a desova
favorecendo a regressatildeo ovariana dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios (Kaptaner amp Ural 2006)
Portanto o presente estudo com as fecircmeas de A bimaculatus evidencia a caspase 3 e a
diminuiccedilatildeo da marcaccedilatildeo com integrina β1 e colaacutegeno tipo IV nas ceacutelulas foliculares nos
foliacuteculos atreacutesicos e poacutes-ovulatoacuterios o que sugere a provaacutevel accedilatildeo destas proteiacutenas na
regressatildeo folicular em lambaris expostos ao Thiodanreg
98
De acordo com os resultados obtidos pode-se inferir que os ovaacuterios A
bimaculatus foram resistentes ao Thiodanreg nas concentraccedilotildees testadas e no periacuteodo
experimental proposto pois tais concentraccedilotildees natildeo interferiram de modo significativo
na estrutura do complexo folicular e no desenvolvimento folicular Qualitativamente
essas anaacutelises demonstraram a marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do
desenvolvimento folicular mesmo quando os peixes foram expostos a diferentes
concentraccedilotildees de Thiodanreg o que caracteriza a integridade das ceacutelulas foliculares e da
via apoptoacutetica caspase-3-dependente que pode estar sendo ativada para futuros
processos de regressatildeo folicular
99
A
DC
B
fsa fp
fpi
fpi
mc
mi
fpa
fpa
fsa
fsa
zr
zr
zr zr
H
E
G
F
mc
m
mi
mc
fsa
fpi
fpa
fsi
vc fsa
fst
v
v
Figura 1 Imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 ao longo do desenvolvimento folicular em A bimaculatus A Controle negativo para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV B Foliacuteculo primordial (fp) sem marcaccedilatildeo para colaacutegeno (setas) C e D Marcaccedilatildeo positiva para colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) respectivamente em folliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio inicial (fpi) E e F Marcaccedilatildeo positiva para colaacutegeno (mc) e integrina (mi) em foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (fpa) Encarte-C Foliacuteculo primaacuterio inicial (fpi) G e H Marcaccedilatildeo para colaacutegeno (mc) e integrina (mi) mais fortemente evidenciada em foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (fsa) Encartes-G e H Foliacuteculo secundaacuterio inicial (fsi) foliacuteculo secundaacuterio intermediaacuterio (fst) foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado (fsa) vesiacuteculas corticais (vc) vitelo (v) zona radiata (zr) Encartes C E G e H corados com hematoxilinaeosina Barras 20 m encartes C e E (80 m) G (100m) e H (200m)
A B
C D
E F
G H
100
fpi
fpa
fsa
fsa
fsa
zr
zr
zr zr
D
A
C
B
Figura 2 Imunomarcaccedilatildeo para caspase 3 ao longo do desenvolvimento folicular em A bimaculatus A Imagem do controle negativo para caspase 3 (setas) B Ausecircncia de marcaccedilatildeo para caspase 3 (setas) em foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio inicial (fpi) C e D Marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) em foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (fsa) e ausente (setas) em foliacuteculo desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (fpa) zr zona radiata fsa foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado Barras 20 m
101
A
mc
mi
mc
mi
mi mc
fpo fpo
ai av
av
B
C D
E F
Figura 3 Imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 de atresia e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterio em A bimaculatus A e C Foliacuteculo secundaacuterio em atresia inicial (ai) caracterizando a presenccedila da zona radiata (zr) e iniacutecio da desorganizaccedilatildeo da marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) no complexo folicular (setas) B e D Imunomarcaccedilatildeo menos intensa do que na etapa anterior em atresia avanccedilada caracterizando a desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) no citoplasma (setas) E e F Foliacuteculo poacutes-ovulatoacuterio (fpo) caracterizando a desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) entre as ceacutelulas
foliculares (setas) Encartes A e B Atresia inicial (ai) e atresia avanccedilada (av) ceacutelula folicular (cf) zona radiata (zr) Encartes A e B corados com hematoxilinaeosina Barras A B C E e F
(20 m) D (200 m) encartes A (25 m) e B (100 m)
ai av zr cf cf
102
A
ai av
fpo fpo
B
C D
Figura 4 Imunomarcaccedilatildeo para caspase 3 em atresia folicular e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios em A bimaculatus A e B Imunomarcaccedilatildeo em atresia inicial (ai) e atresia avanccedilada (av) caracterizando a presenccedila de marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) C e D Imunomarcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) nas ceacutelulas dos foliacuteculos poacutes-ovulatorios (fpo) Barras A B e D (20 m) C (200 m)
103
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6 CONCLUSOtildeES A CL50 estimada para fecircmeas adultas de Astyanax bimaculatus em maturaccedilatildeo
avanccedilada expostas ao Thiodanreg eacute de 136microgL com intervalo de confianccedila de 101 a
184 microgL
A accedilatildeo do Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou o fiacutegado como um todo
mas locais isolados do parecircnquima hepaacutetico sendo a maioria alteraccedilotildees de estaacutegio I e
II com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico
As alteraccedilotildees na quantidade de glicogecircnio hepaacutetico no experimento sem aclimataccedilatildeo
sem alimentaccedilatildeo demonstraram que o Thiodanreg influenciou na maior mobilizaccedilatildeo
das reservas de glicogecircnio em funccedilatildeo das condiccedilotildees ambientais oferecidas aos
animais
As alteraccedilotildees ocorridas no nuacutecleo e citoplasma dos hepatoacutecitos demonstram que o
Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees hepaacuteticas confirmando que o Thiodanreg
influenciou no metabolismo celular como resposta adaptativa celular
Natildeo foram observadas diferenccedilas morfoloacutegicas que comprometessem diretamente os
estaacutedios de desenvolvimento folicular ovariano seja no grupo controle ou nos grupos
tratados com Thiodanreg
Os experimentos com aclimataccedilatildeo apresentaram alteraccedilotildees na quantidade de
foliacuteculos primaacuterios e secundaacuterios quando comparadas com os peixes sem
aclimataccedilatildeo sugerindo que o eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-ovaacuterio pode estar sendo
afetado
Houve maior diacircmetro nos foliacuteculos vitelogecircnicos e maior frequecircncia de atresia
folicular no experimento com aclimataccedilatildeo seguida de exposiccedilatildeo ao Thiodanreg o que
sugere mecanismo adaptativo com maiores diacircmetros de foliacuteculos no meio
impactado
108
As meacutedias dos IGS e IHS nos experimentos aclimatados foram menores quando
comparadas com os experimentos sem aclimataccedilatildeo sugerindo que a espeacutecie A
bimaculatus previamente aclimatada em aquaacuterios pode sofrer comprometimento da
reproduccedilatildeo
As reaccedilotildees imunohistoquiacutemicas para integrina β1 colaacutegeno IV e caspase-3 em
foliacuteculos atreacutesicos e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios sugerem possiacutevel relaccedilatildeo com a
regressatildeo ovariana poacutes-desova
As anaacutelises por imunohistoquiacutemica para integrina β1 colaacutegeno IV e caspase-3 nas
ceacutelulas foliculares ao longo do desenvolvimento folicular demonstraram
qualitativamente marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento
folicular mesmo quando os peixes foram expostos a diferentes concentraccedilotildees de
Thiodanreg o que caracteriza a integridade das ceacutelulas foliculares e da via apoptoacutetica
caspase-3-dependente que pode estar sendo ativada para futuros processos de
regressatildeo folicular
iii
BIOGRAFIA
LUCAS MARCON filho de Carlos Marcon Filho e Narcisa das Dores Marcon
nasceu em 29 de janeiro de 1980 em Campinas-SP
Em fevereiro de 1999 ingressou no curso de Ciecircncias Bioloacutegicas pela Pontifiacutecia
Universidade Catoacutelica de Campinas (PUC-Campinas) onde em janeiro de 2003
graduou-se nesta Instituiccedilatildeo No ano de 2002 foi bolsista de iniciaccedilatildeo cientifica pela
FAPESP no Departamento de Biologia Celular Instituto de BiologiaUNICAMP
Em maio de 2006 ingressou no Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Medicina
Veterinaacuteria na Universidade Federal de Viccedilosa - MG sob orientaccedilatildeo do professor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin na linha de pesquisa Morfofisiologia de Animais
Domeacutesticos e Selvagens (Reproduccedilatildeo e Toxicologia de Peixes) defendendo a
dissertaccedilatildeo de mestrado em fevereiro de 2008 e tese de doutorado em dezembro de
2013 obtendo os tiacutetulos de Magister Scientiae e Doctor Scientiae
iv
IacuteNDICE
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO GERAL
11 O uso de agrotoacutexicos
12 Tipos de inseticidas
13 Inseticidas no meio ambiente rotas de entrada
14 Avaliaccedilatildeo de solubilidade e estudos de toxicidade aquaacutetica
15 Caracterizaccedilatildeo do agrotoacutexico Thiodanreg
16 O uso do endosulfan
17 Toxicidade aguda do endosulfan
18 Efeitos dos inseticidas organoclorados sobre peixes
19 O lambari Astyanax bimaculatus
110 Morfologia hepaacutetica em teleoacutesteos
111 Morfologia ovariana em teleoacutesteos
vi
viii
1
1
2
3
4
5
6
6
7
9
10
12
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
22 Objetivos especiacuteficos
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
31 Animais
32 Agrotoacutexicos
33 Teste de toxidade aguda em sistema estaacutetico - CL50
34 Teste de toxidade subletal em sistema estaacutetico
35 Avaliaccedilatildeo morfoloacutegica
351 Microscopia de luz
352 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos fiacutegados
353 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos ovaacuterios
354 Imunoistoquiacutemica
36 Paracircmetros biomeacutetricos
37 Anaacutelises estastiacuteticas
4 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 CAPIacuteTULO 1 Efeitos do inseticida Thiodanreg sobre a morfologia
hepaacutetica de fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
52 CAPIacuteTULO 2 Efeitos do inseticida Thiodanreg sobre a morfologia
do desenvolvimento folicular em lambaris Astyanax bimaculatus
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
53 CAPIacuteTULO 3 Relaccedilatildeo entre colaacutegeno tipo IV integrina β1 e
caspase 3 durante o desenvolvimento folicular em Astyanax
bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
6 CONCLUSOtildeES
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RESUMO
MARCON Lucas D Sc Universidade Federal de Viccedilosa dezembro de 2013 Efeitos do Thiodanreg em fiacutegado e em ovaacuterios em maturaccedilatildeo avanccedilada de lambaris Astyanax bimaculatus Orientador Laeacutercio dos Anjos Benjamin Coorientadoras Ann Honor Mounteer e Marlene Isabel Vargas Viloria
O agrotoacutexico Thiodanreg (350gL de endosulfan) eacute um inseticida organoclorado utilizado
em diversas monoculturas que pode chegar aos ecossistemas aquaacuteticos e afetar a
reproduccedilatildeo e a integridade das populaccedilotildees de peixes O fiacutegado eacute um dos principais
oacutergatildeos para a biotransformaccedilatildeo de diversos xenobioacuteticos Quando os peixes satildeo
expostos a uma concentraccedilatildeo elevada de agentes quiacutemicos podem ocorrer danos
hepaacuteticos Os ovaacuterios de peixes apresentam foliacuteculos em diferentes estaacutedios de
desenvolvimento que satildeo envoltos por zona radiata ceacutelulas foliculares membrana basal
e ceacutelulas da teca formando o complexo folicular Agentes estressores podem causar
aumento ou diminuiccedilatildeo do diacircmetro dos foliacuteculos vitelogecircnicos alterar a quantidade de
foliacuteculos nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento e aumentar a incidecircncia de atresia
Assim o presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos do Thiodanreg sobre o fiacutegado
e ovaacuterios de lambaris Astyanax bimaculatus por meio de anaacutelises morfoloacutegica
morfomeacutetrica e imunoistoquiacutemica Os peixes expostos ao toacutexico foram divididos em
quatro experimentos 1) sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo 2) sem aclimataccedilatildeo e
alimentados 3) com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo 4) com aclimataccedilatildeo de
10 dias e alimentados Em todos os experimentos foram utilizadas trecircs concentraccedilotildees
diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 de 1367microgL preacute-determinada em laboratoacuterio
de acordo com a NBR 15088 (ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas em cada
experimento foram de 115 23 e 56microgL aleacutem de um grupo controle livre de toacutexico
com trecircs repeticcedilotildees contento 10 peixes para cada concentraccedilatildeo Apoacutes as 96h seis peixes
de cada grupo foram capturados e anestesiados com benzocaiacutena (110000) de acordo
com as Normas da Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de VeterinaacuteriaUFV (protocolo
242009) Os fiacutegados e ovaacuterios foram coletados e processados por teacutecnicas histoloacutegicas
rotineiras As lacircminas foram analisadas em microscoacutepio de luz Olympus CX31 Foram
obtidas imagens digitais de 10 campos aleatoacuterios por animal em objetiva de 20X e 40X
para avaliaccedilatildeo histoloacutegica As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada nos testes em sistema
estaacutetico foram mantidas de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT
2007) A anaacutelise histoloacutegica dos fiacutegados mostrou no experimento 1 (sem
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aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo) na concentraccedilatildeo de 56microgL de Thiodanreg a menor
intensidade (010plusmn00) da reaccedilatildeo ao PAS no citoplasma dos hepatoacutecitos quando
comparada ao grupo controle (133plusmn051) No entanto houve diferenccedila (Plt005) nesse
mesmo experimento quando comparado com as concentraccedilotildees 115microgL (266plusmn081) e
23microgL (300plusmn00) caracterizando depleccedilatildeo de glicogecircnio Aleacutem disso houve
alteraccedilotildees do diacircmetro de nuacutecleos e citoplasma dos hepatoacutecitos nos diferentes
experimentos e maior quantidade de nuacutecleos de hepatoacutecitos nos grupos expostos ao
Thiodanreg associada com a reduccedilatildeo na quantidade de citoplasma O Iacutendice de Alteraccedilatildeo
Histoloacutegica (IAH) dos lambaris coletados manteve-se entre 433 a 833 (para os grupos
controles) 1850 a 2883 (para as concentraccedilotildees de 115microgL) 2033 a 2833 (para as
concentraccedilotildees de 23microgL) e 2366 a 2766 (para as concentraccedilotildees de 56microgL) Os
lambaris coletados nos diferentes experimentos apresentaram valores de IAH para os
grupos controle inferiores (Plt005) aos grupos expostos Estes resultados demonstraram
que o Thiodanreg pode estar influenciando as funccedilotildees hepaacuteticas pela maior mobilizaccedilatildeo
das reservas de glicogecircnio na concentraccedilatildeo 56microgL As alteraccedilotildees observadas nos
fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas sendo alteraccedilotildees de estaacutedio I e II indicando
dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico nos diferentes grupos e experimentos Nos ovaacuterios
percebeu-se que a accedilatildeo do Thiodanreg em niacuteveis subletais natildeo afetou a morfologia dos
diferentes estaacutedios de desenvolvimento folicular Poreacutem os experimentos com
aclimataccedilatildeo demonstraram alteraccedilotildees nas quantidades de foliacuteculos primaacuterios e
secundaacuterios quando comparados com os peixes dos experimentos sem aclimataccedilatildeo
Aleacutem disso houve aumento do nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos e diacircmetro dos foliacuteculos
secundaacuterios nos grupos expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos Estes
resultados sugerem mecanismos compensatoacuterios da perda reprodutiva quando em meio
com condiccedilotildees desfavoraacuteveis As anaacutelises imunoistoquiacutemicas demonstraram marcaccedilatildeo
crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento folicular para integrina β1 e
colaacutegeno tipo IV Entretanto a caspase 3 foi observada somente no complexo folicular
de foliacuteculos secundaacuterios mesmo quando os peixes satildeo expostos a diferentes
concentraccedilotildees de Thiodanreg o que confirma a integridade das ceacutelulas foliculares e da via
apoptoacutetica caspase-3-dependente a qual pode estar sendo ativada para futuros processos
de regressatildeo folicular
viii
ABSTRACT
MARCON Lucas D Sc Universidade Federal de Viccedilosa December 2013 Effects of Thiodanreg in liver and ovaries in advanced maturation of the lambari Astyanax bimaculatus Advisor Laeacutercio dos Anjos Benjamin Co-advisors Ann Honor Mounteer and Marlene Isabel Vargas Viloria
The pesticide Thiodanreg (350gL-1 of endosulfan) is an organochlorine insecticide used
in various monocultures that may reach aquatic ecosystems and affect reproduction and
the health of fish populations The liver is a major organ for the biotransformation of
many xenobiotics and it can be damaged if the fish are exposed to a high level of
chemical substances The fish ovaries have oocytes at different stages of development
that are surrounded by zona radiata follicular basal membrane and teca cells to form the
follicular complex Stressor products may cause an increase or decrease in the diameter
of the secondary follicles vitellogenic depletion a change the number of follicles at
different stages of development and an increase the incidence of atresia The present
study aimed to evaluate the effects of Thiodanreg on the liver and ovaries of Astyanax
bimaculatus through morphological morphometric and immunohistochemistry analysis
The groups of fish were exposed to the toxic substances divided in four experiments
without adaptation and no feeding feeding without adaptation with adaptation and no
feeding with adaptation and feeding All experiments used three different
concentrations of Thiodanreg lower than the LC50 of 1367 microgL-1 previously determined
in the laboratory in accordance with the Brazilian Standard Regulation - NBR 15088
(ABNT 2007) The concentrations used in each experiment were 115 23 and 56
microgL-1 and a control group with three repetitions using ten fish in each aquarium After
96h six fish from each group were captured and anesthetized with benzocaine
(110000) according to the norms of the Ethics Committee of the Veterinary
DepartmentUFV (protocol 242009) Livers and ovaries were collected and processed
by histological techniques The slides were examined under the light microscope
Olympus CX31 Were obtained digital images of 10 random fields per animal at 20X
and 40X objective for evaluation The characteristics of the water used in acute tests
were maintained in a stable system in accordance to the recommendations of NBR
15088 (ABNT 2007) In the experiment 1 (without adaptationno feeding) at the
concentration of 56 mgL-1 of Thiodanreg (010 plusmn 00) the intensity of the PAS reaction
was lower in the cytoplasm of hepatocytes when compared to the control group (133 plusmn
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051) In the same experiment differences in glycogen depletion were (Plt005) when
compared to the concentrations 115 gL-1 (266 plusmn 081) and 23 gL-1 (300 plusmn 00) In
addition changes in the diameter of nuclei and cytoplasm of hepatocytes in all
experiments were observed and an increase in the number of hepatocyte nuclei in
groups exposed to Thiodanreg was associated with a reduction in the amount of
cytoplasm However the IHA was maintained between 433 to 833 (control group)
1850 to 2883 (115 mgL-1 group) 2033 to 2833 (23 gL-1 group) and 2366 to 2766
(56 gL-1 group) These results suggest that Thiodanreg may be influencing liver
functions to increase glycogen mobilization according to higher concentrations of
exposition The changes observed in the livers of A bimaculatus were not severe
classified as stage I and II that indicate repairable damage to liver tissue in all
experiments It was observed in the ovaries that the action of Thiodanreg in sublethal
levels did not affect (Plt005) the morphology of the different stages of follicle
development However the experiments demonstrated an adaptation response in the
number of primary and secondary follicles compared to fish without adaptation In
addition there was a growing incidence of atretic follicles and increased diameter of the
secondary follicles in the groups exposed to Thiodanreg in all experiments These results
suggest an adaptive response to offset reproductive loss where in unfavorable
conditions The immunohistochemical analysis showed increasing and uniform labeling
throughout the follicular development for integrin β1 and collagen type IV However
caspase 3 was observed only in the secondary ovarian follicular complex even when
fish were exposed to different concentrations of Thiodanreg which characterizes the
integrity of follicular cells and the apoptotic pathway-dependent caspase-3 which may
be activated for future follicular regression
1
1 INTRODUCcedilAtildeO GERAL
11 O uso de agrotoacutexicos
Agrotoacutexicos satildeo produtos e agentes de processos fiacutesicos quiacutemicos ou bioloacutegicos
destinados ao uso nos setores de produccedilatildeo no armazenamento e beneficiamento de
produtos agriacutecolas nas pastagens na proteccedilatildeo de florestas nativas ou implantadas e de
outros ecossistemas e tambeacutem de ambientes urbanos e industriais cuja finalidade eacute
preservaacute-los da accedilatildeo danosa de seres vivos considerados nocivos (Lei Federal 7802 de
110789) Os agrotoacutexicos satildeo importantes na agricultura todavia exigem precauccedilatildeo no
seu uso visando a proteccedilatildeo dos operaacuterios que os manipulam e aplicam dos
consumidores dos animais de criaccedilatildeo de abelhas peixes de organismos predadores e
parasitas e enfim do meio ambiente
Certas praacuteticas agriacutecolas ligadas ao modelo de produccedilatildeo agriacutecola como o uso
excessivo e inadequado de agrotoacutexicos a destruiccedilatildeo da cobertura vegetal dos solos para
plantio a natildeo preservaccedilatildeo das matas ciliares e das vegetaccedilotildees protetoras de nascentes
dentre outros fatores satildeo responsaacuteveis por grande parte dos problemas com os recursos
hiacutedricos (Matuo 1990)
Os inseticidas constituem importante grupo de praguicidas para o uso agriacutecola
que ano apoacutes ano mostra um aumento progressivo em seu uso na Ameacuterica do Sul
Estes nas uacuteltimas deacutecadas comeccedilaram a substituir inclusive o trabalho mecacircnico e
manual dos agricultores Ruumlegg et al (1987) e Tomita amp Beyruth (2002) relatam que o
modelo de agricultura adotado no Brasil baseia-se no uso de agrotoacutexicos Estes
compostos satildeo empregados haacute muito tempo e a partir da 2deg guerra mundial passaram a
ser mais intensamente utilizados
Nos uacuteltimos 40 anos a agricultura brasileira sofreu inuacutemeras e profundas
transformaccedilotildees que alteraram tanto a composiccedilatildeo das culturas como os processos de
produccedilatildeo e padrotildees tecnoloacutegicos ateacute entatildeo em vigor Ruumlegg et al (1987) enfatizam que
o processo de modernizaccedilatildeo entendido como uma seacuterie de transformaccedilotildees tecnoloacutegicas
nos processos produtivos intensificou o emprego de insumos como maacutequinas
fertilizantes e agrotoacutexicos que contam com preccedilos favoraacuteveis e estiacutemulos como creacutedito
farto a juros subsidiados que facilitaram sua ampla adoccedilatildeo no meio rural Assim
agrotoacutexicos tecircm sido amplamente utilizados como uma das principais ferramentas para
um bom programa de controle de plantas daninhas em culturas que tecircm ganhado espaccedilo
na balanccedila comercial agriacutecola brasileira (Rodrigues amp Almeida 2005) O emprego dos
2
agrotoacutexicos tornou-se de uso rotineiro principalmente pelo menor custo e maior
eficiecircncia de controle das plantas daninhas quando comparados aos demais meacutetodos
convencionais de controle Para Rosa (1998) o modelo baseado no uso intensivo de
insumos quiacutemicos de sementes melhoradas e mecanizaccedilatildeo foi denominado ldquoRevoluccedilatildeo
Verderdquo que na deacutecada de 1980 trouxe ao Brasil um novo alento em relaccedilatildeo agrave
produtividade com grandes esperanccedilas de colheitas fartas e novas tecnologias que
propiciaram o domiacutenio de aacutereas pouco exploradas como por exemplo o cerrado da
Regiatildeo Centro-Oeste De fato muitas destas expectativas se realizaram entretanto o
impacto ambiental resultante implicou custos muitas vezes irremediaacuteveis como por
exemplo a perda de biodiversidade e a exaustatildeo de vaacuterios cursos drsquoaacutegua por
assoreamento aleacutem de contaminaccedilatildeo
12 Tipos de inseticidas
Os inseticidas satildeo classificados em quatro categorias conforme sua foacutermula
quiacutemica organoclorados carbamatos organofosforados e piretroides Os
organoclorados satildeo produtos sinteacuteticos que possuem carbono cloro e hidrogecircnio em sua
estrutura quiacutemica Satildeo persistentes no meio ambiente por vaacuterios anos e pouco soluacuteveis
em aacutegua Esses inseticidas quando mal administrados tecircm accedilatildeo toacutexica para diversos
mamiacuteferos sendo sua accedilatildeo natildeo sistecircmica neurotoacutexica e mutagecircnica (Guedes 1990
Pereira et al 2012) Os carbamatos satildeo inseticidas considerados menos persistentes e
com degradaccedilatildeo raacutepida no meio ambiente natildeo satildeo bioacumulados pouco lipofiacutelicos
satildeo sistecircmicos em plantas e inibidores da acetilcolinesterase (Guedes 1990 Ware
1994 Chatterjee et al 2001) Os organofosforados satildeo outro grupo de inseticida
amplamente utilizado no mercado mundial representando 355 do uso na uacuteltima
deacutecada Esses inseticidas caracterizam-se por pouca solubilidade em aacutegua (mais
soluacuteveis do que os organoclorados) toxicidade variaacutevel em animais vertebrados em
alguns animais e plantas tecircm atividade sistecircmica baixa persistecircncia no ambiente e
facilmente degradados por enzimas e fatores quiacutemicos A accedilatildeo desses toacutexicos eacute
semelhante ao carbamato agindo nas vias sinaacutepticas dos axocircnios inibindo a
acetilcolinesterase (Ware 1994 Albinati et al 2009) O piretroide tambeacutem eacute um
inseticida amplamente utilizado na agricultura representando 21 do mercado mundial
na uacuteltima deacutecada O fator positivo do uso desse pesticida eacute que ele eacute muito toacutexico para
insetos e apresenta baixa toxicidade para mamiacuteferos satildeo fotoestaacuteveis com degradaccedilatildeo
raacutepida no solo A accedilatildeo toacutexica desse inseticida eacute semelhante aos primeiros inseticidas
3
desenvolvidos como o organoclorado DDT possuindo accedilatildeo neurotoacutexica nos axocircnios
(Naumann 1990 Ware 1994 Haverinen amp Vornanen 2014)
Nos uacuteltimos anos aumentou muito a diversidade de inseticidas visando a morte
de insetos e a persistecircncia do agrotoacutexico por periacuteodos curtos por questotildees de seguranccedila
ao meio ambiente Aleacutem desses inseticidas que foram mencionados acima existem
vaacuterios inseticidas organossinteacuteticos e inseticidas naturais de origem vegetal animal e
microbiana (Casida amp Quistad 1998 Ishaaya amp Horowitz 1998 Drevnick et al 2006)
13 Inseticidas no meio ambiente rotas de entrada
Os inseticidas podem entrar no meio ambiente acidental ou deliberadamente A
entrada acidental do inseticida origina-se de rejeitos industriais urbanos vazamentos
durante transporte armazenamento e distribuiccedilatildeo enquanto a entrada deliberada ocorre
pela aplicaccedilatildeo de inseticidas no meio rural e urbano As contaminaccedilotildees por agrotoacutexicos
podem contaminar solos e ateacute mesmo a atmosfera Nesse uacuteltimo a movimentaccedilatildeo do
toacutexico se daacute por meio de gotas partiacuteculas soacutelidas e gases que acabam sendo
transportados por longas distacircncias a partir do local de origem da aplicaccedilatildeo (Walker et
al 1996)
O transporte e destino dos agrotoacutexicos no ambiente aquaacutetico eacute ponto de
discussatildeo Murty (1988) descreveu que os agrotoacutexicos entram no ambiente aquaacutetico por
meio da aplicaccedilatildeo intencional implemento aeacutereo escoamento das aplicaccedilotildees ou
liberaccedilatildeo acidental A descarga dos resiacuteduos da manufatura de agrotoacutexicos constitui a
segunda maior fonte de contaminaccedilotildees dos corpos de aacutegua O efeito mais draacutestico eacute
esperado no ponto de liberaccedilatildeo em lagos e pequenos mares internos Os efeitos nos
oceanos eacute pequeno devido ao grande volume de aacutegua e accedilatildeo de correntes (Walker et al
1996)
Na rota de transporte bioloacutegico o sistema natildeo eacute muito importante em termos de
magnitude pela quantidade do xenobioacutetico acumulado quando comparado com fatores
mencionados acima (transporte abioacutetico) mas eacute importante para o homem e vida
silvestre O padratildeo do transporte bioloacutegico dos toacutexicos acumulados nos organismos
segue da seguinte forma herbiacutevoros carniacutevoros e pisciacutevoros (maior eficiecircncia de
acuacutemulo) Nesses uacuteltimos particularmente as espeacutecies de ambientes aquaacuteticos a
acumulaccedilatildeo e magnificaccedilatildeo satildeo maiores do que nas espeacutecies de ambiente terrestre
devido agrave lipofilicidade dos inseticidas particularmente os organoclorados Duas rotas de
entrada podem comprometer a toxicidade dos organismos aquaacuteticos absorccedilatildeo ou
4
ingestatildeo A bioconcentraccedilatildeo vai ser mais intensa no ambiente aquaacutetico pois a difusatildeo
dos poluentes na aacutegua aumenta a eficiecircncia de sua absorccedilatildeo pelo organismo aquaacutetico
devido agrave lipofilicidade dos organoclorados Dessa forma a transferecircncia ao longo de
cadeias alimentares eacute tambeacutem mais eficiente e a bioconcentraccedilatildeo acontece em todas as
suas etapas Devido a isso os efeitos em predadores podem ser seacuterios pois aleacutem de
grande bioconcentraccedilatildeo e transferecircncia pela cadeia alimentar alguns destes organismos
como aves que se alimentam de peixes e animais marinhos como focas e cetaacuteceos satildeo
deficientes no metabolismo de desintoxicaccedilatildeo particularmente devido ao sistema de
monoxigenases pouco desenvolvido comprometendo mais a toxicidade por
biomagnificaccedilatildeo (Barron 1995 Borgaacute et al 2004)
Aleacutem da bioconcentraccedilatildeo os resiacuteduos destas substacircncias presentes nas aacuteguas
podem ser aderidos ao material orgacircnico em suspensatildeo depositar-se no sedimento ou
serem absorvidos pelos organismos Assim peixes e invertebrados podem bioacumular
tais compostos ligados agrave mateacuteria ingerida ser passivamente absorvidos pela superfiacutecie
corporal ou durante as trocas respiratoacuterias (Vasconcellos amp Verani 2000 Henry amp
Kishimba 2006)
14 Avaliaccedilatildeo de sensibilidade e estudos de toxicidade aquaacutetica
A realizaccedilatildeo de testes de sensibilidade eacute recomendada como meacutetodo de
qualidade dos planteis de organismos cultivados Nestes testes satildeo utilizadas
substacircncias de referecircncias que incluem principalmente os sais dicromato de potaacutessio
cloreto de potaacutessio e cloreto de soacutedio Estes dois uacuteltimos satildeo mais recomendados pois
seus efluentes experimentais oferecem baixo risco de contaminaccedilatildeo ambiental Os testes
de sensibilidade geralmente satildeo de curta duraccedilatildeo (24 horas) e devem ser repetidos com
frequumlecircncia principalmente nos laboratoacuterios que mantecircm planteis de organismos-testes
pois estes dados servem como padratildeo na sensibilidade natural dos organismos Esta
teacutecnica vem sendo utilizada para avaliar os resultados de toxicidade pois a accedilatildeo toacutexica
somente poderaacute ser atribuiacuteda agrave substacircncia teste quando a sensibilidade natural dos
organismos natildeo tiver demonstrado qualquer alteraccedilatildeo ao longo do periacuteodo em que
foram testados (Ranzani-Paiva et al 2004)
O estudo dos efeitos de agentes toacutexicos sobre a vida aquaacutetica pode ser realizado
por meio de ensaios bioloacutegicos na natureza ou em condiccedilotildees laboratoriais controladas
sendo este uacuteltimo os mais utilizados por permitirem um controle mais efetivo de fatores
ocasionais como temperatura pH duraccedilatildeo de exposiccedilatildeo meio concentraccedilatildeo Ao se
5
avaliar a toxicidade de agentes toacutexicos ou misturas destes frente a um reativo bioloacutegico
geralmente se utiliza uma populaccedilatildeo homogecircnea possuindo uma sensibilidade definida
determinando-se a concentraccedilatildeo responsaacutevel por um efeito toacutexico (efeito letal subletal
crocircnico imobilizaccedilatildeo ou modificaccedilatildeo do comportamento entre outros) Estes testes
podem ser realizados utilizando-se sistemas de fluxo contiacutenuo semi estaacuteticos ou
estaacuteticos Quanto ao meio pode-se utilizar meio aquaacutetico do tipo aacutegua continental (aacutegua
dura rica em bicarbonatos e sulfatos dissolvidos ou aacutegua mole isenta de iacuteons caacutelcio e
magneacutesio) marinha ou salobra segundo as necessidades dos organismos avaliados
(CETESB 2008) Com relaccedilatildeo ao organismo-teste por razotildees teacutecnicas e econocircmicas eacute
impossiacutevel testar todas as espeacutecies que fazem parte do ecossistema aquaacutetico Assim
para esses estudos satildeo relacionados normalmente os organismos mais representativos
de cada niacutevel troacutefico na cadeia alimentar como algas microcrustaacuteceos e peixes
15 Caracterizaccedilatildeo do agrotoacutexico Thiodanreg
O endosulfan inseticida desenvolvido pela Hoechst Aktiengesellschaft na
Alemanha foi introduzido no mercado em 1957 com o nome comercial de Thiodan
(Goebel et al 1982 e Stumpf amp Abhaver 1986) O Thiodanreg eacute um inseticida acaricida
organoclorado do grupo quiacutemico eacutester do aacutecido sulfuroso de um diol ciacuteclico Esse
agrotoacutexico eacute classificado toxicologicamente como altamente toacutexico (Classe I)
classificaccedilatildeo ambiental como produto altamente perigoso aleacutem de inflamaacutevel e
corrosivo (Engelhardt amp Sarmento 2008)
O ingrediente ativo do Thiodanreg (350 gL de endosulfan) consiste na mistura de
dois isocircmeros sendo 70 de α-endosulfan e 30 de β-endosulfan Entre os produtos
derivados do metabolismo do endosulfan em mamiacuteferos o sulfato de endosulfan eacute o
principal metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica (Stumpf amp Abhaver 1986)
Os organoclorados como o Thiodanreg atuam nos canais de soacutedio do axocircnio
aumentando o periacuteodo de abertura destes canais O aumento do periacuteodo de abertura dos
canais de soacutedio leva a um aumento do fluxo de soacutedio para o interior da membrana e
acarretando um prolongamento da fase de despolarizaccedilatildeo apoacutes o pico do potencial de
accedilatildeo e devido a isso o inseto morre por hiperexcitaccedilatildeo Consequentemente a
propagaccedilatildeo contiacutenua do impulso nervoso gera tremores convulsotildees prostraccedilatildeo e
posteriormente a morte como observados em insetos Aleacutem disso pode afetar qualquer
tipo de crustaacuteceo peixes e mamiacuteferos inclusive em baixas concentraccedilotildees (Eto 1990
Pereira et al 2012)
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16 O uso do endosulfan
O endosulfan eacute o uacutenico inseticida organoclorado amplamente utilizado em todo
o mundo (Capkin et al 2006 Chakrabarty et al 2012) Segundo a empresa Bayer
(2010) fabricante do produto o Thiodanreg (endosulfan) eacute um inseticida para o controle
de insetos chupadores e mastigadores com accedilatildeo de contato e ingestatildeo Recomenda-se
seu uso especialmente em cultivos de cafeacute cana hortaliccedilas frutas vinhas e forragens
Adverte tambeacutem que natildeo se devem colher frutos ou vegetais tratados ateacute 21 dias apoacutes a
uacuteltima aplicaccedilatildeo
No Brasil segundo Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) a
importaccedilatildeo do endosulfan estaacute proibida a partir de julho de 2012 e sua utilizaccedilatildeo a partir
de 2013 (Molina 2010) A utilizaccedilatildeo de produtos agrave base de endosulfan no Brasil eacute
estimada em 44 milhotildees de toneladas em uma aacuterea de 22 a 36 milhotildees de hectares
podendo representar cerca de 40 do consumo mundial deste organoclorado segundo
dados do Programa Ambiental das Naccedilotildees Unidas (UNEP 2010) Segundo a Agecircncia
de Proteccedilatildeo Ambiental norte americana (EPA 1980) contaminaccedilotildees humanas por
endosulfan satildeo provenientes em 53 dos casos da ingestatildeo de aacutegua contaminada e em
47 dos casos do consumo de alimentos a base de peixes contaminados A mesma
agecircncia define como CL50 aguda valores de 017microgL-1 para truta arco-iacuteris e 740microgL-1
para Daphnia magna
A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em
consideraccedilatildeo a qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente
Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm 3572007 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo
do referido inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
17 Toxicidade aguda do endosulfan
O endosulfan apesar de pertencer agrave classe toxicoloacutegica I eacute altamente toacutexico
para animais aquaacuteticos e terrestres (espeacutecies natildeo alvo) e segundo a Agency for Toxic
Substances and Disease Registry - ATSDR (2000) possui de moderado a alto risco e
efeitos agudos e crocircnicos
Pinheiro et al (1998) advertem com veemecircncia sobre o perigo de contaminaccedilatildeo
do Pantanal e da Amazocircnia lugares ricos em recursos hiacutedricos por produtos agrave base de
endosulfan pois este produto eacute extremamente toacutexico para peixes e outros organismos
aquaacuteticos mesmo em doses muito pequenas O endosulfan natildeo dissolve facilmente na
7
aacutegua e adere agraves partiacuteculas do solo levando anos para sua degradaccedilatildeo (Soares et al
2003)
18 Efeitos dos inseticidas organoclorados sobre peixes
Apesar dos mecanismos de toxicidade do endosulfan serem extensivamente
estudados alguns trabalhos foram conduzidos com o objetivo de se avaliar efeitos
histopatoloacutegicos dos agrotoacutexicos em peixes (Naqvi amp Vaishnavi 1993) especialmente
nas gocircnadas fiacutegados bracircnquias e rins Em um desses estudos Capkin et al (2006)
reportaram uma CL50 de 1978 gL para Oreochromis mikyss para 24 horas de
exposiccedilatildeo ao toacutexico o que causou aleacutem da morte de 50 dos animais convulsotildees nado
erraacutetico edema e separaccedilatildeo das lacircminas branquiais edema e necrose do fiacutegado dos
tuacutebulos renais e do tecido hematopoieacutetico Cengiz et al (2001) reportaram lesotildees
similares em bracircnquias do peixe-mosquito Gambusia affinis aleacutem de congestatildeo e
hipertrofia do fiacutegado com o uso do pesticida Thiodanreg Segundo Capkin et al (2006)
alcalinidade e temperatura da aacutegua aleacutem do tamanho dos peixes afetam a toxicidade do
endosulfan Assim peixes pequenos e meacutedios mantidos em temperatura de 131ordmC com
1978 microgL do toacutexico tiveram uma sobrevivecircncia de 25 e 425 respectivamente
enquanto os peixes grandes tiveram 100 de sobrevivecircncia Quando a temperatura da
aacutegua foi aumentada para 16ordmC nenhum dos peixes pequenos e meacutedios sobreviveu
enquanto os sobreviventes de peixes grandes diminuiacuteram para 775 O aumento da
alcalinidade de 198 mgL para 419 mgL ou superior aumentou (Plt0001) a
sobrevivecircncia dos peixes Em relaccedilatildeo agrave dureza entre 357 mgL e 126 mgL a
sobrevivecircncia dos peixes expostos ao endosulfan natildeo foi afetada Histologicamente as
bracircnquias dos peixes tiveram edema lamelar separaccedilatildeo do epiteacutelio das lamelas fusatildeo
lamelar e hipertrofia das ceacutelulas epiteliais Os fiacutegados apresentaram edemas e necroses
graves
Cengiz amp Uumlnluuml (2002) estudaram os efeitos crocircnicos do endosulfan sob as
bracircnquias nas concentraccedilotildees de 05 e 075 microgL ao longo de 30 dias de experimento O
que se comprovou eacute que a dose mais elevada do endosulfan causou mais mudanccedilas
patoloacutegicas que a menor dose Altinok amp Capkin (2007) natildeo verificaram alteraccedilatildeo
morfoloacutegica nas bracircnquias de truta com 21 dias de exposiccedilatildeo de metiocarb entretanto
uma concentraccedilatildeo superior (375 mgL) causou separaccedilatildeo epitelial das bracircnquias No
mesmo trabalho os peixes expostos ao endosulfan com concentraccedilotildees de 06 e 13 microgL
mostraram mudanccedilas morfoloacutegicas nas bracircnquias como desprendimento do epiteacutelio
8
aparecimento de granuloacutecitos nas lamelas fusatildeo e necrose lamelar hipertrofia e nuacutecleos
picnoacuteticos Essas evidecircncias comprovam o efeito do endosulfan com comprometimento
das bracircnquias levando a reduccedilatildeo do consumo de oxigecircnio e desregulaccedilatildeo da funccedilatildeo de
osmorregulaccedilatildeo em organismos aquaacuteticos Aleacutem disso os efeitos toacutexicos do endosulfan
no fiacutegado induziram modificaccedilotildees estruturais como hipertrofia dos hepatoacutecitos nuacutecleos
picnoacuteticos e necroses
No trabalho de Ballesteros et al (2007) que utilizaram peixes adultos da espeacutecie
Jenynsia multidentata os testes de toxicidade foram realizados durante 96 horas a fim
de determinar a concentraccedilatildeo letal (CL50) do endosulfan As alteraccedilotildees histoloacutegicas
foram determinadas nas bracircnquias e nos fiacutegados A CL50-96 horas foi significativamente
diferentes entre machos (0719 μgL) e fecircmeas (1317 μgL) A diferenccedila entre os sexos
foi atribuiacuteda ao dimorfismo no teor de lipiacutedios no sexo feminino (216) e masculino
(179) As alteraccedilotildees histoloacutegicas nas bracircnquias incluiacuteram hipertrofia e levantamento
do epiteacutelio das lamelas secundaacuterias e aneurismas Essas alteraccedilotildees causaram um
aumento significativo da espessura da lamela secundaacuteria no grupo tratado em relaccedilatildeo
aos peixes do grupo-controle Finalmente as alteraccedilotildees histoloacutegicas reversiacuteveis como
degeneraccedilatildeo hidroacutepica e dilataccedilotildees dos sinusoides foram observadas nos fiacutegados dos
peixes expostos bem como mudanccedila irreversiacutevel como necrose nas concentraccedilotildees
mais elevadas O fiacutegado eacute um oacutergatildeo importante na capacidade de degradar compostos
toacutexicos mas os seus mecanismos de regulaccedilatildeo podem ser comprometidos em
concentraccedilotildees elevadas causando mudanccedilas estruturais como observadas nesses
trabalhos
A qualidade da aacutegua eacute um fator importante para o sucesso da reproduccedilatildeo dos
peixes Quando a qualidade da aacutegua eacute alterada devido a produtos quiacutemicos a estrutura
histoloacutegica das gocircnadas tambeacutem eacute alterada Para Cengiz et al (2001) os efeitos do
Thiodanreg (endosulfan) satildeo tempo e dose dependentes Dutta et al (2006) descreveram
num estudo de toxicidade crocircnica as injuacuterias causadas pelo Thiodanreg sobre os tuacutebulos
seminiacuteferos do peixe ldquobluegillrdquo Lepomis macrochirus e relataram alteraccedilatildeo dos tuacutebulos
seminiacuteferos que mostraram perda dos padrotildees normais de organizaccedilatildeo celular
diminuindo tambeacutem o diacircmetro das espermatogocircnias primaacuterias gradativamente desde as
primeiras 24 horas de exposiccedilatildeo ateacute as duas semanas seguintes Segundo os autores este
tipo de dano pode afetar as espermaacutetides e os espermatozoides apresentando no final
um impacto negativo na espermatogecircnese e fertilidade do macho comprometendo o
nuacutemero da populaccedilatildeo do ldquobluegillrdquo Lepomis macrochirus Em outro trabalho sobre
9
reproduccedilatildeo Hazarika amp Das (1998) identificaram mudanccedilas estruturais nos ovaacuterios de
Heteropneustes fossilis exposto ao organoclorado lindano por 72 horas Os resultados
demonstraram que houve ruptura e diminuiccedilatildeo do tamanho dos foliacuteculos maduros
afetando a fertilidade dos peixes
19 O lambari Astyanax bimaculatus
O lambari Astyanax bimaculatus (Linnaeus 1758) eacute conhecido popularmente
pelos nomes de lambari piaba lambari-guaccedilu mojarra pertence agrave famiacutelia Characidae
ordem Characiformes e ateacute entatildeo uma das espeacutecies da subfamiacutelia Tetragonopterinae
(CEMIGCETEC 2000) No entanto revisotildees recentes colocam o gecircnero em ldquoIncertae
sedisrdquo com 88 gecircneros e 620 espeacutecies sendo que 86 espeacutecies pertencem ao gecircnero
Astyanax (Lima et al 2003)
O A bimaculatus eacute um peixe de pequeno porte atingindo aproximadamente 20
cm de comprimento e pesando ateacute 40 gramas Possui corpo irregularmente eliacuteptico com
nadadeiras amarelas quatro a cinco dentes na seacuterie externa e cinco na seacuterie interna do
preacute-maxilar escamas com reflexos prateados mancha umeral ovalada e peduacutenculo
caudal com mancha alongada que se prolonga ateacute a ponta dos raios caudais medianos
(Britiski et al 1988 CEMIGCETEC 2000)
O gecircnero Astyanax possui ampla distribuiccedilatildeo geograacutefica sendo encontrado
desde o sudoeste dos Estados Unidos ateacute a Bacia do rio da Prata (Moreira Filho 1989
citado por Pereira Filho 2000) Os lambaris satildeo encontrados em cabeceiras de riachos
rios e lagos e vivem sempre em cardumes realizando curtas migraccedilotildees na eacutepoca das
cheias para sua reproduccedilatildeo Em relaccedilatildeo ao periacuteodo reprodutivo dos lambaris este pode
variar conforme a espeacutecie e o habitat sendo normalmente de setembro a marccedilo
(Vazzoler amp Menezes 1992 citados por Pereira Filho 2000)
A biologia reprodutiva do lambari pode ser prejudicada pelo desmatamento
ciliar poluiccedilatildeo industrial e domeacutestica e destruiccedilatildeo de vaacuterzeas e lagoas marginais por
projetos agriacutecolas que tambeacutem constituem ameaccedila em vaacuterias regiotildees (CEMIGCETEC
2000) Esses fatores interferem na dinacircmica da populaccedilatildeo desses peixes
Os lambaris satildeo oniacutevoros se alimentando de algas vegetais sementes larvas e
insetos adultos (CEMIGCETEC 2000) Os lambaris satildeo de extrema importacircncia em
diversos habitats por equilibrarem o ecossistema e a cadeia alimentar constituindo fonte
de alimentos para peixes maiores espeacutecies carniacutevoras e aves Em estudo conduzido com
o lambari da espeacutecie Astyanax janeiroensis verificaram-se que os principais haacutebitos
10
alimentares se baseavam em algas microcrustaacuteceos pequenos invertebrados e esporos
vegetais (Santin et al 2005) Diversos trabalhos relatam na literatura a importacircncia do
lambari na estrutura troacutefica do ecossistema e sua variaccedilatildeo alimentar diante de
modificaccedilotildees ambientais (Motta amp Uieda 1995 Suarez et al 1995 Esteves 1998)
Trabalho conduzido por Loureiro et al (1995) verificando a dieta alimentar na espeacutecie
Hoplias malabaricus (traiacutera) no reservatoacuterio da UHE de Segredo (PR) mostraram a
ingestatildeo alimentar preferencial de lambaris de diversas espeacutecies Em outro estudo
verificou-se a importacircncia do lambari como alimento para as espeacutecies Hoplias
malabaricus Oligosarcus longirostris e Rhamdia branneri apoacutes o represamento do
Reservatoacuterio de Salto Caxias (PR) demonstrando ser o alimento preferido dessas
espeacutecies (Novakoski 2007) Aleacutem disso na regiatildeo sudoeste do estado de Minas Gerais
existem representantes do gecircnero no Reservatoacuterio de Furnas (MG) caracterizando a
reproduccedilatildeo ao longo do ano para o equiliacutebrio da cadeia alimentar tendo importacircncia
econocircmica na alimentaccedilatildeo e tambeacutem na praacutetica de pesca profissional (Bazzoli et al
1998 Carvalho et al 2009) Portanto os lambaris satildeo de grande importacircncia em
diversos habitats como consumidores secundaacuterios (Esteves 1998) A ecologia alimentar
de uma determinada espeacutecie faz parte e interfere diretamente na dinacircmica de sua
populaccedilatildeo sendo primordial para a conservaccedilatildeo do ecossistema como um todo (Vitule
amp Aranha 2002)
110 Morfologia hepaacutetica em teleoacutesteos
O fiacutegado eacute um oacutergatildeo multifuncional responsaacutevel por uma das etapas do
processo de desenvolvimento folicular principalmente no periacuteodo de formaccedilatildeo dos
gloacutebulos de vitelo momento em que ocorre a transferecircncia de vitelogenina para o
ovaacuterio etapa fisioloacutegica que inicia nas ceacutelulas da teca e ceacutelulas foliculares com
produccedilatildeo do estradiol No fiacutegado o estradiol estimula os hepatoacutecitos a produzirem a
vitelogenina e careogenina que satildeo levadas pela corrente sanguiacutenea ateacute o ovaacuterio onde
participam da formaccedilatildeo do vitelo e zona radiata durante a maturaccedilatildeo folicular
(Senthilkumaran et al 2004) A produccedilatildeo de vitelogenina no fiacutegado pode variar entre as
espeacutecies de teleoacutesteos devido agraves diferenccedilas na capacidade de armazenamento de energia
condiccedilatildeo fisioloacutegica haacutebitos alimentares e contaminaccedilatildeo (Peyon et al 1996 Hull amp
Harvey 2001 Al -Ghais 2013 Silva Barni et al 2014) Aleacutem disso o fiacutegado eacute
responsaacutevel pela conversatildeo do alimento e desintoxicaccedilatildeo de substacircncias estranhas
(Selman amp Walace 1989 Ribeiro et al 2006)
11
O fiacutegado eacute glacircndula digestiva que apresenta superfiacutecie
coberta por uma membrana serosa e o tecido conjuntivo de sua caacutepsula
invagina para o parecircnquima (Takashima amp Hibiya 1995) O fiacutegado de teleoacutesteos eacute
constituiacutedo por hepatoacutecitos ceacutelulas epiteliais dos ductos biliares ceacutelulas endoteliais
ceacutelulas que armazenam gordura (ceacutelulas de Ito) macroacutefagos e ceacutelulas sanguiacuteneas
circulantes (Hinton et al 1984) e em algumas espeacutecies observam-se ceacutelulas do
pacircncreas exoacutecrino (pacircncreas intra-hepaacutetico) distribuiacutedas entre o parecircnquima do oacutergatildeo
assim como descrito para o lambari (Santos et al 2013)
Estruturas lobulares e uma pequena veia central estatildeo presentes em vertebrados
em peixes estas estruturas variam dependendo da espeacutecie e satildeo geralmente obscuras
(Takashima amp Hibyia 1995) Os hepatoacutecitos arranjam-se em fileiras os quais
geralmente apresentam a espessura de duas ceacutelulas O hepatoacutecito possui um nuacutecleo
uacutenico embora ceacutelulas binucleadas possam ser observadas O nuacutecleo se localiza na
regiatildeo central ou no poacutelo celular voltado para o sinusoide e o nucleacuteolo eacute bem evidente
(Arana 1995) A circulaccedilatildeo no fiacutegado eacute realizada pela arteacuteria hepaacutetica veia porta aleacutem
de capilares sinusoides Existem cordotildees de hepatoacutecitos que se arranjam
concentricamente ao redor dos capilares sinusoides (Takashima amp Hibyia 1995)
As vias biliares satildeo formadas por canaliacuteculos biliares preacute-duacutectulo biliar duacutectulo
biliar e ducto biliar O canaliacuteculo biliar eacute formado pela membrana plasmaacutetica dos
hepatoacutecitos e os microvilos dos mesmos preenchem o luacutemen do canaliacuteculo Nos
hepatoacutecitos existem ceacutelulas preacute-ductulares que estabelecem complexos juncionais com
os hepatoacutecitos formando os preacute-duacutectulos biliares A transiccedilatildeo entre preacute-duacutectulo e
duacutectulo ocorre quando o lume biliar estaacute completamente circundado por ceacutelulas
epiteliais biliares O ducto biliar eacute formado por ceacutelulas epiteliais cuacutebicas nos ductos de
menor calibre e ceacutelulas colunares nos grandes ductos sendo a presenccedila de lacircmina basal
o fator diferenciador dos mesmos Nos grandes ductos circundando a lacircmina basal
estatildeo fibroblastos plexo capilar fibras nervosas e ceacutelulas musculares lisas Acredita-se
que estas ceacutelulas musculares promovam os movimentos peristaacutelticos impulsionando a
bile Esse ducto une-se ao ducto ciacutestico dando origem ao ducto coleacutedoco (Arana 1995)
O endoteacutelio eacute fenestrado e a lacircmina basal estaacute ausente No espaccedilo de Disse haacute
ceacutelulas de Ito que em teleoacutesteos se caracterizam por apresentar vesiacuteculas lipiacutedicas
assim como o mesmo tipo celular em mamiacuteferos (Arana 1995) Haacute algumas mudanccedilas
patoloacutegicas que podem ocorrer no fiacutegado de peixes que sofreram exposiccedilatildeo a toacutexicos ou
outras substacircncias irritantes dissolvidas na aacutegua A atrofia eacute caracterizada por
12
diminuiccedilatildeo do tamanho dos hepatoacutecitos com presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos Tambeacutem
podem ocorrer necrose degeneraccedilatildeo vacuolar degeneraccedilatildeo gordurosa estagnaccedilatildeo da
bile inflamaccedilatildeo do parecircnquima hepaacutetico (hepatites) cirrose hepaacutetica e
desenvolvimentos de tumores (Takashima amp Hibyia 1995)
111 Morfologia ovariana em teleoacutesteos
Os ovaacuterios das fecircmeas A bimaculatus seguem os padrotildees descritos para a
maioria dos teleoacutesteos sendo oacutergatildeos pares alongados e foliaacuteceos sofrendo
modificaccedilotildees na espessura volume e coloraccedilatildeo durante as diferentes fases do ciclo
reprodutivo conforme observado tambeacutem em outras espeacutecies do gecircnero (Drummond
1996 Miranda 1996 Melo et al 2005 Mazzoni et al 2005 Rodrigues amp Almeida
2005 Carvalho et al 2009 Prado et al 2011) Nesses peixes o ovaacuterio eacute do tipo
cistovariano onde o lume ovariano se estende ateacute o oviduto como na maioria dos
peixes teleoacutesteos (Nagahama 1983 Selman amp Wallace 1986 Connaughton amp Aida
1998)
Nas observaccedilotildees histoloacutegicas do ovaacuterio de A bimaculatus verificou-se que os
mesmos satildeo envolvidos externamente por uma serosa peritoneal constituiacuteda por
mesoteacutelio e lacircmina do tecido conjuntivo fibroso Profundamente a essa estrutura
observa-se tuacutenica albugiacutenea de natureza conjuntiva contendo fibroacutecitos e vasos
sanguiacuteneos A tuacutenica albugiacutenea emite septos para o interior do oacutergatildeo formando lamelas
ovuliacutegeras nas quais encontram-se ovogocircnias e foliacuteculos em diferentes fases de
desenvolvimento No lambari o tipo de desenvolvimento folicular eacute assincrocircnico com
a presenccedila de foliacuteculos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento (Miranda 1996
Drummmond 1996 Marcon 2008)
Em peixes o desenvolvimento folicular tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Begovac amp Wallace 1988 Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter
1996 Grier 2000 e 2002 Carvalho et al 2009) e como nos animais em geral
compreende os periacuteodos preacute-meioacutetico perinucleolar preacute-vitelogecircnico vitelogecircnico e
maturaccedilatildeo final Os foliacuteculos passam por diversas fases de desenvolvimento
diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo de acordo com o periacuteodo reprodutivo do animal (Wallace amp
Selman 1981) Essas fases ocorrem no interior de foliacuteculos cuja parede constituiacuteda de
zona radiata camada folicular membrana basal e teca (Grier 2000) desempenham um
importante papel durante a ovogecircnese e na fertilizaccedilatildeo
13
A foliculogecircnse eacute regulada hormonalmente pelo eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-
gocircnada Em peixes teleoacutesteos estiacutemulos ambientais satildeo convertidos em informaccedilotildees
sensoriais no ceacuterebro associados com a liberaccedilatildeo de hormocircnios liberadores de
gonadotropinas (GnRH) pelo hipotaacutelamo que via corrente sanguiacutenea chegam agrave
adenohipoacutefise que sintetiza e libera hormocircnios gonodotroacutepicos hormocircnio fociacuteculo
estimulante (FSH) e hormocircnio luteinizante (LH) Os hormocircnios FSH e LH se ligam aos
receptores celulares das ceacutelulas tecais (LH-R) e foliculares (LH-R e FSH-R) para
estimularem a produccedilatildeo 17α-hydroxy-pregnesterona (17α-HP) e testosterona (T) Nas
ceacutelulas foliculares os hormocircnios esteroides 17α-HP e T agem como precursor na
produccedilatildeo do 17β-estradiol (17β-E) e do hormocircnio indutor de maturaccedilatildeo (MIH)
substacircncias importantes nas etapas do desenvolvimento folicular e na ovulaccedilatildeo
respectivamente (Dietrich amp Krieger 2009) (Figura 1)
Figura 1 Ceacutelulas somaacuteticas do ovaacuterio e principais produtos (Adaptado de Dietrich amp Krieger 2009)
Muitas das espeacutecies nativas natildeo desovam espontaneamente em ambientes
lecircnticos Algumas espeacutecies nativas quando mantidas em cativeiro se preparam para a
reproduccedilatildeo mas natildeo desovam naturalmente e sofrem regressatildeo ovariana com
consequente atresia dos foliacuteculos A atresia folicular eacute um processo degenerativo de
ocorrecircncia comum nos ovaacuterios de vertebrados e os foliacuteculos podem sofrer atresia em
diferentes fases do desenvolvimento ou diferenciaccedilatildeo (Guraya 1986 Miranda et al
1999 Santos et al 2008b)
A ovulaccedilatildeo refere-se agrave expulsatildeo do foliacuteculo em desenvolvimento maduro
(Redding amp Patintildeo 1993) Na natureza a ovulaccedilatildeo eacute regulada por dois hormocircnios os
quais estimulam o desenvolvimento gonadal em peixes FSH e LH (Connaughton amp
Aida 1998 Klausen et al 2001) Estes hormocircnios gonadotroacutepicos agem nos oacutergatildeos
reprodutores promovendo o desenvolvimento e maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas O
14
processo de transporte dos hormocircnios para as ceacutelulas reprodutoras eacute lento em ambientes
naturais mas na reproduccedilatildeo artificial com a teacutecnica de hipofisaccedilatildeo esse processo
torna-se mais raacutepido em relaccedilatildeo ao processo natural (Woynarovich amp Horvath 1980)
Nos ovaacuterios de peixes teleoacutesteos com fertilizaccedilatildeo externa os foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios estruturas remanescentes da desova satildeo frequentes Um aspecto
interessante eacute saber a duraccedilatildeo da reabsorccedilatildeo dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios nos
procedimentos de desova induzida para as espeacutecies em criaccedilatildeo Drummond (1996) e
Marcon (2008) estudaram a reabsorccedilatildeo dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios no estroma
ovariano em maturaccedilatildeo avanccedilada de lambaris (A bimaculatus lacustris) e observaram
que cinco dias apoacutes a desova os foliacuteculos haviam sido reabsorvidos Durante esse
processo figuras de apoptose satildeo observadas em fecircmeas submetidas agrave hipofisaccedilatildeo
(Drummond et al 2000) o mesmo ocorrendo em Leporinus taeniatus (Anostomidae)
(Santos et al 2003) Santos et al (2008a) registraram por meio das teacutecnicas de TUNEL
e de imunoistoquiacutemica o iacutendice apoptoacutetico em ceacutelulas foliculares dos foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios em Prochilodus argenteus notando que o maior iacutendice de ceacutelulas
foliculares apoptoacuteticas coincidiu com menores valores de integrinas e colaacutegeno tipo IV
no terceiro dia apoacutes a desova induzida Esses achados demonstram a importacircncia dessas
proteiacutenas na integridade das ceacutelulas foliculares nos foliacuteculos
15
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do inseticida organoclorado
endosulfan em sua apresentaccedilatildeo comercial Thiodanreg sobre as caracteriacutesticas
morfoloacutegicas dos ovaacuterios e fiacutegado de fecircmeas adultas de lambaris A bimaculatus apoacutes
exposiccedilatildeo subletal a esse agrotoacutexico durante a maturaccedilatildeo avanccedilada
22 Objetivos especiacuteficos
Estimar a CL50 para fecircmeas adultas de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada
expostas ao inseticida organoclorado Thiodanreg
Avaliar histopatologicamente o fiacutegado dos animais dos grupos controles e tratados
Analisar por morfometria os principais constituintes celulares do fiacutegado nos grupos
controles e tratados
Avaliar diferenccedilas nos valores dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS) e
hepatossomaacutetico (IHS) de animais dos grupos controles e expostos ao toacutexico
Verificar provaacuteveis alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos diferentes estaacutedios de
desenvolvimento de foliacuteculos ovarianos nos grupos submetidos aos efeitos do
toacutexico utilizando-se microscopia de luz
Quantificar os diferentes tipos de foliacuteculos e avaliar por morfometria os diacircmetros
dos foliacuteculos vitelogecircnicos nos grupos controles e tratados
Avaliar e quantificar o processo de atresia folicular nos grupos controles
comparando-os com os grupos tratados
Analisar qualitativamente por imunoistoquiacutemica as proteiacutenas de adesatildeo celular
(integrina β1 e colaacutegeno do tipo IV) nas ceacutelulas foliculares ao longo do
desenvolvimento folicular nos peixes dos grupos controles e tratados e
16
Analisar qualitativamente por imunoistoquiacutemica a proteiacutena caspase 3 nas ceacutelulas
foliculares ao longo do desenvolvimento folicular nos peixes dos grupos controles e
tratados
17
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade Federal
de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste de toxicidade aguda e o teste subletal quanto
as atividades de coleta fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos fiacutegados As etapas de
microtomia coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e
morfomeacutetricas foram realizadas nos Laboratoacuterios de Peixes e de Histopatologia do
Departamento de Veterinaacuteria da UFV (DVTUFV)
31 Animais
Foram utilizadas fecircmeas do lambari A bimaculatus mantidas em tanques de terra
na Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso (g) de 1152 plusmn 201 e comprimento total (cm)
de 912 plusmn 064 As caracteriacutesticas para a escolha dos animais se basearam em aspectos
corporais como ventre abaulado poro genital dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV Os
aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuem capacidade de 50 litros numa
densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro
temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam
um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo contiacutenua de aacutegua para garantir o bem-estar
dos peixes (Figura 2) Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial Purina
contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas de
acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de 255
plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza total
2815 plusmn 594 mgL-1 (CaCO3)
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
18
Figura 2 Principais componentes estruturais dos grupos experimentais (Adaptado de Oliveira Ribeiro et al 2002)
A Bomba para oxigenaccedilatildeo da aacutegua B Termostato para controle da temperatura D Filtro interno L Material contra isolamento de ruiacutedo H-J Trecircs aquaacuterios para cada grupo experimental (Controle e e cada uma das concentraccedilotildees de Thiodanreg )
Os lotes de peixes (120 peixes em cada lote) foram destinados agrave accedilatildeo do toacutexico em
quatro tratamentos diferentes
Experimentos Tratamentos Experimento 1 sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo Experimento 2 sem aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo Experimento 3 com aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo
Experimento 4 com aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo
O periacuteodo de 10 dias para aclimataccedilatildeo dos peixes foi para permitir que as
caracteriacutesticas ovarianas sejam comparadas com os grupos que natildeo foram aclimatados
Dessa forma mostraraacute quais as melhores condiccedilotildees que esses peixes podem ter na
reproduccedilatildeo quando expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
32 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente experimento foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo com 350gL de endosulfan
33 Teste de toxicidade aguda em sistema estaacutetico ndash CL50
A definiccedilatildeo das concentraccedilotildees toacutexicas a serem testadas nem sempre ocorre de
maneira simples Muitas vezes faz-se necessaacuterio uma anaacutelise preliminar para a
definiccedilatildeo da melhor faixa de concentraccedilatildeo a ser considerada nos testes definitivos
Dessa forma a primeira providecircncia desse estudo de toxidade aguda eacute a realizaccedilatildeo de
testes preliminares que devem ser conduzidos com concentraccedilotildees toacutexicas relacionadas
entre si por progressotildees geomeacutetricas de razatildeo 10 calculadas com base em informaccedilotildees
19
obtidas por meio de testes jaacute realizados com outros organismos que mais se assemelham
filogeneticamente ao grupo em questatildeo (Ranzani-Paiva 2004) A partir dos resultados
obtidos nessa fase eacute possiacutevel estabelecer a faixa ideal de concentraccedilatildeo para conduccedilatildeo
dos testes definitivos com o lambari
O teste de concentraccedilatildeo letal (CL50) que avalia a concentraccedilatildeo responsaacutevel pela
mortalidade de metade dos animais foi realizado em sistema de aacutegua estaacutetico de acordo
NBR 15088 (ABNT 2007) com os animais mantidos sob restriccedilatildeo alimentar que se
iniciou 24 horas antes do iniacutecio e perdurou durante o teste Essa restriccedilatildeo alimentar foi
realizada para evitar acuacutemulo de mateacuteria orgacircnica que poderia interferir na accedilatildeo do
agrotoacutexico
Para o teste foram selecionados 120 lambaris fecircmeas adultas em maturaccedilatildeo
avanccedilada com aproximadamente 7cm de comprimento O agrotoacutexico utilizado foi o
Thiodanreg (Bayer) com 350gL-1 de endosulfan Foram utilizadas trecircs repeticcedilotildees com
cinco peixes cada para cada concentraccedilatildeo de Thiodanreg adotada sendo os grupos assim
classificados controle (0microgL-1) 15microgL-1 30microgL-1 60microgL-1 120microgL-1 240microgL-
1 480microgL-1 e 960microgL-1 As concentraccedilotildees foram distribuiacutedas em recipientes plaacutesticos
com 15L de aacutegua dos proacuteprios aquaacuterios (Figura 3) Para obter as diferentes
concentraccedilotildees o Thiodanreg foi diluiacutedo uma primeira vez 1100 (Soluccedilatildeo Padratildeo
Intermediaacuteria contendo 3500mgL-1 de endosulfan) e uma segunda vez 1100 (Soluccedilatildeo
Padratildeo Final contendo 35000microgL-1 de endosulfan) viabilizando a observaccedilatildeo da
toxicidade total do agrotoacutexico e natildeo apenas do princiacutepio ativo (Figura 4)
Figura 3 Recipiente utilizado e distribuiccedilatildeo das concentraccedilotildees
20
Figura 4 Preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo padratildeo final do Thiodanreg
Foram feitas as verificaccedilotildees de mortalidade a cada seis horas (zero 6 12 18 24
30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 e 96 horas) removendo-se os animais mortos o
que proporcionou menores interferecircncias pela decomposiccedilatildeo dos peixes gerando maior
confianccedila da mortalidade apresentada ser em funccedilatildeo da toxicidade do princiacutepio ativo
endosulfan sinergicamente agrave accedilatildeo dos solventes e demais compostos do inseticida Para
acompanhamento da temperatura foi adicionado 15L de aacutegua do mesmo aquaacuterio em
um recipiente idecircntico de forma que qualquer variaccedilatildeo na temperatura pudesse ser
medida sem provocar estresse adicional a nenhum grupo O teste teve iniacutecio no dia
16012010 agraves 1000 horas com teacutermino agraves 1000 horas do dia 20012010 O programa
utilizado para o caacutelculo da CL50 foi o TOXCALC determinando o valor e o intervalo de
confianccedila pelo meacutetodo PROBITUS (Plt005)
34 Teste de toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Depois de estimar a CL50 pelos testes preliminares foi realizada aclimataccedilatildeo de
novos lambaris como descrito no item 31 (Figura 2) onde os peixes se acostumaram
ao seu novo meio e agraves atividades normais de manutenccedilatildeo como alimentaccedilatildeo e limpeza
dos aquaacuterios O teste de toxicidade aguda com o endosulfan foi realizado baseando-se
principalmente nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo com a
NBR 15088 (ABNT 2007)
O teste de toxicidade subletal foi feito com trecircs diferentes dosagens do toacutexico
inferiores agrave CL50 e para fins estatiacutesticos cada concentraccedilatildeo incluindo-se o grupo
controle teve trecircs repeticcedilotildees sob as mesmas condiccedilotildees para depois se avaliar e
Thiodanreg
Soluccedilatildeo padratildeo
intermediaacuteria
(1100)
Soluccedilatildeo
padratildeo final
(1100)
3500mgL de soluccedilatildeo padratildeo
intermediaacuteria 35000 microgL de
soluccedilatildeo padratildeo
final
21
quantificar a mortalidade se for o caso observar o comportamento dos animais que
sobreviveram agrave intoxicaccedilatildeo e os efeitos morfoloacutegicos nos fiacutegados e ovaacuterios dos peixes
expostos Assim como foram trecircs repeticcedilotildees usando-se trecircs diferentes concentraccedilotildees do
toacutexico e um grupo controle para a realizaccedilatildeo do presente experimento foram
necessaacuterias 120 fecircmeas de lambari para cada experimento (Tabela 1)
Tabela 1 Distribuiccedilatildeo das fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus em cada grupo experimental
Repeticcedilatildeo Controle 115microgl 23microgl 56microgl A 10 10 10 10 B 10 10 10 10 C 10 10 10 10
Para cada peixe que sobreviveu agrave intoxicaccedilatildeo pelo periacuteodo de 96 horas (teste de
toxicidade subletal) foram obtidos dados biomeacutetricos como peso corporal comprimento
total e comprimento-padratildeo peso do fiacutegado e peso do ovaacuterio Os ovaacuterios e fiacutegados na
sequecircncia foram fixados para posterior anaacutelise histoloacutegica
35 Avaliaccedilatildeo morfoloacutegica
351 Microscopia de luz
Apoacutes 96 horas de experimento seis animais de cada grupo foram coletados
anestesiados com benzocaiacutena e eutanasiados para coleta dos ovaacuterios e fiacutegados Para o
estudo das caracteriacutesticas morfoloacutegicas de ovaacuterios e fiacutegados os fragmentos foram
fixados em paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo fosfato 01M pH 72 O material foi
fixado por um periacuteodo miacutenimo de 24 horas e preservado em aacutelcool 70 Em seguida os
fragmentos foram transferidos para soluccedilatildeo de aacutelcool 95 por quatro horas Apoacutes isso
os fragmentos de ovaacuterios e fiacutegados foram imersos em soluccedilatildeo de aacutelcool 95 e resina
glicolmetacrilato (Leica Historesin) na proporccedilatildeo de 11 por 12 horas seguida de resina
pura por 24 horas e posterior emblocamento Os fragmentos foram seccionados em
cortes com 3microm de espessura em microacutetomo rotativo com navalha de vidro Foi
preparada uma lacircmina por animal com quatro cortes em cada e em padratildeo semi-seriado
ou seja a cada corte aproveitado eram descartados cinco cortes seguintes para evitar que
a mesma ceacutelula fosse contada duas vezes no momento da anaacutelise baseando-se no
diacircmetro nuclear previamente estabelecido para cada tipo celular em questatildeo
22
As coloraccedilotildees utilizadas foram azul de toluidina e hematoxilinaeosina para
anaacutelises histotoloacutegicas e para morfometria Tambeacutem foi utilizada a reaccedilatildeo histoquiacutemica
com PAS contracorados com hematoxilina para os cortes de fiacutegados As lacircminas foram
montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e
as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
352 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos fiacutegados
Os estudos morfoloacutegicos foram conduzidos em seis animais por concentraccedilatildeo
As lacircminas histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo e fotografadas (ocular
de 10X e objetiva de 40X) em 10 campos ao acaso para anaacutelises morfoloacutegicas e
morfomeacutetricas que pudessem ser representativas dos efeitos do Thiodanreg no tecido
hepaacutetico Estas alteraccedilotildees foram comparadas com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos fiacutegados
das lacircminas do grupo controle
As alteraccedilotildees histoloacutegicas foram avaliadas semiquantitativamente em duas
formas 1) por meio do caacutelculo do Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) com base na
incidecircncia de lesotildees Para tanto atribuiu-se um valor numeacuterico para cada animal
conforme a escala grau 1 (ausecircncia de alteraccedilatildeo histoloacutegica) grau 2 (ocorrecircncia de
lesotildees pontualmente localizadas) e grau 3 (lesotildees amplamente distribuiacutedas pelo oacutergatildeo)
em 10 campos fotografados e 2) por meio do caacutelculo do Iacutendice de Alteraccedilatildeo
Histopatoloacutegica (IAH) com base na severidade de cada lesatildeo de acordo com Schwaiger
et al (1997) Para tanto as alteraccedilotildees foram classificadas em estaacutedios progressivos
quanto ao comprometimento das funccedilotildees do oacutergatildeo alteraccedilotildees de estaacutedio I que natildeo
comprometem o funcionamento do oacutergatildeo de estaacutedio II mais severas e que prejudicam
o funcionamento normal do oacutergatildeo e de estaacutedio III muito severas e irreversiacuteveis
adaptado de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic (1994) (Tabela 2) O valor de IAH foi
calculado para cada animal utilizando a foacutermula IAH =10ordm sumI + 10ˡ sumII + 10sup2 sumIII
sendo I II e III correspondentes ao nuacutemero de alteraccedilotildees de estaacutedio I II e III
respectivamente O valor meacutedio de IAH foi dividido em cinco categorias seguindo
metodologia de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic (1994) 0-10= funcionamento normal do
tecido 11-20= dano leve a moderado do tecido 21-50= dano moderado a severo do
tecido 51-100= dano severo do tecido maior que 100= dano irreparaacutevel do tecido Este
iacutendice permitiu a comparaccedilatildeo da severidade das lesotildees hepaacuteticas entre os peixes
expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
23
Tabela 2 Classificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histoloacutegicas do fiacutegado quanto ao estaacutegio de comprometimento das funccedilotildees teciduais (adaptado de Poleksic amp MitrovicndashTutundzic1994)
Para as anaacutelises morfomeacutetricas foram realizadas dez mediccedilotildees dos diacircmetros de
nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos para cada animal As medidas foram obtidas por
meio do programa Image-Pro Plus traccedilando duas linhas perpendiculares respeitando-se
os limites do nuacutecleo e do citoplasma do hepatoacutecito em anaacutelise (Figura 5) Aleacutem disso
foram quantificados pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleo citoplasma capilar sinusoides e
macroacutefagos em 10 campos (gradiacutecula com 100microm de lado e uma aacuterea de 10000micromsup2)
totalizando 4410 pontosanimal para o caacutelculo da constituiccedilatildeo tecidual hepaacutetica (Figura
6) Estas avaliaccedilotildees foram conduzidas nos grupos controles e grupos de peixes expostos
ao toacutexico nas diferentes concentraccedilotildees
A quantidade de glicogecircnio nos hepatoacutecitos foi avaliada em toda extensatildeo da
lacircmina de forma semiquantitativa sendo evidenciada pela reaccedilatildeo histoquiacutemica de
Periodic Acid Schiff (PAS) segundo Michalany (1980) Para melhor compreensatildeo dos
resultados as marcaccedilotildees foram determinadas na seguinte escala 0- ausecircncia de
glicogecircnio 1- pouco glicogecircnio 2- quantidade moderada de glicogecircnio 3- muito
glicogecircnio Apoacutes esta anaacutelise foi calculada uma meacutedia do conteuacutedo de glicogecircnio dos
hepatoacutecitos nos grupos controles e grupos expostos ao toacutexico nas diferentes
concentraccedilotildees
ALTERACcedilOtildeES HISTOPATOLOacuteGICAS HEPAacuteTICAS ESTAacuteGIO1 Alteraccedilatildeo nos hepatoacutecitosAtrofia nuclear I
Atorfia nuclear I
Deformaccedilatildeo do contorno celular I
Deformaccedilatildeo do contorno nuclear I
Hipertrofia celular I
Hipertrofia nuclear I
Nuacutecleo na periferia da ceacutelula II
Vacuolizaccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo nuclear II
Nuacutecleos picnoacuteticos II
Rompimento celular II
2 Alteraccedilotildees nos vasos sanguiacuteneos
Hiperemia II
Ruptura de vasos II
3 Necrose
Necrose focal III
24
Figura 5 Metodologia para obtenccedilatildeo de medidas de diacircmetro de nuacutecleo e citoplasma de hepatoacutecitos por meio do programa Image-Pro Plus Coloraccedilatildeo Azul de toluidina Barra 5microm
Figura 6 Gradiacutecula utilizada para contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos capilares e macroacutefagos (4410 pontosanimal) Coloraccedilatildeo Azul de toluidina
25
353 Anaacutelises morfomeacutetri cas e morfoloacutegicas dos ovaacuterios
Os estudos foram conduzidos em seis animais de cada grupo em cada
experimento As lacircminas histoloacutegicas foram analisadsas em toda sua extensatildeo em busca
de alteraccedilotildees morfoloacutegicas foliculares (Tabela 3) que pudessem ser representativas dos
efeitos do Thiodanreg no tecido ovariano sempre comparando estas alteraccedilotildees com o
padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios das lacircminas dos grupos controles
Para a avaliaccedilatildeo morfomeacutetrica foram realizadas contagens dos diferentes
estaacutegios de desenvolvimento folicular Para isto foram utilizadas fotografias obtidas a
partir de 10 campos escolhidos ao acaso em objetiva de 10X (campo com 5094microm de
largura por 68120microm de comprimento totalizando uma aacuterea de 1863 mmsup2) Aleacutem
disso foi realizada a contagem de foliacuteculos atreacutesicos e observados eosinoacutefilos
associados aos foliacuteculos vitelogecircnicos utilizando o microscoacutepio com objetiva de 40X
avaliando-se 10 foliacuteculos escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro
experimentos Tambeacutem foram realizadas mediccedilotildees de diacircmetros em 10 foliacuteculos
vitelogecircnicos para cada animal Estas medidas foram obtidas pelo programa Image-Pro
Plus traccedilando-se duas linhas perpendiculares sobre nuacutecleo e central e respeitando-se os
limites do foliacuteculo As mensuraccedilotildees foram realizadas em imagens obtidas com objetiva
de 4X (Figura 7) Em todas as contagens e mediccedilotildees foram calculados os valores
meacutedios e desvios-padratildeo para cada concentraccedilatildeo para se avaliar o desenvolvimento
folicular nos diferentes experimentos
Tabela 3 Alteraccedilotildees histoloacutegicas do ovaacuterio quanto ao comprometimento folicular (adaptado de Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS FOLICULAR ES Alteraccedilatildeo nos foliacuteculos
Descolamento do revestimento folicular
Retraccedilatildeo citoplasmaacutetica
Retraccedilatildeo nuclear
Atresia folicular
Aglutinaccedilatildeo nucleoplasmaacutetica
Aglutinaccedilatildeo citoplasmaacutetica
Aglutinaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo
Foliacuteculos vazios
Granuloacutecitos envolvendo foliacuteculos
26
Figura 7 Metodologia para obtenccedilatildeo de medidas de diacircmetro de ovoacutecitos vitelogecircnicos avanccedilados por meio do programa Image-Pro Plus Coloraccedilatildeo Hematoxilina eosina
354 Imunoistoquiacutemica
Para detectar a possiacutevel imunorreatividade para colaacutegeno tipo IV integrinas β1 e
caspase 3 no tecido conjuntivo ovaacuterios do lambari foram fixados em paraformaldeido a
4 A recuperaccedilatildeo antigecircnica foi realizada em forno microndas por 10 minutos com os
cortes nas lacircminas sendo imersos em tampatildeo citrato 10mM pH 60 As lacircminas foram
incubadas com peroacutexido de hidrogecircnio a 3 em tampatildeo fosfato por 15 minutos em
temperatura ambiente para inativar peroxidase endoacutegena e com soro albumina bovina a
2 por 45 minutos para bloquear marcador antigecircnico inespeciacutefico Anticorpos
primaacuterios anti-colaacutegeno tipo IV anti-integrina β1 e anti-caspase 3 (Santa Cruz
Biotechnology Calif USA) foram aplicados nas secccedilotildees a 4degC na diluiccedilatildeo 1100
(integrina e colaacutegeno tipo IV) e 1200 (Caspase 3) segundo o fabricante ldquoovernightrdquo
Os cortes foram lavados em PBS e incubados por 45 minutos com diluiccedilatildeo de 1200
com anticorpo secundaacuterio IgG anti-coelho (LSAB 2 sistema HRP da Dako Cytomation
kit Dako Cytomation Carpinteria Calif USA) e tratado com peroxidase conjugada
com estreptavidina por 45 minutos A revelaccedilatildeo foi realizada com diaminobenzidina
(DAB) e as lacircminas foram contracoradas com hematoxilina (Santos et al 2008a)
27
36 Paracircmetros biomeacutetricos
Para analisar quantitativamente a atividade reprodutiva do A bimaculatus foram
registrados para cada exemplar os seguintes dados biomeacutetricos peso corporal (em g)
peso dos ovaacuterios (em g) e peso do fiacutegado (em g) Os valores meacutedios e desvios-padratildeo
dos iacutendices gonadossomaacutetico e hepatossomaacutetico foram calculados para cada animal em
cada um dos grupos propostos no presente estudo
a) Iacutendice gonadossomaacutetico (IGS)
IGS=PG x100 PG= peso dos ovaacuterios
PC PC= peso corporal
b) Iacutendice hepatossomaacutetico (IHS)
IHS= PF x100 PF= peso do fiacutegado
PC PC= peso corporal
37 Anaacutelises estatiacutesticas
As variaacuteveis quantitativas foram submetidas aos testes de homocedasticidade
(Levenes) e normalidade (Shapiro-Wilk) e posteriormente agrave anaacutelise de variacircncia para
testar as variaccedilotildees nos valores meacutedios dos iacutendices calculados no momento da coleta (96
horas) entre os grupos controles e os grupos tratados Foi analisado o coeficiente de
variaccedilatildeo para se evitar erros estatiacutesticos tipo I e tipo II e logo apoacutes foi realizado o teste
parameacutetrico de Duncan ou Tukey (Plt005) para comparar os valores meacutedios Quando
natildeo atenderam agraves premissas de normalidade e homocedasticidade mesmo apoacutes as
transformaccedilotildees apropriadas os dados foram submetidos aos testes natildeo-parameacutetricos de
Kruskal-Wallis (ANOVA) Para as variaacuteveis qualititativas quantificadas foi utilizado o
teste de Kruskal-Wallis (ANOVA) Os graacuteficos foram produzidos usando o software
Microsoft Excel 2010
28
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5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 CAPIacuteTULO 1
EFEITOS DO INSETICIDA THIODAN reg SOBRE A MORFOLOGIA HEPAacuteTICA
DE FEcircMEAS DE LAMBARIS Astyanax bimaculatus
RESUMO
O Thiodanreg eacute um toacutexico que pode causar alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos tecidos de peixes
expostos a ele dependendo da concentraccedilatildeo A fim de investigar possiacuteveis alteraccedilotildees
este estudo avaliou a morfologia hepaacutetica de fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus
expostas ao Thiodanreg por 96 horas em quatro diferentes experimentos com trecircs
concentraccedilotildees subletais de 115 23 e 56 microgL de Thiodanreg aleacutem de um grupo
controle livre de toacutexico As fecircmeas foram divididas em quatro experimentos sem
aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem aclimataccedilatildeo e alimentados com aclimataccedilatildeo de 10 dias e
sem alimentaccedilatildeo e com aclimataccedilatildeo de 10 dias e alimentados Foi observado que a accedilatildeo do
Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou a estrutura morfoloacutegica do fiacutegado
como um todo mas foram observadas alteraccedilotildees em locais isolados do parecircnquima
hepaacutetico Houve depleccedilatildeo de glicogecircnio deformaccedilatildeo nuclear e citoplasmaacutetica
hipertrofia nuclear e citoplasmaacutetica hiperemia e degeneraccedilatildeo celular nos hepatoacutecitos
nas diferentes concentraccedilotildees No entanto o Iacutendice de Alteraccedilatildeo Histoloacutegica (IHA) e o
Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) demonstraram que as alteraccedilotildees observadas nos
fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas sendo na maioria alteraccedilotildees de estaacutedio I e II
de forma leve a moderada com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico em todas as
concentraccedilotildees Aleacutem disso houve alteraccedilatildeo do diacircmetro do nuacutecleo e citoplasma dos
hepatoacutecitos nos diferentes experimentos e maior quantidade de nuacutecleos de hepatoacutecitos
nos grupos expostos ao Thiodanreg associada agrave reduccedilatildeo na quantidade de citoplasma
Conclui-se que o Thiodanreg influenciou o metabolismo hepaacutetico como resposta
adaptativa celular A incidecircncia de alteraccedilotildees histoloacutegicas no fiacutegado dos lambaris
coletados nos diferentes experimentos indica o comprometimento da sauacutede destes
peixes e mostra que os paracircmetros analisados podem ser empregados como
biomarcadores da contaminaccedilatildeo ambiental nesta espeacutecie
Palavras-chave histopatologia fiacutegado peixe endosulfan ecotoxicologia
36
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 α-endosulfan e 30 β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo a
partir da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em risco os organismos que ali
residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al 2007)
Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos como jaacute
observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis niloticus A
Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan em gordura o valor de
005mgkg-1 (EPA 2002) e em aacutegua doce 022microgL-1 (EPA 1980) A Legislaccedilatildeo
Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em consideraccedilatildeo a qualidade da
aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm
3572007 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo do referido inseticida e
seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
A sensibilidade ao endosulfan pelos organismos aquaacuteticos tem sido bem descrita
na literatura (Capkin et al 2006 Ballesteros et al 2007 Pereira et al 2012) O
produto eacute extremamente toacutexico para peixes e outros organismos aquaacuteticos mesmo em
concentraccedilotildees muito pequenas (Cengiz et al 2001) No entanto a sensibilidade pode
variar entre os sexos assim como foi observado nos peixes adultos da espeacutecie Jenynsia
multidentata sob efeito do endosulfan por 96 horas (Ballesteros et al 2007) Neste
trabalho a CL50 em peixes machos foi de 072 μgL-1 enquanto nas fecircmeas foi de
131μgL-1 valores atribuiacutedos agraves diferenccedilas de maior reserva de lipiacutedeos nas fecircmeas que
nos machos Em outros estudos Capkin et al (2006) utilizaram 1978gL-1 em
Oreochromis mikyss por 24 horas de exposiccedilatildeo ao toacutexico o que causou aleacutem da morte
de 50 dos peixes convulsotildees nado erraacutetico separaccedilatildeo das lacircminas bracircnquiais e
necrose do fiacutegado e como Cengiz et al (2001) reportaram lesotildees similares no peixe-
mosquito Gambusia affinis
O sulfato de endosulfan eacute um dos produtos derivados do metabolismo do
endosulfan sendo considerado o principal metaboacutelito devido agrave sua importacircncia
toxicoloacutegica (Stumpf amp abhaver 1986) e por ser mais estaacutevel no meio ambiente do que
37
quando estaacute em sua foacutermula original (Ali et al 1984) Decorrente disto os peixes
quando expostos a este inseticida podem apresentar alteraccedilotildees morfoloacutegicas
significativas no fiacutegado (Capkin et al 2006 Coimbra et al 2007 Glover et al 2007)
Estas alteraccedilotildees morfoloacutegicas podem ser o surgimento de vacuolizaccedilatildeo dos hepatoacutecitos
depleccedilatildeo de glicogecircnio alteraccedilatildeo dos vasos sinusoides alteraccedilatildeo do tamanho dos
hepatoacutecitos e necroses o que de acordo com alguns autores pode influenciar a siacutentese
de vitelogenina no fiacutegado para formaccedilatildeo dos foliacuteculos vitelogecircnicos em periacuteodo
reprodutivo (Senthilkumaran et al 2004 Al-Ghais 2013 Silva Barni et al 2014 )
Aleacutem disso as funccedilotildees hepaacuteticas podem ser influenciadas pelas diferenccedilas na
capacidade de exposiccedilatildeo a contaminantes condiccedilatildeo fisioloacutegica armazenamento de
energia e haacutebitos alimentares (Ribeiro et al 2006 Al -Ghais 2013 Silva Barni et al
2014)
O lambari Astyanax bimaculatus foi escolhido como organismo experimental
pois eacute muito representativo no ecossistema sendo encontrado desde o Nordeste
brasileiro ateacute a bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Eacute um peixe de
pequeno porte e de faacutecil manutenccedilatildeo em laboratoacuterio
Este estudo teve como objetivo verificar a ocorrecircncia de alteraccedilotildees histoloacutegicas
no fiacutegado de fecircmeas de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada e avaliar a intensidade
de alteraccedilatildeo deste orgatildeo em peixes alimentados e desprovidos de alimento durante
ensaios subletais agudos com o toacutexico Thiodanreg
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste de toxicidade aguda e o teste subletal As
atividades de coleta fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos fiacutegados microtomia
coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e morfomeacutetricas foram
realizadas nos Laboratoacuterios de Peixes e de Histopatologia do Departamento de
Veterinaacuteria da UFV (DVTUFV)
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
38
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos animais em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado poro genital
dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV Os
aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuem capacidade de 50 litros numa
densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro
temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam
sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo contiacutenua da aacutegua para garantir o bem-estar dos
peixes Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial Purina contendo 35 de
proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste da toxicidade aguda em sistema estaacutetico - CL 50
O teste de concentraccedilatildeo letal (CL50) que avalia a concentraccedilatildeo responsaacutevel pela
mortalidade de 50 dos animais foi realizado em sistema de aacutegua estaacutetico de acordo
com a NBR 15088 (ABNT 2007) com os animais mantidos em restriccedilatildeo alimentar que
se iniciou 24 horas antes do iniacutecio do experimento e perdurou durante todo o teste (96
horas) Essa restriccedilatildeo alimentar foi realizada para evitar acuacutemulo de mateacuteria orgacircnica
que poderia interferir na accedilatildeo do agrotoacutexico
Para o teste foram selecionadas 120 fecircmeas adultas de lambari em maturaccedilatildeo
avanccedilada O agrotoacutexico utilizado foi o Thiodanreg (Bayer) com 350gL-1 de endosulfan
Foram utilizadas trecircs repeticcedilotildees com cinco peixes cada para cada concentraccedilatildeo de
39
Thiodanreg adotada sendo os grupos assim classificados controle (0microgL-1) 15microgL-1
30microgL-1 60microgL-1 120microgL-1 240microgL-1 480microgL-1 e 960microgL-1 As concentraccedilotildees
foram distribuiacutedas em recipientes plaacutesticos com 15L de aacutegua dos proacuteprios aquaacuterios
Foram realizadas verificaccedilotildees de mortalidade a cada seis horas ateacute 96 horas
(zero 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 e 96 horas) removendo-se
os animais mortos o que proporcionou menores interferecircncias pela decomposiccedilatildeo dos
peixes gerando maior confianccedila da mortalidade apresentada ser em funccedilatildeo da
toxicidade do princiacutepio ativo endosulfan sinergicamente agrave accedilatildeo dos solventes e demais
compostos do inseticida Para acompanhamento da temperatura foi acondicionado 15L
de aacutegua do mesmo aquaacuterio em um recipiente idecircntico de forma que qualquer variaccedilatildeo
na temperatura pudesse ser medida sem provocar estresse adicional a nenhum grupo O
programa utilizado para o caacutelculo da CL50 foi o TOXCALC determinando o valor e
intervalo de confianccedila pelo meacutetodo PROBITUS (Plt005)
24 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi realizado baseando-se
principalmente nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo a NBR
15088 (ABNT 2007)
As fecircmeas foram expostas ao Thiodanreg (endosulfan 350gL-1) por 96 horas em
quatro tratamentos diferentes 1) experimento sem aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem
alimentaccedilatildeo 2) experimento sem aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo 3) experimento com
aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e 4) experimento com aclimataccedilatildeo de 10 dias
e com alimentaccedilatildeo Todos os experimentos foram constituiacutedos por trecircs concentraccedilotildees
diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 preacute-determinada em laboratoacuterio de acordo com
a NBR 15088 (ABNT 2007) e um grupo controle sem toacutexico As concentraccedilotildees
utilizadas em cada experimento foram de 115 23 e 56microgL-1 com trecircs repeticcedilotildees sob
as mesmas condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
25 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas
Apoacutes 96 horas de experimento foram coletados 96 peixes sendo seis animais
em cada grupo nos diferentes experimentos Logo em seguida os fiacutegados foram
coletados apoacutes os peixes terem sido anestesiados com benzocaiacutena (110000) e
eutanasiados pela secccedilatildeo transversal da coluna vertebral na regiatildeo do opeacuterculo
40
Para a histologia todas as amostras foram fixadas em paraformaldeiacutedo a 4 em
tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedos em resina glicolmetacrilato
(Leica Historesinreg) Em seguida secccedilotildees com 3microm de espessura foram coradas
utilizando azul de toluidina para as anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas As lacircminas
foram montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31
Olympus e as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software
Analysis GETIT Olympus
As lacircminas histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo e foram
fotografados 10 campos ao acaso em objetiva de 40X para anaacutelises morfoloacutegicas e
morfomeacutetricas que pudessem ser representativas do efeito do Thiodanreg no tecido
hepaacutetico Estas alteraccedilotildees foram comparadas com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos fiacutegados
dos grupos controles
As alteraccedilotildees histoloacutegicas foram avaliadas semiquantitativamente de duas
formas 1) por meio do caacutelculo do Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) com base na
incidecircncia de lesotildees Para tanto atribuiu-se um valor numeacuterico para cada oacutergatildeo
conforme a escala grau 1 (ausecircncia de alteraccedilatildeo histoloacutegica) grau 2 (ocorrecircncia de
lesotildees pontuais) e grau 3 (lesotildees amplamente difusas pelo oacutergatildeo) em 10 campos
fotografados e 2) pelo caacutelculo do Iacutendice de Alteraccedilatildeo Histotoloacutegica (IAH) com base na
severidade de cada lesatildeo de acordo com Schwaiger et al (1997) Para tanto as
alteraccedilotildees foram classificadas em estaacutedios progressivos quanto ao comprometimento
das funccedilotildees do oacutergatildeo alteraccedilotildees de estaacutedio I que natildeo comprometem o funcionamento
do oacutergatildeo de estaacutedio II mais severas e que prejudicam o funcionamento normal do
oacutergatildeo e de estaacutedio III muito severas e irreversiacuteveis (adaptado de Poleksic amp Mitrovic-
Tutundzic 1994) (Tabela 1) O valor de IAH foi calculado para cada animal utilizando a
foacutermula IAH =10ordm sumI + 10ˡ sumII + 10sup2 sumIII sendo I II e III correspondentes agraves
alteraccedilotildees de estaacutedios I II e III respectivamente O valor meacutedio de IAH foi dividido em
cinco categorias que seguiu metodologia de Poleksic amp Mitrovic- Tutundzic (1994) 0-
10= funcionamento normal do tecido 11-20= dano leve a moderado do tecido 21-50=
dano moderado a severo do tecido 51-100= dano severo do tecido maior que 100=
dano irreparaacutevel do tecido Este iacutendice permitiu a comparaccedilatildeo da severidade das lesotildees
hepaacuteticas entre os peixes expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
Para as anaacutelises morfomeacutetricas foram realizadas mediccedilotildees dos diacircmetros de dez
nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos para cada animal As medidas foram obtidas por
meio do programa Image-Pro Plus traccedilando duas linhas perpendiculares respeitando-se
41
os limites do nuacutecleo e do citoplasma do hepatoacutecito em anaacutelise Aleacutem disso foram
quantificados pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleo de hepatoacutecito citoplasma de hepatoacutecito
capilares sinusoides e macroacutefagos em 10 campos utilizando-se gradiacutecula com 441
pontos de interseccedilatildeo com 100microm de lado e uma aacuterea de 10000micromsup2 totalizando 4410
pontosanimal para o caacutelculo da constituiccedilatildeo tecidual hepaacutetica
Tabela 1 Classificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histoloacutegicas do fiacutegado quanto ao estaacutegio de comprometimento das funccedilotildees teciduais (adaptado de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic 1994)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS HEPAacuteTICAS ESTAacuteDIO 1 Alteraccedilotildees nos hepatoacutecitos I Atrofia nuclear I Deformaccedilatildeo do contorno celular I Deformaccedilatildeo do contorno nuclear I Hipertorfia celular I Hipertorfia nuclear I Nuacutecleo na periferia da ceacutelula I Vacuolizaccedilatildeo citoplasmaacutetica I Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II Degeneraccedilatildeo nuclear II Nuacutecleo picnoacuteticos II Rompimento celular II 2 Alteraccedilotildees nos vasos sanguiacuteneos Hiperemia II Ruptura de vasos II 3 Necrose Necrose focal III
A quantidade de glicogecircnio nos hepatoacutecitos foi avaliada em toda extensatildeo da
lacircmina de forma semiquantitativa sendo evidenciada pela reaccedilatildeo histoquiacutemica de
Periodic Acid Schiff (PAS) seguida de contracoloraccedilatildeo com hematoxilina segundo
Michalany (1980) Para melhor compreensatildeo dos resultados as marcaccedilotildees foram
determinadas na seguinte escala 0- ausecircncia de glicogecircnio 1- pouco glicogecircnio 2-
quantidade moderada de glicogecircnio 3- muito glicogecircnio Apoacutes esta anaacutelise foi
calculada uma meacutedia do conteuacutedo de glicogecircnio dos hepatoacutecitos nos grupos controles e
grupos expostos ao toacutexico nas diferentes concentraccedilotildees
42
26 Iacutendice hepatossomaacutetico (IHS)
Para o caacutelculo do IHS foram registrados para cada exemplar os dados
biomeacutetricos de peso corporal (PC em g) e peso do fiacutegado (PF em g) Os valores meacutedios
e os desvios padratildeo do iacutendice hepatossomaacutetico (IHS=PFx100PC) foram calculados
para cada animal em cada um dos grupos nos diferentes experimentos nas diferentes
concentraccedilotildees
27 Anaacutelises estatiacutesticas
Os dados estatildeo apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo
Os dados foram avaliados pelo Software Statistica 70 por meio da anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) Apoacutes o teste de distribuiccedilatildeo normal os dados foram comparados
entre os grupos controle e grupos expostos ao Thiodanreg usando anaacutelise de variacircncia
one-way seguida pelo teste de Tukey ou Duncan Quando os dados natildeo apresentaram
uma distribuiccedilatildeo normal foi utilizado o teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Plt005 foi utilizado como criteacuterio de significacircncia
3 RESULTADOS
31 Determinaccedilatildeo da CL50-96h
Nas primeiras seis horas de experimento observou-se mortalidade de 100 de
peixes na concentraccedilatildeo de 96microgL-1 944 de mortalidade em 48microgL-1 733 de
mortalidade em 24microgL-1 266 de mortalidade em 12microgL-1 e 20 de mortalidade em
6microgL-1 sendo um total de 447 dos peixes que morreram nas diferentes
concentraccedilotildees do Thiodanreg nas primeiras seis horas Na concentraccedilatildeo de 3microgL-1
morreu apenas um peixe no final das 96 horas Foi observado 100 de mortalidade na
concentraccedilatildeo de 48microgL-1 em ateacute 12 horas de exposiccedilatildeo ao toacutexico As menores
mortalidades foram registradas nas concentraccedilotildees de Thiodanreg de 3microgL-1 e 6microgL-1
sendo respectivamente 944 e 80 de sobrevivecircncias A concentraccedilatildeo de 15microgL-1
de Thiodanreg e o grupo controle natildeo tiveram mortalidade A temperatura da aacutegua
apresentou variaccedilatildeo entre 220ordmC e 245 ordmC com meacutedia de 233plusmn072 ordmC
Os valores registrados determinaram CL50-96hs de 1367microgL-1para as fecircmeas de
A bimaculatus com intervalo de confianccedila de 101 a 184microgL-1 (Plt005)
43
32 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Durante a exposiccedilatildeo ao Thiodanreg por 96 horas foi observado comportamento
anormal dos peixes com nado erraacutetico tentativa de fuga dos aquaacuterios demonstraccedilatildeo de
agressividade com os demais peixes busca de oxigecircnio na superfiacutecie e respiraccedilatildeo
branquial acelerada Apoacutes 24 horas do iacutenicio os animais apresentavam comportamento
normal e procuravam pelo alimento Estas mudanccedilas comportamentais ocorreram em
todas as concentraccedilotildees do agrotoacutexico utilizadas com maior intensidade na concentraccedilatildeo
de 56microgL do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo cuja temperatura meacutedia
foi superior agrave dos demais experimentos (Tabela 2)
33 Morfologia e frequecircncia das alteraccedilotildees histoloacutegicas nos fiacutegados
Morfologicamente o fiacutegado dos lambaris apresentou hepatoacutecitos hexagonais
com citoplasma de aspecto granular e vacuolizado nuacutecleo arredondado central nucleacuteolo
evidente e presenccedila de hepatopacircncreas Os hepatoacutecitos estavam dispostos em cordotildees
margeando os sinusoides (Figura 1 A)
Os infiltrados leucocitaacuterios foram observados nos grupos controles e nos grupos
expostos ao Thiodanreg (Figura 1 B)
A vacuolizaccedilatildeo foi evidente nos hepatoacutecitos das fecircmeas analisadas (Figura 1 A)
No fiacutegado das fecircmeas do experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve a presenccedila caracteriacutestica de acuacutemulos de lipiacutedios nos
hepatoacutecitos com a presenccedila de vesiacuteculas claras grandes e envolvidas por glicogecircnio
marcado positivamente pela reaccedilatildeo de PAS (Figura 1 C) Aleacutem disso foram observados
nuacutecleos deslocados para a periferia celular No experimento sem aclimataccedilatildeosem
alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve reaccedilatildeo negativa pelo PAS no
citoplasma dos hepatoacutecitos (Figura 1 D)
As alteraccedilotildees de estaacutedio I como deformaccedilatildeo do contorno nuclear nuacutecleo na
periferia da ceacutelula atrofia nuclear desarranjo dos cordotildees hepaacuteticos hipertrofia celular
e nuclear (Figuras 1 E-G Figuras 2 A-B) foram observadas nos grupos controles e
naqueles expostos ao Thiodanreg sendo que nos grupos tratados houve maior frequecircncia
O deslocamento do nuacutecleo para a periferia do hepatoacutecito foi observado nas fecircmeas do
experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 56microgL-1
Quanto agraves alteraccedilotildees de estaacutedio II a degeneraccedilatildeo nuclear (Figura 2 C) foi
raramente presente na maioria das concentraccedilotildees nos diferentes experimentos A
degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica (Figura 2 D) foi pouco frequente em todos os experimentos
44
assim como a hiperemia (Figura 2 E) A presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos (Figura 2 F) foi
mais frequente no experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e no experimento
com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
Os VMAs variaram entre 125 e 228 nas fecircmeas analisadas sendo a menor
meacutedia observada nos grupos controles e as maiores nos grupos expostos ao Thiodanreg o
que mostra incidecircncia maior de alteraccedilotildees pontuais no fiacutegado nos animais dos grupos
tratados Os VMAs do fiacutegado na espeacutecie estudada foram superiores (Plt005) nos peixes
expostos ao agrotoacutexico quando comparado aos peixes dos grupos controles (Tabela 3)
O IAH das fecircmeas nos diferentes experimentos apresentaram valores superiores
(Plt005) nos grupos expostos ao Thiodanreg quando comparados como os grupos
controles (Tabela 4) com exceccedilatildeo do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 115microgL-1 de endosulfan que natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
34 Diacircmetro dos nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos
Os resultados demonstraram aumento (Plt005) no diacircmetro dos nuacutecleos de
hepatoacutecitos dos peixes expostos ao Thiodanreg nas concentraccedilotildees de 115microgL-1 e
23microgL-1 quando comparados ao grupo controle no experimento sem aclimataccedilatildeosem
alimentaccedilatildeo Por outro lado foi registrada diminuiccedilatildeo (Plt005) do diacircmetro dos nuacutecleos
de hepatoacutecitos no experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo quando comparados
aos peixes expostos ao Thiodanreg na concentraccedilatildeo 115 e 23microgL-1 em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Tabela 5)
O diacircmetro do citoplasma apresentou aumento no experimento sem
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e no experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo com
diferenccedila (Plt005) registrada entre os peixes do grupos controles e expostos ao
agrotoacutexico com exceccedilatildeo do experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 23microgL-1 (Tabela 6) Entretanto houve diminuiccedilatildeo nos citoplasmas de
hepatoacutecitos nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo ao grupos controles (Plt005)
nos experimentos sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e no experimento com
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Tabela 6)
35 Quantificaccedilatildeo de nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos macroacutefagos e capilares
sanguiacuteneos no tecido hepaacutetico
Nas contagens de pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleos de hepatoacutecitos (Tabela 7)
foram observadas quantidades superiores nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo
45
aos grupos controles (Plt005) Na quantificaccedilatildeo dos citoplasmas de hepatoacutecitos foram
registradas contagens inferiores (Plt005) nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo
aos grupos controles exceto no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Tabela
8)
Na contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre macroacutefagos natildeo houve aumento
significativo (Pgt005) nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo ao controle (Tabela
9) Em relaccedilatildeo agrave contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre capilares sinusoides a
contagem foi igual na maioria dos peixes expostos ao agrotoacutexico quando comparados
com os controles apresentando diferenccedila significativa (Plt005) entre os grupos
expostos do experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo nas concentraccedilotildees de 115 e
56microgL-1 (Tabela 10)
36 Quantificaccedilatildeo do glicogecircnio hepaacutetico
Em todos os grupos controles e tratados nos diferentes experimentos foram
registrados valores meacutedios para o glicogecircnio variando entre 010 e 300 No
experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo no grupo tratado da concentraccedilatildeo de
56microgL-1 de Thiodanreg foi registrada a menor meacutedia (Tabela 11) No entanto houve
diferenccedila (Plt005) do glicogecircnio hepaacutetico na concentraccedilatildeo de 56microgL quando
comparada com as concentraccedilotildees de 115 e 23microgL-1 (Tabela 11 e Figura 1 D)
37 Iacutendice hepatossomaacutetico
As fecircmeas dos grupos experimentais expostos ao Thiodanreg natildeo apresentaram
diferenccedilas (Pgt005) nos valores do IHS quando comparados com os grupos controles
(Tabelas 12) Entretanto houve diferenccedila (Plt005) do IHS na concentraccedilatildeo de 56microgL-1
quando comparada com as concentraccedilotildees de 115 e 23microgL-1 no experimento sem
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Tabela 12)
4 DISCUSSAtildeO
No presente estudo o lambari apesar de ser de pequeno porte apresentou uma
CL50 de 1367microgL-1 em 96 horas sendo mais resistente que adultos de tilaacutepia niloacutetica
Musanhi (1987) determinou a CL50 96 48 e 24 horas de exposiccedilatildeo ao endosulfan para
tilaacutepia niloacutetica adulta encontrando valores de 142 380 e 103 microgL-1 Nas primeiras 24
horas de accedilatildeo do Thiodanreg nas concentraccedilotildees subletais de 115 23 e 56microgL-1 as
fecircmeas do presente estudo apresentaram comportamentos alterados assim como foi
46
observado na espeacutecie Danio rerio exposta ao endosulfan por 96 horas na concentraccedilatildeo
de 24microgL-1 aleacutem desta espeacutecie ter apresentado uma diminuiccedilatildeo do niacutevel de
acetilcolinesterase (AChE) (Pereira et al 2012) Por outro lado em estudo realizado
por Hernan da Cuntildea et al (2011) com a espeacutecie Cichlasoma dimerus exposta ao
endosulfan por 96 horas nas concentraccedilotildees de 025 1 2 3 4 e 16microgL-1 os peixes
exibiram comportamento indicativo de neurotoxicidade mas natildeo foram encontradas
diferenccedilas na atividade da AChE Estes estudos fornecem evidecircncias adicionais de
efeitos deleteacuterios da exposiccedilatildeo ao endosulfan sobre o sistema nervoso o que contribui
para as observaccedilotildees obtidas no presente estudo
As descriccedilotildees histoloacutegicas hepaacuteticas nas fecircmeas do presente estudo foram
semelhantes ao que foi caracterizado em outros peixes onde os hepatoacutecitos organizam-
se em fileiras ou cordotildees duplos em formato de placas representando um sistema de
fundo-cego anastomosado e de tuacutebulos ramificados (Metcalfe 1998 Hinton et al
2001)
A histologia e a fisiologia do fiacutegado satildeo similares nos vertebrados Ferguson
(1989) e Gingerich (1982) descrevem que existem algumas diferenccedilas estruturais
marcadas no parecircnquima hepaacutetico de peixes em especial pela ausecircncia de lobulaccedilatildeo
espaccedilo porta claacutessico e ausecircncia de zonaccedilatildeo no parecircnquima hepaacutetico o que permite
fluxo lento de sangue nos sinusoides com penetraccedilatildeo diminuiacuteda de quiacutemicos nos
hepatoacutecitos
A presenccedila de porccedilotildees pancreaacuteticas dentro do fiacutegado do lambari eacute descrita na
literatura (Santos et al 2013) Uma das funccedilotildees das ceacutelulas pancreaacuteticas distribuiacutedas
pelo fiacutegado eacute a produccedilatildeo da enzima de biotransformaccedilatildeo citocromo P450 diferente do
que eacute observado para mamiacuteferos onde esta enzima eacute ausente (Hahn et al 1994
Stegeman 1991) A presenccedila de ceacutelulas pancreaacuteticas em estruturas do tecido hepaacutetico
de A bimaculatus sugere a provaacutevel funccedilatildeo dessas ceacutelulas em auxiliar na
desintoxicaccedilatildeo Outra importante estrutura na detoxificaccedilatildeo eacute a presenccedila das ceacutelulas dos
endoteacutelios capilares nas quais tem sido confirmada e identificada a presenccedila de enzimas
citocromo P450 por meio de teacutecnicas de imunomarcaccedilatildeo (Lorenzana et al 1986)
Sendo assim a integridade estrutural dos capilares permanece intacta e sem
comprometimento das possiacuteveis funccedilotildees celulares que estas estruturas podem
desempenhar no tecido hepaacutetico de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
A ausecircncia de estagnaccedilatildeo biliar nos fiacutegados das fecircmeas de A bimaculatus eacute um
fator importante de que o Thiodanreg natildeo interferiu na fisiologia de excreccedilatildeo biliar nos
47
diferentes experimentos Histopatologicamente este tipo de alteraccedilatildeo eacute observado nos
citoplasmas dos hepatoacutecitos com a presenccedila de gracircnulos castanho-amarelados Esta
alteraccedilatildeo consiste na manifestaccedilatildeo fisiopatoloacutegica de uma condiccedilatildeo causada pela falta
de metabolismo e excreccedilatildeo biliar (Pacheco amp Santos 2002) uma vez que a bile
sintetizada pelos hepatoacutecitos permanece no interior das ceacutelulas natildeo sendo liberada para
o tubo digestivo (Simonato et al 2008) Este tipo de alteraccedilatildeo pode ser encontrado em
peixes expostos a toacutexicos (Pacheco amp Santos 2002) e tambeacutem em peixes que
apresentam algum problema nutricional quando satildeo mantidos em cativeiros (Langiano
amp Martinez 2008) No entanto no presente estudo natildeo foram registradas essas
evidecircncias o que sugere que a alimentaccedilatildeo nos grupos tratados com raccedilatildeo comercial de
todos os experimentos natildeo interferiu nas funccedilotildees biliares
Os agregados macrofaacutegicos estatildeo relacionados agrave quebra de eritroacutecitos (Herraez
amp Zapata 1986) apresentaccedilatildeo de antiacutegeno (Ellis 1980) armazenamento de ferro e
detoxicaccedilatildeo de substacircncias endoacutegenas e exoacutegenas (Herraez amp Zapata 1986) Hartley et
al (1996) propuseram a utilizaccedilatildeo do agregado macrofaacutegico como biomarcador de
poluiccedilatildeo aquaacutetica a partir da quantificaccedilatildeo destas estruturas Existem alguns estudos
comparativos em diferentes espeacutecies que tecircm demonstrado variaccedilotildees no nuacutemero
tamanho e pigmentaccedilatildeo destas estruturas em relaccedilatildeo agrave idade nutriccedilatildeo e estado de sauacutede
(Blazer et al 1987 Ferguson 1989 Agius et al 2003) Nos agregados podem ser
observados pigmentos do tipo lipofuscina ceroide hemossiderina e melanina (Wolke
1992 Wolf amp Wolfe 2005) mas no presente estudo natildeo foram evidenciadas nenhuma
destas estruturas
No fiacutegado das fecircmeas do grupo experimental sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
na maior concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve a presenccedila caracteriacutestica de acuacutemulos de
lipiacutedios nos hepatoacutecitos de dois peixes No entanto existem vaacuterias condiccedilotildees de
acuacutemulos de lipiacutedios nos hepatoacutecitos associados com a exposiccedilatildeo aos toacutexicos
(Thiyagarajah et al 1985 Biagianti-Risbourg et al 1995 Lumbertdacha et al 1995
Handy et al 1999 Fanta et al 2003) Glover et al (2007) submeteram o peixe salmatildeo
do Atlacircntico a dieta de 4microgkg de endosulfan por 14 e 35 dias sendo observadas
evidecircncias de lipidoses nos hepatoacutecitos O aparecimento destas estruturas nas fecircmeas de
A bimaculatus foi insignificante nos tecidos hepaacuteticos mas foram contabilizadas como
respostas individuais sugerindo uma disfunccedilatildeo hepaacutetica causada pelo Thiodanreg que
pode comprometer a fisiologia hepaacutetica destas fecircmeas
48
No presente estudo as frequecircncias de alteraccedilotildees morfoloacutegicas indicam que a
accedilatildeo toacutexica do Thiodanreg provocou uma distribuiccedilatildeo de lesotildees de incidecircncia leve a
moderada no tecido hepaacutetico nos diferentes experimentos sendo que nas maiores
concentraccedilotildees do toacutexico houve mais incidecircncias de alteraccedilotildees As alteraccedilotildees observadas
nos fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas isto eacute natildeo apresentaram necrose sendo que
a maioria das alteraccedilotildees satildeo de estaacutedios I e II com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico
As alteraccedilotildees histoloacutegicas tecircm sido relatadas em peixes expostos a ambientes poluiacutedos
(Braunbeck et al 1990 Takashima et al 1995 Schwaiger et al 1997) Da mesma
forma a frequecircncia das alteraccedilotildees pode indicar disfunccedilotildees induzidas por agentes
toacutexicos uma vez que aacutereas metabolicamente ativas do fiacutegado ficam reduzidas levando a
uma possiacutevel reduccedilatildeo geral nas funccedilotildees desempenhadas por este oacutergatildeo (Hinton amp
Laureacuten 1990 Oliveira Ribeiro et al 2002 Pacheco amp Santos 2002 Langiano amp
Martinez 2008) Este resultado sugere que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees
hepaacuteticas mesmo em concentraccedilotildees muito baixas nos diferentes experimentos
independentemente do peixe estar sendo alimentado ou natildeo
As alteraccedilotildees dos diacircmetros de nuacutecleos de hepatoacutecitos podem ser consideradas
resposta ao agente estressor sendo indicativo da ativaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica em
decorrecircncia do aumento da atividade metaboacutelica contra as condiccedilotildees adversas (Stephen
et al 1993 Takashima amp Hibyia 1995 Langiano amp Martinez 2008) Por outro lado a
diminuiccedilatildeo nuclear pode estar relacionada possivelmente com a multiplicaccedilatildeo de
hepatoacutecitos na reposiccedilatildeo de ceacutelulas lesadas em funccedilatildeo da multiplicaccedilatildeo celular (Gul et
al 2004) No trabalho realizado por Oliveira Ribeiro et al (2002) observaccedilotildees
qualitativas por microscopia de luz demonstraram diminuiccedilatildeo no diacircmetro dos nuacutecleos
de hepatoacutecitos na espeacutecie A bimaculatus com alimentaccedilatildeo controlada associada agrave
exposiccedilatildeo ao toacutexico tributiltin Este tipo de alteraccedilatildeo eacute um indicativo de processo
degenerativo celular uma vez que inicia com a condensaccedilatildeo e reduccedilatildeo do diacircmetro do
nuacutecleo (Oliveira Ribeiro et al 2002) No presente estudo as alteraccedilotildees nos diacircmetros
de nuacutecleo de hepatoacutecitos demostraram que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees
hepaacuteticas das fecircmeas
A hipertrofia dos hepatoacutecitos tambeacutem pode ser causada por contaminantes
(Arnold et al 1985) por mudanccedilas estruturais do hepatoacutecito relacionadas ao
funcionamento da ceacutelula (Hinton et al 1992) condiccedilotildees fisioloacutegicas ligadas agrave
reproduccedilatildeo (Wester et al 2003) e pela maior atividade metaboacutelica (Takashima amp
Hibyia 1995) Portanto o aumento do diacircmetro citoplasmaacutetico nos experimentos sem
49
adaptaccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e no experimento com adaptaccedilatildeosem alimentaccedilatildeo mesmo
natildeo apresentando caracteriacutestica de hipertrofia morfoloacutegica evidente mas morfomeacutetrica
sugere indiacutecios de maior metabolizaccedilatildeo pelos hepatoacutecitos nestes grupos experimentais
As alteraccedilotildees dos diacircmetros de citoplasmas dos hepatoacutecitos nos experimentos
demonstraram que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees hepaacuteticas
Na quantificaccedilatildeo de nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos nos diferentes
experimentos foram observados indiacutecios de proliferaccedilatildeo de hepatoacutecitos que pode ser
indicativo da accedilatildeo toacutexica dos hepatoacutecitos contra detoxificaccedilatildeo do Thiodanreg assim como
observado no trabalho por Gul et al (2004) O percentual do tecido hepaacutetico ocupado
por ceacutelulas do tipo hepatoacutecito variou entre 8742 a 9088 na constituiccedilatildeo do
parecircnquima hepaacutetico de A bimaculatus Poucos trabalhos citam a constituiccedilatildeo celular
em fiacutegados de peixes sendo 845 a 873 de hepatoacutecitos ocupando o parecircnquima
hepaacutetico na truta (Hampton et al 1989) e 899 no peixe Golden (Rocha et al 1997)
Estes valores demonstram que a maior parte das ceacutelulas dos fiacutegados nas fecircmeas de A
bimaculatus satildeo hepatoacutecitos como descrito em outras espeacutecies de peixes
O aumento da quantidade de macroacutefagos na concentraccedilatildeo 115microgL-1 dos
experimentos foi superior quando comparado aos demais grupos sugerindo que essa
mobilizaccedilatildeo pode estar ajudando na detoxicaccedilatildeo do fiacutegado (Herraez et al 1986)
Assim a presenccedila de maior quantidade de macroacutefagos e sinusoides podem ser
consideradas indicadoras de estresse em peixes decorrentes da presenccedila de agentes
quiacutemicos (Anderson amp Zeeman 1995 Rabitto et al 2005) Essas ceacutelulas satildeo
observadas frequentemente nas regiotildees proacuteximas aos sinusoides e desprovidas de
pigmentaccedilatildeo Foram observados macroacutefagos em trutas Oncorhynchus mykiss e Salmo
trutta fario na proporccedilatildeo de 02 e 07 respectivamente (Hampton et al 1985
Rocha et al 1997) enquanto no presente estudo variou entre 021 a 029 Meseguer
et al (1994) observaram macroacutefagos livres abundantes no parecircnquima do fiacutegado
sugerindo que estes se movem livremente dentro do parecircnquima formando os
agregados macrofaacutegicos quando haacute um aumento na atividade fagociacutetica como resposta
imune a lesotildees em indiviacuteduos expostos a contaminantes Entretanto no presente estudo
natildeo foram observadas estas caracteriacutesticas
Ainda vale ressaltar que esse toacutexico potencializa sua accedilatildeo em temperaturas mais
elevadas como aquelas observadas no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo
Estudando o efeito dos ciclodienos Correa et al (2001) Coutinho et al (2005) e
Capkin et al (2006) relataram que as alteraccedilotildees satildeo diretamente proporcionais agrave
50
temperatura da aacutegua ou seja quanto mais alta a temperatura mais toacutexicos os produtos
se tornam O experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
56microgL-1 registrou temperatura meacutedia da aacutegua em 269ordmC superior aos demais
experimentos Devido a isso uma resposta comum na intoxicaccedilatildeo em fiacutegados de peixes
eacute a diminuiccedilatildeo das reservas de glicogecircnio hepaacutetico (Seinen et al 1981 Ferguson 1989
Cyrino et al 2000) e iacutendice hepatossomaacutetico (Wester et al 1987 Wester et al 1988
Wester et al 2003 Glover et al 2007) evidenciada no presente estudo
No presente estudo percebeu-se que a accedilatildeo do Thiodanreg em concentraccedilotildees
subletais natildeo afetou o fiacutegado como um todo mas na forma de focos no parecircnquima
hepaacutetico nos diferentes experimentos Este tipo de lesatildeo pode estar associado agrave
concentraccedilatildeo do toacutexico utilizado tempo de exposiccedilatildeo e a via de contaminaccedilatildeo A
ventilaccedilatildeo branquial acelerada e a natildeo procura por alimentos nas primeiras 24 horas
observadas nos diferentes experimentos sugere que a entrada de aacutegua pela via branquial
foi a causa mais direta da absorccedilatildeo e difusatildeo do toacutexico para corrente sanguiacutenea ateacute
chegar ao fiacutegado No entanto a via epideacutermica tambeacutem poder ser considerada via de
entrada do toacutexico para os tecidos (Mckim et al 1999)
As alteraccedilotildees observadas nos fiacutegados podem afetar diretamente o metabolismo
das fecircmeas causando diminuiccedilatildeo da capacidade fisica e tornar os peixes uma presa faacutecil
para seus predadores Neste sentido os peixes poderatildeo ter menor sucesso reprodutivo e
se tornarem menos competitivos pelo alimento Do ponto de vista ecoloacutegico isso pode
acarretar alteraccedilotildees na populaccedilatildeo e na cadeia alimentar (Rodrigues amp Fanta 1998)
Nas condiccedilotildees que o estudo foi realizado como as concentraccedilotildees do inseticida
Thiodanreg que foram utilizadas o periacuteodo de exposiccedilatildeo e a espeacutecie de estudo conclui-se
que as fecircmeas podem estar em um processo inicial de intoxicaccedilatildeo um processo
patoloacutegico de recuperaccedilatildeo reversiacutevel
51
Figura 1 A Organizaccedilatildeo histoloacutegica do tecido hepaacutetico normal de A bimaculatus B Infiltrado leucocitaacuterio (IL) no tecido hepaacutetico de A bimaculatus C Hepatoacutecito com vesiacutecula clara (Vc) envolvida por glicogecircnio (G) marcado positivamente pela reaccedilatildeo de PAS e nuacutecleo (seta) deslocado na periferia da ceacutelula no experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo 56microgL-1 D Hepatoacutecito com ausecircncia de glicogecircnio evidenciada pela reaccedilatildeo negativa de PAS no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo 56microgL-1 Alteraccedilotildees de estaacutedio I - E Hepatoacutecito com nuacutecleo (seta) na perifieria F Atrofia nuclear (an) G Deformaccedilatildeo nuclear (dn) Nuacutecleo (N) e citoplasma (C) do hepatoacutecito sinusoacuteide (S) capilar (P) com hemaacutecias no interior acuacutemulo de glicogecircnio (G) no citoplasma e macroacutefagos (M) Barras A (30) B (65 microm) C e D (20 microm) E F e G (28 microm) Coloraccedilatildeo Azul de toluiacutedina em A-B e E-G e PAS em C e D
G S G
N
C
M
M
an
F E
Vc
IL G
B
C
A
D
G
dn
N
C
G
52
Dn
A
E
B
F
Figura 2 Alteraccedilotildees histoloacutegicas do tecido hepaacutetico de A bimaculatus Alteraccedilotildees de estaacutedio I-A Hipertrofia celular (seta) B Hipertrofia nuclear (seta) Alteraccedilotildees de estaacutedio II - C Degeneraccedilatildeo nuclear (Dn) D Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica (Dc) E Hiperemia () F Presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos (setas) Barras A B e E (30 microm) C D e F (25 microm) Coloraccedilatildeo Azul de toluiacutedina
C
A
Dc
D
53
Tabela 2 Valores meacutedios das temperaturas durante a realizaccedilatildeo dos experimentos
Tratamento Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Experimento 4 Controle 268plusmn105 254plusmn049 248plusmn069 250plusmn049
115mgL-1 271plusmn104 256plusmn059 247plusmn045 245plusmn040 23mgL-1 269plusmn117 255plusmn048 244plusmn062 247plusmn043 56mgL-1 269plusmn118 254plusmn048 244plusmn063 247plusmn038
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Legenda Experimento 1 - sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo Experimento 2 - sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo Experimento 3 - com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo Experimento 4 ndash com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
Tabela 3 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquantitativa das alteraccedilotildees
histoloacutegicas (VMA) em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 130 plusmn 020a 210 plusmn 030b 215 plusmn 019b 216 plusmn 011b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 130 plusmn 012a 190 plusmn 020b 190 plusmn 008aᵇ 228 plusmn 056b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 125 plusmn 012a 210 plusmn 021b 206 plusmn 017b 218 plusmn 027b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 130 plusmn 014a 200 plusmn 025b 221 plusmn 035b 228 plusmn 021b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 4 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquantitativa dos iacutendices das
alteraccedilotildees histoloacutegicas (IAH) em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 883plusmn1034a 1850plusmn1009aᵇ 2883plusmn832b 2566plusmn550aᵇ
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 433plusmn557a 2883plusmn 810b 2780plusmn1388b 2766plusmn571b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 566plusmn 585a 2600plusmn773b 2550plusmn1078b 2733plusmn920b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 750plusmn512a 2217plusmn780b 2033plusmn875b 2366plusmn880b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Duncan
54
Tabela 5 Diacircmetro meacutedio (microm) de nuacutecleos de hepatoacutecitos em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 461 plusmn 040aᶜ 498 plusmn 020b 487 plusmn 028b 439 plusmn 027c
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 516 plusmn 071a 501plusmn 040a 502 plusmn 020a 515plusmn025a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 494 plusmn 019a 496 plusmn 036a 492 plusmn 082a 508 plusmn 033a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 561 plusmn 044aᶜ 524 plusmn 040b ᶜ 509 plusmn 028b 533 plusmn 019c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 6 Diacircmetro meacutedio (microm) de citoplasmas de hepatoacutecitos de fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 885 plusmn 099a 1022 plusmn 109b 974 plusmn 080b 1005plusmn129b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1084 plusmn 136a 987 plusmn 153b 975 plusmn 081b 931 plusmn 080b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 960 plusmn 095a 1022 plusmn 094b 1003plusmn120aᵇ 1033 plusmn 108b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1086plusmn130aᵇ 104 plusmn 135b ᶜ 1022 plusmn 138c 1022 plusmn 106c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 7 Quantificaccedilatildeo meacutedia de nuacutecleos de hepatoacutecitos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 2553 plusmn 494a 298 plusmn 464b 284 plusmn 459b 291 plusmn 374b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 2371 plusmn 490a 289 plusmn 541b 289 plusmn 545b 290 plusmn 514b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 2560 plusmn 538a 294 plusmn 480b 286 plusmn 555b 293 plusmn 552b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 2770 plusmn 594a 314 plusmn 1028b 347 plusmn 664b ᶜ 322 plusmn 654c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
55
Tabela 8 Quantificaccedilatildeo meacutedia de citoplasmas no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 39551 plusmn 1056a 39666 plusmn 877a 39360 plusmn 1526a 40080 plusmn 727a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 39996 plusmn 1307a 39830 plusmn 722a 39618 plusmn 1143ab 38865 plusmn 1954b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 39603 plusmn 1755a 39011 plusmn 1620b 39445 plusmn 1388aᵇ 39205 plusmn 2212aᵇ
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 39381 plusmn 3025a 38555 plusmn 2723b 39036 plusmn 2275aᵇ 39136 plusmn 1892b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Tabela 9 Quantificaccedilatildeo meacutedia de macroacutefagos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2
de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 120 plusmn 113a 125 plusmn 089a 101 plusmn 100a 106 plusmn 094a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 101 plusmn 101a 124 plusmn 079a 102 plusmn 084a 131 plusmn 092a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 098 plusmn 089a 128 plusmn 097a 115 plusmn 095a 096 plusmn 090a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 101 plusmn 094a 128 plusmn 109a 086 plusmn 079a 101 plusmn 079a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Tabela 10 Quantificaccedilatildeo meacutedia de vasos sanguiacuteneos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 1875 plusmn 239a 133 plusmn 346a 1796 plusmn 1210a 1103 plusmn 465a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1603 plusmn 784aᵇ 1260 plusmn 532a 1409 plusmn 631aᵇ 2203 plusmn 685b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 1830 plusmn 579a 2036 plusmn 773a 1681 plusmn 560a 1865 plusmn 964a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1850 plusmn 1400a 1831 plusmn 1326a 1510 plusmn 774a 1645 plusmn 739a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
56
Tabela 11 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquatitativa de glicogecircnio nos hepatoacutecitos de fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 133 plusmn 051aᵇ 266 plusmn 081a 300 plusmn 000a 010plusmn 010b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 133 plusmn 051a 180 plusmn 109a 200 plusmn 109a 233 plusmn 103a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 216 plusmn 098a 116 plusmn 040a 216 plusmn 098a 233 plusmn 103a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 266 plusmn 081a 233 plusmn 103a 233 plusmn 103a 216 plusmn 098a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis Tabela 12 Iacutendice hepatossomaacutetico de fecircmeas de lambaris A bimaculatus nos grupos
controles e grupos expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 070 plusmn 014aᵇ 088 plusmn 03a 084 plusmn 038a 038 plusmn 031b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 113 plusmn 054a 104 plusmn 061a 102 plusmn 050a 102 plusmn 051a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 066 plusmn 029a 073 plusmn 020a 092 plusmn 017a 091 plusmn 012a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 074 plusmn 034a 072 plusmn 029a 094 plusmn 040a 063 plusmn 018a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Duncan
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62
52 CAPIacuteTULO 2
EFEITOS DO INSETICIDA THIODAN reg SOBRE A MORFOLOGIA DO
DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM LAMBARIS Astyanax bimaculatus
RESUMO
O Thiodanreg eacute um toacutexico que pode causar alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos tecidos de peixes
expostos dependendo da concentraccedilatildeo A fim de investigar possiacuteveis alteraccedilotildees este
estudo avaliou a morfologia ovariana de lambaris Astyanax bimaculatus expostos ao
Thiodanreg (endosulfan 350gL) por 96 horas em quatro diferentes experimentos com trecircs
concentraccedilotildees subletais 115 23 e 56 microgL As fecircmeas expostas ao Thiodanreg foram
divididas em quatro experimentos sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem
aclimataccedilatildeo e alimentados com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e com
aclimataccedilatildeo de 10 dias e alimentados No presente estudo percebeu-se que a accedilatildeo do
Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou a morfologia do desenvolvimento
folicular Poreacutem os experimentos com aclimataccedilatildeo demonstraram quantidades
inferiores de foliacuteculos primaacuterios e secundaacuterios quando comparados aos peixes dos
experimentos sem aclimataccedilatildeo Houve maior quantidade de foliacuteculos atreacutesicos nos
grupos expostos ao Thiodanreg em relaccedilatildeo ao grupo controle O diacircmetro folicular nos
foliacuteculos secundaacuterios dos peixes expostos ao Thiodanreg no experimento com
adaptaccedilatildeocom alimentaccedilatildeo foi maior em relaccedilatildeo ao grupo controle Aleacutem disso as
meacutedias dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS) e hepatossomaacutetico (IHS) dos experimentos
com aclimataccedilatildeo foram inferiores aos experimentos sem aclimataccedilatildeo Esses dados
sugerem que o eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-ovaacuterio pode estar sendo afetado pelo ambiente
ao qual o peixe foi submetido podendo causar comprometimento na fisiologia do
desenvolvimento folicular
Palavras-chave histopatologia ovaacuterio peixe contaminaccedilatildeo aquaacutetica
63
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 α-endosulfan e 30 β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo
por meio da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em riscos os organismos que ali
residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al 2007)
Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos como jaacute
observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis niloticus
No entanto a Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan em
gordura valores de 005mgkg-1 (EPA 2002) e para aacutegua doce 022microgL-1 (EPA 1980)
A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em consideraccedilatildeo a
qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente Resoluccedilatildeo
CONAMA - nordm 3572005 estabelece o valor limite de 0056gL de resiacuteduo do referido
inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
Muitos inseticidas apresentam baixa toxicidade antes de serem transformados
em substacircncias toacutexicas metabolicamente ativas O sulfato de endosulfan eacute um dos
produtos derivados do metabolismo do endosulfan sendo considerado o principal
metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica por ser mais estaacutevel no meio
ambiente do que em sua foacutermula original (Ali et al 1984) A sensibilidade ao
endosulfan em organismos aquaacuteticos tem sido descrita na literatura (Capkin et al 2006
Ballesteros et al 2007 Pereira et al 2012) O produto eacute extremamente toacutexico para os
peixes e outros organismos aquaacuteticos mesmo em concentraccedilotildees muito pequenas
(Cengiz et al 2001) como verificado tambeacutem por Ballesteros et al (2007) com peixes
adultos da espeacutecie Jenynsia multidentata sob o efeito do endosulfan por 96 horas
utilizando concentraccedilotildees de 072 μgL e 131 μgL em machos e fecircmeas
respectivamente
Em peixes o desenvolvimento folicular tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Begovac amp Wallace 1988 Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter
1996 Grier 2000 2002 e 2007) e como nos animais em geral compreende os periacuteodos
preacute-meioacutetico perinucleolar vitelogecircnico e maturaccedilatildeo final Estas fases ocorrem no
64
interior de foliacuteculos cuja parede eacute constituiacuteda por zona radiata camada folicular
membrana basal e teca (Grier 2000) e que desempenham importante papel durante a
ovogecircnese e fertilizaccedilatildeo Quando a qualidade da aacutegua eacute alterada devido a xenobioacuteticos
a gametogecircnese pode ser alterada comprometendo a fertilizaccedilatildeo e a qualidade do ovo
(Chatterjee et al 1997) Assim os peixes quando expostos a inseticidas podem
apresentar alteraccedilotildees morfoloacutegicas significativas no ovaacuterio
Alguns trabalhos mostram diversas alteraccedilotildees provocadas nos foliacuteculos por
contaminantes como por exemplo retraccedilatildeo citoplasmaacutetica degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica
adesatildeo folicular aparecimento de foliacuteculos anucleados necrose e alteraccedilatildeo no diacircmetro
dos foliacuteculos (Hazarika amp Das 1998 Dutta et al 2003 Maxwell amp Dutta 2005) Aleacutem
disso pode ocorrer a atresia folicular que eacute um processo frequentemente observado nos
ovaacuterios dos vertebrados (Saidapur 1978) sendo causada por diversos fatores como
agrotoacutexicos temperatura luz alimentaccedilatildeo inadequada e confinamento (Nagahama
1983 Guraya 1986) Outro fator importante eacute a concentraccedilatildeo hormonal que pode
interferir na siacutentese de vitelogenina e causar efeitos negativos associados com a
quantidade de foliacuteculos preacute-vitelogecircnicos e vitelogecircnicos durante o desenvolvimento
folicular (Chatterjee et al 1997) No entanto alteraccedilotildees no estado de sauacutede provocadas
por concentraccedilotildees de contaminamtes que natildeo matam os peixes em curto prazo e que
podem ser consideradas seguras podem sugerir consequecircncias na reproduccedilatildeo e
interferecircncia na cadeia alimentar Esse tipo de estudo eacute de grande importacircncia para se
avaliar impactos provocados por diferentes tratamentos sobre o desenvolvimento de
foliacuteculos que poderiam interferir na reproduccedilatildeo de peixes
O lambari Astyanax bimaculatus foi escolhido como organismo experimental
pois eacute representativo no ecossistema sendo encontrado desde Nordeste brasileiro ateacute a
bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Eacute um peixe de pequeno porte e
de faacutecil manutenccedilatildeo em laboratoacuterio
Este estudo teve como objetivo analisar as alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos
diferentes estaacutedios do desenvolvimento folicular em ensaios subletais com o toacutexico
Thiodanreg
65
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste subletal e as atividades de coleta As etapas
de fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos ovaacuterios microtomia coloraccedilatildeo de lacircminas
histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e morfomeacutetricas foram realizadas nos
Laboratoacuterios de Biologia de Peixes e de Histopatologia do Departamento de Veterinaacuteria
da UFV
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos animais em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado e poro genital
dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV e
mantidos em aquaacuterios com capacidade de 50 litros numa densidade de 05g de peixe por
litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro temperatura controlada e monitoramento
duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e
aeraccedilatildeo continua de aacutegua para garantir o bem-estar dos peixes Os peixes foram
alimentados com raccedilatildeo comercial Purina contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia
de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
66
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste de toxicidade subletal em sistema estaacutetico
O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi realizado utilizando-se 120
lambaris tendo por base as normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico (NBR 15088
- ABNT 2007)
As fecircmeas foram expostas ao Thiodanreg (endosulfan 350gL) por 96 horas em
quatro diferentes experimentos sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem aclimataccedilatildeo e
com alimentaccedilatildeo com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e com aclimataccedilatildeo de
10 dias e com alimentaccedilatildeo Foram utilizadas trecircs concentraccedilotildees do Thiodanreg inferiores
agrave CL50 preacute-determinada (137microgL) em laboratoacuterio de acordo com a NBR 15088
(ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas em cada experimento foram de 115 23 e
56microgL-1 aleacutem de um grupo controle sem toacutexico com trecircs repeticcedilotildees nas mesmas
condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
24 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas
Apoacutes 96 horas de experimento foram coletados 96 peixes sendo seis animais de
cada grupo nos diferentes experimentos Os ovaacuterios foram coletados apoacutes os peixes
terem sido anestesiados com benzocaiacutena (110000) e eutanasiados pela secccedilatildeo
transversal da coluna vertebral na regiatildeo do opeacuterculo
Para a histologia os ovaacuterios foram fixados em paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo
fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedos em resina glicolmetacrilato (Leica
Historesin) Em seguida secccedilotildees 3microm de espessura foram coradas utilizando
hematoxilinaeosina para anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas As lacircminas foram
montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e
as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
Para os estudos morfoloacutegicos foram analisadas lacircminas de seis animais por
concentraccedilatildeo As secccedilotildees histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo em busca
de alteraccedilotildees morfoloacutegicas foliculares (Tabela 1) que pudessem ser representativas da
67
accedilatildeo do Thiodanreg no tecido ovariano sempre comparando estas alteraccedilotildees com o
padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios das lacircminas dos grupos controles
Para a avaliaccedilatildeo morfomeacutetrica foram realizadas contagens dos diferentes
estaacutedios de desenvolvimento folicular Para isto foram fotografados ao acaso 10
campos com objetiva de 10X (cada campo com 5094 microm de largura por 6812 microm de
comprimento totalizando uma aacuterea de 347 mmsup2) As contagens foram realizadas em 10
campos escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro experimentos Aleacutem disso foi
realizada a contagem de foliacuteculos atreacutesicos e observados eosinoacutefilos associados aos
foliacuteculos vitelogecircnicos utilizando o microscoacutepio com objetiva de 40X em 10 foliacuteculos
escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro tratamentos experimentais Tambeacutem
foram realizadas mediccedilotildees de diacircmetros em 10 foliacuteculos vitelogecircnicos para cada animal
Foram escolhidos foliacuteculos o mais esfeacutericos possiacutevel com corte passando pelo nuacutecleo
Estas medidas foram obtidas por meio do programa Image-Pro Plus traccedilando-se duas
linhas perpendiculares sobre nuacutecleo e respeitando-se os limites do foliacuteculo Em todas as
contagens e mediccedilotildees foram calculados os valores meacutedios e desvios-padratildeo para cada
concentraccedilatildeo para se avaliar o desenvolvimento folicular nos diferentes experimentos
Tabela 1 Alteraccedilotildees histoloacutegicas quanto ao comprometimento do desenvolvimento folicular (adaptado de Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS FOLICULARES Alteraccedilatildeo nos foliacuteculos Descolamento do revestimento folicular Retraccedilatildeo citoplasmaacutetica Retraccedilatildeo nuclear Atresia folicular Aglutinaccedilatildeo nucleoplasmaacutetica Aglutinaccedilatildeo citoplasmaacutetica Aglutinaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo Foliacuteculos com ausecircncia de citoplasma e nuacutecleo Granuloacutecitos envolvendo foliculos
25 Paracircmetros biomeacutetricos
Foram registrados para cada exemplar os seguintes dados biomeacutetricos peso
corporal (PC em g) peso dos ovaacuterios (PO em g) e peso do fiacutegado (PF em g) Os
valores meacutedios e os desvios padratildeo dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS=POx100PC) e
68
hepatossomaacutetico (IHS=PFx100PC) foram calculados para cada animal em cada um
dos grupos nos diferentes experimentos
26 Anaacutelises estatiacutesticas
Os dados foram apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo e avaliados pelo
Software Statistica 70 por meio da anaacutelise de variacircncia (ANOVA) Apoacutes o teste de
distribuiccedilatildeo normal os dados foram comparados entres os grupos controle e grupos
expostos ao Thiodanreg usando anaacutelise de variacircncia one-way seguida do teste de Tukey
ou Duncan Quando os dados natildeo apresentaram uma distribuiccedilatildeo normal foi utilizado o
teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis Plt005 foi utilizado como criteacuterio de
significacircncia
3 RESULTADOS
31 Desenvolvimento folicular
O desenvolvimento folicular de A bimaculatus do presente estudo foi dividido em
duas etapas desenvolvimento primaacuterio e desenvolvimento secundaacuterio
Para facilitar a compreensatildeo o desenvolvimento primaacuterio em A bimaculatus foi
subdividido em dois estaacutedios desenvolvimento primaacuterio inicial e desenvolvimento
primaacuterio avanccedilado (Figuras 1 A e B) No desenvolvimento primaacuterio inicial os foliacuteculos
apresentaram citoplasma fortemente basoacutefilo nuacutecleo esfeacuterico um ou mais nucleacuteolos
dispersos pelo nucleoplasma e estavam envoltos por ceacutelulas foliculares pavimentosas
(Figura 1 A) Durante o desenvolvimento primaacuterio avanccedilado o citoplasma do foliacuteculo
torna-se menos basoacutefilo que a etapa anterior o nuacutecleo eacute esfeacuterico um ou mais nucleacuteolos
dispersos que estatildeo associados ao envoltoacuterio nuclear (Figura 1 B) A camada de ceacutelulas
foliculares eacute pavimentosa com o nuacutecleo alongado Entre as ceacutelulas foliculares e o
citoplasma do foliacuteculo aparece a zona radiata como uma fina camada (Figura 1 B) Na
regiatildeo mais externa do foliacuteculo aparecem associadas ao mesmo as ceacutelulas da teca
O desenvolvimento secundaacuterio em A bimaculatus foi subdividido em trecircs
estaacutedios desenvolvimento secundaacuterio inicial desenvolvimento intermediaacuterio e
desenvolvimento avanccedilado No desenvolvimento secundaacuterio inicial o volume
citoplasmaacutetico aumentou mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo e o foliacuteculo neste estaacutedio
apresentou um diacircmetro maior que o estaacutedio anterior O nuacutecleo eacute central ligeiramente
acidoacutefilo com nucleacuteolos pequenos e dispersos pelo nucleoplasma O citoplasma eacute
69
granular e fracamente basoacutefilo com a presenccedila de vesiacuteculas corticais pequenas e claras
na periferia do citoplasma (Figura 1 C) Em seguida ocorre um aumento no diacircmetro do
foliacuteculo e inicia-se a deposiccedilatildeo de vitelo a partir da regiatildeo perifeacuterica o que permitiu
classificar esse estaacutedio como desenvolvimento secundaacuterio intermediaacuterio (Figura 1 D)
No estaacutedio de desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado o volume citoplasmaacutetico
aumentou mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo tendo o foliacuteculo neste estaacutedio um diacircmetro maior
quando comparado aos estaacutedios anteriores Nessa etapa do desenvolvimento o
citoplasma do foliacuteculo estaacute preenchido com gloacutebulos de vitelo (Figura 1 D) A
maturaccedilatildeo final eacute caracterizada pela formaccedilatildeo do aparelho micropilar zona radiata
espessa e nuacutecleo deslocado em direccedilatildeo ao aparelho micropilar
Os foliacuteculos ovarianos dos lambaris apresentaram morfologia normal nas
diferentes concentraccedilotildees de Thiodanreg (Figuras 1 A-D)
32 Atresia folicular
A atresia folicular foi caracterizada em trecircs diferentes etapas nos ovaacuterios de A
bimaculatus atresia inicial intermediaacuteria e avanccedilada A atresia folicular inicial eacute
caracterizada pela descontinuidade da zona radiata e hipertrofia das ceacutelulas foliculares
(Figura 2 A) Nesse momento da atresia folicular foram evidenciadas ceacutelulas do tipo
granuloacutecito entre a membrana basal e ceacutelulas da teca na maioria dos foliacuteculos
observados (Figura 2 B) Na sequecircncia do processo atresia folicular intermediaacuteria
ocorre o iniacutecio da fusatildeo e liquefaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo desintegraccedilatildeo e
fragmentaccedilatildeo da zona radiata hipertrofia das ceacutelulas foliculares que se tornam
vacuolizadas e contecircm material granular de aspecto similar aos gloacutebulos de vitelo e
invasatildeo do citoplasma pelas ceacutelulas foliculares (Figura 2 C) Na atresia avanccedilada as
ceacutelulas foliculares absorvem os resiacuteduos finais do foliacuteculo levando a uma diminuiccedilatildeo
do tamanho do foliacuteculo atreacutesico (Figura 2 D)
33 Quantificaccedilatildeo dos foliacuteculos ovarianos
A quantidade de foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio inicial entre as fecircmeas
do mesmo experimento natildeo mostrou diferenccedilas entre si (Pgt005) (Figura 3) Quando
foram comparados os diferentes experimentos nos mesmos grupos foi registrada maior
quantidade de foliacuteculos primaacuterios iniciais nas fecircmeas do grupo controle do experimento
com aclimataccedilatildeoalimentaccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo agraves fecircmeas dos grupos controle dos
70
experimentos sem aclimataccedilatildeo (Figura 3) Aleacutem disso foi observada maior quantidade
de foliacuteculos primaacuterios iniciais na concentraccedilatildeo de 23microgL do experimento com
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo em relaccedilatildeo ao experimento sem aclimataccedilatildeocom
alimentaccedilatildeo (Plt005) (Figura 3)
Na contagem de foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado entre fecircmeas
do mesmo experimento natildeo houve diferenccedilas nas meacutedias obtidas (Figura 4) No entanto
quando comparados os mesmos grupos entre os diferentes experimentos verificou-se
que no estaacutedio de desenvolvimento primaacuterio avanccedilado houve maior quantidade de
foliacuteculos no grupo controle do experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Plt005)
em relaccedilatildeo ao experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo assim como no
experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Figura 4) Quando comparados os
grupos da concentraccedilatildeo 115microgL registrou-se maior quantidade de foliacuteculos no
experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo ao experimento
sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Figura 4) Entre as fecircmeas dos grupos da
concentraccedilatildeo 23microgL foi registrada maior quantidade de foliacuteculos nos experimentos
com aclimataccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo agraves fecircmeas dos experimentos sem aclimataccedilatildeo
(Figura 4)
Na contagem de foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio inicial nas fecircmeas do
experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo houve maior quantidade de foliacuteculos na
concentraccedilatildeo 56microgL (Plt005) em relaccedilatildeo agrave concentraccedilatildeo de 115microgL (Figura 5) mas
natildeo com o controle Ao comparar as fecircmeas dos diferentes experimentos dos mesmos
grupos houve maior quantidade de foliacuteculos secundaacuterios iniciais (Plt005) na
concentraccedilatildeo 115microgL do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e
experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo em relaccedilatildeo ao experimento sem
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Figura
5)
Em relaccedilatildeo as contagens de foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio
intermediaacuterio e avanccedilado natildeo houve diferenccedilas entre as fecircmeas (Pgt005) (Figuras 6 e 7)
34 Quantificaccedilatildeo dos foliacuteculos atreacutesicos
Nas contagens de foliacuteculos atreacutesicos iniciais nas fecircmeas de A bimaculatus dos
diferentes experimentos natildeo foram constatadas diferenccedilas (Pgt005) (Figura 8) As
contagens de atresia total representaram as somas das contagens de atresias inicial
intermediaacuteria e avanccedilada As contagens de atresia total natildeo mostraram diferenccedilas nos
71
experimentos embora o nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos mostrasse tendecircncia crescente
nos grupos tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos (Figura 9) Entretanto
foi observado maior nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos nas fecircmeas dos experimentos com
aclimataccedilatildeo de 10 dias em relaccedilatildeo aos experimentos sem aclimataccedilatildeo (Figura 9)
35 Diacircmetro dos foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado
Os valores meacutedios nos diacircmetros dos foliacuteculos secundaacuterio avanccedilado nas fecircmeas
do experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo demonstraram aumento (Plt005) nas
concentraccedilotildees 115microgL (57837plusmn5977microm) e 56microgL (57311plusmn6178microm) de Thiodanreg
em relaccedilatildeo agraves fecircmeas do grupo controle (51606plusmn5757 microm) Nos demais experimentos
natildeo foram registradas diferenccedilas entre os foliacuteculos (Pgt005) apesar de ter sido
observado na maioria dos grupos essa mesma tendecircncia de aumento do diacircmetro dos
foliacuteculos (Tabela 2)
36 Paracircmetros biomeacutetricos
As fecircmeas de A bimaculatus dos grupos expostos ao Thiodanreg natildeo apresentaram
diferenccedilas (Pgt005) nos valores dos IGS e IHS quando comparados com os grupos
controles (Tabelas 3 e 4) No entanto as fecircmeas dos experimentos com aclimataccedilatildeo
apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores dos IGS e IHS quando comparados aos
experimentos sem aclimataccedilatildeo (Tabelas 3 e 4)
4 DISCUSSAtildeO
Em peixes teleoacutesteos o tipo de desenvolvimento folicular pode ser assincrocircnico
com a presenccedila de foliacuteculos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento (Nagahama
1983 Connaughton et al 1998 Selman et al 1986) assim como na presente espeacutecie
deste estudo Os ovaacuterios das fecircmeas de A bimaculatus submetidas ao efeito do
Thiodanreg apresentaram foliacuteculos ovarianos em diferentes fases de desenvolvimento com
variaccedilotildees na estrutura do foliacuteculo como diacircmetro caracteriacutesticas do nuacutecleo camadas
envoltoacuterias composiccedilatildeo e distribuiccedilatildeo do vitelo conforme observado em outras
espeacutecies do gecircnero (Miranda 1996 Miranda et al 1999 Melo et al 2005 Mazzoni et
al 2005 Rodrigues et al 2005 Hernan Da Cuntildea et al 2011)
Ao contraacuterio do presente estudo Dutta et al (2008) ao submeterem as fecircmeas da
espeacutecie Lepomis macrochirus a trecircs concentraccedilotildees diferentes (025 075 e 1 microgL) de
endosulfan observaram comprometimento do desenvolvimento folicular com retraccedilatildeo
72
nuclear e citoplasmaacutetica na menor concentraccedilatildeo enquanto nos foliacuteculos em maturaccedilatildeo
avanccedilada foi observado um aspecto vazio sem conteuacutedo citoplasmaacutetico na
concentraccedilatildeo de 075 microgL Aleacutem disso na concentraccedilatildeo de 1microgL os autores
encontraram maior grau de deformaccedilotildees com foliacuteculos vazios sem a presenccedila de
foliacuteculos ou alteraccedilotildees do nuacutecleo e perda do material nuclear que eacute relatado como
necrose nuclear No trabalho conduzido por Chartterjee et al (1997) foi avaliada a accedilatildeo
do carbofuram no desenvolvimento folicular na espeacutecie Heteropneustes fossilis
encontrando-se degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica e na camada folicular de foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio Entretanto Hernan Da Cuntildea et al (2011) natildeo
observaram alteraccedilotildees nos ovaacuterios em peixes expostos ao endosulfan No estudo
realizado por Ballesteros et al (2007) utilizando peixes machos e fecircmeas da espeacutecie
Jenynsia multidentata foi verificado que o maior teor de lipiacutedeos nas fecircmeas eacute um fator
importante para esclarecer a maior resistecircncia contra o endosulfan ao contraacuterio dos
machos que satildeo mais suceptiacuteveis neste caso De acordo com este resultado descrito na
literatura pode-se inferir que este fator poder ter interferido na maior resistecircncia das
fecircmeas de A bimaculatus em periacuteodo reprodutivo agraves concentraccedilotildees de Thiodanreg
testadas
Alguns estudos tecircm esclarecido a interferecircncia de poluentes na quantidade de
foliacuteculos nos diferentes estaacutedios do desenvolvimento folicular em peixes Os trabalhos
de Chartterjee et al (1997) Jensen et al (2004) Dutta amp Dalal (2008) e Chakrabarty et
al (2012) avaliaram os efeitos de pesticidas encontrando maior quantidade de foliacuteculos
primaacuterios no grupo tratado em relaccedilatildeo ao grupo controle assim como em peixes
mantidos em cativeiros (Honji et al 2009) Em outro estudo (Chatterjee et al 2001) os
pesquisadores encontraram por meio de anaacutelises histoloacutegicas da hipoacutefise a
possibilidade do carbofuran afetar as ceacutelulas produtoras de GnRH do hipotaacutelamo
prejudicando o eixo hipoacutefise-gocircnada e comprometendo a viabilidade no
desenvolvimento folicular jaacute Chakrabarty et al (2012) verificaram em peixes tratados
com endosulfan concentraccedilatildeo inferior de GnRH e superior da aromatase quando
comparados com o gurupo controle caracterizando que o endosulfan pode atuar como
disruptor endoacutecrino (Lemaire et al 2006) que pode aumentar a biossiacutentese do estradiol
para promover um raacutepido desenvolvimento folicular (Chakrabarty et al 2012) Estes
resultados podem ajudar a esclarecer os resultados do presente trabalho onde se
observou maior quantidade de foliacuteculos primaacuterios iniciais e primaacuterios avanccedilados nos
experimentos com aclimataccedilatildeo quando comparados com os experimentos sem
73
aclimataccedilatildeo sugerindo uma possiacutevel desregulaccedilatildeo endoacutecrina no eixo hipoacutefise-gocircnada
nos peixes aclimatados em aquaacuterios por 10 dias Aleacutem disso as concetraccedilotildees hormonais
e enzimaacuteticas relacionadas ao desenvolvimento folicular podem estar supostamente
alteradas em A bimaculatus mas satildeo necessaacuterios estudos fisioloacutegicos para essa
provaacutevel confirmaccedilatildeo
O processo de atresia folicular no lambari A bimaculatus foi semelhante ao
descrito por Miranda et al (1999) Munoz et al (2002) Melo et al (2005) e Santos et
al (2005) O processo da atresia que ocorre nos foliacuteculos secundaacuterios eacute do tipo
hipertroacutefico devido agrave hipertrofia e hiperplasia das ceacutelulas foliculares (Vizziano amp
Berois 1990) No trabalho realizado por Coward amp Bromage (1998) na espeacutecie Tilapia
zilli foi verificado aumento de foliacuteculos atreacutesicos em experimento com duraccedilatildeo entre 18
e 26 dias assim como verificado no trabalho de Jensen et al (2004) quando utilizaram a
substacircncia flutamida De acordo com estes autores isto pode reduzir a fecundidade e
tambeacutem influenciar na qualidade do foliacuteculo Linares-Casenave et al (2002) explicam
que o processo de atresia estaacute associado com desregulaccedilatildeo das concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de estradiol testosterona e vitelogenina Portanto o aumento da quantidade
dos foliacuteculos atreacutesicos nos grupos expostos ao Thiodanreg e a maior quantidade de atresia
nos experimentos com aclimataccedilatildeo mesmo natildeo apresentando diferenccedilas estatiacutesticas
sugerem que pode estar iniciando desregulaccedilatildeo hormonal nestes peixes
A presenccedila de granuloacutecitos associados aos foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados em
lambari A bimaculatus nos diferentes experimentos pode ser associada agrave reaccedilatildeo
imunoloacutegica em conjunto com as ceacutelulas foliculares assim como observado por alguns
autores (Drummond et al 2000 Santos et al 2005 Santos et al 2008) Aleacutem disso no
trabalho realizado por Santos et al (2008) foi detectada a presenccedila de proliferaccedilatildeo
celular (PCNA) nas ceacutelulas da teca de foliacuteculos em processo de atresia confirmando
que estas ceacutelulas podem estar se preparando para o processo de remodelaccedilatildeo ovariana
No entanto essas evidecircncias de granuloacutecitos associados aos foliacuteculos estatildeo de acordo
com o que jaacute foi observado em outros trabalhos caracterizando um processo fisioloacutegico
importante na regressatildeo folicular das fecircmeas de A bimaculatus expostas ao Thiodanreg
O diacircmetro dos foliacuteculos vitelogecircnicos eacute espeacutecie-especiacutefico poreacutem o Thiodanreg
alterou o diacircmetro folicular no experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo Esta
alteraccedilatildeo do diacircmetro que leva os foliacuteculos vitelogecircnicos a atingirem a maturaccedilatildeo pode
ser causada pelas diferenccedilas nas concentraccedilotildees de vitelogenina estradiol e aromatase
(Jensen et al 2004 Corriero et al 2007 Chakrabarty et al 2012) ou a mesma sendo
74
ligada aos receptores especiacuteficos nos foliacuteculos (Patintildeo amp Sullivan 2002 Bugel et al
2010) Bugel et al (2010) relataram a diminuiccedilatildeo da expressatildeo da vitelogenina no peixe
Fundulus heteroclitus em rio contaminado com pesticidas orgacircnicos persistentes o que
resultou na diminuiccedilatildeo da quantidade de foliacuteculos vitelogecircnicos enquanto Honji et al
(2009) relataram a baixa fecundidade e aumento do diacircmetro dos foliacuteculos nos peixes
Salminus hilari mantidos em cativeiro quando comparados com peixes de ambientes
naturais Contudo eacute necessaacuterio estudar as vias que conduzem a esta alteraccedilatildeo Estes
resultados mostram que diferentes vias podem afetar a reproduccedilatildeo dos peixes e que o
Thiodanreg pode estar agindo como desregulador endoacutecrino nos foliacuteculos secundaacuterios
avanccedilados de A bimaculatus
O IGS e IHS podem variar entre os peixes devido agraves diferenccedilas na sensibilidade
frente agrave exposiccedilatildeo a contaminantes periacuteodo reprodutivo e peixes mantidos em cativeiro
(Chatterjee et al 1997 Cyrino et al 2000 Jensen et al 2004 Honji et al 2009) No
entanto o fato das meacutedias dos IGS e IHS nos experimentos com aclimataccedilatildeo terem sido
menores quando comparadas com os experimentos sem aclimataccedilatildeo sugere associaccedilatildeo
entre quantidade inferior de foliacuteculos secundaacuterios e quantidade superior de atresia nos
experimentos com aclimataccedilatildeo assim como no trabalho de Chatterjee et al (1997) e
Bugel et al (2010) que verificaram diminuiccedilatildeo na taxa de foliacuteculos vitelogecircnicos e
IGS
A ventilaccedilatildeo branquial acelerada e a natildeo procura por alimentos nas primeiras 24
horas observadas nos diferentes experimentos sugere que a entrada de aacutegua pela via
branquial foi causa direta da absorccedilatildeo e difusatildeo do toacutexico no organismo No entanto a
via epideacutermica tambeacutem poder ser considerada via de entrada do toacutexico para os tecidos
(Mckim et al 1999) Portanto a exposiccedilatildeo dos peixes ao Thiodanreg e a aclimataccedilatildeo
foram fatores mais que afetaram o diacircmetro e a quantidade de foliacuteculos em A
bimaculatus Conforme as condiccedilotildees em que o estudo foi realizado levando-se em
consideraccedilatildeo as concentraccedilotildees do inseticida Thiodanreg utilizadas periacuteodo de exposiccedilatildeo e
espeacutecie de estudo demonstram que as fecircmeas analisadas podem estar em processo
inicial de intoxicaccedilatildeo com possiacutevel alteraccedilatildeo fisioloacutegica
75
A
opa
opi opa
vs
D
osint
osa
osa
gv gv
gv
osi
C
B
opa
opa
zr
vc
Figura 1 Desenvolvimento folicular ovariano de Astyanax bimaculatus A Estroma ovariano com foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio inicial (opi) e primaacuterio avanccedilado (opa) B Foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (opa) com ceacutelulas foliculares pavimentosas e zona radiata delgada (zr) C Foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio inicial (osi) possuindo ceacutelulas foliculares pavimentosas com zona radiata espessa (zr) e vesiacuteculas corticais claras (vc) na periferia do foliacuteculo D Foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio intermediaacuterio iniciando deposiccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo (osint) e foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (osa) com gloacutebulos de vitelo (gv) por todo o citoplasma vs vaso sanguiacuteneo Coloraccedilatildeo Hematoxilina-eosina Barra A e B (50 m) C (30 m) D (100 m)
zr
76
ai
gr gr
zr
h
av
A
ait
Figura 2 Foliacuteculos ovarianos de Astyanax bimaculatus em atresia A Atresia folicular inicial (ai) caracterizada pela quebra da zona radiata (zr) hipertrofia de ceacutelulas foliculares (cf) e presenccedila de granuloacutecitos (gr) B Detalhe de granuloacutecito (gr) sobre a regiatildeo de ceacutelulas foliculares C Atresia folicular intermediaacuteria (ait) caracterizada pela liquefaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo (gv) desintegraccedilatildeo da zona radiata e invasatildeo do citoplasma pelas ceacutelulas foliculares D Atresia folicular avanccedilada (av) caracterizada pela ausecircncia de gloacutebulos de vitelo Ceacutelulas da teca (t) hemaacutecias (h) Coloraccedilatildeo Hematoxilina-eosina Barra A (25 m) B (10 m) C (150 m) D (100 m)
gv
ai
B
C D
t
gv
77
Figura 3 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos primaacuterios iniciais por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e expostos ao Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dentro dos grupos (Plt005) pelo teste de Duncan Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
0
5
10
15
20
25
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
A A
AB
B
AB
A
AB
B
0
1
2
3
4
5
6
7
8
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 4 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos primaacuterios avanccedilados por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dentro dos grupos (Plt005) pelo teste de Duncan Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
A
BC AC
BD
AC
BC
AB A A
B
B
A
78
0
02
04
06
08
1
12
14
16
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedilas entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dos grupos com as mesmas concentraccedilotildees nos diferentes experimentos (Plt005) ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) Teste de Duncan
A
B
A
B
ab b
a ab
Figura 5 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios iniciais por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e d
e o
voacuteci
tos Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 6 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Plt005) pelo teste de Duncan
79
0
05
1
15
2
25
3
35
4
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 7 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Duncan
Figura 8 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos atreacutesicos iniciais em ovaacuterios de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Kruskall Wallis
0
005
01
015
02
025
03
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e a
tre
sia
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
80
Figura 9 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos atreacutesicos totais em ovaacuterios de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
0
005
01
015
02
025
03
035
04
045
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e a
tre
sia
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Kruskall Wallis
81
Tabela 2 Diacircmetro meacutedio (microm) de foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados de lambaris A bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
53443 plusmn 7414a 53796 plusmn 7746a 53273 plusmn 8300a 50046 plusmn 5610a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
56807 plusmn 6647a 57517 plusmn 5849a 5904 plusmn 5889a 58449 plusmn 6849a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
53816 plusmn 5684a 51894 plusmn 6065a 55393 plusmn 6193a 54749 plusmn 6849a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
51606 plusmn 5757a 57837 plusmn 5977b 55774 plusmn 7870aᵇ 57311 plusmn 6178b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Tukey
Tabela 3 Iacutendice gonadossomaacutetico de fecircmeas de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
790 plusmn 318a 747 plusmn 221a 505 plusmn 263a 432 plusmn 255a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
856 plusmn 473a 813 plusmn 690a 702 plusmn 430a 683 plusmn 361a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
373 plusmn 213a 270 plusmn 147a 323 plusmn 189a 399 plusmn 201a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
227 plusmn 147a 303 plusmn 106a 305 plusmn 192a 293 plusmn 167a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Duncan
Tabela 4 Iacutendice hepatossomaacutetico de fecircmeas de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
07 plusmn 014aᵇ 088 plusmn 03a 084 plusmn 038a 038 plusmn 031b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
113 plusmn 054a 104 plusmn 061a 102 plusmn 050a 102 plusmn 051a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
066 plusmn 029a 073 plusmn 020a 092 plusmn 017a 091 plusmn 012a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
074 plusmn 034a 072 plusmn 029a 094 plusmn 040a 063 plusmn 018a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Duncan
82
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53 CAPIacuteTULO 3
RELACcedilAtildeO ENTRE COLAacuteGENO TIPO IV INTEGRINA β1 E CASPASE 3
DURANTE O DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM Astyanax bimaculatus
EXPOSTOS AO THIODAN reg
RESUMO
O agrotoacutexico Thiodanreg (350gL de endosulfan) eacute um inseticida organoclorado utilizado
em diversas monoculturas e pode chegar aos ecossistemas aquaacuteticos afetando a
reproduccedilatildeo e a integridade das populaccedilotildees de peixes Ovaacuterios de peixes apresentam
ovoacutecitos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento os quais satildeo envoltos por zona
radiata ceacutelulas foliculares membrana basal e ceacutelulas da teca formando o complexo
folicular A integridade do complexo folicular estaacute associada com a presenccedila de
colaacutegeno tipo IV e integrina β1 enquanto a caspase 3 eacute uma protease importante na via
apoptoacutetica participando ativamente nos processos de regressatildeo ovariana Pela carecircncia
de estudos que avaliam tais proteiacutenas no complexo folicular este estudo teve por
objetivo avaliar por meio de anaacutelise imunoistoquiacutemica a expressatildeo das proteiacutenas
colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspases 3 durante o desenvolvimento folicular do
lambari Astyanax bimaculatus exposto ao Thiodanreg Os peixes foram aclimatados
durante 10 dias em aquaacuterios de 50L com aeraccedilatildeo contiacutenua aacutegua sem cloro filtro
mecacircnico fotoperiacuteodo (12h) e temperatura (26plusmn1ordmC) controlados Para a exposiccedilatildeo ao
Thiodanreg os peixes foram divididos em quatro grupos controle 115 23 e 56 microgL
com trecircs repeticcedilotildees em cada concentraccedilatildeo Apoacutes 96 h seis peixes de cada grupo foram
anestesiados (benzocaiacutena110000) eutanasiados e seus ovaacuterios coletados para detecccedilatildeo
de colaacutegeno de tipo IV integrina β1 e caspase 3 Fragmentos dos ovaacuterios foram fixados
em paraformaldeiacutedo a 4 e incluiacutedos em parafina Os procedimentos de
imunomarcaccedilatildeo seguiram protocolos jaacute padronizados para os anticorpos empregados A
reaccedilatildeo foi revelada com diaminobenzidina e os cortes foram contracorados com
hematoxilina para avaliaccedilatildeo qualitativa em microscoacutepio de luz Os foliacuteculos primordiais
natildeo apresentaram marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 Nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio observou-se reaccedilatildeo fracamente positiva no citoplasma das
ceacutelulas foliculares enquanto foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio foram mais
intensamente marcados para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV A imunomarcaccedilatildeo para
caspase 3 foi evidenciada nas ceacutelulas foliculares durante o desenvolvimento secundaacuterio
sendo mais intensa no estaacutedio avanccedilado Qualitativamente essas anaacutelises demonstraram
87
marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento folicular mesmo com os
peixes expostos a diferentes concentraccedilotildees de Thiodanreg o que caracteriza a integridade
das ceacutelulas foliculares e da via apoptoacutetica caspase-3-dependente que pode estar sendo
ativada para futuros processos de regressatildeo folicular
Palavras-chave ecotoxicologia aquaacutetica ovaacuterio peixes e reproduccedilatildeo
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 de α-endosulfan e 30 de β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo
por meio da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em riscos toxicoloacutegicos os
organismos que ali residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al
2007) Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos
como jaacute observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis
niloticus No entanto a Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan
em gordura o valor de 005mgkg-1 (EPA 2002) e em aacutegua doce 022microgL-1 (EPA
1980) A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em
consideraccedilatildeo a qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente
Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm 3572005 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo
do referido inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
Muitos inseticidas apresentam baixa toxicidade antes de serem transformados
em substacircncias toacutexicas metabolicamente ativas O sulfato de endosulfan eacute um dos
produtos derivados do metabolismo do endosulfan sendo considerado o principal
metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica por ser mais estaacutevel no meio
ambiente em relaccedilatildeo a sua formula original (Ali et al 1984) A sensibilidade dos
organismos aquaacuteticos ao endosulfan eacute baixa e tem sido bem descrita na literatura por
alguns autores (Cengiz et al 2001 Capkin et al 2006 Ballesteros et al 2007 Pereira
et al 2012) sendo os machos geralmente mais sensiacuteveis que as fecircmeas pelo
armazenamento de lipiacutedeos para produccedilatildeo do vitelo e fornecimento de energia e pelo
tamanho maior da fecircmea em relaccedilatildeo ao macho (Ballesteros et al 2007)
88
O desenvolvimento folicular em peixes tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter 1996 Begovac amp Wallace
1988 Grier 2000 2002 e 2007) e como nos animais em geral compreende os periacuteodos
preacute-meioacutetico perinucleolar vitelogecircnico e maturaccedilatildeo final Estas fases ocorrem no
interior de foliacuteculos cujo complexo folicular eacute constituiacutedo por zona radiata camada
folicular membrana basal e teca (Grier 2000) as quais desempenham importante papel
durante a foliculogecircnese e fertilizaccedilatildeo
Entretanto os peixes quando satildeo expostos aos poluentes podem sofrer influecircncia
na foliculogecircnese e assim acarretar prejuiacutezos reprodutivos para as espeacutecies expostas aos
contaminantes Alguns estudos mostram diversas alteraccedilotildees provocadas nos foliacuteculos de
peixes por contaminantes (Hazarika amp Das 1998 Dutta et al 2003 Maxwell amp Dutta
2005 Chakrabarty et al 2012) inclusive a atresia folicular que eacute um processo
frequentemente observado nos ovaacuterios dos vertebrados (Saidapur 1978 Santos et al
2008a Santos et al 2008b) e que pode ser causada por diversos fatores dentre os
quais os agrotoacutexicos (Nagahama 1983 Guraya 1986 Chatterjee et al 1997 e 2001
Dutta amp Dalal 2008)
No desenvolvimento folicular a formaccedilatildeo do complexo folicular eacute importante
no suporte e na sobrevivecircncia das ceacutelulas foliculares No entanto jaacute foram identificadas
vaacuterias proteiacutenas que contribuem para a integridade do complexo folicular como
laminina integrina β1 fibronectina colaacutegeno tipo IV e de metaloproteinases (MMM-P)
em foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios e atreacutesicos (Rodgers et al 1998 Grier 2002 Le Bellego
et al 2002 Berkholtz et al 2006 Santos et al 2008a Thomeacute et al 2010) O colaacutegeno
tipo IV eacute uma proteiacutena especializada da matrix extracelular e membrana basal assim
como a laminina Essas proteacuteinas estatildeo envolvidas em favorecer um microambiente para
sobrevivecircncia das ceacutelulas do epiteacutelio (Rodgers et al 2003) As integrinas compreendem
uma grande famiacutelia de recepetores celulares composto de subnidades α e β que tem
funccedilatildeo importante na adesatildeo e transmissatildeo de sinais na ceacutelula Aleacutem disso as integrinas
estatildeo envolvidas na proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e morte celular
A caspase 3 eacute uma moleacutecula efetora de grande importacircncia no processo de
apoptose na ativaccedilatildeo de endonucleases e na clivagem das proteiacutenas celulares causando
mudanccedilas morfoloacutegicas celulares (Huettenbrenner et al 2003) Este processo de
apoptose envolve uma cascata de eventos bioquiacutemicos com a liberaccedilatildeo de fatores
mitocondriais de morte celular ativaccedilatildeo caspases e mudanccedila na caracteriacutestica
morfoloacutegica no nuacutecleo da ceacutelula assim como fragmentaccedilatildeo do DNA (Huettenbrenner et
89
al 2003) No entanto alguns trabalho citam a importacircncia da integridade do complexo
folicular com a presenccedila de integrina β1 e colaacutegeno tipo IV que em caso de atresia
folicular e ovulaccedilatildeo na formaccedilatildeo de foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios culminam em processo
da ativaccedilatildeo das caspases nas ceacutelulas foliculares Sendo assim a incidecircncia de apoptose
nas ceacutelulas foliculares aumenta nas etapas de regressatildeo ovariana (Drummond et al
2000 Santos et al 2003 2005 2008)
O lambari A bimaculatus foi escolhido como organismo experimental pois eacute
muito representativo no ecossistema sendo encontrado desde o nordeste brasileiro ateacute a
Bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Tambeacutem eacute um peixe de
pequeno porte e faacutecil de manter em laboratoacuterio O complexo folicular associado agrave
siacutentese dessas proteiacutenas ao longo do desenvolvimento folicular eacute algo a ser discutido
Poreacutem nenhum trabalho relata estas proteiacutenas em peixes expostos ao Thiodanreg Devido
agrave carecircncia de estudos que avaliem tais proteiacutenas no complexo folicular o presente
trabalho tem como objetivo avaliar as proteiacutenas colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase
3 durante o desenvolvimento folicular do lambari A bimaculatus exposto ou natildeo ao
Thiodanreg por meio de anaacutelise imunoistoquiacutemica
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria (DVT) da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste subletal e as atividades de coleta fixaccedilatildeo e
inclusatildeo dos fragmentos de ovaacuterios As etapas de microtomia imunoistoquiacutemica
coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas foram realizadas no
DVTUFV e no Laboratoacuterio de Ictiohistologia do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas (ICB)
da Universidade Federal de Minas Gerais
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos peixes em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado poro genital
dilatado e vascularizado
90
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV onde
foram aclimatados por 10 dias Os aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuiacuteam
capacidade de 50 litros numa densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada
aacutegua livre de cloro temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos
os aquaacuterios possuiacuteam um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo continua da aacutegua para
garantir o bem-estar dos peixes Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial
Purina contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da
piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Foram aclimatados 96 lambaris como descrito no item 21 onde os peixes se
acostumaram ao seu novo meio e agraves atividades normais de manutenccedilatildeo como
alimentaccedilatildeo e limpeza dos aquaacuterios O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi
realizado baseando-se nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo com
a NBR 15088 (ABNT 2007)
Logo apoacutes aclimataccedilatildeo os peixes foram submetidos ao toacutexico Thiodanreg
(endosulfan 350gL) por 96 horas Em todos os experimentos foram utilizadas trecircs
concentraccedilotildees diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 (137microgL) preacute-determinada em
laboratoacuterio de acordo com a NBR 15088 (ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas
em cada experimento foram de 115 23 e 56microgL aleacutem de um grupo controle sem
toacutexico com trecircs repeticcedilotildees sob as mesmas condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
91
24 Anaacutelises histoloacutegicas e imunoistoquiacutemicas
Apoacutes 96 horas de experimento seis fecircmeas de cada grupo foram coletadas
anestesiadas com benzocaiacutena (110000) e eutanasiadas para coleta dos ovaacuterios Para a
descriccedilatildeo histoloacutegica todas as amostras foram fixadas em paraformaldeiacutedo a 4 em
tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedas em parafina Em seguida
secccedilotildees com 5 microm de espessura foram coradas utilizando hematoxilinaeosina para
anaacutelises morfoloacutegicas do desenvolvimento folicular
Para detectar a imunorreatividade para colaacutegeno tipo IV integrinas β1 e caspase
3 nos ovaacuterios do lambari trecircs espeacutecimes de cada grupo foram fixados em
paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas incluiacutedas em
parafina e seccionadas com 5 microm de espessura A recuperaccedilatildeo antigecircnica foi realizada
em forno de microondas por 10 minutos com os cortes nas lacircminas sendo imersos em
tampatildeo citrato 10mM pH 60 As lacircminas foram incubadas com peroacutexido de hidrogecircnio
a 3 em tampatildeo fosfato por 15 minutos em temperatura ambiente para inativar
peroxidase endoacutegena e com soro albumina bovina a 2 por 45 minutos para bloquear
marcador antigecircnico inespeciacutefico Anticorpos primaacuterios (policlonais de coelho) anti-
colaacutegeno tipo IV anti-integrina β1 e anti-caspase 3 (Santa Cruz Biotechnology Calif
USA) foram aplicados nas secccedilotildees a 4degC na diluiccedilatildeo 1100 (integrina β1 e colaacutegeno tipo
IV) e 1200 (caspase 3) segundo o fabricante por 12 horas Os cortes foram lavados
em PBS e incubados por 45 minutos com anticorpo secundaacuterio na diluiccedilatildeo de 1200
anti-IgG de coelho (LSAB 2 sistema HRP DakoCymation Carpinteria Calif USA) e
tratados com peroxidase conjugada com estreptavidina por 45 minutos A revelaccedilatildeo foi
realizada com diaminobenzidina (DAB) e as lacircminas foram contracoradas com
hematoxilina (Santos et al 2008)
As lacircminas foram analisadas em toda sua extensatildeo em busca de alteraccedilotildees na
imunomarcaccedilatildeo no complexo folicular que pudessem ser representativas do efeito do
Thiodanreg sempre comparando com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios do grupo
controle As lacircminas foram analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e as
imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
92
3 RESULTADOS
31 Desenvolvimento folicular
O desenvolvimento folicular de A bimaculatus foi dividido em desenvolvimento
primaacuterio inicial e avanccedilado O desenvolvimento secundaacuterio foi dividido em
desenvolvimento secundaacuterio inicial intermediaacuterio e avanccedilado (Tabela 1) A regressatildeo
ovariana tambeacutem foi caracterizada (Tabela 1)
Tabela 1 Aspectos morfoloacutegicos do desenvolvimento folicular e da regressatildeo ovariana de Astyanax bimaculatus
Foliacuteculos primordiais Estaacutedio que antecede o desenvolvimento de foliacuteculos primaacuterios Satildeo ceacutelulas menores apresentando citoplasma volumoso nuacutecleo esfeacuterico e grande e ceacutelulas preacute-foliculares (Figura 1 B) Foliacuteculos primaacuterios iniciais e primaacuterios avanccedilados (perinucleolares) No desenvolvimento primaacuterio inicial os ovoacutecitos apresentam citoplasma fortemente basoacutefilo nuacutecleo esfeacuterico e nucleacuteolos dispersos pelo nucleoplasma Estatildeo envoltos por ceacutelulas foliculares pavimentosas (Figuras 1 C-encarte) No foliacuteculo primaacuterio avanccedilado a camada de ceacutelulas foliculares eacute pavimentosa e com o nuacutecleo eliacuteptico Entre as ceacutelulas foliculares e o ooplasma surge a zona radiata como uma fina camada (Figura 1 E-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios iniciais O citoplasma ovocitaacuterio eacute granular e fracamente basoacutefilo com presenccedila de vesiacuteculas corticais pequenas e claras na periferia do citoplasma O nuacutecleo eacute central ligeiramente acidoacutefilo com nucleacuteolos pequenos e dispersos pelo nucleoplasma (Figura 1 G-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios Assim como na etapa anterior os foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios possuem ovoacutecito com nuacutecleo central e acidoacutefilo No citoplasma inicia-se a deposiccedilatildeo de vitelo a partir da regiatildeo perifeacuterica (Figura 1 H-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados (vitelogecircnicos) No foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado o diacircmetro e o volume citoplasmaacutetico aumentam mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo apresentando os foliacuteculos neste estaacutedio vesiacuteculas corticais na periferia e gloacutebulos de vitelo disperso por todo citoplasma No complexo folicular a membrana basal eacute delgada e a zona radiada mais espessa que nas fases anteriores com ceacutelulas foliculares pavimentosas e cuacutebicas (Figura 1 H-encarte) Foliacuteculos atreacutesicos Apresenta formato irregular com estruturas descontiacutenuas ou desorganizadas com aspecto de grumos devido agrave liquefaccedilatildeo dos gracircnulos de vitelo ou com perda da conectividade entre suas partes fragmentaccedilatildeo da zona radiata (atresia inicial) e absorccedilatildeo total do conteuacutedo ovocitaacuterio pelas ceacutelulas foliculares (atresia avanccedilada) (Figuras 3 A e B-encarte) Foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios O foliacuteculo poacutes-ovulatoacuterio possue lume amplo irregular e contiacutenuo com o lume do ovaacuterio Apresenta parede constituiacuteda por camada uacutenica de ceacutelulas foliculares membrana basal e teca (Figuras 3 E e F)
93
32 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 no desenvolvimento
folicular de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Os foliacuteculos nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento apresentaram diferentes
graus de marcaccedilatildeo para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV Em foliacuteculo primordial natildeo se
observou marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 (Figura 1 B) Nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio inicial foram evidenciadas reaccedilotildees positivas com marcaccedilatildeo
fraca para colaacutegeno e integrina (Figuras 1 C e D) enquanto nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio avanccedilado as marcaccedilotildees foram mais niacutetidas (Figuras 1 E e F)
Nos desenvolvimento secundaacuterio foram evidenciadas marcaccedilotildees positivas para integrina
β1 e colaacutegeno tipo IV no citoplasma das ceacutelulas foliculares com mais intensidade que
nos estaacutedios anteriores (Figuras 1 G e H) Estas marcaccedilotildees natildeo mostraram diferenccedilas
entre os grupos expostos ao Thiodanreg quando comparados com os mesmos estaacutedios de
desenvolvimento folicular dos grupos controle A marcaccedilatildeo para caspase 3 foi
evidenciada no citoplasma e nuacutecleos de ceacutelulas foliculares de foliacuteculos com
desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado apresentando maior intensidade nos estaacutedios de
desenvolvimento secundaacuterio inicial A marcaccedilatildeo foi ausente nos estaacutedios de
desenvolvimento primaacuterio (Figuras 2 A-D) Quando comparadas estas marcaccedilotildees entre
os grupos controle e expostos ao Thiodanreg natildeo houve diferenccedilas nas marcaccedilotildees entre
os mesmos estaacutedios de desenvolvimento folicular
33 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 na atresia folicular de
A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
A marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 foi evidente nos foliacuteculos
atreacutesicos iniciais poreacutem menos intensa em relaccedilatildeo aos foliacuteculos normais (Figuras 3 A e
C) As fases mais avanccediladas da atresia folicular satildeo caracterizadas pela desorganizaccedilatildeo
espalhamento das proteiacutenas no ooplasma com reaccedilatildeo mais fraca da imunomarcaccedilatildeo
para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 (Figuras 3 B e D) Para a caspase 3 foi observada a
marcaccedilatildeo positiva nas ceacutelulas foliculares em foliacuteculos atreacutesicos iniciais e avanccedilados
(Figuras 4 A e B)
94
34 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 em foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Foram evidenciados desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV e
integrina β1 entre as ceacutelulas foliculares com marcaccedilatildeo positiva (Figuras 3 E e F) Em
foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios tambeacutem foi observada marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 nas
ceacutelulas foliculares (Figuras 4 C e D)
4 DISCUSSAtildeO
As fecircmeas de A bimaculatus submetidas agrave accedilatildeo do toacutexico apresentaram ovaacuterios
com padrotildees normais do desenvolvimento folicular sendo as variaccedilotildees na estrutura do
foliacuteculo como diacircmetro caracteriacutesticas do nuacutecleo camadas envoltoacuterias composiccedilatildeo e
distribuiccedilatildeo do vitelo observadas em outras espeacutecies do gecircnero do presente estudo
(Miranda 1996 Miranda et al 1999 Melo et al 2005 Mazzoni et al 2005 Rodrigues
et al 2005) Em outros trabalhos (Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008) satildeo
demonstrados que pequena concentraccedilatildeo de contaminantes pode ser suficiente para
causar alteraccedilotildees na morfologia dos foliacuteculos Entretanto Ballesteros et al (2007)
utilizando peixes machos e fecircmeas da espeacutecie Jenynsia multidentata verificaram que o
maior teor de lipiacutedeos nas fecircmeas foi importante para conferir maior resistecircncia contra o
endosulfan ao contraacuterio dos machos que satildeo mais suceptiacuteveis Estudo realizado por
Hernan Da Cuntildea et al (2011) mostrou que a espeacutecie Cichlasoma dimerus exposta ao
endosulfan nas concentraccedilotildees de zero 025 1 2 3 4 e 16μgL natildeo apresentou
alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos foliacuteculos assim como no presente trabalho com A
bimaculatus
No presente estudo a ausecircncia de marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV em foliacuteculos
primordiais pode ter ocorrido em funccedilatildeo da quantidade reduzida de ceacutelulas foliculares e
pela pequena espessura da membrana basal nesta fase de desenvolvimento folicular Na
literatura eacute mencionado que a espessura da membrana basal em foliacuteculos secundaacuterios
avanccedilados de A bimaculatus eacute de aproximadamente 03 microm caracterizada por ser uma
estrutura muito mais delgada quando comparada a outras espeacutecies de teleoacutesteos
(Drummond et al 2000) Outros autores no entanto observaram positividade para
colaacutegeno tipo IV na membrana basal envolvendo ovogocircnias no estroma ovariano de
peixes (Grier 2002 Thomeacute et al 2010) fase que antecede o ovoacutecito primordial
95
A siacutentese de membrana basal tem sido atribuiacuteda agraves ceacutelulas foliculares (Le Mim
et al 2007) mas ainda faltam investigaccedilotildees que evidenciem esta funccedilatildeo A anaacutelise por
hibridizaccedilatildeo in situ na cadeia α1 do colaacutegeno tipo IV revelou a presenccedila de mRNA
localizada na camada folicular de todos os foliacuteculos em crescimento no peixe medaka
Oryzias latipes (Kato et al 2010) enquanto para integrinas Itami et al (2011) natildeo
identificaram marcaccedilatildeo em foliacuteculos primordiais em ratos Estes estudos confirmam que
durante o desenvolvimento do foliacuteculo primordial poderia estar ocorrendo o inicio da
organizaccedilatildeo e siacutentese do colaacutegeno tipo IV para as fecircmeas do presente estudo
Logo em seguida o desenvolvimento folicular primaacuterio inicial e avanccedilado foi
caracterizado por alteraccedilotildees no complexo folicular com marcaccedilatildeo positiva para
integrina β1 e colaacutegeno tipo IV foi positiva Em outro estudo realizado para marcaccedilatildeo
de vaacuterias subunidades do colaacutegeno tipo IV em foliacuteculos de bovinos a expressatildeo das
cadeias α3 e α6 diminuiacuteram durante o desenvolvimento folicular enquanto as cadeias
α1 e α2 continuaram a ser expressas ao longo do desenvolvimento (Rodgers et al
1998) Em estudo com ratos foi verificado o decliacutenio de colaacutegeno tipo IV α3 ao longo
do desenvolvimento folicular mas foi possiacutevel detectar o colaacutegeno tipo IV α4 e α5 em
foliacuteculos desenvolvidos (Frojdman et al 1998) Entretanto Berkholtz (2006) observou
aumento da marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV ao longo do desenvolvimento folicular em
ratos Aleacutem disso outra caracteriacutestica importante eacute presenccedila de perlecan e nidogen que
fazem parte das ligaccedilotildees cruzadas em foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio mas
natildeo em foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio (McArthur et al 2000) Poreacutem as
diferentes ligaccedilotildees cruzadas entre os colaacutegenos e lamininas nas membranas basais
tambeacutem garantem maior expansatildeo no alargamento do foliacuteculo (Rodgers et al 2003)
Portanto eacute de grande importacircncia nesta etapa de desenvolvimento folicular a evidecircncia
do colaacutegeno tipo IV e integrinas o que pode contribuir na organizaccedilatildeo coordenada no
desenvolvimento folicular de A bimaculatus com estas proteiacutenas da matriz extracelular
Em relaccedilatildeo agraves fases de desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio foram observadas
marcaccedilotildees positivas para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 o que parece caracterizar
maior siacutentese destas proteiacutenas nestes estaacutedios do desenvolvimento folicular Entretanto
deve-se considerar que nas fases mais avanccediladas a quantidade de ceacutelulas foliculares e
ceacutelulas da teca satildeo mais numerosas sendo assim exercem funccedilatildeo importante na
integridade folicular No presente estudo a marcaccedilatildeo contiacutenua de colaacutegeno tipo IV e
integrina β1 nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento folicular em 96 horas de
experimento indicou que natildeo houve desorganizaccedilatildeo na membrana basal e nas ceacutelulas
96
foliculares Thomeacute et al (2010) identificaram por teacutecnicas de imonoistoquiacutemica e
imunofluorescecircncia a presenccedila de laminina β2 integrinas e colaacutegeno tipo IV na
membrana basal demonstrando a importacircncia destes constituintes na integridade da
membrana basal ao longo do desenvolvimento folicular resultados observados tambeacutem
em foliacuteculos de mamiacuteferos (Le Bellego et al 2002 Berkholtz et al 2006)
Em foliacuteculos de ratos tambeacutem foi evidenciada a presenccedila de integrinas ao longo
do desenvolvimento folicular apresentando marcaccedilatildeo positiva no desenvolvimento
primaacuterio e marcaccedilatildeo mais intensa no desenvolvimento secundaacuterio (Itami et al 2011)
Portanto a marcaccedilatildeo positiva nas ceacutelulas foliculares em lambaris A bimaculatus nos
grupos controle e expostos ao Thiodanreg mostrou que a integridade dos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio natildeo foi afetada pelas concentraccedilotildees de
Thiodanreg utilizadas
Em relaccedilatildeo agrave caspase 3 ao longo do desenvolvimento folicular foi possiacutevel
evidenciar sua expressatildeo nos estaacutedios de desenvolvimento secundaacuterio mas natildeo a
presenccedila de condensaccedilatildeo de nuacutecleos e corpos apoptoacuteticos nas ceacutelulas foliculares No
entanto a presenccedila de caspase 3 nas ceacutelulas foliculares de A bimaculatus indica que
estas ceacutelulas podem estar em via apoptoacutetica poreacutem outros trabalhos demonstram que a
via para caspase 3 eacute observada em foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios atresias iniciais e
principalmente nas atresias avanccediladas com a presenccedila de fragmentaccedilatildeo de DNA
condensaccedilatildeo nuclear e formaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos (Hsueh et al 1994 Santos et
al 2008) A ausecircncia destas caracteriacutesticas morfoloacutegicas nos foliacuteculos de A
bimaculatus do presente estudo pode ser explicada por inibidores de apoptose (Salvesen
amp Duckett 2002) que podem estar ativos e protegendo as ceacutelulas contra apoptose
Outros exemplos citados satildeo os fatores hormonais como as gonadotropinas 17β
estradiol e fator de crescimento epideacutermico que agem como fatores de sobrevivecircncia
para suprimir a morte celular por apoptose em foliacuteculos ovarianos de ratos em cultura
(Chun et al 1994) e tambeacutem no peixe truta arco-iacuteris Oncorhynchus mykiss (Janz amp Van
Der Kraak 1997) Segundo Salvesen amp Duckett (2002) poucos estudos tecircm tentado
esclarecer se uma determinada ceacutelula consegue se recuperar de um efeito fisioloacutegico de
caspases quando estatildeo sendo processadas e ativadas
Um grupo de proteiacutenas estruturalmente relacionadas agrave inibiccedilatildeo da apoptose eacute o
inibidor de apoptose (IAP) (Deveraux amp Reed 1999) Satildeo descritos pelo menos oito
IAPs em humanos localizados no citoplasma e que se ligam na forma ativa da caspase
3 ou na forma zimogecircnio das caspases para inibir a sua funccedilatildeo (Salvesen amp Duckett
97
2002) Janz et al (1997) mencionam forte relaccedilatildeo com o aumento da apoptose e
expressatildeo de proteiacutena do choque teacutermico HSP70 em peixes expostos agrave celulose
afetando o tamanho do ovaacuterio provocanado queda da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
testosterona e induccedilatildeo nas concentraccedilotildees plasmaacuteticas de 17β estradiol Em relaccedilatildeo agrave
HSP70 ela pode estar relacionada com a proteccedilatildeo das ceacutelulas foliculares antes da
reabsorccedilatildeo do vitelo em foliacuteculos atreacutesicos (Santos et al 2008) A relaccedilatildeo mais
consistente da viabilidade dos foliacuteculos de A bimaculatus no presente estudo segundo a
literatura pode ser a relaccedilatildeo dos inibidores de apoptose associado com os fatores
hormonais agindo como prevenccedilatildeo na sobrevivecircncia das ceacutelulas foliculares no
desenvolvimento folicular secundaacuterio
Nas fecircmeas do lambari A bimaculatus o processo de atresia foi semelhante ao
descrito por Miranda et al (1999) Munoz et al (2002) Melo et al (2005) e Santos et
al (2005) A maior frequecircncia de atresia foi observada em foliacuteculos secundaacuterios
Observaccedilotildees semelhantes foram feitas por Drummond (1996) em A bimaculatus
lacustris e Melo et al (2005) em A scabripinnis Em relaccedilatildeo aos foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios ocorre perda de contato entre as membranas das ceacutelulas foliculares
adjacentes evento observado por Santos et al (2005) entre 48 e 72 horas poacutes-desova em
Leporinus taeniatus Essas estruturas foram raramente encontradas no presente estudo
indicando que o grau de contaminaccedilatildeo pelo Thiodanreg natildeo interferiu na eliminaccedilatildeo dos
foliacuteculos de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada
Nos processos de atresias e nos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios ocorreram a
desorganizaccedilatildeo e a perda da positividade da imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e
integrinas nas fases avanccediladas quando comparadas com as fases iniciais da regressatildeo
ovariana sendo esta caracteriacutestica tambeacutem observada por outros autores (Santos et al
2008 Thomeacute et al 2010) Relatos importantes sobre a integridade dos foliacuteculos estatildeo
na diminuiccedilatildeo da integrina β1 e colaacutegeno do tipo IV contribuindo para o aumento da
apoptose em ceacutelulas foliculares de foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios e nas atresias avanccediladas
(Santos et al 2008) Aleacutem disso outros fatores contribuem para o aumento da
apoptose como a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 17β estradiol logo apoacutes a desova
favorecendo a regressatildeo ovariana dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios (Kaptaner amp Ural 2006)
Portanto o presente estudo com as fecircmeas de A bimaculatus evidencia a caspase 3 e a
diminuiccedilatildeo da marcaccedilatildeo com integrina β1 e colaacutegeno tipo IV nas ceacutelulas foliculares nos
foliacuteculos atreacutesicos e poacutes-ovulatoacuterios o que sugere a provaacutevel accedilatildeo destas proteiacutenas na
regressatildeo folicular em lambaris expostos ao Thiodanreg
98
De acordo com os resultados obtidos pode-se inferir que os ovaacuterios A
bimaculatus foram resistentes ao Thiodanreg nas concentraccedilotildees testadas e no periacuteodo
experimental proposto pois tais concentraccedilotildees natildeo interferiram de modo significativo
na estrutura do complexo folicular e no desenvolvimento folicular Qualitativamente
essas anaacutelises demonstraram a marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do
desenvolvimento folicular mesmo quando os peixes foram expostos a diferentes
concentraccedilotildees de Thiodanreg o que caracteriza a integridade das ceacutelulas foliculares e da
via apoptoacutetica caspase-3-dependente que pode estar sendo ativada para futuros
processos de regressatildeo folicular
99
A
DC
B
fsa fp
fpi
fpi
mc
mi
fpa
fpa
fsa
fsa
zr
zr
zr zr
H
E
G
F
mc
m
mi
mc
fsa
fpi
fpa
fsi
vc fsa
fst
v
v
Figura 1 Imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 ao longo do desenvolvimento folicular em A bimaculatus A Controle negativo para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV B Foliacuteculo primordial (fp) sem marcaccedilatildeo para colaacutegeno (setas) C e D Marcaccedilatildeo positiva para colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) respectivamente em folliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio inicial (fpi) E e F Marcaccedilatildeo positiva para colaacutegeno (mc) e integrina (mi) em foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (fpa) Encarte-C Foliacuteculo primaacuterio inicial (fpi) G e H Marcaccedilatildeo para colaacutegeno (mc) e integrina (mi) mais fortemente evidenciada em foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (fsa) Encartes-G e H Foliacuteculo secundaacuterio inicial (fsi) foliacuteculo secundaacuterio intermediaacuterio (fst) foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado (fsa) vesiacuteculas corticais (vc) vitelo (v) zona radiata (zr) Encartes C E G e H corados com hematoxilinaeosina Barras 20 m encartes C e E (80 m) G (100m) e H (200m)
A B
C D
E F
G H
100
fpi
fpa
fsa
fsa
fsa
zr
zr
zr zr
D
A
C
B
Figura 2 Imunomarcaccedilatildeo para caspase 3 ao longo do desenvolvimento folicular em A bimaculatus A Imagem do controle negativo para caspase 3 (setas) B Ausecircncia de marcaccedilatildeo para caspase 3 (setas) em foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio inicial (fpi) C e D Marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) em foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (fsa) e ausente (setas) em foliacuteculo desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (fpa) zr zona radiata fsa foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado Barras 20 m
101
A
mc
mi
mc
mi
mi mc
fpo fpo
ai av
av
B
C D
E F
Figura 3 Imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 de atresia e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterio em A bimaculatus A e C Foliacuteculo secundaacuterio em atresia inicial (ai) caracterizando a presenccedila da zona radiata (zr) e iniacutecio da desorganizaccedilatildeo da marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) no complexo folicular (setas) B e D Imunomarcaccedilatildeo menos intensa do que na etapa anterior em atresia avanccedilada caracterizando a desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) no citoplasma (setas) E e F Foliacuteculo poacutes-ovulatoacuterio (fpo) caracterizando a desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) entre as ceacutelulas
foliculares (setas) Encartes A e B Atresia inicial (ai) e atresia avanccedilada (av) ceacutelula folicular (cf) zona radiata (zr) Encartes A e B corados com hematoxilinaeosina Barras A B C E e F
(20 m) D (200 m) encartes A (25 m) e B (100 m)
ai av zr cf cf
102
A
ai av
fpo fpo
B
C D
Figura 4 Imunomarcaccedilatildeo para caspase 3 em atresia folicular e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios em A bimaculatus A e B Imunomarcaccedilatildeo em atresia inicial (ai) e atresia avanccedilada (av) caracterizando a presenccedila de marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) C e D Imunomarcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) nas ceacutelulas dos foliacuteculos poacutes-ovulatorios (fpo) Barras A B e D (20 m) C (200 m)
103
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107
6 CONCLUSOtildeES A CL50 estimada para fecircmeas adultas de Astyanax bimaculatus em maturaccedilatildeo
avanccedilada expostas ao Thiodanreg eacute de 136microgL com intervalo de confianccedila de 101 a
184 microgL
A accedilatildeo do Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou o fiacutegado como um todo
mas locais isolados do parecircnquima hepaacutetico sendo a maioria alteraccedilotildees de estaacutegio I e
II com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico
As alteraccedilotildees na quantidade de glicogecircnio hepaacutetico no experimento sem aclimataccedilatildeo
sem alimentaccedilatildeo demonstraram que o Thiodanreg influenciou na maior mobilizaccedilatildeo
das reservas de glicogecircnio em funccedilatildeo das condiccedilotildees ambientais oferecidas aos
animais
As alteraccedilotildees ocorridas no nuacutecleo e citoplasma dos hepatoacutecitos demonstram que o
Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees hepaacuteticas confirmando que o Thiodanreg
influenciou no metabolismo celular como resposta adaptativa celular
Natildeo foram observadas diferenccedilas morfoloacutegicas que comprometessem diretamente os
estaacutedios de desenvolvimento folicular ovariano seja no grupo controle ou nos grupos
tratados com Thiodanreg
Os experimentos com aclimataccedilatildeo apresentaram alteraccedilotildees na quantidade de
foliacuteculos primaacuterios e secundaacuterios quando comparadas com os peixes sem
aclimataccedilatildeo sugerindo que o eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-ovaacuterio pode estar sendo
afetado
Houve maior diacircmetro nos foliacuteculos vitelogecircnicos e maior frequecircncia de atresia
folicular no experimento com aclimataccedilatildeo seguida de exposiccedilatildeo ao Thiodanreg o que
sugere mecanismo adaptativo com maiores diacircmetros de foliacuteculos no meio
impactado
108
As meacutedias dos IGS e IHS nos experimentos aclimatados foram menores quando
comparadas com os experimentos sem aclimataccedilatildeo sugerindo que a espeacutecie A
bimaculatus previamente aclimatada em aquaacuterios pode sofrer comprometimento da
reproduccedilatildeo
As reaccedilotildees imunohistoquiacutemicas para integrina β1 colaacutegeno IV e caspase-3 em
foliacuteculos atreacutesicos e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios sugerem possiacutevel relaccedilatildeo com a
regressatildeo ovariana poacutes-desova
As anaacutelises por imunohistoquiacutemica para integrina β1 colaacutegeno IV e caspase-3 nas
ceacutelulas foliculares ao longo do desenvolvimento folicular demonstraram
qualitativamente marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento
folicular mesmo quando os peixes foram expostos a diferentes concentraccedilotildees de
Thiodanreg o que caracteriza a integridade das ceacutelulas foliculares e da via apoptoacutetica
caspase-3-dependente que pode estar sendo ativada para futuros processos de
regressatildeo folicular
iv
IacuteNDICE
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO GERAL
11 O uso de agrotoacutexicos
12 Tipos de inseticidas
13 Inseticidas no meio ambiente rotas de entrada
14 Avaliaccedilatildeo de solubilidade e estudos de toxicidade aquaacutetica
15 Caracterizaccedilatildeo do agrotoacutexico Thiodanreg
16 O uso do endosulfan
17 Toxicidade aguda do endosulfan
18 Efeitos dos inseticidas organoclorados sobre peixes
19 O lambari Astyanax bimaculatus
110 Morfologia hepaacutetica em teleoacutesteos
111 Morfologia ovariana em teleoacutesteos
vi
viii
1
1
2
3
4
5
6
6
7
9
10
12
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
22 Objetivos especiacuteficos
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
31 Animais
32 Agrotoacutexicos
33 Teste de toxidade aguda em sistema estaacutetico - CL50
34 Teste de toxidade subletal em sistema estaacutetico
35 Avaliaccedilatildeo morfoloacutegica
351 Microscopia de luz
352 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos fiacutegados
353 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos ovaacuterios
354 Imunoistoquiacutemica
36 Paracircmetros biomeacutetricos
37 Anaacutelises estastiacuteticas
4 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
15
15
15
17
17
18
18
20
21
21
22
25
26
27
27
28
v
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 CAPIacuteTULO 1 Efeitos do inseticida Thiodanreg sobre a morfologia
hepaacutetica de fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
52 CAPIacuteTULO 2 Efeitos do inseticida Thiodanreg sobre a morfologia
do desenvolvimento folicular em lambaris Astyanax bimaculatus
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
53 CAPIacuteTULO 3 Relaccedilatildeo entre colaacutegeno tipo IV integrina β1 e
caspase 3 durante o desenvolvimento folicular em Astyanax
bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
6 CONCLUSOtildeES
35
35
35
36
37
42
45
56
62
62
63
65
68
71
82
86
86
87
89
92
94
103
107
vi
RESUMO
MARCON Lucas D Sc Universidade Federal de Viccedilosa dezembro de 2013 Efeitos do Thiodanreg em fiacutegado e em ovaacuterios em maturaccedilatildeo avanccedilada de lambaris Astyanax bimaculatus Orientador Laeacutercio dos Anjos Benjamin Coorientadoras Ann Honor Mounteer e Marlene Isabel Vargas Viloria
O agrotoacutexico Thiodanreg (350gL de endosulfan) eacute um inseticida organoclorado utilizado
em diversas monoculturas que pode chegar aos ecossistemas aquaacuteticos e afetar a
reproduccedilatildeo e a integridade das populaccedilotildees de peixes O fiacutegado eacute um dos principais
oacutergatildeos para a biotransformaccedilatildeo de diversos xenobioacuteticos Quando os peixes satildeo
expostos a uma concentraccedilatildeo elevada de agentes quiacutemicos podem ocorrer danos
hepaacuteticos Os ovaacuterios de peixes apresentam foliacuteculos em diferentes estaacutedios de
desenvolvimento que satildeo envoltos por zona radiata ceacutelulas foliculares membrana basal
e ceacutelulas da teca formando o complexo folicular Agentes estressores podem causar
aumento ou diminuiccedilatildeo do diacircmetro dos foliacuteculos vitelogecircnicos alterar a quantidade de
foliacuteculos nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento e aumentar a incidecircncia de atresia
Assim o presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos do Thiodanreg sobre o fiacutegado
e ovaacuterios de lambaris Astyanax bimaculatus por meio de anaacutelises morfoloacutegica
morfomeacutetrica e imunoistoquiacutemica Os peixes expostos ao toacutexico foram divididos em
quatro experimentos 1) sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo 2) sem aclimataccedilatildeo e
alimentados 3) com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo 4) com aclimataccedilatildeo de
10 dias e alimentados Em todos os experimentos foram utilizadas trecircs concentraccedilotildees
diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 de 1367microgL preacute-determinada em laboratoacuterio
de acordo com a NBR 15088 (ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas em cada
experimento foram de 115 23 e 56microgL aleacutem de um grupo controle livre de toacutexico
com trecircs repeticcedilotildees contento 10 peixes para cada concentraccedilatildeo Apoacutes as 96h seis peixes
de cada grupo foram capturados e anestesiados com benzocaiacutena (110000) de acordo
com as Normas da Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de VeterinaacuteriaUFV (protocolo
242009) Os fiacutegados e ovaacuterios foram coletados e processados por teacutecnicas histoloacutegicas
rotineiras As lacircminas foram analisadas em microscoacutepio de luz Olympus CX31 Foram
obtidas imagens digitais de 10 campos aleatoacuterios por animal em objetiva de 20X e 40X
para avaliaccedilatildeo histoloacutegica As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada nos testes em sistema
estaacutetico foram mantidas de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT
2007) A anaacutelise histoloacutegica dos fiacutegados mostrou no experimento 1 (sem
vii
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo) na concentraccedilatildeo de 56microgL de Thiodanreg a menor
intensidade (010plusmn00) da reaccedilatildeo ao PAS no citoplasma dos hepatoacutecitos quando
comparada ao grupo controle (133plusmn051) No entanto houve diferenccedila (Plt005) nesse
mesmo experimento quando comparado com as concentraccedilotildees 115microgL (266plusmn081) e
23microgL (300plusmn00) caracterizando depleccedilatildeo de glicogecircnio Aleacutem disso houve
alteraccedilotildees do diacircmetro de nuacutecleos e citoplasma dos hepatoacutecitos nos diferentes
experimentos e maior quantidade de nuacutecleos de hepatoacutecitos nos grupos expostos ao
Thiodanreg associada com a reduccedilatildeo na quantidade de citoplasma O Iacutendice de Alteraccedilatildeo
Histoloacutegica (IAH) dos lambaris coletados manteve-se entre 433 a 833 (para os grupos
controles) 1850 a 2883 (para as concentraccedilotildees de 115microgL) 2033 a 2833 (para as
concentraccedilotildees de 23microgL) e 2366 a 2766 (para as concentraccedilotildees de 56microgL) Os
lambaris coletados nos diferentes experimentos apresentaram valores de IAH para os
grupos controle inferiores (Plt005) aos grupos expostos Estes resultados demonstraram
que o Thiodanreg pode estar influenciando as funccedilotildees hepaacuteticas pela maior mobilizaccedilatildeo
das reservas de glicogecircnio na concentraccedilatildeo 56microgL As alteraccedilotildees observadas nos
fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas sendo alteraccedilotildees de estaacutedio I e II indicando
dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico nos diferentes grupos e experimentos Nos ovaacuterios
percebeu-se que a accedilatildeo do Thiodanreg em niacuteveis subletais natildeo afetou a morfologia dos
diferentes estaacutedios de desenvolvimento folicular Poreacutem os experimentos com
aclimataccedilatildeo demonstraram alteraccedilotildees nas quantidades de foliacuteculos primaacuterios e
secundaacuterios quando comparados com os peixes dos experimentos sem aclimataccedilatildeo
Aleacutem disso houve aumento do nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos e diacircmetro dos foliacuteculos
secundaacuterios nos grupos expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos Estes
resultados sugerem mecanismos compensatoacuterios da perda reprodutiva quando em meio
com condiccedilotildees desfavoraacuteveis As anaacutelises imunoistoquiacutemicas demonstraram marcaccedilatildeo
crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento folicular para integrina β1 e
colaacutegeno tipo IV Entretanto a caspase 3 foi observada somente no complexo folicular
de foliacuteculos secundaacuterios mesmo quando os peixes satildeo expostos a diferentes
concentraccedilotildees de Thiodanreg o que confirma a integridade das ceacutelulas foliculares e da via
apoptoacutetica caspase-3-dependente a qual pode estar sendo ativada para futuros processos
de regressatildeo folicular
viii
ABSTRACT
MARCON Lucas D Sc Universidade Federal de Viccedilosa December 2013 Effects of Thiodanreg in liver and ovaries in advanced maturation of the lambari Astyanax bimaculatus Advisor Laeacutercio dos Anjos Benjamin Co-advisors Ann Honor Mounteer and Marlene Isabel Vargas Viloria
The pesticide Thiodanreg (350gL-1 of endosulfan) is an organochlorine insecticide used
in various monocultures that may reach aquatic ecosystems and affect reproduction and
the health of fish populations The liver is a major organ for the biotransformation of
many xenobiotics and it can be damaged if the fish are exposed to a high level of
chemical substances The fish ovaries have oocytes at different stages of development
that are surrounded by zona radiata follicular basal membrane and teca cells to form the
follicular complex Stressor products may cause an increase or decrease in the diameter
of the secondary follicles vitellogenic depletion a change the number of follicles at
different stages of development and an increase the incidence of atresia The present
study aimed to evaluate the effects of Thiodanreg on the liver and ovaries of Astyanax
bimaculatus through morphological morphometric and immunohistochemistry analysis
The groups of fish were exposed to the toxic substances divided in four experiments
without adaptation and no feeding feeding without adaptation with adaptation and no
feeding with adaptation and feeding All experiments used three different
concentrations of Thiodanreg lower than the LC50 of 1367 microgL-1 previously determined
in the laboratory in accordance with the Brazilian Standard Regulation - NBR 15088
(ABNT 2007) The concentrations used in each experiment were 115 23 and 56
microgL-1 and a control group with three repetitions using ten fish in each aquarium After
96h six fish from each group were captured and anesthetized with benzocaine
(110000) according to the norms of the Ethics Committee of the Veterinary
DepartmentUFV (protocol 242009) Livers and ovaries were collected and processed
by histological techniques The slides were examined under the light microscope
Olympus CX31 Were obtained digital images of 10 random fields per animal at 20X
and 40X objective for evaluation The characteristics of the water used in acute tests
were maintained in a stable system in accordance to the recommendations of NBR
15088 (ABNT 2007) In the experiment 1 (without adaptationno feeding) at the
concentration of 56 mgL-1 of Thiodanreg (010 plusmn 00) the intensity of the PAS reaction
was lower in the cytoplasm of hepatocytes when compared to the control group (133 plusmn
ix
051) In the same experiment differences in glycogen depletion were (Plt005) when
compared to the concentrations 115 gL-1 (266 plusmn 081) and 23 gL-1 (300 plusmn 00) In
addition changes in the diameter of nuclei and cytoplasm of hepatocytes in all
experiments were observed and an increase in the number of hepatocyte nuclei in
groups exposed to Thiodanreg was associated with a reduction in the amount of
cytoplasm However the IHA was maintained between 433 to 833 (control group)
1850 to 2883 (115 mgL-1 group) 2033 to 2833 (23 gL-1 group) and 2366 to 2766
(56 gL-1 group) These results suggest that Thiodanreg may be influencing liver
functions to increase glycogen mobilization according to higher concentrations of
exposition The changes observed in the livers of A bimaculatus were not severe
classified as stage I and II that indicate repairable damage to liver tissue in all
experiments It was observed in the ovaries that the action of Thiodanreg in sublethal
levels did not affect (Plt005) the morphology of the different stages of follicle
development However the experiments demonstrated an adaptation response in the
number of primary and secondary follicles compared to fish without adaptation In
addition there was a growing incidence of atretic follicles and increased diameter of the
secondary follicles in the groups exposed to Thiodanreg in all experiments These results
suggest an adaptive response to offset reproductive loss where in unfavorable
conditions The immunohistochemical analysis showed increasing and uniform labeling
throughout the follicular development for integrin β1 and collagen type IV However
caspase 3 was observed only in the secondary ovarian follicular complex even when
fish were exposed to different concentrations of Thiodanreg which characterizes the
integrity of follicular cells and the apoptotic pathway-dependent caspase-3 which may
be activated for future follicular regression
1
1 INTRODUCcedilAtildeO GERAL
11 O uso de agrotoacutexicos
Agrotoacutexicos satildeo produtos e agentes de processos fiacutesicos quiacutemicos ou bioloacutegicos
destinados ao uso nos setores de produccedilatildeo no armazenamento e beneficiamento de
produtos agriacutecolas nas pastagens na proteccedilatildeo de florestas nativas ou implantadas e de
outros ecossistemas e tambeacutem de ambientes urbanos e industriais cuja finalidade eacute
preservaacute-los da accedilatildeo danosa de seres vivos considerados nocivos (Lei Federal 7802 de
110789) Os agrotoacutexicos satildeo importantes na agricultura todavia exigem precauccedilatildeo no
seu uso visando a proteccedilatildeo dos operaacuterios que os manipulam e aplicam dos
consumidores dos animais de criaccedilatildeo de abelhas peixes de organismos predadores e
parasitas e enfim do meio ambiente
Certas praacuteticas agriacutecolas ligadas ao modelo de produccedilatildeo agriacutecola como o uso
excessivo e inadequado de agrotoacutexicos a destruiccedilatildeo da cobertura vegetal dos solos para
plantio a natildeo preservaccedilatildeo das matas ciliares e das vegetaccedilotildees protetoras de nascentes
dentre outros fatores satildeo responsaacuteveis por grande parte dos problemas com os recursos
hiacutedricos (Matuo 1990)
Os inseticidas constituem importante grupo de praguicidas para o uso agriacutecola
que ano apoacutes ano mostra um aumento progressivo em seu uso na Ameacuterica do Sul
Estes nas uacuteltimas deacutecadas comeccedilaram a substituir inclusive o trabalho mecacircnico e
manual dos agricultores Ruumlegg et al (1987) e Tomita amp Beyruth (2002) relatam que o
modelo de agricultura adotado no Brasil baseia-se no uso de agrotoacutexicos Estes
compostos satildeo empregados haacute muito tempo e a partir da 2deg guerra mundial passaram a
ser mais intensamente utilizados
Nos uacuteltimos 40 anos a agricultura brasileira sofreu inuacutemeras e profundas
transformaccedilotildees que alteraram tanto a composiccedilatildeo das culturas como os processos de
produccedilatildeo e padrotildees tecnoloacutegicos ateacute entatildeo em vigor Ruumlegg et al (1987) enfatizam que
o processo de modernizaccedilatildeo entendido como uma seacuterie de transformaccedilotildees tecnoloacutegicas
nos processos produtivos intensificou o emprego de insumos como maacutequinas
fertilizantes e agrotoacutexicos que contam com preccedilos favoraacuteveis e estiacutemulos como creacutedito
farto a juros subsidiados que facilitaram sua ampla adoccedilatildeo no meio rural Assim
agrotoacutexicos tecircm sido amplamente utilizados como uma das principais ferramentas para
um bom programa de controle de plantas daninhas em culturas que tecircm ganhado espaccedilo
na balanccedila comercial agriacutecola brasileira (Rodrigues amp Almeida 2005) O emprego dos
2
agrotoacutexicos tornou-se de uso rotineiro principalmente pelo menor custo e maior
eficiecircncia de controle das plantas daninhas quando comparados aos demais meacutetodos
convencionais de controle Para Rosa (1998) o modelo baseado no uso intensivo de
insumos quiacutemicos de sementes melhoradas e mecanizaccedilatildeo foi denominado ldquoRevoluccedilatildeo
Verderdquo que na deacutecada de 1980 trouxe ao Brasil um novo alento em relaccedilatildeo agrave
produtividade com grandes esperanccedilas de colheitas fartas e novas tecnologias que
propiciaram o domiacutenio de aacutereas pouco exploradas como por exemplo o cerrado da
Regiatildeo Centro-Oeste De fato muitas destas expectativas se realizaram entretanto o
impacto ambiental resultante implicou custos muitas vezes irremediaacuteveis como por
exemplo a perda de biodiversidade e a exaustatildeo de vaacuterios cursos drsquoaacutegua por
assoreamento aleacutem de contaminaccedilatildeo
12 Tipos de inseticidas
Os inseticidas satildeo classificados em quatro categorias conforme sua foacutermula
quiacutemica organoclorados carbamatos organofosforados e piretroides Os
organoclorados satildeo produtos sinteacuteticos que possuem carbono cloro e hidrogecircnio em sua
estrutura quiacutemica Satildeo persistentes no meio ambiente por vaacuterios anos e pouco soluacuteveis
em aacutegua Esses inseticidas quando mal administrados tecircm accedilatildeo toacutexica para diversos
mamiacuteferos sendo sua accedilatildeo natildeo sistecircmica neurotoacutexica e mutagecircnica (Guedes 1990
Pereira et al 2012) Os carbamatos satildeo inseticidas considerados menos persistentes e
com degradaccedilatildeo raacutepida no meio ambiente natildeo satildeo bioacumulados pouco lipofiacutelicos
satildeo sistecircmicos em plantas e inibidores da acetilcolinesterase (Guedes 1990 Ware
1994 Chatterjee et al 2001) Os organofosforados satildeo outro grupo de inseticida
amplamente utilizado no mercado mundial representando 355 do uso na uacuteltima
deacutecada Esses inseticidas caracterizam-se por pouca solubilidade em aacutegua (mais
soluacuteveis do que os organoclorados) toxicidade variaacutevel em animais vertebrados em
alguns animais e plantas tecircm atividade sistecircmica baixa persistecircncia no ambiente e
facilmente degradados por enzimas e fatores quiacutemicos A accedilatildeo desses toacutexicos eacute
semelhante ao carbamato agindo nas vias sinaacutepticas dos axocircnios inibindo a
acetilcolinesterase (Ware 1994 Albinati et al 2009) O piretroide tambeacutem eacute um
inseticida amplamente utilizado na agricultura representando 21 do mercado mundial
na uacuteltima deacutecada O fator positivo do uso desse pesticida eacute que ele eacute muito toacutexico para
insetos e apresenta baixa toxicidade para mamiacuteferos satildeo fotoestaacuteveis com degradaccedilatildeo
raacutepida no solo A accedilatildeo toacutexica desse inseticida eacute semelhante aos primeiros inseticidas
3
desenvolvidos como o organoclorado DDT possuindo accedilatildeo neurotoacutexica nos axocircnios
(Naumann 1990 Ware 1994 Haverinen amp Vornanen 2014)
Nos uacuteltimos anos aumentou muito a diversidade de inseticidas visando a morte
de insetos e a persistecircncia do agrotoacutexico por periacuteodos curtos por questotildees de seguranccedila
ao meio ambiente Aleacutem desses inseticidas que foram mencionados acima existem
vaacuterios inseticidas organossinteacuteticos e inseticidas naturais de origem vegetal animal e
microbiana (Casida amp Quistad 1998 Ishaaya amp Horowitz 1998 Drevnick et al 2006)
13 Inseticidas no meio ambiente rotas de entrada
Os inseticidas podem entrar no meio ambiente acidental ou deliberadamente A
entrada acidental do inseticida origina-se de rejeitos industriais urbanos vazamentos
durante transporte armazenamento e distribuiccedilatildeo enquanto a entrada deliberada ocorre
pela aplicaccedilatildeo de inseticidas no meio rural e urbano As contaminaccedilotildees por agrotoacutexicos
podem contaminar solos e ateacute mesmo a atmosfera Nesse uacuteltimo a movimentaccedilatildeo do
toacutexico se daacute por meio de gotas partiacuteculas soacutelidas e gases que acabam sendo
transportados por longas distacircncias a partir do local de origem da aplicaccedilatildeo (Walker et
al 1996)
O transporte e destino dos agrotoacutexicos no ambiente aquaacutetico eacute ponto de
discussatildeo Murty (1988) descreveu que os agrotoacutexicos entram no ambiente aquaacutetico por
meio da aplicaccedilatildeo intencional implemento aeacutereo escoamento das aplicaccedilotildees ou
liberaccedilatildeo acidental A descarga dos resiacuteduos da manufatura de agrotoacutexicos constitui a
segunda maior fonte de contaminaccedilotildees dos corpos de aacutegua O efeito mais draacutestico eacute
esperado no ponto de liberaccedilatildeo em lagos e pequenos mares internos Os efeitos nos
oceanos eacute pequeno devido ao grande volume de aacutegua e accedilatildeo de correntes (Walker et al
1996)
Na rota de transporte bioloacutegico o sistema natildeo eacute muito importante em termos de
magnitude pela quantidade do xenobioacutetico acumulado quando comparado com fatores
mencionados acima (transporte abioacutetico) mas eacute importante para o homem e vida
silvestre O padratildeo do transporte bioloacutegico dos toacutexicos acumulados nos organismos
segue da seguinte forma herbiacutevoros carniacutevoros e pisciacutevoros (maior eficiecircncia de
acuacutemulo) Nesses uacuteltimos particularmente as espeacutecies de ambientes aquaacuteticos a
acumulaccedilatildeo e magnificaccedilatildeo satildeo maiores do que nas espeacutecies de ambiente terrestre
devido agrave lipofilicidade dos inseticidas particularmente os organoclorados Duas rotas de
entrada podem comprometer a toxicidade dos organismos aquaacuteticos absorccedilatildeo ou
4
ingestatildeo A bioconcentraccedilatildeo vai ser mais intensa no ambiente aquaacutetico pois a difusatildeo
dos poluentes na aacutegua aumenta a eficiecircncia de sua absorccedilatildeo pelo organismo aquaacutetico
devido agrave lipofilicidade dos organoclorados Dessa forma a transferecircncia ao longo de
cadeias alimentares eacute tambeacutem mais eficiente e a bioconcentraccedilatildeo acontece em todas as
suas etapas Devido a isso os efeitos em predadores podem ser seacuterios pois aleacutem de
grande bioconcentraccedilatildeo e transferecircncia pela cadeia alimentar alguns destes organismos
como aves que se alimentam de peixes e animais marinhos como focas e cetaacuteceos satildeo
deficientes no metabolismo de desintoxicaccedilatildeo particularmente devido ao sistema de
monoxigenases pouco desenvolvido comprometendo mais a toxicidade por
biomagnificaccedilatildeo (Barron 1995 Borgaacute et al 2004)
Aleacutem da bioconcentraccedilatildeo os resiacuteduos destas substacircncias presentes nas aacuteguas
podem ser aderidos ao material orgacircnico em suspensatildeo depositar-se no sedimento ou
serem absorvidos pelos organismos Assim peixes e invertebrados podem bioacumular
tais compostos ligados agrave mateacuteria ingerida ser passivamente absorvidos pela superfiacutecie
corporal ou durante as trocas respiratoacuterias (Vasconcellos amp Verani 2000 Henry amp
Kishimba 2006)
14 Avaliaccedilatildeo de sensibilidade e estudos de toxicidade aquaacutetica
A realizaccedilatildeo de testes de sensibilidade eacute recomendada como meacutetodo de
qualidade dos planteis de organismos cultivados Nestes testes satildeo utilizadas
substacircncias de referecircncias que incluem principalmente os sais dicromato de potaacutessio
cloreto de potaacutessio e cloreto de soacutedio Estes dois uacuteltimos satildeo mais recomendados pois
seus efluentes experimentais oferecem baixo risco de contaminaccedilatildeo ambiental Os testes
de sensibilidade geralmente satildeo de curta duraccedilatildeo (24 horas) e devem ser repetidos com
frequumlecircncia principalmente nos laboratoacuterios que mantecircm planteis de organismos-testes
pois estes dados servem como padratildeo na sensibilidade natural dos organismos Esta
teacutecnica vem sendo utilizada para avaliar os resultados de toxicidade pois a accedilatildeo toacutexica
somente poderaacute ser atribuiacuteda agrave substacircncia teste quando a sensibilidade natural dos
organismos natildeo tiver demonstrado qualquer alteraccedilatildeo ao longo do periacuteodo em que
foram testados (Ranzani-Paiva et al 2004)
O estudo dos efeitos de agentes toacutexicos sobre a vida aquaacutetica pode ser realizado
por meio de ensaios bioloacutegicos na natureza ou em condiccedilotildees laboratoriais controladas
sendo este uacuteltimo os mais utilizados por permitirem um controle mais efetivo de fatores
ocasionais como temperatura pH duraccedilatildeo de exposiccedilatildeo meio concentraccedilatildeo Ao se
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avaliar a toxicidade de agentes toacutexicos ou misturas destes frente a um reativo bioloacutegico
geralmente se utiliza uma populaccedilatildeo homogecircnea possuindo uma sensibilidade definida
determinando-se a concentraccedilatildeo responsaacutevel por um efeito toacutexico (efeito letal subletal
crocircnico imobilizaccedilatildeo ou modificaccedilatildeo do comportamento entre outros) Estes testes
podem ser realizados utilizando-se sistemas de fluxo contiacutenuo semi estaacuteticos ou
estaacuteticos Quanto ao meio pode-se utilizar meio aquaacutetico do tipo aacutegua continental (aacutegua
dura rica em bicarbonatos e sulfatos dissolvidos ou aacutegua mole isenta de iacuteons caacutelcio e
magneacutesio) marinha ou salobra segundo as necessidades dos organismos avaliados
(CETESB 2008) Com relaccedilatildeo ao organismo-teste por razotildees teacutecnicas e econocircmicas eacute
impossiacutevel testar todas as espeacutecies que fazem parte do ecossistema aquaacutetico Assim
para esses estudos satildeo relacionados normalmente os organismos mais representativos
de cada niacutevel troacutefico na cadeia alimentar como algas microcrustaacuteceos e peixes
15 Caracterizaccedilatildeo do agrotoacutexico Thiodanreg
O endosulfan inseticida desenvolvido pela Hoechst Aktiengesellschaft na
Alemanha foi introduzido no mercado em 1957 com o nome comercial de Thiodan
(Goebel et al 1982 e Stumpf amp Abhaver 1986) O Thiodanreg eacute um inseticida acaricida
organoclorado do grupo quiacutemico eacutester do aacutecido sulfuroso de um diol ciacuteclico Esse
agrotoacutexico eacute classificado toxicologicamente como altamente toacutexico (Classe I)
classificaccedilatildeo ambiental como produto altamente perigoso aleacutem de inflamaacutevel e
corrosivo (Engelhardt amp Sarmento 2008)
O ingrediente ativo do Thiodanreg (350 gL de endosulfan) consiste na mistura de
dois isocircmeros sendo 70 de α-endosulfan e 30 de β-endosulfan Entre os produtos
derivados do metabolismo do endosulfan em mamiacuteferos o sulfato de endosulfan eacute o
principal metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica (Stumpf amp Abhaver 1986)
Os organoclorados como o Thiodanreg atuam nos canais de soacutedio do axocircnio
aumentando o periacuteodo de abertura destes canais O aumento do periacuteodo de abertura dos
canais de soacutedio leva a um aumento do fluxo de soacutedio para o interior da membrana e
acarretando um prolongamento da fase de despolarizaccedilatildeo apoacutes o pico do potencial de
accedilatildeo e devido a isso o inseto morre por hiperexcitaccedilatildeo Consequentemente a
propagaccedilatildeo contiacutenua do impulso nervoso gera tremores convulsotildees prostraccedilatildeo e
posteriormente a morte como observados em insetos Aleacutem disso pode afetar qualquer
tipo de crustaacuteceo peixes e mamiacuteferos inclusive em baixas concentraccedilotildees (Eto 1990
Pereira et al 2012)
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16 O uso do endosulfan
O endosulfan eacute o uacutenico inseticida organoclorado amplamente utilizado em todo
o mundo (Capkin et al 2006 Chakrabarty et al 2012) Segundo a empresa Bayer
(2010) fabricante do produto o Thiodanreg (endosulfan) eacute um inseticida para o controle
de insetos chupadores e mastigadores com accedilatildeo de contato e ingestatildeo Recomenda-se
seu uso especialmente em cultivos de cafeacute cana hortaliccedilas frutas vinhas e forragens
Adverte tambeacutem que natildeo se devem colher frutos ou vegetais tratados ateacute 21 dias apoacutes a
uacuteltima aplicaccedilatildeo
No Brasil segundo Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) a
importaccedilatildeo do endosulfan estaacute proibida a partir de julho de 2012 e sua utilizaccedilatildeo a partir
de 2013 (Molina 2010) A utilizaccedilatildeo de produtos agrave base de endosulfan no Brasil eacute
estimada em 44 milhotildees de toneladas em uma aacuterea de 22 a 36 milhotildees de hectares
podendo representar cerca de 40 do consumo mundial deste organoclorado segundo
dados do Programa Ambiental das Naccedilotildees Unidas (UNEP 2010) Segundo a Agecircncia
de Proteccedilatildeo Ambiental norte americana (EPA 1980) contaminaccedilotildees humanas por
endosulfan satildeo provenientes em 53 dos casos da ingestatildeo de aacutegua contaminada e em
47 dos casos do consumo de alimentos a base de peixes contaminados A mesma
agecircncia define como CL50 aguda valores de 017microgL-1 para truta arco-iacuteris e 740microgL-1
para Daphnia magna
A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em
consideraccedilatildeo a qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente
Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm 3572007 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo
do referido inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
17 Toxicidade aguda do endosulfan
O endosulfan apesar de pertencer agrave classe toxicoloacutegica I eacute altamente toacutexico
para animais aquaacuteticos e terrestres (espeacutecies natildeo alvo) e segundo a Agency for Toxic
Substances and Disease Registry - ATSDR (2000) possui de moderado a alto risco e
efeitos agudos e crocircnicos
Pinheiro et al (1998) advertem com veemecircncia sobre o perigo de contaminaccedilatildeo
do Pantanal e da Amazocircnia lugares ricos em recursos hiacutedricos por produtos agrave base de
endosulfan pois este produto eacute extremamente toacutexico para peixes e outros organismos
aquaacuteticos mesmo em doses muito pequenas O endosulfan natildeo dissolve facilmente na
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aacutegua e adere agraves partiacuteculas do solo levando anos para sua degradaccedilatildeo (Soares et al
2003)
18 Efeitos dos inseticidas organoclorados sobre peixes
Apesar dos mecanismos de toxicidade do endosulfan serem extensivamente
estudados alguns trabalhos foram conduzidos com o objetivo de se avaliar efeitos
histopatoloacutegicos dos agrotoacutexicos em peixes (Naqvi amp Vaishnavi 1993) especialmente
nas gocircnadas fiacutegados bracircnquias e rins Em um desses estudos Capkin et al (2006)
reportaram uma CL50 de 1978 gL para Oreochromis mikyss para 24 horas de
exposiccedilatildeo ao toacutexico o que causou aleacutem da morte de 50 dos animais convulsotildees nado
erraacutetico edema e separaccedilatildeo das lacircminas branquiais edema e necrose do fiacutegado dos
tuacutebulos renais e do tecido hematopoieacutetico Cengiz et al (2001) reportaram lesotildees
similares em bracircnquias do peixe-mosquito Gambusia affinis aleacutem de congestatildeo e
hipertrofia do fiacutegado com o uso do pesticida Thiodanreg Segundo Capkin et al (2006)
alcalinidade e temperatura da aacutegua aleacutem do tamanho dos peixes afetam a toxicidade do
endosulfan Assim peixes pequenos e meacutedios mantidos em temperatura de 131ordmC com
1978 microgL do toacutexico tiveram uma sobrevivecircncia de 25 e 425 respectivamente
enquanto os peixes grandes tiveram 100 de sobrevivecircncia Quando a temperatura da
aacutegua foi aumentada para 16ordmC nenhum dos peixes pequenos e meacutedios sobreviveu
enquanto os sobreviventes de peixes grandes diminuiacuteram para 775 O aumento da
alcalinidade de 198 mgL para 419 mgL ou superior aumentou (Plt0001) a
sobrevivecircncia dos peixes Em relaccedilatildeo agrave dureza entre 357 mgL e 126 mgL a
sobrevivecircncia dos peixes expostos ao endosulfan natildeo foi afetada Histologicamente as
bracircnquias dos peixes tiveram edema lamelar separaccedilatildeo do epiteacutelio das lamelas fusatildeo
lamelar e hipertrofia das ceacutelulas epiteliais Os fiacutegados apresentaram edemas e necroses
graves
Cengiz amp Uumlnluuml (2002) estudaram os efeitos crocircnicos do endosulfan sob as
bracircnquias nas concentraccedilotildees de 05 e 075 microgL ao longo de 30 dias de experimento O
que se comprovou eacute que a dose mais elevada do endosulfan causou mais mudanccedilas
patoloacutegicas que a menor dose Altinok amp Capkin (2007) natildeo verificaram alteraccedilatildeo
morfoloacutegica nas bracircnquias de truta com 21 dias de exposiccedilatildeo de metiocarb entretanto
uma concentraccedilatildeo superior (375 mgL) causou separaccedilatildeo epitelial das bracircnquias No
mesmo trabalho os peixes expostos ao endosulfan com concentraccedilotildees de 06 e 13 microgL
mostraram mudanccedilas morfoloacutegicas nas bracircnquias como desprendimento do epiteacutelio
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aparecimento de granuloacutecitos nas lamelas fusatildeo e necrose lamelar hipertrofia e nuacutecleos
picnoacuteticos Essas evidecircncias comprovam o efeito do endosulfan com comprometimento
das bracircnquias levando a reduccedilatildeo do consumo de oxigecircnio e desregulaccedilatildeo da funccedilatildeo de
osmorregulaccedilatildeo em organismos aquaacuteticos Aleacutem disso os efeitos toacutexicos do endosulfan
no fiacutegado induziram modificaccedilotildees estruturais como hipertrofia dos hepatoacutecitos nuacutecleos
picnoacuteticos e necroses
No trabalho de Ballesteros et al (2007) que utilizaram peixes adultos da espeacutecie
Jenynsia multidentata os testes de toxicidade foram realizados durante 96 horas a fim
de determinar a concentraccedilatildeo letal (CL50) do endosulfan As alteraccedilotildees histoloacutegicas
foram determinadas nas bracircnquias e nos fiacutegados A CL50-96 horas foi significativamente
diferentes entre machos (0719 μgL) e fecircmeas (1317 μgL) A diferenccedila entre os sexos
foi atribuiacuteda ao dimorfismo no teor de lipiacutedios no sexo feminino (216) e masculino
(179) As alteraccedilotildees histoloacutegicas nas bracircnquias incluiacuteram hipertrofia e levantamento
do epiteacutelio das lamelas secundaacuterias e aneurismas Essas alteraccedilotildees causaram um
aumento significativo da espessura da lamela secundaacuteria no grupo tratado em relaccedilatildeo
aos peixes do grupo-controle Finalmente as alteraccedilotildees histoloacutegicas reversiacuteveis como
degeneraccedilatildeo hidroacutepica e dilataccedilotildees dos sinusoides foram observadas nos fiacutegados dos
peixes expostos bem como mudanccedila irreversiacutevel como necrose nas concentraccedilotildees
mais elevadas O fiacutegado eacute um oacutergatildeo importante na capacidade de degradar compostos
toacutexicos mas os seus mecanismos de regulaccedilatildeo podem ser comprometidos em
concentraccedilotildees elevadas causando mudanccedilas estruturais como observadas nesses
trabalhos
A qualidade da aacutegua eacute um fator importante para o sucesso da reproduccedilatildeo dos
peixes Quando a qualidade da aacutegua eacute alterada devido a produtos quiacutemicos a estrutura
histoloacutegica das gocircnadas tambeacutem eacute alterada Para Cengiz et al (2001) os efeitos do
Thiodanreg (endosulfan) satildeo tempo e dose dependentes Dutta et al (2006) descreveram
num estudo de toxicidade crocircnica as injuacuterias causadas pelo Thiodanreg sobre os tuacutebulos
seminiacuteferos do peixe ldquobluegillrdquo Lepomis macrochirus e relataram alteraccedilatildeo dos tuacutebulos
seminiacuteferos que mostraram perda dos padrotildees normais de organizaccedilatildeo celular
diminuindo tambeacutem o diacircmetro das espermatogocircnias primaacuterias gradativamente desde as
primeiras 24 horas de exposiccedilatildeo ateacute as duas semanas seguintes Segundo os autores este
tipo de dano pode afetar as espermaacutetides e os espermatozoides apresentando no final
um impacto negativo na espermatogecircnese e fertilidade do macho comprometendo o
nuacutemero da populaccedilatildeo do ldquobluegillrdquo Lepomis macrochirus Em outro trabalho sobre
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reproduccedilatildeo Hazarika amp Das (1998) identificaram mudanccedilas estruturais nos ovaacuterios de
Heteropneustes fossilis exposto ao organoclorado lindano por 72 horas Os resultados
demonstraram que houve ruptura e diminuiccedilatildeo do tamanho dos foliacuteculos maduros
afetando a fertilidade dos peixes
19 O lambari Astyanax bimaculatus
O lambari Astyanax bimaculatus (Linnaeus 1758) eacute conhecido popularmente
pelos nomes de lambari piaba lambari-guaccedilu mojarra pertence agrave famiacutelia Characidae
ordem Characiformes e ateacute entatildeo uma das espeacutecies da subfamiacutelia Tetragonopterinae
(CEMIGCETEC 2000) No entanto revisotildees recentes colocam o gecircnero em ldquoIncertae
sedisrdquo com 88 gecircneros e 620 espeacutecies sendo que 86 espeacutecies pertencem ao gecircnero
Astyanax (Lima et al 2003)
O A bimaculatus eacute um peixe de pequeno porte atingindo aproximadamente 20
cm de comprimento e pesando ateacute 40 gramas Possui corpo irregularmente eliacuteptico com
nadadeiras amarelas quatro a cinco dentes na seacuterie externa e cinco na seacuterie interna do
preacute-maxilar escamas com reflexos prateados mancha umeral ovalada e peduacutenculo
caudal com mancha alongada que se prolonga ateacute a ponta dos raios caudais medianos
(Britiski et al 1988 CEMIGCETEC 2000)
O gecircnero Astyanax possui ampla distribuiccedilatildeo geograacutefica sendo encontrado
desde o sudoeste dos Estados Unidos ateacute a Bacia do rio da Prata (Moreira Filho 1989
citado por Pereira Filho 2000) Os lambaris satildeo encontrados em cabeceiras de riachos
rios e lagos e vivem sempre em cardumes realizando curtas migraccedilotildees na eacutepoca das
cheias para sua reproduccedilatildeo Em relaccedilatildeo ao periacuteodo reprodutivo dos lambaris este pode
variar conforme a espeacutecie e o habitat sendo normalmente de setembro a marccedilo
(Vazzoler amp Menezes 1992 citados por Pereira Filho 2000)
A biologia reprodutiva do lambari pode ser prejudicada pelo desmatamento
ciliar poluiccedilatildeo industrial e domeacutestica e destruiccedilatildeo de vaacuterzeas e lagoas marginais por
projetos agriacutecolas que tambeacutem constituem ameaccedila em vaacuterias regiotildees (CEMIGCETEC
2000) Esses fatores interferem na dinacircmica da populaccedilatildeo desses peixes
Os lambaris satildeo oniacutevoros se alimentando de algas vegetais sementes larvas e
insetos adultos (CEMIGCETEC 2000) Os lambaris satildeo de extrema importacircncia em
diversos habitats por equilibrarem o ecossistema e a cadeia alimentar constituindo fonte
de alimentos para peixes maiores espeacutecies carniacutevoras e aves Em estudo conduzido com
o lambari da espeacutecie Astyanax janeiroensis verificaram-se que os principais haacutebitos
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alimentares se baseavam em algas microcrustaacuteceos pequenos invertebrados e esporos
vegetais (Santin et al 2005) Diversos trabalhos relatam na literatura a importacircncia do
lambari na estrutura troacutefica do ecossistema e sua variaccedilatildeo alimentar diante de
modificaccedilotildees ambientais (Motta amp Uieda 1995 Suarez et al 1995 Esteves 1998)
Trabalho conduzido por Loureiro et al (1995) verificando a dieta alimentar na espeacutecie
Hoplias malabaricus (traiacutera) no reservatoacuterio da UHE de Segredo (PR) mostraram a
ingestatildeo alimentar preferencial de lambaris de diversas espeacutecies Em outro estudo
verificou-se a importacircncia do lambari como alimento para as espeacutecies Hoplias
malabaricus Oligosarcus longirostris e Rhamdia branneri apoacutes o represamento do
Reservatoacuterio de Salto Caxias (PR) demonstrando ser o alimento preferido dessas
espeacutecies (Novakoski 2007) Aleacutem disso na regiatildeo sudoeste do estado de Minas Gerais
existem representantes do gecircnero no Reservatoacuterio de Furnas (MG) caracterizando a
reproduccedilatildeo ao longo do ano para o equiliacutebrio da cadeia alimentar tendo importacircncia
econocircmica na alimentaccedilatildeo e tambeacutem na praacutetica de pesca profissional (Bazzoli et al
1998 Carvalho et al 2009) Portanto os lambaris satildeo de grande importacircncia em
diversos habitats como consumidores secundaacuterios (Esteves 1998) A ecologia alimentar
de uma determinada espeacutecie faz parte e interfere diretamente na dinacircmica de sua
populaccedilatildeo sendo primordial para a conservaccedilatildeo do ecossistema como um todo (Vitule
amp Aranha 2002)
110 Morfologia hepaacutetica em teleoacutesteos
O fiacutegado eacute um oacutergatildeo multifuncional responsaacutevel por uma das etapas do
processo de desenvolvimento folicular principalmente no periacuteodo de formaccedilatildeo dos
gloacutebulos de vitelo momento em que ocorre a transferecircncia de vitelogenina para o
ovaacuterio etapa fisioloacutegica que inicia nas ceacutelulas da teca e ceacutelulas foliculares com
produccedilatildeo do estradiol No fiacutegado o estradiol estimula os hepatoacutecitos a produzirem a
vitelogenina e careogenina que satildeo levadas pela corrente sanguiacutenea ateacute o ovaacuterio onde
participam da formaccedilatildeo do vitelo e zona radiata durante a maturaccedilatildeo folicular
(Senthilkumaran et al 2004) A produccedilatildeo de vitelogenina no fiacutegado pode variar entre as
espeacutecies de teleoacutesteos devido agraves diferenccedilas na capacidade de armazenamento de energia
condiccedilatildeo fisioloacutegica haacutebitos alimentares e contaminaccedilatildeo (Peyon et al 1996 Hull amp
Harvey 2001 Al -Ghais 2013 Silva Barni et al 2014) Aleacutem disso o fiacutegado eacute
responsaacutevel pela conversatildeo do alimento e desintoxicaccedilatildeo de substacircncias estranhas
(Selman amp Walace 1989 Ribeiro et al 2006)
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O fiacutegado eacute glacircndula digestiva que apresenta superfiacutecie
coberta por uma membrana serosa e o tecido conjuntivo de sua caacutepsula
invagina para o parecircnquima (Takashima amp Hibiya 1995) O fiacutegado de teleoacutesteos eacute
constituiacutedo por hepatoacutecitos ceacutelulas epiteliais dos ductos biliares ceacutelulas endoteliais
ceacutelulas que armazenam gordura (ceacutelulas de Ito) macroacutefagos e ceacutelulas sanguiacuteneas
circulantes (Hinton et al 1984) e em algumas espeacutecies observam-se ceacutelulas do
pacircncreas exoacutecrino (pacircncreas intra-hepaacutetico) distribuiacutedas entre o parecircnquima do oacutergatildeo
assim como descrito para o lambari (Santos et al 2013)
Estruturas lobulares e uma pequena veia central estatildeo presentes em vertebrados
em peixes estas estruturas variam dependendo da espeacutecie e satildeo geralmente obscuras
(Takashima amp Hibyia 1995) Os hepatoacutecitos arranjam-se em fileiras os quais
geralmente apresentam a espessura de duas ceacutelulas O hepatoacutecito possui um nuacutecleo
uacutenico embora ceacutelulas binucleadas possam ser observadas O nuacutecleo se localiza na
regiatildeo central ou no poacutelo celular voltado para o sinusoide e o nucleacuteolo eacute bem evidente
(Arana 1995) A circulaccedilatildeo no fiacutegado eacute realizada pela arteacuteria hepaacutetica veia porta aleacutem
de capilares sinusoides Existem cordotildees de hepatoacutecitos que se arranjam
concentricamente ao redor dos capilares sinusoides (Takashima amp Hibyia 1995)
As vias biliares satildeo formadas por canaliacuteculos biliares preacute-duacutectulo biliar duacutectulo
biliar e ducto biliar O canaliacuteculo biliar eacute formado pela membrana plasmaacutetica dos
hepatoacutecitos e os microvilos dos mesmos preenchem o luacutemen do canaliacuteculo Nos
hepatoacutecitos existem ceacutelulas preacute-ductulares que estabelecem complexos juncionais com
os hepatoacutecitos formando os preacute-duacutectulos biliares A transiccedilatildeo entre preacute-duacutectulo e
duacutectulo ocorre quando o lume biliar estaacute completamente circundado por ceacutelulas
epiteliais biliares O ducto biliar eacute formado por ceacutelulas epiteliais cuacutebicas nos ductos de
menor calibre e ceacutelulas colunares nos grandes ductos sendo a presenccedila de lacircmina basal
o fator diferenciador dos mesmos Nos grandes ductos circundando a lacircmina basal
estatildeo fibroblastos plexo capilar fibras nervosas e ceacutelulas musculares lisas Acredita-se
que estas ceacutelulas musculares promovam os movimentos peristaacutelticos impulsionando a
bile Esse ducto une-se ao ducto ciacutestico dando origem ao ducto coleacutedoco (Arana 1995)
O endoteacutelio eacute fenestrado e a lacircmina basal estaacute ausente No espaccedilo de Disse haacute
ceacutelulas de Ito que em teleoacutesteos se caracterizam por apresentar vesiacuteculas lipiacutedicas
assim como o mesmo tipo celular em mamiacuteferos (Arana 1995) Haacute algumas mudanccedilas
patoloacutegicas que podem ocorrer no fiacutegado de peixes que sofreram exposiccedilatildeo a toacutexicos ou
outras substacircncias irritantes dissolvidas na aacutegua A atrofia eacute caracterizada por
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diminuiccedilatildeo do tamanho dos hepatoacutecitos com presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos Tambeacutem
podem ocorrer necrose degeneraccedilatildeo vacuolar degeneraccedilatildeo gordurosa estagnaccedilatildeo da
bile inflamaccedilatildeo do parecircnquima hepaacutetico (hepatites) cirrose hepaacutetica e
desenvolvimentos de tumores (Takashima amp Hibyia 1995)
111 Morfologia ovariana em teleoacutesteos
Os ovaacuterios das fecircmeas A bimaculatus seguem os padrotildees descritos para a
maioria dos teleoacutesteos sendo oacutergatildeos pares alongados e foliaacuteceos sofrendo
modificaccedilotildees na espessura volume e coloraccedilatildeo durante as diferentes fases do ciclo
reprodutivo conforme observado tambeacutem em outras espeacutecies do gecircnero (Drummond
1996 Miranda 1996 Melo et al 2005 Mazzoni et al 2005 Rodrigues amp Almeida
2005 Carvalho et al 2009 Prado et al 2011) Nesses peixes o ovaacuterio eacute do tipo
cistovariano onde o lume ovariano se estende ateacute o oviduto como na maioria dos
peixes teleoacutesteos (Nagahama 1983 Selman amp Wallace 1986 Connaughton amp Aida
1998)
Nas observaccedilotildees histoloacutegicas do ovaacuterio de A bimaculatus verificou-se que os
mesmos satildeo envolvidos externamente por uma serosa peritoneal constituiacuteda por
mesoteacutelio e lacircmina do tecido conjuntivo fibroso Profundamente a essa estrutura
observa-se tuacutenica albugiacutenea de natureza conjuntiva contendo fibroacutecitos e vasos
sanguiacuteneos A tuacutenica albugiacutenea emite septos para o interior do oacutergatildeo formando lamelas
ovuliacutegeras nas quais encontram-se ovogocircnias e foliacuteculos em diferentes fases de
desenvolvimento No lambari o tipo de desenvolvimento folicular eacute assincrocircnico com
a presenccedila de foliacuteculos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento (Miranda 1996
Drummmond 1996 Marcon 2008)
Em peixes o desenvolvimento folicular tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Begovac amp Wallace 1988 Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter
1996 Grier 2000 e 2002 Carvalho et al 2009) e como nos animais em geral
compreende os periacuteodos preacute-meioacutetico perinucleolar preacute-vitelogecircnico vitelogecircnico e
maturaccedilatildeo final Os foliacuteculos passam por diversas fases de desenvolvimento
diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo de acordo com o periacuteodo reprodutivo do animal (Wallace amp
Selman 1981) Essas fases ocorrem no interior de foliacuteculos cuja parede constituiacuteda de
zona radiata camada folicular membrana basal e teca (Grier 2000) desempenham um
importante papel durante a ovogecircnese e na fertilizaccedilatildeo
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A foliculogecircnse eacute regulada hormonalmente pelo eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-
gocircnada Em peixes teleoacutesteos estiacutemulos ambientais satildeo convertidos em informaccedilotildees
sensoriais no ceacuterebro associados com a liberaccedilatildeo de hormocircnios liberadores de
gonadotropinas (GnRH) pelo hipotaacutelamo que via corrente sanguiacutenea chegam agrave
adenohipoacutefise que sintetiza e libera hormocircnios gonodotroacutepicos hormocircnio fociacuteculo
estimulante (FSH) e hormocircnio luteinizante (LH) Os hormocircnios FSH e LH se ligam aos
receptores celulares das ceacutelulas tecais (LH-R) e foliculares (LH-R e FSH-R) para
estimularem a produccedilatildeo 17α-hydroxy-pregnesterona (17α-HP) e testosterona (T) Nas
ceacutelulas foliculares os hormocircnios esteroides 17α-HP e T agem como precursor na
produccedilatildeo do 17β-estradiol (17β-E) e do hormocircnio indutor de maturaccedilatildeo (MIH)
substacircncias importantes nas etapas do desenvolvimento folicular e na ovulaccedilatildeo
respectivamente (Dietrich amp Krieger 2009) (Figura 1)
Figura 1 Ceacutelulas somaacuteticas do ovaacuterio e principais produtos (Adaptado de Dietrich amp Krieger 2009)
Muitas das espeacutecies nativas natildeo desovam espontaneamente em ambientes
lecircnticos Algumas espeacutecies nativas quando mantidas em cativeiro se preparam para a
reproduccedilatildeo mas natildeo desovam naturalmente e sofrem regressatildeo ovariana com
consequente atresia dos foliacuteculos A atresia folicular eacute um processo degenerativo de
ocorrecircncia comum nos ovaacuterios de vertebrados e os foliacuteculos podem sofrer atresia em
diferentes fases do desenvolvimento ou diferenciaccedilatildeo (Guraya 1986 Miranda et al
1999 Santos et al 2008b)
A ovulaccedilatildeo refere-se agrave expulsatildeo do foliacuteculo em desenvolvimento maduro
(Redding amp Patintildeo 1993) Na natureza a ovulaccedilatildeo eacute regulada por dois hormocircnios os
quais estimulam o desenvolvimento gonadal em peixes FSH e LH (Connaughton amp
Aida 1998 Klausen et al 2001) Estes hormocircnios gonadotroacutepicos agem nos oacutergatildeos
reprodutores promovendo o desenvolvimento e maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas O
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processo de transporte dos hormocircnios para as ceacutelulas reprodutoras eacute lento em ambientes
naturais mas na reproduccedilatildeo artificial com a teacutecnica de hipofisaccedilatildeo esse processo
torna-se mais raacutepido em relaccedilatildeo ao processo natural (Woynarovich amp Horvath 1980)
Nos ovaacuterios de peixes teleoacutesteos com fertilizaccedilatildeo externa os foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios estruturas remanescentes da desova satildeo frequentes Um aspecto
interessante eacute saber a duraccedilatildeo da reabsorccedilatildeo dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios nos
procedimentos de desova induzida para as espeacutecies em criaccedilatildeo Drummond (1996) e
Marcon (2008) estudaram a reabsorccedilatildeo dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios no estroma
ovariano em maturaccedilatildeo avanccedilada de lambaris (A bimaculatus lacustris) e observaram
que cinco dias apoacutes a desova os foliacuteculos haviam sido reabsorvidos Durante esse
processo figuras de apoptose satildeo observadas em fecircmeas submetidas agrave hipofisaccedilatildeo
(Drummond et al 2000) o mesmo ocorrendo em Leporinus taeniatus (Anostomidae)
(Santos et al 2003) Santos et al (2008a) registraram por meio das teacutecnicas de TUNEL
e de imunoistoquiacutemica o iacutendice apoptoacutetico em ceacutelulas foliculares dos foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios em Prochilodus argenteus notando que o maior iacutendice de ceacutelulas
foliculares apoptoacuteticas coincidiu com menores valores de integrinas e colaacutegeno tipo IV
no terceiro dia apoacutes a desova induzida Esses achados demonstram a importacircncia dessas
proteiacutenas na integridade das ceacutelulas foliculares nos foliacuteculos
15
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do inseticida organoclorado
endosulfan em sua apresentaccedilatildeo comercial Thiodanreg sobre as caracteriacutesticas
morfoloacutegicas dos ovaacuterios e fiacutegado de fecircmeas adultas de lambaris A bimaculatus apoacutes
exposiccedilatildeo subletal a esse agrotoacutexico durante a maturaccedilatildeo avanccedilada
22 Objetivos especiacuteficos
Estimar a CL50 para fecircmeas adultas de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada
expostas ao inseticida organoclorado Thiodanreg
Avaliar histopatologicamente o fiacutegado dos animais dos grupos controles e tratados
Analisar por morfometria os principais constituintes celulares do fiacutegado nos grupos
controles e tratados
Avaliar diferenccedilas nos valores dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS) e
hepatossomaacutetico (IHS) de animais dos grupos controles e expostos ao toacutexico
Verificar provaacuteveis alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos diferentes estaacutedios de
desenvolvimento de foliacuteculos ovarianos nos grupos submetidos aos efeitos do
toacutexico utilizando-se microscopia de luz
Quantificar os diferentes tipos de foliacuteculos e avaliar por morfometria os diacircmetros
dos foliacuteculos vitelogecircnicos nos grupos controles e tratados
Avaliar e quantificar o processo de atresia folicular nos grupos controles
comparando-os com os grupos tratados
Analisar qualitativamente por imunoistoquiacutemica as proteiacutenas de adesatildeo celular
(integrina β1 e colaacutegeno do tipo IV) nas ceacutelulas foliculares ao longo do
desenvolvimento folicular nos peixes dos grupos controles e tratados e
16
Analisar qualitativamente por imunoistoquiacutemica a proteiacutena caspase 3 nas ceacutelulas
foliculares ao longo do desenvolvimento folicular nos peixes dos grupos controles e
tratados
17
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade Federal
de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste de toxicidade aguda e o teste subletal quanto
as atividades de coleta fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos fiacutegados As etapas de
microtomia coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e
morfomeacutetricas foram realizadas nos Laboratoacuterios de Peixes e de Histopatologia do
Departamento de Veterinaacuteria da UFV (DVTUFV)
31 Animais
Foram utilizadas fecircmeas do lambari A bimaculatus mantidas em tanques de terra
na Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso (g) de 1152 plusmn 201 e comprimento total (cm)
de 912 plusmn 064 As caracteriacutesticas para a escolha dos animais se basearam em aspectos
corporais como ventre abaulado poro genital dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV Os
aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuem capacidade de 50 litros numa
densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro
temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam
um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo contiacutenua de aacutegua para garantir o bem-estar
dos peixes (Figura 2) Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial Purina
contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas de
acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de 255
plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza total
2815 plusmn 594 mgL-1 (CaCO3)
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
18
Figura 2 Principais componentes estruturais dos grupos experimentais (Adaptado de Oliveira Ribeiro et al 2002)
A Bomba para oxigenaccedilatildeo da aacutegua B Termostato para controle da temperatura D Filtro interno L Material contra isolamento de ruiacutedo H-J Trecircs aquaacuterios para cada grupo experimental (Controle e e cada uma das concentraccedilotildees de Thiodanreg )
Os lotes de peixes (120 peixes em cada lote) foram destinados agrave accedilatildeo do toacutexico em
quatro tratamentos diferentes
Experimentos Tratamentos Experimento 1 sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo Experimento 2 sem aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo Experimento 3 com aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo
Experimento 4 com aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo
O periacuteodo de 10 dias para aclimataccedilatildeo dos peixes foi para permitir que as
caracteriacutesticas ovarianas sejam comparadas com os grupos que natildeo foram aclimatados
Dessa forma mostraraacute quais as melhores condiccedilotildees que esses peixes podem ter na
reproduccedilatildeo quando expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
32 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente experimento foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo com 350gL de endosulfan
33 Teste de toxicidade aguda em sistema estaacutetico ndash CL50
A definiccedilatildeo das concentraccedilotildees toacutexicas a serem testadas nem sempre ocorre de
maneira simples Muitas vezes faz-se necessaacuterio uma anaacutelise preliminar para a
definiccedilatildeo da melhor faixa de concentraccedilatildeo a ser considerada nos testes definitivos
Dessa forma a primeira providecircncia desse estudo de toxidade aguda eacute a realizaccedilatildeo de
testes preliminares que devem ser conduzidos com concentraccedilotildees toacutexicas relacionadas
entre si por progressotildees geomeacutetricas de razatildeo 10 calculadas com base em informaccedilotildees
19
obtidas por meio de testes jaacute realizados com outros organismos que mais se assemelham
filogeneticamente ao grupo em questatildeo (Ranzani-Paiva 2004) A partir dos resultados
obtidos nessa fase eacute possiacutevel estabelecer a faixa ideal de concentraccedilatildeo para conduccedilatildeo
dos testes definitivos com o lambari
O teste de concentraccedilatildeo letal (CL50) que avalia a concentraccedilatildeo responsaacutevel pela
mortalidade de metade dos animais foi realizado em sistema de aacutegua estaacutetico de acordo
NBR 15088 (ABNT 2007) com os animais mantidos sob restriccedilatildeo alimentar que se
iniciou 24 horas antes do iniacutecio e perdurou durante o teste Essa restriccedilatildeo alimentar foi
realizada para evitar acuacutemulo de mateacuteria orgacircnica que poderia interferir na accedilatildeo do
agrotoacutexico
Para o teste foram selecionados 120 lambaris fecircmeas adultas em maturaccedilatildeo
avanccedilada com aproximadamente 7cm de comprimento O agrotoacutexico utilizado foi o
Thiodanreg (Bayer) com 350gL-1 de endosulfan Foram utilizadas trecircs repeticcedilotildees com
cinco peixes cada para cada concentraccedilatildeo de Thiodanreg adotada sendo os grupos assim
classificados controle (0microgL-1) 15microgL-1 30microgL-1 60microgL-1 120microgL-1 240microgL-
1 480microgL-1 e 960microgL-1 As concentraccedilotildees foram distribuiacutedas em recipientes plaacutesticos
com 15L de aacutegua dos proacuteprios aquaacuterios (Figura 3) Para obter as diferentes
concentraccedilotildees o Thiodanreg foi diluiacutedo uma primeira vez 1100 (Soluccedilatildeo Padratildeo
Intermediaacuteria contendo 3500mgL-1 de endosulfan) e uma segunda vez 1100 (Soluccedilatildeo
Padratildeo Final contendo 35000microgL-1 de endosulfan) viabilizando a observaccedilatildeo da
toxicidade total do agrotoacutexico e natildeo apenas do princiacutepio ativo (Figura 4)
Figura 3 Recipiente utilizado e distribuiccedilatildeo das concentraccedilotildees
20
Figura 4 Preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo padratildeo final do Thiodanreg
Foram feitas as verificaccedilotildees de mortalidade a cada seis horas (zero 6 12 18 24
30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 e 96 horas) removendo-se os animais mortos o
que proporcionou menores interferecircncias pela decomposiccedilatildeo dos peixes gerando maior
confianccedila da mortalidade apresentada ser em funccedilatildeo da toxicidade do princiacutepio ativo
endosulfan sinergicamente agrave accedilatildeo dos solventes e demais compostos do inseticida Para
acompanhamento da temperatura foi adicionado 15L de aacutegua do mesmo aquaacuterio em
um recipiente idecircntico de forma que qualquer variaccedilatildeo na temperatura pudesse ser
medida sem provocar estresse adicional a nenhum grupo O teste teve iniacutecio no dia
16012010 agraves 1000 horas com teacutermino agraves 1000 horas do dia 20012010 O programa
utilizado para o caacutelculo da CL50 foi o TOXCALC determinando o valor e o intervalo de
confianccedila pelo meacutetodo PROBITUS (Plt005)
34 Teste de toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Depois de estimar a CL50 pelos testes preliminares foi realizada aclimataccedilatildeo de
novos lambaris como descrito no item 31 (Figura 2) onde os peixes se acostumaram
ao seu novo meio e agraves atividades normais de manutenccedilatildeo como alimentaccedilatildeo e limpeza
dos aquaacuterios O teste de toxicidade aguda com o endosulfan foi realizado baseando-se
principalmente nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo com a
NBR 15088 (ABNT 2007)
O teste de toxicidade subletal foi feito com trecircs diferentes dosagens do toacutexico
inferiores agrave CL50 e para fins estatiacutesticos cada concentraccedilatildeo incluindo-se o grupo
controle teve trecircs repeticcedilotildees sob as mesmas condiccedilotildees para depois se avaliar e
Thiodanreg
Soluccedilatildeo padratildeo
intermediaacuteria
(1100)
Soluccedilatildeo
padratildeo final
(1100)
3500mgL de soluccedilatildeo padratildeo
intermediaacuteria 35000 microgL de
soluccedilatildeo padratildeo
final
21
quantificar a mortalidade se for o caso observar o comportamento dos animais que
sobreviveram agrave intoxicaccedilatildeo e os efeitos morfoloacutegicos nos fiacutegados e ovaacuterios dos peixes
expostos Assim como foram trecircs repeticcedilotildees usando-se trecircs diferentes concentraccedilotildees do
toacutexico e um grupo controle para a realizaccedilatildeo do presente experimento foram
necessaacuterias 120 fecircmeas de lambari para cada experimento (Tabela 1)
Tabela 1 Distribuiccedilatildeo das fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus em cada grupo experimental
Repeticcedilatildeo Controle 115microgl 23microgl 56microgl A 10 10 10 10 B 10 10 10 10 C 10 10 10 10
Para cada peixe que sobreviveu agrave intoxicaccedilatildeo pelo periacuteodo de 96 horas (teste de
toxicidade subletal) foram obtidos dados biomeacutetricos como peso corporal comprimento
total e comprimento-padratildeo peso do fiacutegado e peso do ovaacuterio Os ovaacuterios e fiacutegados na
sequecircncia foram fixados para posterior anaacutelise histoloacutegica
35 Avaliaccedilatildeo morfoloacutegica
351 Microscopia de luz
Apoacutes 96 horas de experimento seis animais de cada grupo foram coletados
anestesiados com benzocaiacutena e eutanasiados para coleta dos ovaacuterios e fiacutegados Para o
estudo das caracteriacutesticas morfoloacutegicas de ovaacuterios e fiacutegados os fragmentos foram
fixados em paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo fosfato 01M pH 72 O material foi
fixado por um periacuteodo miacutenimo de 24 horas e preservado em aacutelcool 70 Em seguida os
fragmentos foram transferidos para soluccedilatildeo de aacutelcool 95 por quatro horas Apoacutes isso
os fragmentos de ovaacuterios e fiacutegados foram imersos em soluccedilatildeo de aacutelcool 95 e resina
glicolmetacrilato (Leica Historesin) na proporccedilatildeo de 11 por 12 horas seguida de resina
pura por 24 horas e posterior emblocamento Os fragmentos foram seccionados em
cortes com 3microm de espessura em microacutetomo rotativo com navalha de vidro Foi
preparada uma lacircmina por animal com quatro cortes em cada e em padratildeo semi-seriado
ou seja a cada corte aproveitado eram descartados cinco cortes seguintes para evitar que
a mesma ceacutelula fosse contada duas vezes no momento da anaacutelise baseando-se no
diacircmetro nuclear previamente estabelecido para cada tipo celular em questatildeo
22
As coloraccedilotildees utilizadas foram azul de toluidina e hematoxilinaeosina para
anaacutelises histotoloacutegicas e para morfometria Tambeacutem foi utilizada a reaccedilatildeo histoquiacutemica
com PAS contracorados com hematoxilina para os cortes de fiacutegados As lacircminas foram
montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e
as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
352 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos fiacutegados
Os estudos morfoloacutegicos foram conduzidos em seis animais por concentraccedilatildeo
As lacircminas histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo e fotografadas (ocular
de 10X e objetiva de 40X) em 10 campos ao acaso para anaacutelises morfoloacutegicas e
morfomeacutetricas que pudessem ser representativas dos efeitos do Thiodanreg no tecido
hepaacutetico Estas alteraccedilotildees foram comparadas com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos fiacutegados
das lacircminas do grupo controle
As alteraccedilotildees histoloacutegicas foram avaliadas semiquantitativamente em duas
formas 1) por meio do caacutelculo do Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) com base na
incidecircncia de lesotildees Para tanto atribuiu-se um valor numeacuterico para cada animal
conforme a escala grau 1 (ausecircncia de alteraccedilatildeo histoloacutegica) grau 2 (ocorrecircncia de
lesotildees pontualmente localizadas) e grau 3 (lesotildees amplamente distribuiacutedas pelo oacutergatildeo)
em 10 campos fotografados e 2) por meio do caacutelculo do Iacutendice de Alteraccedilatildeo
Histopatoloacutegica (IAH) com base na severidade de cada lesatildeo de acordo com Schwaiger
et al (1997) Para tanto as alteraccedilotildees foram classificadas em estaacutedios progressivos
quanto ao comprometimento das funccedilotildees do oacutergatildeo alteraccedilotildees de estaacutedio I que natildeo
comprometem o funcionamento do oacutergatildeo de estaacutedio II mais severas e que prejudicam
o funcionamento normal do oacutergatildeo e de estaacutedio III muito severas e irreversiacuteveis
adaptado de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic (1994) (Tabela 2) O valor de IAH foi
calculado para cada animal utilizando a foacutermula IAH =10ordm sumI + 10ˡ sumII + 10sup2 sumIII
sendo I II e III correspondentes ao nuacutemero de alteraccedilotildees de estaacutedio I II e III
respectivamente O valor meacutedio de IAH foi dividido em cinco categorias seguindo
metodologia de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic (1994) 0-10= funcionamento normal do
tecido 11-20= dano leve a moderado do tecido 21-50= dano moderado a severo do
tecido 51-100= dano severo do tecido maior que 100= dano irreparaacutevel do tecido Este
iacutendice permitiu a comparaccedilatildeo da severidade das lesotildees hepaacuteticas entre os peixes
expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
23
Tabela 2 Classificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histoloacutegicas do fiacutegado quanto ao estaacutegio de comprometimento das funccedilotildees teciduais (adaptado de Poleksic amp MitrovicndashTutundzic1994)
Para as anaacutelises morfomeacutetricas foram realizadas dez mediccedilotildees dos diacircmetros de
nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos para cada animal As medidas foram obtidas por
meio do programa Image-Pro Plus traccedilando duas linhas perpendiculares respeitando-se
os limites do nuacutecleo e do citoplasma do hepatoacutecito em anaacutelise (Figura 5) Aleacutem disso
foram quantificados pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleo citoplasma capilar sinusoides e
macroacutefagos em 10 campos (gradiacutecula com 100microm de lado e uma aacuterea de 10000micromsup2)
totalizando 4410 pontosanimal para o caacutelculo da constituiccedilatildeo tecidual hepaacutetica (Figura
6) Estas avaliaccedilotildees foram conduzidas nos grupos controles e grupos de peixes expostos
ao toacutexico nas diferentes concentraccedilotildees
A quantidade de glicogecircnio nos hepatoacutecitos foi avaliada em toda extensatildeo da
lacircmina de forma semiquantitativa sendo evidenciada pela reaccedilatildeo histoquiacutemica de
Periodic Acid Schiff (PAS) segundo Michalany (1980) Para melhor compreensatildeo dos
resultados as marcaccedilotildees foram determinadas na seguinte escala 0- ausecircncia de
glicogecircnio 1- pouco glicogecircnio 2- quantidade moderada de glicogecircnio 3- muito
glicogecircnio Apoacutes esta anaacutelise foi calculada uma meacutedia do conteuacutedo de glicogecircnio dos
hepatoacutecitos nos grupos controles e grupos expostos ao toacutexico nas diferentes
concentraccedilotildees
ALTERACcedilOtildeES HISTOPATOLOacuteGICAS HEPAacuteTICAS ESTAacuteGIO1 Alteraccedilatildeo nos hepatoacutecitosAtrofia nuclear I
Atorfia nuclear I
Deformaccedilatildeo do contorno celular I
Deformaccedilatildeo do contorno nuclear I
Hipertrofia celular I
Hipertrofia nuclear I
Nuacutecleo na periferia da ceacutelula II
Vacuolizaccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo nuclear II
Nuacutecleos picnoacuteticos II
Rompimento celular II
2 Alteraccedilotildees nos vasos sanguiacuteneos
Hiperemia II
Ruptura de vasos II
3 Necrose
Necrose focal III
24
Figura 5 Metodologia para obtenccedilatildeo de medidas de diacircmetro de nuacutecleo e citoplasma de hepatoacutecitos por meio do programa Image-Pro Plus Coloraccedilatildeo Azul de toluidina Barra 5microm
Figura 6 Gradiacutecula utilizada para contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos capilares e macroacutefagos (4410 pontosanimal) Coloraccedilatildeo Azul de toluidina
25
353 Anaacutelises morfomeacutetri cas e morfoloacutegicas dos ovaacuterios
Os estudos foram conduzidos em seis animais de cada grupo em cada
experimento As lacircminas histoloacutegicas foram analisadsas em toda sua extensatildeo em busca
de alteraccedilotildees morfoloacutegicas foliculares (Tabela 3) que pudessem ser representativas dos
efeitos do Thiodanreg no tecido ovariano sempre comparando estas alteraccedilotildees com o
padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios das lacircminas dos grupos controles
Para a avaliaccedilatildeo morfomeacutetrica foram realizadas contagens dos diferentes
estaacutegios de desenvolvimento folicular Para isto foram utilizadas fotografias obtidas a
partir de 10 campos escolhidos ao acaso em objetiva de 10X (campo com 5094microm de
largura por 68120microm de comprimento totalizando uma aacuterea de 1863 mmsup2) Aleacutem
disso foi realizada a contagem de foliacuteculos atreacutesicos e observados eosinoacutefilos
associados aos foliacuteculos vitelogecircnicos utilizando o microscoacutepio com objetiva de 40X
avaliando-se 10 foliacuteculos escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro
experimentos Tambeacutem foram realizadas mediccedilotildees de diacircmetros em 10 foliacuteculos
vitelogecircnicos para cada animal Estas medidas foram obtidas pelo programa Image-Pro
Plus traccedilando-se duas linhas perpendiculares sobre nuacutecleo e central e respeitando-se os
limites do foliacuteculo As mensuraccedilotildees foram realizadas em imagens obtidas com objetiva
de 4X (Figura 7) Em todas as contagens e mediccedilotildees foram calculados os valores
meacutedios e desvios-padratildeo para cada concentraccedilatildeo para se avaliar o desenvolvimento
folicular nos diferentes experimentos
Tabela 3 Alteraccedilotildees histoloacutegicas do ovaacuterio quanto ao comprometimento folicular (adaptado de Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS FOLICULAR ES Alteraccedilatildeo nos foliacuteculos
Descolamento do revestimento folicular
Retraccedilatildeo citoplasmaacutetica
Retraccedilatildeo nuclear
Atresia folicular
Aglutinaccedilatildeo nucleoplasmaacutetica
Aglutinaccedilatildeo citoplasmaacutetica
Aglutinaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo
Foliacuteculos vazios
Granuloacutecitos envolvendo foliacuteculos
26
Figura 7 Metodologia para obtenccedilatildeo de medidas de diacircmetro de ovoacutecitos vitelogecircnicos avanccedilados por meio do programa Image-Pro Plus Coloraccedilatildeo Hematoxilina eosina
354 Imunoistoquiacutemica
Para detectar a possiacutevel imunorreatividade para colaacutegeno tipo IV integrinas β1 e
caspase 3 no tecido conjuntivo ovaacuterios do lambari foram fixados em paraformaldeido a
4 A recuperaccedilatildeo antigecircnica foi realizada em forno microndas por 10 minutos com os
cortes nas lacircminas sendo imersos em tampatildeo citrato 10mM pH 60 As lacircminas foram
incubadas com peroacutexido de hidrogecircnio a 3 em tampatildeo fosfato por 15 minutos em
temperatura ambiente para inativar peroxidase endoacutegena e com soro albumina bovina a
2 por 45 minutos para bloquear marcador antigecircnico inespeciacutefico Anticorpos
primaacuterios anti-colaacutegeno tipo IV anti-integrina β1 e anti-caspase 3 (Santa Cruz
Biotechnology Calif USA) foram aplicados nas secccedilotildees a 4degC na diluiccedilatildeo 1100
(integrina e colaacutegeno tipo IV) e 1200 (Caspase 3) segundo o fabricante ldquoovernightrdquo
Os cortes foram lavados em PBS e incubados por 45 minutos com diluiccedilatildeo de 1200
com anticorpo secundaacuterio IgG anti-coelho (LSAB 2 sistema HRP da Dako Cytomation
kit Dako Cytomation Carpinteria Calif USA) e tratado com peroxidase conjugada
com estreptavidina por 45 minutos A revelaccedilatildeo foi realizada com diaminobenzidina
(DAB) e as lacircminas foram contracoradas com hematoxilina (Santos et al 2008a)
27
36 Paracircmetros biomeacutetricos
Para analisar quantitativamente a atividade reprodutiva do A bimaculatus foram
registrados para cada exemplar os seguintes dados biomeacutetricos peso corporal (em g)
peso dos ovaacuterios (em g) e peso do fiacutegado (em g) Os valores meacutedios e desvios-padratildeo
dos iacutendices gonadossomaacutetico e hepatossomaacutetico foram calculados para cada animal em
cada um dos grupos propostos no presente estudo
a) Iacutendice gonadossomaacutetico (IGS)
IGS=PG x100 PG= peso dos ovaacuterios
PC PC= peso corporal
b) Iacutendice hepatossomaacutetico (IHS)
IHS= PF x100 PF= peso do fiacutegado
PC PC= peso corporal
37 Anaacutelises estatiacutesticas
As variaacuteveis quantitativas foram submetidas aos testes de homocedasticidade
(Levenes) e normalidade (Shapiro-Wilk) e posteriormente agrave anaacutelise de variacircncia para
testar as variaccedilotildees nos valores meacutedios dos iacutendices calculados no momento da coleta (96
horas) entre os grupos controles e os grupos tratados Foi analisado o coeficiente de
variaccedilatildeo para se evitar erros estatiacutesticos tipo I e tipo II e logo apoacutes foi realizado o teste
parameacutetrico de Duncan ou Tukey (Plt005) para comparar os valores meacutedios Quando
natildeo atenderam agraves premissas de normalidade e homocedasticidade mesmo apoacutes as
transformaccedilotildees apropriadas os dados foram submetidos aos testes natildeo-parameacutetricos de
Kruskal-Wallis (ANOVA) Para as variaacuteveis qualititativas quantificadas foi utilizado o
teste de Kruskal-Wallis (ANOVA) Os graacuteficos foram produzidos usando o software
Microsoft Excel 2010
28
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5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 CAPIacuteTULO 1
EFEITOS DO INSETICIDA THIODAN reg SOBRE A MORFOLOGIA HEPAacuteTICA
DE FEcircMEAS DE LAMBARIS Astyanax bimaculatus
RESUMO
O Thiodanreg eacute um toacutexico que pode causar alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos tecidos de peixes
expostos a ele dependendo da concentraccedilatildeo A fim de investigar possiacuteveis alteraccedilotildees
este estudo avaliou a morfologia hepaacutetica de fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus
expostas ao Thiodanreg por 96 horas em quatro diferentes experimentos com trecircs
concentraccedilotildees subletais de 115 23 e 56 microgL de Thiodanreg aleacutem de um grupo
controle livre de toacutexico As fecircmeas foram divididas em quatro experimentos sem
aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem aclimataccedilatildeo e alimentados com aclimataccedilatildeo de 10 dias e
sem alimentaccedilatildeo e com aclimataccedilatildeo de 10 dias e alimentados Foi observado que a accedilatildeo do
Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou a estrutura morfoloacutegica do fiacutegado
como um todo mas foram observadas alteraccedilotildees em locais isolados do parecircnquima
hepaacutetico Houve depleccedilatildeo de glicogecircnio deformaccedilatildeo nuclear e citoplasmaacutetica
hipertrofia nuclear e citoplasmaacutetica hiperemia e degeneraccedilatildeo celular nos hepatoacutecitos
nas diferentes concentraccedilotildees No entanto o Iacutendice de Alteraccedilatildeo Histoloacutegica (IHA) e o
Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) demonstraram que as alteraccedilotildees observadas nos
fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas sendo na maioria alteraccedilotildees de estaacutedio I e II
de forma leve a moderada com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico em todas as
concentraccedilotildees Aleacutem disso houve alteraccedilatildeo do diacircmetro do nuacutecleo e citoplasma dos
hepatoacutecitos nos diferentes experimentos e maior quantidade de nuacutecleos de hepatoacutecitos
nos grupos expostos ao Thiodanreg associada agrave reduccedilatildeo na quantidade de citoplasma
Conclui-se que o Thiodanreg influenciou o metabolismo hepaacutetico como resposta
adaptativa celular A incidecircncia de alteraccedilotildees histoloacutegicas no fiacutegado dos lambaris
coletados nos diferentes experimentos indica o comprometimento da sauacutede destes
peixes e mostra que os paracircmetros analisados podem ser empregados como
biomarcadores da contaminaccedilatildeo ambiental nesta espeacutecie
Palavras-chave histopatologia fiacutegado peixe endosulfan ecotoxicologia
36
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 α-endosulfan e 30 β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo a
partir da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em risco os organismos que ali
residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al 2007)
Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos como jaacute
observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis niloticus A
Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan em gordura o valor de
005mgkg-1 (EPA 2002) e em aacutegua doce 022microgL-1 (EPA 1980) A Legislaccedilatildeo
Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em consideraccedilatildeo a qualidade da
aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm
3572007 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo do referido inseticida e
seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
A sensibilidade ao endosulfan pelos organismos aquaacuteticos tem sido bem descrita
na literatura (Capkin et al 2006 Ballesteros et al 2007 Pereira et al 2012) O
produto eacute extremamente toacutexico para peixes e outros organismos aquaacuteticos mesmo em
concentraccedilotildees muito pequenas (Cengiz et al 2001) No entanto a sensibilidade pode
variar entre os sexos assim como foi observado nos peixes adultos da espeacutecie Jenynsia
multidentata sob efeito do endosulfan por 96 horas (Ballesteros et al 2007) Neste
trabalho a CL50 em peixes machos foi de 072 μgL-1 enquanto nas fecircmeas foi de
131μgL-1 valores atribuiacutedos agraves diferenccedilas de maior reserva de lipiacutedeos nas fecircmeas que
nos machos Em outros estudos Capkin et al (2006) utilizaram 1978gL-1 em
Oreochromis mikyss por 24 horas de exposiccedilatildeo ao toacutexico o que causou aleacutem da morte
de 50 dos peixes convulsotildees nado erraacutetico separaccedilatildeo das lacircminas bracircnquiais e
necrose do fiacutegado e como Cengiz et al (2001) reportaram lesotildees similares no peixe-
mosquito Gambusia affinis
O sulfato de endosulfan eacute um dos produtos derivados do metabolismo do
endosulfan sendo considerado o principal metaboacutelito devido agrave sua importacircncia
toxicoloacutegica (Stumpf amp abhaver 1986) e por ser mais estaacutevel no meio ambiente do que
37
quando estaacute em sua foacutermula original (Ali et al 1984) Decorrente disto os peixes
quando expostos a este inseticida podem apresentar alteraccedilotildees morfoloacutegicas
significativas no fiacutegado (Capkin et al 2006 Coimbra et al 2007 Glover et al 2007)
Estas alteraccedilotildees morfoloacutegicas podem ser o surgimento de vacuolizaccedilatildeo dos hepatoacutecitos
depleccedilatildeo de glicogecircnio alteraccedilatildeo dos vasos sinusoides alteraccedilatildeo do tamanho dos
hepatoacutecitos e necroses o que de acordo com alguns autores pode influenciar a siacutentese
de vitelogenina no fiacutegado para formaccedilatildeo dos foliacuteculos vitelogecircnicos em periacuteodo
reprodutivo (Senthilkumaran et al 2004 Al-Ghais 2013 Silva Barni et al 2014 )
Aleacutem disso as funccedilotildees hepaacuteticas podem ser influenciadas pelas diferenccedilas na
capacidade de exposiccedilatildeo a contaminantes condiccedilatildeo fisioloacutegica armazenamento de
energia e haacutebitos alimentares (Ribeiro et al 2006 Al -Ghais 2013 Silva Barni et al
2014)
O lambari Astyanax bimaculatus foi escolhido como organismo experimental
pois eacute muito representativo no ecossistema sendo encontrado desde o Nordeste
brasileiro ateacute a bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Eacute um peixe de
pequeno porte e de faacutecil manutenccedilatildeo em laboratoacuterio
Este estudo teve como objetivo verificar a ocorrecircncia de alteraccedilotildees histoloacutegicas
no fiacutegado de fecircmeas de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada e avaliar a intensidade
de alteraccedilatildeo deste orgatildeo em peixes alimentados e desprovidos de alimento durante
ensaios subletais agudos com o toacutexico Thiodanreg
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste de toxicidade aguda e o teste subletal As
atividades de coleta fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos fiacutegados microtomia
coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e morfomeacutetricas foram
realizadas nos Laboratoacuterios de Peixes e de Histopatologia do Departamento de
Veterinaacuteria da UFV (DVTUFV)
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
38
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos animais em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado poro genital
dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV Os
aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuem capacidade de 50 litros numa
densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro
temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam
sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo contiacutenua da aacutegua para garantir o bem-estar dos
peixes Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial Purina contendo 35 de
proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste da toxicidade aguda em sistema estaacutetico - CL 50
O teste de concentraccedilatildeo letal (CL50) que avalia a concentraccedilatildeo responsaacutevel pela
mortalidade de 50 dos animais foi realizado em sistema de aacutegua estaacutetico de acordo
com a NBR 15088 (ABNT 2007) com os animais mantidos em restriccedilatildeo alimentar que
se iniciou 24 horas antes do iniacutecio do experimento e perdurou durante todo o teste (96
horas) Essa restriccedilatildeo alimentar foi realizada para evitar acuacutemulo de mateacuteria orgacircnica
que poderia interferir na accedilatildeo do agrotoacutexico
Para o teste foram selecionadas 120 fecircmeas adultas de lambari em maturaccedilatildeo
avanccedilada O agrotoacutexico utilizado foi o Thiodanreg (Bayer) com 350gL-1 de endosulfan
Foram utilizadas trecircs repeticcedilotildees com cinco peixes cada para cada concentraccedilatildeo de
39
Thiodanreg adotada sendo os grupos assim classificados controle (0microgL-1) 15microgL-1
30microgL-1 60microgL-1 120microgL-1 240microgL-1 480microgL-1 e 960microgL-1 As concentraccedilotildees
foram distribuiacutedas em recipientes plaacutesticos com 15L de aacutegua dos proacuteprios aquaacuterios
Foram realizadas verificaccedilotildees de mortalidade a cada seis horas ateacute 96 horas
(zero 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 e 96 horas) removendo-se
os animais mortos o que proporcionou menores interferecircncias pela decomposiccedilatildeo dos
peixes gerando maior confianccedila da mortalidade apresentada ser em funccedilatildeo da
toxicidade do princiacutepio ativo endosulfan sinergicamente agrave accedilatildeo dos solventes e demais
compostos do inseticida Para acompanhamento da temperatura foi acondicionado 15L
de aacutegua do mesmo aquaacuterio em um recipiente idecircntico de forma que qualquer variaccedilatildeo
na temperatura pudesse ser medida sem provocar estresse adicional a nenhum grupo O
programa utilizado para o caacutelculo da CL50 foi o TOXCALC determinando o valor e
intervalo de confianccedila pelo meacutetodo PROBITUS (Plt005)
24 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi realizado baseando-se
principalmente nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo a NBR
15088 (ABNT 2007)
As fecircmeas foram expostas ao Thiodanreg (endosulfan 350gL-1) por 96 horas em
quatro tratamentos diferentes 1) experimento sem aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem
alimentaccedilatildeo 2) experimento sem aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo 3) experimento com
aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e 4) experimento com aclimataccedilatildeo de 10 dias
e com alimentaccedilatildeo Todos os experimentos foram constituiacutedos por trecircs concentraccedilotildees
diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 preacute-determinada em laboratoacuterio de acordo com
a NBR 15088 (ABNT 2007) e um grupo controle sem toacutexico As concentraccedilotildees
utilizadas em cada experimento foram de 115 23 e 56microgL-1 com trecircs repeticcedilotildees sob
as mesmas condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
25 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas
Apoacutes 96 horas de experimento foram coletados 96 peixes sendo seis animais
em cada grupo nos diferentes experimentos Logo em seguida os fiacutegados foram
coletados apoacutes os peixes terem sido anestesiados com benzocaiacutena (110000) e
eutanasiados pela secccedilatildeo transversal da coluna vertebral na regiatildeo do opeacuterculo
40
Para a histologia todas as amostras foram fixadas em paraformaldeiacutedo a 4 em
tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedos em resina glicolmetacrilato
(Leica Historesinreg) Em seguida secccedilotildees com 3microm de espessura foram coradas
utilizando azul de toluidina para as anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas As lacircminas
foram montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31
Olympus e as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software
Analysis GETIT Olympus
As lacircminas histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo e foram
fotografados 10 campos ao acaso em objetiva de 40X para anaacutelises morfoloacutegicas e
morfomeacutetricas que pudessem ser representativas do efeito do Thiodanreg no tecido
hepaacutetico Estas alteraccedilotildees foram comparadas com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos fiacutegados
dos grupos controles
As alteraccedilotildees histoloacutegicas foram avaliadas semiquantitativamente de duas
formas 1) por meio do caacutelculo do Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) com base na
incidecircncia de lesotildees Para tanto atribuiu-se um valor numeacuterico para cada oacutergatildeo
conforme a escala grau 1 (ausecircncia de alteraccedilatildeo histoloacutegica) grau 2 (ocorrecircncia de
lesotildees pontuais) e grau 3 (lesotildees amplamente difusas pelo oacutergatildeo) em 10 campos
fotografados e 2) pelo caacutelculo do Iacutendice de Alteraccedilatildeo Histotoloacutegica (IAH) com base na
severidade de cada lesatildeo de acordo com Schwaiger et al (1997) Para tanto as
alteraccedilotildees foram classificadas em estaacutedios progressivos quanto ao comprometimento
das funccedilotildees do oacutergatildeo alteraccedilotildees de estaacutedio I que natildeo comprometem o funcionamento
do oacutergatildeo de estaacutedio II mais severas e que prejudicam o funcionamento normal do
oacutergatildeo e de estaacutedio III muito severas e irreversiacuteveis (adaptado de Poleksic amp Mitrovic-
Tutundzic 1994) (Tabela 1) O valor de IAH foi calculado para cada animal utilizando a
foacutermula IAH =10ordm sumI + 10ˡ sumII + 10sup2 sumIII sendo I II e III correspondentes agraves
alteraccedilotildees de estaacutedios I II e III respectivamente O valor meacutedio de IAH foi dividido em
cinco categorias que seguiu metodologia de Poleksic amp Mitrovic- Tutundzic (1994) 0-
10= funcionamento normal do tecido 11-20= dano leve a moderado do tecido 21-50=
dano moderado a severo do tecido 51-100= dano severo do tecido maior que 100=
dano irreparaacutevel do tecido Este iacutendice permitiu a comparaccedilatildeo da severidade das lesotildees
hepaacuteticas entre os peixes expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
Para as anaacutelises morfomeacutetricas foram realizadas mediccedilotildees dos diacircmetros de dez
nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos para cada animal As medidas foram obtidas por
meio do programa Image-Pro Plus traccedilando duas linhas perpendiculares respeitando-se
41
os limites do nuacutecleo e do citoplasma do hepatoacutecito em anaacutelise Aleacutem disso foram
quantificados pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleo de hepatoacutecito citoplasma de hepatoacutecito
capilares sinusoides e macroacutefagos em 10 campos utilizando-se gradiacutecula com 441
pontos de interseccedilatildeo com 100microm de lado e uma aacuterea de 10000micromsup2 totalizando 4410
pontosanimal para o caacutelculo da constituiccedilatildeo tecidual hepaacutetica
Tabela 1 Classificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histoloacutegicas do fiacutegado quanto ao estaacutegio de comprometimento das funccedilotildees teciduais (adaptado de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic 1994)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS HEPAacuteTICAS ESTAacuteDIO 1 Alteraccedilotildees nos hepatoacutecitos I Atrofia nuclear I Deformaccedilatildeo do contorno celular I Deformaccedilatildeo do contorno nuclear I Hipertorfia celular I Hipertorfia nuclear I Nuacutecleo na periferia da ceacutelula I Vacuolizaccedilatildeo citoplasmaacutetica I Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II Degeneraccedilatildeo nuclear II Nuacutecleo picnoacuteticos II Rompimento celular II 2 Alteraccedilotildees nos vasos sanguiacuteneos Hiperemia II Ruptura de vasos II 3 Necrose Necrose focal III
A quantidade de glicogecircnio nos hepatoacutecitos foi avaliada em toda extensatildeo da
lacircmina de forma semiquantitativa sendo evidenciada pela reaccedilatildeo histoquiacutemica de
Periodic Acid Schiff (PAS) seguida de contracoloraccedilatildeo com hematoxilina segundo
Michalany (1980) Para melhor compreensatildeo dos resultados as marcaccedilotildees foram
determinadas na seguinte escala 0- ausecircncia de glicogecircnio 1- pouco glicogecircnio 2-
quantidade moderada de glicogecircnio 3- muito glicogecircnio Apoacutes esta anaacutelise foi
calculada uma meacutedia do conteuacutedo de glicogecircnio dos hepatoacutecitos nos grupos controles e
grupos expostos ao toacutexico nas diferentes concentraccedilotildees
42
26 Iacutendice hepatossomaacutetico (IHS)
Para o caacutelculo do IHS foram registrados para cada exemplar os dados
biomeacutetricos de peso corporal (PC em g) e peso do fiacutegado (PF em g) Os valores meacutedios
e os desvios padratildeo do iacutendice hepatossomaacutetico (IHS=PFx100PC) foram calculados
para cada animal em cada um dos grupos nos diferentes experimentos nas diferentes
concentraccedilotildees
27 Anaacutelises estatiacutesticas
Os dados estatildeo apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo
Os dados foram avaliados pelo Software Statistica 70 por meio da anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) Apoacutes o teste de distribuiccedilatildeo normal os dados foram comparados
entre os grupos controle e grupos expostos ao Thiodanreg usando anaacutelise de variacircncia
one-way seguida pelo teste de Tukey ou Duncan Quando os dados natildeo apresentaram
uma distribuiccedilatildeo normal foi utilizado o teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Plt005 foi utilizado como criteacuterio de significacircncia
3 RESULTADOS
31 Determinaccedilatildeo da CL50-96h
Nas primeiras seis horas de experimento observou-se mortalidade de 100 de
peixes na concentraccedilatildeo de 96microgL-1 944 de mortalidade em 48microgL-1 733 de
mortalidade em 24microgL-1 266 de mortalidade em 12microgL-1 e 20 de mortalidade em
6microgL-1 sendo um total de 447 dos peixes que morreram nas diferentes
concentraccedilotildees do Thiodanreg nas primeiras seis horas Na concentraccedilatildeo de 3microgL-1
morreu apenas um peixe no final das 96 horas Foi observado 100 de mortalidade na
concentraccedilatildeo de 48microgL-1 em ateacute 12 horas de exposiccedilatildeo ao toacutexico As menores
mortalidades foram registradas nas concentraccedilotildees de Thiodanreg de 3microgL-1 e 6microgL-1
sendo respectivamente 944 e 80 de sobrevivecircncias A concentraccedilatildeo de 15microgL-1
de Thiodanreg e o grupo controle natildeo tiveram mortalidade A temperatura da aacutegua
apresentou variaccedilatildeo entre 220ordmC e 245 ordmC com meacutedia de 233plusmn072 ordmC
Os valores registrados determinaram CL50-96hs de 1367microgL-1para as fecircmeas de
A bimaculatus com intervalo de confianccedila de 101 a 184microgL-1 (Plt005)
43
32 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Durante a exposiccedilatildeo ao Thiodanreg por 96 horas foi observado comportamento
anormal dos peixes com nado erraacutetico tentativa de fuga dos aquaacuterios demonstraccedilatildeo de
agressividade com os demais peixes busca de oxigecircnio na superfiacutecie e respiraccedilatildeo
branquial acelerada Apoacutes 24 horas do iacutenicio os animais apresentavam comportamento
normal e procuravam pelo alimento Estas mudanccedilas comportamentais ocorreram em
todas as concentraccedilotildees do agrotoacutexico utilizadas com maior intensidade na concentraccedilatildeo
de 56microgL do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo cuja temperatura meacutedia
foi superior agrave dos demais experimentos (Tabela 2)
33 Morfologia e frequecircncia das alteraccedilotildees histoloacutegicas nos fiacutegados
Morfologicamente o fiacutegado dos lambaris apresentou hepatoacutecitos hexagonais
com citoplasma de aspecto granular e vacuolizado nuacutecleo arredondado central nucleacuteolo
evidente e presenccedila de hepatopacircncreas Os hepatoacutecitos estavam dispostos em cordotildees
margeando os sinusoides (Figura 1 A)
Os infiltrados leucocitaacuterios foram observados nos grupos controles e nos grupos
expostos ao Thiodanreg (Figura 1 B)
A vacuolizaccedilatildeo foi evidente nos hepatoacutecitos das fecircmeas analisadas (Figura 1 A)
No fiacutegado das fecircmeas do experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve a presenccedila caracteriacutestica de acuacutemulos de lipiacutedios nos
hepatoacutecitos com a presenccedila de vesiacuteculas claras grandes e envolvidas por glicogecircnio
marcado positivamente pela reaccedilatildeo de PAS (Figura 1 C) Aleacutem disso foram observados
nuacutecleos deslocados para a periferia celular No experimento sem aclimataccedilatildeosem
alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve reaccedilatildeo negativa pelo PAS no
citoplasma dos hepatoacutecitos (Figura 1 D)
As alteraccedilotildees de estaacutedio I como deformaccedilatildeo do contorno nuclear nuacutecleo na
periferia da ceacutelula atrofia nuclear desarranjo dos cordotildees hepaacuteticos hipertrofia celular
e nuclear (Figuras 1 E-G Figuras 2 A-B) foram observadas nos grupos controles e
naqueles expostos ao Thiodanreg sendo que nos grupos tratados houve maior frequecircncia
O deslocamento do nuacutecleo para a periferia do hepatoacutecito foi observado nas fecircmeas do
experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 56microgL-1
Quanto agraves alteraccedilotildees de estaacutedio II a degeneraccedilatildeo nuclear (Figura 2 C) foi
raramente presente na maioria das concentraccedilotildees nos diferentes experimentos A
degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica (Figura 2 D) foi pouco frequente em todos os experimentos
44
assim como a hiperemia (Figura 2 E) A presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos (Figura 2 F) foi
mais frequente no experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e no experimento
com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
Os VMAs variaram entre 125 e 228 nas fecircmeas analisadas sendo a menor
meacutedia observada nos grupos controles e as maiores nos grupos expostos ao Thiodanreg o
que mostra incidecircncia maior de alteraccedilotildees pontuais no fiacutegado nos animais dos grupos
tratados Os VMAs do fiacutegado na espeacutecie estudada foram superiores (Plt005) nos peixes
expostos ao agrotoacutexico quando comparado aos peixes dos grupos controles (Tabela 3)
O IAH das fecircmeas nos diferentes experimentos apresentaram valores superiores
(Plt005) nos grupos expostos ao Thiodanreg quando comparados como os grupos
controles (Tabela 4) com exceccedilatildeo do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 115microgL-1 de endosulfan que natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
34 Diacircmetro dos nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos
Os resultados demonstraram aumento (Plt005) no diacircmetro dos nuacutecleos de
hepatoacutecitos dos peixes expostos ao Thiodanreg nas concentraccedilotildees de 115microgL-1 e
23microgL-1 quando comparados ao grupo controle no experimento sem aclimataccedilatildeosem
alimentaccedilatildeo Por outro lado foi registrada diminuiccedilatildeo (Plt005) do diacircmetro dos nuacutecleos
de hepatoacutecitos no experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo quando comparados
aos peixes expostos ao Thiodanreg na concentraccedilatildeo 115 e 23microgL-1 em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Tabela 5)
O diacircmetro do citoplasma apresentou aumento no experimento sem
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e no experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo com
diferenccedila (Plt005) registrada entre os peixes do grupos controles e expostos ao
agrotoacutexico com exceccedilatildeo do experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 23microgL-1 (Tabela 6) Entretanto houve diminuiccedilatildeo nos citoplasmas de
hepatoacutecitos nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo ao grupos controles (Plt005)
nos experimentos sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e no experimento com
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Tabela 6)
35 Quantificaccedilatildeo de nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos macroacutefagos e capilares
sanguiacuteneos no tecido hepaacutetico
Nas contagens de pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleos de hepatoacutecitos (Tabela 7)
foram observadas quantidades superiores nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo
45
aos grupos controles (Plt005) Na quantificaccedilatildeo dos citoplasmas de hepatoacutecitos foram
registradas contagens inferiores (Plt005) nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo
aos grupos controles exceto no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Tabela
8)
Na contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre macroacutefagos natildeo houve aumento
significativo (Pgt005) nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo ao controle (Tabela
9) Em relaccedilatildeo agrave contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre capilares sinusoides a
contagem foi igual na maioria dos peixes expostos ao agrotoacutexico quando comparados
com os controles apresentando diferenccedila significativa (Plt005) entre os grupos
expostos do experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo nas concentraccedilotildees de 115 e
56microgL-1 (Tabela 10)
36 Quantificaccedilatildeo do glicogecircnio hepaacutetico
Em todos os grupos controles e tratados nos diferentes experimentos foram
registrados valores meacutedios para o glicogecircnio variando entre 010 e 300 No
experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo no grupo tratado da concentraccedilatildeo de
56microgL-1 de Thiodanreg foi registrada a menor meacutedia (Tabela 11) No entanto houve
diferenccedila (Plt005) do glicogecircnio hepaacutetico na concentraccedilatildeo de 56microgL quando
comparada com as concentraccedilotildees de 115 e 23microgL-1 (Tabela 11 e Figura 1 D)
37 Iacutendice hepatossomaacutetico
As fecircmeas dos grupos experimentais expostos ao Thiodanreg natildeo apresentaram
diferenccedilas (Pgt005) nos valores do IHS quando comparados com os grupos controles
(Tabelas 12) Entretanto houve diferenccedila (Plt005) do IHS na concentraccedilatildeo de 56microgL-1
quando comparada com as concentraccedilotildees de 115 e 23microgL-1 no experimento sem
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Tabela 12)
4 DISCUSSAtildeO
No presente estudo o lambari apesar de ser de pequeno porte apresentou uma
CL50 de 1367microgL-1 em 96 horas sendo mais resistente que adultos de tilaacutepia niloacutetica
Musanhi (1987) determinou a CL50 96 48 e 24 horas de exposiccedilatildeo ao endosulfan para
tilaacutepia niloacutetica adulta encontrando valores de 142 380 e 103 microgL-1 Nas primeiras 24
horas de accedilatildeo do Thiodanreg nas concentraccedilotildees subletais de 115 23 e 56microgL-1 as
fecircmeas do presente estudo apresentaram comportamentos alterados assim como foi
46
observado na espeacutecie Danio rerio exposta ao endosulfan por 96 horas na concentraccedilatildeo
de 24microgL-1 aleacutem desta espeacutecie ter apresentado uma diminuiccedilatildeo do niacutevel de
acetilcolinesterase (AChE) (Pereira et al 2012) Por outro lado em estudo realizado
por Hernan da Cuntildea et al (2011) com a espeacutecie Cichlasoma dimerus exposta ao
endosulfan por 96 horas nas concentraccedilotildees de 025 1 2 3 4 e 16microgL-1 os peixes
exibiram comportamento indicativo de neurotoxicidade mas natildeo foram encontradas
diferenccedilas na atividade da AChE Estes estudos fornecem evidecircncias adicionais de
efeitos deleteacuterios da exposiccedilatildeo ao endosulfan sobre o sistema nervoso o que contribui
para as observaccedilotildees obtidas no presente estudo
As descriccedilotildees histoloacutegicas hepaacuteticas nas fecircmeas do presente estudo foram
semelhantes ao que foi caracterizado em outros peixes onde os hepatoacutecitos organizam-
se em fileiras ou cordotildees duplos em formato de placas representando um sistema de
fundo-cego anastomosado e de tuacutebulos ramificados (Metcalfe 1998 Hinton et al
2001)
A histologia e a fisiologia do fiacutegado satildeo similares nos vertebrados Ferguson
(1989) e Gingerich (1982) descrevem que existem algumas diferenccedilas estruturais
marcadas no parecircnquima hepaacutetico de peixes em especial pela ausecircncia de lobulaccedilatildeo
espaccedilo porta claacutessico e ausecircncia de zonaccedilatildeo no parecircnquima hepaacutetico o que permite
fluxo lento de sangue nos sinusoides com penetraccedilatildeo diminuiacuteda de quiacutemicos nos
hepatoacutecitos
A presenccedila de porccedilotildees pancreaacuteticas dentro do fiacutegado do lambari eacute descrita na
literatura (Santos et al 2013) Uma das funccedilotildees das ceacutelulas pancreaacuteticas distribuiacutedas
pelo fiacutegado eacute a produccedilatildeo da enzima de biotransformaccedilatildeo citocromo P450 diferente do
que eacute observado para mamiacuteferos onde esta enzima eacute ausente (Hahn et al 1994
Stegeman 1991) A presenccedila de ceacutelulas pancreaacuteticas em estruturas do tecido hepaacutetico
de A bimaculatus sugere a provaacutevel funccedilatildeo dessas ceacutelulas em auxiliar na
desintoxicaccedilatildeo Outra importante estrutura na detoxificaccedilatildeo eacute a presenccedila das ceacutelulas dos
endoteacutelios capilares nas quais tem sido confirmada e identificada a presenccedila de enzimas
citocromo P450 por meio de teacutecnicas de imunomarcaccedilatildeo (Lorenzana et al 1986)
Sendo assim a integridade estrutural dos capilares permanece intacta e sem
comprometimento das possiacuteveis funccedilotildees celulares que estas estruturas podem
desempenhar no tecido hepaacutetico de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
A ausecircncia de estagnaccedilatildeo biliar nos fiacutegados das fecircmeas de A bimaculatus eacute um
fator importante de que o Thiodanreg natildeo interferiu na fisiologia de excreccedilatildeo biliar nos
47
diferentes experimentos Histopatologicamente este tipo de alteraccedilatildeo eacute observado nos
citoplasmas dos hepatoacutecitos com a presenccedila de gracircnulos castanho-amarelados Esta
alteraccedilatildeo consiste na manifestaccedilatildeo fisiopatoloacutegica de uma condiccedilatildeo causada pela falta
de metabolismo e excreccedilatildeo biliar (Pacheco amp Santos 2002) uma vez que a bile
sintetizada pelos hepatoacutecitos permanece no interior das ceacutelulas natildeo sendo liberada para
o tubo digestivo (Simonato et al 2008) Este tipo de alteraccedilatildeo pode ser encontrado em
peixes expostos a toacutexicos (Pacheco amp Santos 2002) e tambeacutem em peixes que
apresentam algum problema nutricional quando satildeo mantidos em cativeiros (Langiano
amp Martinez 2008) No entanto no presente estudo natildeo foram registradas essas
evidecircncias o que sugere que a alimentaccedilatildeo nos grupos tratados com raccedilatildeo comercial de
todos os experimentos natildeo interferiu nas funccedilotildees biliares
Os agregados macrofaacutegicos estatildeo relacionados agrave quebra de eritroacutecitos (Herraez
amp Zapata 1986) apresentaccedilatildeo de antiacutegeno (Ellis 1980) armazenamento de ferro e
detoxicaccedilatildeo de substacircncias endoacutegenas e exoacutegenas (Herraez amp Zapata 1986) Hartley et
al (1996) propuseram a utilizaccedilatildeo do agregado macrofaacutegico como biomarcador de
poluiccedilatildeo aquaacutetica a partir da quantificaccedilatildeo destas estruturas Existem alguns estudos
comparativos em diferentes espeacutecies que tecircm demonstrado variaccedilotildees no nuacutemero
tamanho e pigmentaccedilatildeo destas estruturas em relaccedilatildeo agrave idade nutriccedilatildeo e estado de sauacutede
(Blazer et al 1987 Ferguson 1989 Agius et al 2003) Nos agregados podem ser
observados pigmentos do tipo lipofuscina ceroide hemossiderina e melanina (Wolke
1992 Wolf amp Wolfe 2005) mas no presente estudo natildeo foram evidenciadas nenhuma
destas estruturas
No fiacutegado das fecircmeas do grupo experimental sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
na maior concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve a presenccedila caracteriacutestica de acuacutemulos de
lipiacutedios nos hepatoacutecitos de dois peixes No entanto existem vaacuterias condiccedilotildees de
acuacutemulos de lipiacutedios nos hepatoacutecitos associados com a exposiccedilatildeo aos toacutexicos
(Thiyagarajah et al 1985 Biagianti-Risbourg et al 1995 Lumbertdacha et al 1995
Handy et al 1999 Fanta et al 2003) Glover et al (2007) submeteram o peixe salmatildeo
do Atlacircntico a dieta de 4microgkg de endosulfan por 14 e 35 dias sendo observadas
evidecircncias de lipidoses nos hepatoacutecitos O aparecimento destas estruturas nas fecircmeas de
A bimaculatus foi insignificante nos tecidos hepaacuteticos mas foram contabilizadas como
respostas individuais sugerindo uma disfunccedilatildeo hepaacutetica causada pelo Thiodanreg que
pode comprometer a fisiologia hepaacutetica destas fecircmeas
48
No presente estudo as frequecircncias de alteraccedilotildees morfoloacutegicas indicam que a
accedilatildeo toacutexica do Thiodanreg provocou uma distribuiccedilatildeo de lesotildees de incidecircncia leve a
moderada no tecido hepaacutetico nos diferentes experimentos sendo que nas maiores
concentraccedilotildees do toacutexico houve mais incidecircncias de alteraccedilotildees As alteraccedilotildees observadas
nos fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas isto eacute natildeo apresentaram necrose sendo que
a maioria das alteraccedilotildees satildeo de estaacutedios I e II com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico
As alteraccedilotildees histoloacutegicas tecircm sido relatadas em peixes expostos a ambientes poluiacutedos
(Braunbeck et al 1990 Takashima et al 1995 Schwaiger et al 1997) Da mesma
forma a frequecircncia das alteraccedilotildees pode indicar disfunccedilotildees induzidas por agentes
toacutexicos uma vez que aacutereas metabolicamente ativas do fiacutegado ficam reduzidas levando a
uma possiacutevel reduccedilatildeo geral nas funccedilotildees desempenhadas por este oacutergatildeo (Hinton amp
Laureacuten 1990 Oliveira Ribeiro et al 2002 Pacheco amp Santos 2002 Langiano amp
Martinez 2008) Este resultado sugere que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees
hepaacuteticas mesmo em concentraccedilotildees muito baixas nos diferentes experimentos
independentemente do peixe estar sendo alimentado ou natildeo
As alteraccedilotildees dos diacircmetros de nuacutecleos de hepatoacutecitos podem ser consideradas
resposta ao agente estressor sendo indicativo da ativaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica em
decorrecircncia do aumento da atividade metaboacutelica contra as condiccedilotildees adversas (Stephen
et al 1993 Takashima amp Hibyia 1995 Langiano amp Martinez 2008) Por outro lado a
diminuiccedilatildeo nuclear pode estar relacionada possivelmente com a multiplicaccedilatildeo de
hepatoacutecitos na reposiccedilatildeo de ceacutelulas lesadas em funccedilatildeo da multiplicaccedilatildeo celular (Gul et
al 2004) No trabalho realizado por Oliveira Ribeiro et al (2002) observaccedilotildees
qualitativas por microscopia de luz demonstraram diminuiccedilatildeo no diacircmetro dos nuacutecleos
de hepatoacutecitos na espeacutecie A bimaculatus com alimentaccedilatildeo controlada associada agrave
exposiccedilatildeo ao toacutexico tributiltin Este tipo de alteraccedilatildeo eacute um indicativo de processo
degenerativo celular uma vez que inicia com a condensaccedilatildeo e reduccedilatildeo do diacircmetro do
nuacutecleo (Oliveira Ribeiro et al 2002) No presente estudo as alteraccedilotildees nos diacircmetros
de nuacutecleo de hepatoacutecitos demostraram que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees
hepaacuteticas das fecircmeas
A hipertrofia dos hepatoacutecitos tambeacutem pode ser causada por contaminantes
(Arnold et al 1985) por mudanccedilas estruturais do hepatoacutecito relacionadas ao
funcionamento da ceacutelula (Hinton et al 1992) condiccedilotildees fisioloacutegicas ligadas agrave
reproduccedilatildeo (Wester et al 2003) e pela maior atividade metaboacutelica (Takashima amp
Hibyia 1995) Portanto o aumento do diacircmetro citoplasmaacutetico nos experimentos sem
49
adaptaccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e no experimento com adaptaccedilatildeosem alimentaccedilatildeo mesmo
natildeo apresentando caracteriacutestica de hipertrofia morfoloacutegica evidente mas morfomeacutetrica
sugere indiacutecios de maior metabolizaccedilatildeo pelos hepatoacutecitos nestes grupos experimentais
As alteraccedilotildees dos diacircmetros de citoplasmas dos hepatoacutecitos nos experimentos
demonstraram que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees hepaacuteticas
Na quantificaccedilatildeo de nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos nos diferentes
experimentos foram observados indiacutecios de proliferaccedilatildeo de hepatoacutecitos que pode ser
indicativo da accedilatildeo toacutexica dos hepatoacutecitos contra detoxificaccedilatildeo do Thiodanreg assim como
observado no trabalho por Gul et al (2004) O percentual do tecido hepaacutetico ocupado
por ceacutelulas do tipo hepatoacutecito variou entre 8742 a 9088 na constituiccedilatildeo do
parecircnquima hepaacutetico de A bimaculatus Poucos trabalhos citam a constituiccedilatildeo celular
em fiacutegados de peixes sendo 845 a 873 de hepatoacutecitos ocupando o parecircnquima
hepaacutetico na truta (Hampton et al 1989) e 899 no peixe Golden (Rocha et al 1997)
Estes valores demonstram que a maior parte das ceacutelulas dos fiacutegados nas fecircmeas de A
bimaculatus satildeo hepatoacutecitos como descrito em outras espeacutecies de peixes
O aumento da quantidade de macroacutefagos na concentraccedilatildeo 115microgL-1 dos
experimentos foi superior quando comparado aos demais grupos sugerindo que essa
mobilizaccedilatildeo pode estar ajudando na detoxicaccedilatildeo do fiacutegado (Herraez et al 1986)
Assim a presenccedila de maior quantidade de macroacutefagos e sinusoides podem ser
consideradas indicadoras de estresse em peixes decorrentes da presenccedila de agentes
quiacutemicos (Anderson amp Zeeman 1995 Rabitto et al 2005) Essas ceacutelulas satildeo
observadas frequentemente nas regiotildees proacuteximas aos sinusoides e desprovidas de
pigmentaccedilatildeo Foram observados macroacutefagos em trutas Oncorhynchus mykiss e Salmo
trutta fario na proporccedilatildeo de 02 e 07 respectivamente (Hampton et al 1985
Rocha et al 1997) enquanto no presente estudo variou entre 021 a 029 Meseguer
et al (1994) observaram macroacutefagos livres abundantes no parecircnquima do fiacutegado
sugerindo que estes se movem livremente dentro do parecircnquima formando os
agregados macrofaacutegicos quando haacute um aumento na atividade fagociacutetica como resposta
imune a lesotildees em indiviacuteduos expostos a contaminantes Entretanto no presente estudo
natildeo foram observadas estas caracteriacutesticas
Ainda vale ressaltar que esse toacutexico potencializa sua accedilatildeo em temperaturas mais
elevadas como aquelas observadas no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo
Estudando o efeito dos ciclodienos Correa et al (2001) Coutinho et al (2005) e
Capkin et al (2006) relataram que as alteraccedilotildees satildeo diretamente proporcionais agrave
50
temperatura da aacutegua ou seja quanto mais alta a temperatura mais toacutexicos os produtos
se tornam O experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
56microgL-1 registrou temperatura meacutedia da aacutegua em 269ordmC superior aos demais
experimentos Devido a isso uma resposta comum na intoxicaccedilatildeo em fiacutegados de peixes
eacute a diminuiccedilatildeo das reservas de glicogecircnio hepaacutetico (Seinen et al 1981 Ferguson 1989
Cyrino et al 2000) e iacutendice hepatossomaacutetico (Wester et al 1987 Wester et al 1988
Wester et al 2003 Glover et al 2007) evidenciada no presente estudo
No presente estudo percebeu-se que a accedilatildeo do Thiodanreg em concentraccedilotildees
subletais natildeo afetou o fiacutegado como um todo mas na forma de focos no parecircnquima
hepaacutetico nos diferentes experimentos Este tipo de lesatildeo pode estar associado agrave
concentraccedilatildeo do toacutexico utilizado tempo de exposiccedilatildeo e a via de contaminaccedilatildeo A
ventilaccedilatildeo branquial acelerada e a natildeo procura por alimentos nas primeiras 24 horas
observadas nos diferentes experimentos sugere que a entrada de aacutegua pela via branquial
foi a causa mais direta da absorccedilatildeo e difusatildeo do toacutexico para corrente sanguiacutenea ateacute
chegar ao fiacutegado No entanto a via epideacutermica tambeacutem poder ser considerada via de
entrada do toacutexico para os tecidos (Mckim et al 1999)
As alteraccedilotildees observadas nos fiacutegados podem afetar diretamente o metabolismo
das fecircmeas causando diminuiccedilatildeo da capacidade fisica e tornar os peixes uma presa faacutecil
para seus predadores Neste sentido os peixes poderatildeo ter menor sucesso reprodutivo e
se tornarem menos competitivos pelo alimento Do ponto de vista ecoloacutegico isso pode
acarretar alteraccedilotildees na populaccedilatildeo e na cadeia alimentar (Rodrigues amp Fanta 1998)
Nas condiccedilotildees que o estudo foi realizado como as concentraccedilotildees do inseticida
Thiodanreg que foram utilizadas o periacuteodo de exposiccedilatildeo e a espeacutecie de estudo conclui-se
que as fecircmeas podem estar em um processo inicial de intoxicaccedilatildeo um processo
patoloacutegico de recuperaccedilatildeo reversiacutevel
51
Figura 1 A Organizaccedilatildeo histoloacutegica do tecido hepaacutetico normal de A bimaculatus B Infiltrado leucocitaacuterio (IL) no tecido hepaacutetico de A bimaculatus C Hepatoacutecito com vesiacutecula clara (Vc) envolvida por glicogecircnio (G) marcado positivamente pela reaccedilatildeo de PAS e nuacutecleo (seta) deslocado na periferia da ceacutelula no experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo 56microgL-1 D Hepatoacutecito com ausecircncia de glicogecircnio evidenciada pela reaccedilatildeo negativa de PAS no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo 56microgL-1 Alteraccedilotildees de estaacutedio I - E Hepatoacutecito com nuacutecleo (seta) na perifieria F Atrofia nuclear (an) G Deformaccedilatildeo nuclear (dn) Nuacutecleo (N) e citoplasma (C) do hepatoacutecito sinusoacuteide (S) capilar (P) com hemaacutecias no interior acuacutemulo de glicogecircnio (G) no citoplasma e macroacutefagos (M) Barras A (30) B (65 microm) C e D (20 microm) E F e G (28 microm) Coloraccedilatildeo Azul de toluiacutedina em A-B e E-G e PAS em C e D
G S G
N
C
M
M
an
F E
Vc
IL G
B
C
A
D
G
dn
N
C
G
52
Dn
A
E
B
F
Figura 2 Alteraccedilotildees histoloacutegicas do tecido hepaacutetico de A bimaculatus Alteraccedilotildees de estaacutedio I-A Hipertrofia celular (seta) B Hipertrofia nuclear (seta) Alteraccedilotildees de estaacutedio II - C Degeneraccedilatildeo nuclear (Dn) D Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica (Dc) E Hiperemia () F Presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos (setas) Barras A B e E (30 microm) C D e F (25 microm) Coloraccedilatildeo Azul de toluiacutedina
C
A
Dc
D
53
Tabela 2 Valores meacutedios das temperaturas durante a realizaccedilatildeo dos experimentos
Tratamento Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Experimento 4 Controle 268plusmn105 254plusmn049 248plusmn069 250plusmn049
115mgL-1 271plusmn104 256plusmn059 247plusmn045 245plusmn040 23mgL-1 269plusmn117 255plusmn048 244plusmn062 247plusmn043 56mgL-1 269plusmn118 254plusmn048 244plusmn063 247plusmn038
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Legenda Experimento 1 - sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo Experimento 2 - sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo Experimento 3 - com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo Experimento 4 ndash com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
Tabela 3 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquantitativa das alteraccedilotildees
histoloacutegicas (VMA) em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 130 plusmn 020a 210 plusmn 030b 215 plusmn 019b 216 plusmn 011b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 130 plusmn 012a 190 plusmn 020b 190 plusmn 008aᵇ 228 plusmn 056b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 125 plusmn 012a 210 plusmn 021b 206 plusmn 017b 218 plusmn 027b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 130 plusmn 014a 200 plusmn 025b 221 plusmn 035b 228 plusmn 021b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 4 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquantitativa dos iacutendices das
alteraccedilotildees histoloacutegicas (IAH) em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 883plusmn1034a 1850plusmn1009aᵇ 2883plusmn832b 2566plusmn550aᵇ
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 433plusmn557a 2883plusmn 810b 2780plusmn1388b 2766plusmn571b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 566plusmn 585a 2600plusmn773b 2550plusmn1078b 2733plusmn920b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 750plusmn512a 2217plusmn780b 2033plusmn875b 2366plusmn880b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Duncan
54
Tabela 5 Diacircmetro meacutedio (microm) de nuacutecleos de hepatoacutecitos em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 461 plusmn 040aᶜ 498 plusmn 020b 487 plusmn 028b 439 plusmn 027c
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 516 plusmn 071a 501plusmn 040a 502 plusmn 020a 515plusmn025a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 494 plusmn 019a 496 plusmn 036a 492 plusmn 082a 508 plusmn 033a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 561 plusmn 044aᶜ 524 plusmn 040b ᶜ 509 plusmn 028b 533 plusmn 019c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 6 Diacircmetro meacutedio (microm) de citoplasmas de hepatoacutecitos de fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 885 plusmn 099a 1022 plusmn 109b 974 plusmn 080b 1005plusmn129b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1084 plusmn 136a 987 plusmn 153b 975 plusmn 081b 931 plusmn 080b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 960 plusmn 095a 1022 plusmn 094b 1003plusmn120aᵇ 1033 plusmn 108b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1086plusmn130aᵇ 104 plusmn 135b ᶜ 1022 plusmn 138c 1022 plusmn 106c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 7 Quantificaccedilatildeo meacutedia de nuacutecleos de hepatoacutecitos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 2553 plusmn 494a 298 plusmn 464b 284 plusmn 459b 291 plusmn 374b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 2371 plusmn 490a 289 plusmn 541b 289 plusmn 545b 290 plusmn 514b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 2560 plusmn 538a 294 plusmn 480b 286 plusmn 555b 293 plusmn 552b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 2770 plusmn 594a 314 plusmn 1028b 347 plusmn 664b ᶜ 322 plusmn 654c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
55
Tabela 8 Quantificaccedilatildeo meacutedia de citoplasmas no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 39551 plusmn 1056a 39666 plusmn 877a 39360 plusmn 1526a 40080 plusmn 727a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 39996 plusmn 1307a 39830 plusmn 722a 39618 plusmn 1143ab 38865 plusmn 1954b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 39603 plusmn 1755a 39011 plusmn 1620b 39445 plusmn 1388aᵇ 39205 plusmn 2212aᵇ
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 39381 plusmn 3025a 38555 plusmn 2723b 39036 plusmn 2275aᵇ 39136 plusmn 1892b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Tabela 9 Quantificaccedilatildeo meacutedia de macroacutefagos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2
de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 120 plusmn 113a 125 plusmn 089a 101 plusmn 100a 106 plusmn 094a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 101 plusmn 101a 124 plusmn 079a 102 plusmn 084a 131 plusmn 092a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 098 plusmn 089a 128 plusmn 097a 115 plusmn 095a 096 plusmn 090a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 101 plusmn 094a 128 plusmn 109a 086 plusmn 079a 101 plusmn 079a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Tabela 10 Quantificaccedilatildeo meacutedia de vasos sanguiacuteneos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 1875 plusmn 239a 133 plusmn 346a 1796 plusmn 1210a 1103 plusmn 465a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1603 plusmn 784aᵇ 1260 plusmn 532a 1409 plusmn 631aᵇ 2203 plusmn 685b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 1830 plusmn 579a 2036 plusmn 773a 1681 plusmn 560a 1865 plusmn 964a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1850 plusmn 1400a 1831 plusmn 1326a 1510 plusmn 774a 1645 plusmn 739a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
56
Tabela 11 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquatitativa de glicogecircnio nos hepatoacutecitos de fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 133 plusmn 051aᵇ 266 plusmn 081a 300 plusmn 000a 010plusmn 010b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 133 plusmn 051a 180 plusmn 109a 200 plusmn 109a 233 plusmn 103a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 216 plusmn 098a 116 plusmn 040a 216 plusmn 098a 233 plusmn 103a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 266 plusmn 081a 233 plusmn 103a 233 plusmn 103a 216 plusmn 098a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis Tabela 12 Iacutendice hepatossomaacutetico de fecircmeas de lambaris A bimaculatus nos grupos
controles e grupos expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 070 plusmn 014aᵇ 088 plusmn 03a 084 plusmn 038a 038 plusmn 031b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 113 plusmn 054a 104 plusmn 061a 102 plusmn 050a 102 plusmn 051a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 066 plusmn 029a 073 plusmn 020a 092 plusmn 017a 091 plusmn 012a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 074 plusmn 034a 072 plusmn 029a 094 plusmn 040a 063 plusmn 018a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Duncan
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52 CAPIacuteTULO 2
EFEITOS DO INSETICIDA THIODAN reg SOBRE A MORFOLOGIA DO
DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM LAMBARIS Astyanax bimaculatus
RESUMO
O Thiodanreg eacute um toacutexico que pode causar alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos tecidos de peixes
expostos dependendo da concentraccedilatildeo A fim de investigar possiacuteveis alteraccedilotildees este
estudo avaliou a morfologia ovariana de lambaris Astyanax bimaculatus expostos ao
Thiodanreg (endosulfan 350gL) por 96 horas em quatro diferentes experimentos com trecircs
concentraccedilotildees subletais 115 23 e 56 microgL As fecircmeas expostas ao Thiodanreg foram
divididas em quatro experimentos sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem
aclimataccedilatildeo e alimentados com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e com
aclimataccedilatildeo de 10 dias e alimentados No presente estudo percebeu-se que a accedilatildeo do
Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou a morfologia do desenvolvimento
folicular Poreacutem os experimentos com aclimataccedilatildeo demonstraram quantidades
inferiores de foliacuteculos primaacuterios e secundaacuterios quando comparados aos peixes dos
experimentos sem aclimataccedilatildeo Houve maior quantidade de foliacuteculos atreacutesicos nos
grupos expostos ao Thiodanreg em relaccedilatildeo ao grupo controle O diacircmetro folicular nos
foliacuteculos secundaacuterios dos peixes expostos ao Thiodanreg no experimento com
adaptaccedilatildeocom alimentaccedilatildeo foi maior em relaccedilatildeo ao grupo controle Aleacutem disso as
meacutedias dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS) e hepatossomaacutetico (IHS) dos experimentos
com aclimataccedilatildeo foram inferiores aos experimentos sem aclimataccedilatildeo Esses dados
sugerem que o eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-ovaacuterio pode estar sendo afetado pelo ambiente
ao qual o peixe foi submetido podendo causar comprometimento na fisiologia do
desenvolvimento folicular
Palavras-chave histopatologia ovaacuterio peixe contaminaccedilatildeo aquaacutetica
63
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 α-endosulfan e 30 β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo
por meio da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em riscos os organismos que ali
residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al 2007)
Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos como jaacute
observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis niloticus
No entanto a Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan em
gordura valores de 005mgkg-1 (EPA 2002) e para aacutegua doce 022microgL-1 (EPA 1980)
A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em consideraccedilatildeo a
qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente Resoluccedilatildeo
CONAMA - nordm 3572005 estabelece o valor limite de 0056gL de resiacuteduo do referido
inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
Muitos inseticidas apresentam baixa toxicidade antes de serem transformados
em substacircncias toacutexicas metabolicamente ativas O sulfato de endosulfan eacute um dos
produtos derivados do metabolismo do endosulfan sendo considerado o principal
metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica por ser mais estaacutevel no meio
ambiente do que em sua foacutermula original (Ali et al 1984) A sensibilidade ao
endosulfan em organismos aquaacuteticos tem sido descrita na literatura (Capkin et al 2006
Ballesteros et al 2007 Pereira et al 2012) O produto eacute extremamente toacutexico para os
peixes e outros organismos aquaacuteticos mesmo em concentraccedilotildees muito pequenas
(Cengiz et al 2001) como verificado tambeacutem por Ballesteros et al (2007) com peixes
adultos da espeacutecie Jenynsia multidentata sob o efeito do endosulfan por 96 horas
utilizando concentraccedilotildees de 072 μgL e 131 μgL em machos e fecircmeas
respectivamente
Em peixes o desenvolvimento folicular tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Begovac amp Wallace 1988 Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter
1996 Grier 2000 2002 e 2007) e como nos animais em geral compreende os periacuteodos
preacute-meioacutetico perinucleolar vitelogecircnico e maturaccedilatildeo final Estas fases ocorrem no
64
interior de foliacuteculos cuja parede eacute constituiacuteda por zona radiata camada folicular
membrana basal e teca (Grier 2000) e que desempenham importante papel durante a
ovogecircnese e fertilizaccedilatildeo Quando a qualidade da aacutegua eacute alterada devido a xenobioacuteticos
a gametogecircnese pode ser alterada comprometendo a fertilizaccedilatildeo e a qualidade do ovo
(Chatterjee et al 1997) Assim os peixes quando expostos a inseticidas podem
apresentar alteraccedilotildees morfoloacutegicas significativas no ovaacuterio
Alguns trabalhos mostram diversas alteraccedilotildees provocadas nos foliacuteculos por
contaminantes como por exemplo retraccedilatildeo citoplasmaacutetica degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica
adesatildeo folicular aparecimento de foliacuteculos anucleados necrose e alteraccedilatildeo no diacircmetro
dos foliacuteculos (Hazarika amp Das 1998 Dutta et al 2003 Maxwell amp Dutta 2005) Aleacutem
disso pode ocorrer a atresia folicular que eacute um processo frequentemente observado nos
ovaacuterios dos vertebrados (Saidapur 1978) sendo causada por diversos fatores como
agrotoacutexicos temperatura luz alimentaccedilatildeo inadequada e confinamento (Nagahama
1983 Guraya 1986) Outro fator importante eacute a concentraccedilatildeo hormonal que pode
interferir na siacutentese de vitelogenina e causar efeitos negativos associados com a
quantidade de foliacuteculos preacute-vitelogecircnicos e vitelogecircnicos durante o desenvolvimento
folicular (Chatterjee et al 1997) No entanto alteraccedilotildees no estado de sauacutede provocadas
por concentraccedilotildees de contaminamtes que natildeo matam os peixes em curto prazo e que
podem ser consideradas seguras podem sugerir consequecircncias na reproduccedilatildeo e
interferecircncia na cadeia alimentar Esse tipo de estudo eacute de grande importacircncia para se
avaliar impactos provocados por diferentes tratamentos sobre o desenvolvimento de
foliacuteculos que poderiam interferir na reproduccedilatildeo de peixes
O lambari Astyanax bimaculatus foi escolhido como organismo experimental
pois eacute representativo no ecossistema sendo encontrado desde Nordeste brasileiro ateacute a
bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Eacute um peixe de pequeno porte e
de faacutecil manutenccedilatildeo em laboratoacuterio
Este estudo teve como objetivo analisar as alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos
diferentes estaacutedios do desenvolvimento folicular em ensaios subletais com o toacutexico
Thiodanreg
65
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste subletal e as atividades de coleta As etapas
de fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos ovaacuterios microtomia coloraccedilatildeo de lacircminas
histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e morfomeacutetricas foram realizadas nos
Laboratoacuterios de Biologia de Peixes e de Histopatologia do Departamento de Veterinaacuteria
da UFV
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos animais em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado e poro genital
dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV e
mantidos em aquaacuterios com capacidade de 50 litros numa densidade de 05g de peixe por
litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro temperatura controlada e monitoramento
duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e
aeraccedilatildeo continua de aacutegua para garantir o bem-estar dos peixes Os peixes foram
alimentados com raccedilatildeo comercial Purina contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia
de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
66
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste de toxicidade subletal em sistema estaacutetico
O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi realizado utilizando-se 120
lambaris tendo por base as normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico (NBR 15088
- ABNT 2007)
As fecircmeas foram expostas ao Thiodanreg (endosulfan 350gL) por 96 horas em
quatro diferentes experimentos sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem aclimataccedilatildeo e
com alimentaccedilatildeo com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e com aclimataccedilatildeo de
10 dias e com alimentaccedilatildeo Foram utilizadas trecircs concentraccedilotildees do Thiodanreg inferiores
agrave CL50 preacute-determinada (137microgL) em laboratoacuterio de acordo com a NBR 15088
(ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas em cada experimento foram de 115 23 e
56microgL-1 aleacutem de um grupo controle sem toacutexico com trecircs repeticcedilotildees nas mesmas
condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
24 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas
Apoacutes 96 horas de experimento foram coletados 96 peixes sendo seis animais de
cada grupo nos diferentes experimentos Os ovaacuterios foram coletados apoacutes os peixes
terem sido anestesiados com benzocaiacutena (110000) e eutanasiados pela secccedilatildeo
transversal da coluna vertebral na regiatildeo do opeacuterculo
Para a histologia os ovaacuterios foram fixados em paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo
fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedos em resina glicolmetacrilato (Leica
Historesin) Em seguida secccedilotildees 3microm de espessura foram coradas utilizando
hematoxilinaeosina para anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas As lacircminas foram
montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e
as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
Para os estudos morfoloacutegicos foram analisadas lacircminas de seis animais por
concentraccedilatildeo As secccedilotildees histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo em busca
de alteraccedilotildees morfoloacutegicas foliculares (Tabela 1) que pudessem ser representativas da
67
accedilatildeo do Thiodanreg no tecido ovariano sempre comparando estas alteraccedilotildees com o
padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios das lacircminas dos grupos controles
Para a avaliaccedilatildeo morfomeacutetrica foram realizadas contagens dos diferentes
estaacutedios de desenvolvimento folicular Para isto foram fotografados ao acaso 10
campos com objetiva de 10X (cada campo com 5094 microm de largura por 6812 microm de
comprimento totalizando uma aacuterea de 347 mmsup2) As contagens foram realizadas em 10
campos escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro experimentos Aleacutem disso foi
realizada a contagem de foliacuteculos atreacutesicos e observados eosinoacutefilos associados aos
foliacuteculos vitelogecircnicos utilizando o microscoacutepio com objetiva de 40X em 10 foliacuteculos
escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro tratamentos experimentais Tambeacutem
foram realizadas mediccedilotildees de diacircmetros em 10 foliacuteculos vitelogecircnicos para cada animal
Foram escolhidos foliacuteculos o mais esfeacutericos possiacutevel com corte passando pelo nuacutecleo
Estas medidas foram obtidas por meio do programa Image-Pro Plus traccedilando-se duas
linhas perpendiculares sobre nuacutecleo e respeitando-se os limites do foliacuteculo Em todas as
contagens e mediccedilotildees foram calculados os valores meacutedios e desvios-padratildeo para cada
concentraccedilatildeo para se avaliar o desenvolvimento folicular nos diferentes experimentos
Tabela 1 Alteraccedilotildees histoloacutegicas quanto ao comprometimento do desenvolvimento folicular (adaptado de Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS FOLICULARES Alteraccedilatildeo nos foliacuteculos Descolamento do revestimento folicular Retraccedilatildeo citoplasmaacutetica Retraccedilatildeo nuclear Atresia folicular Aglutinaccedilatildeo nucleoplasmaacutetica Aglutinaccedilatildeo citoplasmaacutetica Aglutinaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo Foliacuteculos com ausecircncia de citoplasma e nuacutecleo Granuloacutecitos envolvendo foliculos
25 Paracircmetros biomeacutetricos
Foram registrados para cada exemplar os seguintes dados biomeacutetricos peso
corporal (PC em g) peso dos ovaacuterios (PO em g) e peso do fiacutegado (PF em g) Os
valores meacutedios e os desvios padratildeo dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS=POx100PC) e
68
hepatossomaacutetico (IHS=PFx100PC) foram calculados para cada animal em cada um
dos grupos nos diferentes experimentos
26 Anaacutelises estatiacutesticas
Os dados foram apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo e avaliados pelo
Software Statistica 70 por meio da anaacutelise de variacircncia (ANOVA) Apoacutes o teste de
distribuiccedilatildeo normal os dados foram comparados entres os grupos controle e grupos
expostos ao Thiodanreg usando anaacutelise de variacircncia one-way seguida do teste de Tukey
ou Duncan Quando os dados natildeo apresentaram uma distribuiccedilatildeo normal foi utilizado o
teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis Plt005 foi utilizado como criteacuterio de
significacircncia
3 RESULTADOS
31 Desenvolvimento folicular
O desenvolvimento folicular de A bimaculatus do presente estudo foi dividido em
duas etapas desenvolvimento primaacuterio e desenvolvimento secundaacuterio
Para facilitar a compreensatildeo o desenvolvimento primaacuterio em A bimaculatus foi
subdividido em dois estaacutedios desenvolvimento primaacuterio inicial e desenvolvimento
primaacuterio avanccedilado (Figuras 1 A e B) No desenvolvimento primaacuterio inicial os foliacuteculos
apresentaram citoplasma fortemente basoacutefilo nuacutecleo esfeacuterico um ou mais nucleacuteolos
dispersos pelo nucleoplasma e estavam envoltos por ceacutelulas foliculares pavimentosas
(Figura 1 A) Durante o desenvolvimento primaacuterio avanccedilado o citoplasma do foliacuteculo
torna-se menos basoacutefilo que a etapa anterior o nuacutecleo eacute esfeacuterico um ou mais nucleacuteolos
dispersos que estatildeo associados ao envoltoacuterio nuclear (Figura 1 B) A camada de ceacutelulas
foliculares eacute pavimentosa com o nuacutecleo alongado Entre as ceacutelulas foliculares e o
citoplasma do foliacuteculo aparece a zona radiata como uma fina camada (Figura 1 B) Na
regiatildeo mais externa do foliacuteculo aparecem associadas ao mesmo as ceacutelulas da teca
O desenvolvimento secundaacuterio em A bimaculatus foi subdividido em trecircs
estaacutedios desenvolvimento secundaacuterio inicial desenvolvimento intermediaacuterio e
desenvolvimento avanccedilado No desenvolvimento secundaacuterio inicial o volume
citoplasmaacutetico aumentou mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo e o foliacuteculo neste estaacutedio
apresentou um diacircmetro maior que o estaacutedio anterior O nuacutecleo eacute central ligeiramente
acidoacutefilo com nucleacuteolos pequenos e dispersos pelo nucleoplasma O citoplasma eacute
69
granular e fracamente basoacutefilo com a presenccedila de vesiacuteculas corticais pequenas e claras
na periferia do citoplasma (Figura 1 C) Em seguida ocorre um aumento no diacircmetro do
foliacuteculo e inicia-se a deposiccedilatildeo de vitelo a partir da regiatildeo perifeacuterica o que permitiu
classificar esse estaacutedio como desenvolvimento secundaacuterio intermediaacuterio (Figura 1 D)
No estaacutedio de desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado o volume citoplasmaacutetico
aumentou mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo tendo o foliacuteculo neste estaacutedio um diacircmetro maior
quando comparado aos estaacutedios anteriores Nessa etapa do desenvolvimento o
citoplasma do foliacuteculo estaacute preenchido com gloacutebulos de vitelo (Figura 1 D) A
maturaccedilatildeo final eacute caracterizada pela formaccedilatildeo do aparelho micropilar zona radiata
espessa e nuacutecleo deslocado em direccedilatildeo ao aparelho micropilar
Os foliacuteculos ovarianos dos lambaris apresentaram morfologia normal nas
diferentes concentraccedilotildees de Thiodanreg (Figuras 1 A-D)
32 Atresia folicular
A atresia folicular foi caracterizada em trecircs diferentes etapas nos ovaacuterios de A
bimaculatus atresia inicial intermediaacuteria e avanccedilada A atresia folicular inicial eacute
caracterizada pela descontinuidade da zona radiata e hipertrofia das ceacutelulas foliculares
(Figura 2 A) Nesse momento da atresia folicular foram evidenciadas ceacutelulas do tipo
granuloacutecito entre a membrana basal e ceacutelulas da teca na maioria dos foliacuteculos
observados (Figura 2 B) Na sequecircncia do processo atresia folicular intermediaacuteria
ocorre o iniacutecio da fusatildeo e liquefaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo desintegraccedilatildeo e
fragmentaccedilatildeo da zona radiata hipertrofia das ceacutelulas foliculares que se tornam
vacuolizadas e contecircm material granular de aspecto similar aos gloacutebulos de vitelo e
invasatildeo do citoplasma pelas ceacutelulas foliculares (Figura 2 C) Na atresia avanccedilada as
ceacutelulas foliculares absorvem os resiacuteduos finais do foliacuteculo levando a uma diminuiccedilatildeo
do tamanho do foliacuteculo atreacutesico (Figura 2 D)
33 Quantificaccedilatildeo dos foliacuteculos ovarianos
A quantidade de foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio inicial entre as fecircmeas
do mesmo experimento natildeo mostrou diferenccedilas entre si (Pgt005) (Figura 3) Quando
foram comparados os diferentes experimentos nos mesmos grupos foi registrada maior
quantidade de foliacuteculos primaacuterios iniciais nas fecircmeas do grupo controle do experimento
com aclimataccedilatildeoalimentaccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo agraves fecircmeas dos grupos controle dos
70
experimentos sem aclimataccedilatildeo (Figura 3) Aleacutem disso foi observada maior quantidade
de foliacuteculos primaacuterios iniciais na concentraccedilatildeo de 23microgL do experimento com
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo em relaccedilatildeo ao experimento sem aclimataccedilatildeocom
alimentaccedilatildeo (Plt005) (Figura 3)
Na contagem de foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado entre fecircmeas
do mesmo experimento natildeo houve diferenccedilas nas meacutedias obtidas (Figura 4) No entanto
quando comparados os mesmos grupos entre os diferentes experimentos verificou-se
que no estaacutedio de desenvolvimento primaacuterio avanccedilado houve maior quantidade de
foliacuteculos no grupo controle do experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Plt005)
em relaccedilatildeo ao experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo assim como no
experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Figura 4) Quando comparados os
grupos da concentraccedilatildeo 115microgL registrou-se maior quantidade de foliacuteculos no
experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo ao experimento
sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Figura 4) Entre as fecircmeas dos grupos da
concentraccedilatildeo 23microgL foi registrada maior quantidade de foliacuteculos nos experimentos
com aclimataccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo agraves fecircmeas dos experimentos sem aclimataccedilatildeo
(Figura 4)
Na contagem de foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio inicial nas fecircmeas do
experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo houve maior quantidade de foliacuteculos na
concentraccedilatildeo 56microgL (Plt005) em relaccedilatildeo agrave concentraccedilatildeo de 115microgL (Figura 5) mas
natildeo com o controle Ao comparar as fecircmeas dos diferentes experimentos dos mesmos
grupos houve maior quantidade de foliacuteculos secundaacuterios iniciais (Plt005) na
concentraccedilatildeo 115microgL do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e
experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo em relaccedilatildeo ao experimento sem
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Figura
5)
Em relaccedilatildeo as contagens de foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio
intermediaacuterio e avanccedilado natildeo houve diferenccedilas entre as fecircmeas (Pgt005) (Figuras 6 e 7)
34 Quantificaccedilatildeo dos foliacuteculos atreacutesicos
Nas contagens de foliacuteculos atreacutesicos iniciais nas fecircmeas de A bimaculatus dos
diferentes experimentos natildeo foram constatadas diferenccedilas (Pgt005) (Figura 8) As
contagens de atresia total representaram as somas das contagens de atresias inicial
intermediaacuteria e avanccedilada As contagens de atresia total natildeo mostraram diferenccedilas nos
71
experimentos embora o nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos mostrasse tendecircncia crescente
nos grupos tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos (Figura 9) Entretanto
foi observado maior nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos nas fecircmeas dos experimentos com
aclimataccedilatildeo de 10 dias em relaccedilatildeo aos experimentos sem aclimataccedilatildeo (Figura 9)
35 Diacircmetro dos foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado
Os valores meacutedios nos diacircmetros dos foliacuteculos secundaacuterio avanccedilado nas fecircmeas
do experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo demonstraram aumento (Plt005) nas
concentraccedilotildees 115microgL (57837plusmn5977microm) e 56microgL (57311plusmn6178microm) de Thiodanreg
em relaccedilatildeo agraves fecircmeas do grupo controle (51606plusmn5757 microm) Nos demais experimentos
natildeo foram registradas diferenccedilas entre os foliacuteculos (Pgt005) apesar de ter sido
observado na maioria dos grupos essa mesma tendecircncia de aumento do diacircmetro dos
foliacuteculos (Tabela 2)
36 Paracircmetros biomeacutetricos
As fecircmeas de A bimaculatus dos grupos expostos ao Thiodanreg natildeo apresentaram
diferenccedilas (Pgt005) nos valores dos IGS e IHS quando comparados com os grupos
controles (Tabelas 3 e 4) No entanto as fecircmeas dos experimentos com aclimataccedilatildeo
apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores dos IGS e IHS quando comparados aos
experimentos sem aclimataccedilatildeo (Tabelas 3 e 4)
4 DISCUSSAtildeO
Em peixes teleoacutesteos o tipo de desenvolvimento folicular pode ser assincrocircnico
com a presenccedila de foliacuteculos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento (Nagahama
1983 Connaughton et al 1998 Selman et al 1986) assim como na presente espeacutecie
deste estudo Os ovaacuterios das fecircmeas de A bimaculatus submetidas ao efeito do
Thiodanreg apresentaram foliacuteculos ovarianos em diferentes fases de desenvolvimento com
variaccedilotildees na estrutura do foliacuteculo como diacircmetro caracteriacutesticas do nuacutecleo camadas
envoltoacuterias composiccedilatildeo e distribuiccedilatildeo do vitelo conforme observado em outras
espeacutecies do gecircnero (Miranda 1996 Miranda et al 1999 Melo et al 2005 Mazzoni et
al 2005 Rodrigues et al 2005 Hernan Da Cuntildea et al 2011)
Ao contraacuterio do presente estudo Dutta et al (2008) ao submeterem as fecircmeas da
espeacutecie Lepomis macrochirus a trecircs concentraccedilotildees diferentes (025 075 e 1 microgL) de
endosulfan observaram comprometimento do desenvolvimento folicular com retraccedilatildeo
72
nuclear e citoplasmaacutetica na menor concentraccedilatildeo enquanto nos foliacuteculos em maturaccedilatildeo
avanccedilada foi observado um aspecto vazio sem conteuacutedo citoplasmaacutetico na
concentraccedilatildeo de 075 microgL Aleacutem disso na concentraccedilatildeo de 1microgL os autores
encontraram maior grau de deformaccedilotildees com foliacuteculos vazios sem a presenccedila de
foliacuteculos ou alteraccedilotildees do nuacutecleo e perda do material nuclear que eacute relatado como
necrose nuclear No trabalho conduzido por Chartterjee et al (1997) foi avaliada a accedilatildeo
do carbofuram no desenvolvimento folicular na espeacutecie Heteropneustes fossilis
encontrando-se degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica e na camada folicular de foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio Entretanto Hernan Da Cuntildea et al (2011) natildeo
observaram alteraccedilotildees nos ovaacuterios em peixes expostos ao endosulfan No estudo
realizado por Ballesteros et al (2007) utilizando peixes machos e fecircmeas da espeacutecie
Jenynsia multidentata foi verificado que o maior teor de lipiacutedeos nas fecircmeas eacute um fator
importante para esclarecer a maior resistecircncia contra o endosulfan ao contraacuterio dos
machos que satildeo mais suceptiacuteveis neste caso De acordo com este resultado descrito na
literatura pode-se inferir que este fator poder ter interferido na maior resistecircncia das
fecircmeas de A bimaculatus em periacuteodo reprodutivo agraves concentraccedilotildees de Thiodanreg
testadas
Alguns estudos tecircm esclarecido a interferecircncia de poluentes na quantidade de
foliacuteculos nos diferentes estaacutedios do desenvolvimento folicular em peixes Os trabalhos
de Chartterjee et al (1997) Jensen et al (2004) Dutta amp Dalal (2008) e Chakrabarty et
al (2012) avaliaram os efeitos de pesticidas encontrando maior quantidade de foliacuteculos
primaacuterios no grupo tratado em relaccedilatildeo ao grupo controle assim como em peixes
mantidos em cativeiros (Honji et al 2009) Em outro estudo (Chatterjee et al 2001) os
pesquisadores encontraram por meio de anaacutelises histoloacutegicas da hipoacutefise a
possibilidade do carbofuran afetar as ceacutelulas produtoras de GnRH do hipotaacutelamo
prejudicando o eixo hipoacutefise-gocircnada e comprometendo a viabilidade no
desenvolvimento folicular jaacute Chakrabarty et al (2012) verificaram em peixes tratados
com endosulfan concentraccedilatildeo inferior de GnRH e superior da aromatase quando
comparados com o gurupo controle caracterizando que o endosulfan pode atuar como
disruptor endoacutecrino (Lemaire et al 2006) que pode aumentar a biossiacutentese do estradiol
para promover um raacutepido desenvolvimento folicular (Chakrabarty et al 2012) Estes
resultados podem ajudar a esclarecer os resultados do presente trabalho onde se
observou maior quantidade de foliacuteculos primaacuterios iniciais e primaacuterios avanccedilados nos
experimentos com aclimataccedilatildeo quando comparados com os experimentos sem
73
aclimataccedilatildeo sugerindo uma possiacutevel desregulaccedilatildeo endoacutecrina no eixo hipoacutefise-gocircnada
nos peixes aclimatados em aquaacuterios por 10 dias Aleacutem disso as concetraccedilotildees hormonais
e enzimaacuteticas relacionadas ao desenvolvimento folicular podem estar supostamente
alteradas em A bimaculatus mas satildeo necessaacuterios estudos fisioloacutegicos para essa
provaacutevel confirmaccedilatildeo
O processo de atresia folicular no lambari A bimaculatus foi semelhante ao
descrito por Miranda et al (1999) Munoz et al (2002) Melo et al (2005) e Santos et
al (2005) O processo da atresia que ocorre nos foliacuteculos secundaacuterios eacute do tipo
hipertroacutefico devido agrave hipertrofia e hiperplasia das ceacutelulas foliculares (Vizziano amp
Berois 1990) No trabalho realizado por Coward amp Bromage (1998) na espeacutecie Tilapia
zilli foi verificado aumento de foliacuteculos atreacutesicos em experimento com duraccedilatildeo entre 18
e 26 dias assim como verificado no trabalho de Jensen et al (2004) quando utilizaram a
substacircncia flutamida De acordo com estes autores isto pode reduzir a fecundidade e
tambeacutem influenciar na qualidade do foliacuteculo Linares-Casenave et al (2002) explicam
que o processo de atresia estaacute associado com desregulaccedilatildeo das concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de estradiol testosterona e vitelogenina Portanto o aumento da quantidade
dos foliacuteculos atreacutesicos nos grupos expostos ao Thiodanreg e a maior quantidade de atresia
nos experimentos com aclimataccedilatildeo mesmo natildeo apresentando diferenccedilas estatiacutesticas
sugerem que pode estar iniciando desregulaccedilatildeo hormonal nestes peixes
A presenccedila de granuloacutecitos associados aos foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados em
lambari A bimaculatus nos diferentes experimentos pode ser associada agrave reaccedilatildeo
imunoloacutegica em conjunto com as ceacutelulas foliculares assim como observado por alguns
autores (Drummond et al 2000 Santos et al 2005 Santos et al 2008) Aleacutem disso no
trabalho realizado por Santos et al (2008) foi detectada a presenccedila de proliferaccedilatildeo
celular (PCNA) nas ceacutelulas da teca de foliacuteculos em processo de atresia confirmando
que estas ceacutelulas podem estar se preparando para o processo de remodelaccedilatildeo ovariana
No entanto essas evidecircncias de granuloacutecitos associados aos foliacuteculos estatildeo de acordo
com o que jaacute foi observado em outros trabalhos caracterizando um processo fisioloacutegico
importante na regressatildeo folicular das fecircmeas de A bimaculatus expostas ao Thiodanreg
O diacircmetro dos foliacuteculos vitelogecircnicos eacute espeacutecie-especiacutefico poreacutem o Thiodanreg
alterou o diacircmetro folicular no experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo Esta
alteraccedilatildeo do diacircmetro que leva os foliacuteculos vitelogecircnicos a atingirem a maturaccedilatildeo pode
ser causada pelas diferenccedilas nas concentraccedilotildees de vitelogenina estradiol e aromatase
(Jensen et al 2004 Corriero et al 2007 Chakrabarty et al 2012) ou a mesma sendo
74
ligada aos receptores especiacuteficos nos foliacuteculos (Patintildeo amp Sullivan 2002 Bugel et al
2010) Bugel et al (2010) relataram a diminuiccedilatildeo da expressatildeo da vitelogenina no peixe
Fundulus heteroclitus em rio contaminado com pesticidas orgacircnicos persistentes o que
resultou na diminuiccedilatildeo da quantidade de foliacuteculos vitelogecircnicos enquanto Honji et al
(2009) relataram a baixa fecundidade e aumento do diacircmetro dos foliacuteculos nos peixes
Salminus hilari mantidos em cativeiro quando comparados com peixes de ambientes
naturais Contudo eacute necessaacuterio estudar as vias que conduzem a esta alteraccedilatildeo Estes
resultados mostram que diferentes vias podem afetar a reproduccedilatildeo dos peixes e que o
Thiodanreg pode estar agindo como desregulador endoacutecrino nos foliacuteculos secundaacuterios
avanccedilados de A bimaculatus
O IGS e IHS podem variar entre os peixes devido agraves diferenccedilas na sensibilidade
frente agrave exposiccedilatildeo a contaminantes periacuteodo reprodutivo e peixes mantidos em cativeiro
(Chatterjee et al 1997 Cyrino et al 2000 Jensen et al 2004 Honji et al 2009) No
entanto o fato das meacutedias dos IGS e IHS nos experimentos com aclimataccedilatildeo terem sido
menores quando comparadas com os experimentos sem aclimataccedilatildeo sugere associaccedilatildeo
entre quantidade inferior de foliacuteculos secundaacuterios e quantidade superior de atresia nos
experimentos com aclimataccedilatildeo assim como no trabalho de Chatterjee et al (1997) e
Bugel et al (2010) que verificaram diminuiccedilatildeo na taxa de foliacuteculos vitelogecircnicos e
IGS
A ventilaccedilatildeo branquial acelerada e a natildeo procura por alimentos nas primeiras 24
horas observadas nos diferentes experimentos sugere que a entrada de aacutegua pela via
branquial foi causa direta da absorccedilatildeo e difusatildeo do toacutexico no organismo No entanto a
via epideacutermica tambeacutem poder ser considerada via de entrada do toacutexico para os tecidos
(Mckim et al 1999) Portanto a exposiccedilatildeo dos peixes ao Thiodanreg e a aclimataccedilatildeo
foram fatores mais que afetaram o diacircmetro e a quantidade de foliacuteculos em A
bimaculatus Conforme as condiccedilotildees em que o estudo foi realizado levando-se em
consideraccedilatildeo as concentraccedilotildees do inseticida Thiodanreg utilizadas periacuteodo de exposiccedilatildeo e
espeacutecie de estudo demonstram que as fecircmeas analisadas podem estar em processo
inicial de intoxicaccedilatildeo com possiacutevel alteraccedilatildeo fisioloacutegica
75
A
opa
opi opa
vs
D
osint
osa
osa
gv gv
gv
osi
C
B
opa
opa
zr
vc
Figura 1 Desenvolvimento folicular ovariano de Astyanax bimaculatus A Estroma ovariano com foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio inicial (opi) e primaacuterio avanccedilado (opa) B Foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (opa) com ceacutelulas foliculares pavimentosas e zona radiata delgada (zr) C Foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio inicial (osi) possuindo ceacutelulas foliculares pavimentosas com zona radiata espessa (zr) e vesiacuteculas corticais claras (vc) na periferia do foliacuteculo D Foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio intermediaacuterio iniciando deposiccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo (osint) e foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (osa) com gloacutebulos de vitelo (gv) por todo o citoplasma vs vaso sanguiacuteneo Coloraccedilatildeo Hematoxilina-eosina Barra A e B (50 m) C (30 m) D (100 m)
zr
76
ai
gr gr
zr
h
av
A
ait
Figura 2 Foliacuteculos ovarianos de Astyanax bimaculatus em atresia A Atresia folicular inicial (ai) caracterizada pela quebra da zona radiata (zr) hipertrofia de ceacutelulas foliculares (cf) e presenccedila de granuloacutecitos (gr) B Detalhe de granuloacutecito (gr) sobre a regiatildeo de ceacutelulas foliculares C Atresia folicular intermediaacuteria (ait) caracterizada pela liquefaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo (gv) desintegraccedilatildeo da zona radiata e invasatildeo do citoplasma pelas ceacutelulas foliculares D Atresia folicular avanccedilada (av) caracterizada pela ausecircncia de gloacutebulos de vitelo Ceacutelulas da teca (t) hemaacutecias (h) Coloraccedilatildeo Hematoxilina-eosina Barra A (25 m) B (10 m) C (150 m) D (100 m)
gv
ai
B
C D
t
gv
77
Figura 3 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos primaacuterios iniciais por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e expostos ao Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dentro dos grupos (Plt005) pelo teste de Duncan Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
0
5
10
15
20
25
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
A A
AB
B
AB
A
AB
B
0
1
2
3
4
5
6
7
8
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 4 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos primaacuterios avanccedilados por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dentro dos grupos (Plt005) pelo teste de Duncan Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
A
BC AC
BD
AC
BC
AB A A
B
B
A
78
0
02
04
06
08
1
12
14
16
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedilas entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dos grupos com as mesmas concentraccedilotildees nos diferentes experimentos (Plt005) ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) Teste de Duncan
A
B
A
B
ab b
a ab
Figura 5 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios iniciais por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e d
e o
voacuteci
tos Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 6 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Plt005) pelo teste de Duncan
79
0
05
1
15
2
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3
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4
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 7 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Duncan
Figura 8 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos atreacutesicos iniciais em ovaacuterios de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Kruskall Wallis
0
005
01
015
02
025
03
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e a
tre
sia
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
80
Figura 9 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos atreacutesicos totais em ovaacuterios de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
0
005
01
015
02
025
03
035
04
045
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e a
tre
sia
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Kruskall Wallis
81
Tabela 2 Diacircmetro meacutedio (microm) de foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados de lambaris A bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
53443 plusmn 7414a 53796 plusmn 7746a 53273 plusmn 8300a 50046 plusmn 5610a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
56807 plusmn 6647a 57517 plusmn 5849a 5904 plusmn 5889a 58449 plusmn 6849a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
53816 plusmn 5684a 51894 plusmn 6065a 55393 plusmn 6193a 54749 plusmn 6849a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
51606 plusmn 5757a 57837 plusmn 5977b 55774 plusmn 7870aᵇ 57311 plusmn 6178b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Tukey
Tabela 3 Iacutendice gonadossomaacutetico de fecircmeas de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
790 plusmn 318a 747 plusmn 221a 505 plusmn 263a 432 plusmn 255a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
856 plusmn 473a 813 plusmn 690a 702 plusmn 430a 683 plusmn 361a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
373 plusmn 213a 270 plusmn 147a 323 plusmn 189a 399 plusmn 201a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
227 plusmn 147a 303 plusmn 106a 305 plusmn 192a 293 plusmn 167a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Duncan
Tabela 4 Iacutendice hepatossomaacutetico de fecircmeas de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
07 plusmn 014aᵇ 088 plusmn 03a 084 plusmn 038a 038 plusmn 031b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
113 plusmn 054a 104 plusmn 061a 102 plusmn 050a 102 plusmn 051a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
066 plusmn 029a 073 plusmn 020a 092 plusmn 017a 091 plusmn 012a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
074 plusmn 034a 072 plusmn 029a 094 plusmn 040a 063 plusmn 018a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Duncan
82
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53 CAPIacuteTULO 3
RELACcedilAtildeO ENTRE COLAacuteGENO TIPO IV INTEGRINA β1 E CASPASE 3
DURANTE O DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM Astyanax bimaculatus
EXPOSTOS AO THIODAN reg
RESUMO
O agrotoacutexico Thiodanreg (350gL de endosulfan) eacute um inseticida organoclorado utilizado
em diversas monoculturas e pode chegar aos ecossistemas aquaacuteticos afetando a
reproduccedilatildeo e a integridade das populaccedilotildees de peixes Ovaacuterios de peixes apresentam
ovoacutecitos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento os quais satildeo envoltos por zona
radiata ceacutelulas foliculares membrana basal e ceacutelulas da teca formando o complexo
folicular A integridade do complexo folicular estaacute associada com a presenccedila de
colaacutegeno tipo IV e integrina β1 enquanto a caspase 3 eacute uma protease importante na via
apoptoacutetica participando ativamente nos processos de regressatildeo ovariana Pela carecircncia
de estudos que avaliam tais proteiacutenas no complexo folicular este estudo teve por
objetivo avaliar por meio de anaacutelise imunoistoquiacutemica a expressatildeo das proteiacutenas
colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspases 3 durante o desenvolvimento folicular do
lambari Astyanax bimaculatus exposto ao Thiodanreg Os peixes foram aclimatados
durante 10 dias em aquaacuterios de 50L com aeraccedilatildeo contiacutenua aacutegua sem cloro filtro
mecacircnico fotoperiacuteodo (12h) e temperatura (26plusmn1ordmC) controlados Para a exposiccedilatildeo ao
Thiodanreg os peixes foram divididos em quatro grupos controle 115 23 e 56 microgL
com trecircs repeticcedilotildees em cada concentraccedilatildeo Apoacutes 96 h seis peixes de cada grupo foram
anestesiados (benzocaiacutena110000) eutanasiados e seus ovaacuterios coletados para detecccedilatildeo
de colaacutegeno de tipo IV integrina β1 e caspase 3 Fragmentos dos ovaacuterios foram fixados
em paraformaldeiacutedo a 4 e incluiacutedos em parafina Os procedimentos de
imunomarcaccedilatildeo seguiram protocolos jaacute padronizados para os anticorpos empregados A
reaccedilatildeo foi revelada com diaminobenzidina e os cortes foram contracorados com
hematoxilina para avaliaccedilatildeo qualitativa em microscoacutepio de luz Os foliacuteculos primordiais
natildeo apresentaram marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 Nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio observou-se reaccedilatildeo fracamente positiva no citoplasma das
ceacutelulas foliculares enquanto foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio foram mais
intensamente marcados para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV A imunomarcaccedilatildeo para
caspase 3 foi evidenciada nas ceacutelulas foliculares durante o desenvolvimento secundaacuterio
sendo mais intensa no estaacutedio avanccedilado Qualitativamente essas anaacutelises demonstraram
87
marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento folicular mesmo com os
peixes expostos a diferentes concentraccedilotildees de Thiodanreg o que caracteriza a integridade
das ceacutelulas foliculares e da via apoptoacutetica caspase-3-dependente que pode estar sendo
ativada para futuros processos de regressatildeo folicular
Palavras-chave ecotoxicologia aquaacutetica ovaacuterio peixes e reproduccedilatildeo
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 de α-endosulfan e 30 de β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo
por meio da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em riscos toxicoloacutegicos os
organismos que ali residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al
2007) Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos
como jaacute observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis
niloticus No entanto a Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan
em gordura o valor de 005mgkg-1 (EPA 2002) e em aacutegua doce 022microgL-1 (EPA
1980) A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em
consideraccedilatildeo a qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente
Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm 3572005 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo
do referido inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
Muitos inseticidas apresentam baixa toxicidade antes de serem transformados
em substacircncias toacutexicas metabolicamente ativas O sulfato de endosulfan eacute um dos
produtos derivados do metabolismo do endosulfan sendo considerado o principal
metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica por ser mais estaacutevel no meio
ambiente em relaccedilatildeo a sua formula original (Ali et al 1984) A sensibilidade dos
organismos aquaacuteticos ao endosulfan eacute baixa e tem sido bem descrita na literatura por
alguns autores (Cengiz et al 2001 Capkin et al 2006 Ballesteros et al 2007 Pereira
et al 2012) sendo os machos geralmente mais sensiacuteveis que as fecircmeas pelo
armazenamento de lipiacutedeos para produccedilatildeo do vitelo e fornecimento de energia e pelo
tamanho maior da fecircmea em relaccedilatildeo ao macho (Ballesteros et al 2007)
88
O desenvolvimento folicular em peixes tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter 1996 Begovac amp Wallace
1988 Grier 2000 2002 e 2007) e como nos animais em geral compreende os periacuteodos
preacute-meioacutetico perinucleolar vitelogecircnico e maturaccedilatildeo final Estas fases ocorrem no
interior de foliacuteculos cujo complexo folicular eacute constituiacutedo por zona radiata camada
folicular membrana basal e teca (Grier 2000) as quais desempenham importante papel
durante a foliculogecircnese e fertilizaccedilatildeo
Entretanto os peixes quando satildeo expostos aos poluentes podem sofrer influecircncia
na foliculogecircnese e assim acarretar prejuiacutezos reprodutivos para as espeacutecies expostas aos
contaminantes Alguns estudos mostram diversas alteraccedilotildees provocadas nos foliacuteculos de
peixes por contaminantes (Hazarika amp Das 1998 Dutta et al 2003 Maxwell amp Dutta
2005 Chakrabarty et al 2012) inclusive a atresia folicular que eacute um processo
frequentemente observado nos ovaacuterios dos vertebrados (Saidapur 1978 Santos et al
2008a Santos et al 2008b) e que pode ser causada por diversos fatores dentre os
quais os agrotoacutexicos (Nagahama 1983 Guraya 1986 Chatterjee et al 1997 e 2001
Dutta amp Dalal 2008)
No desenvolvimento folicular a formaccedilatildeo do complexo folicular eacute importante
no suporte e na sobrevivecircncia das ceacutelulas foliculares No entanto jaacute foram identificadas
vaacuterias proteiacutenas que contribuem para a integridade do complexo folicular como
laminina integrina β1 fibronectina colaacutegeno tipo IV e de metaloproteinases (MMM-P)
em foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios e atreacutesicos (Rodgers et al 1998 Grier 2002 Le Bellego
et al 2002 Berkholtz et al 2006 Santos et al 2008a Thomeacute et al 2010) O colaacutegeno
tipo IV eacute uma proteiacutena especializada da matrix extracelular e membrana basal assim
como a laminina Essas proteacuteinas estatildeo envolvidas em favorecer um microambiente para
sobrevivecircncia das ceacutelulas do epiteacutelio (Rodgers et al 2003) As integrinas compreendem
uma grande famiacutelia de recepetores celulares composto de subnidades α e β que tem
funccedilatildeo importante na adesatildeo e transmissatildeo de sinais na ceacutelula Aleacutem disso as integrinas
estatildeo envolvidas na proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e morte celular
A caspase 3 eacute uma moleacutecula efetora de grande importacircncia no processo de
apoptose na ativaccedilatildeo de endonucleases e na clivagem das proteiacutenas celulares causando
mudanccedilas morfoloacutegicas celulares (Huettenbrenner et al 2003) Este processo de
apoptose envolve uma cascata de eventos bioquiacutemicos com a liberaccedilatildeo de fatores
mitocondriais de morte celular ativaccedilatildeo caspases e mudanccedila na caracteriacutestica
morfoloacutegica no nuacutecleo da ceacutelula assim como fragmentaccedilatildeo do DNA (Huettenbrenner et
89
al 2003) No entanto alguns trabalho citam a importacircncia da integridade do complexo
folicular com a presenccedila de integrina β1 e colaacutegeno tipo IV que em caso de atresia
folicular e ovulaccedilatildeo na formaccedilatildeo de foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios culminam em processo
da ativaccedilatildeo das caspases nas ceacutelulas foliculares Sendo assim a incidecircncia de apoptose
nas ceacutelulas foliculares aumenta nas etapas de regressatildeo ovariana (Drummond et al
2000 Santos et al 2003 2005 2008)
O lambari A bimaculatus foi escolhido como organismo experimental pois eacute
muito representativo no ecossistema sendo encontrado desde o nordeste brasileiro ateacute a
Bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Tambeacutem eacute um peixe de
pequeno porte e faacutecil de manter em laboratoacuterio O complexo folicular associado agrave
siacutentese dessas proteiacutenas ao longo do desenvolvimento folicular eacute algo a ser discutido
Poreacutem nenhum trabalho relata estas proteiacutenas em peixes expostos ao Thiodanreg Devido
agrave carecircncia de estudos que avaliem tais proteiacutenas no complexo folicular o presente
trabalho tem como objetivo avaliar as proteiacutenas colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase
3 durante o desenvolvimento folicular do lambari A bimaculatus exposto ou natildeo ao
Thiodanreg por meio de anaacutelise imunoistoquiacutemica
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria (DVT) da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste subletal e as atividades de coleta fixaccedilatildeo e
inclusatildeo dos fragmentos de ovaacuterios As etapas de microtomia imunoistoquiacutemica
coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas foram realizadas no
DVTUFV e no Laboratoacuterio de Ictiohistologia do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas (ICB)
da Universidade Federal de Minas Gerais
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos peixes em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado poro genital
dilatado e vascularizado
90
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV onde
foram aclimatados por 10 dias Os aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuiacuteam
capacidade de 50 litros numa densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada
aacutegua livre de cloro temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos
os aquaacuterios possuiacuteam um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo continua da aacutegua para
garantir o bem-estar dos peixes Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial
Purina contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da
piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Foram aclimatados 96 lambaris como descrito no item 21 onde os peixes se
acostumaram ao seu novo meio e agraves atividades normais de manutenccedilatildeo como
alimentaccedilatildeo e limpeza dos aquaacuterios O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi
realizado baseando-se nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo com
a NBR 15088 (ABNT 2007)
Logo apoacutes aclimataccedilatildeo os peixes foram submetidos ao toacutexico Thiodanreg
(endosulfan 350gL) por 96 horas Em todos os experimentos foram utilizadas trecircs
concentraccedilotildees diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 (137microgL) preacute-determinada em
laboratoacuterio de acordo com a NBR 15088 (ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas
em cada experimento foram de 115 23 e 56microgL aleacutem de um grupo controle sem
toacutexico com trecircs repeticcedilotildees sob as mesmas condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
91
24 Anaacutelises histoloacutegicas e imunoistoquiacutemicas
Apoacutes 96 horas de experimento seis fecircmeas de cada grupo foram coletadas
anestesiadas com benzocaiacutena (110000) e eutanasiadas para coleta dos ovaacuterios Para a
descriccedilatildeo histoloacutegica todas as amostras foram fixadas em paraformaldeiacutedo a 4 em
tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedas em parafina Em seguida
secccedilotildees com 5 microm de espessura foram coradas utilizando hematoxilinaeosina para
anaacutelises morfoloacutegicas do desenvolvimento folicular
Para detectar a imunorreatividade para colaacutegeno tipo IV integrinas β1 e caspase
3 nos ovaacuterios do lambari trecircs espeacutecimes de cada grupo foram fixados em
paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas incluiacutedas em
parafina e seccionadas com 5 microm de espessura A recuperaccedilatildeo antigecircnica foi realizada
em forno de microondas por 10 minutos com os cortes nas lacircminas sendo imersos em
tampatildeo citrato 10mM pH 60 As lacircminas foram incubadas com peroacutexido de hidrogecircnio
a 3 em tampatildeo fosfato por 15 minutos em temperatura ambiente para inativar
peroxidase endoacutegena e com soro albumina bovina a 2 por 45 minutos para bloquear
marcador antigecircnico inespeciacutefico Anticorpos primaacuterios (policlonais de coelho) anti-
colaacutegeno tipo IV anti-integrina β1 e anti-caspase 3 (Santa Cruz Biotechnology Calif
USA) foram aplicados nas secccedilotildees a 4degC na diluiccedilatildeo 1100 (integrina β1 e colaacutegeno tipo
IV) e 1200 (caspase 3) segundo o fabricante por 12 horas Os cortes foram lavados
em PBS e incubados por 45 minutos com anticorpo secundaacuterio na diluiccedilatildeo de 1200
anti-IgG de coelho (LSAB 2 sistema HRP DakoCymation Carpinteria Calif USA) e
tratados com peroxidase conjugada com estreptavidina por 45 minutos A revelaccedilatildeo foi
realizada com diaminobenzidina (DAB) e as lacircminas foram contracoradas com
hematoxilina (Santos et al 2008)
As lacircminas foram analisadas em toda sua extensatildeo em busca de alteraccedilotildees na
imunomarcaccedilatildeo no complexo folicular que pudessem ser representativas do efeito do
Thiodanreg sempre comparando com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios do grupo
controle As lacircminas foram analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e as
imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
92
3 RESULTADOS
31 Desenvolvimento folicular
O desenvolvimento folicular de A bimaculatus foi dividido em desenvolvimento
primaacuterio inicial e avanccedilado O desenvolvimento secundaacuterio foi dividido em
desenvolvimento secundaacuterio inicial intermediaacuterio e avanccedilado (Tabela 1) A regressatildeo
ovariana tambeacutem foi caracterizada (Tabela 1)
Tabela 1 Aspectos morfoloacutegicos do desenvolvimento folicular e da regressatildeo ovariana de Astyanax bimaculatus
Foliacuteculos primordiais Estaacutedio que antecede o desenvolvimento de foliacuteculos primaacuterios Satildeo ceacutelulas menores apresentando citoplasma volumoso nuacutecleo esfeacuterico e grande e ceacutelulas preacute-foliculares (Figura 1 B) Foliacuteculos primaacuterios iniciais e primaacuterios avanccedilados (perinucleolares) No desenvolvimento primaacuterio inicial os ovoacutecitos apresentam citoplasma fortemente basoacutefilo nuacutecleo esfeacuterico e nucleacuteolos dispersos pelo nucleoplasma Estatildeo envoltos por ceacutelulas foliculares pavimentosas (Figuras 1 C-encarte) No foliacuteculo primaacuterio avanccedilado a camada de ceacutelulas foliculares eacute pavimentosa e com o nuacutecleo eliacuteptico Entre as ceacutelulas foliculares e o ooplasma surge a zona radiata como uma fina camada (Figura 1 E-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios iniciais O citoplasma ovocitaacuterio eacute granular e fracamente basoacutefilo com presenccedila de vesiacuteculas corticais pequenas e claras na periferia do citoplasma O nuacutecleo eacute central ligeiramente acidoacutefilo com nucleacuteolos pequenos e dispersos pelo nucleoplasma (Figura 1 G-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios Assim como na etapa anterior os foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios possuem ovoacutecito com nuacutecleo central e acidoacutefilo No citoplasma inicia-se a deposiccedilatildeo de vitelo a partir da regiatildeo perifeacuterica (Figura 1 H-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados (vitelogecircnicos) No foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado o diacircmetro e o volume citoplasmaacutetico aumentam mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo apresentando os foliacuteculos neste estaacutedio vesiacuteculas corticais na periferia e gloacutebulos de vitelo disperso por todo citoplasma No complexo folicular a membrana basal eacute delgada e a zona radiada mais espessa que nas fases anteriores com ceacutelulas foliculares pavimentosas e cuacutebicas (Figura 1 H-encarte) Foliacuteculos atreacutesicos Apresenta formato irregular com estruturas descontiacutenuas ou desorganizadas com aspecto de grumos devido agrave liquefaccedilatildeo dos gracircnulos de vitelo ou com perda da conectividade entre suas partes fragmentaccedilatildeo da zona radiata (atresia inicial) e absorccedilatildeo total do conteuacutedo ovocitaacuterio pelas ceacutelulas foliculares (atresia avanccedilada) (Figuras 3 A e B-encarte) Foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios O foliacuteculo poacutes-ovulatoacuterio possue lume amplo irregular e contiacutenuo com o lume do ovaacuterio Apresenta parede constituiacuteda por camada uacutenica de ceacutelulas foliculares membrana basal e teca (Figuras 3 E e F)
93
32 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 no desenvolvimento
folicular de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Os foliacuteculos nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento apresentaram diferentes
graus de marcaccedilatildeo para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV Em foliacuteculo primordial natildeo se
observou marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 (Figura 1 B) Nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio inicial foram evidenciadas reaccedilotildees positivas com marcaccedilatildeo
fraca para colaacutegeno e integrina (Figuras 1 C e D) enquanto nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio avanccedilado as marcaccedilotildees foram mais niacutetidas (Figuras 1 E e F)
Nos desenvolvimento secundaacuterio foram evidenciadas marcaccedilotildees positivas para integrina
β1 e colaacutegeno tipo IV no citoplasma das ceacutelulas foliculares com mais intensidade que
nos estaacutedios anteriores (Figuras 1 G e H) Estas marcaccedilotildees natildeo mostraram diferenccedilas
entre os grupos expostos ao Thiodanreg quando comparados com os mesmos estaacutedios de
desenvolvimento folicular dos grupos controle A marcaccedilatildeo para caspase 3 foi
evidenciada no citoplasma e nuacutecleos de ceacutelulas foliculares de foliacuteculos com
desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado apresentando maior intensidade nos estaacutedios de
desenvolvimento secundaacuterio inicial A marcaccedilatildeo foi ausente nos estaacutedios de
desenvolvimento primaacuterio (Figuras 2 A-D) Quando comparadas estas marcaccedilotildees entre
os grupos controle e expostos ao Thiodanreg natildeo houve diferenccedilas nas marcaccedilotildees entre
os mesmos estaacutedios de desenvolvimento folicular
33 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 na atresia folicular de
A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
A marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 foi evidente nos foliacuteculos
atreacutesicos iniciais poreacutem menos intensa em relaccedilatildeo aos foliacuteculos normais (Figuras 3 A e
C) As fases mais avanccediladas da atresia folicular satildeo caracterizadas pela desorganizaccedilatildeo
espalhamento das proteiacutenas no ooplasma com reaccedilatildeo mais fraca da imunomarcaccedilatildeo
para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 (Figuras 3 B e D) Para a caspase 3 foi observada a
marcaccedilatildeo positiva nas ceacutelulas foliculares em foliacuteculos atreacutesicos iniciais e avanccedilados
(Figuras 4 A e B)
94
34 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 em foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Foram evidenciados desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV e
integrina β1 entre as ceacutelulas foliculares com marcaccedilatildeo positiva (Figuras 3 E e F) Em
foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios tambeacutem foi observada marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 nas
ceacutelulas foliculares (Figuras 4 C e D)
4 DISCUSSAtildeO
As fecircmeas de A bimaculatus submetidas agrave accedilatildeo do toacutexico apresentaram ovaacuterios
com padrotildees normais do desenvolvimento folicular sendo as variaccedilotildees na estrutura do
foliacuteculo como diacircmetro caracteriacutesticas do nuacutecleo camadas envoltoacuterias composiccedilatildeo e
distribuiccedilatildeo do vitelo observadas em outras espeacutecies do gecircnero do presente estudo
(Miranda 1996 Miranda et al 1999 Melo et al 2005 Mazzoni et al 2005 Rodrigues
et al 2005) Em outros trabalhos (Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008) satildeo
demonstrados que pequena concentraccedilatildeo de contaminantes pode ser suficiente para
causar alteraccedilotildees na morfologia dos foliacuteculos Entretanto Ballesteros et al (2007)
utilizando peixes machos e fecircmeas da espeacutecie Jenynsia multidentata verificaram que o
maior teor de lipiacutedeos nas fecircmeas foi importante para conferir maior resistecircncia contra o
endosulfan ao contraacuterio dos machos que satildeo mais suceptiacuteveis Estudo realizado por
Hernan Da Cuntildea et al (2011) mostrou que a espeacutecie Cichlasoma dimerus exposta ao
endosulfan nas concentraccedilotildees de zero 025 1 2 3 4 e 16μgL natildeo apresentou
alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos foliacuteculos assim como no presente trabalho com A
bimaculatus
No presente estudo a ausecircncia de marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV em foliacuteculos
primordiais pode ter ocorrido em funccedilatildeo da quantidade reduzida de ceacutelulas foliculares e
pela pequena espessura da membrana basal nesta fase de desenvolvimento folicular Na
literatura eacute mencionado que a espessura da membrana basal em foliacuteculos secundaacuterios
avanccedilados de A bimaculatus eacute de aproximadamente 03 microm caracterizada por ser uma
estrutura muito mais delgada quando comparada a outras espeacutecies de teleoacutesteos
(Drummond et al 2000) Outros autores no entanto observaram positividade para
colaacutegeno tipo IV na membrana basal envolvendo ovogocircnias no estroma ovariano de
peixes (Grier 2002 Thomeacute et al 2010) fase que antecede o ovoacutecito primordial
95
A siacutentese de membrana basal tem sido atribuiacuteda agraves ceacutelulas foliculares (Le Mim
et al 2007) mas ainda faltam investigaccedilotildees que evidenciem esta funccedilatildeo A anaacutelise por
hibridizaccedilatildeo in situ na cadeia α1 do colaacutegeno tipo IV revelou a presenccedila de mRNA
localizada na camada folicular de todos os foliacuteculos em crescimento no peixe medaka
Oryzias latipes (Kato et al 2010) enquanto para integrinas Itami et al (2011) natildeo
identificaram marcaccedilatildeo em foliacuteculos primordiais em ratos Estes estudos confirmam que
durante o desenvolvimento do foliacuteculo primordial poderia estar ocorrendo o inicio da
organizaccedilatildeo e siacutentese do colaacutegeno tipo IV para as fecircmeas do presente estudo
Logo em seguida o desenvolvimento folicular primaacuterio inicial e avanccedilado foi
caracterizado por alteraccedilotildees no complexo folicular com marcaccedilatildeo positiva para
integrina β1 e colaacutegeno tipo IV foi positiva Em outro estudo realizado para marcaccedilatildeo
de vaacuterias subunidades do colaacutegeno tipo IV em foliacuteculos de bovinos a expressatildeo das
cadeias α3 e α6 diminuiacuteram durante o desenvolvimento folicular enquanto as cadeias
α1 e α2 continuaram a ser expressas ao longo do desenvolvimento (Rodgers et al
1998) Em estudo com ratos foi verificado o decliacutenio de colaacutegeno tipo IV α3 ao longo
do desenvolvimento folicular mas foi possiacutevel detectar o colaacutegeno tipo IV α4 e α5 em
foliacuteculos desenvolvidos (Frojdman et al 1998) Entretanto Berkholtz (2006) observou
aumento da marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV ao longo do desenvolvimento folicular em
ratos Aleacutem disso outra caracteriacutestica importante eacute presenccedila de perlecan e nidogen que
fazem parte das ligaccedilotildees cruzadas em foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio mas
natildeo em foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio (McArthur et al 2000) Poreacutem as
diferentes ligaccedilotildees cruzadas entre os colaacutegenos e lamininas nas membranas basais
tambeacutem garantem maior expansatildeo no alargamento do foliacuteculo (Rodgers et al 2003)
Portanto eacute de grande importacircncia nesta etapa de desenvolvimento folicular a evidecircncia
do colaacutegeno tipo IV e integrinas o que pode contribuir na organizaccedilatildeo coordenada no
desenvolvimento folicular de A bimaculatus com estas proteiacutenas da matriz extracelular
Em relaccedilatildeo agraves fases de desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio foram observadas
marcaccedilotildees positivas para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 o que parece caracterizar
maior siacutentese destas proteiacutenas nestes estaacutedios do desenvolvimento folicular Entretanto
deve-se considerar que nas fases mais avanccediladas a quantidade de ceacutelulas foliculares e
ceacutelulas da teca satildeo mais numerosas sendo assim exercem funccedilatildeo importante na
integridade folicular No presente estudo a marcaccedilatildeo contiacutenua de colaacutegeno tipo IV e
integrina β1 nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento folicular em 96 horas de
experimento indicou que natildeo houve desorganizaccedilatildeo na membrana basal e nas ceacutelulas
96
foliculares Thomeacute et al (2010) identificaram por teacutecnicas de imonoistoquiacutemica e
imunofluorescecircncia a presenccedila de laminina β2 integrinas e colaacutegeno tipo IV na
membrana basal demonstrando a importacircncia destes constituintes na integridade da
membrana basal ao longo do desenvolvimento folicular resultados observados tambeacutem
em foliacuteculos de mamiacuteferos (Le Bellego et al 2002 Berkholtz et al 2006)
Em foliacuteculos de ratos tambeacutem foi evidenciada a presenccedila de integrinas ao longo
do desenvolvimento folicular apresentando marcaccedilatildeo positiva no desenvolvimento
primaacuterio e marcaccedilatildeo mais intensa no desenvolvimento secundaacuterio (Itami et al 2011)
Portanto a marcaccedilatildeo positiva nas ceacutelulas foliculares em lambaris A bimaculatus nos
grupos controle e expostos ao Thiodanreg mostrou que a integridade dos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio natildeo foi afetada pelas concentraccedilotildees de
Thiodanreg utilizadas
Em relaccedilatildeo agrave caspase 3 ao longo do desenvolvimento folicular foi possiacutevel
evidenciar sua expressatildeo nos estaacutedios de desenvolvimento secundaacuterio mas natildeo a
presenccedila de condensaccedilatildeo de nuacutecleos e corpos apoptoacuteticos nas ceacutelulas foliculares No
entanto a presenccedila de caspase 3 nas ceacutelulas foliculares de A bimaculatus indica que
estas ceacutelulas podem estar em via apoptoacutetica poreacutem outros trabalhos demonstram que a
via para caspase 3 eacute observada em foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios atresias iniciais e
principalmente nas atresias avanccediladas com a presenccedila de fragmentaccedilatildeo de DNA
condensaccedilatildeo nuclear e formaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos (Hsueh et al 1994 Santos et
al 2008) A ausecircncia destas caracteriacutesticas morfoloacutegicas nos foliacuteculos de A
bimaculatus do presente estudo pode ser explicada por inibidores de apoptose (Salvesen
amp Duckett 2002) que podem estar ativos e protegendo as ceacutelulas contra apoptose
Outros exemplos citados satildeo os fatores hormonais como as gonadotropinas 17β
estradiol e fator de crescimento epideacutermico que agem como fatores de sobrevivecircncia
para suprimir a morte celular por apoptose em foliacuteculos ovarianos de ratos em cultura
(Chun et al 1994) e tambeacutem no peixe truta arco-iacuteris Oncorhynchus mykiss (Janz amp Van
Der Kraak 1997) Segundo Salvesen amp Duckett (2002) poucos estudos tecircm tentado
esclarecer se uma determinada ceacutelula consegue se recuperar de um efeito fisioloacutegico de
caspases quando estatildeo sendo processadas e ativadas
Um grupo de proteiacutenas estruturalmente relacionadas agrave inibiccedilatildeo da apoptose eacute o
inibidor de apoptose (IAP) (Deveraux amp Reed 1999) Satildeo descritos pelo menos oito
IAPs em humanos localizados no citoplasma e que se ligam na forma ativa da caspase
3 ou na forma zimogecircnio das caspases para inibir a sua funccedilatildeo (Salvesen amp Duckett
97
2002) Janz et al (1997) mencionam forte relaccedilatildeo com o aumento da apoptose e
expressatildeo de proteiacutena do choque teacutermico HSP70 em peixes expostos agrave celulose
afetando o tamanho do ovaacuterio provocanado queda da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
testosterona e induccedilatildeo nas concentraccedilotildees plasmaacuteticas de 17β estradiol Em relaccedilatildeo agrave
HSP70 ela pode estar relacionada com a proteccedilatildeo das ceacutelulas foliculares antes da
reabsorccedilatildeo do vitelo em foliacuteculos atreacutesicos (Santos et al 2008) A relaccedilatildeo mais
consistente da viabilidade dos foliacuteculos de A bimaculatus no presente estudo segundo a
literatura pode ser a relaccedilatildeo dos inibidores de apoptose associado com os fatores
hormonais agindo como prevenccedilatildeo na sobrevivecircncia das ceacutelulas foliculares no
desenvolvimento folicular secundaacuterio
Nas fecircmeas do lambari A bimaculatus o processo de atresia foi semelhante ao
descrito por Miranda et al (1999) Munoz et al (2002) Melo et al (2005) e Santos et
al (2005) A maior frequecircncia de atresia foi observada em foliacuteculos secundaacuterios
Observaccedilotildees semelhantes foram feitas por Drummond (1996) em A bimaculatus
lacustris e Melo et al (2005) em A scabripinnis Em relaccedilatildeo aos foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios ocorre perda de contato entre as membranas das ceacutelulas foliculares
adjacentes evento observado por Santos et al (2005) entre 48 e 72 horas poacutes-desova em
Leporinus taeniatus Essas estruturas foram raramente encontradas no presente estudo
indicando que o grau de contaminaccedilatildeo pelo Thiodanreg natildeo interferiu na eliminaccedilatildeo dos
foliacuteculos de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada
Nos processos de atresias e nos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios ocorreram a
desorganizaccedilatildeo e a perda da positividade da imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e
integrinas nas fases avanccediladas quando comparadas com as fases iniciais da regressatildeo
ovariana sendo esta caracteriacutestica tambeacutem observada por outros autores (Santos et al
2008 Thomeacute et al 2010) Relatos importantes sobre a integridade dos foliacuteculos estatildeo
na diminuiccedilatildeo da integrina β1 e colaacutegeno do tipo IV contribuindo para o aumento da
apoptose em ceacutelulas foliculares de foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios e nas atresias avanccediladas
(Santos et al 2008) Aleacutem disso outros fatores contribuem para o aumento da
apoptose como a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 17β estradiol logo apoacutes a desova
favorecendo a regressatildeo ovariana dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios (Kaptaner amp Ural 2006)
Portanto o presente estudo com as fecircmeas de A bimaculatus evidencia a caspase 3 e a
diminuiccedilatildeo da marcaccedilatildeo com integrina β1 e colaacutegeno tipo IV nas ceacutelulas foliculares nos
foliacuteculos atreacutesicos e poacutes-ovulatoacuterios o que sugere a provaacutevel accedilatildeo destas proteiacutenas na
regressatildeo folicular em lambaris expostos ao Thiodanreg
98
De acordo com os resultados obtidos pode-se inferir que os ovaacuterios A
bimaculatus foram resistentes ao Thiodanreg nas concentraccedilotildees testadas e no periacuteodo
experimental proposto pois tais concentraccedilotildees natildeo interferiram de modo significativo
na estrutura do complexo folicular e no desenvolvimento folicular Qualitativamente
essas anaacutelises demonstraram a marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do
desenvolvimento folicular mesmo quando os peixes foram expostos a diferentes
concentraccedilotildees de Thiodanreg o que caracteriza a integridade das ceacutelulas foliculares e da
via apoptoacutetica caspase-3-dependente que pode estar sendo ativada para futuros
processos de regressatildeo folicular
99
A
DC
B
fsa fp
fpi
fpi
mc
mi
fpa
fpa
fsa
fsa
zr
zr
zr zr
H
E
G
F
mc
m
mi
mc
fsa
fpi
fpa
fsi
vc fsa
fst
v
v
Figura 1 Imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 ao longo do desenvolvimento folicular em A bimaculatus A Controle negativo para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV B Foliacuteculo primordial (fp) sem marcaccedilatildeo para colaacutegeno (setas) C e D Marcaccedilatildeo positiva para colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) respectivamente em folliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio inicial (fpi) E e F Marcaccedilatildeo positiva para colaacutegeno (mc) e integrina (mi) em foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (fpa) Encarte-C Foliacuteculo primaacuterio inicial (fpi) G e H Marcaccedilatildeo para colaacutegeno (mc) e integrina (mi) mais fortemente evidenciada em foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (fsa) Encartes-G e H Foliacuteculo secundaacuterio inicial (fsi) foliacuteculo secundaacuterio intermediaacuterio (fst) foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado (fsa) vesiacuteculas corticais (vc) vitelo (v) zona radiata (zr) Encartes C E G e H corados com hematoxilinaeosina Barras 20 m encartes C e E (80 m) G (100m) e H (200m)
A B
C D
E F
G H
100
fpi
fpa
fsa
fsa
fsa
zr
zr
zr zr
D
A
C
B
Figura 2 Imunomarcaccedilatildeo para caspase 3 ao longo do desenvolvimento folicular em A bimaculatus A Imagem do controle negativo para caspase 3 (setas) B Ausecircncia de marcaccedilatildeo para caspase 3 (setas) em foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio inicial (fpi) C e D Marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) em foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (fsa) e ausente (setas) em foliacuteculo desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (fpa) zr zona radiata fsa foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado Barras 20 m
101
A
mc
mi
mc
mi
mi mc
fpo fpo
ai av
av
B
C D
E F
Figura 3 Imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 de atresia e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterio em A bimaculatus A e C Foliacuteculo secundaacuterio em atresia inicial (ai) caracterizando a presenccedila da zona radiata (zr) e iniacutecio da desorganizaccedilatildeo da marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) no complexo folicular (setas) B e D Imunomarcaccedilatildeo menos intensa do que na etapa anterior em atresia avanccedilada caracterizando a desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) no citoplasma (setas) E e F Foliacuteculo poacutes-ovulatoacuterio (fpo) caracterizando a desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) entre as ceacutelulas
foliculares (setas) Encartes A e B Atresia inicial (ai) e atresia avanccedilada (av) ceacutelula folicular (cf) zona radiata (zr) Encartes A e B corados com hematoxilinaeosina Barras A B C E e F
(20 m) D (200 m) encartes A (25 m) e B (100 m)
ai av zr cf cf
102
A
ai av
fpo fpo
B
C D
Figura 4 Imunomarcaccedilatildeo para caspase 3 em atresia folicular e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios em A bimaculatus A e B Imunomarcaccedilatildeo em atresia inicial (ai) e atresia avanccedilada (av) caracterizando a presenccedila de marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) C e D Imunomarcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) nas ceacutelulas dos foliacuteculos poacutes-ovulatorios (fpo) Barras A B e D (20 m) C (200 m)
103
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6 CONCLUSOtildeES A CL50 estimada para fecircmeas adultas de Astyanax bimaculatus em maturaccedilatildeo
avanccedilada expostas ao Thiodanreg eacute de 136microgL com intervalo de confianccedila de 101 a
184 microgL
A accedilatildeo do Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou o fiacutegado como um todo
mas locais isolados do parecircnquima hepaacutetico sendo a maioria alteraccedilotildees de estaacutegio I e
II com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico
As alteraccedilotildees na quantidade de glicogecircnio hepaacutetico no experimento sem aclimataccedilatildeo
sem alimentaccedilatildeo demonstraram que o Thiodanreg influenciou na maior mobilizaccedilatildeo
das reservas de glicogecircnio em funccedilatildeo das condiccedilotildees ambientais oferecidas aos
animais
As alteraccedilotildees ocorridas no nuacutecleo e citoplasma dos hepatoacutecitos demonstram que o
Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees hepaacuteticas confirmando que o Thiodanreg
influenciou no metabolismo celular como resposta adaptativa celular
Natildeo foram observadas diferenccedilas morfoloacutegicas que comprometessem diretamente os
estaacutedios de desenvolvimento folicular ovariano seja no grupo controle ou nos grupos
tratados com Thiodanreg
Os experimentos com aclimataccedilatildeo apresentaram alteraccedilotildees na quantidade de
foliacuteculos primaacuterios e secundaacuterios quando comparadas com os peixes sem
aclimataccedilatildeo sugerindo que o eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-ovaacuterio pode estar sendo
afetado
Houve maior diacircmetro nos foliacuteculos vitelogecircnicos e maior frequecircncia de atresia
folicular no experimento com aclimataccedilatildeo seguida de exposiccedilatildeo ao Thiodanreg o que
sugere mecanismo adaptativo com maiores diacircmetros de foliacuteculos no meio
impactado
108
As meacutedias dos IGS e IHS nos experimentos aclimatados foram menores quando
comparadas com os experimentos sem aclimataccedilatildeo sugerindo que a espeacutecie A
bimaculatus previamente aclimatada em aquaacuterios pode sofrer comprometimento da
reproduccedilatildeo
As reaccedilotildees imunohistoquiacutemicas para integrina β1 colaacutegeno IV e caspase-3 em
foliacuteculos atreacutesicos e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios sugerem possiacutevel relaccedilatildeo com a
regressatildeo ovariana poacutes-desova
As anaacutelises por imunohistoquiacutemica para integrina β1 colaacutegeno IV e caspase-3 nas
ceacutelulas foliculares ao longo do desenvolvimento folicular demonstraram
qualitativamente marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento
folicular mesmo quando os peixes foram expostos a diferentes concentraccedilotildees de
Thiodanreg o que caracteriza a integridade das ceacutelulas foliculares e da via apoptoacutetica
caspase-3-dependente que pode estar sendo ativada para futuros processos de
regressatildeo folicular
v
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 CAPIacuteTULO 1 Efeitos do inseticida Thiodanreg sobre a morfologia
hepaacutetica de fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
52 CAPIacuteTULO 2 Efeitos do inseticida Thiodanreg sobre a morfologia
do desenvolvimento folicular em lambaris Astyanax bimaculatus
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
53 CAPIacuteTULO 3 Relaccedilatildeo entre colaacutegeno tipo IV integrina β1 e
caspase 3 durante o desenvolvimento folicular em Astyanax
bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Resumo
1 Introduccedilatildeo
2 Material e meacutetodos
3 Resultados
4 Discussatildeo
5 Referecircncias bibliograacuteficas
6 CONCLUSOtildeES
35
35
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107
vi
RESUMO
MARCON Lucas D Sc Universidade Federal de Viccedilosa dezembro de 2013 Efeitos do Thiodanreg em fiacutegado e em ovaacuterios em maturaccedilatildeo avanccedilada de lambaris Astyanax bimaculatus Orientador Laeacutercio dos Anjos Benjamin Coorientadoras Ann Honor Mounteer e Marlene Isabel Vargas Viloria
O agrotoacutexico Thiodanreg (350gL de endosulfan) eacute um inseticida organoclorado utilizado
em diversas monoculturas que pode chegar aos ecossistemas aquaacuteticos e afetar a
reproduccedilatildeo e a integridade das populaccedilotildees de peixes O fiacutegado eacute um dos principais
oacutergatildeos para a biotransformaccedilatildeo de diversos xenobioacuteticos Quando os peixes satildeo
expostos a uma concentraccedilatildeo elevada de agentes quiacutemicos podem ocorrer danos
hepaacuteticos Os ovaacuterios de peixes apresentam foliacuteculos em diferentes estaacutedios de
desenvolvimento que satildeo envoltos por zona radiata ceacutelulas foliculares membrana basal
e ceacutelulas da teca formando o complexo folicular Agentes estressores podem causar
aumento ou diminuiccedilatildeo do diacircmetro dos foliacuteculos vitelogecircnicos alterar a quantidade de
foliacuteculos nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento e aumentar a incidecircncia de atresia
Assim o presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos do Thiodanreg sobre o fiacutegado
e ovaacuterios de lambaris Astyanax bimaculatus por meio de anaacutelises morfoloacutegica
morfomeacutetrica e imunoistoquiacutemica Os peixes expostos ao toacutexico foram divididos em
quatro experimentos 1) sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo 2) sem aclimataccedilatildeo e
alimentados 3) com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo 4) com aclimataccedilatildeo de
10 dias e alimentados Em todos os experimentos foram utilizadas trecircs concentraccedilotildees
diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 de 1367microgL preacute-determinada em laboratoacuterio
de acordo com a NBR 15088 (ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas em cada
experimento foram de 115 23 e 56microgL aleacutem de um grupo controle livre de toacutexico
com trecircs repeticcedilotildees contento 10 peixes para cada concentraccedilatildeo Apoacutes as 96h seis peixes
de cada grupo foram capturados e anestesiados com benzocaiacutena (110000) de acordo
com as Normas da Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de VeterinaacuteriaUFV (protocolo
242009) Os fiacutegados e ovaacuterios foram coletados e processados por teacutecnicas histoloacutegicas
rotineiras As lacircminas foram analisadas em microscoacutepio de luz Olympus CX31 Foram
obtidas imagens digitais de 10 campos aleatoacuterios por animal em objetiva de 20X e 40X
para avaliaccedilatildeo histoloacutegica As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada nos testes em sistema
estaacutetico foram mantidas de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT
2007) A anaacutelise histoloacutegica dos fiacutegados mostrou no experimento 1 (sem
vii
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo) na concentraccedilatildeo de 56microgL de Thiodanreg a menor
intensidade (010plusmn00) da reaccedilatildeo ao PAS no citoplasma dos hepatoacutecitos quando
comparada ao grupo controle (133plusmn051) No entanto houve diferenccedila (Plt005) nesse
mesmo experimento quando comparado com as concentraccedilotildees 115microgL (266plusmn081) e
23microgL (300plusmn00) caracterizando depleccedilatildeo de glicogecircnio Aleacutem disso houve
alteraccedilotildees do diacircmetro de nuacutecleos e citoplasma dos hepatoacutecitos nos diferentes
experimentos e maior quantidade de nuacutecleos de hepatoacutecitos nos grupos expostos ao
Thiodanreg associada com a reduccedilatildeo na quantidade de citoplasma O Iacutendice de Alteraccedilatildeo
Histoloacutegica (IAH) dos lambaris coletados manteve-se entre 433 a 833 (para os grupos
controles) 1850 a 2883 (para as concentraccedilotildees de 115microgL) 2033 a 2833 (para as
concentraccedilotildees de 23microgL) e 2366 a 2766 (para as concentraccedilotildees de 56microgL) Os
lambaris coletados nos diferentes experimentos apresentaram valores de IAH para os
grupos controle inferiores (Plt005) aos grupos expostos Estes resultados demonstraram
que o Thiodanreg pode estar influenciando as funccedilotildees hepaacuteticas pela maior mobilizaccedilatildeo
das reservas de glicogecircnio na concentraccedilatildeo 56microgL As alteraccedilotildees observadas nos
fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas sendo alteraccedilotildees de estaacutedio I e II indicando
dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico nos diferentes grupos e experimentos Nos ovaacuterios
percebeu-se que a accedilatildeo do Thiodanreg em niacuteveis subletais natildeo afetou a morfologia dos
diferentes estaacutedios de desenvolvimento folicular Poreacutem os experimentos com
aclimataccedilatildeo demonstraram alteraccedilotildees nas quantidades de foliacuteculos primaacuterios e
secundaacuterios quando comparados com os peixes dos experimentos sem aclimataccedilatildeo
Aleacutem disso houve aumento do nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos e diacircmetro dos foliacuteculos
secundaacuterios nos grupos expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos Estes
resultados sugerem mecanismos compensatoacuterios da perda reprodutiva quando em meio
com condiccedilotildees desfavoraacuteveis As anaacutelises imunoistoquiacutemicas demonstraram marcaccedilatildeo
crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento folicular para integrina β1 e
colaacutegeno tipo IV Entretanto a caspase 3 foi observada somente no complexo folicular
de foliacuteculos secundaacuterios mesmo quando os peixes satildeo expostos a diferentes
concentraccedilotildees de Thiodanreg o que confirma a integridade das ceacutelulas foliculares e da via
apoptoacutetica caspase-3-dependente a qual pode estar sendo ativada para futuros processos
de regressatildeo folicular
viii
ABSTRACT
MARCON Lucas D Sc Universidade Federal de Viccedilosa December 2013 Effects of Thiodanreg in liver and ovaries in advanced maturation of the lambari Astyanax bimaculatus Advisor Laeacutercio dos Anjos Benjamin Co-advisors Ann Honor Mounteer and Marlene Isabel Vargas Viloria
The pesticide Thiodanreg (350gL-1 of endosulfan) is an organochlorine insecticide used
in various monocultures that may reach aquatic ecosystems and affect reproduction and
the health of fish populations The liver is a major organ for the biotransformation of
many xenobiotics and it can be damaged if the fish are exposed to a high level of
chemical substances The fish ovaries have oocytes at different stages of development
that are surrounded by zona radiata follicular basal membrane and teca cells to form the
follicular complex Stressor products may cause an increase or decrease in the diameter
of the secondary follicles vitellogenic depletion a change the number of follicles at
different stages of development and an increase the incidence of atresia The present
study aimed to evaluate the effects of Thiodanreg on the liver and ovaries of Astyanax
bimaculatus through morphological morphometric and immunohistochemistry analysis
The groups of fish were exposed to the toxic substances divided in four experiments
without adaptation and no feeding feeding without adaptation with adaptation and no
feeding with adaptation and feeding All experiments used three different
concentrations of Thiodanreg lower than the LC50 of 1367 microgL-1 previously determined
in the laboratory in accordance with the Brazilian Standard Regulation - NBR 15088
(ABNT 2007) The concentrations used in each experiment were 115 23 and 56
microgL-1 and a control group with three repetitions using ten fish in each aquarium After
96h six fish from each group were captured and anesthetized with benzocaine
(110000) according to the norms of the Ethics Committee of the Veterinary
DepartmentUFV (protocol 242009) Livers and ovaries were collected and processed
by histological techniques The slides were examined under the light microscope
Olympus CX31 Were obtained digital images of 10 random fields per animal at 20X
and 40X objective for evaluation The characteristics of the water used in acute tests
were maintained in a stable system in accordance to the recommendations of NBR
15088 (ABNT 2007) In the experiment 1 (without adaptationno feeding) at the
concentration of 56 mgL-1 of Thiodanreg (010 plusmn 00) the intensity of the PAS reaction
was lower in the cytoplasm of hepatocytes when compared to the control group (133 plusmn
ix
051) In the same experiment differences in glycogen depletion were (Plt005) when
compared to the concentrations 115 gL-1 (266 plusmn 081) and 23 gL-1 (300 plusmn 00) In
addition changes in the diameter of nuclei and cytoplasm of hepatocytes in all
experiments were observed and an increase in the number of hepatocyte nuclei in
groups exposed to Thiodanreg was associated with a reduction in the amount of
cytoplasm However the IHA was maintained between 433 to 833 (control group)
1850 to 2883 (115 mgL-1 group) 2033 to 2833 (23 gL-1 group) and 2366 to 2766
(56 gL-1 group) These results suggest that Thiodanreg may be influencing liver
functions to increase glycogen mobilization according to higher concentrations of
exposition The changes observed in the livers of A bimaculatus were not severe
classified as stage I and II that indicate repairable damage to liver tissue in all
experiments It was observed in the ovaries that the action of Thiodanreg in sublethal
levels did not affect (Plt005) the morphology of the different stages of follicle
development However the experiments demonstrated an adaptation response in the
number of primary and secondary follicles compared to fish without adaptation In
addition there was a growing incidence of atretic follicles and increased diameter of the
secondary follicles in the groups exposed to Thiodanreg in all experiments These results
suggest an adaptive response to offset reproductive loss where in unfavorable
conditions The immunohistochemical analysis showed increasing and uniform labeling
throughout the follicular development for integrin β1 and collagen type IV However
caspase 3 was observed only in the secondary ovarian follicular complex even when
fish were exposed to different concentrations of Thiodanreg which characterizes the
integrity of follicular cells and the apoptotic pathway-dependent caspase-3 which may
be activated for future follicular regression
1
1 INTRODUCcedilAtildeO GERAL
11 O uso de agrotoacutexicos
Agrotoacutexicos satildeo produtos e agentes de processos fiacutesicos quiacutemicos ou bioloacutegicos
destinados ao uso nos setores de produccedilatildeo no armazenamento e beneficiamento de
produtos agriacutecolas nas pastagens na proteccedilatildeo de florestas nativas ou implantadas e de
outros ecossistemas e tambeacutem de ambientes urbanos e industriais cuja finalidade eacute
preservaacute-los da accedilatildeo danosa de seres vivos considerados nocivos (Lei Federal 7802 de
110789) Os agrotoacutexicos satildeo importantes na agricultura todavia exigem precauccedilatildeo no
seu uso visando a proteccedilatildeo dos operaacuterios que os manipulam e aplicam dos
consumidores dos animais de criaccedilatildeo de abelhas peixes de organismos predadores e
parasitas e enfim do meio ambiente
Certas praacuteticas agriacutecolas ligadas ao modelo de produccedilatildeo agriacutecola como o uso
excessivo e inadequado de agrotoacutexicos a destruiccedilatildeo da cobertura vegetal dos solos para
plantio a natildeo preservaccedilatildeo das matas ciliares e das vegetaccedilotildees protetoras de nascentes
dentre outros fatores satildeo responsaacuteveis por grande parte dos problemas com os recursos
hiacutedricos (Matuo 1990)
Os inseticidas constituem importante grupo de praguicidas para o uso agriacutecola
que ano apoacutes ano mostra um aumento progressivo em seu uso na Ameacuterica do Sul
Estes nas uacuteltimas deacutecadas comeccedilaram a substituir inclusive o trabalho mecacircnico e
manual dos agricultores Ruumlegg et al (1987) e Tomita amp Beyruth (2002) relatam que o
modelo de agricultura adotado no Brasil baseia-se no uso de agrotoacutexicos Estes
compostos satildeo empregados haacute muito tempo e a partir da 2deg guerra mundial passaram a
ser mais intensamente utilizados
Nos uacuteltimos 40 anos a agricultura brasileira sofreu inuacutemeras e profundas
transformaccedilotildees que alteraram tanto a composiccedilatildeo das culturas como os processos de
produccedilatildeo e padrotildees tecnoloacutegicos ateacute entatildeo em vigor Ruumlegg et al (1987) enfatizam que
o processo de modernizaccedilatildeo entendido como uma seacuterie de transformaccedilotildees tecnoloacutegicas
nos processos produtivos intensificou o emprego de insumos como maacutequinas
fertilizantes e agrotoacutexicos que contam com preccedilos favoraacuteveis e estiacutemulos como creacutedito
farto a juros subsidiados que facilitaram sua ampla adoccedilatildeo no meio rural Assim
agrotoacutexicos tecircm sido amplamente utilizados como uma das principais ferramentas para
um bom programa de controle de plantas daninhas em culturas que tecircm ganhado espaccedilo
na balanccedila comercial agriacutecola brasileira (Rodrigues amp Almeida 2005) O emprego dos
2
agrotoacutexicos tornou-se de uso rotineiro principalmente pelo menor custo e maior
eficiecircncia de controle das plantas daninhas quando comparados aos demais meacutetodos
convencionais de controle Para Rosa (1998) o modelo baseado no uso intensivo de
insumos quiacutemicos de sementes melhoradas e mecanizaccedilatildeo foi denominado ldquoRevoluccedilatildeo
Verderdquo que na deacutecada de 1980 trouxe ao Brasil um novo alento em relaccedilatildeo agrave
produtividade com grandes esperanccedilas de colheitas fartas e novas tecnologias que
propiciaram o domiacutenio de aacutereas pouco exploradas como por exemplo o cerrado da
Regiatildeo Centro-Oeste De fato muitas destas expectativas se realizaram entretanto o
impacto ambiental resultante implicou custos muitas vezes irremediaacuteveis como por
exemplo a perda de biodiversidade e a exaustatildeo de vaacuterios cursos drsquoaacutegua por
assoreamento aleacutem de contaminaccedilatildeo
12 Tipos de inseticidas
Os inseticidas satildeo classificados em quatro categorias conforme sua foacutermula
quiacutemica organoclorados carbamatos organofosforados e piretroides Os
organoclorados satildeo produtos sinteacuteticos que possuem carbono cloro e hidrogecircnio em sua
estrutura quiacutemica Satildeo persistentes no meio ambiente por vaacuterios anos e pouco soluacuteveis
em aacutegua Esses inseticidas quando mal administrados tecircm accedilatildeo toacutexica para diversos
mamiacuteferos sendo sua accedilatildeo natildeo sistecircmica neurotoacutexica e mutagecircnica (Guedes 1990
Pereira et al 2012) Os carbamatos satildeo inseticidas considerados menos persistentes e
com degradaccedilatildeo raacutepida no meio ambiente natildeo satildeo bioacumulados pouco lipofiacutelicos
satildeo sistecircmicos em plantas e inibidores da acetilcolinesterase (Guedes 1990 Ware
1994 Chatterjee et al 2001) Os organofosforados satildeo outro grupo de inseticida
amplamente utilizado no mercado mundial representando 355 do uso na uacuteltima
deacutecada Esses inseticidas caracterizam-se por pouca solubilidade em aacutegua (mais
soluacuteveis do que os organoclorados) toxicidade variaacutevel em animais vertebrados em
alguns animais e plantas tecircm atividade sistecircmica baixa persistecircncia no ambiente e
facilmente degradados por enzimas e fatores quiacutemicos A accedilatildeo desses toacutexicos eacute
semelhante ao carbamato agindo nas vias sinaacutepticas dos axocircnios inibindo a
acetilcolinesterase (Ware 1994 Albinati et al 2009) O piretroide tambeacutem eacute um
inseticida amplamente utilizado na agricultura representando 21 do mercado mundial
na uacuteltima deacutecada O fator positivo do uso desse pesticida eacute que ele eacute muito toacutexico para
insetos e apresenta baixa toxicidade para mamiacuteferos satildeo fotoestaacuteveis com degradaccedilatildeo
raacutepida no solo A accedilatildeo toacutexica desse inseticida eacute semelhante aos primeiros inseticidas
3
desenvolvidos como o organoclorado DDT possuindo accedilatildeo neurotoacutexica nos axocircnios
(Naumann 1990 Ware 1994 Haverinen amp Vornanen 2014)
Nos uacuteltimos anos aumentou muito a diversidade de inseticidas visando a morte
de insetos e a persistecircncia do agrotoacutexico por periacuteodos curtos por questotildees de seguranccedila
ao meio ambiente Aleacutem desses inseticidas que foram mencionados acima existem
vaacuterios inseticidas organossinteacuteticos e inseticidas naturais de origem vegetal animal e
microbiana (Casida amp Quistad 1998 Ishaaya amp Horowitz 1998 Drevnick et al 2006)
13 Inseticidas no meio ambiente rotas de entrada
Os inseticidas podem entrar no meio ambiente acidental ou deliberadamente A
entrada acidental do inseticida origina-se de rejeitos industriais urbanos vazamentos
durante transporte armazenamento e distribuiccedilatildeo enquanto a entrada deliberada ocorre
pela aplicaccedilatildeo de inseticidas no meio rural e urbano As contaminaccedilotildees por agrotoacutexicos
podem contaminar solos e ateacute mesmo a atmosfera Nesse uacuteltimo a movimentaccedilatildeo do
toacutexico se daacute por meio de gotas partiacuteculas soacutelidas e gases que acabam sendo
transportados por longas distacircncias a partir do local de origem da aplicaccedilatildeo (Walker et
al 1996)
O transporte e destino dos agrotoacutexicos no ambiente aquaacutetico eacute ponto de
discussatildeo Murty (1988) descreveu que os agrotoacutexicos entram no ambiente aquaacutetico por
meio da aplicaccedilatildeo intencional implemento aeacutereo escoamento das aplicaccedilotildees ou
liberaccedilatildeo acidental A descarga dos resiacuteduos da manufatura de agrotoacutexicos constitui a
segunda maior fonte de contaminaccedilotildees dos corpos de aacutegua O efeito mais draacutestico eacute
esperado no ponto de liberaccedilatildeo em lagos e pequenos mares internos Os efeitos nos
oceanos eacute pequeno devido ao grande volume de aacutegua e accedilatildeo de correntes (Walker et al
1996)
Na rota de transporte bioloacutegico o sistema natildeo eacute muito importante em termos de
magnitude pela quantidade do xenobioacutetico acumulado quando comparado com fatores
mencionados acima (transporte abioacutetico) mas eacute importante para o homem e vida
silvestre O padratildeo do transporte bioloacutegico dos toacutexicos acumulados nos organismos
segue da seguinte forma herbiacutevoros carniacutevoros e pisciacutevoros (maior eficiecircncia de
acuacutemulo) Nesses uacuteltimos particularmente as espeacutecies de ambientes aquaacuteticos a
acumulaccedilatildeo e magnificaccedilatildeo satildeo maiores do que nas espeacutecies de ambiente terrestre
devido agrave lipofilicidade dos inseticidas particularmente os organoclorados Duas rotas de
entrada podem comprometer a toxicidade dos organismos aquaacuteticos absorccedilatildeo ou
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ingestatildeo A bioconcentraccedilatildeo vai ser mais intensa no ambiente aquaacutetico pois a difusatildeo
dos poluentes na aacutegua aumenta a eficiecircncia de sua absorccedilatildeo pelo organismo aquaacutetico
devido agrave lipofilicidade dos organoclorados Dessa forma a transferecircncia ao longo de
cadeias alimentares eacute tambeacutem mais eficiente e a bioconcentraccedilatildeo acontece em todas as
suas etapas Devido a isso os efeitos em predadores podem ser seacuterios pois aleacutem de
grande bioconcentraccedilatildeo e transferecircncia pela cadeia alimentar alguns destes organismos
como aves que se alimentam de peixes e animais marinhos como focas e cetaacuteceos satildeo
deficientes no metabolismo de desintoxicaccedilatildeo particularmente devido ao sistema de
monoxigenases pouco desenvolvido comprometendo mais a toxicidade por
biomagnificaccedilatildeo (Barron 1995 Borgaacute et al 2004)
Aleacutem da bioconcentraccedilatildeo os resiacuteduos destas substacircncias presentes nas aacuteguas
podem ser aderidos ao material orgacircnico em suspensatildeo depositar-se no sedimento ou
serem absorvidos pelos organismos Assim peixes e invertebrados podem bioacumular
tais compostos ligados agrave mateacuteria ingerida ser passivamente absorvidos pela superfiacutecie
corporal ou durante as trocas respiratoacuterias (Vasconcellos amp Verani 2000 Henry amp
Kishimba 2006)
14 Avaliaccedilatildeo de sensibilidade e estudos de toxicidade aquaacutetica
A realizaccedilatildeo de testes de sensibilidade eacute recomendada como meacutetodo de
qualidade dos planteis de organismos cultivados Nestes testes satildeo utilizadas
substacircncias de referecircncias que incluem principalmente os sais dicromato de potaacutessio
cloreto de potaacutessio e cloreto de soacutedio Estes dois uacuteltimos satildeo mais recomendados pois
seus efluentes experimentais oferecem baixo risco de contaminaccedilatildeo ambiental Os testes
de sensibilidade geralmente satildeo de curta duraccedilatildeo (24 horas) e devem ser repetidos com
frequumlecircncia principalmente nos laboratoacuterios que mantecircm planteis de organismos-testes
pois estes dados servem como padratildeo na sensibilidade natural dos organismos Esta
teacutecnica vem sendo utilizada para avaliar os resultados de toxicidade pois a accedilatildeo toacutexica
somente poderaacute ser atribuiacuteda agrave substacircncia teste quando a sensibilidade natural dos
organismos natildeo tiver demonstrado qualquer alteraccedilatildeo ao longo do periacuteodo em que
foram testados (Ranzani-Paiva et al 2004)
O estudo dos efeitos de agentes toacutexicos sobre a vida aquaacutetica pode ser realizado
por meio de ensaios bioloacutegicos na natureza ou em condiccedilotildees laboratoriais controladas
sendo este uacuteltimo os mais utilizados por permitirem um controle mais efetivo de fatores
ocasionais como temperatura pH duraccedilatildeo de exposiccedilatildeo meio concentraccedilatildeo Ao se
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avaliar a toxicidade de agentes toacutexicos ou misturas destes frente a um reativo bioloacutegico
geralmente se utiliza uma populaccedilatildeo homogecircnea possuindo uma sensibilidade definida
determinando-se a concentraccedilatildeo responsaacutevel por um efeito toacutexico (efeito letal subletal
crocircnico imobilizaccedilatildeo ou modificaccedilatildeo do comportamento entre outros) Estes testes
podem ser realizados utilizando-se sistemas de fluxo contiacutenuo semi estaacuteticos ou
estaacuteticos Quanto ao meio pode-se utilizar meio aquaacutetico do tipo aacutegua continental (aacutegua
dura rica em bicarbonatos e sulfatos dissolvidos ou aacutegua mole isenta de iacuteons caacutelcio e
magneacutesio) marinha ou salobra segundo as necessidades dos organismos avaliados
(CETESB 2008) Com relaccedilatildeo ao organismo-teste por razotildees teacutecnicas e econocircmicas eacute
impossiacutevel testar todas as espeacutecies que fazem parte do ecossistema aquaacutetico Assim
para esses estudos satildeo relacionados normalmente os organismos mais representativos
de cada niacutevel troacutefico na cadeia alimentar como algas microcrustaacuteceos e peixes
15 Caracterizaccedilatildeo do agrotoacutexico Thiodanreg
O endosulfan inseticida desenvolvido pela Hoechst Aktiengesellschaft na
Alemanha foi introduzido no mercado em 1957 com o nome comercial de Thiodan
(Goebel et al 1982 e Stumpf amp Abhaver 1986) O Thiodanreg eacute um inseticida acaricida
organoclorado do grupo quiacutemico eacutester do aacutecido sulfuroso de um diol ciacuteclico Esse
agrotoacutexico eacute classificado toxicologicamente como altamente toacutexico (Classe I)
classificaccedilatildeo ambiental como produto altamente perigoso aleacutem de inflamaacutevel e
corrosivo (Engelhardt amp Sarmento 2008)
O ingrediente ativo do Thiodanreg (350 gL de endosulfan) consiste na mistura de
dois isocircmeros sendo 70 de α-endosulfan e 30 de β-endosulfan Entre os produtos
derivados do metabolismo do endosulfan em mamiacuteferos o sulfato de endosulfan eacute o
principal metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica (Stumpf amp Abhaver 1986)
Os organoclorados como o Thiodanreg atuam nos canais de soacutedio do axocircnio
aumentando o periacuteodo de abertura destes canais O aumento do periacuteodo de abertura dos
canais de soacutedio leva a um aumento do fluxo de soacutedio para o interior da membrana e
acarretando um prolongamento da fase de despolarizaccedilatildeo apoacutes o pico do potencial de
accedilatildeo e devido a isso o inseto morre por hiperexcitaccedilatildeo Consequentemente a
propagaccedilatildeo contiacutenua do impulso nervoso gera tremores convulsotildees prostraccedilatildeo e
posteriormente a morte como observados em insetos Aleacutem disso pode afetar qualquer
tipo de crustaacuteceo peixes e mamiacuteferos inclusive em baixas concentraccedilotildees (Eto 1990
Pereira et al 2012)
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16 O uso do endosulfan
O endosulfan eacute o uacutenico inseticida organoclorado amplamente utilizado em todo
o mundo (Capkin et al 2006 Chakrabarty et al 2012) Segundo a empresa Bayer
(2010) fabricante do produto o Thiodanreg (endosulfan) eacute um inseticida para o controle
de insetos chupadores e mastigadores com accedilatildeo de contato e ingestatildeo Recomenda-se
seu uso especialmente em cultivos de cafeacute cana hortaliccedilas frutas vinhas e forragens
Adverte tambeacutem que natildeo se devem colher frutos ou vegetais tratados ateacute 21 dias apoacutes a
uacuteltima aplicaccedilatildeo
No Brasil segundo Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) a
importaccedilatildeo do endosulfan estaacute proibida a partir de julho de 2012 e sua utilizaccedilatildeo a partir
de 2013 (Molina 2010) A utilizaccedilatildeo de produtos agrave base de endosulfan no Brasil eacute
estimada em 44 milhotildees de toneladas em uma aacuterea de 22 a 36 milhotildees de hectares
podendo representar cerca de 40 do consumo mundial deste organoclorado segundo
dados do Programa Ambiental das Naccedilotildees Unidas (UNEP 2010) Segundo a Agecircncia
de Proteccedilatildeo Ambiental norte americana (EPA 1980) contaminaccedilotildees humanas por
endosulfan satildeo provenientes em 53 dos casos da ingestatildeo de aacutegua contaminada e em
47 dos casos do consumo de alimentos a base de peixes contaminados A mesma
agecircncia define como CL50 aguda valores de 017microgL-1 para truta arco-iacuteris e 740microgL-1
para Daphnia magna
A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em
consideraccedilatildeo a qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente
Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm 3572007 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo
do referido inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
17 Toxicidade aguda do endosulfan
O endosulfan apesar de pertencer agrave classe toxicoloacutegica I eacute altamente toacutexico
para animais aquaacuteticos e terrestres (espeacutecies natildeo alvo) e segundo a Agency for Toxic
Substances and Disease Registry - ATSDR (2000) possui de moderado a alto risco e
efeitos agudos e crocircnicos
Pinheiro et al (1998) advertem com veemecircncia sobre o perigo de contaminaccedilatildeo
do Pantanal e da Amazocircnia lugares ricos em recursos hiacutedricos por produtos agrave base de
endosulfan pois este produto eacute extremamente toacutexico para peixes e outros organismos
aquaacuteticos mesmo em doses muito pequenas O endosulfan natildeo dissolve facilmente na
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aacutegua e adere agraves partiacuteculas do solo levando anos para sua degradaccedilatildeo (Soares et al
2003)
18 Efeitos dos inseticidas organoclorados sobre peixes
Apesar dos mecanismos de toxicidade do endosulfan serem extensivamente
estudados alguns trabalhos foram conduzidos com o objetivo de se avaliar efeitos
histopatoloacutegicos dos agrotoacutexicos em peixes (Naqvi amp Vaishnavi 1993) especialmente
nas gocircnadas fiacutegados bracircnquias e rins Em um desses estudos Capkin et al (2006)
reportaram uma CL50 de 1978 gL para Oreochromis mikyss para 24 horas de
exposiccedilatildeo ao toacutexico o que causou aleacutem da morte de 50 dos animais convulsotildees nado
erraacutetico edema e separaccedilatildeo das lacircminas branquiais edema e necrose do fiacutegado dos
tuacutebulos renais e do tecido hematopoieacutetico Cengiz et al (2001) reportaram lesotildees
similares em bracircnquias do peixe-mosquito Gambusia affinis aleacutem de congestatildeo e
hipertrofia do fiacutegado com o uso do pesticida Thiodanreg Segundo Capkin et al (2006)
alcalinidade e temperatura da aacutegua aleacutem do tamanho dos peixes afetam a toxicidade do
endosulfan Assim peixes pequenos e meacutedios mantidos em temperatura de 131ordmC com
1978 microgL do toacutexico tiveram uma sobrevivecircncia de 25 e 425 respectivamente
enquanto os peixes grandes tiveram 100 de sobrevivecircncia Quando a temperatura da
aacutegua foi aumentada para 16ordmC nenhum dos peixes pequenos e meacutedios sobreviveu
enquanto os sobreviventes de peixes grandes diminuiacuteram para 775 O aumento da
alcalinidade de 198 mgL para 419 mgL ou superior aumentou (Plt0001) a
sobrevivecircncia dos peixes Em relaccedilatildeo agrave dureza entre 357 mgL e 126 mgL a
sobrevivecircncia dos peixes expostos ao endosulfan natildeo foi afetada Histologicamente as
bracircnquias dos peixes tiveram edema lamelar separaccedilatildeo do epiteacutelio das lamelas fusatildeo
lamelar e hipertrofia das ceacutelulas epiteliais Os fiacutegados apresentaram edemas e necroses
graves
Cengiz amp Uumlnluuml (2002) estudaram os efeitos crocircnicos do endosulfan sob as
bracircnquias nas concentraccedilotildees de 05 e 075 microgL ao longo de 30 dias de experimento O
que se comprovou eacute que a dose mais elevada do endosulfan causou mais mudanccedilas
patoloacutegicas que a menor dose Altinok amp Capkin (2007) natildeo verificaram alteraccedilatildeo
morfoloacutegica nas bracircnquias de truta com 21 dias de exposiccedilatildeo de metiocarb entretanto
uma concentraccedilatildeo superior (375 mgL) causou separaccedilatildeo epitelial das bracircnquias No
mesmo trabalho os peixes expostos ao endosulfan com concentraccedilotildees de 06 e 13 microgL
mostraram mudanccedilas morfoloacutegicas nas bracircnquias como desprendimento do epiteacutelio
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aparecimento de granuloacutecitos nas lamelas fusatildeo e necrose lamelar hipertrofia e nuacutecleos
picnoacuteticos Essas evidecircncias comprovam o efeito do endosulfan com comprometimento
das bracircnquias levando a reduccedilatildeo do consumo de oxigecircnio e desregulaccedilatildeo da funccedilatildeo de
osmorregulaccedilatildeo em organismos aquaacuteticos Aleacutem disso os efeitos toacutexicos do endosulfan
no fiacutegado induziram modificaccedilotildees estruturais como hipertrofia dos hepatoacutecitos nuacutecleos
picnoacuteticos e necroses
No trabalho de Ballesteros et al (2007) que utilizaram peixes adultos da espeacutecie
Jenynsia multidentata os testes de toxicidade foram realizados durante 96 horas a fim
de determinar a concentraccedilatildeo letal (CL50) do endosulfan As alteraccedilotildees histoloacutegicas
foram determinadas nas bracircnquias e nos fiacutegados A CL50-96 horas foi significativamente
diferentes entre machos (0719 μgL) e fecircmeas (1317 μgL) A diferenccedila entre os sexos
foi atribuiacuteda ao dimorfismo no teor de lipiacutedios no sexo feminino (216) e masculino
(179) As alteraccedilotildees histoloacutegicas nas bracircnquias incluiacuteram hipertrofia e levantamento
do epiteacutelio das lamelas secundaacuterias e aneurismas Essas alteraccedilotildees causaram um
aumento significativo da espessura da lamela secundaacuteria no grupo tratado em relaccedilatildeo
aos peixes do grupo-controle Finalmente as alteraccedilotildees histoloacutegicas reversiacuteveis como
degeneraccedilatildeo hidroacutepica e dilataccedilotildees dos sinusoides foram observadas nos fiacutegados dos
peixes expostos bem como mudanccedila irreversiacutevel como necrose nas concentraccedilotildees
mais elevadas O fiacutegado eacute um oacutergatildeo importante na capacidade de degradar compostos
toacutexicos mas os seus mecanismos de regulaccedilatildeo podem ser comprometidos em
concentraccedilotildees elevadas causando mudanccedilas estruturais como observadas nesses
trabalhos
A qualidade da aacutegua eacute um fator importante para o sucesso da reproduccedilatildeo dos
peixes Quando a qualidade da aacutegua eacute alterada devido a produtos quiacutemicos a estrutura
histoloacutegica das gocircnadas tambeacutem eacute alterada Para Cengiz et al (2001) os efeitos do
Thiodanreg (endosulfan) satildeo tempo e dose dependentes Dutta et al (2006) descreveram
num estudo de toxicidade crocircnica as injuacuterias causadas pelo Thiodanreg sobre os tuacutebulos
seminiacuteferos do peixe ldquobluegillrdquo Lepomis macrochirus e relataram alteraccedilatildeo dos tuacutebulos
seminiacuteferos que mostraram perda dos padrotildees normais de organizaccedilatildeo celular
diminuindo tambeacutem o diacircmetro das espermatogocircnias primaacuterias gradativamente desde as
primeiras 24 horas de exposiccedilatildeo ateacute as duas semanas seguintes Segundo os autores este
tipo de dano pode afetar as espermaacutetides e os espermatozoides apresentando no final
um impacto negativo na espermatogecircnese e fertilidade do macho comprometendo o
nuacutemero da populaccedilatildeo do ldquobluegillrdquo Lepomis macrochirus Em outro trabalho sobre
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reproduccedilatildeo Hazarika amp Das (1998) identificaram mudanccedilas estruturais nos ovaacuterios de
Heteropneustes fossilis exposto ao organoclorado lindano por 72 horas Os resultados
demonstraram que houve ruptura e diminuiccedilatildeo do tamanho dos foliacuteculos maduros
afetando a fertilidade dos peixes
19 O lambari Astyanax bimaculatus
O lambari Astyanax bimaculatus (Linnaeus 1758) eacute conhecido popularmente
pelos nomes de lambari piaba lambari-guaccedilu mojarra pertence agrave famiacutelia Characidae
ordem Characiformes e ateacute entatildeo uma das espeacutecies da subfamiacutelia Tetragonopterinae
(CEMIGCETEC 2000) No entanto revisotildees recentes colocam o gecircnero em ldquoIncertae
sedisrdquo com 88 gecircneros e 620 espeacutecies sendo que 86 espeacutecies pertencem ao gecircnero
Astyanax (Lima et al 2003)
O A bimaculatus eacute um peixe de pequeno porte atingindo aproximadamente 20
cm de comprimento e pesando ateacute 40 gramas Possui corpo irregularmente eliacuteptico com
nadadeiras amarelas quatro a cinco dentes na seacuterie externa e cinco na seacuterie interna do
preacute-maxilar escamas com reflexos prateados mancha umeral ovalada e peduacutenculo
caudal com mancha alongada que se prolonga ateacute a ponta dos raios caudais medianos
(Britiski et al 1988 CEMIGCETEC 2000)
O gecircnero Astyanax possui ampla distribuiccedilatildeo geograacutefica sendo encontrado
desde o sudoeste dos Estados Unidos ateacute a Bacia do rio da Prata (Moreira Filho 1989
citado por Pereira Filho 2000) Os lambaris satildeo encontrados em cabeceiras de riachos
rios e lagos e vivem sempre em cardumes realizando curtas migraccedilotildees na eacutepoca das
cheias para sua reproduccedilatildeo Em relaccedilatildeo ao periacuteodo reprodutivo dos lambaris este pode
variar conforme a espeacutecie e o habitat sendo normalmente de setembro a marccedilo
(Vazzoler amp Menezes 1992 citados por Pereira Filho 2000)
A biologia reprodutiva do lambari pode ser prejudicada pelo desmatamento
ciliar poluiccedilatildeo industrial e domeacutestica e destruiccedilatildeo de vaacuterzeas e lagoas marginais por
projetos agriacutecolas que tambeacutem constituem ameaccedila em vaacuterias regiotildees (CEMIGCETEC
2000) Esses fatores interferem na dinacircmica da populaccedilatildeo desses peixes
Os lambaris satildeo oniacutevoros se alimentando de algas vegetais sementes larvas e
insetos adultos (CEMIGCETEC 2000) Os lambaris satildeo de extrema importacircncia em
diversos habitats por equilibrarem o ecossistema e a cadeia alimentar constituindo fonte
de alimentos para peixes maiores espeacutecies carniacutevoras e aves Em estudo conduzido com
o lambari da espeacutecie Astyanax janeiroensis verificaram-se que os principais haacutebitos
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alimentares se baseavam em algas microcrustaacuteceos pequenos invertebrados e esporos
vegetais (Santin et al 2005) Diversos trabalhos relatam na literatura a importacircncia do
lambari na estrutura troacutefica do ecossistema e sua variaccedilatildeo alimentar diante de
modificaccedilotildees ambientais (Motta amp Uieda 1995 Suarez et al 1995 Esteves 1998)
Trabalho conduzido por Loureiro et al (1995) verificando a dieta alimentar na espeacutecie
Hoplias malabaricus (traiacutera) no reservatoacuterio da UHE de Segredo (PR) mostraram a
ingestatildeo alimentar preferencial de lambaris de diversas espeacutecies Em outro estudo
verificou-se a importacircncia do lambari como alimento para as espeacutecies Hoplias
malabaricus Oligosarcus longirostris e Rhamdia branneri apoacutes o represamento do
Reservatoacuterio de Salto Caxias (PR) demonstrando ser o alimento preferido dessas
espeacutecies (Novakoski 2007) Aleacutem disso na regiatildeo sudoeste do estado de Minas Gerais
existem representantes do gecircnero no Reservatoacuterio de Furnas (MG) caracterizando a
reproduccedilatildeo ao longo do ano para o equiliacutebrio da cadeia alimentar tendo importacircncia
econocircmica na alimentaccedilatildeo e tambeacutem na praacutetica de pesca profissional (Bazzoli et al
1998 Carvalho et al 2009) Portanto os lambaris satildeo de grande importacircncia em
diversos habitats como consumidores secundaacuterios (Esteves 1998) A ecologia alimentar
de uma determinada espeacutecie faz parte e interfere diretamente na dinacircmica de sua
populaccedilatildeo sendo primordial para a conservaccedilatildeo do ecossistema como um todo (Vitule
amp Aranha 2002)
110 Morfologia hepaacutetica em teleoacutesteos
O fiacutegado eacute um oacutergatildeo multifuncional responsaacutevel por uma das etapas do
processo de desenvolvimento folicular principalmente no periacuteodo de formaccedilatildeo dos
gloacutebulos de vitelo momento em que ocorre a transferecircncia de vitelogenina para o
ovaacuterio etapa fisioloacutegica que inicia nas ceacutelulas da teca e ceacutelulas foliculares com
produccedilatildeo do estradiol No fiacutegado o estradiol estimula os hepatoacutecitos a produzirem a
vitelogenina e careogenina que satildeo levadas pela corrente sanguiacutenea ateacute o ovaacuterio onde
participam da formaccedilatildeo do vitelo e zona radiata durante a maturaccedilatildeo folicular
(Senthilkumaran et al 2004) A produccedilatildeo de vitelogenina no fiacutegado pode variar entre as
espeacutecies de teleoacutesteos devido agraves diferenccedilas na capacidade de armazenamento de energia
condiccedilatildeo fisioloacutegica haacutebitos alimentares e contaminaccedilatildeo (Peyon et al 1996 Hull amp
Harvey 2001 Al -Ghais 2013 Silva Barni et al 2014) Aleacutem disso o fiacutegado eacute
responsaacutevel pela conversatildeo do alimento e desintoxicaccedilatildeo de substacircncias estranhas
(Selman amp Walace 1989 Ribeiro et al 2006)
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O fiacutegado eacute glacircndula digestiva que apresenta superfiacutecie
coberta por uma membrana serosa e o tecido conjuntivo de sua caacutepsula
invagina para o parecircnquima (Takashima amp Hibiya 1995) O fiacutegado de teleoacutesteos eacute
constituiacutedo por hepatoacutecitos ceacutelulas epiteliais dos ductos biliares ceacutelulas endoteliais
ceacutelulas que armazenam gordura (ceacutelulas de Ito) macroacutefagos e ceacutelulas sanguiacuteneas
circulantes (Hinton et al 1984) e em algumas espeacutecies observam-se ceacutelulas do
pacircncreas exoacutecrino (pacircncreas intra-hepaacutetico) distribuiacutedas entre o parecircnquima do oacutergatildeo
assim como descrito para o lambari (Santos et al 2013)
Estruturas lobulares e uma pequena veia central estatildeo presentes em vertebrados
em peixes estas estruturas variam dependendo da espeacutecie e satildeo geralmente obscuras
(Takashima amp Hibyia 1995) Os hepatoacutecitos arranjam-se em fileiras os quais
geralmente apresentam a espessura de duas ceacutelulas O hepatoacutecito possui um nuacutecleo
uacutenico embora ceacutelulas binucleadas possam ser observadas O nuacutecleo se localiza na
regiatildeo central ou no poacutelo celular voltado para o sinusoide e o nucleacuteolo eacute bem evidente
(Arana 1995) A circulaccedilatildeo no fiacutegado eacute realizada pela arteacuteria hepaacutetica veia porta aleacutem
de capilares sinusoides Existem cordotildees de hepatoacutecitos que se arranjam
concentricamente ao redor dos capilares sinusoides (Takashima amp Hibyia 1995)
As vias biliares satildeo formadas por canaliacuteculos biliares preacute-duacutectulo biliar duacutectulo
biliar e ducto biliar O canaliacuteculo biliar eacute formado pela membrana plasmaacutetica dos
hepatoacutecitos e os microvilos dos mesmos preenchem o luacutemen do canaliacuteculo Nos
hepatoacutecitos existem ceacutelulas preacute-ductulares que estabelecem complexos juncionais com
os hepatoacutecitos formando os preacute-duacutectulos biliares A transiccedilatildeo entre preacute-duacutectulo e
duacutectulo ocorre quando o lume biliar estaacute completamente circundado por ceacutelulas
epiteliais biliares O ducto biliar eacute formado por ceacutelulas epiteliais cuacutebicas nos ductos de
menor calibre e ceacutelulas colunares nos grandes ductos sendo a presenccedila de lacircmina basal
o fator diferenciador dos mesmos Nos grandes ductos circundando a lacircmina basal
estatildeo fibroblastos plexo capilar fibras nervosas e ceacutelulas musculares lisas Acredita-se
que estas ceacutelulas musculares promovam os movimentos peristaacutelticos impulsionando a
bile Esse ducto une-se ao ducto ciacutestico dando origem ao ducto coleacutedoco (Arana 1995)
O endoteacutelio eacute fenestrado e a lacircmina basal estaacute ausente No espaccedilo de Disse haacute
ceacutelulas de Ito que em teleoacutesteos se caracterizam por apresentar vesiacuteculas lipiacutedicas
assim como o mesmo tipo celular em mamiacuteferos (Arana 1995) Haacute algumas mudanccedilas
patoloacutegicas que podem ocorrer no fiacutegado de peixes que sofreram exposiccedilatildeo a toacutexicos ou
outras substacircncias irritantes dissolvidas na aacutegua A atrofia eacute caracterizada por
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diminuiccedilatildeo do tamanho dos hepatoacutecitos com presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos Tambeacutem
podem ocorrer necrose degeneraccedilatildeo vacuolar degeneraccedilatildeo gordurosa estagnaccedilatildeo da
bile inflamaccedilatildeo do parecircnquima hepaacutetico (hepatites) cirrose hepaacutetica e
desenvolvimentos de tumores (Takashima amp Hibyia 1995)
111 Morfologia ovariana em teleoacutesteos
Os ovaacuterios das fecircmeas A bimaculatus seguem os padrotildees descritos para a
maioria dos teleoacutesteos sendo oacutergatildeos pares alongados e foliaacuteceos sofrendo
modificaccedilotildees na espessura volume e coloraccedilatildeo durante as diferentes fases do ciclo
reprodutivo conforme observado tambeacutem em outras espeacutecies do gecircnero (Drummond
1996 Miranda 1996 Melo et al 2005 Mazzoni et al 2005 Rodrigues amp Almeida
2005 Carvalho et al 2009 Prado et al 2011) Nesses peixes o ovaacuterio eacute do tipo
cistovariano onde o lume ovariano se estende ateacute o oviduto como na maioria dos
peixes teleoacutesteos (Nagahama 1983 Selman amp Wallace 1986 Connaughton amp Aida
1998)
Nas observaccedilotildees histoloacutegicas do ovaacuterio de A bimaculatus verificou-se que os
mesmos satildeo envolvidos externamente por uma serosa peritoneal constituiacuteda por
mesoteacutelio e lacircmina do tecido conjuntivo fibroso Profundamente a essa estrutura
observa-se tuacutenica albugiacutenea de natureza conjuntiva contendo fibroacutecitos e vasos
sanguiacuteneos A tuacutenica albugiacutenea emite septos para o interior do oacutergatildeo formando lamelas
ovuliacutegeras nas quais encontram-se ovogocircnias e foliacuteculos em diferentes fases de
desenvolvimento No lambari o tipo de desenvolvimento folicular eacute assincrocircnico com
a presenccedila de foliacuteculos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento (Miranda 1996
Drummmond 1996 Marcon 2008)
Em peixes o desenvolvimento folicular tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Begovac amp Wallace 1988 Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter
1996 Grier 2000 e 2002 Carvalho et al 2009) e como nos animais em geral
compreende os periacuteodos preacute-meioacutetico perinucleolar preacute-vitelogecircnico vitelogecircnico e
maturaccedilatildeo final Os foliacuteculos passam por diversas fases de desenvolvimento
diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo de acordo com o periacuteodo reprodutivo do animal (Wallace amp
Selman 1981) Essas fases ocorrem no interior de foliacuteculos cuja parede constituiacuteda de
zona radiata camada folicular membrana basal e teca (Grier 2000) desempenham um
importante papel durante a ovogecircnese e na fertilizaccedilatildeo
13
A foliculogecircnse eacute regulada hormonalmente pelo eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-
gocircnada Em peixes teleoacutesteos estiacutemulos ambientais satildeo convertidos em informaccedilotildees
sensoriais no ceacuterebro associados com a liberaccedilatildeo de hormocircnios liberadores de
gonadotropinas (GnRH) pelo hipotaacutelamo que via corrente sanguiacutenea chegam agrave
adenohipoacutefise que sintetiza e libera hormocircnios gonodotroacutepicos hormocircnio fociacuteculo
estimulante (FSH) e hormocircnio luteinizante (LH) Os hormocircnios FSH e LH se ligam aos
receptores celulares das ceacutelulas tecais (LH-R) e foliculares (LH-R e FSH-R) para
estimularem a produccedilatildeo 17α-hydroxy-pregnesterona (17α-HP) e testosterona (T) Nas
ceacutelulas foliculares os hormocircnios esteroides 17α-HP e T agem como precursor na
produccedilatildeo do 17β-estradiol (17β-E) e do hormocircnio indutor de maturaccedilatildeo (MIH)
substacircncias importantes nas etapas do desenvolvimento folicular e na ovulaccedilatildeo
respectivamente (Dietrich amp Krieger 2009) (Figura 1)
Figura 1 Ceacutelulas somaacuteticas do ovaacuterio e principais produtos (Adaptado de Dietrich amp Krieger 2009)
Muitas das espeacutecies nativas natildeo desovam espontaneamente em ambientes
lecircnticos Algumas espeacutecies nativas quando mantidas em cativeiro se preparam para a
reproduccedilatildeo mas natildeo desovam naturalmente e sofrem regressatildeo ovariana com
consequente atresia dos foliacuteculos A atresia folicular eacute um processo degenerativo de
ocorrecircncia comum nos ovaacuterios de vertebrados e os foliacuteculos podem sofrer atresia em
diferentes fases do desenvolvimento ou diferenciaccedilatildeo (Guraya 1986 Miranda et al
1999 Santos et al 2008b)
A ovulaccedilatildeo refere-se agrave expulsatildeo do foliacuteculo em desenvolvimento maduro
(Redding amp Patintildeo 1993) Na natureza a ovulaccedilatildeo eacute regulada por dois hormocircnios os
quais estimulam o desenvolvimento gonadal em peixes FSH e LH (Connaughton amp
Aida 1998 Klausen et al 2001) Estes hormocircnios gonadotroacutepicos agem nos oacutergatildeos
reprodutores promovendo o desenvolvimento e maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas O
14
processo de transporte dos hormocircnios para as ceacutelulas reprodutoras eacute lento em ambientes
naturais mas na reproduccedilatildeo artificial com a teacutecnica de hipofisaccedilatildeo esse processo
torna-se mais raacutepido em relaccedilatildeo ao processo natural (Woynarovich amp Horvath 1980)
Nos ovaacuterios de peixes teleoacutesteos com fertilizaccedilatildeo externa os foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios estruturas remanescentes da desova satildeo frequentes Um aspecto
interessante eacute saber a duraccedilatildeo da reabsorccedilatildeo dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios nos
procedimentos de desova induzida para as espeacutecies em criaccedilatildeo Drummond (1996) e
Marcon (2008) estudaram a reabsorccedilatildeo dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios no estroma
ovariano em maturaccedilatildeo avanccedilada de lambaris (A bimaculatus lacustris) e observaram
que cinco dias apoacutes a desova os foliacuteculos haviam sido reabsorvidos Durante esse
processo figuras de apoptose satildeo observadas em fecircmeas submetidas agrave hipofisaccedilatildeo
(Drummond et al 2000) o mesmo ocorrendo em Leporinus taeniatus (Anostomidae)
(Santos et al 2003) Santos et al (2008a) registraram por meio das teacutecnicas de TUNEL
e de imunoistoquiacutemica o iacutendice apoptoacutetico em ceacutelulas foliculares dos foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios em Prochilodus argenteus notando que o maior iacutendice de ceacutelulas
foliculares apoptoacuteticas coincidiu com menores valores de integrinas e colaacutegeno tipo IV
no terceiro dia apoacutes a desova induzida Esses achados demonstram a importacircncia dessas
proteiacutenas na integridade das ceacutelulas foliculares nos foliacuteculos
15
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do inseticida organoclorado
endosulfan em sua apresentaccedilatildeo comercial Thiodanreg sobre as caracteriacutesticas
morfoloacutegicas dos ovaacuterios e fiacutegado de fecircmeas adultas de lambaris A bimaculatus apoacutes
exposiccedilatildeo subletal a esse agrotoacutexico durante a maturaccedilatildeo avanccedilada
22 Objetivos especiacuteficos
Estimar a CL50 para fecircmeas adultas de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada
expostas ao inseticida organoclorado Thiodanreg
Avaliar histopatologicamente o fiacutegado dos animais dos grupos controles e tratados
Analisar por morfometria os principais constituintes celulares do fiacutegado nos grupos
controles e tratados
Avaliar diferenccedilas nos valores dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS) e
hepatossomaacutetico (IHS) de animais dos grupos controles e expostos ao toacutexico
Verificar provaacuteveis alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos diferentes estaacutedios de
desenvolvimento de foliacuteculos ovarianos nos grupos submetidos aos efeitos do
toacutexico utilizando-se microscopia de luz
Quantificar os diferentes tipos de foliacuteculos e avaliar por morfometria os diacircmetros
dos foliacuteculos vitelogecircnicos nos grupos controles e tratados
Avaliar e quantificar o processo de atresia folicular nos grupos controles
comparando-os com os grupos tratados
Analisar qualitativamente por imunoistoquiacutemica as proteiacutenas de adesatildeo celular
(integrina β1 e colaacutegeno do tipo IV) nas ceacutelulas foliculares ao longo do
desenvolvimento folicular nos peixes dos grupos controles e tratados e
16
Analisar qualitativamente por imunoistoquiacutemica a proteiacutena caspase 3 nas ceacutelulas
foliculares ao longo do desenvolvimento folicular nos peixes dos grupos controles e
tratados
17
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade Federal
de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste de toxicidade aguda e o teste subletal quanto
as atividades de coleta fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos fiacutegados As etapas de
microtomia coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e
morfomeacutetricas foram realizadas nos Laboratoacuterios de Peixes e de Histopatologia do
Departamento de Veterinaacuteria da UFV (DVTUFV)
31 Animais
Foram utilizadas fecircmeas do lambari A bimaculatus mantidas em tanques de terra
na Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso (g) de 1152 plusmn 201 e comprimento total (cm)
de 912 plusmn 064 As caracteriacutesticas para a escolha dos animais se basearam em aspectos
corporais como ventre abaulado poro genital dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV Os
aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuem capacidade de 50 litros numa
densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro
temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam
um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo contiacutenua de aacutegua para garantir o bem-estar
dos peixes (Figura 2) Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial Purina
contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas de
acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de 255
plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza total
2815 plusmn 594 mgL-1 (CaCO3)
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
18
Figura 2 Principais componentes estruturais dos grupos experimentais (Adaptado de Oliveira Ribeiro et al 2002)
A Bomba para oxigenaccedilatildeo da aacutegua B Termostato para controle da temperatura D Filtro interno L Material contra isolamento de ruiacutedo H-J Trecircs aquaacuterios para cada grupo experimental (Controle e e cada uma das concentraccedilotildees de Thiodanreg )
Os lotes de peixes (120 peixes em cada lote) foram destinados agrave accedilatildeo do toacutexico em
quatro tratamentos diferentes
Experimentos Tratamentos Experimento 1 sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo Experimento 2 sem aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo Experimento 3 com aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo
Experimento 4 com aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo
O periacuteodo de 10 dias para aclimataccedilatildeo dos peixes foi para permitir que as
caracteriacutesticas ovarianas sejam comparadas com os grupos que natildeo foram aclimatados
Dessa forma mostraraacute quais as melhores condiccedilotildees que esses peixes podem ter na
reproduccedilatildeo quando expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
32 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente experimento foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo com 350gL de endosulfan
33 Teste de toxicidade aguda em sistema estaacutetico ndash CL50
A definiccedilatildeo das concentraccedilotildees toacutexicas a serem testadas nem sempre ocorre de
maneira simples Muitas vezes faz-se necessaacuterio uma anaacutelise preliminar para a
definiccedilatildeo da melhor faixa de concentraccedilatildeo a ser considerada nos testes definitivos
Dessa forma a primeira providecircncia desse estudo de toxidade aguda eacute a realizaccedilatildeo de
testes preliminares que devem ser conduzidos com concentraccedilotildees toacutexicas relacionadas
entre si por progressotildees geomeacutetricas de razatildeo 10 calculadas com base em informaccedilotildees
19
obtidas por meio de testes jaacute realizados com outros organismos que mais se assemelham
filogeneticamente ao grupo em questatildeo (Ranzani-Paiva 2004) A partir dos resultados
obtidos nessa fase eacute possiacutevel estabelecer a faixa ideal de concentraccedilatildeo para conduccedilatildeo
dos testes definitivos com o lambari
O teste de concentraccedilatildeo letal (CL50) que avalia a concentraccedilatildeo responsaacutevel pela
mortalidade de metade dos animais foi realizado em sistema de aacutegua estaacutetico de acordo
NBR 15088 (ABNT 2007) com os animais mantidos sob restriccedilatildeo alimentar que se
iniciou 24 horas antes do iniacutecio e perdurou durante o teste Essa restriccedilatildeo alimentar foi
realizada para evitar acuacutemulo de mateacuteria orgacircnica que poderia interferir na accedilatildeo do
agrotoacutexico
Para o teste foram selecionados 120 lambaris fecircmeas adultas em maturaccedilatildeo
avanccedilada com aproximadamente 7cm de comprimento O agrotoacutexico utilizado foi o
Thiodanreg (Bayer) com 350gL-1 de endosulfan Foram utilizadas trecircs repeticcedilotildees com
cinco peixes cada para cada concentraccedilatildeo de Thiodanreg adotada sendo os grupos assim
classificados controle (0microgL-1) 15microgL-1 30microgL-1 60microgL-1 120microgL-1 240microgL-
1 480microgL-1 e 960microgL-1 As concentraccedilotildees foram distribuiacutedas em recipientes plaacutesticos
com 15L de aacutegua dos proacuteprios aquaacuterios (Figura 3) Para obter as diferentes
concentraccedilotildees o Thiodanreg foi diluiacutedo uma primeira vez 1100 (Soluccedilatildeo Padratildeo
Intermediaacuteria contendo 3500mgL-1 de endosulfan) e uma segunda vez 1100 (Soluccedilatildeo
Padratildeo Final contendo 35000microgL-1 de endosulfan) viabilizando a observaccedilatildeo da
toxicidade total do agrotoacutexico e natildeo apenas do princiacutepio ativo (Figura 4)
Figura 3 Recipiente utilizado e distribuiccedilatildeo das concentraccedilotildees
20
Figura 4 Preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo padratildeo final do Thiodanreg
Foram feitas as verificaccedilotildees de mortalidade a cada seis horas (zero 6 12 18 24
30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 e 96 horas) removendo-se os animais mortos o
que proporcionou menores interferecircncias pela decomposiccedilatildeo dos peixes gerando maior
confianccedila da mortalidade apresentada ser em funccedilatildeo da toxicidade do princiacutepio ativo
endosulfan sinergicamente agrave accedilatildeo dos solventes e demais compostos do inseticida Para
acompanhamento da temperatura foi adicionado 15L de aacutegua do mesmo aquaacuterio em
um recipiente idecircntico de forma que qualquer variaccedilatildeo na temperatura pudesse ser
medida sem provocar estresse adicional a nenhum grupo O teste teve iniacutecio no dia
16012010 agraves 1000 horas com teacutermino agraves 1000 horas do dia 20012010 O programa
utilizado para o caacutelculo da CL50 foi o TOXCALC determinando o valor e o intervalo de
confianccedila pelo meacutetodo PROBITUS (Plt005)
34 Teste de toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Depois de estimar a CL50 pelos testes preliminares foi realizada aclimataccedilatildeo de
novos lambaris como descrito no item 31 (Figura 2) onde os peixes se acostumaram
ao seu novo meio e agraves atividades normais de manutenccedilatildeo como alimentaccedilatildeo e limpeza
dos aquaacuterios O teste de toxicidade aguda com o endosulfan foi realizado baseando-se
principalmente nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo com a
NBR 15088 (ABNT 2007)
O teste de toxicidade subletal foi feito com trecircs diferentes dosagens do toacutexico
inferiores agrave CL50 e para fins estatiacutesticos cada concentraccedilatildeo incluindo-se o grupo
controle teve trecircs repeticcedilotildees sob as mesmas condiccedilotildees para depois se avaliar e
Thiodanreg
Soluccedilatildeo padratildeo
intermediaacuteria
(1100)
Soluccedilatildeo
padratildeo final
(1100)
3500mgL de soluccedilatildeo padratildeo
intermediaacuteria 35000 microgL de
soluccedilatildeo padratildeo
final
21
quantificar a mortalidade se for o caso observar o comportamento dos animais que
sobreviveram agrave intoxicaccedilatildeo e os efeitos morfoloacutegicos nos fiacutegados e ovaacuterios dos peixes
expostos Assim como foram trecircs repeticcedilotildees usando-se trecircs diferentes concentraccedilotildees do
toacutexico e um grupo controle para a realizaccedilatildeo do presente experimento foram
necessaacuterias 120 fecircmeas de lambari para cada experimento (Tabela 1)
Tabela 1 Distribuiccedilatildeo das fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus em cada grupo experimental
Repeticcedilatildeo Controle 115microgl 23microgl 56microgl A 10 10 10 10 B 10 10 10 10 C 10 10 10 10
Para cada peixe que sobreviveu agrave intoxicaccedilatildeo pelo periacuteodo de 96 horas (teste de
toxicidade subletal) foram obtidos dados biomeacutetricos como peso corporal comprimento
total e comprimento-padratildeo peso do fiacutegado e peso do ovaacuterio Os ovaacuterios e fiacutegados na
sequecircncia foram fixados para posterior anaacutelise histoloacutegica
35 Avaliaccedilatildeo morfoloacutegica
351 Microscopia de luz
Apoacutes 96 horas de experimento seis animais de cada grupo foram coletados
anestesiados com benzocaiacutena e eutanasiados para coleta dos ovaacuterios e fiacutegados Para o
estudo das caracteriacutesticas morfoloacutegicas de ovaacuterios e fiacutegados os fragmentos foram
fixados em paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo fosfato 01M pH 72 O material foi
fixado por um periacuteodo miacutenimo de 24 horas e preservado em aacutelcool 70 Em seguida os
fragmentos foram transferidos para soluccedilatildeo de aacutelcool 95 por quatro horas Apoacutes isso
os fragmentos de ovaacuterios e fiacutegados foram imersos em soluccedilatildeo de aacutelcool 95 e resina
glicolmetacrilato (Leica Historesin) na proporccedilatildeo de 11 por 12 horas seguida de resina
pura por 24 horas e posterior emblocamento Os fragmentos foram seccionados em
cortes com 3microm de espessura em microacutetomo rotativo com navalha de vidro Foi
preparada uma lacircmina por animal com quatro cortes em cada e em padratildeo semi-seriado
ou seja a cada corte aproveitado eram descartados cinco cortes seguintes para evitar que
a mesma ceacutelula fosse contada duas vezes no momento da anaacutelise baseando-se no
diacircmetro nuclear previamente estabelecido para cada tipo celular em questatildeo
22
As coloraccedilotildees utilizadas foram azul de toluidina e hematoxilinaeosina para
anaacutelises histotoloacutegicas e para morfometria Tambeacutem foi utilizada a reaccedilatildeo histoquiacutemica
com PAS contracorados com hematoxilina para os cortes de fiacutegados As lacircminas foram
montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e
as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
352 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos fiacutegados
Os estudos morfoloacutegicos foram conduzidos em seis animais por concentraccedilatildeo
As lacircminas histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo e fotografadas (ocular
de 10X e objetiva de 40X) em 10 campos ao acaso para anaacutelises morfoloacutegicas e
morfomeacutetricas que pudessem ser representativas dos efeitos do Thiodanreg no tecido
hepaacutetico Estas alteraccedilotildees foram comparadas com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos fiacutegados
das lacircminas do grupo controle
As alteraccedilotildees histoloacutegicas foram avaliadas semiquantitativamente em duas
formas 1) por meio do caacutelculo do Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) com base na
incidecircncia de lesotildees Para tanto atribuiu-se um valor numeacuterico para cada animal
conforme a escala grau 1 (ausecircncia de alteraccedilatildeo histoloacutegica) grau 2 (ocorrecircncia de
lesotildees pontualmente localizadas) e grau 3 (lesotildees amplamente distribuiacutedas pelo oacutergatildeo)
em 10 campos fotografados e 2) por meio do caacutelculo do Iacutendice de Alteraccedilatildeo
Histopatoloacutegica (IAH) com base na severidade de cada lesatildeo de acordo com Schwaiger
et al (1997) Para tanto as alteraccedilotildees foram classificadas em estaacutedios progressivos
quanto ao comprometimento das funccedilotildees do oacutergatildeo alteraccedilotildees de estaacutedio I que natildeo
comprometem o funcionamento do oacutergatildeo de estaacutedio II mais severas e que prejudicam
o funcionamento normal do oacutergatildeo e de estaacutedio III muito severas e irreversiacuteveis
adaptado de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic (1994) (Tabela 2) O valor de IAH foi
calculado para cada animal utilizando a foacutermula IAH =10ordm sumI + 10ˡ sumII + 10sup2 sumIII
sendo I II e III correspondentes ao nuacutemero de alteraccedilotildees de estaacutedio I II e III
respectivamente O valor meacutedio de IAH foi dividido em cinco categorias seguindo
metodologia de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic (1994) 0-10= funcionamento normal do
tecido 11-20= dano leve a moderado do tecido 21-50= dano moderado a severo do
tecido 51-100= dano severo do tecido maior que 100= dano irreparaacutevel do tecido Este
iacutendice permitiu a comparaccedilatildeo da severidade das lesotildees hepaacuteticas entre os peixes
expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
23
Tabela 2 Classificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histoloacutegicas do fiacutegado quanto ao estaacutegio de comprometimento das funccedilotildees teciduais (adaptado de Poleksic amp MitrovicndashTutundzic1994)
Para as anaacutelises morfomeacutetricas foram realizadas dez mediccedilotildees dos diacircmetros de
nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos para cada animal As medidas foram obtidas por
meio do programa Image-Pro Plus traccedilando duas linhas perpendiculares respeitando-se
os limites do nuacutecleo e do citoplasma do hepatoacutecito em anaacutelise (Figura 5) Aleacutem disso
foram quantificados pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleo citoplasma capilar sinusoides e
macroacutefagos em 10 campos (gradiacutecula com 100microm de lado e uma aacuterea de 10000micromsup2)
totalizando 4410 pontosanimal para o caacutelculo da constituiccedilatildeo tecidual hepaacutetica (Figura
6) Estas avaliaccedilotildees foram conduzidas nos grupos controles e grupos de peixes expostos
ao toacutexico nas diferentes concentraccedilotildees
A quantidade de glicogecircnio nos hepatoacutecitos foi avaliada em toda extensatildeo da
lacircmina de forma semiquantitativa sendo evidenciada pela reaccedilatildeo histoquiacutemica de
Periodic Acid Schiff (PAS) segundo Michalany (1980) Para melhor compreensatildeo dos
resultados as marcaccedilotildees foram determinadas na seguinte escala 0- ausecircncia de
glicogecircnio 1- pouco glicogecircnio 2- quantidade moderada de glicogecircnio 3- muito
glicogecircnio Apoacutes esta anaacutelise foi calculada uma meacutedia do conteuacutedo de glicogecircnio dos
hepatoacutecitos nos grupos controles e grupos expostos ao toacutexico nas diferentes
concentraccedilotildees
ALTERACcedilOtildeES HISTOPATOLOacuteGICAS HEPAacuteTICAS ESTAacuteGIO1 Alteraccedilatildeo nos hepatoacutecitosAtrofia nuclear I
Atorfia nuclear I
Deformaccedilatildeo do contorno celular I
Deformaccedilatildeo do contorno nuclear I
Hipertrofia celular I
Hipertrofia nuclear I
Nuacutecleo na periferia da ceacutelula II
Vacuolizaccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo nuclear II
Nuacutecleos picnoacuteticos II
Rompimento celular II
2 Alteraccedilotildees nos vasos sanguiacuteneos
Hiperemia II
Ruptura de vasos II
3 Necrose
Necrose focal III
24
Figura 5 Metodologia para obtenccedilatildeo de medidas de diacircmetro de nuacutecleo e citoplasma de hepatoacutecitos por meio do programa Image-Pro Plus Coloraccedilatildeo Azul de toluidina Barra 5microm
Figura 6 Gradiacutecula utilizada para contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos capilares e macroacutefagos (4410 pontosanimal) Coloraccedilatildeo Azul de toluidina
25
353 Anaacutelises morfomeacutetri cas e morfoloacutegicas dos ovaacuterios
Os estudos foram conduzidos em seis animais de cada grupo em cada
experimento As lacircminas histoloacutegicas foram analisadsas em toda sua extensatildeo em busca
de alteraccedilotildees morfoloacutegicas foliculares (Tabela 3) que pudessem ser representativas dos
efeitos do Thiodanreg no tecido ovariano sempre comparando estas alteraccedilotildees com o
padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios das lacircminas dos grupos controles
Para a avaliaccedilatildeo morfomeacutetrica foram realizadas contagens dos diferentes
estaacutegios de desenvolvimento folicular Para isto foram utilizadas fotografias obtidas a
partir de 10 campos escolhidos ao acaso em objetiva de 10X (campo com 5094microm de
largura por 68120microm de comprimento totalizando uma aacuterea de 1863 mmsup2) Aleacutem
disso foi realizada a contagem de foliacuteculos atreacutesicos e observados eosinoacutefilos
associados aos foliacuteculos vitelogecircnicos utilizando o microscoacutepio com objetiva de 40X
avaliando-se 10 foliacuteculos escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro
experimentos Tambeacutem foram realizadas mediccedilotildees de diacircmetros em 10 foliacuteculos
vitelogecircnicos para cada animal Estas medidas foram obtidas pelo programa Image-Pro
Plus traccedilando-se duas linhas perpendiculares sobre nuacutecleo e central e respeitando-se os
limites do foliacuteculo As mensuraccedilotildees foram realizadas em imagens obtidas com objetiva
de 4X (Figura 7) Em todas as contagens e mediccedilotildees foram calculados os valores
meacutedios e desvios-padratildeo para cada concentraccedilatildeo para se avaliar o desenvolvimento
folicular nos diferentes experimentos
Tabela 3 Alteraccedilotildees histoloacutegicas do ovaacuterio quanto ao comprometimento folicular (adaptado de Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS FOLICULAR ES Alteraccedilatildeo nos foliacuteculos
Descolamento do revestimento folicular
Retraccedilatildeo citoplasmaacutetica
Retraccedilatildeo nuclear
Atresia folicular
Aglutinaccedilatildeo nucleoplasmaacutetica
Aglutinaccedilatildeo citoplasmaacutetica
Aglutinaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo
Foliacuteculos vazios
Granuloacutecitos envolvendo foliacuteculos
26
Figura 7 Metodologia para obtenccedilatildeo de medidas de diacircmetro de ovoacutecitos vitelogecircnicos avanccedilados por meio do programa Image-Pro Plus Coloraccedilatildeo Hematoxilina eosina
354 Imunoistoquiacutemica
Para detectar a possiacutevel imunorreatividade para colaacutegeno tipo IV integrinas β1 e
caspase 3 no tecido conjuntivo ovaacuterios do lambari foram fixados em paraformaldeido a
4 A recuperaccedilatildeo antigecircnica foi realizada em forno microndas por 10 minutos com os
cortes nas lacircminas sendo imersos em tampatildeo citrato 10mM pH 60 As lacircminas foram
incubadas com peroacutexido de hidrogecircnio a 3 em tampatildeo fosfato por 15 minutos em
temperatura ambiente para inativar peroxidase endoacutegena e com soro albumina bovina a
2 por 45 minutos para bloquear marcador antigecircnico inespeciacutefico Anticorpos
primaacuterios anti-colaacutegeno tipo IV anti-integrina β1 e anti-caspase 3 (Santa Cruz
Biotechnology Calif USA) foram aplicados nas secccedilotildees a 4degC na diluiccedilatildeo 1100
(integrina e colaacutegeno tipo IV) e 1200 (Caspase 3) segundo o fabricante ldquoovernightrdquo
Os cortes foram lavados em PBS e incubados por 45 minutos com diluiccedilatildeo de 1200
com anticorpo secundaacuterio IgG anti-coelho (LSAB 2 sistema HRP da Dako Cytomation
kit Dako Cytomation Carpinteria Calif USA) e tratado com peroxidase conjugada
com estreptavidina por 45 minutos A revelaccedilatildeo foi realizada com diaminobenzidina
(DAB) e as lacircminas foram contracoradas com hematoxilina (Santos et al 2008a)
27
36 Paracircmetros biomeacutetricos
Para analisar quantitativamente a atividade reprodutiva do A bimaculatus foram
registrados para cada exemplar os seguintes dados biomeacutetricos peso corporal (em g)
peso dos ovaacuterios (em g) e peso do fiacutegado (em g) Os valores meacutedios e desvios-padratildeo
dos iacutendices gonadossomaacutetico e hepatossomaacutetico foram calculados para cada animal em
cada um dos grupos propostos no presente estudo
a) Iacutendice gonadossomaacutetico (IGS)
IGS=PG x100 PG= peso dos ovaacuterios
PC PC= peso corporal
b) Iacutendice hepatossomaacutetico (IHS)
IHS= PF x100 PF= peso do fiacutegado
PC PC= peso corporal
37 Anaacutelises estatiacutesticas
As variaacuteveis quantitativas foram submetidas aos testes de homocedasticidade
(Levenes) e normalidade (Shapiro-Wilk) e posteriormente agrave anaacutelise de variacircncia para
testar as variaccedilotildees nos valores meacutedios dos iacutendices calculados no momento da coleta (96
horas) entre os grupos controles e os grupos tratados Foi analisado o coeficiente de
variaccedilatildeo para se evitar erros estatiacutesticos tipo I e tipo II e logo apoacutes foi realizado o teste
parameacutetrico de Duncan ou Tukey (Plt005) para comparar os valores meacutedios Quando
natildeo atenderam agraves premissas de normalidade e homocedasticidade mesmo apoacutes as
transformaccedilotildees apropriadas os dados foram submetidos aos testes natildeo-parameacutetricos de
Kruskal-Wallis (ANOVA) Para as variaacuteveis qualititativas quantificadas foi utilizado o
teste de Kruskal-Wallis (ANOVA) Os graacuteficos foram produzidos usando o software
Microsoft Excel 2010
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5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 CAPIacuteTULO 1
EFEITOS DO INSETICIDA THIODAN reg SOBRE A MORFOLOGIA HEPAacuteTICA
DE FEcircMEAS DE LAMBARIS Astyanax bimaculatus
RESUMO
O Thiodanreg eacute um toacutexico que pode causar alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos tecidos de peixes
expostos a ele dependendo da concentraccedilatildeo A fim de investigar possiacuteveis alteraccedilotildees
este estudo avaliou a morfologia hepaacutetica de fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus
expostas ao Thiodanreg por 96 horas em quatro diferentes experimentos com trecircs
concentraccedilotildees subletais de 115 23 e 56 microgL de Thiodanreg aleacutem de um grupo
controle livre de toacutexico As fecircmeas foram divididas em quatro experimentos sem
aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem aclimataccedilatildeo e alimentados com aclimataccedilatildeo de 10 dias e
sem alimentaccedilatildeo e com aclimataccedilatildeo de 10 dias e alimentados Foi observado que a accedilatildeo do
Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou a estrutura morfoloacutegica do fiacutegado
como um todo mas foram observadas alteraccedilotildees em locais isolados do parecircnquima
hepaacutetico Houve depleccedilatildeo de glicogecircnio deformaccedilatildeo nuclear e citoplasmaacutetica
hipertrofia nuclear e citoplasmaacutetica hiperemia e degeneraccedilatildeo celular nos hepatoacutecitos
nas diferentes concentraccedilotildees No entanto o Iacutendice de Alteraccedilatildeo Histoloacutegica (IHA) e o
Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) demonstraram que as alteraccedilotildees observadas nos
fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas sendo na maioria alteraccedilotildees de estaacutedio I e II
de forma leve a moderada com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico em todas as
concentraccedilotildees Aleacutem disso houve alteraccedilatildeo do diacircmetro do nuacutecleo e citoplasma dos
hepatoacutecitos nos diferentes experimentos e maior quantidade de nuacutecleos de hepatoacutecitos
nos grupos expostos ao Thiodanreg associada agrave reduccedilatildeo na quantidade de citoplasma
Conclui-se que o Thiodanreg influenciou o metabolismo hepaacutetico como resposta
adaptativa celular A incidecircncia de alteraccedilotildees histoloacutegicas no fiacutegado dos lambaris
coletados nos diferentes experimentos indica o comprometimento da sauacutede destes
peixes e mostra que os paracircmetros analisados podem ser empregados como
biomarcadores da contaminaccedilatildeo ambiental nesta espeacutecie
Palavras-chave histopatologia fiacutegado peixe endosulfan ecotoxicologia
36
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 α-endosulfan e 30 β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo a
partir da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em risco os organismos que ali
residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al 2007)
Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos como jaacute
observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis niloticus A
Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan em gordura o valor de
005mgkg-1 (EPA 2002) e em aacutegua doce 022microgL-1 (EPA 1980) A Legislaccedilatildeo
Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em consideraccedilatildeo a qualidade da
aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm
3572007 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo do referido inseticida e
seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
A sensibilidade ao endosulfan pelos organismos aquaacuteticos tem sido bem descrita
na literatura (Capkin et al 2006 Ballesteros et al 2007 Pereira et al 2012) O
produto eacute extremamente toacutexico para peixes e outros organismos aquaacuteticos mesmo em
concentraccedilotildees muito pequenas (Cengiz et al 2001) No entanto a sensibilidade pode
variar entre os sexos assim como foi observado nos peixes adultos da espeacutecie Jenynsia
multidentata sob efeito do endosulfan por 96 horas (Ballesteros et al 2007) Neste
trabalho a CL50 em peixes machos foi de 072 μgL-1 enquanto nas fecircmeas foi de
131μgL-1 valores atribuiacutedos agraves diferenccedilas de maior reserva de lipiacutedeos nas fecircmeas que
nos machos Em outros estudos Capkin et al (2006) utilizaram 1978gL-1 em
Oreochromis mikyss por 24 horas de exposiccedilatildeo ao toacutexico o que causou aleacutem da morte
de 50 dos peixes convulsotildees nado erraacutetico separaccedilatildeo das lacircminas bracircnquiais e
necrose do fiacutegado e como Cengiz et al (2001) reportaram lesotildees similares no peixe-
mosquito Gambusia affinis
O sulfato de endosulfan eacute um dos produtos derivados do metabolismo do
endosulfan sendo considerado o principal metaboacutelito devido agrave sua importacircncia
toxicoloacutegica (Stumpf amp abhaver 1986) e por ser mais estaacutevel no meio ambiente do que
37
quando estaacute em sua foacutermula original (Ali et al 1984) Decorrente disto os peixes
quando expostos a este inseticida podem apresentar alteraccedilotildees morfoloacutegicas
significativas no fiacutegado (Capkin et al 2006 Coimbra et al 2007 Glover et al 2007)
Estas alteraccedilotildees morfoloacutegicas podem ser o surgimento de vacuolizaccedilatildeo dos hepatoacutecitos
depleccedilatildeo de glicogecircnio alteraccedilatildeo dos vasos sinusoides alteraccedilatildeo do tamanho dos
hepatoacutecitos e necroses o que de acordo com alguns autores pode influenciar a siacutentese
de vitelogenina no fiacutegado para formaccedilatildeo dos foliacuteculos vitelogecircnicos em periacuteodo
reprodutivo (Senthilkumaran et al 2004 Al-Ghais 2013 Silva Barni et al 2014 )
Aleacutem disso as funccedilotildees hepaacuteticas podem ser influenciadas pelas diferenccedilas na
capacidade de exposiccedilatildeo a contaminantes condiccedilatildeo fisioloacutegica armazenamento de
energia e haacutebitos alimentares (Ribeiro et al 2006 Al -Ghais 2013 Silva Barni et al
2014)
O lambari Astyanax bimaculatus foi escolhido como organismo experimental
pois eacute muito representativo no ecossistema sendo encontrado desde o Nordeste
brasileiro ateacute a bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Eacute um peixe de
pequeno porte e de faacutecil manutenccedilatildeo em laboratoacuterio
Este estudo teve como objetivo verificar a ocorrecircncia de alteraccedilotildees histoloacutegicas
no fiacutegado de fecircmeas de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada e avaliar a intensidade
de alteraccedilatildeo deste orgatildeo em peixes alimentados e desprovidos de alimento durante
ensaios subletais agudos com o toacutexico Thiodanreg
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste de toxicidade aguda e o teste subletal As
atividades de coleta fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos fiacutegados microtomia
coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e morfomeacutetricas foram
realizadas nos Laboratoacuterios de Peixes e de Histopatologia do Departamento de
Veterinaacuteria da UFV (DVTUFV)
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
38
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos animais em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado poro genital
dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV Os
aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuem capacidade de 50 litros numa
densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro
temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam
sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo contiacutenua da aacutegua para garantir o bem-estar dos
peixes Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial Purina contendo 35 de
proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste da toxicidade aguda em sistema estaacutetico - CL 50
O teste de concentraccedilatildeo letal (CL50) que avalia a concentraccedilatildeo responsaacutevel pela
mortalidade de 50 dos animais foi realizado em sistema de aacutegua estaacutetico de acordo
com a NBR 15088 (ABNT 2007) com os animais mantidos em restriccedilatildeo alimentar que
se iniciou 24 horas antes do iniacutecio do experimento e perdurou durante todo o teste (96
horas) Essa restriccedilatildeo alimentar foi realizada para evitar acuacutemulo de mateacuteria orgacircnica
que poderia interferir na accedilatildeo do agrotoacutexico
Para o teste foram selecionadas 120 fecircmeas adultas de lambari em maturaccedilatildeo
avanccedilada O agrotoacutexico utilizado foi o Thiodanreg (Bayer) com 350gL-1 de endosulfan
Foram utilizadas trecircs repeticcedilotildees com cinco peixes cada para cada concentraccedilatildeo de
39
Thiodanreg adotada sendo os grupos assim classificados controle (0microgL-1) 15microgL-1
30microgL-1 60microgL-1 120microgL-1 240microgL-1 480microgL-1 e 960microgL-1 As concentraccedilotildees
foram distribuiacutedas em recipientes plaacutesticos com 15L de aacutegua dos proacuteprios aquaacuterios
Foram realizadas verificaccedilotildees de mortalidade a cada seis horas ateacute 96 horas
(zero 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 e 96 horas) removendo-se
os animais mortos o que proporcionou menores interferecircncias pela decomposiccedilatildeo dos
peixes gerando maior confianccedila da mortalidade apresentada ser em funccedilatildeo da
toxicidade do princiacutepio ativo endosulfan sinergicamente agrave accedilatildeo dos solventes e demais
compostos do inseticida Para acompanhamento da temperatura foi acondicionado 15L
de aacutegua do mesmo aquaacuterio em um recipiente idecircntico de forma que qualquer variaccedilatildeo
na temperatura pudesse ser medida sem provocar estresse adicional a nenhum grupo O
programa utilizado para o caacutelculo da CL50 foi o TOXCALC determinando o valor e
intervalo de confianccedila pelo meacutetodo PROBITUS (Plt005)
24 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi realizado baseando-se
principalmente nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo a NBR
15088 (ABNT 2007)
As fecircmeas foram expostas ao Thiodanreg (endosulfan 350gL-1) por 96 horas em
quatro tratamentos diferentes 1) experimento sem aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem
alimentaccedilatildeo 2) experimento sem aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo 3) experimento com
aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e 4) experimento com aclimataccedilatildeo de 10 dias
e com alimentaccedilatildeo Todos os experimentos foram constituiacutedos por trecircs concentraccedilotildees
diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 preacute-determinada em laboratoacuterio de acordo com
a NBR 15088 (ABNT 2007) e um grupo controle sem toacutexico As concentraccedilotildees
utilizadas em cada experimento foram de 115 23 e 56microgL-1 com trecircs repeticcedilotildees sob
as mesmas condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
25 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas
Apoacutes 96 horas de experimento foram coletados 96 peixes sendo seis animais
em cada grupo nos diferentes experimentos Logo em seguida os fiacutegados foram
coletados apoacutes os peixes terem sido anestesiados com benzocaiacutena (110000) e
eutanasiados pela secccedilatildeo transversal da coluna vertebral na regiatildeo do opeacuterculo
40
Para a histologia todas as amostras foram fixadas em paraformaldeiacutedo a 4 em
tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedos em resina glicolmetacrilato
(Leica Historesinreg) Em seguida secccedilotildees com 3microm de espessura foram coradas
utilizando azul de toluidina para as anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas As lacircminas
foram montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31
Olympus e as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software
Analysis GETIT Olympus
As lacircminas histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo e foram
fotografados 10 campos ao acaso em objetiva de 40X para anaacutelises morfoloacutegicas e
morfomeacutetricas que pudessem ser representativas do efeito do Thiodanreg no tecido
hepaacutetico Estas alteraccedilotildees foram comparadas com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos fiacutegados
dos grupos controles
As alteraccedilotildees histoloacutegicas foram avaliadas semiquantitativamente de duas
formas 1) por meio do caacutelculo do Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) com base na
incidecircncia de lesotildees Para tanto atribuiu-se um valor numeacuterico para cada oacutergatildeo
conforme a escala grau 1 (ausecircncia de alteraccedilatildeo histoloacutegica) grau 2 (ocorrecircncia de
lesotildees pontuais) e grau 3 (lesotildees amplamente difusas pelo oacutergatildeo) em 10 campos
fotografados e 2) pelo caacutelculo do Iacutendice de Alteraccedilatildeo Histotoloacutegica (IAH) com base na
severidade de cada lesatildeo de acordo com Schwaiger et al (1997) Para tanto as
alteraccedilotildees foram classificadas em estaacutedios progressivos quanto ao comprometimento
das funccedilotildees do oacutergatildeo alteraccedilotildees de estaacutedio I que natildeo comprometem o funcionamento
do oacutergatildeo de estaacutedio II mais severas e que prejudicam o funcionamento normal do
oacutergatildeo e de estaacutedio III muito severas e irreversiacuteveis (adaptado de Poleksic amp Mitrovic-
Tutundzic 1994) (Tabela 1) O valor de IAH foi calculado para cada animal utilizando a
foacutermula IAH =10ordm sumI + 10ˡ sumII + 10sup2 sumIII sendo I II e III correspondentes agraves
alteraccedilotildees de estaacutedios I II e III respectivamente O valor meacutedio de IAH foi dividido em
cinco categorias que seguiu metodologia de Poleksic amp Mitrovic- Tutundzic (1994) 0-
10= funcionamento normal do tecido 11-20= dano leve a moderado do tecido 21-50=
dano moderado a severo do tecido 51-100= dano severo do tecido maior que 100=
dano irreparaacutevel do tecido Este iacutendice permitiu a comparaccedilatildeo da severidade das lesotildees
hepaacuteticas entre os peixes expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
Para as anaacutelises morfomeacutetricas foram realizadas mediccedilotildees dos diacircmetros de dez
nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos para cada animal As medidas foram obtidas por
meio do programa Image-Pro Plus traccedilando duas linhas perpendiculares respeitando-se
41
os limites do nuacutecleo e do citoplasma do hepatoacutecito em anaacutelise Aleacutem disso foram
quantificados pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleo de hepatoacutecito citoplasma de hepatoacutecito
capilares sinusoides e macroacutefagos em 10 campos utilizando-se gradiacutecula com 441
pontos de interseccedilatildeo com 100microm de lado e uma aacuterea de 10000micromsup2 totalizando 4410
pontosanimal para o caacutelculo da constituiccedilatildeo tecidual hepaacutetica
Tabela 1 Classificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histoloacutegicas do fiacutegado quanto ao estaacutegio de comprometimento das funccedilotildees teciduais (adaptado de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic 1994)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS HEPAacuteTICAS ESTAacuteDIO 1 Alteraccedilotildees nos hepatoacutecitos I Atrofia nuclear I Deformaccedilatildeo do contorno celular I Deformaccedilatildeo do contorno nuclear I Hipertorfia celular I Hipertorfia nuclear I Nuacutecleo na periferia da ceacutelula I Vacuolizaccedilatildeo citoplasmaacutetica I Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II Degeneraccedilatildeo nuclear II Nuacutecleo picnoacuteticos II Rompimento celular II 2 Alteraccedilotildees nos vasos sanguiacuteneos Hiperemia II Ruptura de vasos II 3 Necrose Necrose focal III
A quantidade de glicogecircnio nos hepatoacutecitos foi avaliada em toda extensatildeo da
lacircmina de forma semiquantitativa sendo evidenciada pela reaccedilatildeo histoquiacutemica de
Periodic Acid Schiff (PAS) seguida de contracoloraccedilatildeo com hematoxilina segundo
Michalany (1980) Para melhor compreensatildeo dos resultados as marcaccedilotildees foram
determinadas na seguinte escala 0- ausecircncia de glicogecircnio 1- pouco glicogecircnio 2-
quantidade moderada de glicogecircnio 3- muito glicogecircnio Apoacutes esta anaacutelise foi
calculada uma meacutedia do conteuacutedo de glicogecircnio dos hepatoacutecitos nos grupos controles e
grupos expostos ao toacutexico nas diferentes concentraccedilotildees
42
26 Iacutendice hepatossomaacutetico (IHS)
Para o caacutelculo do IHS foram registrados para cada exemplar os dados
biomeacutetricos de peso corporal (PC em g) e peso do fiacutegado (PF em g) Os valores meacutedios
e os desvios padratildeo do iacutendice hepatossomaacutetico (IHS=PFx100PC) foram calculados
para cada animal em cada um dos grupos nos diferentes experimentos nas diferentes
concentraccedilotildees
27 Anaacutelises estatiacutesticas
Os dados estatildeo apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo
Os dados foram avaliados pelo Software Statistica 70 por meio da anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) Apoacutes o teste de distribuiccedilatildeo normal os dados foram comparados
entre os grupos controle e grupos expostos ao Thiodanreg usando anaacutelise de variacircncia
one-way seguida pelo teste de Tukey ou Duncan Quando os dados natildeo apresentaram
uma distribuiccedilatildeo normal foi utilizado o teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Plt005 foi utilizado como criteacuterio de significacircncia
3 RESULTADOS
31 Determinaccedilatildeo da CL50-96h
Nas primeiras seis horas de experimento observou-se mortalidade de 100 de
peixes na concentraccedilatildeo de 96microgL-1 944 de mortalidade em 48microgL-1 733 de
mortalidade em 24microgL-1 266 de mortalidade em 12microgL-1 e 20 de mortalidade em
6microgL-1 sendo um total de 447 dos peixes que morreram nas diferentes
concentraccedilotildees do Thiodanreg nas primeiras seis horas Na concentraccedilatildeo de 3microgL-1
morreu apenas um peixe no final das 96 horas Foi observado 100 de mortalidade na
concentraccedilatildeo de 48microgL-1 em ateacute 12 horas de exposiccedilatildeo ao toacutexico As menores
mortalidades foram registradas nas concentraccedilotildees de Thiodanreg de 3microgL-1 e 6microgL-1
sendo respectivamente 944 e 80 de sobrevivecircncias A concentraccedilatildeo de 15microgL-1
de Thiodanreg e o grupo controle natildeo tiveram mortalidade A temperatura da aacutegua
apresentou variaccedilatildeo entre 220ordmC e 245 ordmC com meacutedia de 233plusmn072 ordmC
Os valores registrados determinaram CL50-96hs de 1367microgL-1para as fecircmeas de
A bimaculatus com intervalo de confianccedila de 101 a 184microgL-1 (Plt005)
43
32 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Durante a exposiccedilatildeo ao Thiodanreg por 96 horas foi observado comportamento
anormal dos peixes com nado erraacutetico tentativa de fuga dos aquaacuterios demonstraccedilatildeo de
agressividade com os demais peixes busca de oxigecircnio na superfiacutecie e respiraccedilatildeo
branquial acelerada Apoacutes 24 horas do iacutenicio os animais apresentavam comportamento
normal e procuravam pelo alimento Estas mudanccedilas comportamentais ocorreram em
todas as concentraccedilotildees do agrotoacutexico utilizadas com maior intensidade na concentraccedilatildeo
de 56microgL do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo cuja temperatura meacutedia
foi superior agrave dos demais experimentos (Tabela 2)
33 Morfologia e frequecircncia das alteraccedilotildees histoloacutegicas nos fiacutegados
Morfologicamente o fiacutegado dos lambaris apresentou hepatoacutecitos hexagonais
com citoplasma de aspecto granular e vacuolizado nuacutecleo arredondado central nucleacuteolo
evidente e presenccedila de hepatopacircncreas Os hepatoacutecitos estavam dispostos em cordotildees
margeando os sinusoides (Figura 1 A)
Os infiltrados leucocitaacuterios foram observados nos grupos controles e nos grupos
expostos ao Thiodanreg (Figura 1 B)
A vacuolizaccedilatildeo foi evidente nos hepatoacutecitos das fecircmeas analisadas (Figura 1 A)
No fiacutegado das fecircmeas do experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve a presenccedila caracteriacutestica de acuacutemulos de lipiacutedios nos
hepatoacutecitos com a presenccedila de vesiacuteculas claras grandes e envolvidas por glicogecircnio
marcado positivamente pela reaccedilatildeo de PAS (Figura 1 C) Aleacutem disso foram observados
nuacutecleos deslocados para a periferia celular No experimento sem aclimataccedilatildeosem
alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve reaccedilatildeo negativa pelo PAS no
citoplasma dos hepatoacutecitos (Figura 1 D)
As alteraccedilotildees de estaacutedio I como deformaccedilatildeo do contorno nuclear nuacutecleo na
periferia da ceacutelula atrofia nuclear desarranjo dos cordotildees hepaacuteticos hipertrofia celular
e nuclear (Figuras 1 E-G Figuras 2 A-B) foram observadas nos grupos controles e
naqueles expostos ao Thiodanreg sendo que nos grupos tratados houve maior frequecircncia
O deslocamento do nuacutecleo para a periferia do hepatoacutecito foi observado nas fecircmeas do
experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 56microgL-1
Quanto agraves alteraccedilotildees de estaacutedio II a degeneraccedilatildeo nuclear (Figura 2 C) foi
raramente presente na maioria das concentraccedilotildees nos diferentes experimentos A
degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica (Figura 2 D) foi pouco frequente em todos os experimentos
44
assim como a hiperemia (Figura 2 E) A presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos (Figura 2 F) foi
mais frequente no experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e no experimento
com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
Os VMAs variaram entre 125 e 228 nas fecircmeas analisadas sendo a menor
meacutedia observada nos grupos controles e as maiores nos grupos expostos ao Thiodanreg o
que mostra incidecircncia maior de alteraccedilotildees pontuais no fiacutegado nos animais dos grupos
tratados Os VMAs do fiacutegado na espeacutecie estudada foram superiores (Plt005) nos peixes
expostos ao agrotoacutexico quando comparado aos peixes dos grupos controles (Tabela 3)
O IAH das fecircmeas nos diferentes experimentos apresentaram valores superiores
(Plt005) nos grupos expostos ao Thiodanreg quando comparados como os grupos
controles (Tabela 4) com exceccedilatildeo do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 115microgL-1 de endosulfan que natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
34 Diacircmetro dos nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos
Os resultados demonstraram aumento (Plt005) no diacircmetro dos nuacutecleos de
hepatoacutecitos dos peixes expostos ao Thiodanreg nas concentraccedilotildees de 115microgL-1 e
23microgL-1 quando comparados ao grupo controle no experimento sem aclimataccedilatildeosem
alimentaccedilatildeo Por outro lado foi registrada diminuiccedilatildeo (Plt005) do diacircmetro dos nuacutecleos
de hepatoacutecitos no experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo quando comparados
aos peixes expostos ao Thiodanreg na concentraccedilatildeo 115 e 23microgL-1 em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Tabela 5)
O diacircmetro do citoplasma apresentou aumento no experimento sem
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e no experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo com
diferenccedila (Plt005) registrada entre os peixes do grupos controles e expostos ao
agrotoacutexico com exceccedilatildeo do experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 23microgL-1 (Tabela 6) Entretanto houve diminuiccedilatildeo nos citoplasmas de
hepatoacutecitos nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo ao grupos controles (Plt005)
nos experimentos sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e no experimento com
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Tabela 6)
35 Quantificaccedilatildeo de nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos macroacutefagos e capilares
sanguiacuteneos no tecido hepaacutetico
Nas contagens de pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleos de hepatoacutecitos (Tabela 7)
foram observadas quantidades superiores nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo
45
aos grupos controles (Plt005) Na quantificaccedilatildeo dos citoplasmas de hepatoacutecitos foram
registradas contagens inferiores (Plt005) nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo
aos grupos controles exceto no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Tabela
8)
Na contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre macroacutefagos natildeo houve aumento
significativo (Pgt005) nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo ao controle (Tabela
9) Em relaccedilatildeo agrave contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre capilares sinusoides a
contagem foi igual na maioria dos peixes expostos ao agrotoacutexico quando comparados
com os controles apresentando diferenccedila significativa (Plt005) entre os grupos
expostos do experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo nas concentraccedilotildees de 115 e
56microgL-1 (Tabela 10)
36 Quantificaccedilatildeo do glicogecircnio hepaacutetico
Em todos os grupos controles e tratados nos diferentes experimentos foram
registrados valores meacutedios para o glicogecircnio variando entre 010 e 300 No
experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo no grupo tratado da concentraccedilatildeo de
56microgL-1 de Thiodanreg foi registrada a menor meacutedia (Tabela 11) No entanto houve
diferenccedila (Plt005) do glicogecircnio hepaacutetico na concentraccedilatildeo de 56microgL quando
comparada com as concentraccedilotildees de 115 e 23microgL-1 (Tabela 11 e Figura 1 D)
37 Iacutendice hepatossomaacutetico
As fecircmeas dos grupos experimentais expostos ao Thiodanreg natildeo apresentaram
diferenccedilas (Pgt005) nos valores do IHS quando comparados com os grupos controles
(Tabelas 12) Entretanto houve diferenccedila (Plt005) do IHS na concentraccedilatildeo de 56microgL-1
quando comparada com as concentraccedilotildees de 115 e 23microgL-1 no experimento sem
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Tabela 12)
4 DISCUSSAtildeO
No presente estudo o lambari apesar de ser de pequeno porte apresentou uma
CL50 de 1367microgL-1 em 96 horas sendo mais resistente que adultos de tilaacutepia niloacutetica
Musanhi (1987) determinou a CL50 96 48 e 24 horas de exposiccedilatildeo ao endosulfan para
tilaacutepia niloacutetica adulta encontrando valores de 142 380 e 103 microgL-1 Nas primeiras 24
horas de accedilatildeo do Thiodanreg nas concentraccedilotildees subletais de 115 23 e 56microgL-1 as
fecircmeas do presente estudo apresentaram comportamentos alterados assim como foi
46
observado na espeacutecie Danio rerio exposta ao endosulfan por 96 horas na concentraccedilatildeo
de 24microgL-1 aleacutem desta espeacutecie ter apresentado uma diminuiccedilatildeo do niacutevel de
acetilcolinesterase (AChE) (Pereira et al 2012) Por outro lado em estudo realizado
por Hernan da Cuntildea et al (2011) com a espeacutecie Cichlasoma dimerus exposta ao
endosulfan por 96 horas nas concentraccedilotildees de 025 1 2 3 4 e 16microgL-1 os peixes
exibiram comportamento indicativo de neurotoxicidade mas natildeo foram encontradas
diferenccedilas na atividade da AChE Estes estudos fornecem evidecircncias adicionais de
efeitos deleteacuterios da exposiccedilatildeo ao endosulfan sobre o sistema nervoso o que contribui
para as observaccedilotildees obtidas no presente estudo
As descriccedilotildees histoloacutegicas hepaacuteticas nas fecircmeas do presente estudo foram
semelhantes ao que foi caracterizado em outros peixes onde os hepatoacutecitos organizam-
se em fileiras ou cordotildees duplos em formato de placas representando um sistema de
fundo-cego anastomosado e de tuacutebulos ramificados (Metcalfe 1998 Hinton et al
2001)
A histologia e a fisiologia do fiacutegado satildeo similares nos vertebrados Ferguson
(1989) e Gingerich (1982) descrevem que existem algumas diferenccedilas estruturais
marcadas no parecircnquima hepaacutetico de peixes em especial pela ausecircncia de lobulaccedilatildeo
espaccedilo porta claacutessico e ausecircncia de zonaccedilatildeo no parecircnquima hepaacutetico o que permite
fluxo lento de sangue nos sinusoides com penetraccedilatildeo diminuiacuteda de quiacutemicos nos
hepatoacutecitos
A presenccedila de porccedilotildees pancreaacuteticas dentro do fiacutegado do lambari eacute descrita na
literatura (Santos et al 2013) Uma das funccedilotildees das ceacutelulas pancreaacuteticas distribuiacutedas
pelo fiacutegado eacute a produccedilatildeo da enzima de biotransformaccedilatildeo citocromo P450 diferente do
que eacute observado para mamiacuteferos onde esta enzima eacute ausente (Hahn et al 1994
Stegeman 1991) A presenccedila de ceacutelulas pancreaacuteticas em estruturas do tecido hepaacutetico
de A bimaculatus sugere a provaacutevel funccedilatildeo dessas ceacutelulas em auxiliar na
desintoxicaccedilatildeo Outra importante estrutura na detoxificaccedilatildeo eacute a presenccedila das ceacutelulas dos
endoteacutelios capilares nas quais tem sido confirmada e identificada a presenccedila de enzimas
citocromo P450 por meio de teacutecnicas de imunomarcaccedilatildeo (Lorenzana et al 1986)
Sendo assim a integridade estrutural dos capilares permanece intacta e sem
comprometimento das possiacuteveis funccedilotildees celulares que estas estruturas podem
desempenhar no tecido hepaacutetico de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
A ausecircncia de estagnaccedilatildeo biliar nos fiacutegados das fecircmeas de A bimaculatus eacute um
fator importante de que o Thiodanreg natildeo interferiu na fisiologia de excreccedilatildeo biliar nos
47
diferentes experimentos Histopatologicamente este tipo de alteraccedilatildeo eacute observado nos
citoplasmas dos hepatoacutecitos com a presenccedila de gracircnulos castanho-amarelados Esta
alteraccedilatildeo consiste na manifestaccedilatildeo fisiopatoloacutegica de uma condiccedilatildeo causada pela falta
de metabolismo e excreccedilatildeo biliar (Pacheco amp Santos 2002) uma vez que a bile
sintetizada pelos hepatoacutecitos permanece no interior das ceacutelulas natildeo sendo liberada para
o tubo digestivo (Simonato et al 2008) Este tipo de alteraccedilatildeo pode ser encontrado em
peixes expostos a toacutexicos (Pacheco amp Santos 2002) e tambeacutem em peixes que
apresentam algum problema nutricional quando satildeo mantidos em cativeiros (Langiano
amp Martinez 2008) No entanto no presente estudo natildeo foram registradas essas
evidecircncias o que sugere que a alimentaccedilatildeo nos grupos tratados com raccedilatildeo comercial de
todos os experimentos natildeo interferiu nas funccedilotildees biliares
Os agregados macrofaacutegicos estatildeo relacionados agrave quebra de eritroacutecitos (Herraez
amp Zapata 1986) apresentaccedilatildeo de antiacutegeno (Ellis 1980) armazenamento de ferro e
detoxicaccedilatildeo de substacircncias endoacutegenas e exoacutegenas (Herraez amp Zapata 1986) Hartley et
al (1996) propuseram a utilizaccedilatildeo do agregado macrofaacutegico como biomarcador de
poluiccedilatildeo aquaacutetica a partir da quantificaccedilatildeo destas estruturas Existem alguns estudos
comparativos em diferentes espeacutecies que tecircm demonstrado variaccedilotildees no nuacutemero
tamanho e pigmentaccedilatildeo destas estruturas em relaccedilatildeo agrave idade nutriccedilatildeo e estado de sauacutede
(Blazer et al 1987 Ferguson 1989 Agius et al 2003) Nos agregados podem ser
observados pigmentos do tipo lipofuscina ceroide hemossiderina e melanina (Wolke
1992 Wolf amp Wolfe 2005) mas no presente estudo natildeo foram evidenciadas nenhuma
destas estruturas
No fiacutegado das fecircmeas do grupo experimental sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
na maior concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve a presenccedila caracteriacutestica de acuacutemulos de
lipiacutedios nos hepatoacutecitos de dois peixes No entanto existem vaacuterias condiccedilotildees de
acuacutemulos de lipiacutedios nos hepatoacutecitos associados com a exposiccedilatildeo aos toacutexicos
(Thiyagarajah et al 1985 Biagianti-Risbourg et al 1995 Lumbertdacha et al 1995
Handy et al 1999 Fanta et al 2003) Glover et al (2007) submeteram o peixe salmatildeo
do Atlacircntico a dieta de 4microgkg de endosulfan por 14 e 35 dias sendo observadas
evidecircncias de lipidoses nos hepatoacutecitos O aparecimento destas estruturas nas fecircmeas de
A bimaculatus foi insignificante nos tecidos hepaacuteticos mas foram contabilizadas como
respostas individuais sugerindo uma disfunccedilatildeo hepaacutetica causada pelo Thiodanreg que
pode comprometer a fisiologia hepaacutetica destas fecircmeas
48
No presente estudo as frequecircncias de alteraccedilotildees morfoloacutegicas indicam que a
accedilatildeo toacutexica do Thiodanreg provocou uma distribuiccedilatildeo de lesotildees de incidecircncia leve a
moderada no tecido hepaacutetico nos diferentes experimentos sendo que nas maiores
concentraccedilotildees do toacutexico houve mais incidecircncias de alteraccedilotildees As alteraccedilotildees observadas
nos fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas isto eacute natildeo apresentaram necrose sendo que
a maioria das alteraccedilotildees satildeo de estaacutedios I e II com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico
As alteraccedilotildees histoloacutegicas tecircm sido relatadas em peixes expostos a ambientes poluiacutedos
(Braunbeck et al 1990 Takashima et al 1995 Schwaiger et al 1997) Da mesma
forma a frequecircncia das alteraccedilotildees pode indicar disfunccedilotildees induzidas por agentes
toacutexicos uma vez que aacutereas metabolicamente ativas do fiacutegado ficam reduzidas levando a
uma possiacutevel reduccedilatildeo geral nas funccedilotildees desempenhadas por este oacutergatildeo (Hinton amp
Laureacuten 1990 Oliveira Ribeiro et al 2002 Pacheco amp Santos 2002 Langiano amp
Martinez 2008) Este resultado sugere que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees
hepaacuteticas mesmo em concentraccedilotildees muito baixas nos diferentes experimentos
independentemente do peixe estar sendo alimentado ou natildeo
As alteraccedilotildees dos diacircmetros de nuacutecleos de hepatoacutecitos podem ser consideradas
resposta ao agente estressor sendo indicativo da ativaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica em
decorrecircncia do aumento da atividade metaboacutelica contra as condiccedilotildees adversas (Stephen
et al 1993 Takashima amp Hibyia 1995 Langiano amp Martinez 2008) Por outro lado a
diminuiccedilatildeo nuclear pode estar relacionada possivelmente com a multiplicaccedilatildeo de
hepatoacutecitos na reposiccedilatildeo de ceacutelulas lesadas em funccedilatildeo da multiplicaccedilatildeo celular (Gul et
al 2004) No trabalho realizado por Oliveira Ribeiro et al (2002) observaccedilotildees
qualitativas por microscopia de luz demonstraram diminuiccedilatildeo no diacircmetro dos nuacutecleos
de hepatoacutecitos na espeacutecie A bimaculatus com alimentaccedilatildeo controlada associada agrave
exposiccedilatildeo ao toacutexico tributiltin Este tipo de alteraccedilatildeo eacute um indicativo de processo
degenerativo celular uma vez que inicia com a condensaccedilatildeo e reduccedilatildeo do diacircmetro do
nuacutecleo (Oliveira Ribeiro et al 2002) No presente estudo as alteraccedilotildees nos diacircmetros
de nuacutecleo de hepatoacutecitos demostraram que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees
hepaacuteticas das fecircmeas
A hipertrofia dos hepatoacutecitos tambeacutem pode ser causada por contaminantes
(Arnold et al 1985) por mudanccedilas estruturais do hepatoacutecito relacionadas ao
funcionamento da ceacutelula (Hinton et al 1992) condiccedilotildees fisioloacutegicas ligadas agrave
reproduccedilatildeo (Wester et al 2003) e pela maior atividade metaboacutelica (Takashima amp
Hibyia 1995) Portanto o aumento do diacircmetro citoplasmaacutetico nos experimentos sem
49
adaptaccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e no experimento com adaptaccedilatildeosem alimentaccedilatildeo mesmo
natildeo apresentando caracteriacutestica de hipertrofia morfoloacutegica evidente mas morfomeacutetrica
sugere indiacutecios de maior metabolizaccedilatildeo pelos hepatoacutecitos nestes grupos experimentais
As alteraccedilotildees dos diacircmetros de citoplasmas dos hepatoacutecitos nos experimentos
demonstraram que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees hepaacuteticas
Na quantificaccedilatildeo de nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos nos diferentes
experimentos foram observados indiacutecios de proliferaccedilatildeo de hepatoacutecitos que pode ser
indicativo da accedilatildeo toacutexica dos hepatoacutecitos contra detoxificaccedilatildeo do Thiodanreg assim como
observado no trabalho por Gul et al (2004) O percentual do tecido hepaacutetico ocupado
por ceacutelulas do tipo hepatoacutecito variou entre 8742 a 9088 na constituiccedilatildeo do
parecircnquima hepaacutetico de A bimaculatus Poucos trabalhos citam a constituiccedilatildeo celular
em fiacutegados de peixes sendo 845 a 873 de hepatoacutecitos ocupando o parecircnquima
hepaacutetico na truta (Hampton et al 1989) e 899 no peixe Golden (Rocha et al 1997)
Estes valores demonstram que a maior parte das ceacutelulas dos fiacutegados nas fecircmeas de A
bimaculatus satildeo hepatoacutecitos como descrito em outras espeacutecies de peixes
O aumento da quantidade de macroacutefagos na concentraccedilatildeo 115microgL-1 dos
experimentos foi superior quando comparado aos demais grupos sugerindo que essa
mobilizaccedilatildeo pode estar ajudando na detoxicaccedilatildeo do fiacutegado (Herraez et al 1986)
Assim a presenccedila de maior quantidade de macroacutefagos e sinusoides podem ser
consideradas indicadoras de estresse em peixes decorrentes da presenccedila de agentes
quiacutemicos (Anderson amp Zeeman 1995 Rabitto et al 2005) Essas ceacutelulas satildeo
observadas frequentemente nas regiotildees proacuteximas aos sinusoides e desprovidas de
pigmentaccedilatildeo Foram observados macroacutefagos em trutas Oncorhynchus mykiss e Salmo
trutta fario na proporccedilatildeo de 02 e 07 respectivamente (Hampton et al 1985
Rocha et al 1997) enquanto no presente estudo variou entre 021 a 029 Meseguer
et al (1994) observaram macroacutefagos livres abundantes no parecircnquima do fiacutegado
sugerindo que estes se movem livremente dentro do parecircnquima formando os
agregados macrofaacutegicos quando haacute um aumento na atividade fagociacutetica como resposta
imune a lesotildees em indiviacuteduos expostos a contaminantes Entretanto no presente estudo
natildeo foram observadas estas caracteriacutesticas
Ainda vale ressaltar que esse toacutexico potencializa sua accedilatildeo em temperaturas mais
elevadas como aquelas observadas no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo
Estudando o efeito dos ciclodienos Correa et al (2001) Coutinho et al (2005) e
Capkin et al (2006) relataram que as alteraccedilotildees satildeo diretamente proporcionais agrave
50
temperatura da aacutegua ou seja quanto mais alta a temperatura mais toacutexicos os produtos
se tornam O experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
56microgL-1 registrou temperatura meacutedia da aacutegua em 269ordmC superior aos demais
experimentos Devido a isso uma resposta comum na intoxicaccedilatildeo em fiacutegados de peixes
eacute a diminuiccedilatildeo das reservas de glicogecircnio hepaacutetico (Seinen et al 1981 Ferguson 1989
Cyrino et al 2000) e iacutendice hepatossomaacutetico (Wester et al 1987 Wester et al 1988
Wester et al 2003 Glover et al 2007) evidenciada no presente estudo
No presente estudo percebeu-se que a accedilatildeo do Thiodanreg em concentraccedilotildees
subletais natildeo afetou o fiacutegado como um todo mas na forma de focos no parecircnquima
hepaacutetico nos diferentes experimentos Este tipo de lesatildeo pode estar associado agrave
concentraccedilatildeo do toacutexico utilizado tempo de exposiccedilatildeo e a via de contaminaccedilatildeo A
ventilaccedilatildeo branquial acelerada e a natildeo procura por alimentos nas primeiras 24 horas
observadas nos diferentes experimentos sugere que a entrada de aacutegua pela via branquial
foi a causa mais direta da absorccedilatildeo e difusatildeo do toacutexico para corrente sanguiacutenea ateacute
chegar ao fiacutegado No entanto a via epideacutermica tambeacutem poder ser considerada via de
entrada do toacutexico para os tecidos (Mckim et al 1999)
As alteraccedilotildees observadas nos fiacutegados podem afetar diretamente o metabolismo
das fecircmeas causando diminuiccedilatildeo da capacidade fisica e tornar os peixes uma presa faacutecil
para seus predadores Neste sentido os peixes poderatildeo ter menor sucesso reprodutivo e
se tornarem menos competitivos pelo alimento Do ponto de vista ecoloacutegico isso pode
acarretar alteraccedilotildees na populaccedilatildeo e na cadeia alimentar (Rodrigues amp Fanta 1998)
Nas condiccedilotildees que o estudo foi realizado como as concentraccedilotildees do inseticida
Thiodanreg que foram utilizadas o periacuteodo de exposiccedilatildeo e a espeacutecie de estudo conclui-se
que as fecircmeas podem estar em um processo inicial de intoxicaccedilatildeo um processo
patoloacutegico de recuperaccedilatildeo reversiacutevel
51
Figura 1 A Organizaccedilatildeo histoloacutegica do tecido hepaacutetico normal de A bimaculatus B Infiltrado leucocitaacuterio (IL) no tecido hepaacutetico de A bimaculatus C Hepatoacutecito com vesiacutecula clara (Vc) envolvida por glicogecircnio (G) marcado positivamente pela reaccedilatildeo de PAS e nuacutecleo (seta) deslocado na periferia da ceacutelula no experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo 56microgL-1 D Hepatoacutecito com ausecircncia de glicogecircnio evidenciada pela reaccedilatildeo negativa de PAS no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo 56microgL-1 Alteraccedilotildees de estaacutedio I - E Hepatoacutecito com nuacutecleo (seta) na perifieria F Atrofia nuclear (an) G Deformaccedilatildeo nuclear (dn) Nuacutecleo (N) e citoplasma (C) do hepatoacutecito sinusoacuteide (S) capilar (P) com hemaacutecias no interior acuacutemulo de glicogecircnio (G) no citoplasma e macroacutefagos (M) Barras A (30) B (65 microm) C e D (20 microm) E F e G (28 microm) Coloraccedilatildeo Azul de toluiacutedina em A-B e E-G e PAS em C e D
G S G
N
C
M
M
an
F E
Vc
IL G
B
C
A
D
G
dn
N
C
G
52
Dn
A
E
B
F
Figura 2 Alteraccedilotildees histoloacutegicas do tecido hepaacutetico de A bimaculatus Alteraccedilotildees de estaacutedio I-A Hipertrofia celular (seta) B Hipertrofia nuclear (seta) Alteraccedilotildees de estaacutedio II - C Degeneraccedilatildeo nuclear (Dn) D Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica (Dc) E Hiperemia () F Presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos (setas) Barras A B e E (30 microm) C D e F (25 microm) Coloraccedilatildeo Azul de toluiacutedina
C
A
Dc
D
53
Tabela 2 Valores meacutedios das temperaturas durante a realizaccedilatildeo dos experimentos
Tratamento Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Experimento 4 Controle 268plusmn105 254plusmn049 248plusmn069 250plusmn049
115mgL-1 271plusmn104 256plusmn059 247plusmn045 245plusmn040 23mgL-1 269plusmn117 255plusmn048 244plusmn062 247plusmn043 56mgL-1 269plusmn118 254plusmn048 244plusmn063 247plusmn038
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Legenda Experimento 1 - sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo Experimento 2 - sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo Experimento 3 - com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo Experimento 4 ndash com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
Tabela 3 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquantitativa das alteraccedilotildees
histoloacutegicas (VMA) em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 130 plusmn 020a 210 plusmn 030b 215 plusmn 019b 216 plusmn 011b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 130 plusmn 012a 190 plusmn 020b 190 plusmn 008aᵇ 228 plusmn 056b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 125 plusmn 012a 210 plusmn 021b 206 plusmn 017b 218 plusmn 027b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 130 plusmn 014a 200 plusmn 025b 221 plusmn 035b 228 plusmn 021b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 4 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquantitativa dos iacutendices das
alteraccedilotildees histoloacutegicas (IAH) em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 883plusmn1034a 1850plusmn1009aᵇ 2883plusmn832b 2566plusmn550aᵇ
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 433plusmn557a 2883plusmn 810b 2780plusmn1388b 2766plusmn571b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 566plusmn 585a 2600plusmn773b 2550plusmn1078b 2733plusmn920b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 750plusmn512a 2217plusmn780b 2033plusmn875b 2366plusmn880b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Duncan
54
Tabela 5 Diacircmetro meacutedio (microm) de nuacutecleos de hepatoacutecitos em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 461 plusmn 040aᶜ 498 plusmn 020b 487 plusmn 028b 439 plusmn 027c
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 516 plusmn 071a 501plusmn 040a 502 plusmn 020a 515plusmn025a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 494 plusmn 019a 496 plusmn 036a 492 plusmn 082a 508 plusmn 033a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 561 plusmn 044aᶜ 524 plusmn 040b ᶜ 509 plusmn 028b 533 plusmn 019c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 6 Diacircmetro meacutedio (microm) de citoplasmas de hepatoacutecitos de fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 885 plusmn 099a 1022 plusmn 109b 974 plusmn 080b 1005plusmn129b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1084 plusmn 136a 987 plusmn 153b 975 plusmn 081b 931 plusmn 080b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 960 plusmn 095a 1022 plusmn 094b 1003plusmn120aᵇ 1033 plusmn 108b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1086plusmn130aᵇ 104 plusmn 135b ᶜ 1022 plusmn 138c 1022 plusmn 106c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 7 Quantificaccedilatildeo meacutedia de nuacutecleos de hepatoacutecitos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 2553 plusmn 494a 298 plusmn 464b 284 plusmn 459b 291 plusmn 374b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 2371 plusmn 490a 289 plusmn 541b 289 plusmn 545b 290 plusmn 514b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 2560 plusmn 538a 294 plusmn 480b 286 plusmn 555b 293 plusmn 552b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 2770 plusmn 594a 314 plusmn 1028b 347 plusmn 664b ᶜ 322 plusmn 654c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
55
Tabela 8 Quantificaccedilatildeo meacutedia de citoplasmas no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 39551 plusmn 1056a 39666 plusmn 877a 39360 plusmn 1526a 40080 plusmn 727a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 39996 plusmn 1307a 39830 plusmn 722a 39618 plusmn 1143ab 38865 plusmn 1954b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 39603 plusmn 1755a 39011 plusmn 1620b 39445 plusmn 1388aᵇ 39205 plusmn 2212aᵇ
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 39381 plusmn 3025a 38555 plusmn 2723b 39036 plusmn 2275aᵇ 39136 plusmn 1892b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Tabela 9 Quantificaccedilatildeo meacutedia de macroacutefagos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2
de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 120 plusmn 113a 125 plusmn 089a 101 plusmn 100a 106 plusmn 094a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 101 plusmn 101a 124 plusmn 079a 102 plusmn 084a 131 plusmn 092a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 098 plusmn 089a 128 plusmn 097a 115 plusmn 095a 096 plusmn 090a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 101 plusmn 094a 128 plusmn 109a 086 plusmn 079a 101 plusmn 079a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Tabela 10 Quantificaccedilatildeo meacutedia de vasos sanguiacuteneos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 1875 plusmn 239a 133 plusmn 346a 1796 plusmn 1210a 1103 plusmn 465a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1603 plusmn 784aᵇ 1260 plusmn 532a 1409 plusmn 631aᵇ 2203 plusmn 685b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 1830 plusmn 579a 2036 plusmn 773a 1681 plusmn 560a 1865 plusmn 964a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1850 plusmn 1400a 1831 plusmn 1326a 1510 plusmn 774a 1645 plusmn 739a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
56
Tabela 11 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquatitativa de glicogecircnio nos hepatoacutecitos de fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 133 plusmn 051aᵇ 266 plusmn 081a 300 plusmn 000a 010plusmn 010b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 133 plusmn 051a 180 plusmn 109a 200 plusmn 109a 233 plusmn 103a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 216 plusmn 098a 116 plusmn 040a 216 plusmn 098a 233 plusmn 103a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 266 plusmn 081a 233 plusmn 103a 233 plusmn 103a 216 plusmn 098a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis Tabela 12 Iacutendice hepatossomaacutetico de fecircmeas de lambaris A bimaculatus nos grupos
controles e grupos expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 070 plusmn 014aᵇ 088 plusmn 03a 084 plusmn 038a 038 plusmn 031b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 113 plusmn 054a 104 plusmn 061a 102 plusmn 050a 102 plusmn 051a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 066 plusmn 029a 073 plusmn 020a 092 plusmn 017a 091 plusmn 012a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 074 plusmn 034a 072 plusmn 029a 094 plusmn 040a 063 plusmn 018a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Duncan
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52 CAPIacuteTULO 2
EFEITOS DO INSETICIDA THIODAN reg SOBRE A MORFOLOGIA DO
DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM LAMBARIS Astyanax bimaculatus
RESUMO
O Thiodanreg eacute um toacutexico que pode causar alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos tecidos de peixes
expostos dependendo da concentraccedilatildeo A fim de investigar possiacuteveis alteraccedilotildees este
estudo avaliou a morfologia ovariana de lambaris Astyanax bimaculatus expostos ao
Thiodanreg (endosulfan 350gL) por 96 horas em quatro diferentes experimentos com trecircs
concentraccedilotildees subletais 115 23 e 56 microgL As fecircmeas expostas ao Thiodanreg foram
divididas em quatro experimentos sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem
aclimataccedilatildeo e alimentados com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e com
aclimataccedilatildeo de 10 dias e alimentados No presente estudo percebeu-se que a accedilatildeo do
Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou a morfologia do desenvolvimento
folicular Poreacutem os experimentos com aclimataccedilatildeo demonstraram quantidades
inferiores de foliacuteculos primaacuterios e secundaacuterios quando comparados aos peixes dos
experimentos sem aclimataccedilatildeo Houve maior quantidade de foliacuteculos atreacutesicos nos
grupos expostos ao Thiodanreg em relaccedilatildeo ao grupo controle O diacircmetro folicular nos
foliacuteculos secundaacuterios dos peixes expostos ao Thiodanreg no experimento com
adaptaccedilatildeocom alimentaccedilatildeo foi maior em relaccedilatildeo ao grupo controle Aleacutem disso as
meacutedias dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS) e hepatossomaacutetico (IHS) dos experimentos
com aclimataccedilatildeo foram inferiores aos experimentos sem aclimataccedilatildeo Esses dados
sugerem que o eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-ovaacuterio pode estar sendo afetado pelo ambiente
ao qual o peixe foi submetido podendo causar comprometimento na fisiologia do
desenvolvimento folicular
Palavras-chave histopatologia ovaacuterio peixe contaminaccedilatildeo aquaacutetica
63
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 α-endosulfan e 30 β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo
por meio da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em riscos os organismos que ali
residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al 2007)
Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos como jaacute
observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis niloticus
No entanto a Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan em
gordura valores de 005mgkg-1 (EPA 2002) e para aacutegua doce 022microgL-1 (EPA 1980)
A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em consideraccedilatildeo a
qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente Resoluccedilatildeo
CONAMA - nordm 3572005 estabelece o valor limite de 0056gL de resiacuteduo do referido
inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
Muitos inseticidas apresentam baixa toxicidade antes de serem transformados
em substacircncias toacutexicas metabolicamente ativas O sulfato de endosulfan eacute um dos
produtos derivados do metabolismo do endosulfan sendo considerado o principal
metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica por ser mais estaacutevel no meio
ambiente do que em sua foacutermula original (Ali et al 1984) A sensibilidade ao
endosulfan em organismos aquaacuteticos tem sido descrita na literatura (Capkin et al 2006
Ballesteros et al 2007 Pereira et al 2012) O produto eacute extremamente toacutexico para os
peixes e outros organismos aquaacuteticos mesmo em concentraccedilotildees muito pequenas
(Cengiz et al 2001) como verificado tambeacutem por Ballesteros et al (2007) com peixes
adultos da espeacutecie Jenynsia multidentata sob o efeito do endosulfan por 96 horas
utilizando concentraccedilotildees de 072 μgL e 131 μgL em machos e fecircmeas
respectivamente
Em peixes o desenvolvimento folicular tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Begovac amp Wallace 1988 Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter
1996 Grier 2000 2002 e 2007) e como nos animais em geral compreende os periacuteodos
preacute-meioacutetico perinucleolar vitelogecircnico e maturaccedilatildeo final Estas fases ocorrem no
64
interior de foliacuteculos cuja parede eacute constituiacuteda por zona radiata camada folicular
membrana basal e teca (Grier 2000) e que desempenham importante papel durante a
ovogecircnese e fertilizaccedilatildeo Quando a qualidade da aacutegua eacute alterada devido a xenobioacuteticos
a gametogecircnese pode ser alterada comprometendo a fertilizaccedilatildeo e a qualidade do ovo
(Chatterjee et al 1997) Assim os peixes quando expostos a inseticidas podem
apresentar alteraccedilotildees morfoloacutegicas significativas no ovaacuterio
Alguns trabalhos mostram diversas alteraccedilotildees provocadas nos foliacuteculos por
contaminantes como por exemplo retraccedilatildeo citoplasmaacutetica degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica
adesatildeo folicular aparecimento de foliacuteculos anucleados necrose e alteraccedilatildeo no diacircmetro
dos foliacuteculos (Hazarika amp Das 1998 Dutta et al 2003 Maxwell amp Dutta 2005) Aleacutem
disso pode ocorrer a atresia folicular que eacute um processo frequentemente observado nos
ovaacuterios dos vertebrados (Saidapur 1978) sendo causada por diversos fatores como
agrotoacutexicos temperatura luz alimentaccedilatildeo inadequada e confinamento (Nagahama
1983 Guraya 1986) Outro fator importante eacute a concentraccedilatildeo hormonal que pode
interferir na siacutentese de vitelogenina e causar efeitos negativos associados com a
quantidade de foliacuteculos preacute-vitelogecircnicos e vitelogecircnicos durante o desenvolvimento
folicular (Chatterjee et al 1997) No entanto alteraccedilotildees no estado de sauacutede provocadas
por concentraccedilotildees de contaminamtes que natildeo matam os peixes em curto prazo e que
podem ser consideradas seguras podem sugerir consequecircncias na reproduccedilatildeo e
interferecircncia na cadeia alimentar Esse tipo de estudo eacute de grande importacircncia para se
avaliar impactos provocados por diferentes tratamentos sobre o desenvolvimento de
foliacuteculos que poderiam interferir na reproduccedilatildeo de peixes
O lambari Astyanax bimaculatus foi escolhido como organismo experimental
pois eacute representativo no ecossistema sendo encontrado desde Nordeste brasileiro ateacute a
bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Eacute um peixe de pequeno porte e
de faacutecil manutenccedilatildeo em laboratoacuterio
Este estudo teve como objetivo analisar as alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos
diferentes estaacutedios do desenvolvimento folicular em ensaios subletais com o toacutexico
Thiodanreg
65
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste subletal e as atividades de coleta As etapas
de fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos ovaacuterios microtomia coloraccedilatildeo de lacircminas
histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e morfomeacutetricas foram realizadas nos
Laboratoacuterios de Biologia de Peixes e de Histopatologia do Departamento de Veterinaacuteria
da UFV
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos animais em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado e poro genital
dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV e
mantidos em aquaacuterios com capacidade de 50 litros numa densidade de 05g de peixe por
litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro temperatura controlada e monitoramento
duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e
aeraccedilatildeo continua de aacutegua para garantir o bem-estar dos peixes Os peixes foram
alimentados com raccedilatildeo comercial Purina contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia
de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
66
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste de toxicidade subletal em sistema estaacutetico
O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi realizado utilizando-se 120
lambaris tendo por base as normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico (NBR 15088
- ABNT 2007)
As fecircmeas foram expostas ao Thiodanreg (endosulfan 350gL) por 96 horas em
quatro diferentes experimentos sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem aclimataccedilatildeo e
com alimentaccedilatildeo com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e com aclimataccedilatildeo de
10 dias e com alimentaccedilatildeo Foram utilizadas trecircs concentraccedilotildees do Thiodanreg inferiores
agrave CL50 preacute-determinada (137microgL) em laboratoacuterio de acordo com a NBR 15088
(ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas em cada experimento foram de 115 23 e
56microgL-1 aleacutem de um grupo controle sem toacutexico com trecircs repeticcedilotildees nas mesmas
condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
24 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas
Apoacutes 96 horas de experimento foram coletados 96 peixes sendo seis animais de
cada grupo nos diferentes experimentos Os ovaacuterios foram coletados apoacutes os peixes
terem sido anestesiados com benzocaiacutena (110000) e eutanasiados pela secccedilatildeo
transversal da coluna vertebral na regiatildeo do opeacuterculo
Para a histologia os ovaacuterios foram fixados em paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo
fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedos em resina glicolmetacrilato (Leica
Historesin) Em seguida secccedilotildees 3microm de espessura foram coradas utilizando
hematoxilinaeosina para anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas As lacircminas foram
montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e
as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
Para os estudos morfoloacutegicos foram analisadas lacircminas de seis animais por
concentraccedilatildeo As secccedilotildees histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo em busca
de alteraccedilotildees morfoloacutegicas foliculares (Tabela 1) que pudessem ser representativas da
67
accedilatildeo do Thiodanreg no tecido ovariano sempre comparando estas alteraccedilotildees com o
padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios das lacircminas dos grupos controles
Para a avaliaccedilatildeo morfomeacutetrica foram realizadas contagens dos diferentes
estaacutedios de desenvolvimento folicular Para isto foram fotografados ao acaso 10
campos com objetiva de 10X (cada campo com 5094 microm de largura por 6812 microm de
comprimento totalizando uma aacuterea de 347 mmsup2) As contagens foram realizadas em 10
campos escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro experimentos Aleacutem disso foi
realizada a contagem de foliacuteculos atreacutesicos e observados eosinoacutefilos associados aos
foliacuteculos vitelogecircnicos utilizando o microscoacutepio com objetiva de 40X em 10 foliacuteculos
escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro tratamentos experimentais Tambeacutem
foram realizadas mediccedilotildees de diacircmetros em 10 foliacuteculos vitelogecircnicos para cada animal
Foram escolhidos foliacuteculos o mais esfeacutericos possiacutevel com corte passando pelo nuacutecleo
Estas medidas foram obtidas por meio do programa Image-Pro Plus traccedilando-se duas
linhas perpendiculares sobre nuacutecleo e respeitando-se os limites do foliacuteculo Em todas as
contagens e mediccedilotildees foram calculados os valores meacutedios e desvios-padratildeo para cada
concentraccedilatildeo para se avaliar o desenvolvimento folicular nos diferentes experimentos
Tabela 1 Alteraccedilotildees histoloacutegicas quanto ao comprometimento do desenvolvimento folicular (adaptado de Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS FOLICULARES Alteraccedilatildeo nos foliacuteculos Descolamento do revestimento folicular Retraccedilatildeo citoplasmaacutetica Retraccedilatildeo nuclear Atresia folicular Aglutinaccedilatildeo nucleoplasmaacutetica Aglutinaccedilatildeo citoplasmaacutetica Aglutinaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo Foliacuteculos com ausecircncia de citoplasma e nuacutecleo Granuloacutecitos envolvendo foliculos
25 Paracircmetros biomeacutetricos
Foram registrados para cada exemplar os seguintes dados biomeacutetricos peso
corporal (PC em g) peso dos ovaacuterios (PO em g) e peso do fiacutegado (PF em g) Os
valores meacutedios e os desvios padratildeo dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS=POx100PC) e
68
hepatossomaacutetico (IHS=PFx100PC) foram calculados para cada animal em cada um
dos grupos nos diferentes experimentos
26 Anaacutelises estatiacutesticas
Os dados foram apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo e avaliados pelo
Software Statistica 70 por meio da anaacutelise de variacircncia (ANOVA) Apoacutes o teste de
distribuiccedilatildeo normal os dados foram comparados entres os grupos controle e grupos
expostos ao Thiodanreg usando anaacutelise de variacircncia one-way seguida do teste de Tukey
ou Duncan Quando os dados natildeo apresentaram uma distribuiccedilatildeo normal foi utilizado o
teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis Plt005 foi utilizado como criteacuterio de
significacircncia
3 RESULTADOS
31 Desenvolvimento folicular
O desenvolvimento folicular de A bimaculatus do presente estudo foi dividido em
duas etapas desenvolvimento primaacuterio e desenvolvimento secundaacuterio
Para facilitar a compreensatildeo o desenvolvimento primaacuterio em A bimaculatus foi
subdividido em dois estaacutedios desenvolvimento primaacuterio inicial e desenvolvimento
primaacuterio avanccedilado (Figuras 1 A e B) No desenvolvimento primaacuterio inicial os foliacuteculos
apresentaram citoplasma fortemente basoacutefilo nuacutecleo esfeacuterico um ou mais nucleacuteolos
dispersos pelo nucleoplasma e estavam envoltos por ceacutelulas foliculares pavimentosas
(Figura 1 A) Durante o desenvolvimento primaacuterio avanccedilado o citoplasma do foliacuteculo
torna-se menos basoacutefilo que a etapa anterior o nuacutecleo eacute esfeacuterico um ou mais nucleacuteolos
dispersos que estatildeo associados ao envoltoacuterio nuclear (Figura 1 B) A camada de ceacutelulas
foliculares eacute pavimentosa com o nuacutecleo alongado Entre as ceacutelulas foliculares e o
citoplasma do foliacuteculo aparece a zona radiata como uma fina camada (Figura 1 B) Na
regiatildeo mais externa do foliacuteculo aparecem associadas ao mesmo as ceacutelulas da teca
O desenvolvimento secundaacuterio em A bimaculatus foi subdividido em trecircs
estaacutedios desenvolvimento secundaacuterio inicial desenvolvimento intermediaacuterio e
desenvolvimento avanccedilado No desenvolvimento secundaacuterio inicial o volume
citoplasmaacutetico aumentou mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo e o foliacuteculo neste estaacutedio
apresentou um diacircmetro maior que o estaacutedio anterior O nuacutecleo eacute central ligeiramente
acidoacutefilo com nucleacuteolos pequenos e dispersos pelo nucleoplasma O citoplasma eacute
69
granular e fracamente basoacutefilo com a presenccedila de vesiacuteculas corticais pequenas e claras
na periferia do citoplasma (Figura 1 C) Em seguida ocorre um aumento no diacircmetro do
foliacuteculo e inicia-se a deposiccedilatildeo de vitelo a partir da regiatildeo perifeacuterica o que permitiu
classificar esse estaacutedio como desenvolvimento secundaacuterio intermediaacuterio (Figura 1 D)
No estaacutedio de desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado o volume citoplasmaacutetico
aumentou mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo tendo o foliacuteculo neste estaacutedio um diacircmetro maior
quando comparado aos estaacutedios anteriores Nessa etapa do desenvolvimento o
citoplasma do foliacuteculo estaacute preenchido com gloacutebulos de vitelo (Figura 1 D) A
maturaccedilatildeo final eacute caracterizada pela formaccedilatildeo do aparelho micropilar zona radiata
espessa e nuacutecleo deslocado em direccedilatildeo ao aparelho micropilar
Os foliacuteculos ovarianos dos lambaris apresentaram morfologia normal nas
diferentes concentraccedilotildees de Thiodanreg (Figuras 1 A-D)
32 Atresia folicular
A atresia folicular foi caracterizada em trecircs diferentes etapas nos ovaacuterios de A
bimaculatus atresia inicial intermediaacuteria e avanccedilada A atresia folicular inicial eacute
caracterizada pela descontinuidade da zona radiata e hipertrofia das ceacutelulas foliculares
(Figura 2 A) Nesse momento da atresia folicular foram evidenciadas ceacutelulas do tipo
granuloacutecito entre a membrana basal e ceacutelulas da teca na maioria dos foliacuteculos
observados (Figura 2 B) Na sequecircncia do processo atresia folicular intermediaacuteria
ocorre o iniacutecio da fusatildeo e liquefaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo desintegraccedilatildeo e
fragmentaccedilatildeo da zona radiata hipertrofia das ceacutelulas foliculares que se tornam
vacuolizadas e contecircm material granular de aspecto similar aos gloacutebulos de vitelo e
invasatildeo do citoplasma pelas ceacutelulas foliculares (Figura 2 C) Na atresia avanccedilada as
ceacutelulas foliculares absorvem os resiacuteduos finais do foliacuteculo levando a uma diminuiccedilatildeo
do tamanho do foliacuteculo atreacutesico (Figura 2 D)
33 Quantificaccedilatildeo dos foliacuteculos ovarianos
A quantidade de foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio inicial entre as fecircmeas
do mesmo experimento natildeo mostrou diferenccedilas entre si (Pgt005) (Figura 3) Quando
foram comparados os diferentes experimentos nos mesmos grupos foi registrada maior
quantidade de foliacuteculos primaacuterios iniciais nas fecircmeas do grupo controle do experimento
com aclimataccedilatildeoalimentaccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo agraves fecircmeas dos grupos controle dos
70
experimentos sem aclimataccedilatildeo (Figura 3) Aleacutem disso foi observada maior quantidade
de foliacuteculos primaacuterios iniciais na concentraccedilatildeo de 23microgL do experimento com
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo em relaccedilatildeo ao experimento sem aclimataccedilatildeocom
alimentaccedilatildeo (Plt005) (Figura 3)
Na contagem de foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado entre fecircmeas
do mesmo experimento natildeo houve diferenccedilas nas meacutedias obtidas (Figura 4) No entanto
quando comparados os mesmos grupos entre os diferentes experimentos verificou-se
que no estaacutedio de desenvolvimento primaacuterio avanccedilado houve maior quantidade de
foliacuteculos no grupo controle do experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Plt005)
em relaccedilatildeo ao experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo assim como no
experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Figura 4) Quando comparados os
grupos da concentraccedilatildeo 115microgL registrou-se maior quantidade de foliacuteculos no
experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo ao experimento
sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Figura 4) Entre as fecircmeas dos grupos da
concentraccedilatildeo 23microgL foi registrada maior quantidade de foliacuteculos nos experimentos
com aclimataccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo agraves fecircmeas dos experimentos sem aclimataccedilatildeo
(Figura 4)
Na contagem de foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio inicial nas fecircmeas do
experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo houve maior quantidade de foliacuteculos na
concentraccedilatildeo 56microgL (Plt005) em relaccedilatildeo agrave concentraccedilatildeo de 115microgL (Figura 5) mas
natildeo com o controle Ao comparar as fecircmeas dos diferentes experimentos dos mesmos
grupos houve maior quantidade de foliacuteculos secundaacuterios iniciais (Plt005) na
concentraccedilatildeo 115microgL do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e
experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo em relaccedilatildeo ao experimento sem
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Figura
5)
Em relaccedilatildeo as contagens de foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio
intermediaacuterio e avanccedilado natildeo houve diferenccedilas entre as fecircmeas (Pgt005) (Figuras 6 e 7)
34 Quantificaccedilatildeo dos foliacuteculos atreacutesicos
Nas contagens de foliacuteculos atreacutesicos iniciais nas fecircmeas de A bimaculatus dos
diferentes experimentos natildeo foram constatadas diferenccedilas (Pgt005) (Figura 8) As
contagens de atresia total representaram as somas das contagens de atresias inicial
intermediaacuteria e avanccedilada As contagens de atresia total natildeo mostraram diferenccedilas nos
71
experimentos embora o nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos mostrasse tendecircncia crescente
nos grupos tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos (Figura 9) Entretanto
foi observado maior nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos nas fecircmeas dos experimentos com
aclimataccedilatildeo de 10 dias em relaccedilatildeo aos experimentos sem aclimataccedilatildeo (Figura 9)
35 Diacircmetro dos foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado
Os valores meacutedios nos diacircmetros dos foliacuteculos secundaacuterio avanccedilado nas fecircmeas
do experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo demonstraram aumento (Plt005) nas
concentraccedilotildees 115microgL (57837plusmn5977microm) e 56microgL (57311plusmn6178microm) de Thiodanreg
em relaccedilatildeo agraves fecircmeas do grupo controle (51606plusmn5757 microm) Nos demais experimentos
natildeo foram registradas diferenccedilas entre os foliacuteculos (Pgt005) apesar de ter sido
observado na maioria dos grupos essa mesma tendecircncia de aumento do diacircmetro dos
foliacuteculos (Tabela 2)
36 Paracircmetros biomeacutetricos
As fecircmeas de A bimaculatus dos grupos expostos ao Thiodanreg natildeo apresentaram
diferenccedilas (Pgt005) nos valores dos IGS e IHS quando comparados com os grupos
controles (Tabelas 3 e 4) No entanto as fecircmeas dos experimentos com aclimataccedilatildeo
apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores dos IGS e IHS quando comparados aos
experimentos sem aclimataccedilatildeo (Tabelas 3 e 4)
4 DISCUSSAtildeO
Em peixes teleoacutesteos o tipo de desenvolvimento folicular pode ser assincrocircnico
com a presenccedila de foliacuteculos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento (Nagahama
1983 Connaughton et al 1998 Selman et al 1986) assim como na presente espeacutecie
deste estudo Os ovaacuterios das fecircmeas de A bimaculatus submetidas ao efeito do
Thiodanreg apresentaram foliacuteculos ovarianos em diferentes fases de desenvolvimento com
variaccedilotildees na estrutura do foliacuteculo como diacircmetro caracteriacutesticas do nuacutecleo camadas
envoltoacuterias composiccedilatildeo e distribuiccedilatildeo do vitelo conforme observado em outras
espeacutecies do gecircnero (Miranda 1996 Miranda et al 1999 Melo et al 2005 Mazzoni et
al 2005 Rodrigues et al 2005 Hernan Da Cuntildea et al 2011)
Ao contraacuterio do presente estudo Dutta et al (2008) ao submeterem as fecircmeas da
espeacutecie Lepomis macrochirus a trecircs concentraccedilotildees diferentes (025 075 e 1 microgL) de
endosulfan observaram comprometimento do desenvolvimento folicular com retraccedilatildeo
72
nuclear e citoplasmaacutetica na menor concentraccedilatildeo enquanto nos foliacuteculos em maturaccedilatildeo
avanccedilada foi observado um aspecto vazio sem conteuacutedo citoplasmaacutetico na
concentraccedilatildeo de 075 microgL Aleacutem disso na concentraccedilatildeo de 1microgL os autores
encontraram maior grau de deformaccedilotildees com foliacuteculos vazios sem a presenccedila de
foliacuteculos ou alteraccedilotildees do nuacutecleo e perda do material nuclear que eacute relatado como
necrose nuclear No trabalho conduzido por Chartterjee et al (1997) foi avaliada a accedilatildeo
do carbofuram no desenvolvimento folicular na espeacutecie Heteropneustes fossilis
encontrando-se degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica e na camada folicular de foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio Entretanto Hernan Da Cuntildea et al (2011) natildeo
observaram alteraccedilotildees nos ovaacuterios em peixes expostos ao endosulfan No estudo
realizado por Ballesteros et al (2007) utilizando peixes machos e fecircmeas da espeacutecie
Jenynsia multidentata foi verificado que o maior teor de lipiacutedeos nas fecircmeas eacute um fator
importante para esclarecer a maior resistecircncia contra o endosulfan ao contraacuterio dos
machos que satildeo mais suceptiacuteveis neste caso De acordo com este resultado descrito na
literatura pode-se inferir que este fator poder ter interferido na maior resistecircncia das
fecircmeas de A bimaculatus em periacuteodo reprodutivo agraves concentraccedilotildees de Thiodanreg
testadas
Alguns estudos tecircm esclarecido a interferecircncia de poluentes na quantidade de
foliacuteculos nos diferentes estaacutedios do desenvolvimento folicular em peixes Os trabalhos
de Chartterjee et al (1997) Jensen et al (2004) Dutta amp Dalal (2008) e Chakrabarty et
al (2012) avaliaram os efeitos de pesticidas encontrando maior quantidade de foliacuteculos
primaacuterios no grupo tratado em relaccedilatildeo ao grupo controle assim como em peixes
mantidos em cativeiros (Honji et al 2009) Em outro estudo (Chatterjee et al 2001) os
pesquisadores encontraram por meio de anaacutelises histoloacutegicas da hipoacutefise a
possibilidade do carbofuran afetar as ceacutelulas produtoras de GnRH do hipotaacutelamo
prejudicando o eixo hipoacutefise-gocircnada e comprometendo a viabilidade no
desenvolvimento folicular jaacute Chakrabarty et al (2012) verificaram em peixes tratados
com endosulfan concentraccedilatildeo inferior de GnRH e superior da aromatase quando
comparados com o gurupo controle caracterizando que o endosulfan pode atuar como
disruptor endoacutecrino (Lemaire et al 2006) que pode aumentar a biossiacutentese do estradiol
para promover um raacutepido desenvolvimento folicular (Chakrabarty et al 2012) Estes
resultados podem ajudar a esclarecer os resultados do presente trabalho onde se
observou maior quantidade de foliacuteculos primaacuterios iniciais e primaacuterios avanccedilados nos
experimentos com aclimataccedilatildeo quando comparados com os experimentos sem
73
aclimataccedilatildeo sugerindo uma possiacutevel desregulaccedilatildeo endoacutecrina no eixo hipoacutefise-gocircnada
nos peixes aclimatados em aquaacuterios por 10 dias Aleacutem disso as concetraccedilotildees hormonais
e enzimaacuteticas relacionadas ao desenvolvimento folicular podem estar supostamente
alteradas em A bimaculatus mas satildeo necessaacuterios estudos fisioloacutegicos para essa
provaacutevel confirmaccedilatildeo
O processo de atresia folicular no lambari A bimaculatus foi semelhante ao
descrito por Miranda et al (1999) Munoz et al (2002) Melo et al (2005) e Santos et
al (2005) O processo da atresia que ocorre nos foliacuteculos secundaacuterios eacute do tipo
hipertroacutefico devido agrave hipertrofia e hiperplasia das ceacutelulas foliculares (Vizziano amp
Berois 1990) No trabalho realizado por Coward amp Bromage (1998) na espeacutecie Tilapia
zilli foi verificado aumento de foliacuteculos atreacutesicos em experimento com duraccedilatildeo entre 18
e 26 dias assim como verificado no trabalho de Jensen et al (2004) quando utilizaram a
substacircncia flutamida De acordo com estes autores isto pode reduzir a fecundidade e
tambeacutem influenciar na qualidade do foliacuteculo Linares-Casenave et al (2002) explicam
que o processo de atresia estaacute associado com desregulaccedilatildeo das concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de estradiol testosterona e vitelogenina Portanto o aumento da quantidade
dos foliacuteculos atreacutesicos nos grupos expostos ao Thiodanreg e a maior quantidade de atresia
nos experimentos com aclimataccedilatildeo mesmo natildeo apresentando diferenccedilas estatiacutesticas
sugerem que pode estar iniciando desregulaccedilatildeo hormonal nestes peixes
A presenccedila de granuloacutecitos associados aos foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados em
lambari A bimaculatus nos diferentes experimentos pode ser associada agrave reaccedilatildeo
imunoloacutegica em conjunto com as ceacutelulas foliculares assim como observado por alguns
autores (Drummond et al 2000 Santos et al 2005 Santos et al 2008) Aleacutem disso no
trabalho realizado por Santos et al (2008) foi detectada a presenccedila de proliferaccedilatildeo
celular (PCNA) nas ceacutelulas da teca de foliacuteculos em processo de atresia confirmando
que estas ceacutelulas podem estar se preparando para o processo de remodelaccedilatildeo ovariana
No entanto essas evidecircncias de granuloacutecitos associados aos foliacuteculos estatildeo de acordo
com o que jaacute foi observado em outros trabalhos caracterizando um processo fisioloacutegico
importante na regressatildeo folicular das fecircmeas de A bimaculatus expostas ao Thiodanreg
O diacircmetro dos foliacuteculos vitelogecircnicos eacute espeacutecie-especiacutefico poreacutem o Thiodanreg
alterou o diacircmetro folicular no experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo Esta
alteraccedilatildeo do diacircmetro que leva os foliacuteculos vitelogecircnicos a atingirem a maturaccedilatildeo pode
ser causada pelas diferenccedilas nas concentraccedilotildees de vitelogenina estradiol e aromatase
(Jensen et al 2004 Corriero et al 2007 Chakrabarty et al 2012) ou a mesma sendo
74
ligada aos receptores especiacuteficos nos foliacuteculos (Patintildeo amp Sullivan 2002 Bugel et al
2010) Bugel et al (2010) relataram a diminuiccedilatildeo da expressatildeo da vitelogenina no peixe
Fundulus heteroclitus em rio contaminado com pesticidas orgacircnicos persistentes o que
resultou na diminuiccedilatildeo da quantidade de foliacuteculos vitelogecircnicos enquanto Honji et al
(2009) relataram a baixa fecundidade e aumento do diacircmetro dos foliacuteculos nos peixes
Salminus hilari mantidos em cativeiro quando comparados com peixes de ambientes
naturais Contudo eacute necessaacuterio estudar as vias que conduzem a esta alteraccedilatildeo Estes
resultados mostram que diferentes vias podem afetar a reproduccedilatildeo dos peixes e que o
Thiodanreg pode estar agindo como desregulador endoacutecrino nos foliacuteculos secundaacuterios
avanccedilados de A bimaculatus
O IGS e IHS podem variar entre os peixes devido agraves diferenccedilas na sensibilidade
frente agrave exposiccedilatildeo a contaminantes periacuteodo reprodutivo e peixes mantidos em cativeiro
(Chatterjee et al 1997 Cyrino et al 2000 Jensen et al 2004 Honji et al 2009) No
entanto o fato das meacutedias dos IGS e IHS nos experimentos com aclimataccedilatildeo terem sido
menores quando comparadas com os experimentos sem aclimataccedilatildeo sugere associaccedilatildeo
entre quantidade inferior de foliacuteculos secundaacuterios e quantidade superior de atresia nos
experimentos com aclimataccedilatildeo assim como no trabalho de Chatterjee et al (1997) e
Bugel et al (2010) que verificaram diminuiccedilatildeo na taxa de foliacuteculos vitelogecircnicos e
IGS
A ventilaccedilatildeo branquial acelerada e a natildeo procura por alimentos nas primeiras 24
horas observadas nos diferentes experimentos sugere que a entrada de aacutegua pela via
branquial foi causa direta da absorccedilatildeo e difusatildeo do toacutexico no organismo No entanto a
via epideacutermica tambeacutem poder ser considerada via de entrada do toacutexico para os tecidos
(Mckim et al 1999) Portanto a exposiccedilatildeo dos peixes ao Thiodanreg e a aclimataccedilatildeo
foram fatores mais que afetaram o diacircmetro e a quantidade de foliacuteculos em A
bimaculatus Conforme as condiccedilotildees em que o estudo foi realizado levando-se em
consideraccedilatildeo as concentraccedilotildees do inseticida Thiodanreg utilizadas periacuteodo de exposiccedilatildeo e
espeacutecie de estudo demonstram que as fecircmeas analisadas podem estar em processo
inicial de intoxicaccedilatildeo com possiacutevel alteraccedilatildeo fisioloacutegica
75
A
opa
opi opa
vs
D
osint
osa
osa
gv gv
gv
osi
C
B
opa
opa
zr
vc
Figura 1 Desenvolvimento folicular ovariano de Astyanax bimaculatus A Estroma ovariano com foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio inicial (opi) e primaacuterio avanccedilado (opa) B Foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (opa) com ceacutelulas foliculares pavimentosas e zona radiata delgada (zr) C Foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio inicial (osi) possuindo ceacutelulas foliculares pavimentosas com zona radiata espessa (zr) e vesiacuteculas corticais claras (vc) na periferia do foliacuteculo D Foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio intermediaacuterio iniciando deposiccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo (osint) e foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (osa) com gloacutebulos de vitelo (gv) por todo o citoplasma vs vaso sanguiacuteneo Coloraccedilatildeo Hematoxilina-eosina Barra A e B (50 m) C (30 m) D (100 m)
zr
76
ai
gr gr
zr
h
av
A
ait
Figura 2 Foliacuteculos ovarianos de Astyanax bimaculatus em atresia A Atresia folicular inicial (ai) caracterizada pela quebra da zona radiata (zr) hipertrofia de ceacutelulas foliculares (cf) e presenccedila de granuloacutecitos (gr) B Detalhe de granuloacutecito (gr) sobre a regiatildeo de ceacutelulas foliculares C Atresia folicular intermediaacuteria (ait) caracterizada pela liquefaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo (gv) desintegraccedilatildeo da zona radiata e invasatildeo do citoplasma pelas ceacutelulas foliculares D Atresia folicular avanccedilada (av) caracterizada pela ausecircncia de gloacutebulos de vitelo Ceacutelulas da teca (t) hemaacutecias (h) Coloraccedilatildeo Hematoxilina-eosina Barra A (25 m) B (10 m) C (150 m) D (100 m)
gv
ai
B
C D
t
gv
77
Figura 3 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos primaacuterios iniciais por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e expostos ao Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dentro dos grupos (Plt005) pelo teste de Duncan Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
0
5
10
15
20
25
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
A A
AB
B
AB
A
AB
B
0
1
2
3
4
5
6
7
8
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 4 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos primaacuterios avanccedilados por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dentro dos grupos (Plt005) pelo teste de Duncan Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
A
BC AC
BD
AC
BC
AB A A
B
B
A
78
0
02
04
06
08
1
12
14
16
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedilas entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dos grupos com as mesmas concentraccedilotildees nos diferentes experimentos (Plt005) ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) Teste de Duncan
A
B
A
B
ab b
a ab
Figura 5 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios iniciais por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e d
e o
voacuteci
tos Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 6 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Plt005) pelo teste de Duncan
79
0
05
1
15
2
25
3
35
4
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 7 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Duncan
Figura 8 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos atreacutesicos iniciais em ovaacuterios de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Kruskall Wallis
0
005
01
015
02
025
03
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e a
tre
sia
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
80
Figura 9 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos atreacutesicos totais em ovaacuterios de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
0
005
01
015
02
025
03
035
04
045
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e a
tre
sia
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Kruskall Wallis
81
Tabela 2 Diacircmetro meacutedio (microm) de foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados de lambaris A bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
53443 plusmn 7414a 53796 plusmn 7746a 53273 plusmn 8300a 50046 plusmn 5610a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
56807 plusmn 6647a 57517 plusmn 5849a 5904 plusmn 5889a 58449 plusmn 6849a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
53816 plusmn 5684a 51894 plusmn 6065a 55393 plusmn 6193a 54749 plusmn 6849a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
51606 plusmn 5757a 57837 plusmn 5977b 55774 plusmn 7870aᵇ 57311 plusmn 6178b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Tukey
Tabela 3 Iacutendice gonadossomaacutetico de fecircmeas de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
790 plusmn 318a 747 plusmn 221a 505 plusmn 263a 432 plusmn 255a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
856 plusmn 473a 813 plusmn 690a 702 plusmn 430a 683 plusmn 361a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
373 plusmn 213a 270 plusmn 147a 323 plusmn 189a 399 plusmn 201a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
227 plusmn 147a 303 plusmn 106a 305 plusmn 192a 293 plusmn 167a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Duncan
Tabela 4 Iacutendice hepatossomaacutetico de fecircmeas de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
07 plusmn 014aᵇ 088 plusmn 03a 084 plusmn 038a 038 plusmn 031b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
113 plusmn 054a 104 plusmn 061a 102 plusmn 050a 102 plusmn 051a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
066 plusmn 029a 073 plusmn 020a 092 plusmn 017a 091 plusmn 012a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
074 plusmn 034a 072 plusmn 029a 094 plusmn 040a 063 plusmn 018a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Duncan
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53 CAPIacuteTULO 3
RELACcedilAtildeO ENTRE COLAacuteGENO TIPO IV INTEGRINA β1 E CASPASE 3
DURANTE O DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM Astyanax bimaculatus
EXPOSTOS AO THIODAN reg
RESUMO
O agrotoacutexico Thiodanreg (350gL de endosulfan) eacute um inseticida organoclorado utilizado
em diversas monoculturas e pode chegar aos ecossistemas aquaacuteticos afetando a
reproduccedilatildeo e a integridade das populaccedilotildees de peixes Ovaacuterios de peixes apresentam
ovoacutecitos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento os quais satildeo envoltos por zona
radiata ceacutelulas foliculares membrana basal e ceacutelulas da teca formando o complexo
folicular A integridade do complexo folicular estaacute associada com a presenccedila de
colaacutegeno tipo IV e integrina β1 enquanto a caspase 3 eacute uma protease importante na via
apoptoacutetica participando ativamente nos processos de regressatildeo ovariana Pela carecircncia
de estudos que avaliam tais proteiacutenas no complexo folicular este estudo teve por
objetivo avaliar por meio de anaacutelise imunoistoquiacutemica a expressatildeo das proteiacutenas
colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspases 3 durante o desenvolvimento folicular do
lambari Astyanax bimaculatus exposto ao Thiodanreg Os peixes foram aclimatados
durante 10 dias em aquaacuterios de 50L com aeraccedilatildeo contiacutenua aacutegua sem cloro filtro
mecacircnico fotoperiacuteodo (12h) e temperatura (26plusmn1ordmC) controlados Para a exposiccedilatildeo ao
Thiodanreg os peixes foram divididos em quatro grupos controle 115 23 e 56 microgL
com trecircs repeticcedilotildees em cada concentraccedilatildeo Apoacutes 96 h seis peixes de cada grupo foram
anestesiados (benzocaiacutena110000) eutanasiados e seus ovaacuterios coletados para detecccedilatildeo
de colaacutegeno de tipo IV integrina β1 e caspase 3 Fragmentos dos ovaacuterios foram fixados
em paraformaldeiacutedo a 4 e incluiacutedos em parafina Os procedimentos de
imunomarcaccedilatildeo seguiram protocolos jaacute padronizados para os anticorpos empregados A
reaccedilatildeo foi revelada com diaminobenzidina e os cortes foram contracorados com
hematoxilina para avaliaccedilatildeo qualitativa em microscoacutepio de luz Os foliacuteculos primordiais
natildeo apresentaram marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 Nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio observou-se reaccedilatildeo fracamente positiva no citoplasma das
ceacutelulas foliculares enquanto foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio foram mais
intensamente marcados para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV A imunomarcaccedilatildeo para
caspase 3 foi evidenciada nas ceacutelulas foliculares durante o desenvolvimento secundaacuterio
sendo mais intensa no estaacutedio avanccedilado Qualitativamente essas anaacutelises demonstraram
87
marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento folicular mesmo com os
peixes expostos a diferentes concentraccedilotildees de Thiodanreg o que caracteriza a integridade
das ceacutelulas foliculares e da via apoptoacutetica caspase-3-dependente que pode estar sendo
ativada para futuros processos de regressatildeo folicular
Palavras-chave ecotoxicologia aquaacutetica ovaacuterio peixes e reproduccedilatildeo
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 de α-endosulfan e 30 de β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo
por meio da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em riscos toxicoloacutegicos os
organismos que ali residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al
2007) Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos
como jaacute observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis
niloticus No entanto a Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan
em gordura o valor de 005mgkg-1 (EPA 2002) e em aacutegua doce 022microgL-1 (EPA
1980) A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em
consideraccedilatildeo a qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente
Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm 3572005 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo
do referido inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
Muitos inseticidas apresentam baixa toxicidade antes de serem transformados
em substacircncias toacutexicas metabolicamente ativas O sulfato de endosulfan eacute um dos
produtos derivados do metabolismo do endosulfan sendo considerado o principal
metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica por ser mais estaacutevel no meio
ambiente em relaccedilatildeo a sua formula original (Ali et al 1984) A sensibilidade dos
organismos aquaacuteticos ao endosulfan eacute baixa e tem sido bem descrita na literatura por
alguns autores (Cengiz et al 2001 Capkin et al 2006 Ballesteros et al 2007 Pereira
et al 2012) sendo os machos geralmente mais sensiacuteveis que as fecircmeas pelo
armazenamento de lipiacutedeos para produccedilatildeo do vitelo e fornecimento de energia e pelo
tamanho maior da fecircmea em relaccedilatildeo ao macho (Ballesteros et al 2007)
88
O desenvolvimento folicular em peixes tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter 1996 Begovac amp Wallace
1988 Grier 2000 2002 e 2007) e como nos animais em geral compreende os periacuteodos
preacute-meioacutetico perinucleolar vitelogecircnico e maturaccedilatildeo final Estas fases ocorrem no
interior de foliacuteculos cujo complexo folicular eacute constituiacutedo por zona radiata camada
folicular membrana basal e teca (Grier 2000) as quais desempenham importante papel
durante a foliculogecircnese e fertilizaccedilatildeo
Entretanto os peixes quando satildeo expostos aos poluentes podem sofrer influecircncia
na foliculogecircnese e assim acarretar prejuiacutezos reprodutivos para as espeacutecies expostas aos
contaminantes Alguns estudos mostram diversas alteraccedilotildees provocadas nos foliacuteculos de
peixes por contaminantes (Hazarika amp Das 1998 Dutta et al 2003 Maxwell amp Dutta
2005 Chakrabarty et al 2012) inclusive a atresia folicular que eacute um processo
frequentemente observado nos ovaacuterios dos vertebrados (Saidapur 1978 Santos et al
2008a Santos et al 2008b) e que pode ser causada por diversos fatores dentre os
quais os agrotoacutexicos (Nagahama 1983 Guraya 1986 Chatterjee et al 1997 e 2001
Dutta amp Dalal 2008)
No desenvolvimento folicular a formaccedilatildeo do complexo folicular eacute importante
no suporte e na sobrevivecircncia das ceacutelulas foliculares No entanto jaacute foram identificadas
vaacuterias proteiacutenas que contribuem para a integridade do complexo folicular como
laminina integrina β1 fibronectina colaacutegeno tipo IV e de metaloproteinases (MMM-P)
em foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios e atreacutesicos (Rodgers et al 1998 Grier 2002 Le Bellego
et al 2002 Berkholtz et al 2006 Santos et al 2008a Thomeacute et al 2010) O colaacutegeno
tipo IV eacute uma proteiacutena especializada da matrix extracelular e membrana basal assim
como a laminina Essas proteacuteinas estatildeo envolvidas em favorecer um microambiente para
sobrevivecircncia das ceacutelulas do epiteacutelio (Rodgers et al 2003) As integrinas compreendem
uma grande famiacutelia de recepetores celulares composto de subnidades α e β que tem
funccedilatildeo importante na adesatildeo e transmissatildeo de sinais na ceacutelula Aleacutem disso as integrinas
estatildeo envolvidas na proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e morte celular
A caspase 3 eacute uma moleacutecula efetora de grande importacircncia no processo de
apoptose na ativaccedilatildeo de endonucleases e na clivagem das proteiacutenas celulares causando
mudanccedilas morfoloacutegicas celulares (Huettenbrenner et al 2003) Este processo de
apoptose envolve uma cascata de eventos bioquiacutemicos com a liberaccedilatildeo de fatores
mitocondriais de morte celular ativaccedilatildeo caspases e mudanccedila na caracteriacutestica
morfoloacutegica no nuacutecleo da ceacutelula assim como fragmentaccedilatildeo do DNA (Huettenbrenner et
89
al 2003) No entanto alguns trabalho citam a importacircncia da integridade do complexo
folicular com a presenccedila de integrina β1 e colaacutegeno tipo IV que em caso de atresia
folicular e ovulaccedilatildeo na formaccedilatildeo de foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios culminam em processo
da ativaccedilatildeo das caspases nas ceacutelulas foliculares Sendo assim a incidecircncia de apoptose
nas ceacutelulas foliculares aumenta nas etapas de regressatildeo ovariana (Drummond et al
2000 Santos et al 2003 2005 2008)
O lambari A bimaculatus foi escolhido como organismo experimental pois eacute
muito representativo no ecossistema sendo encontrado desde o nordeste brasileiro ateacute a
Bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Tambeacutem eacute um peixe de
pequeno porte e faacutecil de manter em laboratoacuterio O complexo folicular associado agrave
siacutentese dessas proteiacutenas ao longo do desenvolvimento folicular eacute algo a ser discutido
Poreacutem nenhum trabalho relata estas proteiacutenas em peixes expostos ao Thiodanreg Devido
agrave carecircncia de estudos que avaliem tais proteiacutenas no complexo folicular o presente
trabalho tem como objetivo avaliar as proteiacutenas colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase
3 durante o desenvolvimento folicular do lambari A bimaculatus exposto ou natildeo ao
Thiodanreg por meio de anaacutelise imunoistoquiacutemica
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria (DVT) da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste subletal e as atividades de coleta fixaccedilatildeo e
inclusatildeo dos fragmentos de ovaacuterios As etapas de microtomia imunoistoquiacutemica
coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas foram realizadas no
DVTUFV e no Laboratoacuterio de Ictiohistologia do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas (ICB)
da Universidade Federal de Minas Gerais
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos peixes em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado poro genital
dilatado e vascularizado
90
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV onde
foram aclimatados por 10 dias Os aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuiacuteam
capacidade de 50 litros numa densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada
aacutegua livre de cloro temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos
os aquaacuterios possuiacuteam um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo continua da aacutegua para
garantir o bem-estar dos peixes Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial
Purina contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da
piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Foram aclimatados 96 lambaris como descrito no item 21 onde os peixes se
acostumaram ao seu novo meio e agraves atividades normais de manutenccedilatildeo como
alimentaccedilatildeo e limpeza dos aquaacuterios O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi
realizado baseando-se nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo com
a NBR 15088 (ABNT 2007)
Logo apoacutes aclimataccedilatildeo os peixes foram submetidos ao toacutexico Thiodanreg
(endosulfan 350gL) por 96 horas Em todos os experimentos foram utilizadas trecircs
concentraccedilotildees diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 (137microgL) preacute-determinada em
laboratoacuterio de acordo com a NBR 15088 (ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas
em cada experimento foram de 115 23 e 56microgL aleacutem de um grupo controle sem
toacutexico com trecircs repeticcedilotildees sob as mesmas condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
91
24 Anaacutelises histoloacutegicas e imunoistoquiacutemicas
Apoacutes 96 horas de experimento seis fecircmeas de cada grupo foram coletadas
anestesiadas com benzocaiacutena (110000) e eutanasiadas para coleta dos ovaacuterios Para a
descriccedilatildeo histoloacutegica todas as amostras foram fixadas em paraformaldeiacutedo a 4 em
tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedas em parafina Em seguida
secccedilotildees com 5 microm de espessura foram coradas utilizando hematoxilinaeosina para
anaacutelises morfoloacutegicas do desenvolvimento folicular
Para detectar a imunorreatividade para colaacutegeno tipo IV integrinas β1 e caspase
3 nos ovaacuterios do lambari trecircs espeacutecimes de cada grupo foram fixados em
paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas incluiacutedas em
parafina e seccionadas com 5 microm de espessura A recuperaccedilatildeo antigecircnica foi realizada
em forno de microondas por 10 minutos com os cortes nas lacircminas sendo imersos em
tampatildeo citrato 10mM pH 60 As lacircminas foram incubadas com peroacutexido de hidrogecircnio
a 3 em tampatildeo fosfato por 15 minutos em temperatura ambiente para inativar
peroxidase endoacutegena e com soro albumina bovina a 2 por 45 minutos para bloquear
marcador antigecircnico inespeciacutefico Anticorpos primaacuterios (policlonais de coelho) anti-
colaacutegeno tipo IV anti-integrina β1 e anti-caspase 3 (Santa Cruz Biotechnology Calif
USA) foram aplicados nas secccedilotildees a 4degC na diluiccedilatildeo 1100 (integrina β1 e colaacutegeno tipo
IV) e 1200 (caspase 3) segundo o fabricante por 12 horas Os cortes foram lavados
em PBS e incubados por 45 minutos com anticorpo secundaacuterio na diluiccedilatildeo de 1200
anti-IgG de coelho (LSAB 2 sistema HRP DakoCymation Carpinteria Calif USA) e
tratados com peroxidase conjugada com estreptavidina por 45 minutos A revelaccedilatildeo foi
realizada com diaminobenzidina (DAB) e as lacircminas foram contracoradas com
hematoxilina (Santos et al 2008)
As lacircminas foram analisadas em toda sua extensatildeo em busca de alteraccedilotildees na
imunomarcaccedilatildeo no complexo folicular que pudessem ser representativas do efeito do
Thiodanreg sempre comparando com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios do grupo
controle As lacircminas foram analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e as
imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
92
3 RESULTADOS
31 Desenvolvimento folicular
O desenvolvimento folicular de A bimaculatus foi dividido em desenvolvimento
primaacuterio inicial e avanccedilado O desenvolvimento secundaacuterio foi dividido em
desenvolvimento secundaacuterio inicial intermediaacuterio e avanccedilado (Tabela 1) A regressatildeo
ovariana tambeacutem foi caracterizada (Tabela 1)
Tabela 1 Aspectos morfoloacutegicos do desenvolvimento folicular e da regressatildeo ovariana de Astyanax bimaculatus
Foliacuteculos primordiais Estaacutedio que antecede o desenvolvimento de foliacuteculos primaacuterios Satildeo ceacutelulas menores apresentando citoplasma volumoso nuacutecleo esfeacuterico e grande e ceacutelulas preacute-foliculares (Figura 1 B) Foliacuteculos primaacuterios iniciais e primaacuterios avanccedilados (perinucleolares) No desenvolvimento primaacuterio inicial os ovoacutecitos apresentam citoplasma fortemente basoacutefilo nuacutecleo esfeacuterico e nucleacuteolos dispersos pelo nucleoplasma Estatildeo envoltos por ceacutelulas foliculares pavimentosas (Figuras 1 C-encarte) No foliacuteculo primaacuterio avanccedilado a camada de ceacutelulas foliculares eacute pavimentosa e com o nuacutecleo eliacuteptico Entre as ceacutelulas foliculares e o ooplasma surge a zona radiata como uma fina camada (Figura 1 E-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios iniciais O citoplasma ovocitaacuterio eacute granular e fracamente basoacutefilo com presenccedila de vesiacuteculas corticais pequenas e claras na periferia do citoplasma O nuacutecleo eacute central ligeiramente acidoacutefilo com nucleacuteolos pequenos e dispersos pelo nucleoplasma (Figura 1 G-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios Assim como na etapa anterior os foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios possuem ovoacutecito com nuacutecleo central e acidoacutefilo No citoplasma inicia-se a deposiccedilatildeo de vitelo a partir da regiatildeo perifeacuterica (Figura 1 H-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados (vitelogecircnicos) No foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado o diacircmetro e o volume citoplasmaacutetico aumentam mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo apresentando os foliacuteculos neste estaacutedio vesiacuteculas corticais na periferia e gloacutebulos de vitelo disperso por todo citoplasma No complexo folicular a membrana basal eacute delgada e a zona radiada mais espessa que nas fases anteriores com ceacutelulas foliculares pavimentosas e cuacutebicas (Figura 1 H-encarte) Foliacuteculos atreacutesicos Apresenta formato irregular com estruturas descontiacutenuas ou desorganizadas com aspecto de grumos devido agrave liquefaccedilatildeo dos gracircnulos de vitelo ou com perda da conectividade entre suas partes fragmentaccedilatildeo da zona radiata (atresia inicial) e absorccedilatildeo total do conteuacutedo ovocitaacuterio pelas ceacutelulas foliculares (atresia avanccedilada) (Figuras 3 A e B-encarte) Foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios O foliacuteculo poacutes-ovulatoacuterio possue lume amplo irregular e contiacutenuo com o lume do ovaacuterio Apresenta parede constituiacuteda por camada uacutenica de ceacutelulas foliculares membrana basal e teca (Figuras 3 E e F)
93
32 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 no desenvolvimento
folicular de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Os foliacuteculos nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento apresentaram diferentes
graus de marcaccedilatildeo para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV Em foliacuteculo primordial natildeo se
observou marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 (Figura 1 B) Nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio inicial foram evidenciadas reaccedilotildees positivas com marcaccedilatildeo
fraca para colaacutegeno e integrina (Figuras 1 C e D) enquanto nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio avanccedilado as marcaccedilotildees foram mais niacutetidas (Figuras 1 E e F)
Nos desenvolvimento secundaacuterio foram evidenciadas marcaccedilotildees positivas para integrina
β1 e colaacutegeno tipo IV no citoplasma das ceacutelulas foliculares com mais intensidade que
nos estaacutedios anteriores (Figuras 1 G e H) Estas marcaccedilotildees natildeo mostraram diferenccedilas
entre os grupos expostos ao Thiodanreg quando comparados com os mesmos estaacutedios de
desenvolvimento folicular dos grupos controle A marcaccedilatildeo para caspase 3 foi
evidenciada no citoplasma e nuacutecleos de ceacutelulas foliculares de foliacuteculos com
desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado apresentando maior intensidade nos estaacutedios de
desenvolvimento secundaacuterio inicial A marcaccedilatildeo foi ausente nos estaacutedios de
desenvolvimento primaacuterio (Figuras 2 A-D) Quando comparadas estas marcaccedilotildees entre
os grupos controle e expostos ao Thiodanreg natildeo houve diferenccedilas nas marcaccedilotildees entre
os mesmos estaacutedios de desenvolvimento folicular
33 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 na atresia folicular de
A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
A marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 foi evidente nos foliacuteculos
atreacutesicos iniciais poreacutem menos intensa em relaccedilatildeo aos foliacuteculos normais (Figuras 3 A e
C) As fases mais avanccediladas da atresia folicular satildeo caracterizadas pela desorganizaccedilatildeo
espalhamento das proteiacutenas no ooplasma com reaccedilatildeo mais fraca da imunomarcaccedilatildeo
para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 (Figuras 3 B e D) Para a caspase 3 foi observada a
marcaccedilatildeo positiva nas ceacutelulas foliculares em foliacuteculos atreacutesicos iniciais e avanccedilados
(Figuras 4 A e B)
94
34 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 em foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Foram evidenciados desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV e
integrina β1 entre as ceacutelulas foliculares com marcaccedilatildeo positiva (Figuras 3 E e F) Em
foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios tambeacutem foi observada marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 nas
ceacutelulas foliculares (Figuras 4 C e D)
4 DISCUSSAtildeO
As fecircmeas de A bimaculatus submetidas agrave accedilatildeo do toacutexico apresentaram ovaacuterios
com padrotildees normais do desenvolvimento folicular sendo as variaccedilotildees na estrutura do
foliacuteculo como diacircmetro caracteriacutesticas do nuacutecleo camadas envoltoacuterias composiccedilatildeo e
distribuiccedilatildeo do vitelo observadas em outras espeacutecies do gecircnero do presente estudo
(Miranda 1996 Miranda et al 1999 Melo et al 2005 Mazzoni et al 2005 Rodrigues
et al 2005) Em outros trabalhos (Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008) satildeo
demonstrados que pequena concentraccedilatildeo de contaminantes pode ser suficiente para
causar alteraccedilotildees na morfologia dos foliacuteculos Entretanto Ballesteros et al (2007)
utilizando peixes machos e fecircmeas da espeacutecie Jenynsia multidentata verificaram que o
maior teor de lipiacutedeos nas fecircmeas foi importante para conferir maior resistecircncia contra o
endosulfan ao contraacuterio dos machos que satildeo mais suceptiacuteveis Estudo realizado por
Hernan Da Cuntildea et al (2011) mostrou que a espeacutecie Cichlasoma dimerus exposta ao
endosulfan nas concentraccedilotildees de zero 025 1 2 3 4 e 16μgL natildeo apresentou
alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos foliacuteculos assim como no presente trabalho com A
bimaculatus
No presente estudo a ausecircncia de marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV em foliacuteculos
primordiais pode ter ocorrido em funccedilatildeo da quantidade reduzida de ceacutelulas foliculares e
pela pequena espessura da membrana basal nesta fase de desenvolvimento folicular Na
literatura eacute mencionado que a espessura da membrana basal em foliacuteculos secundaacuterios
avanccedilados de A bimaculatus eacute de aproximadamente 03 microm caracterizada por ser uma
estrutura muito mais delgada quando comparada a outras espeacutecies de teleoacutesteos
(Drummond et al 2000) Outros autores no entanto observaram positividade para
colaacutegeno tipo IV na membrana basal envolvendo ovogocircnias no estroma ovariano de
peixes (Grier 2002 Thomeacute et al 2010) fase que antecede o ovoacutecito primordial
95
A siacutentese de membrana basal tem sido atribuiacuteda agraves ceacutelulas foliculares (Le Mim
et al 2007) mas ainda faltam investigaccedilotildees que evidenciem esta funccedilatildeo A anaacutelise por
hibridizaccedilatildeo in situ na cadeia α1 do colaacutegeno tipo IV revelou a presenccedila de mRNA
localizada na camada folicular de todos os foliacuteculos em crescimento no peixe medaka
Oryzias latipes (Kato et al 2010) enquanto para integrinas Itami et al (2011) natildeo
identificaram marcaccedilatildeo em foliacuteculos primordiais em ratos Estes estudos confirmam que
durante o desenvolvimento do foliacuteculo primordial poderia estar ocorrendo o inicio da
organizaccedilatildeo e siacutentese do colaacutegeno tipo IV para as fecircmeas do presente estudo
Logo em seguida o desenvolvimento folicular primaacuterio inicial e avanccedilado foi
caracterizado por alteraccedilotildees no complexo folicular com marcaccedilatildeo positiva para
integrina β1 e colaacutegeno tipo IV foi positiva Em outro estudo realizado para marcaccedilatildeo
de vaacuterias subunidades do colaacutegeno tipo IV em foliacuteculos de bovinos a expressatildeo das
cadeias α3 e α6 diminuiacuteram durante o desenvolvimento folicular enquanto as cadeias
α1 e α2 continuaram a ser expressas ao longo do desenvolvimento (Rodgers et al
1998) Em estudo com ratos foi verificado o decliacutenio de colaacutegeno tipo IV α3 ao longo
do desenvolvimento folicular mas foi possiacutevel detectar o colaacutegeno tipo IV α4 e α5 em
foliacuteculos desenvolvidos (Frojdman et al 1998) Entretanto Berkholtz (2006) observou
aumento da marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV ao longo do desenvolvimento folicular em
ratos Aleacutem disso outra caracteriacutestica importante eacute presenccedila de perlecan e nidogen que
fazem parte das ligaccedilotildees cruzadas em foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio mas
natildeo em foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio (McArthur et al 2000) Poreacutem as
diferentes ligaccedilotildees cruzadas entre os colaacutegenos e lamininas nas membranas basais
tambeacutem garantem maior expansatildeo no alargamento do foliacuteculo (Rodgers et al 2003)
Portanto eacute de grande importacircncia nesta etapa de desenvolvimento folicular a evidecircncia
do colaacutegeno tipo IV e integrinas o que pode contribuir na organizaccedilatildeo coordenada no
desenvolvimento folicular de A bimaculatus com estas proteiacutenas da matriz extracelular
Em relaccedilatildeo agraves fases de desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio foram observadas
marcaccedilotildees positivas para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 o que parece caracterizar
maior siacutentese destas proteiacutenas nestes estaacutedios do desenvolvimento folicular Entretanto
deve-se considerar que nas fases mais avanccediladas a quantidade de ceacutelulas foliculares e
ceacutelulas da teca satildeo mais numerosas sendo assim exercem funccedilatildeo importante na
integridade folicular No presente estudo a marcaccedilatildeo contiacutenua de colaacutegeno tipo IV e
integrina β1 nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento folicular em 96 horas de
experimento indicou que natildeo houve desorganizaccedilatildeo na membrana basal e nas ceacutelulas
96
foliculares Thomeacute et al (2010) identificaram por teacutecnicas de imonoistoquiacutemica e
imunofluorescecircncia a presenccedila de laminina β2 integrinas e colaacutegeno tipo IV na
membrana basal demonstrando a importacircncia destes constituintes na integridade da
membrana basal ao longo do desenvolvimento folicular resultados observados tambeacutem
em foliacuteculos de mamiacuteferos (Le Bellego et al 2002 Berkholtz et al 2006)
Em foliacuteculos de ratos tambeacutem foi evidenciada a presenccedila de integrinas ao longo
do desenvolvimento folicular apresentando marcaccedilatildeo positiva no desenvolvimento
primaacuterio e marcaccedilatildeo mais intensa no desenvolvimento secundaacuterio (Itami et al 2011)
Portanto a marcaccedilatildeo positiva nas ceacutelulas foliculares em lambaris A bimaculatus nos
grupos controle e expostos ao Thiodanreg mostrou que a integridade dos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio natildeo foi afetada pelas concentraccedilotildees de
Thiodanreg utilizadas
Em relaccedilatildeo agrave caspase 3 ao longo do desenvolvimento folicular foi possiacutevel
evidenciar sua expressatildeo nos estaacutedios de desenvolvimento secundaacuterio mas natildeo a
presenccedila de condensaccedilatildeo de nuacutecleos e corpos apoptoacuteticos nas ceacutelulas foliculares No
entanto a presenccedila de caspase 3 nas ceacutelulas foliculares de A bimaculatus indica que
estas ceacutelulas podem estar em via apoptoacutetica poreacutem outros trabalhos demonstram que a
via para caspase 3 eacute observada em foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios atresias iniciais e
principalmente nas atresias avanccediladas com a presenccedila de fragmentaccedilatildeo de DNA
condensaccedilatildeo nuclear e formaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos (Hsueh et al 1994 Santos et
al 2008) A ausecircncia destas caracteriacutesticas morfoloacutegicas nos foliacuteculos de A
bimaculatus do presente estudo pode ser explicada por inibidores de apoptose (Salvesen
amp Duckett 2002) que podem estar ativos e protegendo as ceacutelulas contra apoptose
Outros exemplos citados satildeo os fatores hormonais como as gonadotropinas 17β
estradiol e fator de crescimento epideacutermico que agem como fatores de sobrevivecircncia
para suprimir a morte celular por apoptose em foliacuteculos ovarianos de ratos em cultura
(Chun et al 1994) e tambeacutem no peixe truta arco-iacuteris Oncorhynchus mykiss (Janz amp Van
Der Kraak 1997) Segundo Salvesen amp Duckett (2002) poucos estudos tecircm tentado
esclarecer se uma determinada ceacutelula consegue se recuperar de um efeito fisioloacutegico de
caspases quando estatildeo sendo processadas e ativadas
Um grupo de proteiacutenas estruturalmente relacionadas agrave inibiccedilatildeo da apoptose eacute o
inibidor de apoptose (IAP) (Deveraux amp Reed 1999) Satildeo descritos pelo menos oito
IAPs em humanos localizados no citoplasma e que se ligam na forma ativa da caspase
3 ou na forma zimogecircnio das caspases para inibir a sua funccedilatildeo (Salvesen amp Duckett
97
2002) Janz et al (1997) mencionam forte relaccedilatildeo com o aumento da apoptose e
expressatildeo de proteiacutena do choque teacutermico HSP70 em peixes expostos agrave celulose
afetando o tamanho do ovaacuterio provocanado queda da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
testosterona e induccedilatildeo nas concentraccedilotildees plasmaacuteticas de 17β estradiol Em relaccedilatildeo agrave
HSP70 ela pode estar relacionada com a proteccedilatildeo das ceacutelulas foliculares antes da
reabsorccedilatildeo do vitelo em foliacuteculos atreacutesicos (Santos et al 2008) A relaccedilatildeo mais
consistente da viabilidade dos foliacuteculos de A bimaculatus no presente estudo segundo a
literatura pode ser a relaccedilatildeo dos inibidores de apoptose associado com os fatores
hormonais agindo como prevenccedilatildeo na sobrevivecircncia das ceacutelulas foliculares no
desenvolvimento folicular secundaacuterio
Nas fecircmeas do lambari A bimaculatus o processo de atresia foi semelhante ao
descrito por Miranda et al (1999) Munoz et al (2002) Melo et al (2005) e Santos et
al (2005) A maior frequecircncia de atresia foi observada em foliacuteculos secundaacuterios
Observaccedilotildees semelhantes foram feitas por Drummond (1996) em A bimaculatus
lacustris e Melo et al (2005) em A scabripinnis Em relaccedilatildeo aos foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios ocorre perda de contato entre as membranas das ceacutelulas foliculares
adjacentes evento observado por Santos et al (2005) entre 48 e 72 horas poacutes-desova em
Leporinus taeniatus Essas estruturas foram raramente encontradas no presente estudo
indicando que o grau de contaminaccedilatildeo pelo Thiodanreg natildeo interferiu na eliminaccedilatildeo dos
foliacuteculos de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada
Nos processos de atresias e nos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios ocorreram a
desorganizaccedilatildeo e a perda da positividade da imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e
integrinas nas fases avanccediladas quando comparadas com as fases iniciais da regressatildeo
ovariana sendo esta caracteriacutestica tambeacutem observada por outros autores (Santos et al
2008 Thomeacute et al 2010) Relatos importantes sobre a integridade dos foliacuteculos estatildeo
na diminuiccedilatildeo da integrina β1 e colaacutegeno do tipo IV contribuindo para o aumento da
apoptose em ceacutelulas foliculares de foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios e nas atresias avanccediladas
(Santos et al 2008) Aleacutem disso outros fatores contribuem para o aumento da
apoptose como a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 17β estradiol logo apoacutes a desova
favorecendo a regressatildeo ovariana dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios (Kaptaner amp Ural 2006)
Portanto o presente estudo com as fecircmeas de A bimaculatus evidencia a caspase 3 e a
diminuiccedilatildeo da marcaccedilatildeo com integrina β1 e colaacutegeno tipo IV nas ceacutelulas foliculares nos
foliacuteculos atreacutesicos e poacutes-ovulatoacuterios o que sugere a provaacutevel accedilatildeo destas proteiacutenas na
regressatildeo folicular em lambaris expostos ao Thiodanreg
98
De acordo com os resultados obtidos pode-se inferir que os ovaacuterios A
bimaculatus foram resistentes ao Thiodanreg nas concentraccedilotildees testadas e no periacuteodo
experimental proposto pois tais concentraccedilotildees natildeo interferiram de modo significativo
na estrutura do complexo folicular e no desenvolvimento folicular Qualitativamente
essas anaacutelises demonstraram a marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do
desenvolvimento folicular mesmo quando os peixes foram expostos a diferentes
concentraccedilotildees de Thiodanreg o que caracteriza a integridade das ceacutelulas foliculares e da
via apoptoacutetica caspase-3-dependente que pode estar sendo ativada para futuros
processos de regressatildeo folicular
99
A
DC
B
fsa fp
fpi
fpi
mc
mi
fpa
fpa
fsa
fsa
zr
zr
zr zr
H
E
G
F
mc
m
mi
mc
fsa
fpi
fpa
fsi
vc fsa
fst
v
v
Figura 1 Imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 ao longo do desenvolvimento folicular em A bimaculatus A Controle negativo para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV B Foliacuteculo primordial (fp) sem marcaccedilatildeo para colaacutegeno (setas) C e D Marcaccedilatildeo positiva para colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) respectivamente em folliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio inicial (fpi) E e F Marcaccedilatildeo positiva para colaacutegeno (mc) e integrina (mi) em foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (fpa) Encarte-C Foliacuteculo primaacuterio inicial (fpi) G e H Marcaccedilatildeo para colaacutegeno (mc) e integrina (mi) mais fortemente evidenciada em foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (fsa) Encartes-G e H Foliacuteculo secundaacuterio inicial (fsi) foliacuteculo secundaacuterio intermediaacuterio (fst) foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado (fsa) vesiacuteculas corticais (vc) vitelo (v) zona radiata (zr) Encartes C E G e H corados com hematoxilinaeosina Barras 20 m encartes C e E (80 m) G (100m) e H (200m)
A B
C D
E F
G H
100
fpi
fpa
fsa
fsa
fsa
zr
zr
zr zr
D
A
C
B
Figura 2 Imunomarcaccedilatildeo para caspase 3 ao longo do desenvolvimento folicular em A bimaculatus A Imagem do controle negativo para caspase 3 (setas) B Ausecircncia de marcaccedilatildeo para caspase 3 (setas) em foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio inicial (fpi) C e D Marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) em foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (fsa) e ausente (setas) em foliacuteculo desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (fpa) zr zona radiata fsa foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado Barras 20 m
101
A
mc
mi
mc
mi
mi mc
fpo fpo
ai av
av
B
C D
E F
Figura 3 Imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 de atresia e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterio em A bimaculatus A e C Foliacuteculo secundaacuterio em atresia inicial (ai) caracterizando a presenccedila da zona radiata (zr) e iniacutecio da desorganizaccedilatildeo da marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) no complexo folicular (setas) B e D Imunomarcaccedilatildeo menos intensa do que na etapa anterior em atresia avanccedilada caracterizando a desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) no citoplasma (setas) E e F Foliacuteculo poacutes-ovulatoacuterio (fpo) caracterizando a desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) entre as ceacutelulas
foliculares (setas) Encartes A e B Atresia inicial (ai) e atresia avanccedilada (av) ceacutelula folicular (cf) zona radiata (zr) Encartes A e B corados com hematoxilinaeosina Barras A B C E e F
(20 m) D (200 m) encartes A (25 m) e B (100 m)
ai av zr cf cf
102
A
ai av
fpo fpo
B
C D
Figura 4 Imunomarcaccedilatildeo para caspase 3 em atresia folicular e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios em A bimaculatus A e B Imunomarcaccedilatildeo em atresia inicial (ai) e atresia avanccedilada (av) caracterizando a presenccedila de marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) C e D Imunomarcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) nas ceacutelulas dos foliacuteculos poacutes-ovulatorios (fpo) Barras A B e D (20 m) C (200 m)
103
5 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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6 CONCLUSOtildeES A CL50 estimada para fecircmeas adultas de Astyanax bimaculatus em maturaccedilatildeo
avanccedilada expostas ao Thiodanreg eacute de 136microgL com intervalo de confianccedila de 101 a
184 microgL
A accedilatildeo do Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou o fiacutegado como um todo
mas locais isolados do parecircnquima hepaacutetico sendo a maioria alteraccedilotildees de estaacutegio I e
II com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico
As alteraccedilotildees na quantidade de glicogecircnio hepaacutetico no experimento sem aclimataccedilatildeo
sem alimentaccedilatildeo demonstraram que o Thiodanreg influenciou na maior mobilizaccedilatildeo
das reservas de glicogecircnio em funccedilatildeo das condiccedilotildees ambientais oferecidas aos
animais
As alteraccedilotildees ocorridas no nuacutecleo e citoplasma dos hepatoacutecitos demonstram que o
Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees hepaacuteticas confirmando que o Thiodanreg
influenciou no metabolismo celular como resposta adaptativa celular
Natildeo foram observadas diferenccedilas morfoloacutegicas que comprometessem diretamente os
estaacutedios de desenvolvimento folicular ovariano seja no grupo controle ou nos grupos
tratados com Thiodanreg
Os experimentos com aclimataccedilatildeo apresentaram alteraccedilotildees na quantidade de
foliacuteculos primaacuterios e secundaacuterios quando comparadas com os peixes sem
aclimataccedilatildeo sugerindo que o eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-ovaacuterio pode estar sendo
afetado
Houve maior diacircmetro nos foliacuteculos vitelogecircnicos e maior frequecircncia de atresia
folicular no experimento com aclimataccedilatildeo seguida de exposiccedilatildeo ao Thiodanreg o que
sugere mecanismo adaptativo com maiores diacircmetros de foliacuteculos no meio
impactado
108
As meacutedias dos IGS e IHS nos experimentos aclimatados foram menores quando
comparadas com os experimentos sem aclimataccedilatildeo sugerindo que a espeacutecie A
bimaculatus previamente aclimatada em aquaacuterios pode sofrer comprometimento da
reproduccedilatildeo
As reaccedilotildees imunohistoquiacutemicas para integrina β1 colaacutegeno IV e caspase-3 em
foliacuteculos atreacutesicos e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios sugerem possiacutevel relaccedilatildeo com a
regressatildeo ovariana poacutes-desova
As anaacutelises por imunohistoquiacutemica para integrina β1 colaacutegeno IV e caspase-3 nas
ceacutelulas foliculares ao longo do desenvolvimento folicular demonstraram
qualitativamente marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento
folicular mesmo quando os peixes foram expostos a diferentes concentraccedilotildees de
Thiodanreg o que caracteriza a integridade das ceacutelulas foliculares e da via apoptoacutetica
caspase-3-dependente que pode estar sendo ativada para futuros processos de
regressatildeo folicular
vi
RESUMO
MARCON Lucas D Sc Universidade Federal de Viccedilosa dezembro de 2013 Efeitos do Thiodanreg em fiacutegado e em ovaacuterios em maturaccedilatildeo avanccedilada de lambaris Astyanax bimaculatus Orientador Laeacutercio dos Anjos Benjamin Coorientadoras Ann Honor Mounteer e Marlene Isabel Vargas Viloria
O agrotoacutexico Thiodanreg (350gL de endosulfan) eacute um inseticida organoclorado utilizado
em diversas monoculturas que pode chegar aos ecossistemas aquaacuteticos e afetar a
reproduccedilatildeo e a integridade das populaccedilotildees de peixes O fiacutegado eacute um dos principais
oacutergatildeos para a biotransformaccedilatildeo de diversos xenobioacuteticos Quando os peixes satildeo
expostos a uma concentraccedilatildeo elevada de agentes quiacutemicos podem ocorrer danos
hepaacuteticos Os ovaacuterios de peixes apresentam foliacuteculos em diferentes estaacutedios de
desenvolvimento que satildeo envoltos por zona radiata ceacutelulas foliculares membrana basal
e ceacutelulas da teca formando o complexo folicular Agentes estressores podem causar
aumento ou diminuiccedilatildeo do diacircmetro dos foliacuteculos vitelogecircnicos alterar a quantidade de
foliacuteculos nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento e aumentar a incidecircncia de atresia
Assim o presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos do Thiodanreg sobre o fiacutegado
e ovaacuterios de lambaris Astyanax bimaculatus por meio de anaacutelises morfoloacutegica
morfomeacutetrica e imunoistoquiacutemica Os peixes expostos ao toacutexico foram divididos em
quatro experimentos 1) sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo 2) sem aclimataccedilatildeo e
alimentados 3) com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo 4) com aclimataccedilatildeo de
10 dias e alimentados Em todos os experimentos foram utilizadas trecircs concentraccedilotildees
diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 de 1367microgL preacute-determinada em laboratoacuterio
de acordo com a NBR 15088 (ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas em cada
experimento foram de 115 23 e 56microgL aleacutem de um grupo controle livre de toacutexico
com trecircs repeticcedilotildees contento 10 peixes para cada concentraccedilatildeo Apoacutes as 96h seis peixes
de cada grupo foram capturados e anestesiados com benzocaiacutena (110000) de acordo
com as Normas da Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de VeterinaacuteriaUFV (protocolo
242009) Os fiacutegados e ovaacuterios foram coletados e processados por teacutecnicas histoloacutegicas
rotineiras As lacircminas foram analisadas em microscoacutepio de luz Olympus CX31 Foram
obtidas imagens digitais de 10 campos aleatoacuterios por animal em objetiva de 20X e 40X
para avaliaccedilatildeo histoloacutegica As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada nos testes em sistema
estaacutetico foram mantidas de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT
2007) A anaacutelise histoloacutegica dos fiacutegados mostrou no experimento 1 (sem
vii
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo) na concentraccedilatildeo de 56microgL de Thiodanreg a menor
intensidade (010plusmn00) da reaccedilatildeo ao PAS no citoplasma dos hepatoacutecitos quando
comparada ao grupo controle (133plusmn051) No entanto houve diferenccedila (Plt005) nesse
mesmo experimento quando comparado com as concentraccedilotildees 115microgL (266plusmn081) e
23microgL (300plusmn00) caracterizando depleccedilatildeo de glicogecircnio Aleacutem disso houve
alteraccedilotildees do diacircmetro de nuacutecleos e citoplasma dos hepatoacutecitos nos diferentes
experimentos e maior quantidade de nuacutecleos de hepatoacutecitos nos grupos expostos ao
Thiodanreg associada com a reduccedilatildeo na quantidade de citoplasma O Iacutendice de Alteraccedilatildeo
Histoloacutegica (IAH) dos lambaris coletados manteve-se entre 433 a 833 (para os grupos
controles) 1850 a 2883 (para as concentraccedilotildees de 115microgL) 2033 a 2833 (para as
concentraccedilotildees de 23microgL) e 2366 a 2766 (para as concentraccedilotildees de 56microgL) Os
lambaris coletados nos diferentes experimentos apresentaram valores de IAH para os
grupos controle inferiores (Plt005) aos grupos expostos Estes resultados demonstraram
que o Thiodanreg pode estar influenciando as funccedilotildees hepaacuteticas pela maior mobilizaccedilatildeo
das reservas de glicogecircnio na concentraccedilatildeo 56microgL As alteraccedilotildees observadas nos
fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas sendo alteraccedilotildees de estaacutedio I e II indicando
dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico nos diferentes grupos e experimentos Nos ovaacuterios
percebeu-se que a accedilatildeo do Thiodanreg em niacuteveis subletais natildeo afetou a morfologia dos
diferentes estaacutedios de desenvolvimento folicular Poreacutem os experimentos com
aclimataccedilatildeo demonstraram alteraccedilotildees nas quantidades de foliacuteculos primaacuterios e
secundaacuterios quando comparados com os peixes dos experimentos sem aclimataccedilatildeo
Aleacutem disso houve aumento do nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos e diacircmetro dos foliacuteculos
secundaacuterios nos grupos expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos Estes
resultados sugerem mecanismos compensatoacuterios da perda reprodutiva quando em meio
com condiccedilotildees desfavoraacuteveis As anaacutelises imunoistoquiacutemicas demonstraram marcaccedilatildeo
crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento folicular para integrina β1 e
colaacutegeno tipo IV Entretanto a caspase 3 foi observada somente no complexo folicular
de foliacuteculos secundaacuterios mesmo quando os peixes satildeo expostos a diferentes
concentraccedilotildees de Thiodanreg o que confirma a integridade das ceacutelulas foliculares e da via
apoptoacutetica caspase-3-dependente a qual pode estar sendo ativada para futuros processos
de regressatildeo folicular
viii
ABSTRACT
MARCON Lucas D Sc Universidade Federal de Viccedilosa December 2013 Effects of Thiodanreg in liver and ovaries in advanced maturation of the lambari Astyanax bimaculatus Advisor Laeacutercio dos Anjos Benjamin Co-advisors Ann Honor Mounteer and Marlene Isabel Vargas Viloria
The pesticide Thiodanreg (350gL-1 of endosulfan) is an organochlorine insecticide used
in various monocultures that may reach aquatic ecosystems and affect reproduction and
the health of fish populations The liver is a major organ for the biotransformation of
many xenobiotics and it can be damaged if the fish are exposed to a high level of
chemical substances The fish ovaries have oocytes at different stages of development
that are surrounded by zona radiata follicular basal membrane and teca cells to form the
follicular complex Stressor products may cause an increase or decrease in the diameter
of the secondary follicles vitellogenic depletion a change the number of follicles at
different stages of development and an increase the incidence of atresia The present
study aimed to evaluate the effects of Thiodanreg on the liver and ovaries of Astyanax
bimaculatus through morphological morphometric and immunohistochemistry analysis
The groups of fish were exposed to the toxic substances divided in four experiments
without adaptation and no feeding feeding without adaptation with adaptation and no
feeding with adaptation and feeding All experiments used three different
concentrations of Thiodanreg lower than the LC50 of 1367 microgL-1 previously determined
in the laboratory in accordance with the Brazilian Standard Regulation - NBR 15088
(ABNT 2007) The concentrations used in each experiment were 115 23 and 56
microgL-1 and a control group with three repetitions using ten fish in each aquarium After
96h six fish from each group were captured and anesthetized with benzocaine
(110000) according to the norms of the Ethics Committee of the Veterinary
DepartmentUFV (protocol 242009) Livers and ovaries were collected and processed
by histological techniques The slides were examined under the light microscope
Olympus CX31 Were obtained digital images of 10 random fields per animal at 20X
and 40X objective for evaluation The characteristics of the water used in acute tests
were maintained in a stable system in accordance to the recommendations of NBR
15088 (ABNT 2007) In the experiment 1 (without adaptationno feeding) at the
concentration of 56 mgL-1 of Thiodanreg (010 plusmn 00) the intensity of the PAS reaction
was lower in the cytoplasm of hepatocytes when compared to the control group (133 plusmn
ix
051) In the same experiment differences in glycogen depletion were (Plt005) when
compared to the concentrations 115 gL-1 (266 plusmn 081) and 23 gL-1 (300 plusmn 00) In
addition changes in the diameter of nuclei and cytoplasm of hepatocytes in all
experiments were observed and an increase in the number of hepatocyte nuclei in
groups exposed to Thiodanreg was associated with a reduction in the amount of
cytoplasm However the IHA was maintained between 433 to 833 (control group)
1850 to 2883 (115 mgL-1 group) 2033 to 2833 (23 gL-1 group) and 2366 to 2766
(56 gL-1 group) These results suggest that Thiodanreg may be influencing liver
functions to increase glycogen mobilization according to higher concentrations of
exposition The changes observed in the livers of A bimaculatus were not severe
classified as stage I and II that indicate repairable damage to liver tissue in all
experiments It was observed in the ovaries that the action of Thiodanreg in sublethal
levels did not affect (Plt005) the morphology of the different stages of follicle
development However the experiments demonstrated an adaptation response in the
number of primary and secondary follicles compared to fish without adaptation In
addition there was a growing incidence of atretic follicles and increased diameter of the
secondary follicles in the groups exposed to Thiodanreg in all experiments These results
suggest an adaptive response to offset reproductive loss where in unfavorable
conditions The immunohistochemical analysis showed increasing and uniform labeling
throughout the follicular development for integrin β1 and collagen type IV However
caspase 3 was observed only in the secondary ovarian follicular complex even when
fish were exposed to different concentrations of Thiodanreg which characterizes the
integrity of follicular cells and the apoptotic pathway-dependent caspase-3 which may
be activated for future follicular regression
1
1 INTRODUCcedilAtildeO GERAL
11 O uso de agrotoacutexicos
Agrotoacutexicos satildeo produtos e agentes de processos fiacutesicos quiacutemicos ou bioloacutegicos
destinados ao uso nos setores de produccedilatildeo no armazenamento e beneficiamento de
produtos agriacutecolas nas pastagens na proteccedilatildeo de florestas nativas ou implantadas e de
outros ecossistemas e tambeacutem de ambientes urbanos e industriais cuja finalidade eacute
preservaacute-los da accedilatildeo danosa de seres vivos considerados nocivos (Lei Federal 7802 de
110789) Os agrotoacutexicos satildeo importantes na agricultura todavia exigem precauccedilatildeo no
seu uso visando a proteccedilatildeo dos operaacuterios que os manipulam e aplicam dos
consumidores dos animais de criaccedilatildeo de abelhas peixes de organismos predadores e
parasitas e enfim do meio ambiente
Certas praacuteticas agriacutecolas ligadas ao modelo de produccedilatildeo agriacutecola como o uso
excessivo e inadequado de agrotoacutexicos a destruiccedilatildeo da cobertura vegetal dos solos para
plantio a natildeo preservaccedilatildeo das matas ciliares e das vegetaccedilotildees protetoras de nascentes
dentre outros fatores satildeo responsaacuteveis por grande parte dos problemas com os recursos
hiacutedricos (Matuo 1990)
Os inseticidas constituem importante grupo de praguicidas para o uso agriacutecola
que ano apoacutes ano mostra um aumento progressivo em seu uso na Ameacuterica do Sul
Estes nas uacuteltimas deacutecadas comeccedilaram a substituir inclusive o trabalho mecacircnico e
manual dos agricultores Ruumlegg et al (1987) e Tomita amp Beyruth (2002) relatam que o
modelo de agricultura adotado no Brasil baseia-se no uso de agrotoacutexicos Estes
compostos satildeo empregados haacute muito tempo e a partir da 2deg guerra mundial passaram a
ser mais intensamente utilizados
Nos uacuteltimos 40 anos a agricultura brasileira sofreu inuacutemeras e profundas
transformaccedilotildees que alteraram tanto a composiccedilatildeo das culturas como os processos de
produccedilatildeo e padrotildees tecnoloacutegicos ateacute entatildeo em vigor Ruumlegg et al (1987) enfatizam que
o processo de modernizaccedilatildeo entendido como uma seacuterie de transformaccedilotildees tecnoloacutegicas
nos processos produtivos intensificou o emprego de insumos como maacutequinas
fertilizantes e agrotoacutexicos que contam com preccedilos favoraacuteveis e estiacutemulos como creacutedito
farto a juros subsidiados que facilitaram sua ampla adoccedilatildeo no meio rural Assim
agrotoacutexicos tecircm sido amplamente utilizados como uma das principais ferramentas para
um bom programa de controle de plantas daninhas em culturas que tecircm ganhado espaccedilo
na balanccedila comercial agriacutecola brasileira (Rodrigues amp Almeida 2005) O emprego dos
2
agrotoacutexicos tornou-se de uso rotineiro principalmente pelo menor custo e maior
eficiecircncia de controle das plantas daninhas quando comparados aos demais meacutetodos
convencionais de controle Para Rosa (1998) o modelo baseado no uso intensivo de
insumos quiacutemicos de sementes melhoradas e mecanizaccedilatildeo foi denominado ldquoRevoluccedilatildeo
Verderdquo que na deacutecada de 1980 trouxe ao Brasil um novo alento em relaccedilatildeo agrave
produtividade com grandes esperanccedilas de colheitas fartas e novas tecnologias que
propiciaram o domiacutenio de aacutereas pouco exploradas como por exemplo o cerrado da
Regiatildeo Centro-Oeste De fato muitas destas expectativas se realizaram entretanto o
impacto ambiental resultante implicou custos muitas vezes irremediaacuteveis como por
exemplo a perda de biodiversidade e a exaustatildeo de vaacuterios cursos drsquoaacutegua por
assoreamento aleacutem de contaminaccedilatildeo
12 Tipos de inseticidas
Os inseticidas satildeo classificados em quatro categorias conforme sua foacutermula
quiacutemica organoclorados carbamatos organofosforados e piretroides Os
organoclorados satildeo produtos sinteacuteticos que possuem carbono cloro e hidrogecircnio em sua
estrutura quiacutemica Satildeo persistentes no meio ambiente por vaacuterios anos e pouco soluacuteveis
em aacutegua Esses inseticidas quando mal administrados tecircm accedilatildeo toacutexica para diversos
mamiacuteferos sendo sua accedilatildeo natildeo sistecircmica neurotoacutexica e mutagecircnica (Guedes 1990
Pereira et al 2012) Os carbamatos satildeo inseticidas considerados menos persistentes e
com degradaccedilatildeo raacutepida no meio ambiente natildeo satildeo bioacumulados pouco lipofiacutelicos
satildeo sistecircmicos em plantas e inibidores da acetilcolinesterase (Guedes 1990 Ware
1994 Chatterjee et al 2001) Os organofosforados satildeo outro grupo de inseticida
amplamente utilizado no mercado mundial representando 355 do uso na uacuteltima
deacutecada Esses inseticidas caracterizam-se por pouca solubilidade em aacutegua (mais
soluacuteveis do que os organoclorados) toxicidade variaacutevel em animais vertebrados em
alguns animais e plantas tecircm atividade sistecircmica baixa persistecircncia no ambiente e
facilmente degradados por enzimas e fatores quiacutemicos A accedilatildeo desses toacutexicos eacute
semelhante ao carbamato agindo nas vias sinaacutepticas dos axocircnios inibindo a
acetilcolinesterase (Ware 1994 Albinati et al 2009) O piretroide tambeacutem eacute um
inseticida amplamente utilizado na agricultura representando 21 do mercado mundial
na uacuteltima deacutecada O fator positivo do uso desse pesticida eacute que ele eacute muito toacutexico para
insetos e apresenta baixa toxicidade para mamiacuteferos satildeo fotoestaacuteveis com degradaccedilatildeo
raacutepida no solo A accedilatildeo toacutexica desse inseticida eacute semelhante aos primeiros inseticidas
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desenvolvidos como o organoclorado DDT possuindo accedilatildeo neurotoacutexica nos axocircnios
(Naumann 1990 Ware 1994 Haverinen amp Vornanen 2014)
Nos uacuteltimos anos aumentou muito a diversidade de inseticidas visando a morte
de insetos e a persistecircncia do agrotoacutexico por periacuteodos curtos por questotildees de seguranccedila
ao meio ambiente Aleacutem desses inseticidas que foram mencionados acima existem
vaacuterios inseticidas organossinteacuteticos e inseticidas naturais de origem vegetal animal e
microbiana (Casida amp Quistad 1998 Ishaaya amp Horowitz 1998 Drevnick et al 2006)
13 Inseticidas no meio ambiente rotas de entrada
Os inseticidas podem entrar no meio ambiente acidental ou deliberadamente A
entrada acidental do inseticida origina-se de rejeitos industriais urbanos vazamentos
durante transporte armazenamento e distribuiccedilatildeo enquanto a entrada deliberada ocorre
pela aplicaccedilatildeo de inseticidas no meio rural e urbano As contaminaccedilotildees por agrotoacutexicos
podem contaminar solos e ateacute mesmo a atmosfera Nesse uacuteltimo a movimentaccedilatildeo do
toacutexico se daacute por meio de gotas partiacuteculas soacutelidas e gases que acabam sendo
transportados por longas distacircncias a partir do local de origem da aplicaccedilatildeo (Walker et
al 1996)
O transporte e destino dos agrotoacutexicos no ambiente aquaacutetico eacute ponto de
discussatildeo Murty (1988) descreveu que os agrotoacutexicos entram no ambiente aquaacutetico por
meio da aplicaccedilatildeo intencional implemento aeacutereo escoamento das aplicaccedilotildees ou
liberaccedilatildeo acidental A descarga dos resiacuteduos da manufatura de agrotoacutexicos constitui a
segunda maior fonte de contaminaccedilotildees dos corpos de aacutegua O efeito mais draacutestico eacute
esperado no ponto de liberaccedilatildeo em lagos e pequenos mares internos Os efeitos nos
oceanos eacute pequeno devido ao grande volume de aacutegua e accedilatildeo de correntes (Walker et al
1996)
Na rota de transporte bioloacutegico o sistema natildeo eacute muito importante em termos de
magnitude pela quantidade do xenobioacutetico acumulado quando comparado com fatores
mencionados acima (transporte abioacutetico) mas eacute importante para o homem e vida
silvestre O padratildeo do transporte bioloacutegico dos toacutexicos acumulados nos organismos
segue da seguinte forma herbiacutevoros carniacutevoros e pisciacutevoros (maior eficiecircncia de
acuacutemulo) Nesses uacuteltimos particularmente as espeacutecies de ambientes aquaacuteticos a
acumulaccedilatildeo e magnificaccedilatildeo satildeo maiores do que nas espeacutecies de ambiente terrestre
devido agrave lipofilicidade dos inseticidas particularmente os organoclorados Duas rotas de
entrada podem comprometer a toxicidade dos organismos aquaacuteticos absorccedilatildeo ou
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ingestatildeo A bioconcentraccedilatildeo vai ser mais intensa no ambiente aquaacutetico pois a difusatildeo
dos poluentes na aacutegua aumenta a eficiecircncia de sua absorccedilatildeo pelo organismo aquaacutetico
devido agrave lipofilicidade dos organoclorados Dessa forma a transferecircncia ao longo de
cadeias alimentares eacute tambeacutem mais eficiente e a bioconcentraccedilatildeo acontece em todas as
suas etapas Devido a isso os efeitos em predadores podem ser seacuterios pois aleacutem de
grande bioconcentraccedilatildeo e transferecircncia pela cadeia alimentar alguns destes organismos
como aves que se alimentam de peixes e animais marinhos como focas e cetaacuteceos satildeo
deficientes no metabolismo de desintoxicaccedilatildeo particularmente devido ao sistema de
monoxigenases pouco desenvolvido comprometendo mais a toxicidade por
biomagnificaccedilatildeo (Barron 1995 Borgaacute et al 2004)
Aleacutem da bioconcentraccedilatildeo os resiacuteduos destas substacircncias presentes nas aacuteguas
podem ser aderidos ao material orgacircnico em suspensatildeo depositar-se no sedimento ou
serem absorvidos pelos organismos Assim peixes e invertebrados podem bioacumular
tais compostos ligados agrave mateacuteria ingerida ser passivamente absorvidos pela superfiacutecie
corporal ou durante as trocas respiratoacuterias (Vasconcellos amp Verani 2000 Henry amp
Kishimba 2006)
14 Avaliaccedilatildeo de sensibilidade e estudos de toxicidade aquaacutetica
A realizaccedilatildeo de testes de sensibilidade eacute recomendada como meacutetodo de
qualidade dos planteis de organismos cultivados Nestes testes satildeo utilizadas
substacircncias de referecircncias que incluem principalmente os sais dicromato de potaacutessio
cloreto de potaacutessio e cloreto de soacutedio Estes dois uacuteltimos satildeo mais recomendados pois
seus efluentes experimentais oferecem baixo risco de contaminaccedilatildeo ambiental Os testes
de sensibilidade geralmente satildeo de curta duraccedilatildeo (24 horas) e devem ser repetidos com
frequumlecircncia principalmente nos laboratoacuterios que mantecircm planteis de organismos-testes
pois estes dados servem como padratildeo na sensibilidade natural dos organismos Esta
teacutecnica vem sendo utilizada para avaliar os resultados de toxicidade pois a accedilatildeo toacutexica
somente poderaacute ser atribuiacuteda agrave substacircncia teste quando a sensibilidade natural dos
organismos natildeo tiver demonstrado qualquer alteraccedilatildeo ao longo do periacuteodo em que
foram testados (Ranzani-Paiva et al 2004)
O estudo dos efeitos de agentes toacutexicos sobre a vida aquaacutetica pode ser realizado
por meio de ensaios bioloacutegicos na natureza ou em condiccedilotildees laboratoriais controladas
sendo este uacuteltimo os mais utilizados por permitirem um controle mais efetivo de fatores
ocasionais como temperatura pH duraccedilatildeo de exposiccedilatildeo meio concentraccedilatildeo Ao se
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avaliar a toxicidade de agentes toacutexicos ou misturas destes frente a um reativo bioloacutegico
geralmente se utiliza uma populaccedilatildeo homogecircnea possuindo uma sensibilidade definida
determinando-se a concentraccedilatildeo responsaacutevel por um efeito toacutexico (efeito letal subletal
crocircnico imobilizaccedilatildeo ou modificaccedilatildeo do comportamento entre outros) Estes testes
podem ser realizados utilizando-se sistemas de fluxo contiacutenuo semi estaacuteticos ou
estaacuteticos Quanto ao meio pode-se utilizar meio aquaacutetico do tipo aacutegua continental (aacutegua
dura rica em bicarbonatos e sulfatos dissolvidos ou aacutegua mole isenta de iacuteons caacutelcio e
magneacutesio) marinha ou salobra segundo as necessidades dos organismos avaliados
(CETESB 2008) Com relaccedilatildeo ao organismo-teste por razotildees teacutecnicas e econocircmicas eacute
impossiacutevel testar todas as espeacutecies que fazem parte do ecossistema aquaacutetico Assim
para esses estudos satildeo relacionados normalmente os organismos mais representativos
de cada niacutevel troacutefico na cadeia alimentar como algas microcrustaacuteceos e peixes
15 Caracterizaccedilatildeo do agrotoacutexico Thiodanreg
O endosulfan inseticida desenvolvido pela Hoechst Aktiengesellschaft na
Alemanha foi introduzido no mercado em 1957 com o nome comercial de Thiodan
(Goebel et al 1982 e Stumpf amp Abhaver 1986) O Thiodanreg eacute um inseticida acaricida
organoclorado do grupo quiacutemico eacutester do aacutecido sulfuroso de um diol ciacuteclico Esse
agrotoacutexico eacute classificado toxicologicamente como altamente toacutexico (Classe I)
classificaccedilatildeo ambiental como produto altamente perigoso aleacutem de inflamaacutevel e
corrosivo (Engelhardt amp Sarmento 2008)
O ingrediente ativo do Thiodanreg (350 gL de endosulfan) consiste na mistura de
dois isocircmeros sendo 70 de α-endosulfan e 30 de β-endosulfan Entre os produtos
derivados do metabolismo do endosulfan em mamiacuteferos o sulfato de endosulfan eacute o
principal metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica (Stumpf amp Abhaver 1986)
Os organoclorados como o Thiodanreg atuam nos canais de soacutedio do axocircnio
aumentando o periacuteodo de abertura destes canais O aumento do periacuteodo de abertura dos
canais de soacutedio leva a um aumento do fluxo de soacutedio para o interior da membrana e
acarretando um prolongamento da fase de despolarizaccedilatildeo apoacutes o pico do potencial de
accedilatildeo e devido a isso o inseto morre por hiperexcitaccedilatildeo Consequentemente a
propagaccedilatildeo contiacutenua do impulso nervoso gera tremores convulsotildees prostraccedilatildeo e
posteriormente a morte como observados em insetos Aleacutem disso pode afetar qualquer
tipo de crustaacuteceo peixes e mamiacuteferos inclusive em baixas concentraccedilotildees (Eto 1990
Pereira et al 2012)
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16 O uso do endosulfan
O endosulfan eacute o uacutenico inseticida organoclorado amplamente utilizado em todo
o mundo (Capkin et al 2006 Chakrabarty et al 2012) Segundo a empresa Bayer
(2010) fabricante do produto o Thiodanreg (endosulfan) eacute um inseticida para o controle
de insetos chupadores e mastigadores com accedilatildeo de contato e ingestatildeo Recomenda-se
seu uso especialmente em cultivos de cafeacute cana hortaliccedilas frutas vinhas e forragens
Adverte tambeacutem que natildeo se devem colher frutos ou vegetais tratados ateacute 21 dias apoacutes a
uacuteltima aplicaccedilatildeo
No Brasil segundo Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) a
importaccedilatildeo do endosulfan estaacute proibida a partir de julho de 2012 e sua utilizaccedilatildeo a partir
de 2013 (Molina 2010) A utilizaccedilatildeo de produtos agrave base de endosulfan no Brasil eacute
estimada em 44 milhotildees de toneladas em uma aacuterea de 22 a 36 milhotildees de hectares
podendo representar cerca de 40 do consumo mundial deste organoclorado segundo
dados do Programa Ambiental das Naccedilotildees Unidas (UNEP 2010) Segundo a Agecircncia
de Proteccedilatildeo Ambiental norte americana (EPA 1980) contaminaccedilotildees humanas por
endosulfan satildeo provenientes em 53 dos casos da ingestatildeo de aacutegua contaminada e em
47 dos casos do consumo de alimentos a base de peixes contaminados A mesma
agecircncia define como CL50 aguda valores de 017microgL-1 para truta arco-iacuteris e 740microgL-1
para Daphnia magna
A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em
consideraccedilatildeo a qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente
Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm 3572007 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo
do referido inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
17 Toxicidade aguda do endosulfan
O endosulfan apesar de pertencer agrave classe toxicoloacutegica I eacute altamente toacutexico
para animais aquaacuteticos e terrestres (espeacutecies natildeo alvo) e segundo a Agency for Toxic
Substances and Disease Registry - ATSDR (2000) possui de moderado a alto risco e
efeitos agudos e crocircnicos
Pinheiro et al (1998) advertem com veemecircncia sobre o perigo de contaminaccedilatildeo
do Pantanal e da Amazocircnia lugares ricos em recursos hiacutedricos por produtos agrave base de
endosulfan pois este produto eacute extremamente toacutexico para peixes e outros organismos
aquaacuteticos mesmo em doses muito pequenas O endosulfan natildeo dissolve facilmente na
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aacutegua e adere agraves partiacuteculas do solo levando anos para sua degradaccedilatildeo (Soares et al
2003)
18 Efeitos dos inseticidas organoclorados sobre peixes
Apesar dos mecanismos de toxicidade do endosulfan serem extensivamente
estudados alguns trabalhos foram conduzidos com o objetivo de se avaliar efeitos
histopatoloacutegicos dos agrotoacutexicos em peixes (Naqvi amp Vaishnavi 1993) especialmente
nas gocircnadas fiacutegados bracircnquias e rins Em um desses estudos Capkin et al (2006)
reportaram uma CL50 de 1978 gL para Oreochromis mikyss para 24 horas de
exposiccedilatildeo ao toacutexico o que causou aleacutem da morte de 50 dos animais convulsotildees nado
erraacutetico edema e separaccedilatildeo das lacircminas branquiais edema e necrose do fiacutegado dos
tuacutebulos renais e do tecido hematopoieacutetico Cengiz et al (2001) reportaram lesotildees
similares em bracircnquias do peixe-mosquito Gambusia affinis aleacutem de congestatildeo e
hipertrofia do fiacutegado com o uso do pesticida Thiodanreg Segundo Capkin et al (2006)
alcalinidade e temperatura da aacutegua aleacutem do tamanho dos peixes afetam a toxicidade do
endosulfan Assim peixes pequenos e meacutedios mantidos em temperatura de 131ordmC com
1978 microgL do toacutexico tiveram uma sobrevivecircncia de 25 e 425 respectivamente
enquanto os peixes grandes tiveram 100 de sobrevivecircncia Quando a temperatura da
aacutegua foi aumentada para 16ordmC nenhum dos peixes pequenos e meacutedios sobreviveu
enquanto os sobreviventes de peixes grandes diminuiacuteram para 775 O aumento da
alcalinidade de 198 mgL para 419 mgL ou superior aumentou (Plt0001) a
sobrevivecircncia dos peixes Em relaccedilatildeo agrave dureza entre 357 mgL e 126 mgL a
sobrevivecircncia dos peixes expostos ao endosulfan natildeo foi afetada Histologicamente as
bracircnquias dos peixes tiveram edema lamelar separaccedilatildeo do epiteacutelio das lamelas fusatildeo
lamelar e hipertrofia das ceacutelulas epiteliais Os fiacutegados apresentaram edemas e necroses
graves
Cengiz amp Uumlnluuml (2002) estudaram os efeitos crocircnicos do endosulfan sob as
bracircnquias nas concentraccedilotildees de 05 e 075 microgL ao longo de 30 dias de experimento O
que se comprovou eacute que a dose mais elevada do endosulfan causou mais mudanccedilas
patoloacutegicas que a menor dose Altinok amp Capkin (2007) natildeo verificaram alteraccedilatildeo
morfoloacutegica nas bracircnquias de truta com 21 dias de exposiccedilatildeo de metiocarb entretanto
uma concentraccedilatildeo superior (375 mgL) causou separaccedilatildeo epitelial das bracircnquias No
mesmo trabalho os peixes expostos ao endosulfan com concentraccedilotildees de 06 e 13 microgL
mostraram mudanccedilas morfoloacutegicas nas bracircnquias como desprendimento do epiteacutelio
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aparecimento de granuloacutecitos nas lamelas fusatildeo e necrose lamelar hipertrofia e nuacutecleos
picnoacuteticos Essas evidecircncias comprovam o efeito do endosulfan com comprometimento
das bracircnquias levando a reduccedilatildeo do consumo de oxigecircnio e desregulaccedilatildeo da funccedilatildeo de
osmorregulaccedilatildeo em organismos aquaacuteticos Aleacutem disso os efeitos toacutexicos do endosulfan
no fiacutegado induziram modificaccedilotildees estruturais como hipertrofia dos hepatoacutecitos nuacutecleos
picnoacuteticos e necroses
No trabalho de Ballesteros et al (2007) que utilizaram peixes adultos da espeacutecie
Jenynsia multidentata os testes de toxicidade foram realizados durante 96 horas a fim
de determinar a concentraccedilatildeo letal (CL50) do endosulfan As alteraccedilotildees histoloacutegicas
foram determinadas nas bracircnquias e nos fiacutegados A CL50-96 horas foi significativamente
diferentes entre machos (0719 μgL) e fecircmeas (1317 μgL) A diferenccedila entre os sexos
foi atribuiacuteda ao dimorfismo no teor de lipiacutedios no sexo feminino (216) e masculino
(179) As alteraccedilotildees histoloacutegicas nas bracircnquias incluiacuteram hipertrofia e levantamento
do epiteacutelio das lamelas secundaacuterias e aneurismas Essas alteraccedilotildees causaram um
aumento significativo da espessura da lamela secundaacuteria no grupo tratado em relaccedilatildeo
aos peixes do grupo-controle Finalmente as alteraccedilotildees histoloacutegicas reversiacuteveis como
degeneraccedilatildeo hidroacutepica e dilataccedilotildees dos sinusoides foram observadas nos fiacutegados dos
peixes expostos bem como mudanccedila irreversiacutevel como necrose nas concentraccedilotildees
mais elevadas O fiacutegado eacute um oacutergatildeo importante na capacidade de degradar compostos
toacutexicos mas os seus mecanismos de regulaccedilatildeo podem ser comprometidos em
concentraccedilotildees elevadas causando mudanccedilas estruturais como observadas nesses
trabalhos
A qualidade da aacutegua eacute um fator importante para o sucesso da reproduccedilatildeo dos
peixes Quando a qualidade da aacutegua eacute alterada devido a produtos quiacutemicos a estrutura
histoloacutegica das gocircnadas tambeacutem eacute alterada Para Cengiz et al (2001) os efeitos do
Thiodanreg (endosulfan) satildeo tempo e dose dependentes Dutta et al (2006) descreveram
num estudo de toxicidade crocircnica as injuacuterias causadas pelo Thiodanreg sobre os tuacutebulos
seminiacuteferos do peixe ldquobluegillrdquo Lepomis macrochirus e relataram alteraccedilatildeo dos tuacutebulos
seminiacuteferos que mostraram perda dos padrotildees normais de organizaccedilatildeo celular
diminuindo tambeacutem o diacircmetro das espermatogocircnias primaacuterias gradativamente desde as
primeiras 24 horas de exposiccedilatildeo ateacute as duas semanas seguintes Segundo os autores este
tipo de dano pode afetar as espermaacutetides e os espermatozoides apresentando no final
um impacto negativo na espermatogecircnese e fertilidade do macho comprometendo o
nuacutemero da populaccedilatildeo do ldquobluegillrdquo Lepomis macrochirus Em outro trabalho sobre
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reproduccedilatildeo Hazarika amp Das (1998) identificaram mudanccedilas estruturais nos ovaacuterios de
Heteropneustes fossilis exposto ao organoclorado lindano por 72 horas Os resultados
demonstraram que houve ruptura e diminuiccedilatildeo do tamanho dos foliacuteculos maduros
afetando a fertilidade dos peixes
19 O lambari Astyanax bimaculatus
O lambari Astyanax bimaculatus (Linnaeus 1758) eacute conhecido popularmente
pelos nomes de lambari piaba lambari-guaccedilu mojarra pertence agrave famiacutelia Characidae
ordem Characiformes e ateacute entatildeo uma das espeacutecies da subfamiacutelia Tetragonopterinae
(CEMIGCETEC 2000) No entanto revisotildees recentes colocam o gecircnero em ldquoIncertae
sedisrdquo com 88 gecircneros e 620 espeacutecies sendo que 86 espeacutecies pertencem ao gecircnero
Astyanax (Lima et al 2003)
O A bimaculatus eacute um peixe de pequeno porte atingindo aproximadamente 20
cm de comprimento e pesando ateacute 40 gramas Possui corpo irregularmente eliacuteptico com
nadadeiras amarelas quatro a cinco dentes na seacuterie externa e cinco na seacuterie interna do
preacute-maxilar escamas com reflexos prateados mancha umeral ovalada e peduacutenculo
caudal com mancha alongada que se prolonga ateacute a ponta dos raios caudais medianos
(Britiski et al 1988 CEMIGCETEC 2000)
O gecircnero Astyanax possui ampla distribuiccedilatildeo geograacutefica sendo encontrado
desde o sudoeste dos Estados Unidos ateacute a Bacia do rio da Prata (Moreira Filho 1989
citado por Pereira Filho 2000) Os lambaris satildeo encontrados em cabeceiras de riachos
rios e lagos e vivem sempre em cardumes realizando curtas migraccedilotildees na eacutepoca das
cheias para sua reproduccedilatildeo Em relaccedilatildeo ao periacuteodo reprodutivo dos lambaris este pode
variar conforme a espeacutecie e o habitat sendo normalmente de setembro a marccedilo
(Vazzoler amp Menezes 1992 citados por Pereira Filho 2000)
A biologia reprodutiva do lambari pode ser prejudicada pelo desmatamento
ciliar poluiccedilatildeo industrial e domeacutestica e destruiccedilatildeo de vaacuterzeas e lagoas marginais por
projetos agriacutecolas que tambeacutem constituem ameaccedila em vaacuterias regiotildees (CEMIGCETEC
2000) Esses fatores interferem na dinacircmica da populaccedilatildeo desses peixes
Os lambaris satildeo oniacutevoros se alimentando de algas vegetais sementes larvas e
insetos adultos (CEMIGCETEC 2000) Os lambaris satildeo de extrema importacircncia em
diversos habitats por equilibrarem o ecossistema e a cadeia alimentar constituindo fonte
de alimentos para peixes maiores espeacutecies carniacutevoras e aves Em estudo conduzido com
o lambari da espeacutecie Astyanax janeiroensis verificaram-se que os principais haacutebitos
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alimentares se baseavam em algas microcrustaacuteceos pequenos invertebrados e esporos
vegetais (Santin et al 2005) Diversos trabalhos relatam na literatura a importacircncia do
lambari na estrutura troacutefica do ecossistema e sua variaccedilatildeo alimentar diante de
modificaccedilotildees ambientais (Motta amp Uieda 1995 Suarez et al 1995 Esteves 1998)
Trabalho conduzido por Loureiro et al (1995) verificando a dieta alimentar na espeacutecie
Hoplias malabaricus (traiacutera) no reservatoacuterio da UHE de Segredo (PR) mostraram a
ingestatildeo alimentar preferencial de lambaris de diversas espeacutecies Em outro estudo
verificou-se a importacircncia do lambari como alimento para as espeacutecies Hoplias
malabaricus Oligosarcus longirostris e Rhamdia branneri apoacutes o represamento do
Reservatoacuterio de Salto Caxias (PR) demonstrando ser o alimento preferido dessas
espeacutecies (Novakoski 2007) Aleacutem disso na regiatildeo sudoeste do estado de Minas Gerais
existem representantes do gecircnero no Reservatoacuterio de Furnas (MG) caracterizando a
reproduccedilatildeo ao longo do ano para o equiliacutebrio da cadeia alimentar tendo importacircncia
econocircmica na alimentaccedilatildeo e tambeacutem na praacutetica de pesca profissional (Bazzoli et al
1998 Carvalho et al 2009) Portanto os lambaris satildeo de grande importacircncia em
diversos habitats como consumidores secundaacuterios (Esteves 1998) A ecologia alimentar
de uma determinada espeacutecie faz parte e interfere diretamente na dinacircmica de sua
populaccedilatildeo sendo primordial para a conservaccedilatildeo do ecossistema como um todo (Vitule
amp Aranha 2002)
110 Morfologia hepaacutetica em teleoacutesteos
O fiacutegado eacute um oacutergatildeo multifuncional responsaacutevel por uma das etapas do
processo de desenvolvimento folicular principalmente no periacuteodo de formaccedilatildeo dos
gloacutebulos de vitelo momento em que ocorre a transferecircncia de vitelogenina para o
ovaacuterio etapa fisioloacutegica que inicia nas ceacutelulas da teca e ceacutelulas foliculares com
produccedilatildeo do estradiol No fiacutegado o estradiol estimula os hepatoacutecitos a produzirem a
vitelogenina e careogenina que satildeo levadas pela corrente sanguiacutenea ateacute o ovaacuterio onde
participam da formaccedilatildeo do vitelo e zona radiata durante a maturaccedilatildeo folicular
(Senthilkumaran et al 2004) A produccedilatildeo de vitelogenina no fiacutegado pode variar entre as
espeacutecies de teleoacutesteos devido agraves diferenccedilas na capacidade de armazenamento de energia
condiccedilatildeo fisioloacutegica haacutebitos alimentares e contaminaccedilatildeo (Peyon et al 1996 Hull amp
Harvey 2001 Al -Ghais 2013 Silva Barni et al 2014) Aleacutem disso o fiacutegado eacute
responsaacutevel pela conversatildeo do alimento e desintoxicaccedilatildeo de substacircncias estranhas
(Selman amp Walace 1989 Ribeiro et al 2006)
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O fiacutegado eacute glacircndula digestiva que apresenta superfiacutecie
coberta por uma membrana serosa e o tecido conjuntivo de sua caacutepsula
invagina para o parecircnquima (Takashima amp Hibiya 1995) O fiacutegado de teleoacutesteos eacute
constituiacutedo por hepatoacutecitos ceacutelulas epiteliais dos ductos biliares ceacutelulas endoteliais
ceacutelulas que armazenam gordura (ceacutelulas de Ito) macroacutefagos e ceacutelulas sanguiacuteneas
circulantes (Hinton et al 1984) e em algumas espeacutecies observam-se ceacutelulas do
pacircncreas exoacutecrino (pacircncreas intra-hepaacutetico) distribuiacutedas entre o parecircnquima do oacutergatildeo
assim como descrito para o lambari (Santos et al 2013)
Estruturas lobulares e uma pequena veia central estatildeo presentes em vertebrados
em peixes estas estruturas variam dependendo da espeacutecie e satildeo geralmente obscuras
(Takashima amp Hibyia 1995) Os hepatoacutecitos arranjam-se em fileiras os quais
geralmente apresentam a espessura de duas ceacutelulas O hepatoacutecito possui um nuacutecleo
uacutenico embora ceacutelulas binucleadas possam ser observadas O nuacutecleo se localiza na
regiatildeo central ou no poacutelo celular voltado para o sinusoide e o nucleacuteolo eacute bem evidente
(Arana 1995) A circulaccedilatildeo no fiacutegado eacute realizada pela arteacuteria hepaacutetica veia porta aleacutem
de capilares sinusoides Existem cordotildees de hepatoacutecitos que se arranjam
concentricamente ao redor dos capilares sinusoides (Takashima amp Hibyia 1995)
As vias biliares satildeo formadas por canaliacuteculos biliares preacute-duacutectulo biliar duacutectulo
biliar e ducto biliar O canaliacuteculo biliar eacute formado pela membrana plasmaacutetica dos
hepatoacutecitos e os microvilos dos mesmos preenchem o luacutemen do canaliacuteculo Nos
hepatoacutecitos existem ceacutelulas preacute-ductulares que estabelecem complexos juncionais com
os hepatoacutecitos formando os preacute-duacutectulos biliares A transiccedilatildeo entre preacute-duacutectulo e
duacutectulo ocorre quando o lume biliar estaacute completamente circundado por ceacutelulas
epiteliais biliares O ducto biliar eacute formado por ceacutelulas epiteliais cuacutebicas nos ductos de
menor calibre e ceacutelulas colunares nos grandes ductos sendo a presenccedila de lacircmina basal
o fator diferenciador dos mesmos Nos grandes ductos circundando a lacircmina basal
estatildeo fibroblastos plexo capilar fibras nervosas e ceacutelulas musculares lisas Acredita-se
que estas ceacutelulas musculares promovam os movimentos peristaacutelticos impulsionando a
bile Esse ducto une-se ao ducto ciacutestico dando origem ao ducto coleacutedoco (Arana 1995)
O endoteacutelio eacute fenestrado e a lacircmina basal estaacute ausente No espaccedilo de Disse haacute
ceacutelulas de Ito que em teleoacutesteos se caracterizam por apresentar vesiacuteculas lipiacutedicas
assim como o mesmo tipo celular em mamiacuteferos (Arana 1995) Haacute algumas mudanccedilas
patoloacutegicas que podem ocorrer no fiacutegado de peixes que sofreram exposiccedilatildeo a toacutexicos ou
outras substacircncias irritantes dissolvidas na aacutegua A atrofia eacute caracterizada por
12
diminuiccedilatildeo do tamanho dos hepatoacutecitos com presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos Tambeacutem
podem ocorrer necrose degeneraccedilatildeo vacuolar degeneraccedilatildeo gordurosa estagnaccedilatildeo da
bile inflamaccedilatildeo do parecircnquima hepaacutetico (hepatites) cirrose hepaacutetica e
desenvolvimentos de tumores (Takashima amp Hibyia 1995)
111 Morfologia ovariana em teleoacutesteos
Os ovaacuterios das fecircmeas A bimaculatus seguem os padrotildees descritos para a
maioria dos teleoacutesteos sendo oacutergatildeos pares alongados e foliaacuteceos sofrendo
modificaccedilotildees na espessura volume e coloraccedilatildeo durante as diferentes fases do ciclo
reprodutivo conforme observado tambeacutem em outras espeacutecies do gecircnero (Drummond
1996 Miranda 1996 Melo et al 2005 Mazzoni et al 2005 Rodrigues amp Almeida
2005 Carvalho et al 2009 Prado et al 2011) Nesses peixes o ovaacuterio eacute do tipo
cistovariano onde o lume ovariano se estende ateacute o oviduto como na maioria dos
peixes teleoacutesteos (Nagahama 1983 Selman amp Wallace 1986 Connaughton amp Aida
1998)
Nas observaccedilotildees histoloacutegicas do ovaacuterio de A bimaculatus verificou-se que os
mesmos satildeo envolvidos externamente por uma serosa peritoneal constituiacuteda por
mesoteacutelio e lacircmina do tecido conjuntivo fibroso Profundamente a essa estrutura
observa-se tuacutenica albugiacutenea de natureza conjuntiva contendo fibroacutecitos e vasos
sanguiacuteneos A tuacutenica albugiacutenea emite septos para o interior do oacutergatildeo formando lamelas
ovuliacutegeras nas quais encontram-se ovogocircnias e foliacuteculos em diferentes fases de
desenvolvimento No lambari o tipo de desenvolvimento folicular eacute assincrocircnico com
a presenccedila de foliacuteculos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento (Miranda 1996
Drummmond 1996 Marcon 2008)
Em peixes o desenvolvimento folicular tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Begovac amp Wallace 1988 Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter
1996 Grier 2000 e 2002 Carvalho et al 2009) e como nos animais em geral
compreende os periacuteodos preacute-meioacutetico perinucleolar preacute-vitelogecircnico vitelogecircnico e
maturaccedilatildeo final Os foliacuteculos passam por diversas fases de desenvolvimento
diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo de acordo com o periacuteodo reprodutivo do animal (Wallace amp
Selman 1981) Essas fases ocorrem no interior de foliacuteculos cuja parede constituiacuteda de
zona radiata camada folicular membrana basal e teca (Grier 2000) desempenham um
importante papel durante a ovogecircnese e na fertilizaccedilatildeo
13
A foliculogecircnse eacute regulada hormonalmente pelo eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-
gocircnada Em peixes teleoacutesteos estiacutemulos ambientais satildeo convertidos em informaccedilotildees
sensoriais no ceacuterebro associados com a liberaccedilatildeo de hormocircnios liberadores de
gonadotropinas (GnRH) pelo hipotaacutelamo que via corrente sanguiacutenea chegam agrave
adenohipoacutefise que sintetiza e libera hormocircnios gonodotroacutepicos hormocircnio fociacuteculo
estimulante (FSH) e hormocircnio luteinizante (LH) Os hormocircnios FSH e LH se ligam aos
receptores celulares das ceacutelulas tecais (LH-R) e foliculares (LH-R e FSH-R) para
estimularem a produccedilatildeo 17α-hydroxy-pregnesterona (17α-HP) e testosterona (T) Nas
ceacutelulas foliculares os hormocircnios esteroides 17α-HP e T agem como precursor na
produccedilatildeo do 17β-estradiol (17β-E) e do hormocircnio indutor de maturaccedilatildeo (MIH)
substacircncias importantes nas etapas do desenvolvimento folicular e na ovulaccedilatildeo
respectivamente (Dietrich amp Krieger 2009) (Figura 1)
Figura 1 Ceacutelulas somaacuteticas do ovaacuterio e principais produtos (Adaptado de Dietrich amp Krieger 2009)
Muitas das espeacutecies nativas natildeo desovam espontaneamente em ambientes
lecircnticos Algumas espeacutecies nativas quando mantidas em cativeiro se preparam para a
reproduccedilatildeo mas natildeo desovam naturalmente e sofrem regressatildeo ovariana com
consequente atresia dos foliacuteculos A atresia folicular eacute um processo degenerativo de
ocorrecircncia comum nos ovaacuterios de vertebrados e os foliacuteculos podem sofrer atresia em
diferentes fases do desenvolvimento ou diferenciaccedilatildeo (Guraya 1986 Miranda et al
1999 Santos et al 2008b)
A ovulaccedilatildeo refere-se agrave expulsatildeo do foliacuteculo em desenvolvimento maduro
(Redding amp Patintildeo 1993) Na natureza a ovulaccedilatildeo eacute regulada por dois hormocircnios os
quais estimulam o desenvolvimento gonadal em peixes FSH e LH (Connaughton amp
Aida 1998 Klausen et al 2001) Estes hormocircnios gonadotroacutepicos agem nos oacutergatildeos
reprodutores promovendo o desenvolvimento e maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas O
14
processo de transporte dos hormocircnios para as ceacutelulas reprodutoras eacute lento em ambientes
naturais mas na reproduccedilatildeo artificial com a teacutecnica de hipofisaccedilatildeo esse processo
torna-se mais raacutepido em relaccedilatildeo ao processo natural (Woynarovich amp Horvath 1980)
Nos ovaacuterios de peixes teleoacutesteos com fertilizaccedilatildeo externa os foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios estruturas remanescentes da desova satildeo frequentes Um aspecto
interessante eacute saber a duraccedilatildeo da reabsorccedilatildeo dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios nos
procedimentos de desova induzida para as espeacutecies em criaccedilatildeo Drummond (1996) e
Marcon (2008) estudaram a reabsorccedilatildeo dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios no estroma
ovariano em maturaccedilatildeo avanccedilada de lambaris (A bimaculatus lacustris) e observaram
que cinco dias apoacutes a desova os foliacuteculos haviam sido reabsorvidos Durante esse
processo figuras de apoptose satildeo observadas em fecircmeas submetidas agrave hipofisaccedilatildeo
(Drummond et al 2000) o mesmo ocorrendo em Leporinus taeniatus (Anostomidae)
(Santos et al 2003) Santos et al (2008a) registraram por meio das teacutecnicas de TUNEL
e de imunoistoquiacutemica o iacutendice apoptoacutetico em ceacutelulas foliculares dos foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios em Prochilodus argenteus notando que o maior iacutendice de ceacutelulas
foliculares apoptoacuteticas coincidiu com menores valores de integrinas e colaacutegeno tipo IV
no terceiro dia apoacutes a desova induzida Esses achados demonstram a importacircncia dessas
proteiacutenas na integridade das ceacutelulas foliculares nos foliacuteculos
15
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do inseticida organoclorado
endosulfan em sua apresentaccedilatildeo comercial Thiodanreg sobre as caracteriacutesticas
morfoloacutegicas dos ovaacuterios e fiacutegado de fecircmeas adultas de lambaris A bimaculatus apoacutes
exposiccedilatildeo subletal a esse agrotoacutexico durante a maturaccedilatildeo avanccedilada
22 Objetivos especiacuteficos
Estimar a CL50 para fecircmeas adultas de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada
expostas ao inseticida organoclorado Thiodanreg
Avaliar histopatologicamente o fiacutegado dos animais dos grupos controles e tratados
Analisar por morfometria os principais constituintes celulares do fiacutegado nos grupos
controles e tratados
Avaliar diferenccedilas nos valores dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS) e
hepatossomaacutetico (IHS) de animais dos grupos controles e expostos ao toacutexico
Verificar provaacuteveis alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos diferentes estaacutedios de
desenvolvimento de foliacuteculos ovarianos nos grupos submetidos aos efeitos do
toacutexico utilizando-se microscopia de luz
Quantificar os diferentes tipos de foliacuteculos e avaliar por morfometria os diacircmetros
dos foliacuteculos vitelogecircnicos nos grupos controles e tratados
Avaliar e quantificar o processo de atresia folicular nos grupos controles
comparando-os com os grupos tratados
Analisar qualitativamente por imunoistoquiacutemica as proteiacutenas de adesatildeo celular
(integrina β1 e colaacutegeno do tipo IV) nas ceacutelulas foliculares ao longo do
desenvolvimento folicular nos peixes dos grupos controles e tratados e
16
Analisar qualitativamente por imunoistoquiacutemica a proteiacutena caspase 3 nas ceacutelulas
foliculares ao longo do desenvolvimento folicular nos peixes dos grupos controles e
tratados
17
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade Federal
de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste de toxicidade aguda e o teste subletal quanto
as atividades de coleta fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos fiacutegados As etapas de
microtomia coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e
morfomeacutetricas foram realizadas nos Laboratoacuterios de Peixes e de Histopatologia do
Departamento de Veterinaacuteria da UFV (DVTUFV)
31 Animais
Foram utilizadas fecircmeas do lambari A bimaculatus mantidas em tanques de terra
na Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso (g) de 1152 plusmn 201 e comprimento total (cm)
de 912 plusmn 064 As caracteriacutesticas para a escolha dos animais se basearam em aspectos
corporais como ventre abaulado poro genital dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV Os
aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuem capacidade de 50 litros numa
densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro
temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam
um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo contiacutenua de aacutegua para garantir o bem-estar
dos peixes (Figura 2) Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial Purina
contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas de
acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de 255
plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza total
2815 plusmn 594 mgL-1 (CaCO3)
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
18
Figura 2 Principais componentes estruturais dos grupos experimentais (Adaptado de Oliveira Ribeiro et al 2002)
A Bomba para oxigenaccedilatildeo da aacutegua B Termostato para controle da temperatura D Filtro interno L Material contra isolamento de ruiacutedo H-J Trecircs aquaacuterios para cada grupo experimental (Controle e e cada uma das concentraccedilotildees de Thiodanreg )
Os lotes de peixes (120 peixes em cada lote) foram destinados agrave accedilatildeo do toacutexico em
quatro tratamentos diferentes
Experimentos Tratamentos Experimento 1 sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo Experimento 2 sem aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo Experimento 3 com aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo
Experimento 4 com aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo
O periacuteodo de 10 dias para aclimataccedilatildeo dos peixes foi para permitir que as
caracteriacutesticas ovarianas sejam comparadas com os grupos que natildeo foram aclimatados
Dessa forma mostraraacute quais as melhores condiccedilotildees que esses peixes podem ter na
reproduccedilatildeo quando expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
32 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente experimento foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo com 350gL de endosulfan
33 Teste de toxicidade aguda em sistema estaacutetico ndash CL50
A definiccedilatildeo das concentraccedilotildees toacutexicas a serem testadas nem sempre ocorre de
maneira simples Muitas vezes faz-se necessaacuterio uma anaacutelise preliminar para a
definiccedilatildeo da melhor faixa de concentraccedilatildeo a ser considerada nos testes definitivos
Dessa forma a primeira providecircncia desse estudo de toxidade aguda eacute a realizaccedilatildeo de
testes preliminares que devem ser conduzidos com concentraccedilotildees toacutexicas relacionadas
entre si por progressotildees geomeacutetricas de razatildeo 10 calculadas com base em informaccedilotildees
19
obtidas por meio de testes jaacute realizados com outros organismos que mais se assemelham
filogeneticamente ao grupo em questatildeo (Ranzani-Paiva 2004) A partir dos resultados
obtidos nessa fase eacute possiacutevel estabelecer a faixa ideal de concentraccedilatildeo para conduccedilatildeo
dos testes definitivos com o lambari
O teste de concentraccedilatildeo letal (CL50) que avalia a concentraccedilatildeo responsaacutevel pela
mortalidade de metade dos animais foi realizado em sistema de aacutegua estaacutetico de acordo
NBR 15088 (ABNT 2007) com os animais mantidos sob restriccedilatildeo alimentar que se
iniciou 24 horas antes do iniacutecio e perdurou durante o teste Essa restriccedilatildeo alimentar foi
realizada para evitar acuacutemulo de mateacuteria orgacircnica que poderia interferir na accedilatildeo do
agrotoacutexico
Para o teste foram selecionados 120 lambaris fecircmeas adultas em maturaccedilatildeo
avanccedilada com aproximadamente 7cm de comprimento O agrotoacutexico utilizado foi o
Thiodanreg (Bayer) com 350gL-1 de endosulfan Foram utilizadas trecircs repeticcedilotildees com
cinco peixes cada para cada concentraccedilatildeo de Thiodanreg adotada sendo os grupos assim
classificados controle (0microgL-1) 15microgL-1 30microgL-1 60microgL-1 120microgL-1 240microgL-
1 480microgL-1 e 960microgL-1 As concentraccedilotildees foram distribuiacutedas em recipientes plaacutesticos
com 15L de aacutegua dos proacuteprios aquaacuterios (Figura 3) Para obter as diferentes
concentraccedilotildees o Thiodanreg foi diluiacutedo uma primeira vez 1100 (Soluccedilatildeo Padratildeo
Intermediaacuteria contendo 3500mgL-1 de endosulfan) e uma segunda vez 1100 (Soluccedilatildeo
Padratildeo Final contendo 35000microgL-1 de endosulfan) viabilizando a observaccedilatildeo da
toxicidade total do agrotoacutexico e natildeo apenas do princiacutepio ativo (Figura 4)
Figura 3 Recipiente utilizado e distribuiccedilatildeo das concentraccedilotildees
20
Figura 4 Preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo padratildeo final do Thiodanreg
Foram feitas as verificaccedilotildees de mortalidade a cada seis horas (zero 6 12 18 24
30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 e 96 horas) removendo-se os animais mortos o
que proporcionou menores interferecircncias pela decomposiccedilatildeo dos peixes gerando maior
confianccedila da mortalidade apresentada ser em funccedilatildeo da toxicidade do princiacutepio ativo
endosulfan sinergicamente agrave accedilatildeo dos solventes e demais compostos do inseticida Para
acompanhamento da temperatura foi adicionado 15L de aacutegua do mesmo aquaacuterio em
um recipiente idecircntico de forma que qualquer variaccedilatildeo na temperatura pudesse ser
medida sem provocar estresse adicional a nenhum grupo O teste teve iniacutecio no dia
16012010 agraves 1000 horas com teacutermino agraves 1000 horas do dia 20012010 O programa
utilizado para o caacutelculo da CL50 foi o TOXCALC determinando o valor e o intervalo de
confianccedila pelo meacutetodo PROBITUS (Plt005)
34 Teste de toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Depois de estimar a CL50 pelos testes preliminares foi realizada aclimataccedilatildeo de
novos lambaris como descrito no item 31 (Figura 2) onde os peixes se acostumaram
ao seu novo meio e agraves atividades normais de manutenccedilatildeo como alimentaccedilatildeo e limpeza
dos aquaacuterios O teste de toxicidade aguda com o endosulfan foi realizado baseando-se
principalmente nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo com a
NBR 15088 (ABNT 2007)
O teste de toxicidade subletal foi feito com trecircs diferentes dosagens do toacutexico
inferiores agrave CL50 e para fins estatiacutesticos cada concentraccedilatildeo incluindo-se o grupo
controle teve trecircs repeticcedilotildees sob as mesmas condiccedilotildees para depois se avaliar e
Thiodanreg
Soluccedilatildeo padratildeo
intermediaacuteria
(1100)
Soluccedilatildeo
padratildeo final
(1100)
3500mgL de soluccedilatildeo padratildeo
intermediaacuteria 35000 microgL de
soluccedilatildeo padratildeo
final
21
quantificar a mortalidade se for o caso observar o comportamento dos animais que
sobreviveram agrave intoxicaccedilatildeo e os efeitos morfoloacutegicos nos fiacutegados e ovaacuterios dos peixes
expostos Assim como foram trecircs repeticcedilotildees usando-se trecircs diferentes concentraccedilotildees do
toacutexico e um grupo controle para a realizaccedilatildeo do presente experimento foram
necessaacuterias 120 fecircmeas de lambari para cada experimento (Tabela 1)
Tabela 1 Distribuiccedilatildeo das fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus em cada grupo experimental
Repeticcedilatildeo Controle 115microgl 23microgl 56microgl A 10 10 10 10 B 10 10 10 10 C 10 10 10 10
Para cada peixe que sobreviveu agrave intoxicaccedilatildeo pelo periacuteodo de 96 horas (teste de
toxicidade subletal) foram obtidos dados biomeacutetricos como peso corporal comprimento
total e comprimento-padratildeo peso do fiacutegado e peso do ovaacuterio Os ovaacuterios e fiacutegados na
sequecircncia foram fixados para posterior anaacutelise histoloacutegica
35 Avaliaccedilatildeo morfoloacutegica
351 Microscopia de luz
Apoacutes 96 horas de experimento seis animais de cada grupo foram coletados
anestesiados com benzocaiacutena e eutanasiados para coleta dos ovaacuterios e fiacutegados Para o
estudo das caracteriacutesticas morfoloacutegicas de ovaacuterios e fiacutegados os fragmentos foram
fixados em paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo fosfato 01M pH 72 O material foi
fixado por um periacuteodo miacutenimo de 24 horas e preservado em aacutelcool 70 Em seguida os
fragmentos foram transferidos para soluccedilatildeo de aacutelcool 95 por quatro horas Apoacutes isso
os fragmentos de ovaacuterios e fiacutegados foram imersos em soluccedilatildeo de aacutelcool 95 e resina
glicolmetacrilato (Leica Historesin) na proporccedilatildeo de 11 por 12 horas seguida de resina
pura por 24 horas e posterior emblocamento Os fragmentos foram seccionados em
cortes com 3microm de espessura em microacutetomo rotativo com navalha de vidro Foi
preparada uma lacircmina por animal com quatro cortes em cada e em padratildeo semi-seriado
ou seja a cada corte aproveitado eram descartados cinco cortes seguintes para evitar que
a mesma ceacutelula fosse contada duas vezes no momento da anaacutelise baseando-se no
diacircmetro nuclear previamente estabelecido para cada tipo celular em questatildeo
22
As coloraccedilotildees utilizadas foram azul de toluidina e hematoxilinaeosina para
anaacutelises histotoloacutegicas e para morfometria Tambeacutem foi utilizada a reaccedilatildeo histoquiacutemica
com PAS contracorados com hematoxilina para os cortes de fiacutegados As lacircminas foram
montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e
as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
352 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos fiacutegados
Os estudos morfoloacutegicos foram conduzidos em seis animais por concentraccedilatildeo
As lacircminas histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo e fotografadas (ocular
de 10X e objetiva de 40X) em 10 campos ao acaso para anaacutelises morfoloacutegicas e
morfomeacutetricas que pudessem ser representativas dos efeitos do Thiodanreg no tecido
hepaacutetico Estas alteraccedilotildees foram comparadas com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos fiacutegados
das lacircminas do grupo controle
As alteraccedilotildees histoloacutegicas foram avaliadas semiquantitativamente em duas
formas 1) por meio do caacutelculo do Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) com base na
incidecircncia de lesotildees Para tanto atribuiu-se um valor numeacuterico para cada animal
conforme a escala grau 1 (ausecircncia de alteraccedilatildeo histoloacutegica) grau 2 (ocorrecircncia de
lesotildees pontualmente localizadas) e grau 3 (lesotildees amplamente distribuiacutedas pelo oacutergatildeo)
em 10 campos fotografados e 2) por meio do caacutelculo do Iacutendice de Alteraccedilatildeo
Histopatoloacutegica (IAH) com base na severidade de cada lesatildeo de acordo com Schwaiger
et al (1997) Para tanto as alteraccedilotildees foram classificadas em estaacutedios progressivos
quanto ao comprometimento das funccedilotildees do oacutergatildeo alteraccedilotildees de estaacutedio I que natildeo
comprometem o funcionamento do oacutergatildeo de estaacutedio II mais severas e que prejudicam
o funcionamento normal do oacutergatildeo e de estaacutedio III muito severas e irreversiacuteveis
adaptado de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic (1994) (Tabela 2) O valor de IAH foi
calculado para cada animal utilizando a foacutermula IAH =10ordm sumI + 10ˡ sumII + 10sup2 sumIII
sendo I II e III correspondentes ao nuacutemero de alteraccedilotildees de estaacutedio I II e III
respectivamente O valor meacutedio de IAH foi dividido em cinco categorias seguindo
metodologia de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic (1994) 0-10= funcionamento normal do
tecido 11-20= dano leve a moderado do tecido 21-50= dano moderado a severo do
tecido 51-100= dano severo do tecido maior que 100= dano irreparaacutevel do tecido Este
iacutendice permitiu a comparaccedilatildeo da severidade das lesotildees hepaacuteticas entre os peixes
expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
23
Tabela 2 Classificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histoloacutegicas do fiacutegado quanto ao estaacutegio de comprometimento das funccedilotildees teciduais (adaptado de Poleksic amp MitrovicndashTutundzic1994)
Para as anaacutelises morfomeacutetricas foram realizadas dez mediccedilotildees dos diacircmetros de
nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos para cada animal As medidas foram obtidas por
meio do programa Image-Pro Plus traccedilando duas linhas perpendiculares respeitando-se
os limites do nuacutecleo e do citoplasma do hepatoacutecito em anaacutelise (Figura 5) Aleacutem disso
foram quantificados pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleo citoplasma capilar sinusoides e
macroacutefagos em 10 campos (gradiacutecula com 100microm de lado e uma aacuterea de 10000micromsup2)
totalizando 4410 pontosanimal para o caacutelculo da constituiccedilatildeo tecidual hepaacutetica (Figura
6) Estas avaliaccedilotildees foram conduzidas nos grupos controles e grupos de peixes expostos
ao toacutexico nas diferentes concentraccedilotildees
A quantidade de glicogecircnio nos hepatoacutecitos foi avaliada em toda extensatildeo da
lacircmina de forma semiquantitativa sendo evidenciada pela reaccedilatildeo histoquiacutemica de
Periodic Acid Schiff (PAS) segundo Michalany (1980) Para melhor compreensatildeo dos
resultados as marcaccedilotildees foram determinadas na seguinte escala 0- ausecircncia de
glicogecircnio 1- pouco glicogecircnio 2- quantidade moderada de glicogecircnio 3- muito
glicogecircnio Apoacutes esta anaacutelise foi calculada uma meacutedia do conteuacutedo de glicogecircnio dos
hepatoacutecitos nos grupos controles e grupos expostos ao toacutexico nas diferentes
concentraccedilotildees
ALTERACcedilOtildeES HISTOPATOLOacuteGICAS HEPAacuteTICAS ESTAacuteGIO1 Alteraccedilatildeo nos hepatoacutecitosAtrofia nuclear I
Atorfia nuclear I
Deformaccedilatildeo do contorno celular I
Deformaccedilatildeo do contorno nuclear I
Hipertrofia celular I
Hipertrofia nuclear I
Nuacutecleo na periferia da ceacutelula II
Vacuolizaccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II
Degeneraccedilatildeo nuclear II
Nuacutecleos picnoacuteticos II
Rompimento celular II
2 Alteraccedilotildees nos vasos sanguiacuteneos
Hiperemia II
Ruptura de vasos II
3 Necrose
Necrose focal III
24
Figura 5 Metodologia para obtenccedilatildeo de medidas de diacircmetro de nuacutecleo e citoplasma de hepatoacutecitos por meio do programa Image-Pro Plus Coloraccedilatildeo Azul de toluidina Barra 5microm
Figura 6 Gradiacutecula utilizada para contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos capilares e macroacutefagos (4410 pontosanimal) Coloraccedilatildeo Azul de toluidina
25
353 Anaacutelises morfomeacutetri cas e morfoloacutegicas dos ovaacuterios
Os estudos foram conduzidos em seis animais de cada grupo em cada
experimento As lacircminas histoloacutegicas foram analisadsas em toda sua extensatildeo em busca
de alteraccedilotildees morfoloacutegicas foliculares (Tabela 3) que pudessem ser representativas dos
efeitos do Thiodanreg no tecido ovariano sempre comparando estas alteraccedilotildees com o
padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios das lacircminas dos grupos controles
Para a avaliaccedilatildeo morfomeacutetrica foram realizadas contagens dos diferentes
estaacutegios de desenvolvimento folicular Para isto foram utilizadas fotografias obtidas a
partir de 10 campos escolhidos ao acaso em objetiva de 10X (campo com 5094microm de
largura por 68120microm de comprimento totalizando uma aacuterea de 1863 mmsup2) Aleacutem
disso foi realizada a contagem de foliacuteculos atreacutesicos e observados eosinoacutefilos
associados aos foliacuteculos vitelogecircnicos utilizando o microscoacutepio com objetiva de 40X
avaliando-se 10 foliacuteculos escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro
experimentos Tambeacutem foram realizadas mediccedilotildees de diacircmetros em 10 foliacuteculos
vitelogecircnicos para cada animal Estas medidas foram obtidas pelo programa Image-Pro
Plus traccedilando-se duas linhas perpendiculares sobre nuacutecleo e central e respeitando-se os
limites do foliacuteculo As mensuraccedilotildees foram realizadas em imagens obtidas com objetiva
de 4X (Figura 7) Em todas as contagens e mediccedilotildees foram calculados os valores
meacutedios e desvios-padratildeo para cada concentraccedilatildeo para se avaliar o desenvolvimento
folicular nos diferentes experimentos
Tabela 3 Alteraccedilotildees histoloacutegicas do ovaacuterio quanto ao comprometimento folicular (adaptado de Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS FOLICULAR ES Alteraccedilatildeo nos foliacuteculos
Descolamento do revestimento folicular
Retraccedilatildeo citoplasmaacutetica
Retraccedilatildeo nuclear
Atresia folicular
Aglutinaccedilatildeo nucleoplasmaacutetica
Aglutinaccedilatildeo citoplasmaacutetica
Aglutinaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo
Foliacuteculos vazios
Granuloacutecitos envolvendo foliacuteculos
26
Figura 7 Metodologia para obtenccedilatildeo de medidas de diacircmetro de ovoacutecitos vitelogecircnicos avanccedilados por meio do programa Image-Pro Plus Coloraccedilatildeo Hematoxilina eosina
354 Imunoistoquiacutemica
Para detectar a possiacutevel imunorreatividade para colaacutegeno tipo IV integrinas β1 e
caspase 3 no tecido conjuntivo ovaacuterios do lambari foram fixados em paraformaldeido a
4 A recuperaccedilatildeo antigecircnica foi realizada em forno microndas por 10 minutos com os
cortes nas lacircminas sendo imersos em tampatildeo citrato 10mM pH 60 As lacircminas foram
incubadas com peroacutexido de hidrogecircnio a 3 em tampatildeo fosfato por 15 minutos em
temperatura ambiente para inativar peroxidase endoacutegena e com soro albumina bovina a
2 por 45 minutos para bloquear marcador antigecircnico inespeciacutefico Anticorpos
primaacuterios anti-colaacutegeno tipo IV anti-integrina β1 e anti-caspase 3 (Santa Cruz
Biotechnology Calif USA) foram aplicados nas secccedilotildees a 4degC na diluiccedilatildeo 1100
(integrina e colaacutegeno tipo IV) e 1200 (Caspase 3) segundo o fabricante ldquoovernightrdquo
Os cortes foram lavados em PBS e incubados por 45 minutos com diluiccedilatildeo de 1200
com anticorpo secundaacuterio IgG anti-coelho (LSAB 2 sistema HRP da Dako Cytomation
kit Dako Cytomation Carpinteria Calif USA) e tratado com peroxidase conjugada
com estreptavidina por 45 minutos A revelaccedilatildeo foi realizada com diaminobenzidina
(DAB) e as lacircminas foram contracoradas com hematoxilina (Santos et al 2008a)
27
36 Paracircmetros biomeacutetricos
Para analisar quantitativamente a atividade reprodutiva do A bimaculatus foram
registrados para cada exemplar os seguintes dados biomeacutetricos peso corporal (em g)
peso dos ovaacuterios (em g) e peso do fiacutegado (em g) Os valores meacutedios e desvios-padratildeo
dos iacutendices gonadossomaacutetico e hepatossomaacutetico foram calculados para cada animal em
cada um dos grupos propostos no presente estudo
a) Iacutendice gonadossomaacutetico (IGS)
IGS=PG x100 PG= peso dos ovaacuterios
PC PC= peso corporal
b) Iacutendice hepatossomaacutetico (IHS)
IHS= PF x100 PF= peso do fiacutegado
PC PC= peso corporal
37 Anaacutelises estatiacutesticas
As variaacuteveis quantitativas foram submetidas aos testes de homocedasticidade
(Levenes) e normalidade (Shapiro-Wilk) e posteriormente agrave anaacutelise de variacircncia para
testar as variaccedilotildees nos valores meacutedios dos iacutendices calculados no momento da coleta (96
horas) entre os grupos controles e os grupos tratados Foi analisado o coeficiente de
variaccedilatildeo para se evitar erros estatiacutesticos tipo I e tipo II e logo apoacutes foi realizado o teste
parameacutetrico de Duncan ou Tukey (Plt005) para comparar os valores meacutedios Quando
natildeo atenderam agraves premissas de normalidade e homocedasticidade mesmo apoacutes as
transformaccedilotildees apropriadas os dados foram submetidos aos testes natildeo-parameacutetricos de
Kruskal-Wallis (ANOVA) Para as variaacuteveis qualititativas quantificadas foi utilizado o
teste de Kruskal-Wallis (ANOVA) Os graacuteficos foram produzidos usando o software
Microsoft Excel 2010
28
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5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 CAPIacuteTULO 1
EFEITOS DO INSETICIDA THIODAN reg SOBRE A MORFOLOGIA HEPAacuteTICA
DE FEcircMEAS DE LAMBARIS Astyanax bimaculatus
RESUMO
O Thiodanreg eacute um toacutexico que pode causar alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos tecidos de peixes
expostos a ele dependendo da concentraccedilatildeo A fim de investigar possiacuteveis alteraccedilotildees
este estudo avaliou a morfologia hepaacutetica de fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus
expostas ao Thiodanreg por 96 horas em quatro diferentes experimentos com trecircs
concentraccedilotildees subletais de 115 23 e 56 microgL de Thiodanreg aleacutem de um grupo
controle livre de toacutexico As fecircmeas foram divididas em quatro experimentos sem
aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem aclimataccedilatildeo e alimentados com aclimataccedilatildeo de 10 dias e
sem alimentaccedilatildeo e com aclimataccedilatildeo de 10 dias e alimentados Foi observado que a accedilatildeo do
Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou a estrutura morfoloacutegica do fiacutegado
como um todo mas foram observadas alteraccedilotildees em locais isolados do parecircnquima
hepaacutetico Houve depleccedilatildeo de glicogecircnio deformaccedilatildeo nuclear e citoplasmaacutetica
hipertrofia nuclear e citoplasmaacutetica hiperemia e degeneraccedilatildeo celular nos hepatoacutecitos
nas diferentes concentraccedilotildees No entanto o Iacutendice de Alteraccedilatildeo Histoloacutegica (IHA) e o
Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) demonstraram que as alteraccedilotildees observadas nos
fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas sendo na maioria alteraccedilotildees de estaacutedio I e II
de forma leve a moderada com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico em todas as
concentraccedilotildees Aleacutem disso houve alteraccedilatildeo do diacircmetro do nuacutecleo e citoplasma dos
hepatoacutecitos nos diferentes experimentos e maior quantidade de nuacutecleos de hepatoacutecitos
nos grupos expostos ao Thiodanreg associada agrave reduccedilatildeo na quantidade de citoplasma
Conclui-se que o Thiodanreg influenciou o metabolismo hepaacutetico como resposta
adaptativa celular A incidecircncia de alteraccedilotildees histoloacutegicas no fiacutegado dos lambaris
coletados nos diferentes experimentos indica o comprometimento da sauacutede destes
peixes e mostra que os paracircmetros analisados podem ser empregados como
biomarcadores da contaminaccedilatildeo ambiental nesta espeacutecie
Palavras-chave histopatologia fiacutegado peixe endosulfan ecotoxicologia
36
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 α-endosulfan e 30 β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo a
partir da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em risco os organismos que ali
residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al 2007)
Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos como jaacute
observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis niloticus A
Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan em gordura o valor de
005mgkg-1 (EPA 2002) e em aacutegua doce 022microgL-1 (EPA 1980) A Legislaccedilatildeo
Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em consideraccedilatildeo a qualidade da
aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm
3572007 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo do referido inseticida e
seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
A sensibilidade ao endosulfan pelos organismos aquaacuteticos tem sido bem descrita
na literatura (Capkin et al 2006 Ballesteros et al 2007 Pereira et al 2012) O
produto eacute extremamente toacutexico para peixes e outros organismos aquaacuteticos mesmo em
concentraccedilotildees muito pequenas (Cengiz et al 2001) No entanto a sensibilidade pode
variar entre os sexos assim como foi observado nos peixes adultos da espeacutecie Jenynsia
multidentata sob efeito do endosulfan por 96 horas (Ballesteros et al 2007) Neste
trabalho a CL50 em peixes machos foi de 072 μgL-1 enquanto nas fecircmeas foi de
131μgL-1 valores atribuiacutedos agraves diferenccedilas de maior reserva de lipiacutedeos nas fecircmeas que
nos machos Em outros estudos Capkin et al (2006) utilizaram 1978gL-1 em
Oreochromis mikyss por 24 horas de exposiccedilatildeo ao toacutexico o que causou aleacutem da morte
de 50 dos peixes convulsotildees nado erraacutetico separaccedilatildeo das lacircminas bracircnquiais e
necrose do fiacutegado e como Cengiz et al (2001) reportaram lesotildees similares no peixe-
mosquito Gambusia affinis
O sulfato de endosulfan eacute um dos produtos derivados do metabolismo do
endosulfan sendo considerado o principal metaboacutelito devido agrave sua importacircncia
toxicoloacutegica (Stumpf amp abhaver 1986) e por ser mais estaacutevel no meio ambiente do que
37
quando estaacute em sua foacutermula original (Ali et al 1984) Decorrente disto os peixes
quando expostos a este inseticida podem apresentar alteraccedilotildees morfoloacutegicas
significativas no fiacutegado (Capkin et al 2006 Coimbra et al 2007 Glover et al 2007)
Estas alteraccedilotildees morfoloacutegicas podem ser o surgimento de vacuolizaccedilatildeo dos hepatoacutecitos
depleccedilatildeo de glicogecircnio alteraccedilatildeo dos vasos sinusoides alteraccedilatildeo do tamanho dos
hepatoacutecitos e necroses o que de acordo com alguns autores pode influenciar a siacutentese
de vitelogenina no fiacutegado para formaccedilatildeo dos foliacuteculos vitelogecircnicos em periacuteodo
reprodutivo (Senthilkumaran et al 2004 Al-Ghais 2013 Silva Barni et al 2014 )
Aleacutem disso as funccedilotildees hepaacuteticas podem ser influenciadas pelas diferenccedilas na
capacidade de exposiccedilatildeo a contaminantes condiccedilatildeo fisioloacutegica armazenamento de
energia e haacutebitos alimentares (Ribeiro et al 2006 Al -Ghais 2013 Silva Barni et al
2014)
O lambari Astyanax bimaculatus foi escolhido como organismo experimental
pois eacute muito representativo no ecossistema sendo encontrado desde o Nordeste
brasileiro ateacute a bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Eacute um peixe de
pequeno porte e de faacutecil manutenccedilatildeo em laboratoacuterio
Este estudo teve como objetivo verificar a ocorrecircncia de alteraccedilotildees histoloacutegicas
no fiacutegado de fecircmeas de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada e avaliar a intensidade
de alteraccedilatildeo deste orgatildeo em peixes alimentados e desprovidos de alimento durante
ensaios subletais agudos com o toacutexico Thiodanreg
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste de toxicidade aguda e o teste subletal As
atividades de coleta fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos fiacutegados microtomia
coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e morfomeacutetricas foram
realizadas nos Laboratoacuterios de Peixes e de Histopatologia do Departamento de
Veterinaacuteria da UFV (DVTUFV)
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
38
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos animais em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado poro genital
dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV Os
aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuem capacidade de 50 litros numa
densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro
temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam
sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo contiacutenua da aacutegua para garantir o bem-estar dos
peixes Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial Purina contendo 35 de
proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste da toxicidade aguda em sistema estaacutetico - CL 50
O teste de concentraccedilatildeo letal (CL50) que avalia a concentraccedilatildeo responsaacutevel pela
mortalidade de 50 dos animais foi realizado em sistema de aacutegua estaacutetico de acordo
com a NBR 15088 (ABNT 2007) com os animais mantidos em restriccedilatildeo alimentar que
se iniciou 24 horas antes do iniacutecio do experimento e perdurou durante todo o teste (96
horas) Essa restriccedilatildeo alimentar foi realizada para evitar acuacutemulo de mateacuteria orgacircnica
que poderia interferir na accedilatildeo do agrotoacutexico
Para o teste foram selecionadas 120 fecircmeas adultas de lambari em maturaccedilatildeo
avanccedilada O agrotoacutexico utilizado foi o Thiodanreg (Bayer) com 350gL-1 de endosulfan
Foram utilizadas trecircs repeticcedilotildees com cinco peixes cada para cada concentraccedilatildeo de
39
Thiodanreg adotada sendo os grupos assim classificados controle (0microgL-1) 15microgL-1
30microgL-1 60microgL-1 120microgL-1 240microgL-1 480microgL-1 e 960microgL-1 As concentraccedilotildees
foram distribuiacutedas em recipientes plaacutesticos com 15L de aacutegua dos proacuteprios aquaacuterios
Foram realizadas verificaccedilotildees de mortalidade a cada seis horas ateacute 96 horas
(zero 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 e 96 horas) removendo-se
os animais mortos o que proporcionou menores interferecircncias pela decomposiccedilatildeo dos
peixes gerando maior confianccedila da mortalidade apresentada ser em funccedilatildeo da
toxicidade do princiacutepio ativo endosulfan sinergicamente agrave accedilatildeo dos solventes e demais
compostos do inseticida Para acompanhamento da temperatura foi acondicionado 15L
de aacutegua do mesmo aquaacuterio em um recipiente idecircntico de forma que qualquer variaccedilatildeo
na temperatura pudesse ser medida sem provocar estresse adicional a nenhum grupo O
programa utilizado para o caacutelculo da CL50 foi o TOXCALC determinando o valor e
intervalo de confianccedila pelo meacutetodo PROBITUS (Plt005)
24 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi realizado baseando-se
principalmente nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo a NBR
15088 (ABNT 2007)
As fecircmeas foram expostas ao Thiodanreg (endosulfan 350gL-1) por 96 horas em
quatro tratamentos diferentes 1) experimento sem aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem
alimentaccedilatildeo 2) experimento sem aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo 3) experimento com
aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e 4) experimento com aclimataccedilatildeo de 10 dias
e com alimentaccedilatildeo Todos os experimentos foram constituiacutedos por trecircs concentraccedilotildees
diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 preacute-determinada em laboratoacuterio de acordo com
a NBR 15088 (ABNT 2007) e um grupo controle sem toacutexico As concentraccedilotildees
utilizadas em cada experimento foram de 115 23 e 56microgL-1 com trecircs repeticcedilotildees sob
as mesmas condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
25 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas
Apoacutes 96 horas de experimento foram coletados 96 peixes sendo seis animais
em cada grupo nos diferentes experimentos Logo em seguida os fiacutegados foram
coletados apoacutes os peixes terem sido anestesiados com benzocaiacutena (110000) e
eutanasiados pela secccedilatildeo transversal da coluna vertebral na regiatildeo do opeacuterculo
40
Para a histologia todas as amostras foram fixadas em paraformaldeiacutedo a 4 em
tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedos em resina glicolmetacrilato
(Leica Historesinreg) Em seguida secccedilotildees com 3microm de espessura foram coradas
utilizando azul de toluidina para as anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas As lacircminas
foram montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31
Olympus e as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software
Analysis GETIT Olympus
As lacircminas histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo e foram
fotografados 10 campos ao acaso em objetiva de 40X para anaacutelises morfoloacutegicas e
morfomeacutetricas que pudessem ser representativas do efeito do Thiodanreg no tecido
hepaacutetico Estas alteraccedilotildees foram comparadas com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos fiacutegados
dos grupos controles
As alteraccedilotildees histoloacutegicas foram avaliadas semiquantitativamente de duas
formas 1) por meio do caacutelculo do Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) com base na
incidecircncia de lesotildees Para tanto atribuiu-se um valor numeacuterico para cada oacutergatildeo
conforme a escala grau 1 (ausecircncia de alteraccedilatildeo histoloacutegica) grau 2 (ocorrecircncia de
lesotildees pontuais) e grau 3 (lesotildees amplamente difusas pelo oacutergatildeo) em 10 campos
fotografados e 2) pelo caacutelculo do Iacutendice de Alteraccedilatildeo Histotoloacutegica (IAH) com base na
severidade de cada lesatildeo de acordo com Schwaiger et al (1997) Para tanto as
alteraccedilotildees foram classificadas em estaacutedios progressivos quanto ao comprometimento
das funccedilotildees do oacutergatildeo alteraccedilotildees de estaacutedio I que natildeo comprometem o funcionamento
do oacutergatildeo de estaacutedio II mais severas e que prejudicam o funcionamento normal do
oacutergatildeo e de estaacutedio III muito severas e irreversiacuteveis (adaptado de Poleksic amp Mitrovic-
Tutundzic 1994) (Tabela 1) O valor de IAH foi calculado para cada animal utilizando a
foacutermula IAH =10ordm sumI + 10ˡ sumII + 10sup2 sumIII sendo I II e III correspondentes agraves
alteraccedilotildees de estaacutedios I II e III respectivamente O valor meacutedio de IAH foi dividido em
cinco categorias que seguiu metodologia de Poleksic amp Mitrovic- Tutundzic (1994) 0-
10= funcionamento normal do tecido 11-20= dano leve a moderado do tecido 21-50=
dano moderado a severo do tecido 51-100= dano severo do tecido maior que 100=
dano irreparaacutevel do tecido Este iacutendice permitiu a comparaccedilatildeo da severidade das lesotildees
hepaacuteticas entre os peixes expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico
Para as anaacutelises morfomeacutetricas foram realizadas mediccedilotildees dos diacircmetros de dez
nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos para cada animal As medidas foram obtidas por
meio do programa Image-Pro Plus traccedilando duas linhas perpendiculares respeitando-se
41
os limites do nuacutecleo e do citoplasma do hepatoacutecito em anaacutelise Aleacutem disso foram
quantificados pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleo de hepatoacutecito citoplasma de hepatoacutecito
capilares sinusoides e macroacutefagos em 10 campos utilizando-se gradiacutecula com 441
pontos de interseccedilatildeo com 100microm de lado e uma aacuterea de 10000micromsup2 totalizando 4410
pontosanimal para o caacutelculo da constituiccedilatildeo tecidual hepaacutetica
Tabela 1 Classificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histoloacutegicas do fiacutegado quanto ao estaacutegio de comprometimento das funccedilotildees teciduais (adaptado de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic 1994)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS HEPAacuteTICAS ESTAacuteDIO 1 Alteraccedilotildees nos hepatoacutecitos I Atrofia nuclear I Deformaccedilatildeo do contorno celular I Deformaccedilatildeo do contorno nuclear I Hipertorfia celular I Hipertorfia nuclear I Nuacutecleo na periferia da ceacutelula I Vacuolizaccedilatildeo citoplasmaacutetica I Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II Degeneraccedilatildeo nuclear II Nuacutecleo picnoacuteticos II Rompimento celular II 2 Alteraccedilotildees nos vasos sanguiacuteneos Hiperemia II Ruptura de vasos II 3 Necrose Necrose focal III
A quantidade de glicogecircnio nos hepatoacutecitos foi avaliada em toda extensatildeo da
lacircmina de forma semiquantitativa sendo evidenciada pela reaccedilatildeo histoquiacutemica de
Periodic Acid Schiff (PAS) seguida de contracoloraccedilatildeo com hematoxilina segundo
Michalany (1980) Para melhor compreensatildeo dos resultados as marcaccedilotildees foram
determinadas na seguinte escala 0- ausecircncia de glicogecircnio 1- pouco glicogecircnio 2-
quantidade moderada de glicogecircnio 3- muito glicogecircnio Apoacutes esta anaacutelise foi
calculada uma meacutedia do conteuacutedo de glicogecircnio dos hepatoacutecitos nos grupos controles e
grupos expostos ao toacutexico nas diferentes concentraccedilotildees
42
26 Iacutendice hepatossomaacutetico (IHS)
Para o caacutelculo do IHS foram registrados para cada exemplar os dados
biomeacutetricos de peso corporal (PC em g) e peso do fiacutegado (PF em g) Os valores meacutedios
e os desvios padratildeo do iacutendice hepatossomaacutetico (IHS=PFx100PC) foram calculados
para cada animal em cada um dos grupos nos diferentes experimentos nas diferentes
concentraccedilotildees
27 Anaacutelises estatiacutesticas
Os dados estatildeo apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo
Os dados foram avaliados pelo Software Statistica 70 por meio da anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) Apoacutes o teste de distribuiccedilatildeo normal os dados foram comparados
entre os grupos controle e grupos expostos ao Thiodanreg usando anaacutelise de variacircncia
one-way seguida pelo teste de Tukey ou Duncan Quando os dados natildeo apresentaram
uma distribuiccedilatildeo normal foi utilizado o teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Plt005 foi utilizado como criteacuterio de significacircncia
3 RESULTADOS
31 Determinaccedilatildeo da CL50-96h
Nas primeiras seis horas de experimento observou-se mortalidade de 100 de
peixes na concentraccedilatildeo de 96microgL-1 944 de mortalidade em 48microgL-1 733 de
mortalidade em 24microgL-1 266 de mortalidade em 12microgL-1 e 20 de mortalidade em
6microgL-1 sendo um total de 447 dos peixes que morreram nas diferentes
concentraccedilotildees do Thiodanreg nas primeiras seis horas Na concentraccedilatildeo de 3microgL-1
morreu apenas um peixe no final das 96 horas Foi observado 100 de mortalidade na
concentraccedilatildeo de 48microgL-1 em ateacute 12 horas de exposiccedilatildeo ao toacutexico As menores
mortalidades foram registradas nas concentraccedilotildees de Thiodanreg de 3microgL-1 e 6microgL-1
sendo respectivamente 944 e 80 de sobrevivecircncias A concentraccedilatildeo de 15microgL-1
de Thiodanreg e o grupo controle natildeo tiveram mortalidade A temperatura da aacutegua
apresentou variaccedilatildeo entre 220ordmC e 245 ordmC com meacutedia de 233plusmn072 ordmC
Os valores registrados determinaram CL50-96hs de 1367microgL-1para as fecircmeas de
A bimaculatus com intervalo de confianccedila de 101 a 184microgL-1 (Plt005)
43
32 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Durante a exposiccedilatildeo ao Thiodanreg por 96 horas foi observado comportamento
anormal dos peixes com nado erraacutetico tentativa de fuga dos aquaacuterios demonstraccedilatildeo de
agressividade com os demais peixes busca de oxigecircnio na superfiacutecie e respiraccedilatildeo
branquial acelerada Apoacutes 24 horas do iacutenicio os animais apresentavam comportamento
normal e procuravam pelo alimento Estas mudanccedilas comportamentais ocorreram em
todas as concentraccedilotildees do agrotoacutexico utilizadas com maior intensidade na concentraccedilatildeo
de 56microgL do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo cuja temperatura meacutedia
foi superior agrave dos demais experimentos (Tabela 2)
33 Morfologia e frequecircncia das alteraccedilotildees histoloacutegicas nos fiacutegados
Morfologicamente o fiacutegado dos lambaris apresentou hepatoacutecitos hexagonais
com citoplasma de aspecto granular e vacuolizado nuacutecleo arredondado central nucleacuteolo
evidente e presenccedila de hepatopacircncreas Os hepatoacutecitos estavam dispostos em cordotildees
margeando os sinusoides (Figura 1 A)
Os infiltrados leucocitaacuterios foram observados nos grupos controles e nos grupos
expostos ao Thiodanreg (Figura 1 B)
A vacuolizaccedilatildeo foi evidente nos hepatoacutecitos das fecircmeas analisadas (Figura 1 A)
No fiacutegado das fecircmeas do experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve a presenccedila caracteriacutestica de acuacutemulos de lipiacutedios nos
hepatoacutecitos com a presenccedila de vesiacuteculas claras grandes e envolvidas por glicogecircnio
marcado positivamente pela reaccedilatildeo de PAS (Figura 1 C) Aleacutem disso foram observados
nuacutecleos deslocados para a periferia celular No experimento sem aclimataccedilatildeosem
alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve reaccedilatildeo negativa pelo PAS no
citoplasma dos hepatoacutecitos (Figura 1 D)
As alteraccedilotildees de estaacutedio I como deformaccedilatildeo do contorno nuclear nuacutecleo na
periferia da ceacutelula atrofia nuclear desarranjo dos cordotildees hepaacuteticos hipertrofia celular
e nuclear (Figuras 1 E-G Figuras 2 A-B) foram observadas nos grupos controles e
naqueles expostos ao Thiodanreg sendo que nos grupos tratados houve maior frequecircncia
O deslocamento do nuacutecleo para a periferia do hepatoacutecito foi observado nas fecircmeas do
experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 56microgL-1
Quanto agraves alteraccedilotildees de estaacutedio II a degeneraccedilatildeo nuclear (Figura 2 C) foi
raramente presente na maioria das concentraccedilotildees nos diferentes experimentos A
degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica (Figura 2 D) foi pouco frequente em todos os experimentos
44
assim como a hiperemia (Figura 2 E) A presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos (Figura 2 F) foi
mais frequente no experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e no experimento
com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
Os VMAs variaram entre 125 e 228 nas fecircmeas analisadas sendo a menor
meacutedia observada nos grupos controles e as maiores nos grupos expostos ao Thiodanreg o
que mostra incidecircncia maior de alteraccedilotildees pontuais no fiacutegado nos animais dos grupos
tratados Os VMAs do fiacutegado na espeacutecie estudada foram superiores (Plt005) nos peixes
expostos ao agrotoacutexico quando comparado aos peixes dos grupos controles (Tabela 3)
O IAH das fecircmeas nos diferentes experimentos apresentaram valores superiores
(Plt005) nos grupos expostos ao Thiodanreg quando comparados como os grupos
controles (Tabela 4) com exceccedilatildeo do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 115microgL-1 de endosulfan que natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
34 Diacircmetro dos nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos
Os resultados demonstraram aumento (Plt005) no diacircmetro dos nuacutecleos de
hepatoacutecitos dos peixes expostos ao Thiodanreg nas concentraccedilotildees de 115microgL-1 e
23microgL-1 quando comparados ao grupo controle no experimento sem aclimataccedilatildeosem
alimentaccedilatildeo Por outro lado foi registrada diminuiccedilatildeo (Plt005) do diacircmetro dos nuacutecleos
de hepatoacutecitos no experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo quando comparados
aos peixes expostos ao Thiodanreg na concentraccedilatildeo 115 e 23microgL-1 em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Tabela 5)
O diacircmetro do citoplasma apresentou aumento no experimento sem
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e no experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo com
diferenccedila (Plt005) registrada entre os peixes do grupos controles e expostos ao
agrotoacutexico com exceccedilatildeo do experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de 23microgL-1 (Tabela 6) Entretanto houve diminuiccedilatildeo nos citoplasmas de
hepatoacutecitos nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo ao grupos controles (Plt005)
nos experimentos sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e no experimento com
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Tabela 6)
35 Quantificaccedilatildeo de nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos macroacutefagos e capilares
sanguiacuteneos no tecido hepaacutetico
Nas contagens de pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleos de hepatoacutecitos (Tabela 7)
foram observadas quantidades superiores nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo
45
aos grupos controles (Plt005) Na quantificaccedilatildeo dos citoplasmas de hepatoacutecitos foram
registradas contagens inferiores (Plt005) nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo
aos grupos controles exceto no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Tabela
8)
Na contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre macroacutefagos natildeo houve aumento
significativo (Pgt005) nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo ao controle (Tabela
9) Em relaccedilatildeo agrave contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre capilares sinusoides a
contagem foi igual na maioria dos peixes expostos ao agrotoacutexico quando comparados
com os controles apresentando diferenccedila significativa (Plt005) entre os grupos
expostos do experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo nas concentraccedilotildees de 115 e
56microgL-1 (Tabela 10)
36 Quantificaccedilatildeo do glicogecircnio hepaacutetico
Em todos os grupos controles e tratados nos diferentes experimentos foram
registrados valores meacutedios para o glicogecircnio variando entre 010 e 300 No
experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo no grupo tratado da concentraccedilatildeo de
56microgL-1 de Thiodanreg foi registrada a menor meacutedia (Tabela 11) No entanto houve
diferenccedila (Plt005) do glicogecircnio hepaacutetico na concentraccedilatildeo de 56microgL quando
comparada com as concentraccedilotildees de 115 e 23microgL-1 (Tabela 11 e Figura 1 D)
37 Iacutendice hepatossomaacutetico
As fecircmeas dos grupos experimentais expostos ao Thiodanreg natildeo apresentaram
diferenccedilas (Pgt005) nos valores do IHS quando comparados com os grupos controles
(Tabelas 12) Entretanto houve diferenccedila (Plt005) do IHS na concentraccedilatildeo de 56microgL-1
quando comparada com as concentraccedilotildees de 115 e 23microgL-1 no experimento sem
aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Tabela 12)
4 DISCUSSAtildeO
No presente estudo o lambari apesar de ser de pequeno porte apresentou uma
CL50 de 1367microgL-1 em 96 horas sendo mais resistente que adultos de tilaacutepia niloacutetica
Musanhi (1987) determinou a CL50 96 48 e 24 horas de exposiccedilatildeo ao endosulfan para
tilaacutepia niloacutetica adulta encontrando valores de 142 380 e 103 microgL-1 Nas primeiras 24
horas de accedilatildeo do Thiodanreg nas concentraccedilotildees subletais de 115 23 e 56microgL-1 as
fecircmeas do presente estudo apresentaram comportamentos alterados assim como foi
46
observado na espeacutecie Danio rerio exposta ao endosulfan por 96 horas na concentraccedilatildeo
de 24microgL-1 aleacutem desta espeacutecie ter apresentado uma diminuiccedilatildeo do niacutevel de
acetilcolinesterase (AChE) (Pereira et al 2012) Por outro lado em estudo realizado
por Hernan da Cuntildea et al (2011) com a espeacutecie Cichlasoma dimerus exposta ao
endosulfan por 96 horas nas concentraccedilotildees de 025 1 2 3 4 e 16microgL-1 os peixes
exibiram comportamento indicativo de neurotoxicidade mas natildeo foram encontradas
diferenccedilas na atividade da AChE Estes estudos fornecem evidecircncias adicionais de
efeitos deleteacuterios da exposiccedilatildeo ao endosulfan sobre o sistema nervoso o que contribui
para as observaccedilotildees obtidas no presente estudo
As descriccedilotildees histoloacutegicas hepaacuteticas nas fecircmeas do presente estudo foram
semelhantes ao que foi caracterizado em outros peixes onde os hepatoacutecitos organizam-
se em fileiras ou cordotildees duplos em formato de placas representando um sistema de
fundo-cego anastomosado e de tuacutebulos ramificados (Metcalfe 1998 Hinton et al
2001)
A histologia e a fisiologia do fiacutegado satildeo similares nos vertebrados Ferguson
(1989) e Gingerich (1982) descrevem que existem algumas diferenccedilas estruturais
marcadas no parecircnquima hepaacutetico de peixes em especial pela ausecircncia de lobulaccedilatildeo
espaccedilo porta claacutessico e ausecircncia de zonaccedilatildeo no parecircnquima hepaacutetico o que permite
fluxo lento de sangue nos sinusoides com penetraccedilatildeo diminuiacuteda de quiacutemicos nos
hepatoacutecitos
A presenccedila de porccedilotildees pancreaacuteticas dentro do fiacutegado do lambari eacute descrita na
literatura (Santos et al 2013) Uma das funccedilotildees das ceacutelulas pancreaacuteticas distribuiacutedas
pelo fiacutegado eacute a produccedilatildeo da enzima de biotransformaccedilatildeo citocromo P450 diferente do
que eacute observado para mamiacuteferos onde esta enzima eacute ausente (Hahn et al 1994
Stegeman 1991) A presenccedila de ceacutelulas pancreaacuteticas em estruturas do tecido hepaacutetico
de A bimaculatus sugere a provaacutevel funccedilatildeo dessas ceacutelulas em auxiliar na
desintoxicaccedilatildeo Outra importante estrutura na detoxificaccedilatildeo eacute a presenccedila das ceacutelulas dos
endoteacutelios capilares nas quais tem sido confirmada e identificada a presenccedila de enzimas
citocromo P450 por meio de teacutecnicas de imunomarcaccedilatildeo (Lorenzana et al 1986)
Sendo assim a integridade estrutural dos capilares permanece intacta e sem
comprometimento das possiacuteveis funccedilotildees celulares que estas estruturas podem
desempenhar no tecido hepaacutetico de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
A ausecircncia de estagnaccedilatildeo biliar nos fiacutegados das fecircmeas de A bimaculatus eacute um
fator importante de que o Thiodanreg natildeo interferiu na fisiologia de excreccedilatildeo biliar nos
47
diferentes experimentos Histopatologicamente este tipo de alteraccedilatildeo eacute observado nos
citoplasmas dos hepatoacutecitos com a presenccedila de gracircnulos castanho-amarelados Esta
alteraccedilatildeo consiste na manifestaccedilatildeo fisiopatoloacutegica de uma condiccedilatildeo causada pela falta
de metabolismo e excreccedilatildeo biliar (Pacheco amp Santos 2002) uma vez que a bile
sintetizada pelos hepatoacutecitos permanece no interior das ceacutelulas natildeo sendo liberada para
o tubo digestivo (Simonato et al 2008) Este tipo de alteraccedilatildeo pode ser encontrado em
peixes expostos a toacutexicos (Pacheco amp Santos 2002) e tambeacutem em peixes que
apresentam algum problema nutricional quando satildeo mantidos em cativeiros (Langiano
amp Martinez 2008) No entanto no presente estudo natildeo foram registradas essas
evidecircncias o que sugere que a alimentaccedilatildeo nos grupos tratados com raccedilatildeo comercial de
todos os experimentos natildeo interferiu nas funccedilotildees biliares
Os agregados macrofaacutegicos estatildeo relacionados agrave quebra de eritroacutecitos (Herraez
amp Zapata 1986) apresentaccedilatildeo de antiacutegeno (Ellis 1980) armazenamento de ferro e
detoxicaccedilatildeo de substacircncias endoacutegenas e exoacutegenas (Herraez amp Zapata 1986) Hartley et
al (1996) propuseram a utilizaccedilatildeo do agregado macrofaacutegico como biomarcador de
poluiccedilatildeo aquaacutetica a partir da quantificaccedilatildeo destas estruturas Existem alguns estudos
comparativos em diferentes espeacutecies que tecircm demonstrado variaccedilotildees no nuacutemero
tamanho e pigmentaccedilatildeo destas estruturas em relaccedilatildeo agrave idade nutriccedilatildeo e estado de sauacutede
(Blazer et al 1987 Ferguson 1989 Agius et al 2003) Nos agregados podem ser
observados pigmentos do tipo lipofuscina ceroide hemossiderina e melanina (Wolke
1992 Wolf amp Wolfe 2005) mas no presente estudo natildeo foram evidenciadas nenhuma
destas estruturas
No fiacutegado das fecircmeas do grupo experimental sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
na maior concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve a presenccedila caracteriacutestica de acuacutemulos de
lipiacutedios nos hepatoacutecitos de dois peixes No entanto existem vaacuterias condiccedilotildees de
acuacutemulos de lipiacutedios nos hepatoacutecitos associados com a exposiccedilatildeo aos toacutexicos
(Thiyagarajah et al 1985 Biagianti-Risbourg et al 1995 Lumbertdacha et al 1995
Handy et al 1999 Fanta et al 2003) Glover et al (2007) submeteram o peixe salmatildeo
do Atlacircntico a dieta de 4microgkg de endosulfan por 14 e 35 dias sendo observadas
evidecircncias de lipidoses nos hepatoacutecitos O aparecimento destas estruturas nas fecircmeas de
A bimaculatus foi insignificante nos tecidos hepaacuteticos mas foram contabilizadas como
respostas individuais sugerindo uma disfunccedilatildeo hepaacutetica causada pelo Thiodanreg que
pode comprometer a fisiologia hepaacutetica destas fecircmeas
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No presente estudo as frequecircncias de alteraccedilotildees morfoloacutegicas indicam que a
accedilatildeo toacutexica do Thiodanreg provocou uma distribuiccedilatildeo de lesotildees de incidecircncia leve a
moderada no tecido hepaacutetico nos diferentes experimentos sendo que nas maiores
concentraccedilotildees do toacutexico houve mais incidecircncias de alteraccedilotildees As alteraccedilotildees observadas
nos fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas isto eacute natildeo apresentaram necrose sendo que
a maioria das alteraccedilotildees satildeo de estaacutedios I e II com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico
As alteraccedilotildees histoloacutegicas tecircm sido relatadas em peixes expostos a ambientes poluiacutedos
(Braunbeck et al 1990 Takashima et al 1995 Schwaiger et al 1997) Da mesma
forma a frequecircncia das alteraccedilotildees pode indicar disfunccedilotildees induzidas por agentes
toacutexicos uma vez que aacutereas metabolicamente ativas do fiacutegado ficam reduzidas levando a
uma possiacutevel reduccedilatildeo geral nas funccedilotildees desempenhadas por este oacutergatildeo (Hinton amp
Laureacuten 1990 Oliveira Ribeiro et al 2002 Pacheco amp Santos 2002 Langiano amp
Martinez 2008) Este resultado sugere que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees
hepaacuteticas mesmo em concentraccedilotildees muito baixas nos diferentes experimentos
independentemente do peixe estar sendo alimentado ou natildeo
As alteraccedilotildees dos diacircmetros de nuacutecleos de hepatoacutecitos podem ser consideradas
resposta ao agente estressor sendo indicativo da ativaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica em
decorrecircncia do aumento da atividade metaboacutelica contra as condiccedilotildees adversas (Stephen
et al 1993 Takashima amp Hibyia 1995 Langiano amp Martinez 2008) Por outro lado a
diminuiccedilatildeo nuclear pode estar relacionada possivelmente com a multiplicaccedilatildeo de
hepatoacutecitos na reposiccedilatildeo de ceacutelulas lesadas em funccedilatildeo da multiplicaccedilatildeo celular (Gul et
al 2004) No trabalho realizado por Oliveira Ribeiro et al (2002) observaccedilotildees
qualitativas por microscopia de luz demonstraram diminuiccedilatildeo no diacircmetro dos nuacutecleos
de hepatoacutecitos na espeacutecie A bimaculatus com alimentaccedilatildeo controlada associada agrave
exposiccedilatildeo ao toacutexico tributiltin Este tipo de alteraccedilatildeo eacute um indicativo de processo
degenerativo celular uma vez que inicia com a condensaccedilatildeo e reduccedilatildeo do diacircmetro do
nuacutecleo (Oliveira Ribeiro et al 2002) No presente estudo as alteraccedilotildees nos diacircmetros
de nuacutecleo de hepatoacutecitos demostraram que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees
hepaacuteticas das fecircmeas
A hipertrofia dos hepatoacutecitos tambeacutem pode ser causada por contaminantes
(Arnold et al 1985) por mudanccedilas estruturais do hepatoacutecito relacionadas ao
funcionamento da ceacutelula (Hinton et al 1992) condiccedilotildees fisioloacutegicas ligadas agrave
reproduccedilatildeo (Wester et al 2003) e pela maior atividade metaboacutelica (Takashima amp
Hibyia 1995) Portanto o aumento do diacircmetro citoplasmaacutetico nos experimentos sem
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adaptaccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e no experimento com adaptaccedilatildeosem alimentaccedilatildeo mesmo
natildeo apresentando caracteriacutestica de hipertrofia morfoloacutegica evidente mas morfomeacutetrica
sugere indiacutecios de maior metabolizaccedilatildeo pelos hepatoacutecitos nestes grupos experimentais
As alteraccedilotildees dos diacircmetros de citoplasmas dos hepatoacutecitos nos experimentos
demonstraram que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees hepaacuteticas
Na quantificaccedilatildeo de nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos nos diferentes
experimentos foram observados indiacutecios de proliferaccedilatildeo de hepatoacutecitos que pode ser
indicativo da accedilatildeo toacutexica dos hepatoacutecitos contra detoxificaccedilatildeo do Thiodanreg assim como
observado no trabalho por Gul et al (2004) O percentual do tecido hepaacutetico ocupado
por ceacutelulas do tipo hepatoacutecito variou entre 8742 a 9088 na constituiccedilatildeo do
parecircnquima hepaacutetico de A bimaculatus Poucos trabalhos citam a constituiccedilatildeo celular
em fiacutegados de peixes sendo 845 a 873 de hepatoacutecitos ocupando o parecircnquima
hepaacutetico na truta (Hampton et al 1989) e 899 no peixe Golden (Rocha et al 1997)
Estes valores demonstram que a maior parte das ceacutelulas dos fiacutegados nas fecircmeas de A
bimaculatus satildeo hepatoacutecitos como descrito em outras espeacutecies de peixes
O aumento da quantidade de macroacutefagos na concentraccedilatildeo 115microgL-1 dos
experimentos foi superior quando comparado aos demais grupos sugerindo que essa
mobilizaccedilatildeo pode estar ajudando na detoxicaccedilatildeo do fiacutegado (Herraez et al 1986)
Assim a presenccedila de maior quantidade de macroacutefagos e sinusoides podem ser
consideradas indicadoras de estresse em peixes decorrentes da presenccedila de agentes
quiacutemicos (Anderson amp Zeeman 1995 Rabitto et al 2005) Essas ceacutelulas satildeo
observadas frequentemente nas regiotildees proacuteximas aos sinusoides e desprovidas de
pigmentaccedilatildeo Foram observados macroacutefagos em trutas Oncorhynchus mykiss e Salmo
trutta fario na proporccedilatildeo de 02 e 07 respectivamente (Hampton et al 1985
Rocha et al 1997) enquanto no presente estudo variou entre 021 a 029 Meseguer
et al (1994) observaram macroacutefagos livres abundantes no parecircnquima do fiacutegado
sugerindo que estes se movem livremente dentro do parecircnquima formando os
agregados macrofaacutegicos quando haacute um aumento na atividade fagociacutetica como resposta
imune a lesotildees em indiviacuteduos expostos a contaminantes Entretanto no presente estudo
natildeo foram observadas estas caracteriacutesticas
Ainda vale ressaltar que esse toacutexico potencializa sua accedilatildeo em temperaturas mais
elevadas como aquelas observadas no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo
Estudando o efeito dos ciclodienos Correa et al (2001) Coutinho et al (2005) e
Capkin et al (2006) relataram que as alteraccedilotildees satildeo diretamente proporcionais agrave
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temperatura da aacutegua ou seja quanto mais alta a temperatura mais toacutexicos os produtos
se tornam O experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
56microgL-1 registrou temperatura meacutedia da aacutegua em 269ordmC superior aos demais
experimentos Devido a isso uma resposta comum na intoxicaccedilatildeo em fiacutegados de peixes
eacute a diminuiccedilatildeo das reservas de glicogecircnio hepaacutetico (Seinen et al 1981 Ferguson 1989
Cyrino et al 2000) e iacutendice hepatossomaacutetico (Wester et al 1987 Wester et al 1988
Wester et al 2003 Glover et al 2007) evidenciada no presente estudo
No presente estudo percebeu-se que a accedilatildeo do Thiodanreg em concentraccedilotildees
subletais natildeo afetou o fiacutegado como um todo mas na forma de focos no parecircnquima
hepaacutetico nos diferentes experimentos Este tipo de lesatildeo pode estar associado agrave
concentraccedilatildeo do toacutexico utilizado tempo de exposiccedilatildeo e a via de contaminaccedilatildeo A
ventilaccedilatildeo branquial acelerada e a natildeo procura por alimentos nas primeiras 24 horas
observadas nos diferentes experimentos sugere que a entrada de aacutegua pela via branquial
foi a causa mais direta da absorccedilatildeo e difusatildeo do toacutexico para corrente sanguiacutenea ateacute
chegar ao fiacutegado No entanto a via epideacutermica tambeacutem poder ser considerada via de
entrada do toacutexico para os tecidos (Mckim et al 1999)
As alteraccedilotildees observadas nos fiacutegados podem afetar diretamente o metabolismo
das fecircmeas causando diminuiccedilatildeo da capacidade fisica e tornar os peixes uma presa faacutecil
para seus predadores Neste sentido os peixes poderatildeo ter menor sucesso reprodutivo e
se tornarem menos competitivos pelo alimento Do ponto de vista ecoloacutegico isso pode
acarretar alteraccedilotildees na populaccedilatildeo e na cadeia alimentar (Rodrigues amp Fanta 1998)
Nas condiccedilotildees que o estudo foi realizado como as concentraccedilotildees do inseticida
Thiodanreg que foram utilizadas o periacuteodo de exposiccedilatildeo e a espeacutecie de estudo conclui-se
que as fecircmeas podem estar em um processo inicial de intoxicaccedilatildeo um processo
patoloacutegico de recuperaccedilatildeo reversiacutevel
51
Figura 1 A Organizaccedilatildeo histoloacutegica do tecido hepaacutetico normal de A bimaculatus B Infiltrado leucocitaacuterio (IL) no tecido hepaacutetico de A bimaculatus C Hepatoacutecito com vesiacutecula clara (Vc) envolvida por glicogecircnio (G) marcado positivamente pela reaccedilatildeo de PAS e nuacutecleo (seta) deslocado na periferia da ceacutelula no experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo 56microgL-1 D Hepatoacutecito com ausecircncia de glicogecircnio evidenciada pela reaccedilatildeo negativa de PAS no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo 56microgL-1 Alteraccedilotildees de estaacutedio I - E Hepatoacutecito com nuacutecleo (seta) na perifieria F Atrofia nuclear (an) G Deformaccedilatildeo nuclear (dn) Nuacutecleo (N) e citoplasma (C) do hepatoacutecito sinusoacuteide (S) capilar (P) com hemaacutecias no interior acuacutemulo de glicogecircnio (G) no citoplasma e macroacutefagos (M) Barras A (30) B (65 microm) C e D (20 microm) E F e G (28 microm) Coloraccedilatildeo Azul de toluiacutedina em A-B e E-G e PAS em C e D
G S G
N
C
M
M
an
F E
Vc
IL G
B
C
A
D
G
dn
N
C
G
52
Dn
A
E
B
F
Figura 2 Alteraccedilotildees histoloacutegicas do tecido hepaacutetico de A bimaculatus Alteraccedilotildees de estaacutedio I-A Hipertrofia celular (seta) B Hipertrofia nuclear (seta) Alteraccedilotildees de estaacutedio II - C Degeneraccedilatildeo nuclear (Dn) D Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica (Dc) E Hiperemia () F Presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos (setas) Barras A B e E (30 microm) C D e F (25 microm) Coloraccedilatildeo Azul de toluiacutedina
C
A
Dc
D
53
Tabela 2 Valores meacutedios das temperaturas durante a realizaccedilatildeo dos experimentos
Tratamento Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Experimento 4 Controle 268plusmn105 254plusmn049 248plusmn069 250plusmn049
115mgL-1 271plusmn104 256plusmn059 247plusmn045 245plusmn040 23mgL-1 269plusmn117 255plusmn048 244plusmn062 247plusmn043 56mgL-1 269plusmn118 254plusmn048 244plusmn063 247plusmn038
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Legenda Experimento 1 - sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo Experimento 2 - sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo Experimento 3 - com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo Experimento 4 ndash com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo
Tabela 3 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquantitativa das alteraccedilotildees
histoloacutegicas (VMA) em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 130 plusmn 020a 210 plusmn 030b 215 plusmn 019b 216 plusmn 011b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 130 plusmn 012a 190 plusmn 020b 190 plusmn 008aᵇ 228 plusmn 056b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 125 plusmn 012a 210 plusmn 021b 206 plusmn 017b 218 plusmn 027b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 130 plusmn 014a 200 plusmn 025b 221 plusmn 035b 228 plusmn 021b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 4 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquantitativa dos iacutendices das
alteraccedilotildees histoloacutegicas (IAH) em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 883plusmn1034a 1850plusmn1009aᵇ 2883plusmn832b 2566plusmn550aᵇ
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 433plusmn557a 2883plusmn 810b 2780plusmn1388b 2766plusmn571b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 566plusmn 585a 2600plusmn773b 2550plusmn1078b 2733plusmn920b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 750plusmn512a 2217plusmn780b 2033plusmn875b 2366plusmn880b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Duncan
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Tabela 5 Diacircmetro meacutedio (microm) de nuacutecleos de hepatoacutecitos em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 461 plusmn 040aᶜ 498 plusmn 020b 487 plusmn 028b 439 plusmn 027c
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 516 plusmn 071a 501plusmn 040a 502 plusmn 020a 515plusmn025a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 494 plusmn 019a 496 plusmn 036a 492 plusmn 082a 508 plusmn 033a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 561 plusmn 044aᶜ 524 plusmn 040b ᶜ 509 plusmn 028b 533 plusmn 019c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 6 Diacircmetro meacutedio (microm) de citoplasmas de hepatoacutecitos de fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 885 plusmn 099a 1022 plusmn 109b 974 plusmn 080b 1005plusmn129b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1084 plusmn 136a 987 plusmn 153b 975 plusmn 081b 931 plusmn 080b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 960 plusmn 095a 1022 plusmn 094b 1003plusmn120aᵇ 1033 plusmn 108b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1086plusmn130aᵇ 104 plusmn 135b ᶜ 1022 plusmn 138c 1022 plusmn 106c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey
Tabela 7 Quantificaccedilatildeo meacutedia de nuacutecleos de hepatoacutecitos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 2553 plusmn 494a 298 plusmn 464b 284 plusmn 459b 291 plusmn 374b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 2371 plusmn 490a 289 plusmn 541b 289 plusmn 545b 290 plusmn 514b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 2560 plusmn 538a 294 plusmn 480b 286 plusmn 555b 293 plusmn 552b
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 2770 plusmn 594a 314 plusmn 1028b 347 plusmn 664b ᶜ 322 plusmn 654c
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
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Tabela 8 Quantificaccedilatildeo meacutedia de citoplasmas no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 39551 plusmn 1056a 39666 plusmn 877a 39360 plusmn 1526a 40080 plusmn 727a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 39996 plusmn 1307a 39830 plusmn 722a 39618 plusmn 1143ab 38865 plusmn 1954b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 39603 plusmn 1755a 39011 plusmn 1620b 39445 plusmn 1388aᵇ 39205 plusmn 2212aᵇ
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 39381 plusmn 3025a 38555 plusmn 2723b 39036 plusmn 2275aᵇ 39136 plusmn 1892b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Tabela 9 Quantificaccedilatildeo meacutedia de macroacutefagos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2
de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 120 plusmn 113a 125 plusmn 089a 101 plusmn 100a 106 plusmn 094a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 101 plusmn 101a 124 plusmn 079a 102 plusmn 084a 131 plusmn 092a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 098 plusmn 089a 128 plusmn 097a 115 plusmn 095a 096 plusmn 090a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 101 plusmn 094a 128 plusmn 109a 086 plusmn 079a 101 plusmn 079a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
Tabela 10 Quantificaccedilatildeo meacutedia de vasos sanguiacuteneos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 1875 plusmn 239a 133 plusmn 346a 1796 plusmn 1210a 1103 plusmn 465a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1603 plusmn 784aᵇ 1260 plusmn 532a 1409 plusmn 631aᵇ 2203 plusmn 685b
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 1830 plusmn 579a 2036 plusmn 773a 1681 plusmn 560a 1865 plusmn 964a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1850 plusmn 1400a 1831 plusmn 1326a 1510 plusmn 774a 1645 plusmn 739a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis
56
Tabela 11 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquatitativa de glicogecircnio nos hepatoacutecitos de fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 133 plusmn 051aᵇ 266 plusmn 081a 300 plusmn 000a 010plusmn 010b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 133 plusmn 051a 180 plusmn 109a 200 plusmn 109a 233 plusmn 103a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 216 plusmn 098a 116 plusmn 040a 216 plusmn 098a 233 plusmn 103a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 266 plusmn 081a 233 plusmn 103a 233 plusmn 103a 216 plusmn 098a
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis Tabela 12 Iacutendice hepatossomaacutetico de fecircmeas de lambaris A bimaculatus nos grupos
controles e grupos expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 070 plusmn 014aᵇ 088 plusmn 03a 084 plusmn 038a 038 plusmn 031b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 113 plusmn 054a 104 plusmn 061a 102 plusmn 050a 102 plusmn 051a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 066 plusmn 029a 073 plusmn 020a 092 plusmn 017a 091 plusmn 012a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 074 plusmn 034a 072 plusmn 029a 094 plusmn 040a 063 plusmn 018a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Duncan
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52 CAPIacuteTULO 2
EFEITOS DO INSETICIDA THIODAN reg SOBRE A MORFOLOGIA DO
DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM LAMBARIS Astyanax bimaculatus
RESUMO
O Thiodanreg eacute um toacutexico que pode causar alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos tecidos de peixes
expostos dependendo da concentraccedilatildeo A fim de investigar possiacuteveis alteraccedilotildees este
estudo avaliou a morfologia ovariana de lambaris Astyanax bimaculatus expostos ao
Thiodanreg (endosulfan 350gL) por 96 horas em quatro diferentes experimentos com trecircs
concentraccedilotildees subletais 115 23 e 56 microgL As fecircmeas expostas ao Thiodanreg foram
divididas em quatro experimentos sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem
aclimataccedilatildeo e alimentados com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e com
aclimataccedilatildeo de 10 dias e alimentados No presente estudo percebeu-se que a accedilatildeo do
Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou a morfologia do desenvolvimento
folicular Poreacutem os experimentos com aclimataccedilatildeo demonstraram quantidades
inferiores de foliacuteculos primaacuterios e secundaacuterios quando comparados aos peixes dos
experimentos sem aclimataccedilatildeo Houve maior quantidade de foliacuteculos atreacutesicos nos
grupos expostos ao Thiodanreg em relaccedilatildeo ao grupo controle O diacircmetro folicular nos
foliacuteculos secundaacuterios dos peixes expostos ao Thiodanreg no experimento com
adaptaccedilatildeocom alimentaccedilatildeo foi maior em relaccedilatildeo ao grupo controle Aleacutem disso as
meacutedias dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS) e hepatossomaacutetico (IHS) dos experimentos
com aclimataccedilatildeo foram inferiores aos experimentos sem aclimataccedilatildeo Esses dados
sugerem que o eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-ovaacuterio pode estar sendo afetado pelo ambiente
ao qual o peixe foi submetido podendo causar comprometimento na fisiologia do
desenvolvimento folicular
Palavras-chave histopatologia ovaacuterio peixe contaminaccedilatildeo aquaacutetica
63
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 α-endosulfan e 30 β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo
por meio da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em riscos os organismos que ali
residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al 2007)
Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos como jaacute
observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis niloticus
No entanto a Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan em
gordura valores de 005mgkg-1 (EPA 2002) e para aacutegua doce 022microgL-1 (EPA 1980)
A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em consideraccedilatildeo a
qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente Resoluccedilatildeo
CONAMA - nordm 3572005 estabelece o valor limite de 0056gL de resiacuteduo do referido
inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
Muitos inseticidas apresentam baixa toxicidade antes de serem transformados
em substacircncias toacutexicas metabolicamente ativas O sulfato de endosulfan eacute um dos
produtos derivados do metabolismo do endosulfan sendo considerado o principal
metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica por ser mais estaacutevel no meio
ambiente do que em sua foacutermula original (Ali et al 1984) A sensibilidade ao
endosulfan em organismos aquaacuteticos tem sido descrita na literatura (Capkin et al 2006
Ballesteros et al 2007 Pereira et al 2012) O produto eacute extremamente toacutexico para os
peixes e outros organismos aquaacuteticos mesmo em concentraccedilotildees muito pequenas
(Cengiz et al 2001) como verificado tambeacutem por Ballesteros et al (2007) com peixes
adultos da espeacutecie Jenynsia multidentata sob o efeito do endosulfan por 96 horas
utilizando concentraccedilotildees de 072 μgL e 131 μgL em machos e fecircmeas
respectivamente
Em peixes o desenvolvimento folicular tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Begovac amp Wallace 1988 Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter
1996 Grier 2000 2002 e 2007) e como nos animais em geral compreende os periacuteodos
preacute-meioacutetico perinucleolar vitelogecircnico e maturaccedilatildeo final Estas fases ocorrem no
64
interior de foliacuteculos cuja parede eacute constituiacuteda por zona radiata camada folicular
membrana basal e teca (Grier 2000) e que desempenham importante papel durante a
ovogecircnese e fertilizaccedilatildeo Quando a qualidade da aacutegua eacute alterada devido a xenobioacuteticos
a gametogecircnese pode ser alterada comprometendo a fertilizaccedilatildeo e a qualidade do ovo
(Chatterjee et al 1997) Assim os peixes quando expostos a inseticidas podem
apresentar alteraccedilotildees morfoloacutegicas significativas no ovaacuterio
Alguns trabalhos mostram diversas alteraccedilotildees provocadas nos foliacuteculos por
contaminantes como por exemplo retraccedilatildeo citoplasmaacutetica degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica
adesatildeo folicular aparecimento de foliacuteculos anucleados necrose e alteraccedilatildeo no diacircmetro
dos foliacuteculos (Hazarika amp Das 1998 Dutta et al 2003 Maxwell amp Dutta 2005) Aleacutem
disso pode ocorrer a atresia folicular que eacute um processo frequentemente observado nos
ovaacuterios dos vertebrados (Saidapur 1978) sendo causada por diversos fatores como
agrotoacutexicos temperatura luz alimentaccedilatildeo inadequada e confinamento (Nagahama
1983 Guraya 1986) Outro fator importante eacute a concentraccedilatildeo hormonal que pode
interferir na siacutentese de vitelogenina e causar efeitos negativos associados com a
quantidade de foliacuteculos preacute-vitelogecircnicos e vitelogecircnicos durante o desenvolvimento
folicular (Chatterjee et al 1997) No entanto alteraccedilotildees no estado de sauacutede provocadas
por concentraccedilotildees de contaminamtes que natildeo matam os peixes em curto prazo e que
podem ser consideradas seguras podem sugerir consequecircncias na reproduccedilatildeo e
interferecircncia na cadeia alimentar Esse tipo de estudo eacute de grande importacircncia para se
avaliar impactos provocados por diferentes tratamentos sobre o desenvolvimento de
foliacuteculos que poderiam interferir na reproduccedilatildeo de peixes
O lambari Astyanax bimaculatus foi escolhido como organismo experimental
pois eacute representativo no ecossistema sendo encontrado desde Nordeste brasileiro ateacute a
bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Eacute um peixe de pequeno porte e
de faacutecil manutenccedilatildeo em laboratoacuterio
Este estudo teve como objetivo analisar as alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos
diferentes estaacutedios do desenvolvimento folicular em ensaios subletais com o toacutexico
Thiodanreg
65
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste subletal e as atividades de coleta As etapas
de fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos ovaacuterios microtomia coloraccedilatildeo de lacircminas
histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e morfomeacutetricas foram realizadas nos
Laboratoacuterios de Biologia de Peixes e de Histopatologia do Departamento de Veterinaacuteria
da UFV
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos animais em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado e poro genital
dilatado e vascularizado
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV e
mantidos em aquaacuterios com capacidade de 50 litros numa densidade de 05g de peixe por
litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro temperatura controlada e monitoramento
duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e
aeraccedilatildeo continua de aacutegua para garantir o bem-estar dos peixes Os peixes foram
alimentados com raccedilatildeo comercial Purina contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia
de acordo com o manejo da piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
66
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste de toxicidade subletal em sistema estaacutetico
O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi realizado utilizando-se 120
lambaris tendo por base as normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico (NBR 15088
- ABNT 2007)
As fecircmeas foram expostas ao Thiodanreg (endosulfan 350gL) por 96 horas em
quatro diferentes experimentos sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem aclimataccedilatildeo e
com alimentaccedilatildeo com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e com aclimataccedilatildeo de
10 dias e com alimentaccedilatildeo Foram utilizadas trecircs concentraccedilotildees do Thiodanreg inferiores
agrave CL50 preacute-determinada (137microgL) em laboratoacuterio de acordo com a NBR 15088
(ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas em cada experimento foram de 115 23 e
56microgL-1 aleacutem de um grupo controle sem toacutexico com trecircs repeticcedilotildees nas mesmas
condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
24 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas
Apoacutes 96 horas de experimento foram coletados 96 peixes sendo seis animais de
cada grupo nos diferentes experimentos Os ovaacuterios foram coletados apoacutes os peixes
terem sido anestesiados com benzocaiacutena (110000) e eutanasiados pela secccedilatildeo
transversal da coluna vertebral na regiatildeo do opeacuterculo
Para a histologia os ovaacuterios foram fixados em paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo
fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedos em resina glicolmetacrilato (Leica
Historesin) Em seguida secccedilotildees 3microm de espessura foram coradas utilizando
hematoxilinaeosina para anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas As lacircminas foram
montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e
as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
Para os estudos morfoloacutegicos foram analisadas lacircminas de seis animais por
concentraccedilatildeo As secccedilotildees histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo em busca
de alteraccedilotildees morfoloacutegicas foliculares (Tabela 1) que pudessem ser representativas da
67
accedilatildeo do Thiodanreg no tecido ovariano sempre comparando estas alteraccedilotildees com o
padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios das lacircminas dos grupos controles
Para a avaliaccedilatildeo morfomeacutetrica foram realizadas contagens dos diferentes
estaacutedios de desenvolvimento folicular Para isto foram fotografados ao acaso 10
campos com objetiva de 10X (cada campo com 5094 microm de largura por 6812 microm de
comprimento totalizando uma aacuterea de 347 mmsup2) As contagens foram realizadas em 10
campos escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro experimentos Aleacutem disso foi
realizada a contagem de foliacuteculos atreacutesicos e observados eosinoacutefilos associados aos
foliacuteculos vitelogecircnicos utilizando o microscoacutepio com objetiva de 40X em 10 foliacuteculos
escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro tratamentos experimentais Tambeacutem
foram realizadas mediccedilotildees de diacircmetros em 10 foliacuteculos vitelogecircnicos para cada animal
Foram escolhidos foliacuteculos o mais esfeacutericos possiacutevel com corte passando pelo nuacutecleo
Estas medidas foram obtidas por meio do programa Image-Pro Plus traccedilando-se duas
linhas perpendiculares sobre nuacutecleo e respeitando-se os limites do foliacuteculo Em todas as
contagens e mediccedilotildees foram calculados os valores meacutedios e desvios-padratildeo para cada
concentraccedilatildeo para se avaliar o desenvolvimento folicular nos diferentes experimentos
Tabela 1 Alteraccedilotildees histoloacutegicas quanto ao comprometimento do desenvolvimento folicular (adaptado de Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008)
ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS FOLICULARES Alteraccedilatildeo nos foliacuteculos Descolamento do revestimento folicular Retraccedilatildeo citoplasmaacutetica Retraccedilatildeo nuclear Atresia folicular Aglutinaccedilatildeo nucleoplasmaacutetica Aglutinaccedilatildeo citoplasmaacutetica Aglutinaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo Foliacuteculos com ausecircncia de citoplasma e nuacutecleo Granuloacutecitos envolvendo foliculos
25 Paracircmetros biomeacutetricos
Foram registrados para cada exemplar os seguintes dados biomeacutetricos peso
corporal (PC em g) peso dos ovaacuterios (PO em g) e peso do fiacutegado (PF em g) Os
valores meacutedios e os desvios padratildeo dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS=POx100PC) e
68
hepatossomaacutetico (IHS=PFx100PC) foram calculados para cada animal em cada um
dos grupos nos diferentes experimentos
26 Anaacutelises estatiacutesticas
Os dados foram apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo e avaliados pelo
Software Statistica 70 por meio da anaacutelise de variacircncia (ANOVA) Apoacutes o teste de
distribuiccedilatildeo normal os dados foram comparados entres os grupos controle e grupos
expostos ao Thiodanreg usando anaacutelise de variacircncia one-way seguida do teste de Tukey
ou Duncan Quando os dados natildeo apresentaram uma distribuiccedilatildeo normal foi utilizado o
teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis Plt005 foi utilizado como criteacuterio de
significacircncia
3 RESULTADOS
31 Desenvolvimento folicular
O desenvolvimento folicular de A bimaculatus do presente estudo foi dividido em
duas etapas desenvolvimento primaacuterio e desenvolvimento secundaacuterio
Para facilitar a compreensatildeo o desenvolvimento primaacuterio em A bimaculatus foi
subdividido em dois estaacutedios desenvolvimento primaacuterio inicial e desenvolvimento
primaacuterio avanccedilado (Figuras 1 A e B) No desenvolvimento primaacuterio inicial os foliacuteculos
apresentaram citoplasma fortemente basoacutefilo nuacutecleo esfeacuterico um ou mais nucleacuteolos
dispersos pelo nucleoplasma e estavam envoltos por ceacutelulas foliculares pavimentosas
(Figura 1 A) Durante o desenvolvimento primaacuterio avanccedilado o citoplasma do foliacuteculo
torna-se menos basoacutefilo que a etapa anterior o nuacutecleo eacute esfeacuterico um ou mais nucleacuteolos
dispersos que estatildeo associados ao envoltoacuterio nuclear (Figura 1 B) A camada de ceacutelulas
foliculares eacute pavimentosa com o nuacutecleo alongado Entre as ceacutelulas foliculares e o
citoplasma do foliacuteculo aparece a zona radiata como uma fina camada (Figura 1 B) Na
regiatildeo mais externa do foliacuteculo aparecem associadas ao mesmo as ceacutelulas da teca
O desenvolvimento secundaacuterio em A bimaculatus foi subdividido em trecircs
estaacutedios desenvolvimento secundaacuterio inicial desenvolvimento intermediaacuterio e
desenvolvimento avanccedilado No desenvolvimento secundaacuterio inicial o volume
citoplasmaacutetico aumentou mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo e o foliacuteculo neste estaacutedio
apresentou um diacircmetro maior que o estaacutedio anterior O nuacutecleo eacute central ligeiramente
acidoacutefilo com nucleacuteolos pequenos e dispersos pelo nucleoplasma O citoplasma eacute
69
granular e fracamente basoacutefilo com a presenccedila de vesiacuteculas corticais pequenas e claras
na periferia do citoplasma (Figura 1 C) Em seguida ocorre um aumento no diacircmetro do
foliacuteculo e inicia-se a deposiccedilatildeo de vitelo a partir da regiatildeo perifeacuterica o que permitiu
classificar esse estaacutedio como desenvolvimento secundaacuterio intermediaacuterio (Figura 1 D)
No estaacutedio de desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado o volume citoplasmaacutetico
aumentou mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo tendo o foliacuteculo neste estaacutedio um diacircmetro maior
quando comparado aos estaacutedios anteriores Nessa etapa do desenvolvimento o
citoplasma do foliacuteculo estaacute preenchido com gloacutebulos de vitelo (Figura 1 D) A
maturaccedilatildeo final eacute caracterizada pela formaccedilatildeo do aparelho micropilar zona radiata
espessa e nuacutecleo deslocado em direccedilatildeo ao aparelho micropilar
Os foliacuteculos ovarianos dos lambaris apresentaram morfologia normal nas
diferentes concentraccedilotildees de Thiodanreg (Figuras 1 A-D)
32 Atresia folicular
A atresia folicular foi caracterizada em trecircs diferentes etapas nos ovaacuterios de A
bimaculatus atresia inicial intermediaacuteria e avanccedilada A atresia folicular inicial eacute
caracterizada pela descontinuidade da zona radiata e hipertrofia das ceacutelulas foliculares
(Figura 2 A) Nesse momento da atresia folicular foram evidenciadas ceacutelulas do tipo
granuloacutecito entre a membrana basal e ceacutelulas da teca na maioria dos foliacuteculos
observados (Figura 2 B) Na sequecircncia do processo atresia folicular intermediaacuteria
ocorre o iniacutecio da fusatildeo e liquefaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo desintegraccedilatildeo e
fragmentaccedilatildeo da zona radiata hipertrofia das ceacutelulas foliculares que se tornam
vacuolizadas e contecircm material granular de aspecto similar aos gloacutebulos de vitelo e
invasatildeo do citoplasma pelas ceacutelulas foliculares (Figura 2 C) Na atresia avanccedilada as
ceacutelulas foliculares absorvem os resiacuteduos finais do foliacuteculo levando a uma diminuiccedilatildeo
do tamanho do foliacuteculo atreacutesico (Figura 2 D)
33 Quantificaccedilatildeo dos foliacuteculos ovarianos
A quantidade de foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio inicial entre as fecircmeas
do mesmo experimento natildeo mostrou diferenccedilas entre si (Pgt005) (Figura 3) Quando
foram comparados os diferentes experimentos nos mesmos grupos foi registrada maior
quantidade de foliacuteculos primaacuterios iniciais nas fecircmeas do grupo controle do experimento
com aclimataccedilatildeoalimentaccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo agraves fecircmeas dos grupos controle dos
70
experimentos sem aclimataccedilatildeo (Figura 3) Aleacutem disso foi observada maior quantidade
de foliacuteculos primaacuterios iniciais na concentraccedilatildeo de 23microgL do experimento com
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo em relaccedilatildeo ao experimento sem aclimataccedilatildeocom
alimentaccedilatildeo (Plt005) (Figura 3)
Na contagem de foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado entre fecircmeas
do mesmo experimento natildeo houve diferenccedilas nas meacutedias obtidas (Figura 4) No entanto
quando comparados os mesmos grupos entre os diferentes experimentos verificou-se
que no estaacutedio de desenvolvimento primaacuterio avanccedilado houve maior quantidade de
foliacuteculos no grupo controle do experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Plt005)
em relaccedilatildeo ao experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo assim como no
experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Figura 4) Quando comparados os
grupos da concentraccedilatildeo 115microgL registrou-se maior quantidade de foliacuteculos no
experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo ao experimento
sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Figura 4) Entre as fecircmeas dos grupos da
concentraccedilatildeo 23microgL foi registrada maior quantidade de foliacuteculos nos experimentos
com aclimataccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo agraves fecircmeas dos experimentos sem aclimataccedilatildeo
(Figura 4)
Na contagem de foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio inicial nas fecircmeas do
experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo houve maior quantidade de foliacuteculos na
concentraccedilatildeo 56microgL (Plt005) em relaccedilatildeo agrave concentraccedilatildeo de 115microgL (Figura 5) mas
natildeo com o controle Ao comparar as fecircmeas dos diferentes experimentos dos mesmos
grupos houve maior quantidade de foliacuteculos secundaacuterios iniciais (Plt005) na
concentraccedilatildeo 115microgL do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e
experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo em relaccedilatildeo ao experimento sem
aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Figura
5)
Em relaccedilatildeo as contagens de foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio
intermediaacuterio e avanccedilado natildeo houve diferenccedilas entre as fecircmeas (Pgt005) (Figuras 6 e 7)
34 Quantificaccedilatildeo dos foliacuteculos atreacutesicos
Nas contagens de foliacuteculos atreacutesicos iniciais nas fecircmeas de A bimaculatus dos
diferentes experimentos natildeo foram constatadas diferenccedilas (Pgt005) (Figura 8) As
contagens de atresia total representaram as somas das contagens de atresias inicial
intermediaacuteria e avanccedilada As contagens de atresia total natildeo mostraram diferenccedilas nos
71
experimentos embora o nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos mostrasse tendecircncia crescente
nos grupos tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos (Figura 9) Entretanto
foi observado maior nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos nas fecircmeas dos experimentos com
aclimataccedilatildeo de 10 dias em relaccedilatildeo aos experimentos sem aclimataccedilatildeo (Figura 9)
35 Diacircmetro dos foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado
Os valores meacutedios nos diacircmetros dos foliacuteculos secundaacuterio avanccedilado nas fecircmeas
do experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo demonstraram aumento (Plt005) nas
concentraccedilotildees 115microgL (57837plusmn5977microm) e 56microgL (57311plusmn6178microm) de Thiodanreg
em relaccedilatildeo agraves fecircmeas do grupo controle (51606plusmn5757 microm) Nos demais experimentos
natildeo foram registradas diferenccedilas entre os foliacuteculos (Pgt005) apesar de ter sido
observado na maioria dos grupos essa mesma tendecircncia de aumento do diacircmetro dos
foliacuteculos (Tabela 2)
36 Paracircmetros biomeacutetricos
As fecircmeas de A bimaculatus dos grupos expostos ao Thiodanreg natildeo apresentaram
diferenccedilas (Pgt005) nos valores dos IGS e IHS quando comparados com os grupos
controles (Tabelas 3 e 4) No entanto as fecircmeas dos experimentos com aclimataccedilatildeo
apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores dos IGS e IHS quando comparados aos
experimentos sem aclimataccedilatildeo (Tabelas 3 e 4)
4 DISCUSSAtildeO
Em peixes teleoacutesteos o tipo de desenvolvimento folicular pode ser assincrocircnico
com a presenccedila de foliacuteculos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento (Nagahama
1983 Connaughton et al 1998 Selman et al 1986) assim como na presente espeacutecie
deste estudo Os ovaacuterios das fecircmeas de A bimaculatus submetidas ao efeito do
Thiodanreg apresentaram foliacuteculos ovarianos em diferentes fases de desenvolvimento com
variaccedilotildees na estrutura do foliacuteculo como diacircmetro caracteriacutesticas do nuacutecleo camadas
envoltoacuterias composiccedilatildeo e distribuiccedilatildeo do vitelo conforme observado em outras
espeacutecies do gecircnero (Miranda 1996 Miranda et al 1999 Melo et al 2005 Mazzoni et
al 2005 Rodrigues et al 2005 Hernan Da Cuntildea et al 2011)
Ao contraacuterio do presente estudo Dutta et al (2008) ao submeterem as fecircmeas da
espeacutecie Lepomis macrochirus a trecircs concentraccedilotildees diferentes (025 075 e 1 microgL) de
endosulfan observaram comprometimento do desenvolvimento folicular com retraccedilatildeo
72
nuclear e citoplasmaacutetica na menor concentraccedilatildeo enquanto nos foliacuteculos em maturaccedilatildeo
avanccedilada foi observado um aspecto vazio sem conteuacutedo citoplasmaacutetico na
concentraccedilatildeo de 075 microgL Aleacutem disso na concentraccedilatildeo de 1microgL os autores
encontraram maior grau de deformaccedilotildees com foliacuteculos vazios sem a presenccedila de
foliacuteculos ou alteraccedilotildees do nuacutecleo e perda do material nuclear que eacute relatado como
necrose nuclear No trabalho conduzido por Chartterjee et al (1997) foi avaliada a accedilatildeo
do carbofuram no desenvolvimento folicular na espeacutecie Heteropneustes fossilis
encontrando-se degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica e na camada folicular de foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio Entretanto Hernan Da Cuntildea et al (2011) natildeo
observaram alteraccedilotildees nos ovaacuterios em peixes expostos ao endosulfan No estudo
realizado por Ballesteros et al (2007) utilizando peixes machos e fecircmeas da espeacutecie
Jenynsia multidentata foi verificado que o maior teor de lipiacutedeos nas fecircmeas eacute um fator
importante para esclarecer a maior resistecircncia contra o endosulfan ao contraacuterio dos
machos que satildeo mais suceptiacuteveis neste caso De acordo com este resultado descrito na
literatura pode-se inferir que este fator poder ter interferido na maior resistecircncia das
fecircmeas de A bimaculatus em periacuteodo reprodutivo agraves concentraccedilotildees de Thiodanreg
testadas
Alguns estudos tecircm esclarecido a interferecircncia de poluentes na quantidade de
foliacuteculos nos diferentes estaacutedios do desenvolvimento folicular em peixes Os trabalhos
de Chartterjee et al (1997) Jensen et al (2004) Dutta amp Dalal (2008) e Chakrabarty et
al (2012) avaliaram os efeitos de pesticidas encontrando maior quantidade de foliacuteculos
primaacuterios no grupo tratado em relaccedilatildeo ao grupo controle assim como em peixes
mantidos em cativeiros (Honji et al 2009) Em outro estudo (Chatterjee et al 2001) os
pesquisadores encontraram por meio de anaacutelises histoloacutegicas da hipoacutefise a
possibilidade do carbofuran afetar as ceacutelulas produtoras de GnRH do hipotaacutelamo
prejudicando o eixo hipoacutefise-gocircnada e comprometendo a viabilidade no
desenvolvimento folicular jaacute Chakrabarty et al (2012) verificaram em peixes tratados
com endosulfan concentraccedilatildeo inferior de GnRH e superior da aromatase quando
comparados com o gurupo controle caracterizando que o endosulfan pode atuar como
disruptor endoacutecrino (Lemaire et al 2006) que pode aumentar a biossiacutentese do estradiol
para promover um raacutepido desenvolvimento folicular (Chakrabarty et al 2012) Estes
resultados podem ajudar a esclarecer os resultados do presente trabalho onde se
observou maior quantidade de foliacuteculos primaacuterios iniciais e primaacuterios avanccedilados nos
experimentos com aclimataccedilatildeo quando comparados com os experimentos sem
73
aclimataccedilatildeo sugerindo uma possiacutevel desregulaccedilatildeo endoacutecrina no eixo hipoacutefise-gocircnada
nos peixes aclimatados em aquaacuterios por 10 dias Aleacutem disso as concetraccedilotildees hormonais
e enzimaacuteticas relacionadas ao desenvolvimento folicular podem estar supostamente
alteradas em A bimaculatus mas satildeo necessaacuterios estudos fisioloacutegicos para essa
provaacutevel confirmaccedilatildeo
O processo de atresia folicular no lambari A bimaculatus foi semelhante ao
descrito por Miranda et al (1999) Munoz et al (2002) Melo et al (2005) e Santos et
al (2005) O processo da atresia que ocorre nos foliacuteculos secundaacuterios eacute do tipo
hipertroacutefico devido agrave hipertrofia e hiperplasia das ceacutelulas foliculares (Vizziano amp
Berois 1990) No trabalho realizado por Coward amp Bromage (1998) na espeacutecie Tilapia
zilli foi verificado aumento de foliacuteculos atreacutesicos em experimento com duraccedilatildeo entre 18
e 26 dias assim como verificado no trabalho de Jensen et al (2004) quando utilizaram a
substacircncia flutamida De acordo com estes autores isto pode reduzir a fecundidade e
tambeacutem influenciar na qualidade do foliacuteculo Linares-Casenave et al (2002) explicam
que o processo de atresia estaacute associado com desregulaccedilatildeo das concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de estradiol testosterona e vitelogenina Portanto o aumento da quantidade
dos foliacuteculos atreacutesicos nos grupos expostos ao Thiodanreg e a maior quantidade de atresia
nos experimentos com aclimataccedilatildeo mesmo natildeo apresentando diferenccedilas estatiacutesticas
sugerem que pode estar iniciando desregulaccedilatildeo hormonal nestes peixes
A presenccedila de granuloacutecitos associados aos foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados em
lambari A bimaculatus nos diferentes experimentos pode ser associada agrave reaccedilatildeo
imunoloacutegica em conjunto com as ceacutelulas foliculares assim como observado por alguns
autores (Drummond et al 2000 Santos et al 2005 Santos et al 2008) Aleacutem disso no
trabalho realizado por Santos et al (2008) foi detectada a presenccedila de proliferaccedilatildeo
celular (PCNA) nas ceacutelulas da teca de foliacuteculos em processo de atresia confirmando
que estas ceacutelulas podem estar se preparando para o processo de remodelaccedilatildeo ovariana
No entanto essas evidecircncias de granuloacutecitos associados aos foliacuteculos estatildeo de acordo
com o que jaacute foi observado em outros trabalhos caracterizando um processo fisioloacutegico
importante na regressatildeo folicular das fecircmeas de A bimaculatus expostas ao Thiodanreg
O diacircmetro dos foliacuteculos vitelogecircnicos eacute espeacutecie-especiacutefico poreacutem o Thiodanreg
alterou o diacircmetro folicular no experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo Esta
alteraccedilatildeo do diacircmetro que leva os foliacuteculos vitelogecircnicos a atingirem a maturaccedilatildeo pode
ser causada pelas diferenccedilas nas concentraccedilotildees de vitelogenina estradiol e aromatase
(Jensen et al 2004 Corriero et al 2007 Chakrabarty et al 2012) ou a mesma sendo
74
ligada aos receptores especiacuteficos nos foliacuteculos (Patintildeo amp Sullivan 2002 Bugel et al
2010) Bugel et al (2010) relataram a diminuiccedilatildeo da expressatildeo da vitelogenina no peixe
Fundulus heteroclitus em rio contaminado com pesticidas orgacircnicos persistentes o que
resultou na diminuiccedilatildeo da quantidade de foliacuteculos vitelogecircnicos enquanto Honji et al
(2009) relataram a baixa fecundidade e aumento do diacircmetro dos foliacuteculos nos peixes
Salminus hilari mantidos em cativeiro quando comparados com peixes de ambientes
naturais Contudo eacute necessaacuterio estudar as vias que conduzem a esta alteraccedilatildeo Estes
resultados mostram que diferentes vias podem afetar a reproduccedilatildeo dos peixes e que o
Thiodanreg pode estar agindo como desregulador endoacutecrino nos foliacuteculos secundaacuterios
avanccedilados de A bimaculatus
O IGS e IHS podem variar entre os peixes devido agraves diferenccedilas na sensibilidade
frente agrave exposiccedilatildeo a contaminantes periacuteodo reprodutivo e peixes mantidos em cativeiro
(Chatterjee et al 1997 Cyrino et al 2000 Jensen et al 2004 Honji et al 2009) No
entanto o fato das meacutedias dos IGS e IHS nos experimentos com aclimataccedilatildeo terem sido
menores quando comparadas com os experimentos sem aclimataccedilatildeo sugere associaccedilatildeo
entre quantidade inferior de foliacuteculos secundaacuterios e quantidade superior de atresia nos
experimentos com aclimataccedilatildeo assim como no trabalho de Chatterjee et al (1997) e
Bugel et al (2010) que verificaram diminuiccedilatildeo na taxa de foliacuteculos vitelogecircnicos e
IGS
A ventilaccedilatildeo branquial acelerada e a natildeo procura por alimentos nas primeiras 24
horas observadas nos diferentes experimentos sugere que a entrada de aacutegua pela via
branquial foi causa direta da absorccedilatildeo e difusatildeo do toacutexico no organismo No entanto a
via epideacutermica tambeacutem poder ser considerada via de entrada do toacutexico para os tecidos
(Mckim et al 1999) Portanto a exposiccedilatildeo dos peixes ao Thiodanreg e a aclimataccedilatildeo
foram fatores mais que afetaram o diacircmetro e a quantidade de foliacuteculos em A
bimaculatus Conforme as condiccedilotildees em que o estudo foi realizado levando-se em
consideraccedilatildeo as concentraccedilotildees do inseticida Thiodanreg utilizadas periacuteodo de exposiccedilatildeo e
espeacutecie de estudo demonstram que as fecircmeas analisadas podem estar em processo
inicial de intoxicaccedilatildeo com possiacutevel alteraccedilatildeo fisioloacutegica
75
A
opa
opi opa
vs
D
osint
osa
osa
gv gv
gv
osi
C
B
opa
opa
zr
vc
Figura 1 Desenvolvimento folicular ovariano de Astyanax bimaculatus A Estroma ovariano com foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio inicial (opi) e primaacuterio avanccedilado (opa) B Foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (opa) com ceacutelulas foliculares pavimentosas e zona radiata delgada (zr) C Foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio inicial (osi) possuindo ceacutelulas foliculares pavimentosas com zona radiata espessa (zr) e vesiacuteculas corticais claras (vc) na periferia do foliacuteculo D Foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio intermediaacuterio iniciando deposiccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo (osint) e foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (osa) com gloacutebulos de vitelo (gv) por todo o citoplasma vs vaso sanguiacuteneo Coloraccedilatildeo Hematoxilina-eosina Barra A e B (50 m) C (30 m) D (100 m)
zr
76
ai
gr gr
zr
h
av
A
ait
Figura 2 Foliacuteculos ovarianos de Astyanax bimaculatus em atresia A Atresia folicular inicial (ai) caracterizada pela quebra da zona radiata (zr) hipertrofia de ceacutelulas foliculares (cf) e presenccedila de granuloacutecitos (gr) B Detalhe de granuloacutecito (gr) sobre a regiatildeo de ceacutelulas foliculares C Atresia folicular intermediaacuteria (ait) caracterizada pela liquefaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo (gv) desintegraccedilatildeo da zona radiata e invasatildeo do citoplasma pelas ceacutelulas foliculares D Atresia folicular avanccedilada (av) caracterizada pela ausecircncia de gloacutebulos de vitelo Ceacutelulas da teca (t) hemaacutecias (h) Coloraccedilatildeo Hematoxilina-eosina Barra A (25 m) B (10 m) C (150 m) D (100 m)
gv
ai
B
C D
t
gv
77
Figura 3 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos primaacuterios iniciais por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e expostos ao Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dentro dos grupos (Plt005) pelo teste de Duncan Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
0
5
10
15
20
25
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
A A
AB
B
AB
A
AB
B
0
1
2
3
4
5
6
7
8
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 4 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos primaacuterios avanccedilados por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dentro dos grupos (Plt005) pelo teste de Duncan Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005)
A
BC AC
BD
AC
BC
AB A A
B
B
A
78
0
02
04
06
08
1
12
14
16
controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
tid
ad
e m
eacuted
ia d
e o
voacuteci
tos
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedilas entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dos grupos com as mesmas concentraccedilotildees nos diferentes experimentos (Plt005) ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) Teste de Duncan
A
B
A
B
ab b
a ab
Figura 5 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios iniciais por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
0
01
02
03
04
05
06
07
08
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controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
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ad
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voacuteci
tos Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 6 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Plt005) pelo teste de Duncan
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1
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controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
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Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Figura 7 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Duncan
Figura 8 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos atreacutesicos iniciais em ovaacuterios de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Kruskall Wallis
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03
controle 115microgL 23microgL 56microgL
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ad
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Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
80
Figura 9 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos atreacutesicos totais em ovaacuterios de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas
0
005
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controle 115microgL 23microgL 56microgL
Qu
an
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ad
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eacuted
ia d
e a
tre
sia
Sem aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Sem aclimataccedilatildeo
Com alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Sem alimentaccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
Com aclimataccedilatildeo
As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Kruskall Wallis
81
Tabela 2 Diacircmetro meacutedio (microm) de foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados de lambaris A bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
53443 plusmn 7414a 53796 plusmn 7746a 53273 plusmn 8300a 50046 plusmn 5610a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
56807 plusmn 6647a 57517 plusmn 5849a 5904 plusmn 5889a 58449 plusmn 6849a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
53816 plusmn 5684a 51894 plusmn 6065a 55393 plusmn 6193a 54749 plusmn 6849a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
51606 plusmn 5757a 57837 plusmn 5977b 55774 plusmn 7870aᵇ 57311 plusmn 6178b
Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Tukey
Tabela 3 Iacutendice gonadossomaacutetico de fecircmeas de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
790 plusmn 318a 747 plusmn 221a 505 plusmn 263a 432 plusmn 255a
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
856 plusmn 473a 813 plusmn 690a 702 plusmn 430a 683 plusmn 361a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
373 plusmn 213a 270 plusmn 147a 323 plusmn 189a 399 plusmn 201a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
227 plusmn 147a 303 plusmn 106a 305 plusmn 192a 293 plusmn 167a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Duncan
Tabela 4 Iacutendice hepatossomaacutetico de fecircmeas de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos
Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL
sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
07 plusmn 014aᵇ 088 plusmn 03a 084 plusmn 038a 038 plusmn 031b
sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
113 plusmn 054a 104 plusmn 061a 102 plusmn 050a 102 plusmn 051a
com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo
066 plusmn 029a 073 plusmn 020a 092 plusmn 017a 091 plusmn 012a
com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo
074 plusmn 034a 072 plusmn 029a 094 plusmn 040a 063 plusmn 018a
Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Duncan
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53 CAPIacuteTULO 3
RELACcedilAtildeO ENTRE COLAacuteGENO TIPO IV INTEGRINA β1 E CASPASE 3
DURANTE O DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM Astyanax bimaculatus
EXPOSTOS AO THIODAN reg
RESUMO
O agrotoacutexico Thiodanreg (350gL de endosulfan) eacute um inseticida organoclorado utilizado
em diversas monoculturas e pode chegar aos ecossistemas aquaacuteticos afetando a
reproduccedilatildeo e a integridade das populaccedilotildees de peixes Ovaacuterios de peixes apresentam
ovoacutecitos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento os quais satildeo envoltos por zona
radiata ceacutelulas foliculares membrana basal e ceacutelulas da teca formando o complexo
folicular A integridade do complexo folicular estaacute associada com a presenccedila de
colaacutegeno tipo IV e integrina β1 enquanto a caspase 3 eacute uma protease importante na via
apoptoacutetica participando ativamente nos processos de regressatildeo ovariana Pela carecircncia
de estudos que avaliam tais proteiacutenas no complexo folicular este estudo teve por
objetivo avaliar por meio de anaacutelise imunoistoquiacutemica a expressatildeo das proteiacutenas
colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspases 3 durante o desenvolvimento folicular do
lambari Astyanax bimaculatus exposto ao Thiodanreg Os peixes foram aclimatados
durante 10 dias em aquaacuterios de 50L com aeraccedilatildeo contiacutenua aacutegua sem cloro filtro
mecacircnico fotoperiacuteodo (12h) e temperatura (26plusmn1ordmC) controlados Para a exposiccedilatildeo ao
Thiodanreg os peixes foram divididos em quatro grupos controle 115 23 e 56 microgL
com trecircs repeticcedilotildees em cada concentraccedilatildeo Apoacutes 96 h seis peixes de cada grupo foram
anestesiados (benzocaiacutena110000) eutanasiados e seus ovaacuterios coletados para detecccedilatildeo
de colaacutegeno de tipo IV integrina β1 e caspase 3 Fragmentos dos ovaacuterios foram fixados
em paraformaldeiacutedo a 4 e incluiacutedos em parafina Os procedimentos de
imunomarcaccedilatildeo seguiram protocolos jaacute padronizados para os anticorpos empregados A
reaccedilatildeo foi revelada com diaminobenzidina e os cortes foram contracorados com
hematoxilina para avaliaccedilatildeo qualitativa em microscoacutepio de luz Os foliacuteculos primordiais
natildeo apresentaram marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 Nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio observou-se reaccedilatildeo fracamente positiva no citoplasma das
ceacutelulas foliculares enquanto foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio foram mais
intensamente marcados para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV A imunomarcaccedilatildeo para
caspase 3 foi evidenciada nas ceacutelulas foliculares durante o desenvolvimento secundaacuterio
sendo mais intensa no estaacutedio avanccedilado Qualitativamente essas anaacutelises demonstraram
87
marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento folicular mesmo com os
peixes expostos a diferentes concentraccedilotildees de Thiodanreg o que caracteriza a integridade
das ceacutelulas foliculares e da via apoptoacutetica caspase-3-dependente que pode estar sendo
ativada para futuros processos de regressatildeo folicular
Palavras-chave ecotoxicologia aquaacutetica ovaacuterio peixes e reproduccedilatildeo
1 INTRODUCcedilAtildeO
O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois
isocircmeros ativos sendo 70 de α-endosulfan e 30 de β-endosulfan Endosulfan eacute um
hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos
por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)
Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O
toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo
por meio da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em riscos toxicoloacutegicos os
organismos que ali residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al
2007) Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos
como jaacute observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis
niloticus No entanto a Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan
em gordura o valor de 005mgkg-1 (EPA 2002) e em aacutegua doce 022microgL-1 (EPA
1980) A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em
consideraccedilatildeo a qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente
Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm 3572005 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo
do referido inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1
Muitos inseticidas apresentam baixa toxicidade antes de serem transformados
em substacircncias toacutexicas metabolicamente ativas O sulfato de endosulfan eacute um dos
produtos derivados do metabolismo do endosulfan sendo considerado o principal
metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica por ser mais estaacutevel no meio
ambiente em relaccedilatildeo a sua formula original (Ali et al 1984) A sensibilidade dos
organismos aquaacuteticos ao endosulfan eacute baixa e tem sido bem descrita na literatura por
alguns autores (Cengiz et al 2001 Capkin et al 2006 Ballesteros et al 2007 Pereira
et al 2012) sendo os machos geralmente mais sensiacuteveis que as fecircmeas pelo
armazenamento de lipiacutedeos para produccedilatildeo do vitelo e fornecimento de energia e pelo
tamanho maior da fecircmea em relaccedilatildeo ao macho (Ballesteros et al 2007)
88
O desenvolvimento folicular em peixes tem sido descrito por vaacuterios
pesquisadores (Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter 1996 Begovac amp Wallace
1988 Grier 2000 2002 e 2007) e como nos animais em geral compreende os periacuteodos
preacute-meioacutetico perinucleolar vitelogecircnico e maturaccedilatildeo final Estas fases ocorrem no
interior de foliacuteculos cujo complexo folicular eacute constituiacutedo por zona radiata camada
folicular membrana basal e teca (Grier 2000) as quais desempenham importante papel
durante a foliculogecircnese e fertilizaccedilatildeo
Entretanto os peixes quando satildeo expostos aos poluentes podem sofrer influecircncia
na foliculogecircnese e assim acarretar prejuiacutezos reprodutivos para as espeacutecies expostas aos
contaminantes Alguns estudos mostram diversas alteraccedilotildees provocadas nos foliacuteculos de
peixes por contaminantes (Hazarika amp Das 1998 Dutta et al 2003 Maxwell amp Dutta
2005 Chakrabarty et al 2012) inclusive a atresia folicular que eacute um processo
frequentemente observado nos ovaacuterios dos vertebrados (Saidapur 1978 Santos et al
2008a Santos et al 2008b) e que pode ser causada por diversos fatores dentre os
quais os agrotoacutexicos (Nagahama 1983 Guraya 1986 Chatterjee et al 1997 e 2001
Dutta amp Dalal 2008)
No desenvolvimento folicular a formaccedilatildeo do complexo folicular eacute importante
no suporte e na sobrevivecircncia das ceacutelulas foliculares No entanto jaacute foram identificadas
vaacuterias proteiacutenas que contribuem para a integridade do complexo folicular como
laminina integrina β1 fibronectina colaacutegeno tipo IV e de metaloproteinases (MMM-P)
em foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios e atreacutesicos (Rodgers et al 1998 Grier 2002 Le Bellego
et al 2002 Berkholtz et al 2006 Santos et al 2008a Thomeacute et al 2010) O colaacutegeno
tipo IV eacute uma proteiacutena especializada da matrix extracelular e membrana basal assim
como a laminina Essas proteacuteinas estatildeo envolvidas em favorecer um microambiente para
sobrevivecircncia das ceacutelulas do epiteacutelio (Rodgers et al 2003) As integrinas compreendem
uma grande famiacutelia de recepetores celulares composto de subnidades α e β que tem
funccedilatildeo importante na adesatildeo e transmissatildeo de sinais na ceacutelula Aleacutem disso as integrinas
estatildeo envolvidas na proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e morte celular
A caspase 3 eacute uma moleacutecula efetora de grande importacircncia no processo de
apoptose na ativaccedilatildeo de endonucleases e na clivagem das proteiacutenas celulares causando
mudanccedilas morfoloacutegicas celulares (Huettenbrenner et al 2003) Este processo de
apoptose envolve uma cascata de eventos bioquiacutemicos com a liberaccedilatildeo de fatores
mitocondriais de morte celular ativaccedilatildeo caspases e mudanccedila na caracteriacutestica
morfoloacutegica no nuacutecleo da ceacutelula assim como fragmentaccedilatildeo do DNA (Huettenbrenner et
89
al 2003) No entanto alguns trabalho citam a importacircncia da integridade do complexo
folicular com a presenccedila de integrina β1 e colaacutegeno tipo IV que em caso de atresia
folicular e ovulaccedilatildeo na formaccedilatildeo de foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios culminam em processo
da ativaccedilatildeo das caspases nas ceacutelulas foliculares Sendo assim a incidecircncia de apoptose
nas ceacutelulas foliculares aumenta nas etapas de regressatildeo ovariana (Drummond et al
2000 Santos et al 2003 2005 2008)
O lambari A bimaculatus foi escolhido como organismo experimental pois eacute
muito representativo no ecossistema sendo encontrado desde o nordeste brasileiro ateacute a
Bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Tambeacutem eacute um peixe de
pequeno porte e faacutecil de manter em laboratoacuterio O complexo folicular associado agrave
siacutentese dessas proteiacutenas ao longo do desenvolvimento folicular eacute algo a ser discutido
Poreacutem nenhum trabalho relata estas proteiacutenas em peixes expostos ao Thiodanreg Devido
agrave carecircncia de estudos que avaliem tais proteiacutenas no complexo folicular o presente
trabalho tem como objetivo avaliar as proteiacutenas colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase
3 durante o desenvolvimento folicular do lambari A bimaculatus exposto ou natildeo ao
Thiodanreg por meio de anaacutelise imunoistoquiacutemica
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria (DVT) da Universidade
Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de
Veterinaacuteria onde foram realizados o teste subletal e as atividades de coleta fixaccedilatildeo e
inclusatildeo dos fragmentos de ovaacuterios As etapas de microtomia imunoistoquiacutemica
coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas foram realizadas no
DVTUFV e no Laboratoacuterio de Ictiohistologia do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas (ICB)
da Universidade Federal de Minas Gerais
21 Animais
Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na
Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas
fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento
total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos peixes em maturaccedilatildeo
avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado poro genital
dilatado e vascularizado
90
Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV onde
foram aclimatados por 10 dias Os aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuiacuteam
capacidade de 50 litros numa densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada
aacutegua livre de cloro temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos
os aquaacuterios possuiacuteam um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo continua da aacutegua para
garantir o bem-estar dos peixes Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial
Purina contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da
piscicultura
As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas
de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de
255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza
total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1
Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de
VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor
Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)
22 Agrotoacutexico
Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida
organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de
endosulfan
23 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico
Foram aclimatados 96 lambaris como descrito no item 21 onde os peixes se
acostumaram ao seu novo meio e agraves atividades normais de manutenccedilatildeo como
alimentaccedilatildeo e limpeza dos aquaacuterios O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi
realizado baseando-se nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo com
a NBR 15088 (ABNT 2007)
Logo apoacutes aclimataccedilatildeo os peixes foram submetidos ao toacutexico Thiodanreg
(endosulfan 350gL) por 96 horas Em todos os experimentos foram utilizadas trecircs
concentraccedilotildees diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 (137microgL) preacute-determinada em
laboratoacuterio de acordo com a NBR 15088 (ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas
em cada experimento foram de 115 23 e 56microgL aleacutem de um grupo controle sem
toacutexico com trecircs repeticcedilotildees sob as mesmas condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo
91
24 Anaacutelises histoloacutegicas e imunoistoquiacutemicas
Apoacutes 96 horas de experimento seis fecircmeas de cada grupo foram coletadas
anestesiadas com benzocaiacutena (110000) e eutanasiadas para coleta dos ovaacuterios Para a
descriccedilatildeo histoloacutegica todas as amostras foram fixadas em paraformaldeiacutedo a 4 em
tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedas em parafina Em seguida
secccedilotildees com 5 microm de espessura foram coradas utilizando hematoxilinaeosina para
anaacutelises morfoloacutegicas do desenvolvimento folicular
Para detectar a imunorreatividade para colaacutegeno tipo IV integrinas β1 e caspase
3 nos ovaacuterios do lambari trecircs espeacutecimes de cada grupo foram fixados em
paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas incluiacutedas em
parafina e seccionadas com 5 microm de espessura A recuperaccedilatildeo antigecircnica foi realizada
em forno de microondas por 10 minutos com os cortes nas lacircminas sendo imersos em
tampatildeo citrato 10mM pH 60 As lacircminas foram incubadas com peroacutexido de hidrogecircnio
a 3 em tampatildeo fosfato por 15 minutos em temperatura ambiente para inativar
peroxidase endoacutegena e com soro albumina bovina a 2 por 45 minutos para bloquear
marcador antigecircnico inespeciacutefico Anticorpos primaacuterios (policlonais de coelho) anti-
colaacutegeno tipo IV anti-integrina β1 e anti-caspase 3 (Santa Cruz Biotechnology Calif
USA) foram aplicados nas secccedilotildees a 4degC na diluiccedilatildeo 1100 (integrina β1 e colaacutegeno tipo
IV) e 1200 (caspase 3) segundo o fabricante por 12 horas Os cortes foram lavados
em PBS e incubados por 45 minutos com anticorpo secundaacuterio na diluiccedilatildeo de 1200
anti-IgG de coelho (LSAB 2 sistema HRP DakoCymation Carpinteria Calif USA) e
tratados com peroxidase conjugada com estreptavidina por 45 minutos A revelaccedilatildeo foi
realizada com diaminobenzidina (DAB) e as lacircminas foram contracoradas com
hematoxilina (Santos et al 2008)
As lacircminas foram analisadas em toda sua extensatildeo em busca de alteraccedilotildees na
imunomarcaccedilatildeo no complexo folicular que pudessem ser representativas do efeito do
Thiodanreg sempre comparando com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios do grupo
controle As lacircminas foram analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e as
imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis
GETIT Olympus
92
3 RESULTADOS
31 Desenvolvimento folicular
O desenvolvimento folicular de A bimaculatus foi dividido em desenvolvimento
primaacuterio inicial e avanccedilado O desenvolvimento secundaacuterio foi dividido em
desenvolvimento secundaacuterio inicial intermediaacuterio e avanccedilado (Tabela 1) A regressatildeo
ovariana tambeacutem foi caracterizada (Tabela 1)
Tabela 1 Aspectos morfoloacutegicos do desenvolvimento folicular e da regressatildeo ovariana de Astyanax bimaculatus
Foliacuteculos primordiais Estaacutedio que antecede o desenvolvimento de foliacuteculos primaacuterios Satildeo ceacutelulas menores apresentando citoplasma volumoso nuacutecleo esfeacuterico e grande e ceacutelulas preacute-foliculares (Figura 1 B) Foliacuteculos primaacuterios iniciais e primaacuterios avanccedilados (perinucleolares) No desenvolvimento primaacuterio inicial os ovoacutecitos apresentam citoplasma fortemente basoacutefilo nuacutecleo esfeacuterico e nucleacuteolos dispersos pelo nucleoplasma Estatildeo envoltos por ceacutelulas foliculares pavimentosas (Figuras 1 C-encarte) No foliacuteculo primaacuterio avanccedilado a camada de ceacutelulas foliculares eacute pavimentosa e com o nuacutecleo eliacuteptico Entre as ceacutelulas foliculares e o ooplasma surge a zona radiata como uma fina camada (Figura 1 E-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios iniciais O citoplasma ovocitaacuterio eacute granular e fracamente basoacutefilo com presenccedila de vesiacuteculas corticais pequenas e claras na periferia do citoplasma O nuacutecleo eacute central ligeiramente acidoacutefilo com nucleacuteolos pequenos e dispersos pelo nucleoplasma (Figura 1 G-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios Assim como na etapa anterior os foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios possuem ovoacutecito com nuacutecleo central e acidoacutefilo No citoplasma inicia-se a deposiccedilatildeo de vitelo a partir da regiatildeo perifeacuterica (Figura 1 H-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados (vitelogecircnicos) No foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado o diacircmetro e o volume citoplasmaacutetico aumentam mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo apresentando os foliacuteculos neste estaacutedio vesiacuteculas corticais na periferia e gloacutebulos de vitelo disperso por todo citoplasma No complexo folicular a membrana basal eacute delgada e a zona radiada mais espessa que nas fases anteriores com ceacutelulas foliculares pavimentosas e cuacutebicas (Figura 1 H-encarte) Foliacuteculos atreacutesicos Apresenta formato irregular com estruturas descontiacutenuas ou desorganizadas com aspecto de grumos devido agrave liquefaccedilatildeo dos gracircnulos de vitelo ou com perda da conectividade entre suas partes fragmentaccedilatildeo da zona radiata (atresia inicial) e absorccedilatildeo total do conteuacutedo ovocitaacuterio pelas ceacutelulas foliculares (atresia avanccedilada) (Figuras 3 A e B-encarte) Foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios O foliacuteculo poacutes-ovulatoacuterio possue lume amplo irregular e contiacutenuo com o lume do ovaacuterio Apresenta parede constituiacuteda por camada uacutenica de ceacutelulas foliculares membrana basal e teca (Figuras 3 E e F)
93
32 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 no desenvolvimento
folicular de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Os foliacuteculos nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento apresentaram diferentes
graus de marcaccedilatildeo para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV Em foliacuteculo primordial natildeo se
observou marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 (Figura 1 B) Nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio inicial foram evidenciadas reaccedilotildees positivas com marcaccedilatildeo
fraca para colaacutegeno e integrina (Figuras 1 C e D) enquanto nos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio avanccedilado as marcaccedilotildees foram mais niacutetidas (Figuras 1 E e F)
Nos desenvolvimento secundaacuterio foram evidenciadas marcaccedilotildees positivas para integrina
β1 e colaacutegeno tipo IV no citoplasma das ceacutelulas foliculares com mais intensidade que
nos estaacutedios anteriores (Figuras 1 G e H) Estas marcaccedilotildees natildeo mostraram diferenccedilas
entre os grupos expostos ao Thiodanreg quando comparados com os mesmos estaacutedios de
desenvolvimento folicular dos grupos controle A marcaccedilatildeo para caspase 3 foi
evidenciada no citoplasma e nuacutecleos de ceacutelulas foliculares de foliacuteculos com
desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado apresentando maior intensidade nos estaacutedios de
desenvolvimento secundaacuterio inicial A marcaccedilatildeo foi ausente nos estaacutedios de
desenvolvimento primaacuterio (Figuras 2 A-D) Quando comparadas estas marcaccedilotildees entre
os grupos controle e expostos ao Thiodanreg natildeo houve diferenccedilas nas marcaccedilotildees entre
os mesmos estaacutedios de desenvolvimento folicular
33 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 na atresia folicular de
A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
A marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 foi evidente nos foliacuteculos
atreacutesicos iniciais poreacutem menos intensa em relaccedilatildeo aos foliacuteculos normais (Figuras 3 A e
C) As fases mais avanccediladas da atresia folicular satildeo caracterizadas pela desorganizaccedilatildeo
espalhamento das proteiacutenas no ooplasma com reaccedilatildeo mais fraca da imunomarcaccedilatildeo
para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 (Figuras 3 B e D) Para a caspase 3 foi observada a
marcaccedilatildeo positiva nas ceacutelulas foliculares em foliacuteculos atreacutesicos iniciais e avanccedilados
(Figuras 4 A e B)
94
34 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 em foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg
Foram evidenciados desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV e
integrina β1 entre as ceacutelulas foliculares com marcaccedilatildeo positiva (Figuras 3 E e F) Em
foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios tambeacutem foi observada marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 nas
ceacutelulas foliculares (Figuras 4 C e D)
4 DISCUSSAtildeO
As fecircmeas de A bimaculatus submetidas agrave accedilatildeo do toacutexico apresentaram ovaacuterios
com padrotildees normais do desenvolvimento folicular sendo as variaccedilotildees na estrutura do
foliacuteculo como diacircmetro caracteriacutesticas do nuacutecleo camadas envoltoacuterias composiccedilatildeo e
distribuiccedilatildeo do vitelo observadas em outras espeacutecies do gecircnero do presente estudo
(Miranda 1996 Miranda et al 1999 Melo et al 2005 Mazzoni et al 2005 Rodrigues
et al 2005) Em outros trabalhos (Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008) satildeo
demonstrados que pequena concentraccedilatildeo de contaminantes pode ser suficiente para
causar alteraccedilotildees na morfologia dos foliacuteculos Entretanto Ballesteros et al (2007)
utilizando peixes machos e fecircmeas da espeacutecie Jenynsia multidentata verificaram que o
maior teor de lipiacutedeos nas fecircmeas foi importante para conferir maior resistecircncia contra o
endosulfan ao contraacuterio dos machos que satildeo mais suceptiacuteveis Estudo realizado por
Hernan Da Cuntildea et al (2011) mostrou que a espeacutecie Cichlasoma dimerus exposta ao
endosulfan nas concentraccedilotildees de zero 025 1 2 3 4 e 16μgL natildeo apresentou
alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos foliacuteculos assim como no presente trabalho com A
bimaculatus
No presente estudo a ausecircncia de marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV em foliacuteculos
primordiais pode ter ocorrido em funccedilatildeo da quantidade reduzida de ceacutelulas foliculares e
pela pequena espessura da membrana basal nesta fase de desenvolvimento folicular Na
literatura eacute mencionado que a espessura da membrana basal em foliacuteculos secundaacuterios
avanccedilados de A bimaculatus eacute de aproximadamente 03 microm caracterizada por ser uma
estrutura muito mais delgada quando comparada a outras espeacutecies de teleoacutesteos
(Drummond et al 2000) Outros autores no entanto observaram positividade para
colaacutegeno tipo IV na membrana basal envolvendo ovogocircnias no estroma ovariano de
peixes (Grier 2002 Thomeacute et al 2010) fase que antecede o ovoacutecito primordial
95
A siacutentese de membrana basal tem sido atribuiacuteda agraves ceacutelulas foliculares (Le Mim
et al 2007) mas ainda faltam investigaccedilotildees que evidenciem esta funccedilatildeo A anaacutelise por
hibridizaccedilatildeo in situ na cadeia α1 do colaacutegeno tipo IV revelou a presenccedila de mRNA
localizada na camada folicular de todos os foliacuteculos em crescimento no peixe medaka
Oryzias latipes (Kato et al 2010) enquanto para integrinas Itami et al (2011) natildeo
identificaram marcaccedilatildeo em foliacuteculos primordiais em ratos Estes estudos confirmam que
durante o desenvolvimento do foliacuteculo primordial poderia estar ocorrendo o inicio da
organizaccedilatildeo e siacutentese do colaacutegeno tipo IV para as fecircmeas do presente estudo
Logo em seguida o desenvolvimento folicular primaacuterio inicial e avanccedilado foi
caracterizado por alteraccedilotildees no complexo folicular com marcaccedilatildeo positiva para
integrina β1 e colaacutegeno tipo IV foi positiva Em outro estudo realizado para marcaccedilatildeo
de vaacuterias subunidades do colaacutegeno tipo IV em foliacuteculos de bovinos a expressatildeo das
cadeias α3 e α6 diminuiacuteram durante o desenvolvimento folicular enquanto as cadeias
α1 e α2 continuaram a ser expressas ao longo do desenvolvimento (Rodgers et al
1998) Em estudo com ratos foi verificado o decliacutenio de colaacutegeno tipo IV α3 ao longo
do desenvolvimento folicular mas foi possiacutevel detectar o colaacutegeno tipo IV α4 e α5 em
foliacuteculos desenvolvidos (Frojdman et al 1998) Entretanto Berkholtz (2006) observou
aumento da marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV ao longo do desenvolvimento folicular em
ratos Aleacutem disso outra caracteriacutestica importante eacute presenccedila de perlecan e nidogen que
fazem parte das ligaccedilotildees cruzadas em foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio mas
natildeo em foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio (McArthur et al 2000) Poreacutem as
diferentes ligaccedilotildees cruzadas entre os colaacutegenos e lamininas nas membranas basais
tambeacutem garantem maior expansatildeo no alargamento do foliacuteculo (Rodgers et al 2003)
Portanto eacute de grande importacircncia nesta etapa de desenvolvimento folicular a evidecircncia
do colaacutegeno tipo IV e integrinas o que pode contribuir na organizaccedilatildeo coordenada no
desenvolvimento folicular de A bimaculatus com estas proteiacutenas da matriz extracelular
Em relaccedilatildeo agraves fases de desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio foram observadas
marcaccedilotildees positivas para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 o que parece caracterizar
maior siacutentese destas proteiacutenas nestes estaacutedios do desenvolvimento folicular Entretanto
deve-se considerar que nas fases mais avanccediladas a quantidade de ceacutelulas foliculares e
ceacutelulas da teca satildeo mais numerosas sendo assim exercem funccedilatildeo importante na
integridade folicular No presente estudo a marcaccedilatildeo contiacutenua de colaacutegeno tipo IV e
integrina β1 nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento folicular em 96 horas de
experimento indicou que natildeo houve desorganizaccedilatildeo na membrana basal e nas ceacutelulas
96
foliculares Thomeacute et al (2010) identificaram por teacutecnicas de imonoistoquiacutemica e
imunofluorescecircncia a presenccedila de laminina β2 integrinas e colaacutegeno tipo IV na
membrana basal demonstrando a importacircncia destes constituintes na integridade da
membrana basal ao longo do desenvolvimento folicular resultados observados tambeacutem
em foliacuteculos de mamiacuteferos (Le Bellego et al 2002 Berkholtz et al 2006)
Em foliacuteculos de ratos tambeacutem foi evidenciada a presenccedila de integrinas ao longo
do desenvolvimento folicular apresentando marcaccedilatildeo positiva no desenvolvimento
primaacuterio e marcaccedilatildeo mais intensa no desenvolvimento secundaacuterio (Itami et al 2011)
Portanto a marcaccedilatildeo positiva nas ceacutelulas foliculares em lambaris A bimaculatus nos
grupos controle e expostos ao Thiodanreg mostrou que a integridade dos foliacuteculos em
desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio natildeo foi afetada pelas concentraccedilotildees de
Thiodanreg utilizadas
Em relaccedilatildeo agrave caspase 3 ao longo do desenvolvimento folicular foi possiacutevel
evidenciar sua expressatildeo nos estaacutedios de desenvolvimento secundaacuterio mas natildeo a
presenccedila de condensaccedilatildeo de nuacutecleos e corpos apoptoacuteticos nas ceacutelulas foliculares No
entanto a presenccedila de caspase 3 nas ceacutelulas foliculares de A bimaculatus indica que
estas ceacutelulas podem estar em via apoptoacutetica poreacutem outros trabalhos demonstram que a
via para caspase 3 eacute observada em foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios atresias iniciais e
principalmente nas atresias avanccediladas com a presenccedila de fragmentaccedilatildeo de DNA
condensaccedilatildeo nuclear e formaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos (Hsueh et al 1994 Santos et
al 2008) A ausecircncia destas caracteriacutesticas morfoloacutegicas nos foliacuteculos de A
bimaculatus do presente estudo pode ser explicada por inibidores de apoptose (Salvesen
amp Duckett 2002) que podem estar ativos e protegendo as ceacutelulas contra apoptose
Outros exemplos citados satildeo os fatores hormonais como as gonadotropinas 17β
estradiol e fator de crescimento epideacutermico que agem como fatores de sobrevivecircncia
para suprimir a morte celular por apoptose em foliacuteculos ovarianos de ratos em cultura
(Chun et al 1994) e tambeacutem no peixe truta arco-iacuteris Oncorhynchus mykiss (Janz amp Van
Der Kraak 1997) Segundo Salvesen amp Duckett (2002) poucos estudos tecircm tentado
esclarecer se uma determinada ceacutelula consegue se recuperar de um efeito fisioloacutegico de
caspases quando estatildeo sendo processadas e ativadas
Um grupo de proteiacutenas estruturalmente relacionadas agrave inibiccedilatildeo da apoptose eacute o
inibidor de apoptose (IAP) (Deveraux amp Reed 1999) Satildeo descritos pelo menos oito
IAPs em humanos localizados no citoplasma e que se ligam na forma ativa da caspase
3 ou na forma zimogecircnio das caspases para inibir a sua funccedilatildeo (Salvesen amp Duckett
97
2002) Janz et al (1997) mencionam forte relaccedilatildeo com o aumento da apoptose e
expressatildeo de proteiacutena do choque teacutermico HSP70 em peixes expostos agrave celulose
afetando o tamanho do ovaacuterio provocanado queda da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
testosterona e induccedilatildeo nas concentraccedilotildees plasmaacuteticas de 17β estradiol Em relaccedilatildeo agrave
HSP70 ela pode estar relacionada com a proteccedilatildeo das ceacutelulas foliculares antes da
reabsorccedilatildeo do vitelo em foliacuteculos atreacutesicos (Santos et al 2008) A relaccedilatildeo mais
consistente da viabilidade dos foliacuteculos de A bimaculatus no presente estudo segundo a
literatura pode ser a relaccedilatildeo dos inibidores de apoptose associado com os fatores
hormonais agindo como prevenccedilatildeo na sobrevivecircncia das ceacutelulas foliculares no
desenvolvimento folicular secundaacuterio
Nas fecircmeas do lambari A bimaculatus o processo de atresia foi semelhante ao
descrito por Miranda et al (1999) Munoz et al (2002) Melo et al (2005) e Santos et
al (2005) A maior frequecircncia de atresia foi observada em foliacuteculos secundaacuterios
Observaccedilotildees semelhantes foram feitas por Drummond (1996) em A bimaculatus
lacustris e Melo et al (2005) em A scabripinnis Em relaccedilatildeo aos foliacuteculos poacutes-
ovulatoacuterios ocorre perda de contato entre as membranas das ceacutelulas foliculares
adjacentes evento observado por Santos et al (2005) entre 48 e 72 horas poacutes-desova em
Leporinus taeniatus Essas estruturas foram raramente encontradas no presente estudo
indicando que o grau de contaminaccedilatildeo pelo Thiodanreg natildeo interferiu na eliminaccedilatildeo dos
foliacuteculos de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada
Nos processos de atresias e nos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios ocorreram a
desorganizaccedilatildeo e a perda da positividade da imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e
integrinas nas fases avanccediladas quando comparadas com as fases iniciais da regressatildeo
ovariana sendo esta caracteriacutestica tambeacutem observada por outros autores (Santos et al
2008 Thomeacute et al 2010) Relatos importantes sobre a integridade dos foliacuteculos estatildeo
na diminuiccedilatildeo da integrina β1 e colaacutegeno do tipo IV contribuindo para o aumento da
apoptose em ceacutelulas foliculares de foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios e nas atresias avanccediladas
(Santos et al 2008) Aleacutem disso outros fatores contribuem para o aumento da
apoptose como a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 17β estradiol logo apoacutes a desova
favorecendo a regressatildeo ovariana dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios (Kaptaner amp Ural 2006)
Portanto o presente estudo com as fecircmeas de A bimaculatus evidencia a caspase 3 e a
diminuiccedilatildeo da marcaccedilatildeo com integrina β1 e colaacutegeno tipo IV nas ceacutelulas foliculares nos
foliacuteculos atreacutesicos e poacutes-ovulatoacuterios o que sugere a provaacutevel accedilatildeo destas proteiacutenas na
regressatildeo folicular em lambaris expostos ao Thiodanreg
98
De acordo com os resultados obtidos pode-se inferir que os ovaacuterios A
bimaculatus foram resistentes ao Thiodanreg nas concentraccedilotildees testadas e no periacuteodo
experimental proposto pois tais concentraccedilotildees natildeo interferiram de modo significativo
na estrutura do complexo folicular e no desenvolvimento folicular Qualitativamente
essas anaacutelises demonstraram a marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do
desenvolvimento folicular mesmo quando os peixes foram expostos a diferentes
concentraccedilotildees de Thiodanreg o que caracteriza a integridade das ceacutelulas foliculares e da
via apoptoacutetica caspase-3-dependente que pode estar sendo ativada para futuros
processos de regressatildeo folicular
99
A
DC
B
fsa fp
fpi
fpi
mc
mi
fpa
fpa
fsa
fsa
zr
zr
zr zr
H
E
G
F
mc
m
mi
mc
fsa
fpi
fpa
fsi
vc fsa
fst
v
v
Figura 1 Imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 ao longo do desenvolvimento folicular em A bimaculatus A Controle negativo para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV B Foliacuteculo primordial (fp) sem marcaccedilatildeo para colaacutegeno (setas) C e D Marcaccedilatildeo positiva para colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) respectivamente em folliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio inicial (fpi) E e F Marcaccedilatildeo positiva para colaacutegeno (mc) e integrina (mi) em foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (fpa) Encarte-C Foliacuteculo primaacuterio inicial (fpi) G e H Marcaccedilatildeo para colaacutegeno (mc) e integrina (mi) mais fortemente evidenciada em foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (fsa) Encartes-G e H Foliacuteculo secundaacuterio inicial (fsi) foliacuteculo secundaacuterio intermediaacuterio (fst) foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado (fsa) vesiacuteculas corticais (vc) vitelo (v) zona radiata (zr) Encartes C E G e H corados com hematoxilinaeosina Barras 20 m encartes C e E (80 m) G (100m) e H (200m)
A B
C D
E F
G H
100
fpi
fpa
fsa
fsa
fsa
zr
zr
zr zr
D
A
C
B
Figura 2 Imunomarcaccedilatildeo para caspase 3 ao longo do desenvolvimento folicular em A bimaculatus A Imagem do controle negativo para caspase 3 (setas) B Ausecircncia de marcaccedilatildeo para caspase 3 (setas) em foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio inicial (fpi) C e D Marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) em foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (fsa) e ausente (setas) em foliacuteculo desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (fpa) zr zona radiata fsa foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado Barras 20 m
101
A
mc
mi
mc
mi
mi mc
fpo fpo
ai av
av
B
C D
E F
Figura 3 Imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 de atresia e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterio em A bimaculatus A e C Foliacuteculo secundaacuterio em atresia inicial (ai) caracterizando a presenccedila da zona radiata (zr) e iniacutecio da desorganizaccedilatildeo da marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) no complexo folicular (setas) B e D Imunomarcaccedilatildeo menos intensa do que na etapa anterior em atresia avanccedilada caracterizando a desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) no citoplasma (setas) E e F Foliacuteculo poacutes-ovulatoacuterio (fpo) caracterizando a desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) entre as ceacutelulas
foliculares (setas) Encartes A e B Atresia inicial (ai) e atresia avanccedilada (av) ceacutelula folicular (cf) zona radiata (zr) Encartes A e B corados com hematoxilinaeosina Barras A B C E e F
(20 m) D (200 m) encartes A (25 m) e B (100 m)
ai av zr cf cf
102
A
ai av
fpo fpo
B
C D
Figura 4 Imunomarcaccedilatildeo para caspase 3 em atresia folicular e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios em A bimaculatus A e B Imunomarcaccedilatildeo em atresia inicial (ai) e atresia avanccedilada (av) caracterizando a presenccedila de marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) C e D Imunomarcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) nas ceacutelulas dos foliacuteculos poacutes-ovulatorios (fpo) Barras A B e D (20 m) C (200 m)
103
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avanccedilada expostas ao Thiodanreg eacute de 136microgL com intervalo de confianccedila de 101 a
184 microgL
A accedilatildeo do Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou o fiacutegado como um todo
mas locais isolados do parecircnquima hepaacutetico sendo a maioria alteraccedilotildees de estaacutegio I e
II com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico
As alteraccedilotildees na quantidade de glicogecircnio hepaacutetico no experimento sem aclimataccedilatildeo
sem alimentaccedilatildeo demonstraram que o Thiodanreg influenciou na maior mobilizaccedilatildeo
das reservas de glicogecircnio em funccedilatildeo das condiccedilotildees ambientais oferecidas aos
animais
As alteraccedilotildees ocorridas no nuacutecleo e citoplasma dos hepatoacutecitos demonstram que o
Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees hepaacuteticas confirmando que o Thiodanreg
influenciou no metabolismo celular como resposta adaptativa celular
Natildeo foram observadas diferenccedilas morfoloacutegicas que comprometessem diretamente os
estaacutedios de desenvolvimento folicular ovariano seja no grupo controle ou nos grupos
tratados com Thiodanreg
Os experimentos com aclimataccedilatildeo apresentaram alteraccedilotildees na quantidade de
foliacuteculos primaacuterios e secundaacuterios quando comparadas com os peixes sem
aclimataccedilatildeo sugerindo que o eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-ovaacuterio pode estar sendo
afetado
Houve maior diacircmetro nos foliacuteculos vitelogecircnicos e maior frequecircncia de atresia
folicular no experimento com aclimataccedilatildeo seguida de exposiccedilatildeo ao Thiodanreg o que
sugere mecanismo adaptativo com maiores diacircmetros de foliacuteculos no meio
impactado
108
As meacutedias dos IGS e IHS nos experimentos aclimatados foram menores quando
comparadas com os experimentos sem aclimataccedilatildeo sugerindo que a espeacutecie A
bimaculatus previamente aclimatada em aquaacuterios pode sofrer comprometimento da
reproduccedilatildeo
As reaccedilotildees imunohistoquiacutemicas para integrina β1 colaacutegeno IV e caspase-3 em
foliacuteculos atreacutesicos e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios sugerem possiacutevel relaccedilatildeo com a
regressatildeo ovariana poacutes-desova
As anaacutelises por imunohistoquiacutemica para integrina β1 colaacutegeno IV e caspase-3 nas
ceacutelulas foliculares ao longo do desenvolvimento folicular demonstraram
qualitativamente marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento
folicular mesmo quando os peixes foram expostos a diferentes concentraccedilotildees de
Thiodanreg o que caracteriza a integridade das ceacutelulas foliculares e da via apoptoacutetica
caspase-3-dependente que pode estar sendo ativada para futuros processos de
regressatildeo folicular
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