A r c h . M i k r o b i o l . 72, 267-296 (1970) © b y Springer -Ver lag 1970
Die Phenoloxydasen des Ascomyceten Podospora anserina
V . Eigenschaften der Laccase I nach weiterer Reinigung*
H . P E T E R MOLITORIS und K A R L E S S E R
Inst i tut für Allgemeine B o t a n i k der Ruhr-Universität B o c h u m
Eingegangen a m 1. A p r i l 1970
The Phenoloxidases of the Ascomycete Podospora anserina V . Properties of Laccase I after F u r t h e r Pur i f i cat ion
Summary. 1. B y using an improved method for puri f ication of the laccase I of the w i l d type of Podospora anserina, y i e ld and specific a c t i v i t y of this enzyme have been increased, whereas its s tab i l i ty decreased.
2. F resh ly prepared laccase I seems to be homogeneous, according to its behavior i n hydroxylapat i te -chromatography, i n sedimentation-analysis and i n disc-electro-phoresis.
3. The catalyt ic , electrophoretic, spectral and molecular properties and the carbohydrate-composit ion of laccase I have been investigated. Laccase I exhibits a doub le -pH-opt imum for its reaction w i t h dopa (at p H 5.5 and 7.5), the isoelectric point being at p H 4.9. The enzyme is reversibly inhib i ted b y sodium azide (Kt = 1 . 9 x l O - 6 M ) a n d has absorpt ion-maxima at 280 and 610 n m . The content of nitrogen, copper and carbohydrate is 13.6%> 0.3°/o a n d 2 3 % of the d r y weight, respectively. Hexosamine , mannose, glucose and galactose have been found i n the carbohydrate moiety of the enzyme. The fol lowing molecular data wrere determined: sedimentation coefficient «5o, w — 14.47 x 10 - 1 3 sec, diffusion coefficient JDÎJO, W = 3.06 X l O - 7 cm 2 /sec, part ia l specific volume = 0.701 m l / g , rat io of the fr ict ional coefficient / / / 0 = 1.46. The molecular weight MttD (sedimentation a n d diffusion) is 390,000. Th is has been substantiated by finding a molecular weight Mw of 383,000 using equi l ibr ium sedimentation. One molecule of laccase I contains therefore about 18 atoms of copper.
4. The laccase spectrum of a certain m u t a n t s tra in is phenocopied i f the w i l d type myce l ium is grown i n a medium of p H 5 or below.
5. The laccase occurs at different degrees of polymerisat ion. The respective sedimentat ion coefficients indicate that , depending on experimental conditions, aggregation to a dimer or dissociation into 4, perhaps 5 subunits , can occur. These subunits can be further spl it into halves.
6. The relat ion of the mul t ip le forms of laccase I of the w i l d type to the laccases of some mutants of this fungus is discussed.
Zusammenfassung. 1. D i e Laccase I des Wi lds tammes v o n Podospora anserina wurde nach einer verbesserten Methode gereinigt. D a d u r c h konnten Ausbeute u n d spezifische Aktivität des E n z y m s gesteigert werden. D i e Stabilität n a h m dagegen ab.
* M i t Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft.
18 Arch. Mikrobiol., Bd. 72
2. Das Verha l ten der frisch gereinigten Laccase I bei der Chromatographie a n H y d r o x y l a p a t i t , i n der Ultrazentr i fuge u n d i n der Disc -Elektrophorese spricht für deren molekulare E inhe i t l i chke i t .
3. D i e kata lyt i schen , elektrophoretischen, spektralen u n d molekularen E i g e n schaften sowie die Zusammensetzung der Laccase I wurden untersucht. Sie besitzt ein doppeltes p H - O p t i m u m ( p H 5,5 u n d 7,5), der isoelektrische P u n k t liegt bei p H 4,9; sie w i r d durch N a t r i u m a z i d reversibel gehemmt {Kt = 1,9 • 10~ 6 M ) , die Absorpt i onsmaxima liegen bei 280 u n d 610 n m . D e r Stickstoffgehalt beträgt 13,6%» der Kupfergehal t 0 , 3 % , der Koh lenhydratgeha l t 2 3 % der Trockensubstanz. I m K o h l e n h y d r a t a n t e i l wurden H e x o s a m i n , Mannose, Glucose u n d Galactose nachgewiesen. Folgende molekulare D a t e n wurden ermi t te l t : Sedimentationskonstante 4o, w = 14,47 • 10~ 1 3 sec, Diffusionskonstante D\0t w = 3,06 • 1 0 - 7 cm 2 /sec, partielles spezifisches V o l u m e n = 0,701 m l / g , Verhältnis der Reibungskoeff izienten flfQ = 1,46. Das Molekulargewicht liegt bei 390.000 (Sedimentation, Di f fus ion) ; dies Ergebnis w i r d bestätigt durch e in m i t Gleichgewichtsedimentation zu 383.000 ermitteltes Molekulargewicht . E i n Laccase-I-Molekül enthält somit etwa 18 K u p f e r atome.
4. D u r c h veränderte Anzuchtbedingungen des W i l d s t a m m - M y c e l s ( p H der Nährlösung unter 5) k a n n das Laccasespektrum einer best immten M u t a n t e phäno-kopiert werden.
5. D i e Laccase k o m m t i n verschiedenen Polymerisat ionsstufen vor . A u s den gewonnenen Sedimentationskonstanten läßt sich je nach Versuchsbedingungen sowohl Aggregation zu einem D i m e r folgern als auch Dissoz iat ion i n 4, möglicherweise 5 akt ive Untere inhei ten , die nochmals i n Hälften zerfallen können.
6. D i e Beziehungen der Laccase I des W i l d t y p s u n d ihrer verschiedenen P o l y merisationsstufen zu den Mutanten-Laccasen werden d iskut iert .
Einleitung
In den vorausgegangenen Teilen dieser Veröffentlichungsreihe1 wurden die im Mycel des Wildstammes und der Mutanten der Podospora gebildeten Phenoloxydasen beschrieben (Laccase: Teil I, II, III; Tyrosinase: Teil III, IV). Bei der Isolierung, Reinigung und biochemischen Analyse dieser Phenoloxydasen stellten sich charakteristische qualitative und quantitative Unterschiede zwischen einer höhermolekularen Laccase I und den niedermolekularen Laccasen II und III heraus, die besonders von den Mutanten gebildet werden (s. Teil VI). Für die weitere Untersuchung der molekularen Eigenschaften der Laccase I wurden größere Mengen eines hochgereinigten Enzyms benötigt. In der vorliegenden Arbeit wird eine verbesserte Methode der Aufarbeitung beschrieben, die zu einer höheren Enzymausbeute und einer gesteigerten spezifischen Aktivität (SpA) führte. Das so gereinigte Enzym wurde auf seine katalytischen und molekularen Eigenschaften sowie auf seine Zusammensetzung hin untersucht. Es zeigte, wie zu erwarten, eine Reihe von abweichenden Eigenschaften gegenüber der in Teil II beschriebenen Laccase. Weiterhin
1 Referenzen der Mit te i lungen I — V I a m A n f a n g des Literaturverzeichnisses. Hinweise auf die einzelnen Mit te i lungen erfolgen i m T e x t durch die Kennze i chnung T e i l I , T e i l I I usw.
ergaben sich Hinweise auf eine Spaltbarkeit der Laccase I in aktive Untereinheiten, dieu. a. den immer noch verhältnismäßig geringen Reinigungsfaktor und die geringe Stabilität der Enzymaktivität erklären können. Die Eigenschaften der hier beschriebenen Wildstamm-Laccase sind besonders für den Vergleich mit den niedermolekularen Mutanten-Lacca-sen (Teil III, VI) von Bedeutung.
Material und Methoden
Material A l s W i l d s t a m m verwendeten w i r den S t a m m sx- von Podospora anserina (Ces.)
R e h m . Einze lhe i ten über Genetik u n d Entwicklungsgeschichte dieses Stammes bei Esser (1956 a, 1959). Angaben z u der Mutante z finden sich bei Esser (1956b) u n d i n T e i l I I I , I V u n d V I .
Vie le der i n dieser A r b e i t verwendeten Methoden s ind bereits an anderer Stelle mitgetei l t worden : A n z u c h t der Myce l i en , Herste l lung der E x t r a k t e , colorimetrische Aktivitätsbestimmung der Phenoloxydasen (Teil I) , bisherige Re in igung der L a c case I , B e s t i m m u n g der Michael iskonstanten, des K o h l e n h y d r a t - u n d K u p f e r gehaltes (Teil I I ) , analytische Disc-Elektrophorese u n d serologische Methoden (Teil I I I , V I bzw. Esser, 1963), Re in igung u n d Charakteris ierung der Tyrosinase (Teil I V ) .
Folgende Puffer wurden verwendet : Phosphat-Puffer ( N a 2 H P 0 4 / N a H 2 P 0 4 ) , Acetat -Puf fer (Essigsäure/NaOH), Borat -Puf fer (Borsäure/Borax), T r i s / H C l - P u f f e r [Tr i s ( Hy droxymethy l )aminomethan /HCl ] , Ammoniumacetat -Puf fer (Essigsäure/ A m m o n i a k ) , McI lvain-PufFer (Na 2HP0 4 /Citronensäure), Britton-Robinson-PufFer(II ) (alle i n R a u e n , 1964).
Anzucht der Mycelien für vergleichende Untersuchungen. U n t e r den bisherigen Anzuchtbedingungen (flüssiges Maisdekoktmedium p H 6—7, Belüftung, 26° C, 4 Tage K u l t u r d a u e r ) wurde W i l d s t a m m - M y c e l i n Großfermentern der F a r b e n fabr iken B a y e r A . G . , Wupper ta l -E lber f e ld (1.0001), u n d der Schering A . G . , B e r g k a m e n (2.500 l ) 2 sowie später i n der eigenen Fermenteranlage (3001, Chemap A . G . , Männedorf/Schweiz) angezogen.
Protein- und Trockensubstanzbestimmungen D e r Proteingehalt wurde nach L o w r y et a l . (1951) u n d m i t der M i k r o k j e l d a h l -
Methode best immt. N u r für die Routinemessungen des Proteingehaltes während der Aufarbei tungen u n d für alle S p A - A n g a b e n wurde aus den E x t i n k t i o n s w e r t e n bei 280 u n d 260 n m der Proteingehalt nach W a r b u r g u . Chr i s t ian (1941) ermitte l t . D e n analyt ischen D a t e n liegt das Trockengewicht (Vacuumtrockenpistole , P 2 0 5 , 70° C) zugrunde. Aufbewahrung der Trockensubstanz bei - f 4°C i m E x s i k k a t o r .
Kohlenhydratbestimmung a) Qualitativ mit Dünnschichtchromatographie. B e i R a u m t e m p e r a t u r nach den
bei S tah l (1967) beschriebenen Standardmethoden m i t Geräten der F i r m e n Desaga G m b H , Heidelberg , u n d Camag , Muttens /Schweiz . A l s Sorpt ionsmitte l wurde Cellulosepulver C M 300 (Macherey, Nagel & Co. , Düren) verwendet. Das E n z y m wurde d irekt oder nach H y d r o l y s e (a) 1,0 n H C l , 1 S t d , 80°C; b) 1,0 n H C l , 2V2 S t d ,
2 Be iden F i r m e n sei für ihr Entgegenkommen gedankt.
100°C; c) 3,0 n H C l , 4 S t d , 100°C) untersucht. A l s Fließmittel dienten (jeweils V / V ) : n - B u t a n o l - P y r i d i n - W a s s e r 6 : 4 : 3 (Crumpton , 1959); n - B u t a n o l - P r o p a n o l -Wasser 1 :2 :1 (Svennerholm u . Svennerholm, 1958, verändert) ; Pyridin-Äthylacetat-Essigsäure-Wasser 1 2 : 1 8 : 4 : 7 (Fischer u . Dörfel, 1955, verändert); Pheno l , gesättigt m i t Wasser + 1 % N H 3 + K C N - S p u r e n (Partridge u . W e s t a l l , 1948). D i e C h r o m a -togramme wurden m i t Silbernitratlösung angefärbt (Trevelyan et a l . , 1950) u n d m i t Thiosul fat fixiert.
b) Quantitativ. Neben der Orcin-Methode wurde der K o h l e n h y d r a t - G e h a l t auch m i t dem Anthronreagens nach Hörmann u . Go l lwi tzer (1962) ermitte l t . A c y l n e u r -aminsäure wurde m i t dem Bial -Reagens nach Böhm et a l . (1954), H e x o s a m i n d irekt oder nach H y d r o l y s e der Laccase (2 n H C l , 16 S t d , 100° C) m i t dem M o r g a n - E l s o n -Reagens nach B l i x (1948) best immt.
Bestimmung des Molekulargewichtes A l l e diesbezüglichen Untersuchungen wurden m i t frischer, dialysierter Laccase
(0,1 M Phosphatpuffer , p H 6,0) bei 20 i 0,1° C durchgeführt an einer analyt ischen Ultrazentr i fuge Mode l l E m i t Schl ierenoptik (Wi nke l 70°) bzw. Monochromator (280 nm) u n d photoelektrischem Scanner (jeweils B e c k m a n Instruments , München).
a) Aus der Sedimentations- und Diffusionskonstante. Sedimentationskonstante : Konzentrat ionsbere ich 1,11—6,39 m g / m l : Schlierenoptik, 22 Läufe, 59.780 U p m , A l u m i n i u m - E i n k a n a l z e l l e (4°) ; Konzentrat ionsbereich 0,21—0,25 m g / m l : Scanner, 3 Läufe, 56.100 U p m , Aluminium-Doppe lsektorze l le , Saphirfenster.
Di f fusionskonstante : Konzentrat ionsbereich 1,71—5,20 m g / m l : Schl ierenoptik, 11 Läufe, 3.848 U p m , Doppelsektorzelle (Capi l lartyp m i t synthetischer Grenzl inie) . D i e Sedimentations- u n d Diffusionskonstanten wurden jeweils auf Standardbedingungen umgerechnet u n d auf unendliche Verdünnung interpoliert . Das Moleku lar gewicht MSD wurde nach der Svedberg-Gleichung errechnet.
b) Aus Sedimentationsgleicligewichtsläufennach Yphantis (1964). Konzentrat i ons bereich 1,70—5,20 m g / m l : Schl ierenoptik, 4 Läufe bei 7.447 u n d 4.059 U p m , 8 - K a n a l K e l - F Mittelstück, Saphirfenster. Berechnung des Molekulargewichtes M T Ü
u n d K o r r e k t u r auf unendliche Verdünnung nach E l i a s (1961). Das partielle spezifische Volumen wurde m i t einem digitalen Präzisionsdensito-
meter (A. P a a r K G , Graz/Österreich) nach Stabinger et a l . (1967) bei 25 ± 0,02° C ermitte l t u n d auf 20°C umgerechnet 3 .
Isoelektrischer Punkt D e r isoelektrische Punkt wurde durch Amphol ine -Elektro fokuss ierung (Svensson,
1961) m i t der L K B - A p p a r a t u r 8101 ( L K B - P r o d u k t e r A B , Bromma/Schweden) best immt (Aktivitäts- u n d pH-Messungen von 1,5 m l F r a k t i o n e n ; p H - G r a d i e n t e n 3 - 1 0 , 3 - 5 u n d 4 - 6 ) .
Hemmkinetik A r t u n d Ausmaß der H e m m u n g w rurden i m normalen Reaktionsansatz colori -
metrisch als Geschwindigkeit (v) der D o p a - O x y d a t i o n m i t N a t r i u m a z i d als H e m m stoff untersucht mi t den V a r i a b l e n : K o n z e n t r a t i o n des Substrates (S), des H e m m stoffes («/) u n d des E n z y m s . D ie Reversibilität der H e m m u n g wurde nach A c k e r m a n n u . Pot ter (1949) geprüft, während die weitere E r m i t t l u n g des Hemmungs typs nach den i n D i x o n u . Webb (1964) angegebenen Methoden erfolgte.
3 W i r danken H e r r n D r . B . Kickhöfen, M a x - P l a n c k - I n s t i t u t für Immunbiologie , F r e i b u r g (D i rektor : Prof . D r . O. Westphal ) , für seine H i l f e bei der Durchführung der Messungen.
Bestimmung der Enzymaktivitäten
Katalasebestimmung. D i e polarographische B e s t i m m u n g der K a t a l a s e wurde durchgeführt nach der von Wisser (1968) angegebenen Methode m i t dem Tetrapola-ron (Dr. A . K u n t z e G m b H & Co. K G , Düsseldorf-Oberkassel).
E i n e Enzymeinheit (E) entspricht einer Extinktionsänderung von 0,2 / m i n bei 436 n m u n d 1 cm Lichtweg . A l s Substrat wurden DL -3 ,4 -DihydroxyphenyIa lan in ( = D L - D o p a , reagiert m i t Laccase u n d Tyrosinase), K a l i u m f e r r o c y a n i d u n d Ascor-binsaure (beide spezifisch für Laccase) verwendet.
D a die Tyrosinase i m V e r l a u f der Re in igung abgetrennt u n d ihre Abwesenheit durch spezifische Reakt ionen nachgewiesen wurde, konnte D o p a als Substrat für die Routine-Aktivitätsbestimmungen der Laccase eingesetzt werden.
p - K r e s o l , das mi t Laccase weiße, als Trübung ausfallende Dikresole u n d m i t Tyrosinase einen roten Farbstof f bi ldet , wurde als E n z y m s u b s t r a t zu Schnelltesten und zur Anfärbung von E n z y m b a n d e n nach Disc-Elektrophorese u n d I m m u n -Elektrophorese verwendet.
D ie spezifische Aktivität (SpA) gibt die A n z a h l der Enzymeinhe i ten pro m g Prote in an ( E / m g Pro te in , best immt nach W a r b u r g u . Chr i s t ian , 1941).
F a l l s Fehlergrenzen angegeben werden, handelt es sich u m den einfachen, mitt leren Fehler des Mitte lwertes , dem wenigstens 4 unabhängige Messungen z u grunde liegen.
Versuchsergebnisse und Diskussion
1. Reinigung
Die in Teil II angegebene Methodik der Enzymgewinnung wurde wie folgt verändert : Das Mycel wurde vor und nach dem Aufbrechen in der Hughes-Presse bis zur weiteren Verarbeitung in Polyäthylenbeutel unter Stickstoffschutz eingeschweißt und bei — 20° C aufbewahrt. Dadurch wurde die normalerweise bei der Aufbewahrung in der Tiefkühltruhe beobachtete Inaktivierung stark vermindert. Die weiteren Änderungen ergeben sich aus der Tab. 1.
D u r c h die Zentr i fugat ion bei 35.000 X g wurden störende Polysaccharide u n d durch den Einsatz der Molekularsiebsäule ein Großteil von Fremdprote inen u n d P i g menten abgetrennt. D a d u r c h konnte auf zwischengeschaltete D ia lysen verzichtet werden, die Zeit - u n d Aktivitätsverluste gebracht hatten . Anste l le der zwar besser trennenden, aber besonders bei hohen Füllhöhen sehr langsam laufenden Sephadex G-200 Säule k a n n auch eine B I O - G e l A 0,5-m Säule eingesetzt werden, wodurch Zeit gewonnen w i r d .
V o n der Hydroxylapatit-Säule wurden m i t 0,2 M Phosphatpuffer p H 6 zwei gefärbte Gipfe l eluiert , deren zweiter auch geringe Enzymaktivität bei niedriger S p A aufwies. D i e Hauptmenge des E n z y m s (ca. 9 0 % ) k a m m i t dem 0,4 M Phosphat puffer als t ie fb lau gefärbte Lösung von der Säule (vgl . T e i l II ) u n d wurde weiterverarbeitet.
Bei den 28 durchgeführten Reinigungen zeigte sich, daß nicht nur die SpA, sondern auch die Enzymausbeute erheblich gesteigert und der Reinigungsfaktor gegenüber dem Rohextrakt von 24 (Teil II) auf 55 erhöht wurde (Tab. 1). Es fiel jedoch auf, daß in den Elutionsdiagrammen der Molekularsieb- und Hydroxylapatit-Säulen die SpA jetzt keine
Tabel le 1. Typische Reinigung der Laccase I nach dem verbesserten Reinigungsverfahren
N r . Reinigungsschritt Aktivität ( E / k g Feucht -mycel)
Spez. A k t . ( E / m g P r o t . ) *
E n z y m ausbeute i n %
Re in igung
1 R o h e x t r a k t 59.700 2,7 100 1,0
2 Überstand nach Protaminsu l fa t -fä l lung b 62.800 7,8 105 2,8
3 Überstand nach 1. A m m o n -sulfatfällung ( 0 - 5 5 % ) c 1.167 0,2 2
4 Überstand nach 2. A m m o n -sulfatfällung ( 5 5 - 7 5 % ) 0 0
5 Überstand nach Zentr i fugat ion (15 S t d bei 35.000 X g) des i n P u f f e r 4 gelösten Präzipitats v o n Schr i t t 4 38.800 28 65 9,1
6 Gipfe l frakt ionen der Sephadex G-200 Säule ( 8 7 - 3 , 5 cm)« 29.700 106 50 34,8
7 Gipfe l frakt ionen der H y d r o x y l -apatitsäule (10 • 3 c m ) f 18.000 129 30 42,3
8 nach Dia lyse (0,1 M Phosphat puffer p H 6; m i n d . 36 Std) u n d Zentr i fugat ion (30 m i n , 55.000 X g) 22.200 169 37 55,4
9 Entsprechende Endwer te der Re in igung T e i l I I 8.842 123,2 15,2 23,7
* A l l e Reinigungsschritte wurden bei -|- 4°C durchgeführt. D e r R o h e x t r a k t wurde aus 1500 g M y c e l (Feuchtgewicht) des Wi lds tammes hergestellt.
a Prote inbest immung nach W a r b u r g u . Chr i s t ian (1941). b Ansteigen der Aktivität bedingt durch A k t i v i e r u n g der i m R o h e x t r a k t noch
enthaltenen Tyrosinase (vgl . T e i l I V ) . c Reversible I n a k t i v i e r u n g durch Ammonsu l fa t . d 0,01 M Phosphatpuffer, p H 6,0. e D u r c h Säule m i t B i o - G e l A 0,5-m ersetzbar. 0,02 M Phosphatpuffer, p H 6,0. f Stufengradient, Phosphatpuffer p H 6; 0,02 M ; 0,20 M ; 0,40 M . N a c h P i g
ment- u n d Fremdprote in vorgipfeln k o m m t die Hauptmenge der gereinigten Laccase bei der 0,4 M Pufferstufe v o n der Säule = Schr i t t 7.
deutliche Plateauzone mehr zeigt, wie es für ein hochgereinigtes, stabiles Enzym zu erwarten wäre (vgl. Teil II). Auf dieses Phänomen wird noch einzugehen sein (s. S. 290).
2. Reinheitskriterien Frisch gereinigtes Material von eng geschnittenen Elutionsgipfeln
zeigte in der Ultrazentrifuge nur einen symmetrischen Gipfel. In der Disc- und Agargel-Elektrophorese wurden nach Anfärben auf Protein (mit Amidoschwarz) und auf Enzymaktivität (mit Dopa oder p-Kresol) nur eine Bande bzw. ein Fleck gefunden.
3. Stabilität bei der Aufbewahrung Für die weiteren Untersuchungen war es von Wichtigkeit, Bedingun
gen zu finden, unter denen Aktivität und Konfiguration der Laccase I möglichst erhalten bleiben. Optimale Stabilität (Tab. 2) wurde erreicht,
Tabelle 2. Stabilität der Laccaseaktivität
Untersuchter Parameter V a r i a t i o n des Parameters Opt imale Stabilität bei
Temperatur (°C) + 60 ; + 2 2 ; + 4 ; - 1 8 ; - 1 8
p H - W e r t 3 ; 4 ; 4,5; 5 ; 5,5; 6 ; 6,5; 7; 7,5; 8 ;
5,0
E n z y m k o n z e n t r a t i o n (mg Trockensubstanz/ml)
0,05; 0,23; 0,5; 2,3; > 2,3
Phosphatpufferkonzent ra t i on (M) 0,02; 0,05; 0,15; 0,40; 0,45; 0 , 0 5 - 0 , 1 5
Zusätze bei + 2 2 ° C 2 0 % G l y c e r i n ; 2 0 % Saccharose; ohne Zusatz
2 0 % Glycer in
+ 4°C 2 0 % G l y c e r i n ; 2 0 % Saccharose; 1 0 % Rinderseruma l b u m i n ; ohne Zusatz
2 0 % G l y c e r i n
- 1 8 ° C 2 0 % G l y c e r i n ; 2 0 % Saccharose; 1 0 % Rinderseruma l b u m i n ; ohne Zusatz
2 0 % Glycer in
F r i s c h gereinigte Laccase I wurde unter den angegebenen Bedingungen i n k u biert u n d die Restaktivität i n Abständen über einen Ze i t raum v o n mehreren M o n a ten gemessen. W e n n nicht anders angegeben, wurde i n 0,4 M Phosphatpuffer p H 6 bei + 4°C inkubiert . Undialys ierte Laccase I , S p A 121 — 148.
wenn konzentrierte Laccase I in gelöstem Zustand bei möglichst niedriger Temperatur, p H 5 und einer Pufferkonzentration um 0,1 M aufbewahrt wurde. Durch Zusatz von 2 0 % Glycerin konnte das Enzym auch noch bei — 20° C in gelöstem Zustand erhalten werden.
Soweit der Glycer inzusatz bei den folgenden Untersuchungen stören konnte, wurde auf i h n verzichtet.
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Wie aus Tab. 3 ersichtlich, wurde in einem weiteren Versuch über die Erhaltung der Enzymaktivität der Einfluß verschiedener Puffer sowie von E D T A und den bivalenten Kationen C a + + und Mg++ (zugesetzt als CaCl 2 und MgCl 2) geprüft.
Aus den Kontrollen zeigte sich, daß Boratpuffer (0,1 M ; p H 7,2) für die Erhaltung der Aktivität am günstigsten war.
Ein Zusatz von E D T A in einer Endkonzentration von 1 • 10~3 bis 1 • 10~2 M verdoppelte die Stabilität bei den Phosphatpuffern gegenüber der Kontrolle (vgl. auch Peisach u. Levine, 1965). Die höchste Restaktivität wurde bei der Kombination 0,1 M Phosphatpuffer p H 6 mit 1 • 10-2 M E D T A gefunden.
CaCl2 und MgCl2 fördern die Erhaltung der polymeren Struktur und der katalytischen Aktivität bei Hämocyanin, einem der Laccase in vieler Hinsicht ähnlichen Kupfer-Glykoprotein (Literatur bei Konings, 1969). Tab. 3 zeigt, daß sowohl CaCl 2 als auch MgCl 2 zwischen 1 • 10~3 und 1 • 10~2 M die Stabilität der Laccase I leicht fördern, bei 1 • 10 _ 1 M sie jedoch vermindern.
Dem fördernden Einfluß der bivalenten Kationen steht hier möglicherweise bei höheren Konzentrationen der von Peisach u. Levine (1965) und Malkin et al. (1968) beobachtete Hemmeffekt des Chlorid-Ions entgegen.
Wurde das in 0,1 M Phosphatpuffer p H 6 gelöste, tiefblaue Enzym direkt gefriergetrocknet, so blieb die blaue Farbe weitgehend erhalten, die in Analogie zu Befunden von Malmström et al. (1968) dem C u + + , Typ 1 der Laccase zuzuschreiben wäre. Wurde das Enzym jedoch, um pufferfreies Material zu erhalten, zuerst in 0,02 M Ammonacetat-Puffer p H 6,52 überführt und dann lyophilisiert, so war das Produkt fast farblos. Beide Arten des gefriergetrockneten Enzyms lösen sich nur unvollständig wieder in Puffer und verlieren dabei einen Großteil ihrer Aktivität. Da bei allen Aufbewahrungsmethoden Aktivitätsverluste aufgetreten waren, wurde für die Messung der Aktivität und biophysikalischer Daten nur frisches Enzym verwendet, während zur Ermittlung analytischer Daten weitgehend gefriergetrocknetes Material eingesetzt wurde.
Aus den Versuchen geht hervor, daß durch die neue Beinigungsme-thode Ausbeute und SpA der Laccase I gesteigert werden. Die Stabilität des hochgereinigten Enzyms hat jedoch abgenommen. Das gleiche fanden Fling et al. (1963) für die hochgereinigte Tyrosinase aus Neurospora.
4. Eigenschaften der gereinigten Laccase In Tab. 4 sind eine Reihe von Eigenschaften der Laccase I mit den
Vergleichswerten aus Teil II aufgeführt.
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a) Aktivitäts-Daten (Tab.4, Zeile 1-12) Gegenüber der früher beschriebenen Reinigung ist die SpA stark
erhöht. Signifikante Unterschiede zeigen auch die Michaelis konstant en für Ascorbinsäure und Kaliumferrocyanid.
Der Zusatz von EDTA und ein- und zweiwertigem Kupfer zum Reaktionsgemisch mit Dopa hatte bei sofortiger Messung in den untersuchten Konzentrationen keine Wirkung auf die Aktivität. Der Einfluß der Kupferionen ist offenbar stark vom Substrat abhängig, denn von Peisach u. Levine (1965) und Iwasaki et al. (1967) wurde übereinstimmend gefunden, daß C u + + mit Hydrochinon als Substrat die Laccase-Aktivität nicht beeinflußte, während mit Brenzcatechin Aktivitätssteigerung beobachtet wurde. Die mit MgCl2 und CaCl2 gefundene 2 0 % Hemmung ist offenbar auf das Chlorid-Ion zurückzuführen (Peisach u. Levine, 1965; Malkin et al., 1968).
Hemmversuche. Das niedermolekulare Natriumazid erwies sich als wirkungsvoller Hemmstoff der Laccase (Ki = 1,9 ± 0,1 • 10~6 M). Da Natriumazid mit Kupfer Komplexe bildet, ist anzunehmen, daß dadurch die katalytische Aktivität der kupferhaltigen Laccase gehemmt wird. Die Hemmung durch Natriumazid ist reversibel. Reversible Hemmung durch Komplexbildung des Hemmstoffes mit dem Kupfer von Phenoloxydasen wurde bereits verschiedentlich festgestellt (Teil I V ; Suzuki, 1959; Pomerantz, 1963).
Dies konnte durch einen Versuch bestätigt werden, bei dem das E n z y m zwei Tage bei - f 4°C m i t 3,8 • 1 0 - 3 M N a t r i u m a z i d inkubier t wurde, was zu einer 9 0 % H e m m u n g führte. D u r c h Ausfällen des Proteins ( 8 0 % Sättigung m i t Ammonsul fa t ) , Abzentr i fugieren und Wiederaufnehmen des Sedimentes i n 0,02 M Phosphatpuffer p H 6, wurde die ursprüngliche Aktivität fast völlig wiedergewonnen. D a d u r c h w i r d sowohl die Reversibilität der H e m m u n g bewiesen als auch die Möglichkeit ausgeschaltet, daß diese auf einer Abspa l tung eines K u p f e r - A z i d - K o m p l e x e s beruht .
E i n weiterer Hinwe is für die starke B i n d u n g des K u p f e r s i n der Laccase ist die Tatsache, daß es sich auch durch ausgiebige Dia lyse n icht entfernen läßt.
Im Gegensatz zum niedermolekularen Natriumazid kommt es mit dem höhermolekularen EDTA, offenbar aus sterischen Gründen, nicht zu einer Kupfer-Hemmstoff-Komplexbildung, wodurch die an Laccase u.a. durch Peisach u. Levine (1965), Iwasaki et al. (1967) erhobenen Befunde bestätigt werden.
Die Auswertung der Daten der Hemmversuche mit Natriumazid (Methodik in Dixon u. Webb, 1964) nach Line weaver-Burk (Abb.l) oder Hofstee läßt zunächst auf eine nichtkompetitive Hemmung schließen. Die Tatsache jedoch, daß bei der Auftragung nach Dixon keine Geraden resultieren (Abb. 2), weist auf einen gemischten Hemmtyp hin. Folgende Deutung bietet sich an: Für die Bindung des Substrates am Enzym ist ein aktives Zentrum verantwortlich (mit C u + + , Typ 1 ; Pilzlaccase ;
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38,6-10 1/S [l/Mol]
A b b . 1. H e m m u n g der D o p a - O x y d a t i o n der Laccase I durch N a t r i u m a z i d . A u f t r a gung nach L ineweaver -Burk . I m normalen Reaktionsansatz wurde der Hemmstof f unmitte lbar vor dem E n z y m zugegeben (0,054 mg Laccase pro Ansatz = 1,4 • 1 0 ~ 1 0 M ) .
Fr ische Laccase, dialysiert gegen 0,1 M Phosphatpuffer p H 6; S p A = 115
Dopa 2,59*10"3M
3,71* 10"3 M
* 5,56 MO"3 M 7,14*10~3M U,82«10- 3M
0 0,93 1,85 278 3,70 4.63 5,55 6,48 7,40*10~6
Natriumazid J [M]
A b b . 2. H e m m u n g der D o p a - O x y d a t i o n der Laccase I durch N a t r i u m a z i d . A u f t r a gung der Versuchsdaten von A b b . 1 nach D i x o n . Nähere Erläuterung i m T e x t
Malmström et al., 1969), während die Komplexbildung des Natrium-azids mit dem Enzym-Kupfer an einem zweiten aktiven Zentrum der Laccase stattfindet (mit C u + + , Typ 2; Pilzlaccase; Malkin et al., 1968).
Für die spezifische katalytische Aktivität der Laccase, nämlich die durch den Elektronenüberträger Kupfer vermittelte Oxydation des Substrates bei gleichzeitiger Reduktion von molekularem Sauerstoff, müssen jedoch alle aktiven Zentren zusammenwirken. Dabei ist deren Abstand möglicherweise so gering, daß eine gegenseitige Beeinflussung in einem mehr kompetitiven Sinne resultiert.
A u c h Macrae u . Duggleby (1968) u n d W a l k e r (1969) schließen aus ihren U n t e r suchungen a n Kar to f f e l - bzw. A p f e l - Phenoloxydase au f das Vorhandensein zweier verschiedener akt iver Zentren für die Substrat - bzw. Inh ib i torb indung .
D a bei der colorimetrischen Messung der Laccaseaktivität m i t D o p a die B i l d u n g des gefärbten Endproduktes einer Mehrschr i t t reakt ion best immt w i r d u n d weiterhin mehrere akt ive Zentren i m E n z y m vorhanden s ind (Malmström et a l . , 1969), s ind auch Zwischenwirkungen n icht auszuschließen, die den H e m m u n g s t y p verschleiern können. E s ist daher vorgesehen, die H e m m k i n e t i k auch a n Einschr i t t reakt ionen i m Polarographen z u überprüfen.
Hitzeinaktivierung. Die Halbwertszeit der Hitzeinaktivierung frisch gereinigter Laccase I entspricht mit 5,4 min dem bereits in Teil II mitgeteilten Wert. Eine logarithmische Auftragung der Restaktivität in ° / 0
gegen die Inkubationszeit ergibt eine Gerade, entsprechend einem nach einer Reaktion I. Ordnung verlaufenden Aktivitätsverlust (Abb. 5, Gerade A). Im Gegensatz dazu steht der Verlauf der Hitzeinaktivierung gealterter Laccase. Darauf wird später noch eingegangen (S. 291).
b) Analytische Daten (Tab.4, Zeüe 13-21) Der Proteingehalt wurde zunächst nach Warburg u. Christian (1941)
ermittelt. In Parallel versuchen wurde jedoch festgestellt, daß der Trockensubstanzgehalt nur knapp 50° / 0 des nach Warburg u. Christian ermittelten Proteingehaltes ausmacht.
D a diese spektrophotometrische Methode ursprünglich für Hefe-Enolase entwicke l t wurde, ist ein Umrechnungsfaktor erforderlich, der für die frische gereinigte Laccase I 0,46 beträgt (Tab.4) . D a aber weiterhin festgestellt wurde, daß das A b sorptionsverhältnis 2)280^2)260 be im Stehenlassen der Laccase langsam a b n i m m t (vor a l lem A b n a h m e bei 280 nm), k a m diese Methode zur B e s t i m m u n g absoluter Proteinwerte n icht mehr i n Frage . Wegen der E in fachhe i t u n d Schnel l igkeit der Methode wurde sie jedoch für Rout inebest immungen der S p A bei den A u f a r b e i t u n gen verwendet, wo relative Werte ausreichend waren.
Alle hier angegebenen analytischen Werte beziehen sich daher auf Trockensubstanzbestimmungen. Während das Trockengewicht der hier beschriebenen Laccase I nur etwa 5 0 % des Warburg u. Christian-Wertes ausmacht, betrug es bei der Laccase I aus Teil II 90—95°/ 0 dieses Wertes. Diese Differenz erklärt einen Großteil der Unterschiede in den analytischen Daten gegenüber Teil II, soweit sie auf Protein- oder Trocken-
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substanzwerten basieren (z.B. f m ^ Laccase, Kohlenhydrat- und
Kupfergehalt etc.).
Der aus der StickstofFbestimmung (Mikrokjeldahl) ermittelte Protein-gehalt liegt bei 85° / 0 der Trockensubstanz, der nach Lowry et al. (1951) bestimmte Wert jedoch nur bei 73°/ 0 , also 12°/ 0 niedriger.
D i e Differenz ist darauf zurückzuführen, daß m i t der Methode nach L o w r y über den T y r o s i n - u n d Tryptophangehalt nur der Prote inante i l , bei der K j e l d a h l -Methode jedoch der Gesamtstickstoff erfaßt w i r d u n d dami t auch n ichtprote in-artige, jedoch stickstoffhaltige Ante i le des E n z y m s .
Die im Vergleich zur Trockensubstanzmenge niedrigen Proteinwerte erklären sich durch einen Anteil von 24 bzw. 22° / 0 (Orcin- bzw. Anthron-methode) Kohlenhydrat, doppelt so viel wie in Teil II berichtet. Der Kohlenhydratgehalt hegt damit innerhalb der Grenzen, die auch bei anderen kupferhaltigen Glykoproteinen mit Oxydaseaktivität gefunden wurden (Literatur s. unten). E r ergänzt sich mit dem Proteingehalt (nach Lowry et al.) auf ca. 100%. Wie bei einem pflanzlichen Protein nicht anders zu erwarten, wurde keine Neuraminsäure gefunden.
Eine vorläufige qualitative Untersuchung verschiedener Laccase-hydrolysate mit Dünnschichtchromatographie ergab folgende Haupt-komponenten des Kohlenhydrates (in der Reihenfolge abnehmender Konzentration): Hexosamin (wahrscheinlich Glucosamin). Mannose, Glucose, eine schnelle Komponente (Pentose?) und Galactose. Diese Komponenten finden sich auch in der Laccase des Pilzes Polyporus (Fâhraeus u. Reinhammar, 1967). Der Gehalt des Kohlenhydrates an freiem Hexosamin wurde nach Blix (1948) zu 7%, an gebundenem Hexosamin zu 18% bestimmt.
Der hohe Hexosamingehalt der Laccase erklärt damit auch die Tatsache, daß der Proteinanteil nach Kjeldahl über dem nach Lowry bestimmten Wert liegt; er erreicht jedoch nicht 100% der Trockensubstanz, da der mittlere Stickstoff gehalt des Kohlenhydrates unter dem von Aminosäuren hegt.
Der Kohlenhydratgehalt des gereinigten Enzyms war bei verschiedenen Aufarbeitungen, auch nach Rechromatographie, stets gleich, unabhängig davon, ob das Enzym an Dextrangelen (Sephadex) oder Polyacrylamidgelen (Bio-Gel) chromatographiert wurde.
Zusammenfassend kann man sagen, daß es sich bei der Laccase I um ein Olykoprotein mit kovalent gebundenem Kohlenhydratanteil handelt, wie es bereits von anderen Laccasen berichtet wurde (Nakamura, 1958; Mosbach, 1963). Gleiches gilt auch für weitere kupferhaltige Oxydasen wie Ascorbinsäure-Oxydase (Stark u. Dawson, 1962). Coeraloplasrnin (Jamieson, 1965), Hämocyanin (Konings, 1969) und Stellacyanin (Peisach u. Blumberg, 1967).
Der Kupfergehalt entspricht mit etwa 0,3 % der Trockensubstanz dem anderer Laccasen, Hegt damit jedoch um mehr als das Doppelte über dem in Teil II berichteten Wert, was sich durch die höhere Reinheit
des Enzyms und den bereits besprochenen Trockensubstanz-Umrechnungsfaktor erklärt.
c) Spektrale Daten (Tab.4, Zeile 22-28) Die Maxima und Minima im Absorptionsspektrum der Laccase I
haben sich gegenüber Teil II nicht verändert. I n Analogie zu den Befunden v o n Malmström et a l . (1968) dürfte das Absorp
t i o n s m a x i m u m bei 605 n m auf die Anwesenheit des C u + + T y p 1 i n der Laccase I zurückzuführen sein. D e r z. B . beim Stehenlassen des E n z y m s , bei der Gefriertrocknung oder der R e a k t i o n m i t Substrat beobachtete Ver lus t der blauen F a r b e ist demnach m i t einer R e d u k t i o n dieses Cu + +-Ions verbunden.
Die in Teil II bei 340 nm und 640 nm beobachteten Schultern treten nicht mehr auf.
Die Tatsache, daß um 410 nm keine verstärkte Absorption mehr festgestellt wurde, deutet auf eine Abtrennung der hier absorbierenden verunreinigenden Pigmente hin.
Das Verhältnis der Extinktionswerte der beiden Gipfel, Z ) 2 8 0 / D 6 0 5 , blieb gegenüber Teil II unverändert und liegt mit einem Wert um 40 etwa doppelt so hoch wie die von Nakamura (1958), Mosbach (1963) und Iwasaki et al. (1967) für Laccasen angegebenen Werte. Das Absorptionsverhältnis 2)280/1)260 ist gestiegen und liegt im Mittel bei 1,66 mit Maximalwerten über 1,70 und deutet damit ebenfalls einen höheren Reinheitsgrad an. Der millimolare Extinktionskoeffizient des Kupfers
f Q u = 1,047 entspricht den in Teil II und bei Nakamura (1958),
Mosbach (1963) und Fâhraeus u. Reinhammar (1967) berichteten Werten. 605
Der millimolare Extinktionskoeffizient für die Laccase £ — = * m M Laccase
19,15 (berechnet auf der Basis des Molekulargewichtes, s. unten) liegt dagegen um den Faktor 2,5 über den Werten von Teil II.
d) Molekulare Daten (Tab. 4, Zeile 29-35) Da die genaue Bestimmung des partiellen spezifischen Volumens, be
sonders bei kleinen Probenmengen, methodische Schwierigkeiten bereitet, wurde bisher vielfach — und das trifft auch für die meisten Arbeiten mit Phenoloxydasen zu — mit angenommenen oder nur annähernd bestimmten Werten gearbeitet. Durch die Anwendung eines Präzisions-densitometers konnte das partielle spezifische Volumen der Laccase zu 0,701 ml/g bestimmt werden.
Dieser W e r t liegt niedriger als die meisten der angenommenen Werte , s t i m m t jedoch gut m i t dem v o n Fâhraeus u . R e i n h a m m a r (1967) aus der K o h l e n h y d r a t -u n d Aminosäurenanalyse errechneten W e r t (0,705 ml/g) überein. Das i n T e i l I I m i t 0,63 angegebene partiel le spezifische V o l u m e n wäre dagegen eher für reine K o h lenhydrate oder Glykoprote ine m i t überwiegendem K o h l e n h y d r a t a n t e i l (Gott schalk, 1966) typ isch .
Zusammen mit der aus Ultrazentrifugenmessungen ermittelten Sedimentationskonstanten s°2QtW und der Diffusionskonstanten D\^w
er" rechnet sich ein Molekulargewicht von 390.000.
E s liegt d a m i t i m gleichen Bere ich wie das — allerdings aus abweichenden E i n z e l werten v o n V20 u n d 4o, w errechnete — Molekulargewicht der Laccase aus T e i l I I . D ie Molekulargewichte der anderen bisher untersuchten Laccasen liegen dagegen entweder u m 65.000 (Mosbach, 1963; Fâhraeus u . R e i n h a m m a r , 1967; Iwasak i et a l . , 1967) oder u m 130.000 ( N a k a m u r a , 1958; O m u r a , 1961).
Das aus Sedimentation und Diffusion ermittelte Molekulargewicht wird durch den im Gleichgewichtssedimentations-Verfahren gefundenen Wert von 383.000 bestätigt.
Aus den angegebenen Daten errechnet sich das Verhältnis der Reibungskoeffizienten f/fQ zu 1,46, was auf eine noch globuläre Struktur des Laccasemoleküls hinweist. Unter der Annahme, daß es sich um ein gestrecktes, unhydratisiertes Molekül handelt, ergibt sich nach Schachmann (1959) ein Achsen Verhältnis von etwa 9.
A u c h das Verhältnis der Reibungskoeffizienten anderer kupfer- u n d kohlen-hydrathal t iger Oxydasen liegt i m Bere ich zwischen 1,25 u n d 1,68 (errechnet aus den entsprechenden D a t e n für Laccase I I u n d I I I aus T e i l V I ; Laccase : N a k a m u r a , 1958; Coeruloplasmin: Starcher u . H i l l , 1966; H i b i n o u . Samej ima, 1969; Hämo-c y a n i n : K o n i n g s , 1969).
Für die Bestimmung funktioneller Einheiten des Laccasemoleküls ist die Anzahl der Kupferatome pro Enzymmolekül von Bedeutung. Mit über 18 Hegt dieser Wert bei der hier untersuchten Laccase I sehr hoch, im Gegensatz zu nur 7 in Teil II (vgl. jedoch die Diskussion der Trockensubstanz- und Proteinbestimmung S. 280) und den von anderen Autoren bei Laccase gefundenen Werten, die zwischen 4 und 6 Hegen (Literatur bei Blumberg et al., 1964).
e) Elektrophoretische Daten (Tab. 4, Zeile 36 und 37)
Frischgereinigte Laccase I zeigt in der Disc-Elektrophorese bei p H 9,5 nach Anfärbung auf Protein oder Enzymaktivität jeweils eine anodisch wandernde Bande mit R f-Werten von 0,10—0,11. In der Agargel-Elektrophorese auf Objektträgern wurde nach Anfärben mit denselben Substanzen ebenfaUs nur ein anodisch wandernder Fleck gefunden. Die Elektrofokussierung frischer Laccase I im Ampholine-pH-Gradienten ergab einen isoelektrischen Punkt des Enzyms bei p H 4,9. Die isoelektrischen Punkte der von Jonsson et al. (1968) untersuchten Polyporus-LaccaseA lagen zwischen p H 3,1 und 3,3, für die Komponenten der Laccase B zwischen p H 4,6 und 6,8. Es fäUt auf, daß bei der Laccase I isoelektrischer Punkt und optimale StabiHtät der enzymatischen Akti vität beim gleichen pH-Wert Hegen.
19 Arch. Mikrobiol., Bd. 72
a b
Lacc.-I
0
Lacc.-I—
• EA-I E A - n
A b b . 3. Immunelektrophorese der Laccase I des Wi lds tammes (schematisch). Fr i sche Wi lds tamm-Laccase I gegen : a) Enzymantikörper gegen Laccase I , W i l d s t a m m ( = E A I ) ; b) Enzymantikörper gegen Laccase I I I , M u t a n t e z ( = E A I I I ) .
Anode oben, K a t h o d e unten
f ) Serologie
Zur Bestimmung serologischer Eigenschaften (nicht in Tab. 4 aufgeführt) wurden Antiseren aus Kaninchen gegen die hier beschriebene Laccase I des Wildstammes und die Laccasen II und III der Mutante z eingesetzt (ausführliche Darstellung der Methodik und der Eigenschaften der einzelnen Laccasen in Teil VI). Die qualitativen Beziehungen zwischen der Laccase I und den Antienzymen gegen Laccase I, II und III wurden mit Hilfe der Immunelektrophorese ermittelt (Abb. 3). Die anodisch wandernde Laccase I reagiert mit ihrem Antiserum durch eine starke und eine schwache Präzipitationsbande, was bei einem reinen, homogenen Enzym nicht zu erwarten wäre. Darauf wird später noch einzugehen sein. Mit Antiserum III wurde eine deutliche Einzelbande gebildet, während mit Antiserum II keine Präzipitationsreaktion zu beobachten war.
I m Gegensatz dazu konnte bei der Untersuchung der quant i ta t iven serologischen Beziehungen (Methodik T e i l I I I , E inze lda ten T e i l V I ) durch E r m i t t l u n g der K R M - W e r t e (Kreuzreagierendes Mater ia l ) eine geringe R e a k t i o n des E n z y m a n t i körpers I I m i t seinem A l l o e n z y m Laccase I gefunden werden.
Die Ergebnisse der Immunelektrophorese und der KRM-Wert-Bestimmungen lassen auf eine serologisch nahe Verwandtschaft der höhermolekularen Laccase I mit der niedermolekularen Laccase III und auf geringe Verwandtschaft sowohl zwischen Laccase I und der niedermolekularen Laccase II als auch zwischen Laccase II und III schließen.
g) Weitere Eigenschaften der gereinigten Laccase Katalatische Aktivität. Die teilweise gereinigte Laccase I (Tab. l ,
Schritt 6, nach der Molekularsiebsäule) zeigt im polarographischen Test 4
mit H 2 0 2 katalatische Aktivität. Durch anschließende Chromatographie an Hydroxylapatit lassen sich katalatische und Laccase-Aktivität nicht trennen und verlassen gemeinsam die Säule. Das gleiche wird auch bei der Reinigung der Tyrosinase der Podospora gefunden, wo ebenfalls die beiden genannten Aktivitäten gemeinsam die Hydroxylapatitsäule verlassen und so von der Tyrosinase abgetrennt werden (Herzfeld, persönl. Mitteil.). In der Disc-Elektrophorese Hegt die katalatische Akti vität in der auch mit Dopa (= Laccaseaktivität) reagierenden Zone (Katalasenachweis mit 0,5 % gekochter Stärke im Gel und Zusatz von H 2 0 2 und K J ; nach Brewbaker et al., 1968). Durch Hitzebehandlung (+ 60°C) wird nur die Laccase-, nicht aber die katalatische Aktivität zerstört.
Zwei ErklärungsmögHchkeiten für die Anwesenheit der katalatischen Aktivität in der Laccase I kommen in Betracht : 1. Verunreinigung mit dem Hämoprotein Katalase, in freier Form oder als Komplex vorHegend ; 2. Gehalt der Laccase an peroxydatisch und katalatisch wirksamem C u + + . Wenn auch bei der hohen spezifischen Aktivität der Katalase bereits Spuren des Enzyms zum Nachweis seiner katalatischen Aktivität ausreichen, so ist die erste MögHchkeit doch unwahrscheiiüich, da in diesem FaU die Katalase durch aUe Reinigungsschritte mitgeschleppt worden wäre und sich auch nach den angewandten Reinheitskriterien wie die Laccase verhalten müßte. Außerdem besitzt die reine Laccase I nicht das für Katalase typische Absorptionsmaximum bei 405 nm. Die genannten Gründe, zusammen mit den im folgenden aufgeführten Befunden anderer Autoren, sprechen daher für die zweite MögHchkeit.
Sigel (1969) hat m i t verschiedenen Model lsubstanzen, die Cu++ m i t freien K o ordinationsstellen enthalten, sowohl katalatische als auch peroxydatische Aktivität nachgewiesen. I m speziellen F a l l des Kupfer -G lykopro te ins Coeruloplasmin fanden M u k a s a et a l . (1969), daß die peroxydatische Aktivität dem Gehal t des Proteins a n K u p f e r i n der Cu++-Form paral le l lief. Felsenfeld u . P r i n t z (1959) u n d G h i r e t t i (1956) stel lten a n Hämocyanin, einem weiteren K u p f e r - G l y k o p r o t e i n , ebenfalls katalat ische Aktivität fest, wobei G h i r e t t i die Anwesenheit des Hämoproteins K a t a l a s e ausschließen u n d die katalatische Aktivität a l le in au f das i m Hämocyanin vorliegende Cu++ zurückführen konnte . A n a l o g z u unseren Befunden (Hi tze inakt iv ierung) waren auch dort beide Aktivitäten zwar i m gleichen Proteinmolekül lokal is iert , doch reagierten sie unabhängig voneinander au f verschiedene Versuchsbedingungen.
Zwar kann auf Grund der bisher vorHegenden Versuche die Frage der Herkunft der katalatischen Aktivität der gereinigten Laccase noch
4 D e n H e r r e n D r . K . Wisser u n d D r . F . Herz fe ld sei für ihre Unterstützung bei den polarographischen Messungen gedankt .
A b b . 4. p H - O p t i m u m der R e a k t i o n frisch gereinigter Laccase I m i t D L - D o p a . D i e pH-Messungen wurden unmit te lbar nach jeder Aktivitätsmessung vorgenommen. Z u r Verminderung der A u t o x y d a t i o n des D o p a i m alkal ischen Bere ich wurde dem Puffer 0,1 M E D T A zugegeben u n d jede p H - S t u f e des Puffers erst unmit te lbar vor Reakt ionsbeg inn angesetzt. • • M c l l v a i n e - P u f f e r ; Laccase i n 0,4 M Phos phatpuffer p H 6, undialys iert , S p A = 145. o o Br i t ton -Rob inson -Puf fer (II) ;
Laccase, dialysiert gegen 0,1 M Phosphatpuffer p H 6, S p A = 112
nicht entschieden werden, doch erscheint in Analogie zu den Befunden von Ghiretti (1956), Sigel (1969) und Felsenfeld u. Printz (1959) ein Reaktionsmechanismus wahrscheinlicher zu sein, der allein auf das in der Laccase vorhandene C u + + zurückzuführen ist.
pH-Optimum. Bei der Betrachtung der Kurve der pH-Abhängigkeit der Reaktion mit Dopa (Abb. 4) fällt auf, daß die Aktivität der gereinigten Laccase I in Mcllvain-Puffer (pH 2,7—7,9) und Britton-Robinson-II-Puffer (pH 3,6—8,6) jeweils 2 Optima bei p H 5,5 und p H 7,5 aufweist. Sie liegen damit innerhalb der allgemein für Phenoloxydasen beobachteten Werte (pH 3,5—8,0). Oberhalb p H 8 fällt die Aktivität steil ab, was auch Cheung u. Marshall (1969) für die 3 Isozyme der Laccase von Poly-porus gefunden hatten.
Zweigipfelige p H - O p t i m a wurden bei Phenoloxydasen nur vereinzelt gefunden (Tyrosinase: A lbergh ina , 1964; P a t i l u . Zucker , 1965; K a t z u . M a y e r , 1969; Laccase : Rösch, 1961 ; W a l c h , 1968). D ie partikelgebundene Chloroplasten-Tyrosinase ( K a t z u . M a y e r , 1969) verlor allerdings ihr zweites p H - O p t i m u m , wenn sie durch T r y p s i n -behandlung i n löslichen Zus tand überführt wurde. D i e eine der v o n P a t i l u . Zucker (1965) beschriebenen Karto f fe l -Tyros inasen hat ein D o p p e l o p t i m u m bei p H 5 u n d p H 7, die andere höhermolekulare, deren Homogenität durch Stärkegelelektrophorese, Hydroxy lapat i t -Chromatograph ie u n d Ultrazentr i fugat ion nachgewiesen wurde, hatte e in O p t i m u m bei p H 5 u n d eine ausgeprägte Schulter bei p H 7. D i e sonstigen kata lyt i schen Eigenschaften der beiden v o n P a t i l u . Zucker beschriebenen E n z y m e waren fast gleich. Dieser B e f u n d wurde i n R i c h t u n g einer Monomer -Po lymer -Beziehung d iskut iert . D a es sich i n den zit ierten Fällen nur bei den Tyrosinasen u m gereinigtes E n z y m handelte, k a n n das bei den Laccasen beschriebene p H - D o p p e l o p t i m u m auch d u r c h Verunreinigungen verursacht sein.
Im Fall der von uns beschriebenen Laccase I ist das doppelte p H -Optimum entweder als eine ungewöhnliche Eigenschaft eines reinen Enzyms anzusehen oder es handelt sich um einen Enzymkomplex, der
sich durch die angewandten Reinheitskriterien nicht erfassen und auftrennen läßt. (Dieser Punkt wird im folgenden noch zu diskutieren sein.)
h) Einfluß von Außenbedingungen auf die Laccase-Produktion Der Podospora-Wildstamm wird normalerweise bei p H 6—7 ange
zogen und zeigt auf Maismehl-Agar kontinuierliches Wachstum. Wird er jedoch bei p H 5 und darunter kultiviert, so wird die Wuchsform in zunehmendem Maße zoniert und die Wachstumsrate sinkt ab. Der Wildstamm gleicht dann in seinem Habitus den Mutanten z und un (Esser, 1969). Diese zunächst auf morphologischem Niveau gefundene Phänokopie konnte auch im physiologischen Bereich bestätigt werden: Bei Submerskultur der Mutante z in Maismehl-Medium werden bei p H 6—7 hauptsächlich die niedermolekularen Laccasen II und III und nur Spuren der höhermolekularen Laccase I produziert. Der Wildstamm dagegen bildet unter gleichen Bedingungen fast ausschließlich Laccase I und kaum Laccase II und III (Teil VI). Wird der Wildstamm jedoch im Fermenter (300 1) im Bereich zwischen p H 6 bis 4,5 und bei geänderter Belüftung, sonst aber gleichen Bedingungen angezogen, so ergibt sich folgendes Bild : Die Mycelproduktion sinkt auf etwa die Hälfte ab und auch die im Mycel enthaltene Phenoloxydasenaktivität (E/kg Feuchtgewicht) ist erheblich vermindert.
Bei einer Aufarbeitung dieses Materials nach der für die Laccase I beschriebenen Methode zeigen sich weitere Unterschiede : Bei gestiegenem Tyrosinaseanteil (der im Verlauf der Reinigung abgetrennt wird) taucht eine neue Komponente mit Laccaseaktivität in größerer Menge auf. Während in den für die höhermolekulare Laccase I typischen Fraktionen der Molekularsiebsäule nur wenig Aktivität enthalten ist, kommt die Hauptmenge der Aktivität erst in späteren, für ein niedrigeres Molekulargewicht typischen Fraktionen von der Säule. Bei einer probeweisen Weiterverarbeitung zeigt dieses Enzym folgende Merkmale :
1. Elution von der Hydroxylapatitsäule bereits bei einer Pufferkonzentration weit unter 0,2 M .
2. SpA zwischen 40 und 60. 3. Erniedrigte Michaelis-Menten-Konstante für Dopa (Km D o pa =
1,5- l O " 3 M). 4. Erhöhte Halbwertszeit der Hitzeinaktivierung bei 60° C (ca.
100 min). 5. Auftreten einer kathodisch wandernden Komponente mit Laccase
aktivität neben einer anodisch wandernden (wie Laccase I) in der Agar gel-Elektrophorese.
6. In der Immunelektrophorese gegen Antiserum I eine kathodisch wandernde Doppelbande neben der für Laccase I typischen, anodisch wandernden Doppelbande.
7. In der Immunelektrophorese gegen Antiserum II eine Präzipitations-bande im kathodischen Bereich, in dem mit Laccase I keine Reaktion beobachtet wird.
Alle diese Befunde deuten auf die Anwesenheit einer Laccase hin, die in ihren Eigenschaften von der Laccase I abweicht und in manchen Punkten der Laccase II der Mutante z gleicht (Teil VI). Sie wird daher im folgenden als Laccase ,,11" bezeichnet. Die unter Punkt 2 und 3 berichteten Werte liegen zwischen denen der Laccase I und der Laccase II und können, wie auch die unter Punkt 5 und 6 berichteten Eigenschaften, auf gleichzeitige Anwesenheit von Laccase I schließen lassen, die dann allerdings an der Molekularsiebsäule nicht völlig abgetrennt worden wäre. Die Laccase ,,11" hat weiterhin, wie auch die Laccase I, ein doppelgipfeliges pH-Optimum, das jedoch geringfügig zur alkalischen Seite verschoben ist. Es ist bemerkenswert, daß die beiden Gipfel der Laccase „ I I " bei p H 7,4 bzw. p H 6,0 den pH-Optima entsprechen, die für reine Laccase II bzw. Laccase III gefunden wurden.
Das durch geänderte Anzuchtbedingungen hervorgerufene Auftreten der Laccase „ I I " bei gleichzeitiger Abnahme der Laccase I wirft die Frage nach dem Mechanismus dieser Veränderung auf.
E i n m a l k a n n diese Ersche inung durch die I n d u k t i o n einer weiteren Laccase bedingt sein. Verschiedentl ich wurde bereits festgestellt, daß die Laccaseprodukt ion v o n Anzuchtbedingungen abhängig ist . Mosbach (1963) hatte i m K u l t u r f i l t r a t des Pi lzes Polyporus zwei Laccase-Isozyme nachgewiesen. Cheung u . M a r s h a l l (1969) verwendeten ein neues Nährmedium u n d stellten daraufh in das Auf t re ten eines weiteren Isozyms fest. Gle ichzei t ig verfolgten sie auch die Ausscheidung der drei Isozyme ins Nährmedium u n d beobachteten, daß die M a x i m a l p r o d u k t i o n z u verschiedenen Zeiten erreicht wurde. D a s Auf t re ten des dr i t ten Isozyms k a n n daher auch dadurch erklärt werden, daß die Änderung der Anzuchtbedingungen z u einer zeit l ichen Verschiebung der Synthese der Isozyme führte, so daß jetzt — i m Gegensatz z u früheren Untersuchungen — z u m E r n t e z e i t p u n k t alle drei Laccasen i n nachweisbarer Menge vorlagen. Diese Erklärung wäre auch für das hier beschriebene Auf t re ten der Laccase „ I I " denkbar .
D a die neue aufgetretene Komponente offenbar ein geringeres Molekulargewicht als die Laccase I besitzt, könnte sie aber auch als Baustein bzw. als Spaltprodukt einer polymeren Laccase I anzusehen sein. Diese und die oben besprochenen Möglichkeiten brauchen sich dabei nicht auszuschließen.
i) Polymere Struktur der Laccase Im Verlaufe der Reinigung sowie bei einigen gezielten Versuchen
wurden folgende Hinweise auf eine polymère Struktur der gereinigten Laccase gewonnen :
Laccase mit höherem Molekulargewicht als 390.000 1. Bei der Aufarbeitung des Mycels kann mit der Molekularsiebsäule im
Vorlauf ein höhermolekularer Aktivitätsgipfel von der Hauptmenge der
Laccase I abgetrennt und weiter gereinigt werden. Aus Ultrazentrifugen-messungen ergibt sich ein wesentlich höherer Sedimentationskoeffizient (ca. 34 Svedberg-Einheiten). Wurde dieser Wert in die von Scheraga u. Mandelkern (1953) angegebene Formel zur Ermittlung von Molekulargewichtsverhältnissen aus den Sedimentationskoeffizienten eingesetzt ((in abgewandelter Form: [(s20t^W^o,W)DV
%
= MA\MD)), so ergibt sich ein Verhältnis gegenüber Laccase I von annähernd 5:1. In der Disc-und Immunelektrophorese (anodische Wanderung) hat das Material einen niedrigeren Rf-Wert als Laccase I und reagiert mit Antiserum I. Weiterhin zeichnet es sich durch eine höhere SpA und höhere Hitzestabilität aus. Diese Befunde lassen vermuten, daß es sich um ein Aggregationsprodukt der Laccase I handelt.
2. Gereinigte Laccase I scheint auch in vitro zu einem höhermolekularen Produkt aggregieren zu können : a) Die Sedimentationskonstante der Laccase I steigt nämlich mit zunehmender Proteinkonzentration an, wenn die Sedimentationsläufe in 0,4 M Phosphatpuffer statt in dem normalerweise verwendeten 0,1 M Puffer durchgeführt werden, b) Wird Laccase I in höherer Konzentration inkubiert, so tritt bei anschließender Disc-Elektrophorese eine zusätzliche aktive Bande mit niedrigerem Rf-Wert auf. Parallel dazu erscheint in Sedimentationsläufen (0,1 M Phosphatpuffer, p H 6) ein zusätzlicher, schneller sedimentierender Gipfel (ca. 20 Svedberg-Einheiten), der nach der oben angeführten Berechnung auf ein doppelt so hohes Molekulargewicht wie das des Ausgangsmaterials, der Laccase I, schließen läßt.
Laccase mit niedrigerem Molekulargewicht als 390.000 Außer den beiden Aggregationsformen mit höherem Molekulargewicht
scheinen aber auch kleinere Einheiten einer aktiven Laccase vorzuliegen. 1. Unter Normalbedingungen werden bei der Reinigung der Laccase I
Spuren niedermolekularer Laccasen beobachtet, die den Mutanten-Lac-casen II und III gleichen (Teü VI).
2. Bei geänderten Anzuchtbedingungen (pH < 5) lassen sich, wie bereits unter Punkt h) berichtet, bei stark vermindertem Gehalt an Laccase I erhebliche Mengen an niedermolekularer Laccase gewinnen, die der Laccase II und teilweise auch der Laccase III der Mutanten gleichen.
3. Wird normal angezogenes My cd längere Zeit bei —18°C gelagert, so wird bei anschließender Reinigung neben Laccase I in größeren Mengen eine Laccase gefunden, die folgende Eigenschaften aufweist: Eine um den Faktor 3—4 niedrigere SpA, eine geringere Hitzestabüität, Auftreten schneller wandernder Banden in der Disc-Elektrophorese und eine langsamer sedimentierende Komponente in Sedimentationsläufen. Aus der Sedimentationskonstanten (ca. 5,5 Svedberg-Einheiten) ergibt sich nach der bereits erwähnten Formel ein um den Faktor 4—5 niedrigeres
Molekulargewicht. Offenbar können bei der Lagerung des Mycels Vorgänge ablaufen, die zu dem Auftreten niedermolekularer Laccaseein-heiten führen.
4. Folgende Befunde lassen eine Dissoziation der gereinigten Laccase I annehmen : Wird frischgereinigte, homogene Laccase I längere Zeit bei + 4°C inkubiert, so fällt die Aktivität und damit auch die SpA ab. Bei Raumtemperatur erfolgt der Aktivitätsbefall entsprechend schneller. Parallel dazu treten in der Disc-Elektrophorese schneDer wandernde, enzymatisch aktive Banden auf und in Sedimentationsläufen zeigt sich eine zusätzliche, langsamer sedimentierende Komponente (ca. 5,5 Sved-berg-Einheiten). Nach der Scheraga-Formel beträgt ihr Molekulargewicht etwa 1 / 4 der Laccase I. Mehrmaliges Einfrieren und Auftauen der Laccase I hat den gleichen Effekt. Es kommt unter diesen Bedingungen anscheinend zu einer Dissoziation der Laccase I in aktive Untereinheiten.
5. Unter den bisher geschilderten Bedingungen erfolgt eine Dissoziation der Laccase I in 4 oder 5 Untereinheiten. Wird die Laccase dagegen mit Natriumdodecylsulfat (25 • 10 - 3 M) inkubiert, so liegt die Sedimentationskonstante der Zerfallsprodukte bei 3 Svedberg-Einheiten. Das daraus errechnete Molekulargewicht würde nur 1 / 8 bis 1 / 1 0 der Laccase I betragen und mit etwa 40.000 nur halb so groß sein wie das der mit anderen Verfahren gewonnenen Untereinheiten. Es liegt damit im Bereich der bei vielen Enzymen gefundenen kleinsten aktiven Untereinheiten.
j) Diskussionsbemerkungen zur Struktur der Laccase I Auf Grund des Assoziations- und Dissoziationsverhaltens der Lac
case I lassen sich jetzt auch folgende experimentelle Befunde im Zusammenhang mit den Ergebnissen anderer Autoren erklären :
1. Die bei der Immunelektrophorese der Laccase I gegen Antiserum I beobachteten doppelten Präzipitationslinien können wie bei der Lactat-dehydrogenase (Avrameas u. Rajewsky, 1964) im Sinne einer Monomer-Polymer beziehung aufgefaßt werden.
2. Wurden die Gleichgewichtssedimentationsläufe mit Laccase I bei 20° C über längere Zeit durchgeführt, so nimmt das als Gewichtsmittel Mw errechnete Molekulargewicht kontinuierlich mit der Zentrifugations-dauer ab. Diese Abnahme ist um so stärker, je geringer die eingesetzte Proteinkonzentration ist. Dies deutet ebenfalls auf Dissoziation hin.
3. Das partielle spezifische Volumen nimmt bei + 25° C langsam, kontinuierlich ab. Das gleiche konnte Konings (1969) bei Hämocyanin unter Bedingungen beobachten, die zur Dissoziation des Moleküls führten.
4. Die Tatsache, daß die hochgereinigte Laccase I bei der Elution von den verschiedenen Säulen kein Plateau der SpA mehr aufweist (s. S. 272),
0 01 » — « — 1 — 1 — 1 — 1 — 1 1 1 3 1 « « ' 0 20 AO 60 80 100 120 U0 160 180 200
min Inkubationszeit ( 6 0 ° C )
A b b . 5. H i t z e i n a k t i v i e r u n g der Laccase I . I n k u b a t i o n der Laccase bei -f- 60° C. N a c h den angegebenen Zeiten Probenentnahme für den normalen Aktivitätstest Biit D o p a , o o Gerade A : frische Laccase, 0,5 M Phosphatpuffer p H 6, u n -dialysiert , S p A = 117. • • K u r v e B , Schenkel a u n d b : gealterte Laccase, 0,4 M Phosphatpuffer p H 6, undialysiert , 8 Tage I n k u b a t i o n bei - f 4°C, S p A = 82
läßt sich ebenfalls als ständige Dissoziation in Untereinheiten geringerer SpA erklären. In diesem Sinne wären auch die Ergebnisse der Stabilitätsversuche zu deuten.
5. Auf Grund einer polymeren Struktur der Laccase I und der leichten Dissoziierbarkeit des gealterten Enzyms wird auch der abweichende Verlauf der Hitzeinaktivierung gealterter Laccase I verständlich. Die graphische Darstellung (Abb. 5) zeigt eine zweischenkelige Kurve B öHt einem zunächst schnellen Aktivitätsbefall (Schenkel a, Halbwertszeit 5 min), gefolgt von einem wesentlich langsameren Abfall der Aktivität (Schenkel b, Halbwertszeit 170 min).
Dies könnte einmal durch die gleichzeitige Anwesenheit zweier verschiedener Enzyme mit verschiedener Hitzestabilität bedingt sein, wie es von Horowitz u. Fling (1956) für die Tyrosinase von Neurospora gefunden wurde.
I n dem dort untersuchten Heterokaryon , dessen Kernkomponenten die A l l e l e Ts bzw. T l für verschiedene Hitzestabilität die Tyrosinase tragen, w i r k e n beide Al le le unabhängig voneinander u n d führen nicht zur P r o d u k t i o n einer E n z y m -hybr ide m i t intermediären Eigenschaften, sondern zur gleichzeitigen B i l d u n g beider E n z y m e .
Unsere Versuchsergebnisse dagegen lassen die Deutung zu, daß die gealterte, polymère, hitzelabile Laccase I (Abb. 5, Hitzeinaktivierung und Spaltung nach Kurve B , Schenkel a) in Untereinheiten größerer Hitzestabilität zerfällt. Diese werden dann entsprechend einer Reaktion I. Ordnung inaktiviert (Kurve B, Schenkel b). Dieser Befund und die Tatsache, daß die hitzebedingte Dissoziation und Inaktivierung der eingesetzten Proteinkonzentration umgekehrt proportional sind, decken sich mit den Ergebnissen von Jolley et al. (1969) bei der Agaricus-Tyrosinase.
Alle diese Beobachtungen sind durch eine Dissoziation der Laccase I in Untereinheiten geringerer SpA in Abhängigkeit von Proteinkonzentration, Zeit und Temperatur erklärbar.
6. Ob bei der Alterung und Dissoziation der Laccase I sich auch die Konformation des Enzymmoleküls ändert, kann auf Grund der vorliegenden Befunde nicht eindeutig festgestellt werden. In diese Richtung deutet jedoch 'die Veränderung der Absorption im ultravioletten Spektralbereich, die Abnahme des partiellen spezifischen Volumens und die veränderte Hemmkinetik dissoziierender Laccase (kompetitiver Hemmungstyp mit Dopa und Natriumazid; K\ ca. 1 • 10~5 M ; praktisch unveränderte Michaelis-Konstante für Dopa).
7. Für die Berechnung der Molekulargewichtsverhältnisse wurde die von Scheraga u. Mandelkern (1953) angegebene Gleichung benutzt. Sie gilt strenggenommen nur bei globulären, unhydratisierten Molekülen geringer Asymmetrie. Andernfalls sind die errechneten Molekulargewichte zu hoch. Die Laccase I entspricht auf Grund ihrer hydrodynamischen Daten nicht völlig diesen Voraussetzungen, so daß das nach obiger Gleichung berechnete Molekulargewicht der Untereinheiten zu hoch sein könnte. Nach entsprechender Korrektur der Molekulargewichte wäre demnach eine Dissoziation nicht in 4, sondern in 5 U n tereinheiten im Bereich des Möglichen.
Bisher wurden allerdings n u r wenige Enzymmoleküle gefunden, die aus einer ungeraden A n z a h l v o n Untere inhei ten aufgebaut s ind (L i teratur s. A n o n y m u s , 1968). Das V o r k o m m e n v o n 5 Untere inhei ten wurde für Cytochrom a (Takemori et a l . , 1961), Arginindecarboxylase (Boeker u . Sne l l , 1968) u n d Hämocyanin (L i teratur bei K o n i n g s , 1969) berichtet. I n al len drei Fällen können diese Untere inhei ten
nochmals halbiert werden (bei Cytochrom a z. B . durch Natr iumdodecylsul fat ) , was m i t unserem Be fund an der Laccase übereinstimmen würde.
E s war bereits festgestellt worden, daß der ermittelte W e r t v o n mehr als 18 K u p feratomen pro Enzymmolekül (390.000 Molekulargewicht) außerordentlich hoch liegt. B e i einem Zerfa l l i n 5 Untereinheiten würden jedoch n u r etwa 4 Kupfera tome auf eine Untereinheit kommen, e in W e r t , der auch v o n N a k a m u r a (1958) u n d Mosbach (1963) für Laccase gefunden wurde. D ie neueren A r b e i t e n der letztgenannten Gruppe über A r t u n d F u n k t i o n der 4 Kupferatome der Polyporus-L&ce&Be (Fee et a l . , 1969) lassen bereits eine Interpretat ion v o n F u n k t i o n u n d Zusammenwirken i m Enzymmolekül z u .
D a s Ergebnis vorläufiger elektronenmikroskopischer Untersuchungen deutet allerdings auf eine tetramere S t r u k t u r der Laccase I h i n , die i n Dimere u n d Mono mere zerfallen k a n n (Molitoris , unveröffentlicht).
In Analogie zu den Befunden von Cheung u. Marshall (1969) läßt sich, besonders auf Grund der serologischen Daten, auch bei den Laccasen der Podospora eine Monomer-Polymer-Beziehung zwischen nicht identischen Untereinheiten diskutieren. Auch das doppelte p H -Optimum kann in diese Richtung deuten. Zur Klärung dieser Frage bedarf es jedoch weiterer Untersuchungen.
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Laccase des Wildstammes von Podospora anserina in verschiedenen Aggregationszuständen vorkommt, die zumindest teilweise ineinander umwandelbar sind. Inwieweit es sich dabei um die wahren Verhältnisse in der Zelle und nicht um Artefakte bei der Reinigung handelt, muß vorerst dahingestellt bleiben. E i n weiterer Punkt ist, ob die bei der Dissoziation der Laccase I entstandenen Untereinheiten Bausteine der Laccase sind, die auch als selbständige Einheiten auftreten und enzymatisch aktiv sind. Daraus ergibt sich dann die Frage, ob diese Untereinheiten mit den vor allem in den Mutanten gefundenen niedermolekularen Laccasen verwandt oder identisch sind.
E i n früherer Mitarbe i ter unserer Gruppe , H e r r D r . W . K r a u s e , war besonders a n der E n t w i c k l u n g des neuen Reinigungsverfahrens beteiligt. I h m u n d auch H e r r n W . M i n u t h , der durch krit ische Diskussionen z u m For tgang der A r b e i t beigetragen hat , gebührt unser D a n k . D e n technischen Mitarbe i tern des Institutes, insbesondere F r l . H . Goldschmidt , danken wir für tatkräftige u n d sorgfältige Unterstützung bei der Durchführung der Exper imente .
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