Edición genómica
Técnica para introducir cambios específicos en el ADN genómico de
una célula o de un organismo
Evolución de la tecnología de edición de ADN
Frecuencia de recombinación homóloga en células de mamíferos: 1 cada 30.000 células
La introducción de cortes en las dos hebras de ADN en el genoma aumenta la
frecuencia de recombinación
Cre-lox: Tecnología usada para controlar la expresión de genes temporal y
espacialmente a través del knock-out de genes blanco por recombinación
de sitios loxP. (fago P1)
Nucleasas “dedos de Zn”: Zn finger nucleases
Los dedos de cinc son pequeños motivos estructurales de proteínas
que pueden coordinar uno o más iones de cinc para ayudar a
estabilizar sus pliegues. Normalmente funcionan como módulos de
interacción que unen el ADN, ARN, proteínas y moléculas pequeñas
Los dedos de zinc pueden ser modificados para reconocer secuencias
de ADN específicas.
TALENS: transcription activator-like effector nucleases
Generadas por la fusión de efectores TAL (proteínas de la bacteria Xanthomonas que se unen a
secuencias específicas de ADN) con una endonucleasa (FokI). Se hace ingeniería de TAL para que se
una a distintas secuencias de ADN.
Integración dirigida
Meganucleasa:
Endonucleasa que
reconoce sitios de
reconocimiento grandes
(12-30 pb)
Por ingeniería de proteína
se puede cambiar su
secuencia de
reconocimiento
Locus transcripcionalmente
activo
Gen de timidina quinasa para eliminar integraciones no deseadas con ganciclovir
Sistema CRISPR/Cas
Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats
Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas
Mecanismo de inmunidad mediada por CRISPR en bacterias
GenScript
Cas9
+
ARN guía: generado
por la fusión de los
transcriptos crRNA
con tracrRNA
Especificidad: 20 nuc de
extremo 5´del gRNA
SIGMA
PAM: protospacer –adjacent motif
5'-NGG-3: PAM canónico que se asocia con la nucleasa Cas9 de Streptococcus
pyogenes (SpCas9) . Está cada 8-12 nuc en humanos
Ubicación: 3´del sitio de corte
Función: -permite a Cas 9 discriminar ADN propio de ajeno
-su reconocimiento está involucrado en la transición de Cas 9 entre
conformación de unión (binding) a corte (cleavage)
El único requerimiento para la selección de un
sitio blanco de Cas9 es la presencia de un sitio
PAM inmediatamente después del sitio de corte
Generación de Cas9 mutantes que reconozcan
otros PAM
Uso de alternativas de Cas9: nucleasa de
Francisella Cpf1 (PAM: TTN)
Mutagénesis inespecífica causada por Cas9
(off-target activity):
Alta concentración de Cas9
Duración de la expresión
Diseño de gRNA
Mejoramiento de la fidelidad del reconocimiento de
la secuencia blanco de Cas9
Los cortes en una sóla hebra (SSB) son reparados preferentemente por
HDR en vez de por NHEJ, lo que reduce la posibilidad de mutaciones
Generación de animales transgénicos.
La transcripción y la traducción están suprimidas en el
cigoto de ratón, la actividad de Cas9 se demora hasta
después de la primera división lo que llevaría a
mosaicismo.
Generación de modelos celulares
Modificación de células somáticas
A
P
L
I
C
A
C
I
O
N
E
S
Screening genómico funcional
Mapping a functional cancer genome atlas of tumor
suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–
mediated direct in vivo screening
Guangchuan Wang et . SCIENCE ADVANCES. 2018
Cancer genomics consortia have charted the landscapes of numerous human cancers. Whereas
some mutations were found in classical oncogenes and tumor suppressors, others have not yet
been functionally studied in vivo. To date, a comprehensive assessment of how these genes
influence oncogenesis is lacking. We performed direct high-throughput in vivo mapping of functional
variants in an autochthonous mouse model of cancerviruses (AAVs) carrying a single-guide RNA
(sgRNA) library targeting putative tumor suppressor genes significantly mutated in human cancers,
we directly pool-mutagenized the livers of Cre-inducible CRI. Using adeno-associated SPR
(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)–associated protein 9 (Cas9) mice. All
mice that received the AAV-mTSG library developed liver cancer and died within 4 months. We
used molecular inversion probe sequencing of the sgRNA target sites to chart the mutational
landscape of these tumors, revealing the functional consequence of multiple variants in driving liver
tumorigenesis in immunocompetent mice. AAV-mediated autochthonous CRISPR screens provide
a powerful means for mapping a provisional functional cancer genome atlas of tumor suppressors
in vivo.
Cas9
Biblioteca de
sgRNAs de
genes
supresores
tumorales
putativos
humanos
Todos los ratones desarrollaron cáncer de hígado y murieron en cuatro
meses
Secuenciación del genoma de los tumores por “molecular inversion probe
sequencing” para determinar las mutaciones ocasionadas (indels)
I.V.
Rosa-LSL-Cas9-EGFP knock-in mice
Ratones inmunocompetentes
MIP: Molecular Inversion Probe
Es una de las técnicas moleculares de captura por
circularización para realizar partición genómica,
proceso a través del cual se capturan y
enriquecen regiones específicas del genoma
Probe: ADN simple cadena con secuencias
complementarias al genoma
Modulación transcripcional y
control epigenéticoUnión de Cas9 a represores o activadores
transcripcionales y a enzimas “modificadoras
epigenéticas”
Visualización del ADN en células
vivasEstudio de la arquitectura de cromosomas y
organización nuclear
Edición de bases
(GRAPHIC) C. BICKEL/SCIENCE; (DATA) D. B. T. COX ET AL., SCIENCE 358, 6362, 2017 © SCIENCE; J.
DOUDNA AND E. CHARPENTIER, SCIENCE 346, 6213, 2014 © SCIENCE; GAUDELLI ET AL., NATURE
551, 7677, 2017
Regulación inducible de Cas9
A través de la heterodimerización por inducción química u
óptica
Uso terapéutico
Para corregir enfermedades monogénicas recesivas causadas por
mutaciones que llevan a la pérdida de una función :
Fibrosis quística
Anemia falciforme
Distrofia muscular de Duchenne
Para corregir desórdenes dominantes–negativos en los que el gen
afectado es haplosuficiente, como la forma dominante de retinitis
pigmentosa: inactivación del alelo mutado por NHEJ
Diferencia con otras posibles terapias génicas tradicionales:
El nuevo gen funcional se expresa
en su contexto natural
“A new technology for ‘editing’ defective genes has raised hopes for
a future generation of medicines” – The Wall Street JournalCRISPR Therapeutics is focused on the development of transformative medicines using its proprietary CRISPR/Cas9 gene-editing platform. CRISPR/Cas9 is a revolutionary
technology that allows for precise, directed changes to genomic DNA. We have licensed the foundational CRISPR/Cas9 patent estate for human therapeutic use from our
scientific founder, Dr. Emmanuelle Charpentier, who co-invented the application of CRISPR/Cas9 for gene editing.
Translating a revolutionary platform into medicines targeted toward
hemoglobinopathies, cancer, liver and neuromuscular diseasesOur multi-disciplinary team of world-class researchers and drug developers is working to translate CRISPR/Cas9 technology into breakthrough human therapeutics. Our lead
program in the blood diseases β-thalassemia and sickle cell disease will soon enter clinical testing. In addition, our immuno-oncology franchise, focused on CRISPR-based
allogeneic CAR-T cell therapies to treat cancers, offers potential therapeutic advantages over the current generation of therapies.
Building a great company with a focus on science, innovation,
collaboration and entrepreneurshipThe revolutionary CRISPR platform provides the foundation for building a sustainable innovation engine and a place to foster entrepreneurship across all fronts. We are
looking for talented and experienced individuals across various functions. Our company is headquartered in Zug, Switzerland with R&D operations in Cambridge,
Massachusetts, USA and select business operations in London, United Kingdom. Please visit the careers page to see available positions.
Reactivación de hemoglobina fetal anulando el gen BCL11A
Infobae 3 de octubre de 2017
Edición genética: investigadores corrigieron una
anomalía en embriones para impedir una enfermedad
Un equipo de científicos chinos realizó una técnica que permitió corregir
una anomalía genética en embriones humanos portadores de una grave
enfermedad llamada talasemia
Correction of β-thalassemia mutant by base editor in
human embryos
Puping Liang et al. Protein Cell 2017
Usaron el sistema “Editor de bases”: CRISPR Cas9 + citidina
deaminasa, cambio de C por T
.
Infobae 4 de diciembre de 2017
Avance científico mundial: investigadores argentinos lograron generar
clones equinos con genomas mejorados
Utilizando la técnica CRISPR-Cas9 o llamada "tijera genética", lograron alterar el
ADN de un caballo de polo para mejorar su potencial y destreza.
Se bloqueó el gen de miostatina, proteína que inhibe el aumento de masa
muscular
El pasado mes de julio tuvo
lugar el Gotteborg (Suecia), el
congreso sobre New Breeding
techniques (Nuevas técnicas de
mejora genética). En este
congreso los representantes
locales dejaron claro a los
científicos asistentes que la
postura de Suecia es apoyar
que las variedades obtenidas
por CRISPR sin incluir ningún
ADN foráneo no sean
consideradas OGM y por tanto
no deban superar un largo
proceso de aprobación ni ir
etiquetadas
Menú de la
cena de gala
Julio 2017
http://jmmulet.naukas.com/2017/10/24/crispr-de-primero/
El INTA logró modificar el gen que hace
que la papa se ponga negraLa Nación, Viernes, 04 de Mayo de 2018 18:55
- Después de siete años de estudio con la técnica de
edición génica, investigadores del INTA Balcarce
lograron modificar el gen de polifenol oxidasa,
presente en el cultivo de papa (Solanum tuberosum
L.), cuya enzima provoca el pardeamiento enzimático
en tubérculos, es decir, que se pongan negros o que
se oxiden cuando se los corta y se los expone al aire.
La técnica utilizada fue edición génica", dijo Sergio
Feingold, director del Laboratorio de
Agrobiotecnología del INTA. La tecnología, también
conocida como CRISPR/Cas9, permite realizar
cambios "dirigidos en el material genético de plantas
y animales de consumo, con el objetivo de mejorar su
producción y calidad"
“Si no hay enzima,
no hay pardeamiento”
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