DESLIGNIFICACIDESLIGNIFICACIÓÓN DE PASTA KRAFT DE EUCALIPTO N DE PASTA KRAFT DE EUCALIPTO CON EL POLIOXOMETALATO CON EL POLIOXOMETALATO SiWSiW1111 MnMnIIIIII EN UN EN UN
PROCESO MULTIETAPAS CON PEROXIDASA VERSPROCESO MULTIETAPAS CON PEROXIDASA VERSÁÁTIL TIL DE DE PleurotusPleurotus eryngiieryngii
Memoria del trabajo de fin de Máster en Estudios Avanzados en Química (Especialidad de Química Industrial y Medioambiental) por la Universidad de Sevilla
Tutor Prof. Alfonso Guiraum Pérez
Gisela Marques Silva
DESLIGNIFICACIDESLIGNIFICACIÓÓN DE PASTA KRAFT DE EUCALIPTO N DE PASTA KRAFT DE EUCALIPTO CON EL POLIOXOMETALATO CON EL POLIOXOMETALATO SiWSiW1111 MnMnIIIIII EN UN EN UN
PROCESO MULTIETAPAS CON PEROXIDASA VERSPROCESO MULTIETAPAS CON PEROXIDASA VERSÁÁTIL TIL DE DE PleurotusPleurotus eryngiieryngii
Gisela Marques Silva
Tutor del Máster: Alfonso Guiraum Pérez(Universidad de Sevilla)
Directores de tesis: Dres. Ana Gutiérrez y José Carlos del Río(IRNAS, CSIC, Sevilla)
Con la colaboración de Dmitry Evtuguin(Universidad de Aveiro, Portugal)
Abreviaturas
ABREVIATURAS
A Absorbancia
A245 Absorbancia a 245 nm
A480 Absorbancia a 480 nm
CED Cobre (II) –etilenodiamina
-E Etapa de extracción alcalina en los ensayos de blanqueo
ECF Elemental-Clorine Free
FAO Food and Agriculture Organization
h horas
HexA Ácidos hexenurónicos
IK Índice kappa
Ligninaox Productos de degradación oxidativa de la lignina
LiP Lignina peroxidasa
min Minutos
MnP Manganeso peroxidasa
POM Polioxometalato
POM 1- Primera etapa POM en los ensayos de deslignificación
-POM 2- Segunda etapa POM en los ensayos de deslignificación
POMox Polioxometalato oxidado
POMred Polioxometalato reducido
rpm Revoluciones por minuto
TAPPI Technical Association of the Pulp and Paper Industry
TCF Totally-Clorine Free
I
Abreviaturas
II
UV/VIS Espectroscopía de ultravioleta/visible
VP Peroxidasa versátil
-VP- Etapa en los ensayos de deslignificación donde se da la reoxidación del POM
ε Coeficiente de extinción molar
Índice
ÍNDICE
I
1
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1
2
2
2
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3
4
4
4
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8
8
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ABREVIATURAS.……..………………………………………………………………………
I. INTRODUCCIÓN……………....…………………………………………………………...
1. Perfil general sobre la industria de la pasta de papel...........…………………………
2. Fuentes de fibra para la fabricación de pasta de papel………………………………
2.1. Fibras procedentes de maderas……………………………………………………......
2.1.1. Maderas de coníferas……………………………………………………………..
2.1.2. Maderas de frondosas…………………………………………………………….
2.2. Fibras procedentes de materiales no madereros………………………………………
3. Composición química del material lignocelulósico………………………………
3.1. Sustancias macromoleculares…………………………………………………………
3.1.1. Celulosa………………………………………………………………………………..
3.1.2. Hemicelulosas………………………………………………………………………….
3.1.3. Lignina………………………………………………………………………………….
3.2. Sustancias de bajo peso molecular…………………………………………………….
3.2.1. Compuestos extraíbles………………………………………………………………….
3.2.2. Cenizas………………………………………………………………………………….
4. Breve descripción del proceso de obtención de pasta de papel……………………
4.1. Pastas mecánicas……………………………………………………………………....
4.2. Pastas químicas………………………………………………………………………..
4.2.1. Proceso a la soda………………………………………………………….....…............
4.2.2. Proceso kraft o al sulfato……………………………………………………….............
4.3. Pastas químico-mecánicas…………………………………………………………….
5. Proceso de blanqueo de la pasta…………………………………………………..
III
Índice
IV
6. Polioxometalatos como catalizadores de blanqueo……………………………....
6.1. Deslignificación oxidativa con oxígeno catalisada por polioxometalatos…………….
II. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS………………...……………………………………..
III. MATERIAL Y MÉTODOS…...…………………………………………………………..
1. Muestras…………………………………...……………………………………….
2. Optimización de la cinética de oxidación de SiW11MnII con peroxidasa versátil
(VP) monitorizada por espectroscopia UV/VIS…………………………………………
3. Ensayos de deslignificación de la pasta kraft de eucalipto con SiW11MnIII…….....
4. Determinación de la humedad de las pastas……………………………………….
5. Determinación de índice kappa……………………………………………………
6. Determinación de la viscosidad intrínseca………………………………………..
7. Determinación de la cantidad en ácidos hexenurónicos…………………………..
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………….
1. Optimización de la cinética de oxidación de SiW11MnII con peroxidasa versátil
(VP) monitorizada por espectroscopia UV/VIS………………..………………………
2. Ensayos de deslignificación de la pasta kraft de eucalipto con SiW11MnIII……...
V. CONCLUSIONES…………………………………………………………………
VI. REFERENCIAS………………………………………………………………….
VII. ANEXOS……………………………………..……………………………………
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15
15
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I. Introducción
I. INTRODUCCIÓN
1. Perfil general sobre la industria de la pasta de papel
La pasta de papel es el producto que resulta de la separación de las fibras de la madera u
otros materiales fibrosos y constituye un producto intermedio dentro del proceso global de
transformación de las materias primas en papel. Sus propiedades, que incidirán ampliamente en
las de los productos finales, papel y cartón, dependen de la fuente de fibras y del proceso de
pasteado utilizado, cuyo objetivo principal consiste en la liberación de las fibras por destrucción o
debilitación de los enlaces que las mantienen unidas en una estructura bien cohesionada [1].
Se cree que la fabricación de papel tiene su origen en China hacia el año 100 d. C, donde
se utilizaban trapos, cáñamo, paja y hierba como materias primas, golpeándose contra morteros
de piedra para separar la fibra original y utilizando extractos de agar y algas marinas para dar la
impermeabilidad necesaria y unir las fibras [2,3]. Las primeras máquinas continuas de papel se
patentaron en los años de cambio del siglo XIX al XX. Entre 1844 y 1884 se desarrollaron los
primeros métodos para la obtención de pasta a partir de madera, una fuente de fibra más
abundante que los trapos o las hierbas; estos métodos implicaban la abrasión mecánica y la
aplicación de procedimientos químicos basados en sosa cáustica, sulfitos y sulfatos. Con estos
cambios se inició la era moderna de la fabricación de pasta y de papel [2].
2. Fuentes de fibra para la fabricación de pasta de papel
Para la fabricación de pasta de papel se utilizan materiales lignocelulósicos de origen
forestal y agrícola. La madera es actualmente el material lignocelulósico más utilizado en la
fabricación de la pasta de papel en los países desarrollados [4].
Además de la madera, se pueden utilizar otras plantas como materia prima, entre ellas la
paja de cereales diversos como el trigo, el centeno, etc.; el arroz; cañas como el bagazo; tallos
leñosos del bambú, lino y cáñamo; y fibras de semillas, hojas y cortezas, como las del algodón, el
abacá y el henequén o sisal. El propio papel viejo puede ser reciclado, constituyendo por lo tanto
una fuente de materia prima para la obtención de pasta de papel [5].
1
I. Introducción
2.1. Fibras procedentes de maderas
La madera es un material natural muy complejo al que no se le puede atribuir
generalmente una composición química precisa y definitiva, dependiendo del árbol, de su
localización geográfica, de las características del suelo, entre otros [6].
Las fibras de celulosa, con relación a su configuración, pueden variar según su largura,
diámetro global y espesura de sus paredes. Relativamente a la calidad de la pasta que se desea
obtener, la dimensión de la fibra es una característica muy importante, fácilmente relacionada con
la resistencia del papel. Aparece así una diferencia entre pastas de fibra larga y pastas de fibra
corta. La fibra larga está asociada a las maderas de coníferas y la fibra corta a las maderas de
frondosas [5].
2.1.1. Maderas de coníferas
Las principales maderas de coníferas usadas para la fabricación de pasta de papel son el
pino y la picea. La estructura de estas maderas es sencilla, son ligeras y blandas por lo que son
fáciles de trabajar [7]. Están constituidas principalmente por traqueidas, que representan más del
90% de la madera siendo elementos morfológicos largos y que tienen como función el soporte
mecánico, conducción de agua y nutrientes [8, 9]. Otro tipo de célula en las coníferas es el
parénquima, el cual es no fibroso, corto, pudiendo estar agrupado radial o longitudinalmente y
tienen función de almacenamiento de nutrientes [7, 8, 10].
2.1.2. Maderas de frondosas
Las principales maderas de frondosas utilizadas para la fabricación de pasta de papel son
eucalipto y chopo o abedul. Estas maderas están constituidas por células de paredes gruesas, con
pequeños espacios huecos, por lo cual son más pesadas que las maderas de coníferas, y tienen un
tejido leñoso más compacto ofreciendo mayor resistencia y siendo por lo tanto más difíciles de
trabajar [7].
Las fibras de las maderas de frondosas son principalmente del tipo libriforme, con
funciones de soporte, y también compuestas por vasos, con funciones de conducción. Las
proporciones relativas son de 50% para fibras, 30% para los vasos y cerca de 20% para el
parénquima. El porcentaje de parénquima es superior en las frondosas influyendo principalmente
en las propiedades físicas de la madera y en las pastas resultantes [8].
2
I. Introducción
2.2. Fibras procedentes de materiales no madereros
A partir de mediados del siglo XIX la madera ha sido la materia prima preferida para la
fabricación de pasta y papel debido a su disponibilidad en grandes cantidades, a la menor
presencia de material no fibroso, a la obtención de una pasta de características más uniformes y a
su mejor comportamiento en el proceso de fabricación. No obstante en los últimos años ha habido
un incremento importante en la demanda del papel, y la FAO (Food and Agriculture
Organization) ha pronosticado un incremento a nivel mundial del consumo anual de papel y
cartón que irá desde los 210 millones de toneladas en 1988 a alrededor de los 350 millones de
toneladas para el año 2010. Este continuo aumento de la demanda de papel puede causar, a nivel
mundial, una insuficiencia en el suministro de fibras madereras, conduciendo a un progresivo
aumento de la escasez de materia prima maderera y a una gradual deforestación en algunas áreas
del planeta. Una posible solución a este problema puede ser la utilización de fibras de origen
agrícola [11].
Esencialmente tres categorías de plantas son usadas en la producción de fibras no
madereras, aunque en teoría casi cualquier planta fibrosa puede ser utilizada; fibras procedentes
de plantas anuales como el cáñamo, kenaf, lino, yute, abacá; residuos agrícolas como la paja de
trigo, maíz, paja de arroz, bagazo de caña y sisal; hierbas silvestres como pastos, bambú, hierba
elefante; etc. [4]. Actualmente estas fibras representan una alternativa para países con baja
disponibilidad de maderas y para los que disponen de residuos agrícolas fibrosos o cultivos de
plantas fibrosas no madereras [12], así el uso de fibras naturales provenientes de plantas como
fuente de materia prima para la producción de pasta de celulosa y papel ha sido creciente,
especialmente en los países en vías de desarrollo, como la India, China y algunos países
latinoamericanos [4].
3. Composición química del material lignocelulósico
Los principales componentes de las fibras lignocelulósicas o de la biomasa
lignocelulósica son los polímeros constituyentes de todas las paredes celulares de materiales
vegetales: celulosa, hemicelulosa y lignina, además de algunos componentes minoritarios de bajo
peso molecular que pueden ser extraídos con disolventes orgánicos, siendo normalmente
designados por extraíbles y otros componentes inorgánicos [4, 8]. La composición química de las
fibras lignocelulósicas varía con las especies, pero de una forma general se puede decir que existe
3
I. Introducción
un mayor porcentaje de celulosa, entre un 40 y 50%, siendo a veces superior, entre un 10 y 30%
de lignina, de 20 a 30% de hemicelulosa y un pequeño porcentaje de extraíbles. El contenido en
cenizas varía de una forma sustancial, como en el caso de la madera cuyo contenido es inferior a
1% o en el caso de fibras de materiales no madereros que es superior [4].
3.1. Sustancias macromoleculares
3.1.1. Celulosa
La celulosa es la base estructural de las plantas, siendo químicamente definida como un
heteropolímero lineal constituido por unidades de D-glucopiranosa unidas mediante enlaces
glucosídicos en la configuración β(1-4), donde dos moléculas de glucosa se unen por la
eliminación de una molécula de agua entre dos grupos hidroxilo de los carbonos C1 y el C4 de la
otra unidad para formar la molécula de celobiosa, un disacárido que representa la unidad
constitutiva de la celulosa (Figura I. 1) [6, 8, 13].
Unidad de celobiosa
Figura I. 1. Estructura de la cadena de celulosa.
3.1.2. Hemicelulosas
Son heteropolisacáridos que, al igual que la celulosa, tienen la función general de soporte
en las paredes celulares y poseen un grado de polimerización inferior al de la celulosa [6, 8]. Las
hemicelulosas al contrario que la celulosa están compuestas por diferentes monosacáridos
formando cadenas más cortas y con ramificaciones, fácilmente hidrolizables en sus monómeros:
D-glucosa, D-manosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido 4-O-metil-D-glucurónico, ácido D-
galacturónico y L-ramnosa [4, 6]. Algunas hemicelulosas están asociadas a la porción celulósica,
mientras que otras están asociados a la lignina [14].
4
I. Introducción
El contenido en hemicelulosa, difiere mucho en función de las diferentes especies, tanto
por la cantidad como por la variedad, tanto en maderas como en otros materiales
lignocelulósicos. En el caso de la madera se puede apreciar una mayor cantidad de manosa y
galactosa en las coníferas, mientras que la xilosa y los grupos acetilo son más abundantes en las
frondosas [4].
3.1.3. Lignina
Después de la celulosa, es el polímero más abundante en el mundo vegetal y su función es
actuar como aglomerante de las fibras debido a su carácter hidrófobo, además de proteger contra
la humedad y los agentes atmosféricos [4, 14]. Es muy diferente de la celulosa y de las
hemicelulosas, pues es un polímero aromático formado por la condensación oxidativa de los
precursores fenólicos (alcohol p-cumarílico, alcohol coniferílico y alcohol sinapílico,
representados en la Figura I. 2). Es un polímero ramificado, tridimensional y amorfo, constituido
a partir de unidades de fenilpropano que se unen entre sí por enlaces del tipo éter alquil-arílico [4,
14, 15].
Alcohol p-cumarílico Alcohol coniferílico Alcohol sinapílico
Figura I. 2. Fórmula estructural de los precursores biosintéticos de la lignina.
La cantidad de lignina y su distribución a través de las paredes celulares difieren según su
origen, pues en las coníferas hay mayor porcentaje de lignina que en las frondosas. La estructura
básica de la lignina también difiere entre coníferas y frondosas. En las coníferas la estructura que
se repite predominantemente es la unidad de guayacilo (G), que contiene un único grupo
metoxilo en el anillo de fenilpropano y deriva del alcohol coniferílico (más de 95% de las
unidades estructurales). En el caso de las frondosas, hay predominantemente dos unidades que se
5
I. Introducción
repiten, la unidad guayacilo (G) y la unidad siringilo (S), conteniendo esta última dos grupos
metoxilo por núcleo de fenilpropano y deriva del alcohol sinapílico [14, 15]. Por otro lado, en la
lignina de fibras procedentes de materiales no madereros la estructura presenta unidades del tipo
p-hidroxifenilo (H), procedentes del alcohol p-cumarílico, y unidades S y G, en proporciones
variables dependiendo de la planta [14]. En la Figura I. 3 se muestra la complejidad de la
estructura de una lignina de conífera y se observan las diferentes subunidades.
4
1
2
3
5
Figura I. 3. Estructura química de la lignina de coníferas formada por diferentes tipos de sub estructuras. 1-4 son estructuras diméricas; siendo (1) éter guayacilglicerol-β-arílico, (2) fenilcumarano, (3) pinoresinol y (4) éter difenílico; y (5) es una estructura trimérica de dibenzodioxocina [14].
6
I. Introducción
Las unidades guayacilo, al contrario que las siringilo, tienen un único grupo metoxilo y la
posición C-5 está libre y disponible para la formación de enlaces carbono-carbono, por lo que
ligninas con mayor cantidad de unidades guayacilo tienen una estructura más condensada y por lo
tanto la lignina se elimina con mayor dificultad.
3.2. Sustancias de bajo peso molecular
Estos componentes existen en los materiales lignocelulósicos en una proporción mucho
menor que los otros constituyentes, pero tienen gran influencia en las propiedades y en el
procesado de estos materiales. Algunos protegen la madera de los insectos y son responsables de
dar color, olor y gusto a la madera. Pertenecen a diferentes clases de compuestos químicos pero
simplificando se pueden dividir en compuestos extraíbles y cenizas [4].
3.2.1. Compuestos extraíbles
Estas sustancias existen en menor proporción que los otros constituyentes y existen tanto
en maderas de frondosas como en coníferas y también en los materiales no madereros. Consisten
en compuestos orgánicos no poliméricos tanto lipofílicos como hidrofílicos, que pueden ser
extraídos con solventes orgánicos [16, 17]. La fracción lipofílica de los extraíbles comprende una
gran diversidad de compuestos como terpenos, ácidos grasos libres, hidrocarburos, alcoholes,
ceras, esteroles, ésteres de esteroles, glicéridos y otros compuestos oxidados [4, 17].
3.2.2. Cenizas
Son sustancias inorgánicas que se pueden determinar por incineración del material entre
575 y 850º. Fundamentalmente son sales inorgánicas de calcio, potasio y magnesio, así como
sílice en las maderas tropicales. Forman carbonatos, fosfatos, oxalatos y silicatos [4].
4. Breve descripción del proceso de obtención de pasta de papel
En el proceso de elaboración de la pasta de papel se separan las fibras de celulosa del
resto de los componentes de la madera, lignina fundamentalmente [18]. El fundamento principal
del proceso es la eliminación de la lignina afectando lo más mínimo posible la pared secundaria
de las fibras [8]. El proceso de pasteado u obtención de una suspensión de fibras en agua, consta
de varias fases [4]:
- Preparación de la materia prima: son operaciones tales como el lavado de troncos, corte,
descortezado y astillado que facilitan el tratamiento posterior.
7
I. Introducción
- Obtención de la pasta: se realizan de diversas formas (por métodos químicos, mecánicos y
químico-mecánicos), según la calidad que se desea obtener.
- Lavado: se realiza para eliminar las sustancias disueltas que acompañan la pasta.
- Depuración y acondicionamiento: las fibras se tratan para dejarlas sin sustancias extrañas y
con un tamaño y espesor adecuado para procesos posteriores.
- Blanqueo: consiste en la eliminación de la lignina residual y componentes coloreados de la
pasta.
4.1. Pastas mecánicas
El tratamiento mecánico tiene como objetivo la disgregación y separación física de las
fibras. La lignina que une la celulosa a las hemicelulosas no se disuelve, apenas se torna más
blanda [2, 4]. Las especies utilizadas para la fabricación de pasta mecánica son las maderas de
coníferas, pero se han utilizado frondosas [5]. La fabricación de pastas mecánicas ofrece la
ventaja de dar como resultado rendimientos elevados (90- 95%) [4].
4.2. Pastas químicas
En el pasteado o cocción química, la deslignificación se lleva a cabo con la ayuda de
agentes químicos ácidos o básicos, en digestores o reactores a altas temperaturas y presiones [4].
La pasta se produce con disolución de la lignina que se encuentra entre las fibras del material
lignocelulósico, sin dañar sustancialmente la celulosa.
En el pasteado químico, ya que la lignina y las hemicelulosas se pierden, los rendimientos
son normalmente de 40 a 60%, el producto es más resistente y de mejor calidad [2, 4]. Los
métodos químicos se dividen en ácidos o alcalinos dependiendo del pH del reactivo [4].
4.2.1. Proceso a la sosa
Es el más antiguo y el más simple de los procesos químicos alcalinos, donde su finalidad
es eliminar parte de la lignina contenida en la fibra. La fibra pretratada entra en la planta de pasta,
donde se somete a un proceso de cocción con sosa cáustica y vapor a alta presión y temperatura.
Esta operación se efectúa en digestores continuos [2, 4, 12].
El hidróxido de sodio, o sosa cáustica, es un producto muy útil para la deslignificación de
materias primas vegetales, principalmente de maderas, pajas de cereales y plantas fibrosas en
general [12].
8
I. Introducción
Además se puede utilizar antraquinona (AQ) que funciona como catalizador. Este aditivo
presenta dos efectos fundamentales como son la aceleración del proceso de deslignificación
alcalino y la estabilización de los carbohidratos, mejorando además los rendimientos respecto al
proceso convencional en las mismas condiciones de operación [12].
4.2.2. Proceso kraft o al sulfato
El proceso kraft para la obtención de pasta de papel es un proceso químico alcalino que
deriva del proceso a la sosa [1]. En este proceso, además de hidróxido de sodio se utiliza el
sulfuro sódico, siendo estos agentes de cocción conocidos como lejías blancas [2, 4].
El proceso se lleva a cabo en digestores que pueden ser tanto discontinuos como
continuos, en los que se introducen las astillas junto a las lejías blancas llevándose a cabo la
cocción a elevada temperatura (150-170ºC) y presión [1]. De un modo general el proceso tiene
lugar con una concentración de reactivos del 16-20% (expresados como peso de Na2O, en
relación al peso de la madera) y sus rendimientos varían entre un 40 y 60% (Figura 13) [4, 8]. La
ventaja de este proceso es que requiere tiempos de cocción relativamente bajos pues el sulfuro
acelera la deslignificación reduciendo la degradación del material celulósico y produciendo así
pastas de mejor calidad. La resistencia es su principal característica de donde deriva su nombre
“kraft”, del alemán resistencia [4, 8]. La muestra de pasta utilizada en el presente trabajo es una
pasta kraft de Eucalipto.
4.3. Pastas químico-mecánicas
Las pastas químico-mecánicas se obtienen por desfibrado de las maderas de frondosas o
coníferas en desfibradores del tipo clásico, habiendo la madera sufrido previamente un
tratamiento químico. La materia prima se introduce en autoclaves horizontales y se somete a la
acción de productos químicos, siendo más vulgarmente usada una solución caliente de bisulfito
sódico. La pasta pasa después por desfibradores, seguidamente se lava y se blanquea. La pasta
resultante es semejante a la pasta mecánica, pudiéndose no obstante utilizar maderas de frondosas
que no sirven como materia prima para la fabricación de pasta mecánica [5].
9
I. Introducción
5. Proceso de blanqueo de la pasta
En el proceso de blanqueo se trata químicamente la pasta de celulosa para eliminar la
lignina residual que queda después del proceso de cocción. Los componentes coloreados de la
lignina son degradados, disueltos y/o decolorados. El principal objetivo en este proceso es el
blanqueo de la pasta tratando que, un mínimo posible, o ningún, daño ocurra a los polisacáridos,
particularmente a la celulosa [19]. Todo el material coloreado, en el caso de las pastas químicas
no puede ser eliminado en una sola etapa, tratándose por tanto de un procedimiento multietapas.
En este proceso se utilizan dos tipos de reactivos: oxidantes, que se emplean para degradar y
decolorar la lignina; y el álcali, que se emplea para degradar la lignina, para hidrolizar y para
facilitar su disolución posterior [4]. El proceso de blanqueo se lleva a cabo hasta el punto de
blancura que se pretende, por lo que el número de etapas dependerá de la calidad de la pasta que
se desea obtener, utilizándose comúnmente cinco fases de blanqueo, donde entre cada dos fases
de blanqueo hay una etapa de extracción donde se neutraliza la pasta [5]. Los reactivos comerciales más utilizados para el blanqueo son el cloro gas, el hipoclorito,
el peróxido de hidrógeno y el dióxido de cloro; y el único álcali utilizado comercialmente es el
hidróxido de sodio que se usa en la operación de extracción alcalina [4].
En la actualidad, a causa de la imposición de límites estrictos en la emisión total de
compuestos clorados orgánicos, de haluros orgánicos absorbibles y dioxinas en los efluentes de
las plantas de blanqueo, se están imponiendo cada vez más las secuencias de blanqueo que
eliminan parcialmente (ECF: Elemental-Clorine Free) o totalmente (TCF: Totally-Clorine Free)
el uso de compuestos clorados [4]. Para esto se están utilizando procesos de blanqueo que
utilizan dióxido de cloro, oxígeno, ozono y peróxido de hidrógeno [5].
6. Polioxometalatos como catalizadores de blanqueo
Los polioxometalatos (POMs) son catalizadores de oxidación conocidos por sus síntesis
orgánicas homogéneas y heterogéneas. A mediados de la década de los 90, los POMs fueron
propuestos como catalizadores de alta selectividad para el blanqueo de pastas kraft. Los POMs
fueron sugeridos como alternativas adecuadas a los reactivos de blanqueo basados en cloro,
perjudiciales para el ambiente, y al blanqueo convencional alcalino con oxígeno [20]. El uso de
estos compuestos presenta ciertas ventajas, como poder ser regenerados y reutilizados en el
proceso de deslignificación.
10
I. Introducción
Los polioxometalatos se caracterizan por ser aniones que se pueden visualizar
estructuralmente como conjuntos agregados metal-oxígeno [21]. Presentan un centro metálico,
M, que está rodeado por un grupo de átomos. Los agregados metal-oxígeno son poliedros (Figura
I. 4), donde los más frecuentes son los octaedros MOx, las bipirámides pentagonales o pirámides
cuadrangulares [21]. La unidad básica y más común de construcción de los POMs, los octaedros,
está formada por un metal rodeado de seis oxígenos (MO6), pudiendo estas unidades unirse unas
a otras [22].
Figura I. 4. Representación poliédrica de algunos polioxometalatos. a) Anión de Keggin α-[XM12O40]m-; b) Anión de Keggin del tipo α-[XM11M’(H2O)O39]n-; c) Anión tipo sándwich [(XW9O34)2M´4(H2O)2]p-; y d) Anión de Dawson [P2W18O62]p-.
En los POMs, los átomos ligantes son los átomos de oxígeno. En general presentan
unidades MOy, donde “y” indica el numero de coordinación de M. Además de M, O y otros
elementos, que usualmente son designados por X, pueden formar parte de la estructura de los
POMs. Pueden ser clasificados como isopolianiones o heteropolianiones, con fórmulas generales
[MmOy]p- y [XxMmOy]q- respectivamente, donde x≤m, M= Mo, W, V, Nb, Ta y X, que representa
11
I. Introducción
el heteropoliátomo introducido en la estructura y que está localizado en el centro de la molécula,
puede ser P, Si, Ge, B, As entre otros [21, 23].
Los polioxometalatos presentan una estructura organizada en unidades discretas y, a pesar
de que sus fórmulas generales son bastante simples, la composición de un grupo puede ser
altamente compleja, con varios elementos M formando parte de la estructura [22].
Los polioxometalatos con estructura de Keggin (Figura I. 4, a y b) son los más
importantes y los más estudiados actualmente ya que son los más estables y los más fácilmente
disponibles [22]. El anión de Keggin está compuesto por un tetraedro central XO4 rodeado por 12
octaedros MO6, metal-oxígeno, compartiendo aristas y vértices. Los octaedros se encuentran en
cuatro grupos M3O13. Cada grupo comparte los átomos de oxígeno de los vértices con otros tres,
formando el polioxometalato con estructura de Keggin, con la fórmula [XM12O40]m-, en que
XM12 es la fórmula abreviada. Los heteroátomos más comunes en los aniones de Keggin son los
heteropolitungstatos [XW12O40]m- y los heteropolimolibdatos [XMo12O40]m [22].
Los polioxometalatos presentan una serie de propiedades peculiares, entre ellas su
dimensión iónica relativamente grande, pues ya se han aislado y caracterizado estructuralmente
POMs de hasta 4nm. También son resistentes a la degradación oxidativa y presentan
generalmente una estabilidad térmica elevada. La solubilidad de las sales de
heteropolioxoaniones está principalmente determinada por el contra-ión, ya que estos compuestos
presentan una energía de red relativamente baja y la energía de solvatación del anión es
igualmente baja. Así, las sales de potasio, sodio y amonio son solubles en agua [21, 24].
Los POMs son susceptibles de recibir electrones, en procesos reversibles e irreversibles.
Las propiedades redox de estos complejos, pueden ser alteradas variando la estructura del POM o
el tipo o número de los sustituyentes. Este hecho es de especial interés en experimentos de
catálisis oxidativa, tal como la deslignificación de pasta de papel.
6.1. Deslignificación oxidativa con oxígeno catalizada por polioxometalatos
Los polioxometalatos son utilizados en procesos de deslignificación oxidativa con
oxígeno, cuyo objetivo principal es la oxidación selectiva de la lignina residual.
La degradación oxidativa de la lignina es un proceso relativamente fácil en este sistema,
ya que la lignina presenta un potencial redox inferior al de los polisacáridos. A pesar de haber
diferentes estructuras químicas redox y diferentes potenciales para cada polioxometalato en
12
I. Introducción
13
particular, en general las reacciones redox envueltas en la degradación oxidativa de la lignina
pueden ser descritas de la siguiente forma:
(1) POMox + Lignina → POMred + Ligninaox
(2) POMred + (m/4)O2 + mH+ → POMox + (m/2)H2O
En donde POMox y POMred son las formas oxidadas y reducidas del polioxometalato,
respectivamente, y Ligninaox representa los productos de bajo peso molecular procedentes de la
degradación oxidativa de la lignina.
En este proceso se pueden considerar dos sistemas principales: un sistema anaeróbico, en
que las dos reacciones ocurren en etapas separadas, donde el POM tiene función de oxidante
regenerativo, que consta de una primera etapa en condiciones anaeróbicas (1) y una segunda
etapa en condiciones fuertes de presión de oxígeno y de temperatura (2); y un sistema aeróbico,
en el cual las dos reacciones ocurren en la misma etapa, en la presencia de oxígeno y donde el
POM tiene la función de catalizador oxidativo.
Para la oxidación de la lignina y la reoxidación del POM es necesario que existan
condiciones termodinámicas favorables. De este modo, los polioxometalatos deben tener un
potencial redox más elevado que las unidades de lignina, para poder oxidar la lignina, y más baja
que el oxígeno para permitir su posible reoxidación por el oxígeno. La degradación oxidativa de
la lignina puede ocurrir a potenciales de 0,6-0,8V para las unidades fenólicas de la lignina y,
cerca de 1,0V para las unidades no fenólicas a pH 2 [25]. El potencial redox O2/H2O es de 1,22V
a pH 0, de este modo, los POM con potenciales redox entre 0,6 y 1,22V son posibles
catalizadores para la deslignificación por oxígeno. Sin embargo, existen otros factores, como los
cinéticos, que pueden limitar la reoxidación práctica de los POMs [24].
II. Antecedentes y objetivos
II. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS
Anteriormente se han realizado ensayos de deslignificación de pasta de papel con oxígeno
molecular en la presencia del POM [SiW11MnIII(H2O)O39]5- [24, 26]. Este sistema surgió como
una alternativa para la reducción del uso de compuestos clorados y se demostró como uno de los
más selectivos para la oxidación de la lignina en pastas de papel sin afectar la viscosidad de las
pastas. Sin embargo, se verificó que el POM después del ensayo de deslignificación se encuentra
en un estado de oxidación predominantemente reducido, lo que inviabiliza la reutilización de los
licores resultantes en nuevas etapas/ ciclos de deslignificación. Anteriormente, se pretendió
resolver este problema utilizando una enzima que reoxide el POM, para de este modo poder
reutilizar el POM en una nueva etapa para deslignificación. La enzima utilizada en estos trabajos
fue la lacasa de Trametes versicolor, pero los resultados no fueron muy esperanzadores para una
posible aplicación industrial, pues era necesario mucho tiempo para que la lacasa reoxidase el
POM y la reoxidación no era completa [20, 24, 27, 28].
Durante la realización de este proyecto se pretendió resolver el problema de la
reoxidación del POM utilizando una enzima de tipo peroxidasa (peroxidasa versátil- VP). Esta
enzima se denomina peroxidasa versátil por su capacidad para oxidar tanto Mn2+ como diferentes
compuestos aromáticos (fenólicos y no fenólicos) y colorantes.
Al poseer capacidad para oxidar el Mn2+ se pensó que esta VP podría ser adecuada para
oxidar este POM que contiene Mn. El proceso puede ser descrito por las ecuaciones 1 y 2. En una
primera etapa, tendría lugar en el reactor la deslignificación de la pasta Kraft con oxígeno y
[SiW11MnIII(H2O)O39]5-, a 110 ºC o 100ºC, durante 1 o 2 horas, ecuación 1. En un paso
intermedio el POM se recuperaría, esto es, el líquido de filtrado obtenido de la primera etapa, se
reoxidaría por la enzima, en presencia de H2O2, a temperatura ambiente, ecuaciones 2.
Finalmente, se realizaría una nueva etapa POM reutilizando el POM reoxidado por la VP,
ecuación 1.
(1) Lignina + [SiW11MnIII(H2O)39]5- ligninaox + [SiW11MnII(H2O)39]6-.
(2) VP + H2O2 VPox + H2O
[SiW11MnII(H2O)39]6- + VPox [SiW11MnIII(H2O)39]5- + VP
14
III. Material y métodos
III. MATERIAL Y MÉTODOS
1. Muestras
La pasta de papel utilizada para los ensayos de deslignificación fue suministrada por la
empresa ENCE (Pontevedra, España), una pasta kraft de eucalipto (Eucalyptus globulus) sin
blanquear.
La enzima, peroxidasa versátil de Pleurotus eryngii (VP), fue suministrada por el Centro
de Investigaciones Biológicas (CIB, CSIC, Madrid) con una concentración de 35,5 μM.
La solución acuosa de [SiW11MnIII(H2O)O39]5- (SiW11MnIII) fue preparada a partir de α-
K8[SiW11O39]·13H2O, KMnO4 y Mn(CH3COO)2·4H2O. Se disolvieron aproximadamente 9,6 g de
K8[SiW11O39]·13H2O en 13 mL de agua, a 95 ºC aproximadamente. En vasos separados se
disolvieron, a temperatura ambiente, aproximadamente 0,095 g de KMnO4 en 10 mL de HCl
0,6mM y 10 mL de agua y aproximadamente 0.6 g de Mn(CH3COO)2·4H2O en 10 mL de agua.
Al vaso conteniendo K8[SiW11O39]·13H2O a 95 ºC se le adicionó poco a poco y
consecutivamente las disoluciones de los otros dos vasos y se dejó unos 25 minutos a 95 ºC. Se
guardó la disolución preparada hasta el dia siguiente para filtrarla y diluirla para 100 mL de modo
a la concentración final ser de aproximadamente 30 mM.
2. Optimización de la cinética de oxidación de SiW11MnII con peroxidasa versátil
(VP) monitorizada por espectroscopía UV/VIS Se realizaron varias pruebas en tampón acetato 0,1 M, pH 4,5 en el sentido de maximizar
la oxidación del POM con VP/H2O2, variando para esto la relación H2O2/POM y POM/VP. Las
lecturas se realizaron a un valor de longitud de onda fijo (490 nm) para intervalos de tiempo de 1
minuto, considerando ε en cm-1mol-1L de (SiW11MnIII)=327 y de (SiW11MnII)=19.
Todas las medidas espectrofotométricas se realizaron en un espectrofotómetro Jasco V-
560 UV/Vis a temperatura ambiente.
3. Ensayos de deslignificación de la pasta kraft de eucalipto con SiW11MnIII
Los ensayos de blanqueo se llevaron a cabo en un reactor PARR modelo 4842 (0,25 L)
equipado con un sistema de control de temperatura y mecanismo de agitación (Figura III. 1).
15
III. Material y métodos
Para cada uno de los ensayos, se dejó aproximadamente 8 g de pasta en remojo en unos
600 mL de agua destilada y en agitación constante durante dos noches. Se filtró la pasta, se pasó
al reactor y se adicionó 67 mL de tampón acetato de sodio 0,2 M pH 4,5 (concentración final de
0,1 M), disolución de POM concentrado (entre 12,5 a 13,5 mL para que la concentración final de
POM en la mezcla fuera de aproximadamente 3 mM) y agua destilada hasta 134 mL de volumen
total (considerando todavía la contribución del agua retenida en la pasta filtrada), para obtener
una consistencia final de 6%. Se presurizó el reactor con pO2=5 bar, se encendió la agitación
mecánica y se llevó hasta la temperatura pretendida (dependiendo del ensayo). Una vez acabado
el ensayo, se filtró la pasta y se lavó con agua destilada (POM 1-). En los casos en que los
líquidos de filtrado conteniendo el POM fueron reoxidados (-VP-), se adicionó a estos la enzima
y el peróxido de hidrógeno en las cantidades necesarias (obtenidas a través de los ensayos de
optimización), manteniendo agitación constante y a temperatura ambiente (para no
desnaturarlizar la enzima), durante aproximadamente 10 min (aunque a los seis minutos la
reoxidación ya se estimaba como completa). El filtrado conteniendo el POM reoxidado se añadió
nuevamente a la pasta filtrada reiniciando una nueva etapa de deslignificación (-POM 2-).
Figura III. 1. Imagen del sistema usado para los ensayos de deslignificación.
16
III. Material y métodos
Finalmente, todas las pastas deslignificadas se sometieron a extracción alcalina con NaOH
(-E) 2% durante 1 hora a 70 ºC. Después de las extracciones alcalinas, se lavaron las pastas con
agua destilada, hasta alcanzar pH neutro en el líquido de filtrado y se dejaron secar a temperatura
ambiente durante 4 días. Se realizaron análisis posteriores de humedad, índice kappa, viscosidad
intrínseca y ácidos hexenurónicos.
Ensayos de deslignificación realizados:
- Blanco 2h/110ºC (sin POM).
- Blanco 2h/110ºC (sin POM/sin O2).
- POM1 (1h/110ºC).
- POM1 (2h/110ºC).
- POM1 (2h/100ºC).
- POM1 (2h/110ºC) – POM2 (2h/110ºC).
- POM1 (1h/110ºC) – VP – POM2 (1h/110ºC).
- POM1 (2h/110ºC) – VP – POM2 (2h/110ºC).
4. Determinación de la humedad de las pastas
La humedad de las pastas se determinó secando aproximadamente 0,5 g de pasta a una
temperatura de 105±1ºC hasta obtener un peso constante.
5. Determinación del índice kappa
El procedimiento standard utilizado en la industria para determinar el grado de
deslignificación en una pasta química es la determinación del índice kappa por la norma TAPPI
T 236cm-85 (volumen en mL de una disolución de KMnO4 0,1 N consumido por 1 g de pasta).
La lignina de la pasta reacciona con el permanganato y la cuantificación del permanganato
consumido se determina por titulación con tiosulfato de sodio [29].
Se desintegraron, con ayuda de una batidora de mano, entre 1,4 a 1,6 g de pasta (ver
Anexo 1) en 140 mL de agua destilada y se lavó el pie de la batidora con 50 mL de agua. Se
colocó en agitación constante y se adicionó una mezcla de 25 mL de KMnO4 0,1 N y 25 mL de
H2SO4 0,2 N. Al cabo de 5 minutos se midió la temperatura y al cabo de 10 minutos se paró la
reacción con 5 mL de KI 1,0 N, se colocaron unas gotas de solución indicadora de almidón al
17
III. Material y métodos
0,2% y se tituló el I2 liberado con una disolución de Na2S2O3 0,2 N. Previamente se realizó
siempre un ensayo en blanco que no contenía pasta.
El índice kappa se calculó por la expresión:
[ ])25(013,01 tw
fpIK −+×
=
⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛ −=
1,0)( Nabp
Con:
IK= índice kappa
p= Volumen de permanganato de potasio 0,1 N consumido en el ensayo (mL)
f= factor de corrección para un consumo de 50 % de permanganato de potasio y que
depende de p (Anexo 2, [29]).
w= peso de pasta seca (g)
b= volumen consumido de tiosulfato de sodio para determinación del blanco (mL)
a= volumen consumido de tiosulfato de sodio para determinación de la muestra (mL)
N= normalidad de la disolución de tiosulfato de sodio
T= Temperatura del medio de reacción (ºC).
6. Determinación de la viscosidad intrínseca
La viscosidad de las pastas está directamente relacionada con el grado de polimerización
de las moléculas de celulosa y por lo tanto con la resistencia de las fibras. Se determinó la
viscosidad intrínseca de las pastas a través de la norma SCAN-CM 15:85 [30]. Este método
permite determinar la viscosidad de las pastas celulósicas solubles en una disolución de cobre
(II)-etilendiamina (CED) en un viscosímetro capilar.
Se pesó entre 0,15-0,20g de pasta (ver Anexo 3) y se transfirieron a frascos propios de 61
mL, se adicionó 25 mL de agua destilada y 5 hilos de cobre. Se colocaron los frascos a agitar
durante aproximadamente 30 minutos en un agitador de brazos. Seguidamente, se adicionó 25
mL de CED 1,0 M para dar lugar a la disolución de los polisacáridos. Se completó el volumen del
frasco con disolución de CED 0,5 M usando una bureta, se cerraron los frascos de modo a no
dejar burbujas de aire y se colocaron de nuevo sobre agitación durante otros 30 minutos.
Finalmente, se anotó el tiempo de escurrido de 1 mL de pasta disuelta en CED, repitiendo la
18
III. Material y métodos
lectura 3 veces para cada frasco, usando un viscosímetro capilar a una temperatura controlada de
25 ºC.
La viscosidad relativa de las pastas fue determinada por la expresión:
ηrel= h*tn
Con:
h= constante del viscosímetro, obtenida por calibración (0,0928 s-1)
tn= tiempo de escurrido (s)
A partir de la tabla que se encuentra en anexo (Anexo 4, [30]), se lee el valor del producto
[η]*C, que corresponde al valor de la viscosidad relativa obtenido:
ηrel= [η]*C
Con:
[η]= viscosidad intrínseca (mL/g)
C= concentración de la pasta seca en CED (g/mL).
7. Determinación de la cantidad en ácidos hexenurónicos (HexA)
Durante el proceso kraft, los ácidos 4-O-metil-D-glucurónicos, presentes en la cadena
principal de los xilanos, se convierten en los ácidos insaturados correspondientes a través de la
pérdida del grupo metanol- ácidos hexenurónicos. Estas estructuras se forman en la fase más
rápida de la cocción kraft y son de gran interés ya que interaccionan con los agentes químicos de
blanqueo y otros reactivos. De esta forma, la eliminación de los ácidos hexenurónicos reduce el
consumo de los reactivos de blanqueo y aumenta la blancura de las pastas [31, 32].
Los ácidos hexenurónicos interfieren con el método de determinación de la lignina
residual, índice kappa, ya que reaccionan con el permanganato de potasio, haciendo que se
obtenga un valor más elevado de lignina residual que el real. Es importante determinar la
cantidad de ácidos hexenurónicos presentes en las pastas para así medir el valor de índice kappa
sin la influencia de éstos [31, 32].
Los ácidos hexenurónicos se determinaron a través del método de la hidrólisis ácida,
norma TYÖOHJE C/6 15/07/98 [32]. En este método, los ácidos hexenurónicos son
selectivamente convertidos en derivados del furano. La determinación de la cantidad de HexA,
presentes en la pasta, se basea en la cuantificación de los derivados del furano que se forman a
través del análisis del espectro de UV/VIS.
19
III. Material y métodos
20
Para la determinación de los ácidos hexenurónicos, se pesaron aproximadamente 0,75 g
de pasta y se adicionaron 0,75 mL de tampón formato de sodio 10 mM. Se dejó impregnar la
pasta sobre agitación durante una noche. Esta mezcla se transfirió al reactor, se substituyó el aire
por nitrógeno durante 5 minutos, se encendió la agitación mecánica y se llevó la temperatura
hasta 110ºC durante 1h y con agitación constante. Una vez acabada la reacción se filtró la pasta y
se lavó, recogiendo siempre el líquido de filtrado, diluyéndose todo hasta 500 mL. Se leyó
entonces el valor de la absorbancia a 245 nm y 480 nm. Se realizó también un ensayo en blanco.
La cantidad de HexA existentes en las pastas se determinó por la expresión:
=CmAA
×−
7,8)( 480245
Con:
C= cantidad de HexA en la pasta (meq/Kg)
A245= absorbancia a 245 nm
A480= absorbancia a 480 nm
m= peso de la pasta seca (Kg)
8,7 mM-1cm-1= coeficiente de extinción molar a 245 nm con relación a los HexA.
IV. Resultados y discusión
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el proceso de deslignificación se pretende eliminar la lignina residual, reduciendo el
índice kappa, con una disminución mínima de la viscosidad. De este modo, el análisis de
parámetros como el kappa, la viscosidad y los ácidos hexenurónicos determinan la selectividad
del proceso de deslignificación.
El POM SiW11MnIII ha sido previamente sugerido como catalizador en ensayos de
deslignificación de pastas kraft con oxígeno [24, 26-28]. Sin embargo, factores como los
cinéticos, limitan la reoxidación del POM por el oxígeno. Para solucionar este problema, en
trabajos anteriores, se utilizó para la reoxidación del POM una lacasa del hongo Trametes
versicolor, pero los tiempos transcurridos para obtener la reoxidación del POM eran enormes y
además la reoxidación no era completa. En este estudio, se utilizó otra enzima para la reoxidación
del POM, la peroxidasa versátil, VP, del hongo Pleurotus eryngii, Figura IV. 1. La VP es una
enzima que comparte las propiedades catalíticas de una lignina peroxidasa (LiP) y de una
manganeso peroxidasa (MnP), pudiendo oxidar lignina y compuestos de manganeso, con
preferencia por compuestos de manganeso [33, 34].
Figura IV. 1. Hongo Pleurotus eryngii.
Por un lado, la LiP está envuelta en mecanismos de degradación de la lignina. Esta
enzima es una glicoproteína con hierro protoporfirínico IX como grupo prostético, dependiente
de H2O2 para su actividad [33-35].Inicialmente es oxidada por peróxido de hidrógeno H2O2,
21
IV. Resultados y discusión
oxidando núcleos aromáticos de la molécula de lignina (fenólicos y no fenólicos), generando
radicales catiónicos. Estos interactúan espontáneamente con nucleófilos (principalmente H2O) y
con oxígeno molecular, generando una “combustión enzimática” donde los enlaces C-C e C-O se
rompen, despolimerizando la lignina y abriendo los anillos aromáticos. El ciclo catalítico de esta
enzima se puede observar en la Figura IV. 2A.
(A)
(B)
MnP (nativa) MnP (I)
MnP (II)
MnP (nativa) MnP (I)
MnP (II)
Alcoholveratrílico
Radical catiónicoAlcohol veratrílico
Figura IV. 2. Ciclos catalíticos de (A) LiP y de (B) MnP.
22
IV. Resultados y discusión
Por otro lado, la MnP también es una glicoproteína con hierro protoporfirínico IX como
grupo prostético y dependiente de H2O2 para su actividad, pero la oxidación por esta enzima es
también dependiente de la disponibilidad de iones manganeso. Su ciclo catalítico es semejante al
de la LiP; sin embargo, el Mn2+ actúa como dador de electrones para generar el compuesto MnPII
[33- 35], Figura IV. 2B.
En este caso concreto, en que la VP es utilizada para reoxidar el POM, el proceso se inicia
por el enlace del peróxido al hierro nativo de la enzima, formando un complejo radical hierro-
peróxido. La rotura subsiguiente del enlace O-O del peróxido requiere la transferencia de dos
electrones del grupo hemo de la enzima, que resulta en la formación de un radical complejo Fe4+-
oxo-porfirina (compuesto 1 de la Figura IV. 3). Una reducción siguiente tiene lugar formando el
complejo Fe4+-oxo-porfirina no radicalar (compuesto 2 de la Figura IV. 3). Un ión Mn2+
(proveniente del POM) actúa como dador de 1 electrón para ese complejo intermediario y es
oxidado a Mn3+. La reducción del compuesto 2 se produce de manera similar y otro Mn3+ se
forma a partir de un Mn2+, dando lugar a la forma original de la enzima [33]. En la Figura IV. 3
además del ciclo catalítico de la enzima por si sola, también se muestra la oxidación de la lignina
por el POM.
Figura IV. 3. Ciclo catalítico propuesto para la VP para la reoxidación del POM en los ensayos de deslignificación realizados, adaptado de [33].
H2O2H2O
Compuesto 1 (enzima activa)
Ligninaox
H2O
Lignina
Ligninaox
Compuesto 2
Lignina
23
IV. Resultados y discusión
La reoxidación del POM por la VP fue monitorizada por espectroscopía de UV/VIS. El
color amarillo del POMred, SiW11MnII, cambiaba gradualmente durante la oxidación con la VP a
un color rosa característico del POMox, SiW11MnIII, (Figura IV. 4A-b), mostrando una banda de
transición d-d* con un máximo de Absorbancia a 490-495 nm (Figura IV. 4B).
(a) (b)(a) (b)
(A)
(B)
Figura IV. 4. (A), Colores característicos de (a): SiW11MnIII y (b): SiW11MnII; (B) Espectros de UV/VIS de disoluciones acuosas de a: SiW11MnII, b-d: diferentes porcentajes de oxidación hasta e: SiW11MnIII (la oxidación máxima).
1. Optimización de la cinética de oxidación de SiW11MnII con peroxidasa versátil
(VP) monitorizada por espectroscopía UV/VIS Se realizaron diversas pruebas en con la finalidad de maximizar la oxidación del POM
con VP y H2O2, variando la relación H2O2/POM y POM/VP. También se realizaron estas pruebas
24
IV. Resultados y discusión
en el líquido de filtrado resultante de la etapa POM1- de la deslignificación para ver de qué
manera los compuestos disueltos en esa lejía afectaban la reoxidación del POM por la enzima.
Comparando los resultados obtenidos en las pruebas en agua y en las lejías, se obtuvieron
mejores resultados en las lejías, lo que demuestra que los compuestos disueltos en las lejías,
provenientes de los productos de la primera etapa de deslignificación, favorecen el proceso de
reoxidación del POM. En la tabla 1 se muestra una selección de los resultados obtenidos en las
pruebas con la lejía.
Tabla1. Resultados de la oxidación de SiW11MnII con VP/H2O2 en el líquido de filtrado resultante de la etapa POM1- de la deslignificación.
[POM]final/mM H2O2/MnP H2O2/POM POM/MnP Absmax %oxidación tiempo/min
2,64 0 0,00 2195 0,24 23 2 2,62 472 0,21 2195 0,55 62 2 2,61 896 0,41 2195 0,83 97 6 2,59 1321 0,60 2195 0,68 79 27 2,58 1769 0,81 2195 0,44 49 25 2,56 2217 1,01 2195 0,36 39 20
Según los resultados que se muestran en la tabla 1, la máxima oxidación del
polioxometalato se obtiene para una cantidad de enzima y peróxido correspondientes a una
relación H2O2/POM =0,4, H2O2/VP~900 y POM/VP~2200 y en aproximadamente 6 minutos.
2. Ensayos de deslignificación de la pasta kraft de eucalipto con SiW11MnIII
Se realizaron diferentes ensayos de deslignificación de la pasta kraft de eucalipto con
SiW11MnIII. En la tabla 2 se muestran los resultados de los diferentes ensayos realizados. Entre
éstos resultados se encuentran el número kappa de la pasta (parámetro relacionado con la
cantidad presente de lignina y ácidos hexenurónicos), la viscosidad intrínseca (parámetro
relacionado con el grado de polimerización de los polisacáridos) y el contenido en ácidos
hexenurónicos. Inicialmente se realizó un ensayo POM2h/110 ºC con una velocidad de agitación
en el reactor de ~50 rot/min, pero una vez que se obtuvieron mejores resultados con una
25
IV. Resultados y discusión
velocidad de agitación de 220 rot/min el resto de los ensayos se realizaron con esta velocidad y
los resultados que se muestran en la tabla son todos para 220 rot/min. En los ensayos en que se
utiliza la enzima para reoxidar el POM, la temperatura de cada etapa POM es de 110ºC (mejores
resultados que a 100 ºC) y la etapa VP es realizada a temperatura ambiente para evitar la
desnaturalización de la enzima.
Estos ensayos de deslignificación con POM son llevados a cabo a temperaturas
relativamente altas y en medio ácido, lo que por sí solo contribuye a la disminución del índice
kappa y a la eliminación de ácidos hexenurónicos, HexA, (que también contribuyen en 3-4
unidades de índice kappa) [25]. Esta contribución de las condiciones experimentales se puede
observar en la disminución del índice kappa observado en los ensayos en blanco, en donde en el
ensayo realizado con oxígeno el kappa disminuye más aún.
Tabla 2. Resultados obtenidos en los diferentes ensayos de deslignificación.
PASTAS humedad IK viscosidad A-Hex IK IK' Grado % viscos.
(%) (cm3/g) (meq/Kg) (HexA) deslignif. perdidaPasta inicial 7,9 13,6 1215 61,2 4,5 9,1 - - blanco2h/110ºC (sin POM/con O2)
8,1
6,8
875
15,7
1,1
5,7
50,0
28,0
blanco2h/110ºC (sin POM/sin O2)
8,0
7,8
1115
18,9
1,4
6,4
42,6
8,2
POM1(1h/110ºC) 7,1 8,2 1180 28,5 2,1 6,1 39,7 2,9 POM1(2h/110ºC) 7,9 6,8 1140 18,4 1,3 5,5 50,0 6,2 POM1(2h/100ºC) 7,3 8,5 1190 32,5 2,4 6,1 37,5 2,1 POM1(2h/110ºC)- -POM2(2h/110ºC)
7,3
5,2
1085
8,2
0,6
4,6
61,8
10,7
POM1(1h/110ºC)-VP--POM2(1h/110ºC)
7,8
6,5
1130
16,8
1,2
5,3
52,2
7,0
POM1(2h/110ºC)-VP--POM2(2h/110ºC)
7,6
5,2
1080
9,3
0,7
4,5
61,8
11,1
Condiciones experimentales: consistencia de la pasta 6,0%; [SiW11MnIII]= 2,9 mM; pH 4,5; Pº (O2)= 5 bar. A todos los ensayos les sigue una etapa –E.
26
IV. Resultados y discusión
27
Los resultados obtenidos en los ensayos de deslignificación con POM confirman que el
sistema [SiW11MnIII(H2O)O39]5-/O2 es altamente selectivo para la deslignificación, ya que la
pérdida de viscosidad es siempre ≤11% para una reducción de kappa de ~62% frente al blanco
(sin POM) en donde hay una pérdida de viscosidad de ~28%. Además, comparando los
resultados de los ensayos POM1(2h/110ºC)-POM2(2h/110ºC) y POM1(2h/110ºC)-VP-
-POM2(2h/110ºC) se observa que de hecho si es posible implantar un proceso multietapas con el
sistema [SiW11MnIII(H2O)O39]5-/O2 utilizando la peroxidasa versátil para la reoxidación del
polioxometalato, ya que lo consigue reoxidar en su totalidad y la disminución del índice kappa
en los ensayos de deslignificación en los dos casos es semejante.
V. Conclusiones
V. CONCLUSIONES
En el presente trabajo se ha abordado la problemática surgida en ensayos de
deslignificación de pasta de papel con el sistema [SiW11MnIII(H2O)O39]5-/O2, en donde era
imposible la reutilización del polioxometalato en sistemas multietapas ya que el POM después
del ensayo de deslignificación se encontraba en un estado de oxidación predominantemente
reducido. Para esto, se ha probado una enzima, la peroxidasa versátil del hongo Pleurotus
eryngii, que se creía capaz de reoxidar el polioxometalato ya que es una enzima que oxida del
manganeso. Se ha conseguido hacer frente a este problema con la utilización de dicha enzima,
pues de hecho se verificó que reoxida el POM y además se consiguió optimizar la cinética de
oxidación de SiW11MnII para obtener una reoxidación completa, manteniéndose este grado de
reoxidación del POM cuando se implementó en los ensayos de deslignificación. La reoxidación
completa se consiguió en un intervalo de tiempo bastante pequeño lo que es de bastante interés
para la industria.
El siguiente paso a seguir es intentar implementar este sistema a gran escala y en
continuo, donde el POM pueda ser continuamente recirculado para otro reactor donde ocurra su
reoxidación, volviendo luego al de deslignificación y así sucesivamente.
28
VI. Referencias
VI. REFERENCIAS
[1] García J. A., Colom J. F. 1992. El proceso al sulfato: aspectos químicos de la cocción. Escuela técnica superior de ingenieros industriales de Terrassa. España. [2] http://www.aspapel.es/upload/historia.pdf [3] http://www.mtas.es/insht/encOIT/pdf/tomo3/72.pdf [4] http:// www.Tdx.Cesca.es/tesis-urv [5] Almeida J. C., Videira J. G. A industria da pasta para papel. Evolução recente e perspectivas. 1979. Lisboa, Portugal. [6] Bolé I. M. R. 1996. Modificação química dos polissacarídeos da madeira com iões inorgânicos. Tese de mestrado em engenharia de materiais. Aveiro, portugal. [7] http:// www.Asturtalla.Com/mno.htm [8] Rodrigues P. C. 2000. Comportamento da lenhina de Eucalyptus globulus durante o processo de deslenhificação kraft. Aveiro, Portugal. [9] Parhan A., Gray R. L. 1990. The practical identification of wood pulp fibers. Tappi press. USA. [10] Stevens C. F. B., Kocurek M. J. 1983. Pulp and paper manufacture: properties of fibrous raw materials and their preparation for pulping. Technical section Canadian Pulp and Paper Association. USA. [11] http://www.tdx.cesca.es/tesis_upc/available/TDX_0325103-125233/11Brv11de20.pdf [12] Aparecida M. L. 2001. Produção de polpa celulósica a partir do engaço da bananeira. Dissertação apresentada à Escola Superior de Agricultura “Luis queiroz”, Universidade de São Paulo, para obtenção do titulo de mestre em ciências. [13] Freire C. S. R. 2003. Eucalyptus globulus low molecular weight organic compounds: behaviour during wood kraft pulping and pulp bleaching. Aveiro, Portugal. [14] García O. 2003. Utilización de fibras de lino en la fabricación de papel. Nuevas secuencias de blanqueo y aplicación de sistemas enzimáticos. Tesis Doctoral, Universidad Politécnica de Cataluña, España. [15] Lin S., Dence C. 1992. Methods in lignin Chemistry. Springer-Verlag. New York. [16] Sjöström E. 1993. Wood chemistry: Fundamentals and applications. Academis press, INC.New York.
29
VI. Referencias
[17] Duarte A. C. P. 1991. Estudo da composição química dos extractivos de Eucalyptus globulus. Universidade da Beira Interior. Covilhã, Portugal. [18] http://www.geocities.Yahoo.Com.Br/gpechp/biocarvão.Htm [19] McDonald R. G. 1970. Pulp and paper manufacture. Vol. II, Chap. 4, McGraw-Hill, New York [20] Gamelas J. A. F., Pontes A. S. N., Evtuguin D. V., Xavier A. M. R. B., Esculcas A. P. 2007. New polyoxometalete-laccase integrated sistem for kraft pulp delignification. Biochemical Engineering Journal. 33, 141-147. [21] Pope M. T. Springer Verlag. 1983. Heteropoly and Isopoly Oxometalates. Inorganic Chemistry concepts. V 8. Berlin. [22] Weinstock I. A., Atalla R.H., Reiner R. S., Moen M.A. Hammel K. E., Houtman C. J., Hill C. L., Harrup M. K. 1997. A new wnvironmentally bening technology for transforming wood pulp into paper. Engineering polyoxometalates as catalysts for multiple processes. Journal of Molecular Catalysis A: Chemical. 116, 59-84. [23] Gamelas J. A. F., Cavaleiro A., Santos I., Balula M. 2003. Os polioxometalatos. Do anião de Keggin às nanocápsulas. Boletim da Sociedade Portuguesa de Química. 90, 45-51. [24] Gaspar A. R., Gamelas J. A. F., Evtuguin D. V., Pasocal Neto C. 2007. Alternatives for lignocellulosic pulp delignification using polyoxometalates and oxygen: a review. Green Chemistry. 9, 717-730. [25] Evtuguin D. V. 2006. Highly selective oxygen delignification process under acidic conditions. Summary of reviewing lecture. University of Aveiro. Portugal. [26] Jonas E. 2002. Polyoxometalates as bleach catalysts. Évfolyam. 6, 222-227. [27] Tavares A. P. M., Gamelas J. A. F., Gaspar A. R., Evtuguin D. V., Xavier A. M. R. B. 2004. A novel approach for the oxidative catalysis employing polyoxometalate-laccase system: application to the oxigen bleaching of kraft pulp. Catalysis Communications. 5, 485-489. [28] Gamelas J. A. F., Tavares A. P. M., Evtuguin D. V., Xavier A. M. R. B. 2005. Oxygen bleaching of kraft pulp with polyoxometalates and laccase applying a novel multi-stage process. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 33, 57-64. [29] Norma TAPPI T 236cm-85. [30] Norma SCAN-CM 15:85. [31] Göran G., Liebing L. 1996. An HPLC method for the quantitative determination of hexenuronic acid groups in chemical pulps. Carbohydrate Research. 294, 41-51.
30
VI. Referencias
31
[32] Norma Finlandesa TYÖOHJE C/6 15/07/98. [33] Neto S. L. 2006. Enzimas ligninolíticas produzidas por Psilocybe castanella CCB444 em solo contaminado com hexaclorobenzeno. Tesis Doctoral. Sao Paulo. Brazil. [34] Pérez M. 2003. Expresión heteróloga y estudios estructura-función de una nueva peroxidasa versátil de Pleorotus eryngii. Tesis Doctoral. Madrid. España. [35] Ruiz F. J. 1998. Caracterización molecular de un nuevo tipo de peroxidasa ligninolítica. Tesis Doctoral. Madrid. España.
VII. Anexos
VII. ANEXOS
Anexo 1. Peso de pasta ideal (c/ ≈ 7,5% humedad) para la determinación del índice kappa. Adaptado de un documento realizado por Armindo Gaspar.
IK peso ideal/g peso seco/g 70,0 0,190 0,176 65,0 0,204 0,189 60,0 0,221 0,205 55,0 0,242 0,224 50,0 0,266 0,246 45,0 0,295 0,273 40,0 0,332 0,308 35,0 0,380 0,351 30,0 0,443 0,410 25,0 0,531 0,492 20,0 0,664 0,615 19,0 0,699 0,647 18,0 0,738 0,683 17,0 0,781 0,724 16,0 0,830 0,769 15,0 0,886 0,820 14,0 0,949 0,879 13,0 1,022 0,946 12,0 1,107 1,025 11,0 1,208 1,118 10,0 1,328 1,230 9,0 1,476 1,367 8,0 1,661 1,538 7,0 1,898 1,757 6,0 2,214 2,050 5,0 2,657 2,460 4,0 3,321 3,705 3,0 4,428 4,100 2,0 6,642 6,150 1,0 13,284 12,300
32
VII. Anexos
Anexo 2. Factores f de corrección del consumo de permanganato usado en la determinación del índice kappa. [29].
f+ 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 30 0,958 0,960 0,962 0,964 0,966 0,968 0,970 0,973 0,975 0,99740 0,979 0,981 0,983 0,985 0,987 0,989 0,991 0,994 0,996 0,99850 1,000 1,002 1,004 1,006 1,099 1,011 1,013 1,015 1,017 1,01960 1,002 1,024 1,026 1,028 1,030 1,033 1,035 1,037 1,039 1,04270 1,004
33
VII. Anexos
Anexo 3. Peso de pasta ideal (c/ ≈ 7,5% humedad) para la determinación de la viscosidad intrínseca. Adaptado de un documento realizado por Armindo Gaspar.
Volumen del frasco/ml Viscosidad 56 58 61
1400 0,129 0,134 0,1411350 0,134 0,139 0,1461300 0,139 0,144 0,1521250 0,145 0,150 0,1581200 0,151 0,156 0,1651150 0,158 0,163 0,1721100 0,165 0,171 0,1791050 0,173 0,179 0,1881000 0,181 0,188 0,197950 0,191 0,198 0,208900 0,201 0,209 0,219850 0,213 0,221 0,232800 0,227 0,235 0,247750 0,242 0,250 0,263700 0,259 0,268 0,282
34
VII. Anexos
Anexo 4. Valores del producto [η]C para diferentes valores de ηrel [30].
0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,091,0 0,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,049 0,059 0,069 0,078 0,0881,1 0,097 0,107 0,116 0,125 0,134 0,144 0,153 0,162 1,171 0,1801,2 0,189 0,198 0,207 0,216 0,224 0,233 0,242 0,250 0,259 0,2681,3 0,276 0,285 0,293 0,302 0,310 0,318 0,326 0,335 0,343 0,3511,4 0,359 0,367 0,375 0,383 0,391 0,399 0,407 0,415 0,423 0,4311,5 0,438 0,446 0,454 0,462 0,469 0,477 0,484 0,492 0,499 0,5071,6 0,514 0,522 0,529 0,537 0,544 0,551 0,558 0,566 0,573 0,5801,7 0,587 0,594 0,601 0,608 0,615 0,622 0,629 0,636 0,643 0,6501,8 0,657 0,664 0,671 0,678 0,684 0,691 0,698 0,705 0,711 0,7181,9 0,725 0,731 0,738 0,744 0,751 0,757 0,764 0,770 0,777 0,783
2,0 0,790 0,796 0,802 0,809 0,815 0,821 0,827 0,834 0,840 0,8462,1 0,852 0,858 0,865 0,871 0,877 0,883 0,889 0,895 0,901 0,9072,2 0,913 0,919 0,925 0,931 0,937 0,943 0,949 0,954 0,960 0,9662,3 0,972 0,978 0,983 0,989 0,995 1,001 1,006 1,012 1,018 1,0232,4 1,029 1,035 1,040 1,046 1,051 1,057 1,062 1,068 1,073 1,0792,5 1,084 1,090 1,095 1,101 1,106 1,111 1,117 1,122 1,127 1,1332,6 1,138 1,143 1,149 1,154 1,159 1,164 1,170 1,175 1,180 1,1852,7 1,190 1,196 1,201 1,206 1,211 1,216 1,221 1,226 1,231 1,2362,8 1,241 1,246 1,251 1,256 1,261 1,266 1,271 1,276 1,281 1,2862,9 1,291 1,296 1,301 1,306 1,310 1,316 1,320 1,325 1,330 1,335
3,0 1,339 1,344 1,349 1,354 1,358 1,363 1,368 1,373 1,377 1,3823,1 1,387 1,391 1,396 1,401 1,405 1,410 1,414 1,419 1,424 1,4283,2 1,433 1,437 1,442 1,446 1,451 1,455 1,460 1,464 1,469 1,4733,3 1,478 1,482 1,487 1,491 1,496 1,500 1,504 1,509 1,513 1,5173,4 1,522 1,526 1,531 1,535 1,539 1,544 1,548 1,552 1,556 1,5613,5 1,565 1,569 1,573 1,578 1,582 1,586 1,590 1,595 1,599 1,6033,6 1,607 1,611 1,615 1,620 1,624 1,628 1,632 1,636 1,640 1,6443,7 1,648 1,653 1,657 1,661 1,665 1,669 1,673 1,677 1,681 1,6853,8 1,689 1,693 1,697 1,701 1,705 1,709 1,713 1,717 1,721 1,7253,9 1,729 1,732 1,736 1,740 1,744 1,748 1,752 1,756 1,760 1,764
4,0 1,767 1,771 1,775 1,779 1,783 1,787 1,790 1,794 1,798 1,8024,1 1,806 1,809 1,813 1,817 1,821 1,824 1,828 1,832 1,836 1,8394,2 1,843 1,847 1,851 1,854 1,858 1,862 1,865 1,869 1,873 1,8764,3 1,880 1,884 1,887 1,891 1,894 1,898 1,902 1,905 1,909 1,9124,4 1,916 1,920 1,923 1,927 1,930 1,934 1,937 1,941 1,944 1,948
35
VII. Anexos
0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09
4,5 1,952 1,955 1,959 1,962 1,966 1,969 1,973 1,976 1,979 1,9834,6 1,986 1,990 1,993 1,997 2,000 2,004 2,007 2,010 2,014 2,0174,7 2,021 2,024 2,028 2,031 2,034 2,038 2,041 2,044 2,048 2,0514,8 2,054 2,058 2,061 2,064 2,068 2,071 2,074 2,078 2,081 2,0844,9 2,088 2,091 2,094 2,098 2,101 2,104 2,107 2,111 2,114 2,117
5,0 2,120 2,124 2,127 2,130 2,133 2,137 2,140 2,143 2,146 2,1495,1 2,153 2,156 2,159 2,162 2,165 2,168 2,172 2,175 2,178 2,1815,2 2,184 2,187 2,191 2,194 2,197 2,200 2,203 2,206 2,209 2,2125,3 2,215 2,219 2,222 2,225 2,228 2,231 2,234 2,237 2,240 2,2435,4 2,246 2,249 2,252 2,255 2,258 2,261 2,264 2,267 2,270 2,2735,5 2,276 2,280 2,283 2,286 2,288 2,291 2,294 2,297 2,300 2,3035,6 2,306 2,309 2,312 2,315 2,318 2,321 2,324 2,327 2,330 2,3335,7 2,336 2,339 2,342 2,345 2,347 2,350 2,353 2,356 2,359 2,3625,8 2,365 2,368 2,371 2,374 2,376 2,379 2,382 2,385 2,388 2,3915,9 2,394 2,396 2,399 2,402 2,405 2,408 2,411 2,413 2,416 2,419
6,0 2,422 2,425 2,427 2,430 2,433 2,436 2,439 2,441 2,444 2,4476,1 2,450 2,452 2,455 2,458 2,461 2,463 2,466 2,469 2,472 2,4756,2 2,477 2,480 2,783 2,485 2,488 2,491 2,494 2,496 2,499 2,5026,3 2,504 2,507 2,510 2,512 2,515 2,518 2,521 2,523 2,526 2,5296,4 2,531 2,534 2,537 2,539 2,542 2,545 2,547 2,550 2,552 2,5556,5 2,558 2,560 2,563 2,566 2,568 2,571 2,573 2,576 2,579 2,5816,6 2,584 2,587 2,589 2,592 2,594 2,597 2,599 2,602 2,605 2,6076,7 2,610 2,612 2,615 2,617 2,620 2,623 2,625 2,628 2,630 2,6336,8 2,635 2,638 2,640 2,643 2,645 2,648 2,651 2,653 2,656 2,6596,9 2,661 2,663 2,666 2,668 2,671 2,673 2,676 2,678 2,681 2,683
7,0 2,686 2,688 2,690 2,693 2,695 2,698 2,700 2,703 2,705 2,7087,1 2,710 2,713 2,715 2,718 2,720 2,722 2,725 2,727 2,730 2,7327,2 2,735 2,737 2,739 2,742 2,744 2,747 2,749 2,752 2,754 2,7567,3 2,758 2,761 2,764 2,766 2,768 2,771 2,773 2,775 2,778 2,7807,4 2,783 2,785 2,787 2,790 2,792 2,794 2,797 2,799 2,801 2,8047,5 2,806 2,809 2,811 2,813 2,816 2,818 2,820 2,823 2,825 2,8277,6 2,829 2,832 2,834 2,836 2,839 2,841 2,843 2,846 2,848 2,8507,7 2,853 2,855 2,857 2,859 2,862 2,864 2,866 2,869 2,871 2,8737,8 2,875 2,878 2,880 2,882 2,885 2,887 2,889 2,891 2,894 2,8967,9 2,898 2,900 2,903 2,905 2,907 2,909 2,911 2,914 2,916 2,918
36
VII. Anexos
37
0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09
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