Diversité et étude des métabolismes microbiens de
l’arsenic d’un ancien site minier, Sainte Marie aux Mines (68)
Séminaire RP2E - Audrey CORDI le 28 janvier 2010
Laboratoire Interaction Ecotoxicologie Biodiversité Ecosystèmes LIEBE UMR 7146
GDR 2909: Métabolisme de l’arsenic chez les Procaryotes
As (III) + soluble, + mobile, et plus toxique que l’As (V)
2 formes solubles prédominantes: As (III) ou arsénite et As (V) ou arséniate
Toxicité de l’arsenic
PitAqp
As III As V
SH Phosphorylation
As V
Pst
Les métabolismes bactériens influencent le statut Redox de l’arsenic
Métabolismes énergétiques
- Réduction dissimilatrice: As (V)= accepteur final d’e- en anaérobie gènes arr
- Oxydation de l’arsenic: As (III) donneur d’e- gènes aox/ aro/ aso
Métabolismes de résistance et de tolérance
- Méthylation de l’arsenic: production d’espèces généralement moins toxiques dont certaines volatiles gènes ars M
- Oxydation de l’arsenic: As (III) est oxydé en As (V) gènes aox
- Réduction expulsion: As(V) réduit en As (III) (gène ars C) puis sortie de l’As (III) par une pompe spécifique (ars B et analogues)
Illustrations: Silver et Phung,2005
As V
Pit
As VAs III
As III
As III
As V
Pit
As VAs III
As III
As III
As III As V
Réduction / expulsion Oxydation
Métabolismes de détoxification
Etude de la diversité des microorganismes capables de métaboliser l’arsenic sur le site de Sainte Marie aux Mines qui présente des conditions moins extrêmes que des sites précédemment étudiés comme Carnoulès.
Hypothèse: diversité taxonomique et fonctionnelle plus élevée.
But de l’étude: Comprendre le rôle des microorganismes dans la spéciation de l’arsenic
en milieu faiblement contaminé.
Site d’étude: Sainte Marie aux Mines, 68.
pH 6,9 / Carnoulès pH ≤ 3
Concentration en arsenic dans l’eau 6 – 23 µg/L / Carnoulès 350 mg/L
Concentration dans le sédiment 320 - 737 mg/kg
Concentration moyenne fond géochimique dans les Vosges (48 mg/kg)
Contamination en Aluminium (15150 mg/kg) et en Fer (23745 mg/kg)
Prélèvement du sédiment
Isolement souches cultivables Extraction ADN total
Etude de la diversité taxonomique bactérienne par amplification PCR de l’ADNr 16S bactérien
Etude de la diversité archéale par amplification de l’ADN r 16S archée
Démarche expérimentale
Etude de la diversité fonctionnelle par amplification gènes aox et transporteurs
Résultats: Diversité taxonomique
Diversité bactérienne des isolats cultivable
Diversité bactérienne totale
Diversité archéale
Diversité bactérienne des isolats cultivables
1%
33%
15%6%
6%
39%
Firmicutes
Actinobacteria
Bacteroidetes
Alphaproteobacteria
Betaproteobacteria
Gammaproteobacteria
1%
33%
15%6%
6%
39%
Firmicutes
Actinobacteria
Bacteroidetes
Alphaproteobacteria
Betaproteobacteria
Gammaproteobacteria
157 isolats aérobies
2%9%
89%
2%9%
89%
55 isolats anaérobies
212 isolats
Diversité bactérienne totale (248 clones séquencés)
Carnoulès dominance des Betaproteobactéries (38%) et Gammaproteobactéries ( 23%) et Acidobactéries seulement 3% (Thèse Giloteaux, 2009)
Proportion des phyla Archaea obtenus par clonage / séquençage (83 clones)
55%
5%
4%
12%
1%
23%
Thermoprotei
Non déterminé
Methanobacteria
Methanomicrobia
Thermococci
Non déterminé
Proportion des phyla Archaea obtenus par clonage / séquençage (83 clones)
55%
5%
4%
12%
1%
23%
Thermoprotei
Non déterminé
Methanobacteria
Methanomicrobia
Thermococci
Non déterminé
Euryarchaeota
40%
Crenarchaeota
60%
Proportion des phyla Archaea obtenus par clonage / séquençage (83 clones)
55%
5%
4%
12%
1%
23%
Thermoprotei
Non déterminé
Methanobacteria
Methanomicrobia
Thermococci
Non déterminé
Proportion des phyla Archaea obtenus par clonage / séquençage (83 clones)
55%
5%
4%
12%
1%
23%
Thermoprotei
Non déterminé
Methanobacteria
Methanomicrobia
Thermococci
Non déterminé
Euryarchaeota
40%
Crenarchaeota
60%
Diversité archéale (83 clones séquencés)
Diversité significative d’Archées
A Carnoulès uniquement Euryarchaeota amplifiés à partir d’échantillons d’eau (Bruneel et al., 2008)
Résultats: Diversité fonctionnelle
Répartition des gènes fonctionnels chez les isolats
Gènes de transporteurs + gènes aox
Diversité totale des gènes aox
Alignement des séquences des souches cultivables + clones
Répartition des gènes fonctionnels dans les isolats
arsB- 59 isolats acr3(1)- 75 isolats acr3(2)- 11 isolats aox- 22 isolats
Transporteurs d’arsénite Oxydation
Analyse croisée
Aucun gène de résistance: 38
1 gène de résistance: 100
2 gènes de résistance: 26
3 gènes de résistance: 7
A déterminer: 41
Diversité des gènes aox
Pas de gène aox affilié aux archées
Pas d’aox affiliés aux Gammaproteobactéries amplifiés à partir du sédiment
Présence de clones sans représentants cultivables associés
Présence chez Gram + et Flavobactéries
Possibilité de transferts horizontaux (souches soulignées)
Be
tapro
teobacté
ries
Ga
mm
apro
teoba
ctéries
Chloroflexi
Alphap
roteobactéries
Be
taproteobactéries
Gam
ma
proteob
actériesChloroflexis
Archaea
Be
tapro
teobacté
ries
Ga
mm
apro
teoba
ctéries
Chloroflexi
Alphap
roteobactéries
Be
taproteobactéries
Gam
ma
proteob
actériesChloroflexis
Archaea
Conclusion et perspectives
Mise en évidence dans le milieu d’organismes capables de réduire/ oxyder l’arsenic.
Recherche des gènes arr (respiration) et ars M (méthylation)
Réalisation de microcosmes abiotiques ou avec un inoculum bactérien contrôlé ou naturel sous différentes conditions :
-Différentes phase minérale
- pH
- Statuts redox
- As (III)/As (V)
- Donneur/ Accepteur d’e-
Suivi de l’expression des gènes fonctionnels et de la spéciation de l’arsenic
Séminaire RP2E - Audrey CORDI le 28 janvier 2010
Physicochimie du site: (eau et sédiments)
Water Sediments
pH 6.9 -
Density (Kg/l) - 2.07
Moisture 20° (%) - 18
Moisture 105° (%) - 19.3
Fraction <2mn (%) - 57.8
Fraction >2mn (%) - 42.2
OM on <2mn (%) - 2
P total - 0.08
Al 98 µg/l 15150 µg/g
As 6 µg/l 320 µg/g
Cd ND 0.3 µg/g
Cr ND 40 µg/g
Cu 1 µg/l 103 µg/g
Fe ND 23745 µg/g
Mn ND 510 µg/g
Ni ND 23 µg/g
Pb ND 49 µg/g
Zn 2 µg/l 88 µg/g
pH (6,9) proche de la neutralité (diffère par rapport aux autres sites d’études)
Concentration en arsenic faible dans l’eau (6 µg/L) et modérée dans sédiment (320 mg/kg) mais plus élevée que la concentration moyenne provenant du fond géochimique dans les Vosges (48 mg/kg).
Contamination en Aluminium et en Fer non négligeable dans sédiments.
Résultat de diversité des gènes de transport d’arsénite Pas de gènes d’Archées amplifiés alors que séquences utilisées pour dessin des amorces.
Séquences ars B clonées et isolats phylogénétiquement proche des arsB des Gammaproteobactéries
Mise en évidence par clonage de nouveaux groupes sans représentants cultivables
Phylogénie non respectée nombreux transferts horizontaux suspectés.
2 clusters: le premier associé aux Proteobactéries et le second associé aux Verrucomicrobia (clones).
Transporteur généralement trouvés chez Alpha- et Betaproteobactéries mais
possibilité de transferts horizontaux chez Gammaproteobactéries, Actinobactéries et Firmicutes.
Divisé en deux clusters:
Premier cluster: Actinobactéries (clones et isolats) et Gemmatimonadetes (clones).
Second cluster: Bacteroidetes (isolats), Verrucomicrobia (clones), Chloroflexi- Deltaproteobacteries (clones) , et Gammaproteobactéries.
Nombreux clones proches des Chloroflexi- Deltaproteobacteries mais sans représentants cultivables connus associés.
Même si phylogénie respectée par rapport au 16S cas de transferts horizontaux
ars B acr3(1) acr3(2)
Diversité des gènes arsB
Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries Betaproteobactéries Gammaproteobactéries Bacteroidetes
Séquences ars B clonées proviennent des mêmes groupes que les isolats porteurs de arsB phylogénétiquement proche des arsB des Gammaproteobactéries Mise en évidence de nouveaux groupes sans représentants cultivables par clonage
Phylogénie non respectée nombreux transferts horizontaux suspectés.
Pas de gènes d’Archées amplifiées alors que séquences utilisées pour dessin des amorces.
Diversité des gènes acr3(1) (1/2)
Divisé en deux clusters: ici est représenté le premier qui comprend les Actinobactéries et les Gemmatimonadetes (clones).
Transferts horizontaux à des Gammaproteobactéries, Betaproteobactéries et Flavobactéries.
Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries Betaproteobactéries Gammaproteobactéries Bacteroidetes
Actinobactéries
Diversité des gènes acr3(1) (2/2)
Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries Betaproteobactéries Gammaproteobactéries Bacteroidetes
Bacteroidetes
Verrucomicrobia
Clo
rofle
xi- De
ltap
rote
ob
acté
ries
Ga
mm
ap
rote
ob
acté
ries
Second cluster, comprenant les Bacteroidetes, Verrucomicrobia (clones), Chloroflexi- Deltaproteobacteries (clones) , et Gammaproteobactéries.
Nombreux clones proches des Chloroflexi- Deltaproteobacteries mais sans représentants cultivables connus associés.
Cas de transferts horizontaux
Phylogénie conservée par rapport au 16S.
Pas de gènes d’Archées amplifiées alors que séquences utilisées pour dessin des amorces.
Diversité des gènes acr3(2)
2 clusters: le premier composé des acr3(2) associés aux Proteobactéries et le second associé aux Verrucomicrobia (clones).
Transporteur généralement trouvés chez Alpha- et Betaproteobactéries mais possibilité de transferts horizontaux chez Gammaproteobactéries, Actinobactéries et Firmicutes.
Pas de gènes d’Archées amplifiées alors que séquences utilisées pour dessin des amorces.
Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries Betaproteobactéries Gammaproteobactéries Bacteroidetes
Proteobactéries
Verrucomicrobia
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