2. Vorlesungsstunde:���Biochemie und Nachweis von DNA
Wie untersucht man DNA ?
5´
2´
O
OH
N
HN
O
OPO
OH
O
POPHO
OH
O
OH
O
N
N
H2N
Guanin
Unsere Tools Enzyme Enzyme sind Eiweiße die Reaktionen katalysieren. Fast der gesamte Stoffwechsel von Organismen beruht auf Enzymen. Viele Enzyme prozessieren DNA. Das sind super Tools zur DNA Analyse! Marker Nur wer DNA sieht kann sie auch analysieren. Wir können DNA sichtbar machen! Hybridisieren Ein DNA-Strang bindet an seinen homologen Gegenstrang. Super um DNA zu identifizieren !
Enzyme die DNA bearbeiten
• DNA-Polymerasen • RNA Polymerasen • reverse Transkriptase • Exonukleasen • Endonukleasen
DNA-Polymerasen
DNA-Polymerasen bauen einen neuen Strang nach der Vorlage einer einzelsträngigen DNA auf: die Vorlage heißt TEMPLATE die Synthese erfolgt immer in 5´-3´-Richtung
Was braucht eine DNA-Polymerase
Das DNA-Template
Einen doppelsträngigen DNA-Abschnitt
Einen einzelsträngigen DNA-Abschnitt
Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) = dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Häufig verwendete DNA-Polymerasen
DNA-Polymerase I aus E. coli 103.000 Dalton Masse��� drei Funktionen 5´-3´-Polymerase 3´-5´-Exonuklease���5´-3´-Exonuklease DNA Reparatur und Synthese 37˚ C���
DNA-Polymerase aus Thermus ���aquticus (Taq-Pol) zwei Funktionen 5´-3´-Polymerase 5´-3´-Exonuklease���keine 3´-5´-Exo DNA Synthese 72˚ C
}Klenov- Fragment
The Polymerase Chain Reaction (PCR)is exponential
Primer annealingat 60-50°C
Melting of DNA at~95°C Polymerisation at
72°C
1. Cycle 2. Cycle
PCR and TaqMan are registered trademarks of Hoffmann La Roche and Perkin Elmer
PCR
Die reverse Transkriptase (RT)���oder ���
RNA abhängige DNA Polymerse
schreibt RNA in DNA um arbeitet wie eine DNA Polymerase, aber das Template ist RNA Funktionen: 5´-3´-DNA Polymerase
RNAse H (baut die RNA des DNA-RNA ��� Hybrides ab.
Das Produkt heißt cDNA (c = complementary)
RNA-Polymerasen RNA-Polymerasen lesen RNA von einem Stück doppelsträngiger DNA ab. RNA-Polymerasen brauchen eine sog. Promotorsequenz um aktiv zu werden. RNA-Polymerasen synthetisieren in 5´-3´-Richtung, die Sequenz der RNA entspricht der Sequenz des 5´-3´DNA Stranges (d.h. es wir der 3´-5´Strang abgelesen) die RNA-Pol. baut NTP statt dNTPs ein. Uracil ersetzt Tymidin
Exonukleasen
bauen DNA vom Ende her ab:���es gibt Exonukleasen die in���
3´-5´-Richtung vom Ende her abbauen und Exonukleasen die DNA vom
5´-3´- Ende her abbauen
Endonukleasen können mitten im DNA-Molekül schneiden manche Endonukleasen haben eine klare Erkennungs- sequenz: Restriktionsendonukleasen Typ II z.B. NNNNNGGATCCNNNNNN NNNNNCCTAGGNNNNNN
NNNNNG GATCCNNNNNN NNNNNCCTAG GNNNNNN
Palindrome
z.B. 5´ NNNNNGGCGCCNNNNNN 3´ 3´ NNNNNCCGCGGNNNNNN 5´
Die Sequenz liest sich auf beiden Strängen in 5´-3´, bzw 3´-5´-Richtung gleich.
Endonukleasen II
Es gibt Endonukleasen die unspezifisch DNA-schneiden. Manche dieser Enzyme schneiden nur einzelsträngige DNA, sog. ssDNA andere Enzyme schneiden bevorzugt doppelsträngige DNA, dsDNA
Markieren von DNA
1. Einbau von modifizierten Nukleotiden 2. Interkalierende Farbstoffe
z.B. Ethidiumbromid
3P 5¥ O
OH
N
HN
O
O
O
NH
R
3´ 5´
Top Related