Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências da Saúde
Departamento de Ciências Farmacêuticas Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Desenvolvimento de processos de bioconjugação empregando pontos quânticos fluorescentes de
semicondutores II-VI
Aluízio Gonçalves Brasil Júnior
Recife-PE, Brasil Fevereiro, 2010
Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências da Saúde
Departamento de Ciências Farmacêuticas Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Desenvolvimento de processos de bioconjugação empregando pontos quânticos fluorescentes de
semicondutores II-VI
Aluízio Gonçalves Brasil Júnior (Bolsista FACEPE)
Orientadora: Profª. Dra. Beate Saegesser dos Santos
Có-orientadores: Profª. Dra. Adriana Fontes
Profª. Dra. Patrícia M. A. Farias
Recife-PE, Brasil Fevereiro, 2010
Dissertação apresentada ao ProgramaGraduação em Ciências Farmacêuticas como parte dos requisitos necessárioobtenção de título de mestre.
de Pós-da UFPE s para a
Brasil Júnior, Aluízio Gonçalves
Desenvolvimento de processos de bioconjugação empregando pontos quânticos fluorescentes de semicondutores II-VI / Aluízio Gonçalves Brasil Júnior . – Recife: O Autor, 2010.
99 folhas: il., tab., fig.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2010.
Inclui bibliografia, anexos e apêndices.
1. Pontos quânticos fluorescentes. 2. Fotoativação. 3. Albumina sérica bovina. 4. Carbodiimidas. 5. Glutaraldeído. I. Título.
615 CDU (2.ed.) UFPE
615.1
CDD (20.ed.) CCS2010-162
DEDICO ESTE TRABALHO
À minha noiva e futura esposa, Kilmara Higia Gomes Carvalho, por todo amor, estímulo, parceria e dedicação durante a realização deste trabalho.
À minha mãe, Alda Maria de Lima, pelas constantes demonstrações de amor, companheirismo, compreensão e pelos sábios ensinamentos.
Ao meu pai, Aluízio Gonçalves Brasil, que sempre será um referencial de homem na minha vida. Saudades.
AGRADECIMENTOS À Deus primeiramente, pelas contínuas bênçãos em minha vida. À minha noiva, pelo amor, compreensão e parceria durante o desenvolvimento do trabalho. À minha mãe, por todo carinho, amor e paciência. Ao meu pai, pelos sábios ensinamentos e carinho. À professora Beate pela amizade, confiança, ensinamentos, compreensão e paciência durante estes anos de orientação. Um agradecimento em especial, pois sem o seu apoio e dedicação este trabalho seria apenas uma perspectiva. Às professoras Adriana e Patrícia, pelos ensinamentos e discussões extremamente valiosos. À Juliana, Breno e Thiago, pela parceria e contribuição no trabalho desenvolvido. Aos colegas do laboratório Profº. Ricardo Ferreira: Claudilene, Denise, Rebeca, Thiago, Breno, João Paulo, Clayton, Rayana, Rafael, Cida, Clarissa, Fabrício, Tony, Ana Célia, Aline, Paulo, Cauêh, Diego. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas: Coordenador, Vice-coordenadora, professores e secretárias Conceição, Margareth e Rosa por toda atenção e dedicação. Ao grupo de Polímeros Não-Convencionais, do Departamento de Física: em especial à Clécio pelos espectros de emissão. À João Carlos do laboratório de Microscopia-DF, pelas análises de DRX. À Marcelo da UECE pela colaboração e ensinamentos. Ao grupo do CETENE: Adriana, Eduardo, Edwin, Lucas e Regivaldo. À FACEPE pelo auxílio financeiro. A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a elaboração deste trabalho. Obrigado a todos!
RESUMO
A pouco mais de uma década surgiu uma nova classe de marcadores
fluorescentes baseados em nanocristais de semicondutores do tipo II-VI conhecidos
como pontos quânticos (quantum dots). Neste trabalho, apresentam-se
metodologias de obtenção de pontos quânticos fluorescentes de semicondutores do
tipo core/shell de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 através de técnicas de química coloidal
em meio aquoso. O tamanho médio dos nanocristais (ZnSe = 3 nm e CdS = 6 nm)
foi estimado utilizando-se as técnicas de espectroscopia de absorção na região do
ultravioleta-visível, microscopia eletrônica de transmissão convencional e pela
técnica de difração de Raios-X. A caracterização das propriedades ópticas foi
realizada empregando-se espectroscopia de emissão e excitação eletrônica. Os
sistemas apresentam alta intensidade de luminescência com máximos observados
na região do azul para o ZnSe/ZnS e do verde para o CdS/Cd(OH)2. Para otimização
de sua emissão os pontos quânticos de ZnSe/ZnS foram submetidos a processo de
fotoativação, com radiação ultravioleta. Ambos sistemas foram bioconjugados à
proteína albumina sérica bovina (BSA), empregando-se agentes de comprimento
zero (carbodiimidas) para os pontos quânticos de ZnSe/ZnS e o crosslinker
glutaraldeído para o CdS/Cd(OH)2. Foram desenvolvidos e avaliados protocolos de
bioconjugação para os dois pontos quânticos, a fim de se estabelecer os mais
eficazes. Os bioconjugados foram caracterizados através de técnicas
espectroscópicas e confirmados pela detecção quantitativa da intensidade de
fluorescência, empregando-se microplacas de poliestireno como substrato. Foi
evidenciado por meio da técnica de dicroísmo circular, que a estrutura secundária da
proteína foi preservada. Os espectros de luz polarizada da biomolécula conjugada
aos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2, apresentaram alterações mínimas em
relação ao padrão não conjugado, enquanto que os conjugados aos pontos
quânticos de ZnSe/ZnS exibiram alterações estruturais significativas. Os
bioconjugados obtidos podem ser considerados protótipos na preparação de
imunocomplexos baseados em ligantes bioespecíficos, visando o desenvolvimento
de imunoensaios heterogêneos para o diagnóstico sorológico de doenças.
Palavras-chaves: pontos quânticos fluorescentes, fotoativação, albumina sérica
bovina, carbodiimidas, glutaraldeído, imunoensaios.
ABSTRACT
A few years ago, a new class of fluorescent biolabels based on semiconductor
nanocrystals of type II-VI known as quantum dots (QDs). In this work, methods were
presented for obtaining QDs type core/shell of ZnSe/ZnS and CdS/Cd(OH)2 by colloid
chemistry techniques in aqueous media. The nanocrystals average size (ZnSe = 3
nm and CdS = 6 nm) was estimated using absorption spectroscopy in the ultraviolet-
visible, conventional transmission electronic microscopy and X-Ray diffraction
techniques. The electronic excitation and emission spectroscopy were collected to
investigate the optical properties. The systems showed high intensity of
luminescence with maximum in blue and green regions to ZnSe/ZnS and
CdS/Cd(OH)2, respectively. QDs of ZnSe/ZnS were submitted a photoactivation
process with ultraviolet radiation to optimize their emission. Both systems were
bioconjugated to the protein bovine serum albumin (BSA), using zero-length agent
(carbodiimide) for ZnSe/ZnS and glutaraldehyde crosslinker for CdS/Cd(OH)2.
Bioconjugation protocols were developed and evaluated for these QDs, in order to
establish the most effective. The bioconjugates were characterized by spectroscopic
techniques and confirmed by quantitative detection of fluorescence intensity, using
microplates as substrate. It was shown that the secondary structure of the protein
was preserved by circular dichroism technique. The polarized light spectra of
biomolecule to QDs of CdS/Cd(OH)2 conjugated showed minimal changes compared
to unconjugated reference, while the QDs of ZnSe/ZnS conjugate exhibited
significant structural changes. The bioconjugate obtained can be considered
prototypes in the preparation of immunocomplex based on biospecific ligand, for the
development of heterogeneous immunoassays for serological diagnosis of diseases.
Keywords: Quantum Dots, photoactivation, bovine serum albumin, carbodiimides,
glutaraldehyde, immunoassays.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BV Banda de valência
BC Banda de condução
Eg Band gap
NPs Nanopartículas fluorescentes de materiais semicondutores
DCC N,N’-diciclohexilcarbodiimida
EDC / EDAC [Cloreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropril) carbodiimida]
Sulfo-NHS N-hidroxisuccinamida sulfonada
CdS/Cd(OH)2 Sulfeto de Cádmio/Hidróxido de Cádmio
ZnSe/ZnS Seleneto de Zinco/Sulfeto de Zinco
Cd(ClO4)2 Perclorato de cádmio
H2S Gás sulfídrico
(NaPO3) n Polifosfato de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
UV Ultravioleta
DRX Difração de Raios-X
MET Microscopia eletrônica de transmissão
Å Angstrom
λ Comprimento de onda
CdTe Telureto de Cádmio
AMA Ácido mercaptoacético
AMP Ácido 3-mercaptopropiônico
ZnSO4 Sulfato de zinco
Seº Selênio elementar
NaBH4 Borohidreto de sódio
BSA Bovine serum albumin
MES Ácido 4-Morfolino etanossulfônico
PBS Phosphate buffer saline
Tris Tris(hidroximetil)aminometano
PQ Pontos quânticos
D.P. Desvio padrão
C.V. Coeficiente de variação
Sulfo-SMCC Succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato sulfonado
DC Dicroismo circular
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 - Fluoróforo convencional (Alexa 488) marcando filamentos de actina, sofrendo completa fotodegradação em aproximadamente 120s. Diferentemente o núcleo marcado por pontos quânticos, mantém a fluorescência na ordem de algumas horas...........................................................................................................19
Figura 1.2 – Representação esquemática de um éxciton ligado formado num material semicondutor...............................................................................................20
Figura 1.3 - Emissão de suspensões coloidais de CdSe/ZnS com diferentes diâmetros, excitadas em 365 nm..............................................................................21
Figura 1.4 – Esquema representativo de um Croslinker homobifuncional........................................................................................................24
Figura 1.5 – Esquema representativo de uma molécula de glutaraldeído e do seu polímero insaturado...................................................................................................25
Figura 1.6 – Estrutura da DCC (N,N’ -diciclohexilcarbodiimida)...............................27
Figura 1.7– EDC reage com um ácido carboxílico formando o intermediário reativo. Na presença de um nucleófilo a ligação amida é formada, com liberação da isouréia......................................................................................................................28
Figura 1.8 – Estrutura da EDC [Cloreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropril) carbodiimida].............................................................................................................28 Figura 1.9 – Estrutura da Sulfo-NHS (N-hydroxisulfosuccinimida)..........................29
Figura 3.1 - Esquema representativo da síntese e passivação das nanopartículas de CdS/Cd(OH)2.......................................................................................................37
Figura 3.2 - Representação esquemática do processo de passivação de nanopartículas de CdS empregando-se Cd(OH)2 ...................................................40
Figura 3.3 - Espectros de absorção das suspensões coloidais de CdS e CdS/Cd(OH)2............................................................................................................41
Figura 3.4 - Espectros normalizados de emissão (λexc=365 nm) e excitação (λem = 496 nm) de uma suspensão coloidal de CdS/Cd(OH)2 ............................................42
Figura 3.5 – Difratograma do pó de uma amostra de pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2 e a estrutura cúbica tipo blenda de zinco..........................................43 Figura 3.6 – Imagem representativa de NPs de CdS/Cd(OH)2 (parte mais elétron densa da imagem) obtida através de MET .............................................................44
Figura 4.1 – Coloração característica do selênio reduzido formando um complexo coloridoNa-Te-Te-Na ..............................................................................................49
Figura 4.2 – Alteração da coloração após processo de nucleação das NPs..........................................................................................................................49
Figura 4.3 - Espectro de absorção de uma suspensão coloidal de ZnSe/ZnS..................................................................................................................52
Figura 4.4 - Espectro de emissão (λexc=365 nm) representativo de uma suspensão coloidal de ZnSe/ZnS...............................................................................................53
Figura 4.5 – Evolução temporal dos espectros de emissão (λexc=365 nm) de uma suspensão coloidal de ZnSe/ZnS empregada no experimento de fotoativação...............................................................................................................54
Figura 4.6 – Gráfico da evolução temporal dos espectros de emissão (λexc=365 nm) de uma suspensão coloidal de ZnSe/ZnS empregada no experimento de fotoativação...............................................................................................................55
Figura 4.7 – Fluorescência de uma amostra fotoativada durante 20 minutos.....................................................................................................................55
Figura 4.8 – Evolução temporal dos espectros de absorção de uma suspensão coloidal de ZnSe/ZnS empregada no experimento de fotoativação...............................................................................................................57
Figura 4.9 – Difratograma de Raios-X de pó de uma amostra de pontos quânticos ZnSe/ZnS..................................................................................................................58
Figura 4.10 – Microscopia eletrônica de transmissão representativa de NPs de ZnSe/ZnS (regiões mais elétron densas da imagem)...............................................59
Figura 5.1 - Estrutura clássica da albumina sérica...................................................62
Figura 5.2 – Microplaca negra de poliestireno.........................................................64
Figura 5.3 – Equipamento VICTOR 2 WALLAC 1420.............................................67
Figura 5.4 – Esquema reacional do EDC e Sulfo-NHS com os grupamentos carboxilatos presentes nas nanopartículas de ZnSe/ZnS........................................69
Figura 5.5 - Corrida em gel de agarose 2% do padrão de BSA e dos bioconjugados formados entre os pontos quânticos e as moléculas da proteína. Amostras coradas em azul de coumassie..............................................................................................70
Figura 5.6 – Esquema do processo de interação da BSA-ponto quântico e a placa de poliestireno..........................................................................................................71
Figura 5.7 – Comparativo entre as emissões, antes e após o processo de bioconjugação. Amostras excitadas em 365 nm.....................................................73
Figura 5.8 – Espectro de dicroísmo circular de uma solução aquosa de BSA na concentração de 1mg/mL........................................................................................75
Figura 5.9 – Espectro de dicroísmo circular de um bioconjugado formado entre as NPs de ZnSe/ZnS e a BSA.......................................................................................75
Figura 5.10 – Espectro de dicroísmo circular de um controle (todos reagentes exceto as NPs) com a BSA na concentração de 1mg/mL........................................76
Figura 5.11 – Esquema reacional do acoplamento entre a BSA e o glutaraldeído..77
Figura 5.12 – Comparativo entre as emissões, antes e após o processo de bioconjugação. Amostras excitadas em 365 nm.......................................................78
Figura 5.13 – Espectro de dicroísmo circular de um controle com a BSA na concentração de 1mg/mL e a amostra bioconjugada via crosslinker.......................79
LISTA DE TABELAS Tabela 5.1 – Resultados da análise de bioconjugação por detecção quantitativa de fluorescência, empregando-se o filtro de excitação F355 nm (± 40 nm) e o filtro de emissão F535 nm (± 25 nm)....................................................................72
Tabela 5.2 – Resultados da análise de bioconjugação por detecção quantitativa de fluorescência, empregando-se o filtro de excitação F355 nm (± 40 nm) e o filtro de emissão F420 nm (± 10 nm)....................................................................73
Tabela 5.3 – Resultados da análise de bioconjugação por detecção quantitativa de fluorescência, empregando-se o filtro de excitação F355 nm (± 40 nm) e o filtro de emissão F535 nm (± 25 nm)....................................................................78
SUMÁRIO Capítulo 1: Introdução............................................................................................15
1.1 Introdução...........................................................................................................16
1.2 Semicondutores .................................................................................................17
1.3 Pontos Quânticos................................................................................................18
1.4 Bioconjugação.....................................................................................................22
1.4.1 Crosslinkers......................................................................................................23
1.4.2 Glutaraldeído....................................................................................................25
1.4.3 Agentes de Comprimento Zero........................................................................25
1.4.4 Emprego de Carbodiimidas..............................................................................26
1.5 Apresentação da dissertação..............................................................................29
Capítulo 2: Objetivos..............................................................................................31
2.1 Objetivos gerais..................................................................................................32
2.2 Objetivos específicos..........................................................................................32
Capítulo 3: Síntese, funcionalização e caracterização de suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2 ......................................................................................................33
3.1 Introdução...........................................................................................................34
3.2 Procedimentos experimentais.............................................................................35
3.2.1 Reagentes empregados...................................................................................35
3.2.2 Metodologia de síntese das NPs de CdS/Cd(OH)2..........................................35
3.2.3 Caracterização óptica e estrutural....................................................................37
3.3 Resultados e discussão......................................................................................39
3.3.1 Síntese e passivação dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2........................39
3.3.2 Caracterização óptica dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2........................40
3.3.3 Caracterização estrutural dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2..................43
Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS.................................................................................................................45
4.1 Introdução.......................................................................................................... 46
4.2 Procedimentos experimentais.............................................................................47
4.2.1 Reagentes empregados...................................................................................47
4.2.2 Metodologia de síntese das NPs de ZnSe/ZnS...............................................48
4.2.3 Experimento de fotoativação............................................................................50
4.2.4 Caracterização óptica e estrutural....................................................................50
4.3 Resultados e discussão......................................................................................51
4.3.1 Síntese, passivação e funcionalização dos pontos quânticos de ZnSe/ZnS...51
4.3.2 Caracterização óptica dos pontos quânticos de ZnSe/ZnS.............................52
4.3.3 Caracterização estrutural dos pontos quânticos deZnSe/ZnS.........................58
Capítulo 5: Bioconjugação dos pontos quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com albumina sérica bovina (BSA).......................................................................60
5.1 Introdução...........................................................................................................61
5.2 Bioconjugação dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2......................................62
5.2.1 Emprego de reagentes de comprimento zero..................................................62
5.2.2 Procedimentos experimentais..........................................................................62
5.2.2.1 Reagentes empregados................................................................................62
5.2.2.2 Protocolo desenvolvido.................................................................................63
5.2.3 Emprego do crosslinker homobifuncional glutaraldeído..................................64
5.2.4 Procedimentos experimentais..........................................................................64
5.2.4.1 Reagentes empregados................................................................................64
5.2.4.2 Protocolo desenvolvido.................................................................................65
5.3 Bioconjugação dos pontos quânticos de ZnSe/ZnS............................................66
5.3.1 Emprego de agentes de comprimento zero.....................................................66
5.3.2 Procedimentos experimentais..........................................................................66
5.3.2.1 Reagentes empregados................................................................................66
5.3.2.2 Protocolo desenvolvido.................................................................................66
5.4 Caracterização dos bioconjugados de CdS/Cd(OH)2-BSA e ZnSe/ZnS-BSA....67
5.5 Resultados e Discussão......................................................................................68
5.5.2 Bioconjugação via agentes de comprimento zero............................................68
5.5.3 Bioconjugação via crosslinker homobifuncional...............................................77
Capítulo 6: Conclusões e perspectivas................................................................81
6.1 Conclusões..........................................................................................................82
6.2 Perspectivas........................................................................................................83
Referências..............................................................................................................84
Anexos......................................................................................................................87
Anexo A Mapa de intensidade da câmara de Fotoestabilidade................................88
Apêndice..................................................................................................................89
Apêndice A - Cálculo teórico da estimativa do diâmetro médio das nanopartículas de CdS/Cd(OH)2.............................................................................................................90
Apêndice B - Estimativa da quantidade de NPs/mL da Suspensão de CdS/Cd(OH)2 ..................................................................................................................................92
Apêndice C - Cálculo teórico da estimativa do diâmetro médio das nanopartículas de ZnSe/ZnS ............................................................................................................95
Apêndice D - Estimativa da quantidade de NPs/mL ................................................97
Capítulo 1
Introdução
Capítulo 1 - Introdução
16
1.1 – Introdução
Atualmente, diversos grupos de pesquisa tem empreendido esforços
voltados para o desenvolvimento e aprimoramento de tecnologias biomédicas,
em especial métodos diagnósticos. Neste contexto, materiais
nanoestruturados, entre eles os pontos quânticos (PQ), apresentam
perspectivas promissoras para esta finalidade.
Comparados aos fluoróforos orgânicos convencionais, os PQs possuem
algumas características vantajosas. Além disso, estes materiais inorgânicos
fluorescentes podem ser empregados para detecção de sinais, geração de
imagens, dentre outras aplicações. Contudo, faz-se necessário a inserção de
grupamentos químicos que os tornem compatíveis com moléculas de origem
biológica. Esta compatibilidade possibilita o acoplamento entre as
nanopartículas inorgânicas (NPs) e o biomaterial, por meio do emprego de
metodologias de bioconjugação.
Neste sentido, o presente trabalho apresenta os PQs de CdS/Cd(OH)2 e
ZnSe/ZnS dispersos em meio aquoso visando aplicações biológicas, como
alternativas simples, eficazes e de baixo custo. Para tanto, protocolos de
bioconjugação foram estabelecidos, empregando-se a albumina sérica bovina
(BSA) como sistema modelo.
Como perspectiva, a utilização destes PQs em futuros ensaios com
imunoglobulinas, permitirão a aplicação destes bioconjugados em diagnósticos
sorológicos, em especial para doenças tropicais e negligenciadas. Desta
maneira, os nanomarcadores desenvolvidos possibilitarão ao Brasil sua auto-
suficiência na produção de kits de diagnóstico.
Capítulo 1 - Introdução
17
1.2 – Semicondutores
Bandas de energia, originadas da natureza ondulatória dos elétrons (e-)
nos cristais, representam os estados eletrônicos dos materiais sólidos
cristalinos. O efeito do potencial periódico sobre a distribuição energética dos
elétrons livres promove a separação dos estados energéticos em bandas
permitidas e proibidas.
A diferença de energia que separa a banda de valência (BV) da banda
de condução (BC) é denominada de band gap (Eg). Quando os elétrons
passam da BV para a BC, deixam estados denominados de buracos na BV que
se comportam como portadores de carga elétrica positiva. A corrente elétrica é
produzida quando os e- da BC e os buracos na BV são submetidos a ação de
um campo externo que possibilita a mudança dos estados dos e-.
Existem várias bandas cheias com e- em um material cristalino no
estado fundamental (T = 0K), cujas propriedades de condução do cristal são
refletidas diretamente pelo preenchimento ou não da última banda. Assim,
quando a última banda está preenchida por completo, o material é isolante (Eg
>4 eV) e quando está parcialmente preenchida, o material é condutor. Contudo,
os materiais semicondutores apresentam condutividade significativa
intermediária entre a dos isolantes e dos condutores, devido os sólidos
cristalinos a T = 0 K, quando à temperatura ambiente, serem caracterizados
por uma Eg relativamente pequena de aproximadamente 3 eV ou inferior com
uma BV cheia e uma BC vazia 38.
Dentre os materiais semicondutores com propriedades elétricas e
ópticas de interesse, como compostos binários (IV-IV, III-V, II-VI), terciários e
quaternários, destaca-se os compostos binários do tipo II-VI que abrange os
pontos quânticos empregados no presente trabalho. Estes são constituídos
pelos elementos da família VIA (calcogênios) e IIB (metais de transição) da
tabela periódica 39.
Capítulo 1 - Introdução
18
1.3 – Pontos Quânticos
Pontos quânticos ou quantum dots são nanopartículas semicondutoras
tridimensionais, que possuem dimensões na faixa de 1 a 10 nm. Estes
materiais podem ser preparados por meio de técnicas de crescimento
controlado dos nanocristais (bottom up) em meio coloidal ou por redução das
dimensões (ablação) de um cristal pré-existente (top down). As dimensões
reduzidas conferem alterações significativas nas propriedades físico-químicas,
em comparação com o mesmo material em escala macroscópica. Alterações
das propriedades ópticas destes sistemas nanoestruturados são realizadas por
meio da manipulação do tamanho, estrutura e composição química1. A habilidade de alterar as propriedades ópticas destes materiais por
meio da manipulação de tamanho, se apresenta como fator decisivo em alguns
campos de aplicação. Basicamente, por esta razão, pontos quânticos vem
sendo empregados na produção de células solares, diodos e lasers,
detectores, em dispositivos de telecomunicação e mais recentemente como
biomarcadores fluorescentes1.
Desde que o uso de ligantes conjugados com estes biomarcadores foi
relatado nos trabalhos desenvolvidos por Alivisatos e Nie2,3, muitas aplicações
em ensaios bioanalíticos vem sendo realizadas. Esta nova classe de
marcadores apresenta uma série de vantagens frente ao fluoróforos
convencionais empregados em métodos de marcação celular e diagnóstico.
Dentre elas podemos destacar: (i) emissão em diversos comprimentos de onda
para um mesmo material, (ii) elevada fotoestabilidade; (iii) baixa citotoxidade;
(iv) alto deslocamento Stokes possibilitando que praticamente não se
empregue filtros para eliminar interferências da radiação de excitação (v)
marcação múltipla simultânea de diversos componentes e estruturas celulares
em células vivas ou fixadas, além do fato de que (vi) os resultados podem ser
obtidos com tempo de incubação da ordem de alguns minutos2.
Na Figura 1.1 é exiba a elevada fotoestabilidade dos pontos quânticos
em comparação com fluoróforos orgânicos convencionais, os quais possuem
rápida fotodegradação.
Capítulo 1 - Introdução 19
Figura 1.1 - Fluoróforo convencional (Alexa 488) marcando filamentos de actina, sofrendo
completa fotodegradação em aproximadamente 120s. Diferentemente o núcleo marcado por
pontos quânticos, mantém a fluorescência na ordem de algumas horas [Chan et al., 2002,
adaptado].
A elevada fluorescência na região visível do espectro eletromagnético,
possibilita a aplicação destes materiais em metodologias diagnosticas e
processos de marcação celular. Esta fluorescência é originada do processo de
recombinação excitônica, que ocorre devido o elevado confinamento quântico
destes cristais em dimensões nanométricas5.
Uma nanopartícula de semicondutor encontra-se em regime de
confinamento quântico , quando suas dimensões são reduzidas a ponto de a
diferença entre os valores de energia entre a BV e a BC, sejam próximos ou
menores do que as dimensões do raio de Bohr do seu éxciton6.
A BV que apresenta menor energia equivale aos orbitais ligantes,
enquanto que a BC equivale aos orbitais antiligantes, apresentando nível
energético superior. Em um sistema nanocristalino ideal, com poucos defeitos
em sua rede, as bandas são separadas energeticamente pela região proibida
(Eg), onde nenhum elétron de valência pode transitar. Esta região refere-se ao
valor mínimo de energia que se deve fornecer para que um elétron situado na
BV seja promovido a BC6,7.
Esta energia pode ser fornecida por processos que envolvam o aumento
da temperatura do sistema, ou por meio de uma radiação incidente. Quando os
processos anteriormente citados possuem uma quantidade de energia
suficiente para ultrapassar a barreira energética (Eg), os elétrons presentes nos
últimos níveis energéticos da BV são promovidos para a BC. O processo possibilita a formação de pares elétron-buraco (vacância),
gerando uma carga virtual (h+) na BV. Este buraco virtual (h+) possui carga
idêntica a do elétron, entretanto apresenta sinal oposto. O conjunto elétron-
Capítulo 1 - Introdução
20
buraco é chamado de éxciton, que possui existência vinculada as forças
coulômbianas fracas, formando um estado ligado8,9 (Figura 1.2).
Figura 1.2 Representação esquemática de um éxciton ligado formado num material
semicondutor.
O éxciton formado possui um tempo de vida muito curto, cerca de alguns
nanosegundos, acarretando em um processo de decaimento energético para a
BV (recombinação excitônica). O excesso de energia pode ser dissipado de
dois modos: pela vibração da rede cristalina, por meio da emissão de fônons
(decaimento não radiativo) e/ou pela emissão de fótons com energia inferior
aos da radiação incidente (decaimento radiativo). Este último processo
possibilita que as nanopartículas fluorescentes de materiais semicondutores
em regime de confinamento quântico apresentem fluorescência7,9.
A alteração das dimensões dos pontos quânticos formado por um
mesmo material permite que os sistemas nanoestruturados emitam
fluorescência em diferentes comprimentos de onda do espectro
eletromagnético visível10. Isto ocorre devido ao fato que as diferenças entre os
estados energéticos (Eg) presentes nas duas bandas, variam de acordo com o
tamanho da nanopartícula. Deste modo, quanto menor o tamanho da
nanopartícula, maior será a diferença de energia entre as bandas (Eg). Por isso
partículas menores tendem a fluorescer em regiões mais energéticas (próximas
ao azul), enquanto que as de dimensões maiores em geral exibem
fluorescência nas regiões menos energéticas, próximas ao vermelho (Figura
1.3).
Capítulo 1 - Introdução
21
quâ
org
des
Den
utili
inso
sist
sint
prin
aqu
que
seg
Figura 1.3 - Emissão de suspensões coloidais de CdSe/ZnS com diferentes diâmetros,
excitadas em 365 nm. (FORTINA et. al., 2005).
As primeiras metodologias empregadas na obtenção de pontos
nticos em meio coloidal, referem-se a processos de síntese em meio
anometálico. Entretanto, estas rotas sintéticas apresentam uma série de
vantagens frente as metodologia baseadas em química coloidal aquosa.
tre as desvantagens dos sistemas organometálicos, podemos citar:
zação de compostos pirofóricos, emprego de solventes orgânicos,
lubilidade em meio aquoso, custo elevado e incompatibilidade com
emas biológicos. Diante do que foi mencionado, o desenvolvimento de rotas
éticas em meio aquoso, surgiram como alternativas promissoras,
cipalmente em aplicações biológicas10,11.
Uma das etapas mais importante durante a obtenção das NPs em meio
oso, é o emprego de agentes funcionalizantes, pois os mesmos permitirão
o sistema inorgânico seja acoplado a uma biomolécula. Nas Seções a
uir serão detalhados o processo de bioconjugação dos pontos quânticos a
Capítulo 1 - Introdução
22
biomoléculas, bem como os agentes empregados durante as etapas de
bioacoplamento.
1.4 – Bioconjugação
Biomoléculas conjugadas ou modificadas têm sido empregadas com
êxito em processos de purificação, detecção ultra-sensível, localização de
componentes celulares específicos e no desenvolvimento de metodologias
diagnósticas12.
A bioconjugação envolve a ligação de duas ou mais moléculas,
formando um novo complexo que possui a combinação das propriedades de
seus componentes individuais. Moléculas de origem biológica podem ser
quimicamente ligadas a compostos de origem sintética, por diferentes
mecanismos de reação 4. Estas técnicas de bioconjugação podem ser empregadas não apenas
visando a formação de complexos, mas podem exercer a atividade de agentes
modificadores da estrutura nativa e das funções de peptídeos, proteínas,
açúcares, polissacarídeos, ácidos nucléicos, oligonucleotídeos, entre outros
3,4,12.
A associação química entre duas moléculas é intermediada por um
agente de ligação chamado comumente de crosslinker. O processo de
bioconjugação depende da capacidade do crosslinker empregado em interagir
com dois sistemas distintos, devendo apresentar afinidade química com os
grupamentos presentes no sistema de origem inorgânica ou orgânica e os
radicais da biomolécula12. Como exemplo, podemos citar o emprego de
carbodiimidas no processo de interação entre os grupamentos carboxilatos
presentes na superfície do ponto quântico e as aminas primárias oriundas de
uma molécula protéica.
É importante que durante o processo de bioconjugação, todas as etapas
sejam cuidadosamente planejadas e desenvolvidas para que não ocorram
desnaturações, modificações estruturais irreversíveis ou alterações químicas na
biomolécula empregada. Outro fator de extrema importância é a escolha do
Capítulo 1 - Introdução
23
crosslinker mais adequado para as condições reacionais e aplicação desejada,
bem como a definição da estequiometria reacional ideal 3,30.
O número de grupos-alvo (aminas, carboxilatos, tióis) presentes na
superfície da molécula biológica é essencial para que o processo ocorra de
modo eficaz. Quando os grupos-alvo estão prontamente disponíveis para a
conjugação, o processo reacional é otimizado. A quantidade de crosslinker
empregado (estequiometria reacional) está diretamente relacionada ao número
de grupamentos encontrados na superfície da biomolécula 12,30.
1.4.1 – Crosslinkers
Crosslinkers ou agentes de ligação cruzada possuem pelos menos dois
grupos reativos, os quais possibilitam a interação com uma grande diversidade
de grupamentos químicos presentes em biomoléculas ou nos mais variados
compostos sintéticos13. Estes reagentes promovem a formação de ligações
covalentes entre duas ou mais moléculas. Em geral, os crosslinkers se ligam
covalentemente a grupos funcionais como aminas primárias, carboxilatos e
sulfidrilas.
A grande maioria das moléculas de origem biológica possui ao menos
um destes grupos funcionais, o que acaba viabilizando a conjugação via
croslinkers. Esses reagentes são amplamente empregados no estudo da
estrutura e função protéica, na ancoragem de proteínas em fase sólida, na
preparação de imunógenos, imunotoxinas e na conjugação de biomoléculas a
sistemas inorgânicos como quantum dots 4,27,30.
Agentes de ligação cruzada podem ser divididos em dois grupos de
acordo com a similaridade dos seus grupos reativos:
• Homobifuncionais possuem dois grupamentos terminais idênticos;
• Heterobifuncionais possuem dois grupamentos terminais distintos.
Os homobifuncionais são utilizados em reações de conjugação que
possuem apenas uma ou duas etapas, enquanto que os heterofuncionais são
utilizados em reações de duas ou mais etapas.
Capítulo 1 - Introdução
24
O primeiro agente crosslinker empregado na modificação e conjugação
de macromoléculas consistia em um composto que apresentava dois
grupamentos terminais idênticos12. Como observado na Figura 1.4, os
reagentes homobifuncionais possuem uma cadeia carbônica simétrica que liga
os dois grupos terminais. Estes podem interagir covalentemente com os
radicais oriundos de moléculas biológicas ou compostos de origem
inorgânica/orgânica.
Figura 1.4 – Esquema representativo de um Croslinker homobifuncional.
Uma grande variedade de reagentes homobifuncionais surgiu durante os
últimos trinta anos. Atualmente, existem dezenas de crosslinkers disponíveis
comercialmente, os quais possuem os mais variados comprimentos de cadeia
carbônica e grupos reativos. Dentre eles podemos destacar: os ésteres da N-
hidroxisuccinamida, os imidoésteres, os derivados do difluorobenzeno e os
aldeídos 12.
A grande maioria das reações é realizada em condições de pH
fisiológico. Entretanto alguns crosslinkers só apresentam rendimento ideal em
meio levemente ácido ou alcalino. Para tanto são empregados tampões
específicos, visando a manutenção das condições ideais do processo reacional,
bem como a integridade da biomolécula. O agente homobifuncional glutaraldeído
é um bom exemplo11. Ele apresenta rendimento ideal apenas em meio
levemente alcalino (pH 8,0-8,5), sendo empregado como tampão o carbonato de
sódio.
Cadeia Carbônica
Grupo Reativo 1
Grupo Reativo 2
Grupos Reativos Idênticos
Capítulo 1 - Introdução
25
1.4.2 – Glutaraldeído
O glutaraldeído é o reagente homobifuncional mais empregado na
atualidade12. Apesar da sua simplicidade estrutural, este composto apresenta
uma série de possíveis mecanismos reacionais. Ele promove a formação de
bases de Schiff em reações com proteínas ou outros compostos aminados. O
glutaraldeído em soluções aquosas pode formar polímeros com pontos de
insaturação. Os polímeros insaturados α e β são extremamente reativos na
presença de agentes nucleófilos, especialmente aminas primárias 6,11,12,13,
Figura 1.5.
Figura 1.5 –insaturado.
A r
aminados
mecanism
elevada e
molecular,
Est
homobifun
de anticorp
1.4.3 – A
Os
reagentes
Esquema representativo de uma molécula de glutaraldeído e do seu polímero
eação com uma proteína resulta em alquilação dos grupamentos
disponíveis, promovendo a formação de ligações amida. Este
o reacional resulta em conjugados, proteína-glutaraldeído, de
stabilidade. Para minimizar a formação de polímeros de alto peso
em geral são adotados protocolos de duas etapas 12.
e aldeído tem sido amplamente utilizado como crosslinker
cional em aplicações biomédicas, especialmente para conjugações
os-enzimas e proteínas-quantum dots11.
gentes de Comprimento Zero
agentes de comprimento zero (zero-length crosslinkers) são
que promovem a ligação entre duas moléculas, sem formar um
Capítulo 1 - Introdução
26
composto adicional entre os dois sistemas12. Possibilitando que os
grupamentos químicos das duas moléculas sejam covalentemente ligados, sem
a formação de um ligante adicional ou espaçamento. Dentre eles, os mais
empregados em processos de bioconjugação são as carbodiimidas, as
hidroxisuccinimidas e as maleidoimidas.
Em algumas aplicações, é indesejável a presença de um composto
adicional entre as duas estruturas. Um exemplo é durante a preparação de
carreadores conjugados a haptenos, tendo como principal objetivo o
desenvolvimento de resposta imune à biomolécula ligada. Ocasionalmente, um
percentual dos anticorpos produzidos pode apresentar resposta imune ao
ligante (crosslinker) utilizado no procedimento de conjugação. Os agentes de
comprimento zero podem ser considerados uma alternativa frente aos ligantes
convencionais, pois eliminam consideravelmente este tipo de reatividade
cruzada, mediando uma ligação direta entre os dois compostos12,14.
Esses reagentes podem promover a formação de três tipos de ligações:
• Ligação amida via condensação de uma amina primária com um ácido
carboxílico;
• Obtenção de uma ligação fosforamidato intermediada pela reação entre um
grupo fosfato e uma amina primária;
• Aminação redutiva de uma amina primária ou secundária ligada a aldeído.
Portanto, o uso destes reagentes, possibilita que biomoléculas aminadas
sejam conjugadas a compostos que contenham grupamentos fosfatos ou
carboxilatos. Todas estas reações apresentam um bom rendimento,
dependendo exclusivamente do reagente empregado e da aplicação desejada,
podendo ser realizadas em meio aquoso ou orgânico 12,15,30.
1.4.4 Emprego de Carbodiimidas
As Carbodiimidas pertencem a uma classe de reagentes que são
capazes de promover a ativação de grupamentos carboxilatos ou fosfatos, os
quais podem interagir com aminas primárias presentes em inúmeros
Capítulo 1 - Introdução
27
compostos de origem biológica. Sem dúvida, elas são os agentes de
comprimento zero mais empregados em processos biotecnológicos, devido a
habilidade em formar conjugados entre duas proteínas, entre peptídeos e
proteínas, e entre uma biomolécula e um sistema inorgânico biocompatível12.
A utilização de carbodiimidas como mediadores em reações biológicas
de condensação é de considerável importância. John Sheehan recebeu o
prêmio Nobel por ser o primeiro pesquisador a conseguir a síntese total da
fenoximetil penicilina, empregando DCC (N,N’-diciclohexilcarbodiimida) no
fechamento do anel β-lactâmico14, Figura 1.6.
Figura 1.6 – Estrutura da DCC (N,N’-diciclohexilcarbodiimida).
Existem dois tipos básicos de carbodiimidas: as solúveis em meio
aquoso e as solúveis em meio orgânico. As hidrossolúveis são as mais
empregadas em conjugações de proteínas e demais macromoléculas de
origem biológica. Os subprodutos das reações que empregam as
carbodiimidas, principalmente as isouréias, apresentam boa solubilidade no
meio reacional, o que facilita o processo de purificação dos conjugados.
Carbodiimidas organossolúveis, são freqüentemente utilizadas em síntese
peptídica e na obtenção de conjugados envolvendo moléculas solúveis em
meio orgânico12,14.
As carbodiimidas são empregadas para mediar à formação de ligações
amida ou fosforamidato, por meio da interação de grupamentos carboxilatos ou
fosfatos com uma amina. Independentemente do tipo de carbodiimida utilizada,
a reação resulta na formação do intermediário reativo o-acilisouréia. Como
pode ser observado na Figura 1.7, este composto que apresenta elevada
reatividade, promove o ataque da amina nucleófila no grupamento carbonila do
éster formado, resultando na formação da ligação amida.
Capítulo 1 - Introdução
28
Figura 1.7presença (HERMANS
ED
o reagen
possuem
Figura
Atu
são os a
bioconjug
quantum
aumento
reação, F
– EDC reage com um ácido carboxílico formando o intermediário reativo. Na de um nucleófilo a ligação amida é formada, com liberação da isouréia ON, 2008, adaptada).
C ou EDAC [Cloreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropril) carbodiimida] é
te mais comumente utilizado na conjugação de compostos que
grupos carboxílicos e/ou aminas, Figura 1.8.
1.8 – Estrutura da EDC [Cloreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropril) carbodiimida].
almente, EDC e Sulfo-NHS (N-hydroxisulfosuccinimida) em conjunto,
gentes de comprimento zero mais empregados em processos de
ação que envolvem compostos inorgânicos biocompatíveis, tais como
dots e complexos de íons terras raras14. O Sulfo-NHS promove o
da solubilidade e estabilidade do intermediário reativo durante a
igura 1.9.
Capítulo 1 - Introdução
29
Figura 1.9 – Estrutura da
Estes agentes de acopla
meio aquoso, o que permite qu
solventes orgânicos. O bioconjug
removidos facilmente empregando
Ficou comprovado através
que a ativação dos grupamentos
faixa de pH 3,5-4,515, enquanto q
rendimento mais elevado na faixa
que quando proteínas e peptíde
amida mediada por EDC, apresen
no intervalo de 4,5 a 7,5. Quando
faixa preconizada, o processo de
rendimento12,14,15.
1.5 Apresentação da disser
Neste trabalho pretende-s
bioconjugação de materiais semic
os pontos quânticos de CdS/
bioacoplamento foram desenvolvid
sistema modelo.
No capítulo 2 serão desc
trabalho desenvolvido.
Sulfo-NHS (N-hydroxisulfosuccinimida)
mento apresentam elevada solubilidade em
e a reação se processe na ausência de
ado e os subprodutos formados podem ser
-se diálise ou filtração em gel.
dos estudos realizados por Nakajima e Ikada,
carboxilatos ocorre de modo mais efetivo na
ue a formação da ligação amida apresenta
de pH 4,0-6,0. Dados da literatura indicam
os são empregados, a formação da ligação
ta rendimento satisfatório com o pH do meio
o pH do meio reacional se encontra fora da
acoplamento ocorre lentamente e com baixo
tação
e enfatizar a síntese, caracterização e a
ondutores fluorescentes, mais precisamente
Cd(OH)2 e ZnSe/ZnS. Os processos de
os utilizando a albumina sérica bovina como
ritos os objetivos gerais e específicos do
Capítulo 1 - Introdução
30
No capítulo 3 serão apresentados a metodologia de síntese e
passivação dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2, a caracterização óptica e
estrutural, sendo finalizado pelos resultados e a discussão .
O capítulo 4 trata da síntese e caracterização estrutural e óptica das
suspensões coloidais de ZnSe/ZnS. É apresentado um estudo de fotoativação
destes pontos quânticos, visando o incremento da fluorescência do material.
Os processos de bioconjugação e a caracterização dos conjugados
formados entre os dois pontos quânticos estudados e a albumina sérica bovina,
são descritos no capítulo 5.
Por último, são apresentadas as conclusões do trabalho desenvolvido e
as perspectivas de melhorias do mesmo.
Capítulo 2
Objetivos
Capítulo 2: Objetivos
32
2.1 – Objetivos gerais
Este trabalho tem por objetivo desenvolver protocolos de bioconjugação
entre o sistema modelo empregado, a proteína albumina sérica bovina, e
nanopartículas fluorescentes de semicondutores do tipo II-VI de Sulfeto de
Cádmio/Hidróxido de Cádmio [CdS/Cd(OH)2] e Seleneto de Zinco/Sulfeto de
Zinco [ZnSe/ZnS], via agentes de comprimento zero e o crosslinker
glutaraldeído.
2.2 – Objetivos específicos
• Preparar as suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2 e ZnSe/ZnS, em meio
aquoso, empregando diferentes agentes estabilizantes e funcionalizantes.
• Realizar caracterização óptica e estrutural dos pontos quânticos
sintetizados;
• Avaliar o processo de fotoativação das nanopartículas de ZnSe/ZnS;
• Conjugar as nanopartículas de CdS/Cd(OH)2 e ZnSe/ZnS à albumina
sérica bovina, por meio do desenvolvimento de protocolos de
bioconjugação empregando agentes de comprimento zero e o crosslinker
homobifuncional glutaraldeído;
• Avaliar e caracterizar os bioconjugados obtidos pelo acoplamento dos
pontos quânticos a albumina sérica bovina.
Capítulo 3
Síntese, funcionalização e caracterização de
suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2
Capítulo 3 – Síntese, funcionalização e caracterização de suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2
34
3.1 – Introdução
O sulfeto de cádmio (CdS) é um semicondutor binário do tipo II-VI, que
apresenta Eg= 2,5 eV. O processo de obtenção de nanopartículas deste
semicondutor em meio aquoso é realizado de modo simples, sendo
previamente estabelecido na literatura e implantado no nosso grupo de
pesquisa. Estas nanopartículas, sob condições ideais de síntese, apresentam
fluorescência na região visível do espectro eletromagnético, possibilitando o
seu emprego como marcadores biológicos fluorescentes16. Neste capítulo é descrita a metodologia de obtenção de NPs de
CdS/Cd(OH)2 dispersas em meio aquoso. Os pontos quânticos foram
preparados por meio de técnicas coloidais, conhecidas como bottom-up, com
utilização de precursores hidrossolúveis.
O composto polifosfato de sódio foi escolhido como agente estabilizante
das NPs dispersas em meio aquoso. Este polímero inorgânico é constituído
pela repetição de vários ânions PO3- ligados em cadeia. Estas cadeias se ligam
eletrostaticamente aos cátions de cádmio presentes na superfície do quantum
dot, resultando na formação de uma camada de carga residual negativa11,16.
Durante o processo de preparação das NPs de CdS/Cd(OH)2 devem ser
observados vários fatores que contribuem diretamente na obtenção de
sistemas coloidais estáveis. Dentre eles podemos citar: o grau de pureza e a
concentração inicial dos precursores empregados durante o processo
reacional, o tipo e a proporção do agente estabilizante utilizado, a duração do
processo de síntese, a temperatura, o pH e a força iônica do meio reacional.
Estes fatores influenciam consideravelmente no tamanho médio, morfologia,
cristalinidade e dispersão de tamanho dos pontos quânticos obtidos.
Capítulo 3 – Síntese, funcionalização e caracterização de suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2
35
3.2 – Procedimentos experimentais:
3.2.1 – Reagentes empregados: Foram utilizados durante o processo de obtenção das nanopartículas de
CdS/Cd(OH)2, os seguintes reagentes:
• Perclorato de cádmio [Cd(ClO4)2] – 99% -Sigma-Aldrich;
• Gás sulfídrico (H2S) - 98% - White Martins;
• Polifosfato de sódio [(NaPO3) n]- Puro 65+% - Riedel de Haën;
• Hidróxido de sódio (NaOH) – Min. 98% - Vetec;
• Água ultra-pura deionizada.
3.2.2 – Metodologia de síntese das NPs de CdS/Cd(OH)2
A metodologia de obtenção das NPs de CdS/Cd(OH)2 empregada neste
trabalho, é uma adaptação do processo original desenvolvido por Weller e
colaboradores17,18. Santos (2002) realizou algumas modificações do processo
original durante o desenvolvimento do seu trabalho de tese, viabilizando a
aplicação destas nanopartículas em marcação de sistemas biológicos16.
Empregou-se como precursores das NPs o perclorato de cádmio
[Cd(ClO4)2] e o gás sulfídrico (H2S), o polifosfato de sódio [(NaPO3)n] como
agente estabilizante do colóide e a água ultra-pura deionizada como fase
dispersante.
Realizou-se a síntese das nanopartículas de CdS/Cd(OH)2 a partir de
uma solução contendo 96 mL de água ultra-pura deionizada, 2,5mL (2,5 x 10-5
mol) da solução de Cd(ClO4)2 0,01M - fonte precursora do íon Cd2+ - e 2,0 mL
(1,0 x 10-3 mol) de uma solução do agente estabilizante polifosfato de sódio na
concentração de 0,0051g/mL. O pH da solução obtida foi elevado para
aproximadamente 8,5, empregando-se solução de NaOH 0,01M. Este valor de
pH foi previamente estabelecido por Santos em seus estudos, com a finalidade
que as NPs apresentem fluorescência na região do verde do espectro visível
(~500 nm) após passivação. Posteriormente, o sistema foi fechado com
Capítulo 3 – Síntese, funcionalização e caracterização de suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2
36
emprego de um septum de borracha e a ele adicionada uma alíquota de 750 µL
de gás sulfídrico (H2S), equivalente a 2,5 x 10-5 mol de S2-, com auxilio de uma
seringa especial para gases. Agitou-se vigorosamente o balão por cerca de 10
minutos à temperatura ambiente. Durante a agitação, visualizou-se a mudança
da coloração da suspensão de incolor para amarelo, indicativa da formação
das nanopartículas de sulfeto de cádmio. A proporção entre os íons Cd2+ e S2-
presentes no meio foi de 1:1. Finalizada a etapa, a suspensão é armazenada
em refrigerador.
Ao final da síntese das NPs de CdS é necessário a formação de
algumas monocamadas de hidróxido de cádmio Cd(OH)2. Pretende-se com
este artifício minimizar a quantidade de defeitos na superfície da nanopartícula.
Esta etapa de passivação foi realizada após 24 h da obtenção da suspensão
inicial.
Como pode ser observado na Figura 3.1, durante o processo ajustou-se
o pH da suspensão coloidal para aproximadamente 10,5, empregando-se
NaOH 0,1M. Em seguida, acrescentou-se sob gotejamento constante 6mL (6,0
x 10-5 mol) da solução de Cd(ClO4)2 0,01M sob agitação constante.
A adição lenta do precursor de cádmio é de fundamental importância,
pois evita a formação de aglomerados de hidróxido de cádmio, que
conseqüentemente provocariam a desestabilização do sistema coloidal.
Os grupamentos fosfatos e as hidroxilas, presentes na superfície dos
pontos quânticos, desempenham a função de agentes funcionalizantes no
processo de conjugação entre as nanopartículas e moléculas de origem
biológica11.
Capítulo 3 – Síntese, funcionalização e caracterização de suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2
37
Figura 3.1 - Esquema representativoCdS/Cd(OH)2.
3.2.3 – Caracterização óptic
Após o processo de obte
sistemas foram caracterizados po
estrutural.
Realizou-se caracterização
no UV/Visível, com intuito de se
CdS/Cd(OH)2 bem como ter uma
Podemos também verificar a qua
sua homogeneidade, bem como
superior a 1µm que ocasionam
utilizou-se um espectrofotômetro
região analisada foi de 200 a 700n
Os espectros de emissão
dos pontos quânticos dispersos
espectrofluorímetro ISS K2 com u
de excitação. Durante a varredur
Cd2+ / (NaPO3)n
O
CdS
H2S
CdS
H - Agitação
da síntese e passivação das nanopartículas de
a e estrutural
nção e passivação das nanopartículas, os
r meio de técnicas de caracterização óptica e
por espectroscopia de absorção eletrônica
confirmar a formação das nanopartículas de
estimativa do tamanho médio das mesmas.
lidade da suspensão coloidal com relação à
a presença de contaminantes com diâmetro
espalhamento de luz. Neste procedimento,
da marca Beckman modelo DU 7500. A
m.
e excitação (caracterização espectroscópica)
em meio aquoso, foram realizadas em um
ma lâmpada de xenônio de 300W como fonte
a foi aplicado passo de 1 nm e empregadas
OH -
pH = 10,5
CdS/Cd(OH)2
24 horas
Capítulo 3 – Síntese, funcionalização e caracterização de suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2
38
fendas de excitação e emissão de 1.0 mm. Pretende-se por meio dos espectros
de emissão, observar em que região do espectro eletromagnético os pontos
quânticos apresentam o máximo de emissão (fluorescência). Os espectros de
excitação nos fornecem informações relativas às transições excitônicas,
exibindo as regiões espectrais nas quais se devem excitar as nanopartículas
para se ter um máximo de emissão.
A caracterização estrutural dos pontos quânticos obtidos foi realizada
por meio das técnicas de difração de Raios-X (DRX) e microscopia eletrônica
de transmissão (MET).
A difratometria de Raios-X nos fornece informações relativas ao arranjo
estrutural do material e perfil de cristalinidade. As amostras de CdS/Cd(OH)2
preparadas para análise de DRX foram submetidas a um processo de
precipitação seletiva por tamanho. Para se obter o precipitado, empregou-se
álcool isopropílico absoluto como agente desestabilizante do meio coloidal,
seguido de centrifugação.
O equipamento empregado para obtenção dos difratogramas das NPs
de CdS/Cd(OH)2, foi um difratômeto da marca Siemens Nixford modelo D5000
digital, possuindo biblioteca cristalográfica e radiação incidente Kα(Cu)= 1,542 Å.
Por meio dos difratogramas obtidos estimou-se o tamanho médio das NPs,
utilizando a equação de Scherrer:
0,9× λλλλ = d × β ×cos θ θ θ θ (3.1)(3.1)(3.1)(3.1)
onde:
d = diâmetro médio das nanopartículas (em nm);
λ = comprimento de onda dos Raios-X incidentes (λ = 0,1542 nm);
β = largura da meia banda do máximo de intensidade em radianos;
θ = centro angular do pico mais intenso.
Utilizou-se a microscopia eletrônica de transmissão com intuito de se
obter informações relativas à morfologia, tamanho médio e dispersão de
tamanho das NPs de CdS/Cd(OH)2. O material a ser analisado foi depositado
Capítulo 3 – Síntese, funcionalização e caracterização de suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2
39
em uma pequena grade de cobre, que possuía um revestimento com um filme
fino de parlódio.
O equipamento utilizado foi um microscópio fabricado pela FEI, modelo
Tecnai20, com tensão entre 20 e 200 kV e resolução de ponto 0,2 nm. Foram
obtidas imagens de campo claro (bright field).
3.3 – Resultados e discussão: 3.3.1 – Síntese e passivação dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2
As nanopartículas de CdS recém sintetizadas apresentam uma grande
quantidade de defeitos na superfície. Este defeitos são oriundos de átomos
superficiais que não apresentam todas as suas ligações balanceadas,
proporcionando descontinuidade da rede cristalina11,17,18. Tendo em vista as
dimensões reduzidas deste sistema, os átomos da superfície contribuem
significativamente nas propriedades ópticas do material.
Os defeitos na estrutura cristalina do semicondutor resultam na
formação de níveis eletrônicos intermediários entre a banda de valência e a de
condução. Estes níveis proporcionam o surgimento de vias não radiativas no
processo de recombinação elétron-buraco, o que acarreta a diminuição ou
perda da fluorescência dos quantum dots11.
Portanto se faz necessário o processo de passivação da superfície dos
pontos quânticos de CdS, por meio da formação e deposição de algumas
monocamadas de Cd(OH)2. Este recobrimento da superfície dos quantum dots,
promove a diminuição dos defeitos, devido a formação de ligações Cd-OH na
superfície da nanopartícula. Conseqüentemente ocorre uma diminuição dos
níveis eletrônicos intermediários, desencadeando na formação de processos
radiativos (emissão de luz).
Este processo de passivação mostrou-se eficiente no sentido de
aumentar significativamente a fluorescência dos pontos quânticos. A Figura 3.2
ilustra de forma simples o processo de passivação.
Capítulo 3 – Síntese, funcionalização e caracterização deCdS/Cd(OH)2
Foram realizados cálculos para estima
nanopartículas/mL na suspensão. Empregou-se dura
cristalino blenda de zinco (cúbico) como referencia
cálculos, a lattice constant do sistema cristalino juntam
volume médio de um único ponto quântico e a q
empregados.
Por fim, obteve-se uma concentração estima
NPs/mL. Os cálculos estão descritos de modo
Apêndices.
3.3.2 – Caracterização óptica dos pontos quân
A Figura 3.3 mostra espectros de absorção re
CdS e CdS/Cd(OH)2, sintetizados de acordo com a
Seção 3.2.2.
CdS Passivação
BV
BC
Cd(OH)2 Cd(
band gap
Figura 3.2 - Representação esquemática do p
empregando-se Cd(OH)2.
CdS
h+
e-
suspensões coloidais de 40
Cd(OH)2
CdS
OH)2
rocesso de passivação de nanopartículas de CdS
r a
nte a
l. For
ente
uant
da n
deta
tico
pres
me
concentração de
estimativa o sistema
am empregados nos
com a estimativa do
idade dos reagentes
a ordem de 6,5x1013
lhado na Seção de
s de CdS/Cd(OH)2
entativos das NPs de
todologia descrita na
Capítulo 3 – Síntese, funcionalização e caracterização de suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2
41
Comparando os espectros mostrad
de absorção juntamente com o valor do
praticamente iguais para a amostra antes
o tamanho das partículas não foi afetado p
O alargamento observado nas ban
Figura 3.3, constatado pela ausência de um
na região entre 400 e 500 nm indica que
de nanopartículas com diferentes diâmetr
uma dispersão de tamanho considerável.
uma dispersão de tamanho característic
aceitável, tendo em vista que não comprom
Isto se deve à cinética rápida de formação
externo durante o processo de formação da
Figura 3.3 - Espectros de absorção das sus
pensões coloidais de CdS e CdS/Cd(OH)2.300 400 500 600
0
1
Abs
orbâ
ncia
(u.
a.)
CdS/Cd(OH)2 CdS
Comprimento de Onda (nm)
os acima, verificamos que o padrão
primeiro máximo de absorção são
e após a passivação, sugerindo que
elo processo de passivação.
das de absorção dos espectros da
máximo de absorção bem definido
os sistemas apresentam populações
os e valores de band gap, ou seja,
Esta metodologia de fato apresenta
a de 15%, percentual este que é
ete a aplicabilidade do material11, 22.
e a algumas limitações de controle
s nanopartículas16,18.
Capítulo 3 – Síntese, funcionalização e caracterização de suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2
42
A Figura 3.4 exibe os espectros de emissão e excitação de uma
suspensão de NPs de CdS/Cd(OH)2.
300 350 400 450 500 550 600 650 7000,0
0,5
1,0
Inte
nsid
ade
norm
aliz
ada
Comprimento de Onda (nm)
Emissao Excitaçao
O espectro de emissão se const
emissão sob determinado comprimen
suspensões coloidais de CdS/Cd(OH
excitando-se a amostra em um comprim
A Figura 3.4 mostra um espec
emissão de pontos quântico com má
encontra na região do verde no espectro
A intensidade do pico de emissã
recombinação radiativa e não-radiativ
evidencia a presença de diferentes po
de tamanho do sistema)16,19,22. Pode se
relativamente estreita (largura de banda
se estende desde o azul ao UV. O esp
no intervalo de 300 a 470 nm, po
Figura 3.4 - Espectros normalizados de emisde uma suspensão coloidal de CdS/Cd(OH)2.
são (λexc=365 nm) e excitação (λem = 496 nm)
itui em um registro das intensidades de
to de onda de excitação. Para as
)2 o espectro de emissão foi obtido
ento de onda de 365 nm.
tro representativo de um espectro de
ximo em λ= 496 nm. Este valor se
eletromagnético visível.
o revela a possível competição entre a
a, enquanto que a largura da banda
pulações de nanopartículas (dispersão
r observado que a banda de emissão é
= 40 nm) e que a banda de excitação
ectro de excitação exibe três máximos
ssibilitando que os pontos quânticos
Capítulo 3 – Síntese, funcionalização e caracterização de suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2
43
apresentem boa intensidade de fluorescência quando excitados em diferentes
comprimentos de onda. Cada máximo de excitação está correlacionado a
processos de recombinação elétron-buraco ocorrendo de diferentes bandas
energéticas para o estado fundamental. O primeiro máximo de excitação, bem
como o de absorção estão relacionados com a população de nanopartículas
responsáveis pela emissão observada16,22. Mais diretamente ainda, o tamanho
médio das partículas pode ser estimado utilizando-se a relação de
Vossmeyer20. Neste caso, para o máximo de emissão observado em 496 nm
observa-se que o primeiro máximo de excitação ocorre em 468 nm o que
corresponde a um diâmetro médio de 6 nm.
3.3.3 – Caracterização estrutural dos pontos quânticos de
CdS/Cd(OH)2
A Figura 3.5 exibe um difratograma de raios-X de pó característico das
nanopartículas de CdS/Cd(OH)2.
Figura 3.5 – Difratograma do pó de uma amostra de pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2 e a estrutura cúbica tipo blenda de zinco.
10 20 30 40 50 600
10
20
30
40
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
2θθθθ
(111)
(200)
(220) (311)
Capítulo 3 – Síntese, funcionalização e caracterização de suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2
44
Analisando o difratograma da Figura 3.5 podemos observar a presença
de picos alargados, algo que é bastante característico de materiais que estão
sob regime de dimensões nanométricas. Materiais nanoestruturados
apresentam uma quantidade reduzida de planos cristalinos detectáveis, o que
reduz substancialmente o fenômeno de difração dos Raios-X incidentes21. Utilizando cartões de identificação da biblioteca cristalográfica JCPDS,
confirmamos que os picos mais intensos correspondem ao sistema cristalino
cúbico, do tipo blenda de zinco. Empregando a equação de Scherrer (Seção
3.2.3), estimou-se que as NPs analisadas apresentam um diâmetro médio de
3,7 nm.
A Figura 3.6 exibe uma micrografia representativa das NPs de
CdS/Cd(OH)2, apresentando uma considerável dispersão de tamanho.
Figura 3.6 – Imagem representativa de NPs de CdS/Cd(OH)2 (parte mais elétron densa da
imagem) obtida através de MET. Barra = 40 nm.
Capítulo 4
Síntese e Caracterização de
Suspensões Coloidais de ZnSe/ZnS
Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS
46
4.1 – Introdução
Recentemente o desenvolvimento de metodologias para obtenção de
nanopartículas de ZnSe/ZnS em meio aquoso tem despertado um interesse em
especial, devido características que não são observadas em outros materiais
semicondutores do tipo II-VI (e.g. CdS, CdSe, CdTe)23. Diante da necessidade
de se buscar sistemas que apresentem uma menor toxicidade e maior
segurança nas aplicações in vivo e em ensaios in vitro, há atualmente uma
busca natural por precursores que causem alterações mínimas nos mais
variados sistemas biológicos e biomoléculas. Neste contexto, busca-se a
substituição dos íons de cádmio presentes em alguns sistemas, por
precursores a base de zinco. Esse elemento é naturalmente presente nos mais
variados sistemas biológicos, estando envolvido em processos bioquímicos
relacionados à imunidade, à formação óssea, à atividade enzimática e à
cicatrização.
As NPs de ZnSe/ZnS em regime de confinamento quântico se apresentam
como uma possível ferramenta para processos diagnósticos seguros e
otimizados. Esse material apresenta intensa luminescência na região do azul e
ultravioleta próximo, com comprimento de onda de emissão na faixa de 410 a
460 nm e band gap de 2.7 eV23. A sua emissão no azul é oriunda do processo
de recombinação elétron-buraco, podendo também apresentar emissões que
variam do verde ao vermelho provenientes de defeitos da superfície ou
dopagem com íons Mn2+. Devido às características supracitadas, ao seu índice
de refração e sua transparência à radiação visível, esse material vem sendo
utilizado com freqüência nos mais diversos dispositivos fotônicos, incluindo
equipamentos de eletroluminescência de baixa voltagem e lasers de diodo
azul23,24.
Outra característica interessante deste material nanoestruturado é o
fenômeno de fotoativação, observado quando as suspensões coloidais são
expostas a radiação UV na ordem de alguns minutos25. Essa exposição em um
curto intervalo de tempo, em torno de 5-40 min, proporciona modificações na
superfície do nanocristal que direcionam a um ganho na intensidade de
Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS
47
fluorescência. Essas modificações estão relacionadas a reações de foto-
oxidação dos grupamentos tiois presentes na superfície do material25.
Os compostos orgânicos tiolados, ácido mercaptoacético (AMA) e ácido
mercaptopropiônico (AMP), foram empregados como estabilizantes e
funcionalizantes das NPs dispersas em meio aquoso26,32. As sulfidrilas de
ambos os compostos, apresentam alta afinidade pelos átomos de zinco
presentes na superfície, garantindo a formação de uma camada de passivação
com baixo índice de dissociação. Estes ácidos orgânicos tiolados, também
desempenham a função de funcionalizantes durante a etapa de
bioconjugação23.
Neste capítulo é descrita a metodologia de obtenção de NPs de
ZnSe/ZnS dispersas em meio aquoso. Os pontos quânticos foram preparados
por meio de técnicas coloidais, conhecidas como bottom-up, com utilização de
precursores hidrossolúveis.
4.2 – Procedimentos experimentais:
4.2.1 – Reagentes empregados: Foram utilizados durante o processo de obtenção das nanopartículas de
ZnSe/ZnS, os seguintes reagentes:
• Sulfato de zinco hepta-hidratado (ZnSO4 . 7H2O) – 99+% - Dinâmica;
• Selênio elementar (Seº) - 100 mesh, 99,9% - Aldrich;
• Borohidreto de sódio (NaBH4) – Venpure AF grânulos, 98+% - Sigma-
Aldrich;
• Ácido mercaptoacético (AMA) – 98% - Acros Organics;
• Ácido mercaptopropiônico (AMP) – 99+% - Sigma-Aldrich;
• Hidróxido de sódio (NaOH) – Min. 98% - Vetec;
• Água ultra-pura deionizada.
Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS
48
4.2.2 – Metodologia de síntese das NPs de ZnSe/ZnS
A metodologia de obtenção dos pontos quânticos de ZnSe/ZnS
empregada neste trabalho, é baseada no processo original desenvolvido por
Andrade e colaboradores23.
Para a síntese de nanocristais de ZnSe/ZnS, utilizou-se o íon Zn2+ em
solução juntamente com o agente estabilizante, um ácido orgânico tiolado
como AMA ou AMP. Inicialmente empregou-se 7,837 mL (8,36 mmol) de uma
solução do estabilizante a 4,9 %. O pH da solução foi elevado para
aproximadamente 11, empregando-se uma solução de NaOH 0,5M.
Posteriormente, foi adicionada uma alíquota de 55 mL (2,2 mmol) da solução
de ZnSO4 0,04M, mantendo-se sob agitação, à temperatura ambiente, por
cerca de 30 minutos.
Vale salientar que nessa primeira etapa ocorre a desprotonação dos
grupamentos sulfidrilas e carboxilatos do estabilizante, pois o pH encontra-se
acima do valor do pKa de ambos, garantindo uma maior concentração da forma
ionizada no meio. A solução contendo Zn2+ e o agente estabilizante é então
aquecida lentamente até a temperatura de aproximadamente 70°C para ser
empregada na próxima etapa.
Para preparar a fonte de íons seleneto (Se2-), que serviu como precursor
na formação dos nanocristais, adicionou-se 0,0788g (1 mmol) de Selênio
elementar (Se0) em um balão e em seguida 0,08 g (2,1 mmol) do agente
redutor borohidreto de sódio (NaBH4). Os pós foram misturados até formar uma
massa homogênea de cor acinzentada. Em seguida, acrescentou-se de forma
lenta aproximadamente 8 mL (4 mmol) de uma solução de NaOH 0,5 M,
mantendo-se o sistema sob constante agitação e temperatura ambiente.
O processo de redução do selênio durou cerca de 30 minutos, e
evidenciou-se a reação pelo aparecimento de um tom acastanhado,
característico do selênio reduzido (Figura 4.1).
Após a redução, injetou-se os íons seleneto obtidos na etapa anterior na
solução Zn2+/agente estabilizante, observando-se a formação das NPs devido à
modificação da coloração de incolor para um tom amarelado. A reação
Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS
49
prossegue sob constante agitação e aquecimento (70°C) durante 90 minutos.
Após esse período, a suspensão modifica a sua coloração, tornando-se
praticamente incolor (Figura 4.2). Em seguida, armazenou-se a suspensão sob
refrigeração (2-8ºC).
Figura 4.1 –forman
Figura 4.2 – Altera
Coloração característica do selênio reduzido do um complexo colorido Na-Se-Se-Na.
70ºC
90 min
ção da coloração após processo de nucleação das NPs.
Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS
50
4.2.3 – Experimento de fotoativação
As NPs de ZnSe/ZnS foram submetidas ao processo de fotoativação,
empregando uma câmara de fotoestabilidade farmacêutica, desenvolvida e
validada por Azevedo33. O equipamento possui uma lâmpada com emissão na
região do ultravioleta próximo, sendo a dose de irradiação mensurada por
técnicas radiométricas.
Empregaram-se durante os experimentos sínteses recém preparadas de
suspensões coloidais de ZnSe/ZnS, estabilizadas e funcionalizadas com AMA.
As amostras do experimento foram separadas em alíquotas de 5 mL e
acondicionadas em frascos de penicilina. Duas alíquotas foram cobertas com
papel alumínio e utilizadas como controles (interno e externo), e outras cinco
foram colocadas na câmara de fotoestabilidade.
Iniciada a etapa de irradiação UV, a cada intervalo de 5 minutos retirou-
se uma alíquota, sendo rapidamente envolvida em papel alumínio e
armazenada no refrigerador (2-8ºC). Foram preparadas alíquotas com 5,10, 20,
30 e 40 minutos. Ao final desta etapa, todas as amostras foram caracterizadas
por meio de espectroscopia de absorção eletrônica e de emissão.
4.2.4 – Caracterização óptica e estrutural
Após o processo de obtenção das nanopartículas de ZnSe/ZnS, os
sistemas foram caracterizados por meio de técnicas de caracterização óptica e
estrutural. As técnicas empregadas são as mesmas que foram descritas na
Seção 3.2.3.
Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS
51
4.3 – Resultados e discussão: 4.3.1 – Síntese, passivação e funcionalização dos pontos quânticos
de ZnSe/ZnS
Assim como os pontos quânticos de CdS, as NPs de ZnSe recém
sintetizadas apresentam uma grande quantidade de defeitos na
superfície23,24,32. Estes defeitos são oriundos de átomos superficiais que não
apresentam todas as suas ligações balanceadas, proporcionando
descontinuidade da rede cristalina. O processo de passivação do ZnSe,
acontece por meio da formação de algumas monocamadas de ZnS, resultantes
da desprotonação dos grupamentos sulfidrilas do estabilizante.
Na primeira etapa do processo de síntese ocorre a desprotonação dos
grupamentos carboxilatos (pKCOOH= 3,6) e sulfidrilas (pKSH= 10,55) do
estabilizante, devido o pH se encontrar acima do valor do pKa de ambos,
garantindo uma maior concentração sob a forma ionizada no meio32.
No final da etapa de nucleação das nanopartículas, os grupamentos
resultantes da desprotonação das sulfidrilas, radicais estes que possuem alta
afinidade por íons Zn2+, interagem com os átomos de zinco da superfície.
Durante este processo, ocorre a formação de algumas monocamadas do
passivante ZnS, que é um semicondutor de band gap maior (EgZnS= 3,54 eV e
EgZnSe = 2,70 eV). Esta elevada afinidade pelos os íons garante uma baixa taxa
de dissociação da camada de estabilizante formada nas superfícies dos NPs.
Este processo de passivação mostrou-se eficiente no sentido de
aumentar significativamente a fluorescência dos pontos quânticos, pois ocorre
uma diminuição dos níveis eletrônicos intermediários, desencadeando na
formação de processos radiativos (emissão de luz).
Os grupamentos carboxilatos conferem aos pontos quânticos uma carga
residual negativa, garantindo uma repulsão eletrostática entre as NPs
dispersas no meio. A diminuição da freqüência de choques entre as NPs
confere uma maior estabilidade ao sistema coloidal (metaestável), postergando
o processo de coalescência. Os grupamentos carboxilatos também atuam
como funcionalizantes no processo de bioconjugação, possibilitando a
Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS 52
interação do composto inorgânico com uma biomolécula. O processo de
bioconjugação envolvendo os pontos quânticos de ZnSe/ZnS, está descrito de
modo detalhado no Capítulo 5.
Pelo fato de atuarem simultaneamente como estabilizantes e
funcionalizantes, os ácidos mercaptocarboxílicos (tanto os de cadeia carbônica
curta ou longa), são amplamente empregados na síntese de nanoparticulas de
semicondutores do tipo II-VI23,24,26,28,32.
4.3.2 – Caracterização óptica dos pontos quânticos de ZnSe/ZnS
As caracterizações descritas nesta Seção estão relacionadas às NPs de
ZnSe/ZnS, que possuem o AMA como estabilizante e funcionalizante.
A Figura 4.3 mostra um espectro de absorção representativo das NPs de
ZnSe/ZnS sintetizados de acordo com a metodologia descrita na Seção 4.2.2.
250 300 350 400 450 5000
1
2
Comprimento de Onda (nm)
Abs
orbâ
ncia
(u.
a.)
ZnSe/ZnS-AMA
Figura 4.3 - Espectro de absorção de uma suspensão coloidal de ZnSe/ZnS.
O alargamento observado na banda de absorção do espectro da Figura
4.3, constatado por um máximo de absorção pouco definido na região entre
300 e 380 nm (Eg = 4,14 a 3,26 eV ) indica que o sistema apresenta uma
considerável dispersão de tamanho (>10%), entretanto, não compromete a
Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS 53
aplicabilidade do material 23,24,26 . O valor estimado para o primeiro máximo
encontra-se bem acima do valor do band gap do ZnSe (Eg = 2,7 eV) indicando
que as partículas encontram-se em forte regime de confinamento quântico.
A Figura 4.4 exibe o espectro de emissão de uma suspensão de NPs de
ZnSe/ZnS.
Figura 4.4 - Espectro de emissão (λexc=365 nm) representativo de uma suspensão coloidal de ZnSe/ZnS.
365 n
Pode
apres
obser
dos p
350 400 450 500 550 600 650 7000
20000
40000
60000
80000
100000
Comprimento de Onda (nm)
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
ZnSe/ZnS-AMA
O espectro de emissão destas nanopartículas, obtido com excitação em
m, exibe emissão na região do azul (λmax= 406 nm) do espectro visível.
-se observar que a banda de emissão é relativamente estreita,
entando uma largura de pico a meia altura de 32 nm. O alargamento
vado na base do espectro se deve possivelmente a defeitos na superfície
ontos quânticos23,24,26.
Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS 54
Os espectros de emissão exibidos na Figura 4.5, correspondem às
amostras que foram submetidas ao processo de fotoativação.
Figura 4.5 – Evolução temporal dos espectros de emissão (λexc=365 nm) de uma suspensão
coloidal de ZnSe/ZnS empregada no experimento de fotoativação.
fa
m
d
s
d
d
F
350 400 450 500 550 6000
5000
10000
15000
20000
25000
30000
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
Comprimento de Onda (nm)
ZnSe/ZnS - Controle ZnSe/ZnS - 5 min ZnSe/ZnS - 10 min ZnSe/ZnS - 20min ZnSe/ZnS - 30 min ZnSe/ZnS - 40 min
Sugere-se que o processo de fotoativação das NPs de ZnSe/ZnS,
voreça a passivação dos pontos quânticos por meio da formação de algumas
onocamadas de ZnS. Estas monocamadas são formadas através da hidrólise
os grupamentos tióis presentes nas moléculas do ácido mercaptoacético,
endo o processo otimizado pela radiação incidente no meio. À medida que os
efeitos superficiais são reduzidos, promove-se um incremento na intensidade
e fluorescência dos pontos quânticos, como observado no gráfico exibido na
igura 4.6 23,24.
Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS
55
quân
Figura
suspen
4.6 – Gráfico da evolução temporal dos espectros de emissão (λexc=365 nm) de uma
são coloidal de ZnSe/ZnS empregada no experimento de fotoativação.
Na Figura 4.7 é exibida a fluo
ticos fotoativados durante um perí
420
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
Intensidade (u.a.)
1 2 3 5 6
Tempo (min)
Evolução Temporal do Processo de Fotoativação de uma Suspensão Coloidal de ZnSe/ZnS
Cont. 5 10 30 40
rescência de uma amostra de pontos
odo de 20 minutos.
Figura 4.7 – Fluorescência de uma amostra fotoativada durante 20 minutos.
UV – 365nm
Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS
56
Entretanto foi observado que em intervalos superiores a 40 minutos, que
os pontos quânticos perdem progressivamente a capacidade de emissão e sua
estabilidade coloidal. Acredita-se que os processos de foto-oxidação e a
hidrólise do estabilizante, promovam este fenômeno.
No processo de foto-oxidação, elétrons presentes nos átomos
superficiais das NPs são transferidos para as moléculas de oxigênio presentes
no meio. Durante este processo, são formadas espécies altamente reativas,
tais como o oxigênio singleto. Esta espécie reativa pode promover a foto-
corrosão da camada de passivação dos pontos quânticos, acarretando em
perda de fluorescência, devido à prevalência de processos de decaimento não
radiativos25.
Quando o processo de hidrólise do funcionalizante é realizado de modo
excessivo, as NPs acabam perdendo a estabilidade em meio coloidal. Isto
ocorre devido ao desacoplamento dos terminais carboxilatos, que
anteriormente estavam ligados à superfície dos pontos quânticos, resultando
na perda da carga residual negativa, que anteriormente possibilitava a repulsão
eletrostática entre as NPs dispersas no meio23,25.
Acredita-se que este segundo mecanismo reacional é predominante nos
experimentos em que as amostras são irradiadas excessivamente, pois,
durante os ensaios realizados, verificou-se a formação de precipitados em
exposições superiores a 40 minutos.
Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS
57
padrã
para
partíc
Figura
ZnSe/Z
4.8 – Evolução temporal dos espectros de absorção de uma suspensão coloidal de
nS empregada no experimento de fotoativação.
300 4000
1
2
Absorbância (u.a.)
ZnSe/ZnS - Controle ZnSe/ZnS - 5 min ZnSe/ZnS - 10 min ZnSe/ZnS - 20 min ZnSe/ZnS - 30 min ZnSe/ZnS - 40 min
Comprimento de Onda (nm)
Comparando os espectros mostrados na Figura 4.8, verificou-se que o
o de absorção juntamente com o valor do primeiro máximo são similares
a amostras fotoativadas e o controle. Sugerindo que o tamanho das
ulas não foi afetado pelo processo de fotoativação.
Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS
58
4.3.3 – Caracterização estrutural dos pontos quânticos de
ZnSe/ZnS
A Figura 4.9 exibe um difratograma de raios-X de pó característico das
nanopartículas de ZnSe/ZnS.
ap
re
co
cú
3.
in
10 20 30 40 50 60
0
2
4
6
8
10
12
14
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
2θ
ZnSe/ZnS
(111) (120)
(311)
Figura 4.9 – Difratograma de Raios-X de pó de uma amostra de pontos quânticos ZnSe/ZnS.
Assim como as NPs de CdS/Cd(OH)2, os pontos quânticos de ZnSe/ZnS
resentam uma quantidade reduzida de planos cristalinos detectáveis, o que
duz substancialmente o fenômeno de difração dos Raios-X incidentes.
Utilizando cartões de identificação da biblioteca cristalográfica JCPDS,
nfirmamos que os picos mais intensos correspondem ao sistema cristalino
bico, do tipo blenda de zinco. Empregando a equação de Scherrer (Seção
2.3), estimou-se que as NPs analisadas apresentam diâmetro médio no
tervalo de d = 1,5-3 nm.
Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS
59
A Figura 4.10 exibe uma micrografia representativa das NPs de
ZnSe/ZnS, apresentando uma região com pequena dispersão de tamanho.
Figura 4.10 –
(regiões mais e
Como
dispersão d
tamanho do
concordânci
Microscopia eletrônica de transmissão representativa de NPs de ZnSe/ZnS
létron densas da imagem). Barra = 5 nm.
não se conseguiu ainda fazer uma boa estatística de resultados a
e tamanho não pode ser estimada, entretanto, a dimensão de
s campos observados para as suspensões de ZnSe demonstram
a com o estimado pela análise dos difratogramas de Raios-X.
Capítulo 5
Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com Albumina Sérica Bovina (BSA)
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
61
5.1 – Introdução
Neste capítulo são descritas duas metodologias de bioconjugação, que
promovem a interação dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2 e ZnSe/ZnS com
a proteína albumina sérica bovina.
No primeiro protocolo foram empregados agentes de comprimento zero
como mediadores do processo de conjugação entre as NPs de CdS/Cd(OH)2
ou ZnSe/ZnS e a proteína. Um segundo processo de bioacoplamento foi
desenvolvido apenas para os pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2, empregando
o glutaraldeído como crosslinker homobifuncional.
A albumina sérica bovina apresenta características que viabilizam o seu
emprego como sistema modelo no desenvolvimento de metodologias de
acoplamento com sistemas inorgânicos. Dentre elas podemos destacar: a
ampla citação na literatura, estrutura secundária/terciária e composição bem
definida, presença e disponibilidade de resíduos aminados, mudança
conformacional reversível e robustez em diferentes condições do meio
(osmolaridade, pH, força iônica e temperatura).
Trata-se de uma proteína com cadeia polipeptídica simples constituída
por cerca de 583 resíduos de aminoácidos e nenhum carboidrato, que ocorre
abundantemente no fluido e tecido, compreendendo 55-62% das proteínas
totais. A estrutura da albumina sérica aproxima-se de um elipsóide de 140 x 40
Å com três domínios homólogos, apresentando-se sob a forma de um charuto
(Figura 5.1). Comparado a globulinas, possui baixo peso molecular de 67 kDa.
A BSA possui apenas um resíduo de cisteína livre, Cis34, sendo este o grupo
alvo para os processos de bioconjugação desenvolvidos, enquanto os outros
formam 17 pontes dissulfeto que ajudam a manter a sua estrutura terciária.
Entre as suas propriedades mais importantes, podemos destacar a
hidrosolubilidade e a sua capacidade de ligar-se reversivelmente a uma grande
variedade de compostos, constituindo-se em uma proteína transportadora
multifuncional 36,37.
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
62
Figura 5.1 - Estrutura clássica da albumina sérica (Peters, 1985).
5.2 – Bioconjugação dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2
5.2.1 – Emprego de agentes de comprimento zero
5.2.2 – Procedimentos experimentais:
5.2.2.1 – Reagentes empregados: Foram utilizados durante o processo de bioconjugação das
nanopartículas de CdS/Cd(OH)2 com a albumina, os seguintes reagentes:
• Cloreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropril) carbodiimida (EDC) - pureza
>99% – Fluka;
• N-hidroxisuccinamida sulfonada (Sulfo-NHS) - pureza >98,5% (HPLC) -
Aldrich;
• Albumina sérica bovina (BSA) liofilizada – pureza > 96% - Sigma Aldrich;
• Mercaptoetanol – pureza >98%, Sigma;
• Ácido 4-Morfolino etanossulfônico (MES 0,1M – Tampão de Ativação
pH= 5,5-6,0) – pureza >98% – Sigma Aldrich;
• Álcool etílico absoluto – 99,8% PA ACS – Cinética;
• Tampão PBS – pH=7,2;
• Solução de Tampão Tris 1M;
• Suspensão de pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2;
• Água ultra-pura deionizada.
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
63
5.2.2.2 – Protocolo desenvolvido
A metodologia de obtenção dos bioconjugados empregada neste ensaio,
é uma adaptação dos vários processos descritos na literatura que utilizam
agentes de comprimento zero27,29,31. Os bioconjugados foram confirmados por
uma técnica de detecção quantitativa da intensidade de fluorescência,
empregando microplacas de poliestireno como fase sólida.
Etapa 1
Em um balão de fundo redondo de 100mL e sob constante agitação,
adicionou-se 1,25mL da suspensão coloidal de CdS/Cd(OH)2 e completou-se o
volume para 5mL com o tampão de ativação MES 0,1M. Aguardou-se 15
minutos e em seguida foi adicionado 0,4mg/mL (2mmol) de EDC e 1,1mg/mL
(5mmol) de sulfo-NHS, previamente solubilizados em água ultra-pura. Foi
efetuado um segundo intervalo de 15 minutos, para que os grupamentos
fosfatos presentes na superfície das NPs de de CdS/Cd(OH)2 fossem ativados
pela carbodiimida. Em seguida adicionou-se 14µL de mercaptoetanol 2mM
para inativar o excesso de EDC presente no meio.
Após estes processos, foi adicionado 1mg (15nmol) da albumina sérica
bovina, previamente solubilizada em 1mL de solução hidroalcoólica (80:20).
Todos os processos foram realizados sob atmosfera inerte (argônio), deixando-
se o sistema reagir por 15 horas à temperatura ambiente. Ao término do
processo reacional, foi realizado o bloqueio com 170µL de tampão Tris 1M.
Dois controles foram preparados para serem empregados no ensaio. O
primeiro foi composto por todos os reagentes utilizados no processo reacional,
excetuando-se o ponto quântico. No segundo controle foi empregado apenas o
quantum dot na mesma concentração utilizada no processo de bioconjugação.
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
64
Etapa 2
Foi utilizada uma microplaca negra de poliestireno (fluorescência por
cima), especifica para ensaios fluorescentes (Figura 5.2) durante a etapa de
incubação. Adicionou-se em cada poço 200µL da amostra (em triplicata),
realizando-se em seguida a incubação no equipamento de banho-maria por 2
horas a 37°C. Após a etapa de incubação, retiraram-se as amostras, lavando-
se cada poço por três vezes com tampão PBS. Realizou-se a leitura da placa,
empregando-se os filtros de excitação e emissão adequados para o quantum
dot utilizado.
Ao final das etapas de acoplamento e incubação, o bioconjugado, os
controles e a microplaca empregada no ensaio, foram armazenados em
refrigerador.
5.2.3 – Emp
5.2.4 – Proc
5.2.4.1 – Re Foram
nanopartícula
FIGURA 5.1 (Microplaca)
rego do crosslinker homobifuncional glutaraldeído
edimentos experimentais:
agentes empregados:
utilizados durante o processo de bioconjugação das
s de CdS/Cd(OH)2 com a albumina, os seguintes reagentes:
Figura 5.2 – Microplaca negra de poliestireno.
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
65
• Albumina sérica bovina (BSA) liofilizada – pureza > 96% - Sigma Aldrich;
• Glutaraldeído 25% em água – J T Baker ;
• Tampão PBS – pH=7,2;
• Solução de Tampão Tris 1mM;
• Suspensão de pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2;
• Água ultra-pura deionizada.
5.2.4.2 – Protocolo desenvolvido
Neste ensaio empregou-se um agente homobifuncional amplamente
utilizado em processos de bioconjugação, apresentado de maneira mais
pormenorizada na Seção 1.2.2. A metodologia de obtenção dos bioconjugados
empregada neste ensaio foi adaptada dos processos descritos na
literatura11,12,30. Os bioconjugados foram confirmados empregando-se a técnica
descrita na seção 5.2.2.2.
Etapa 1
Em um balão de fundo redondo com capacidade para 100 mL e sob
constante agitação, adicionou-se 4,5 mL da suspensão coloidal de
CdS/Cd(OH)2 em pH=8,5. Em seguida, adicionou-se 480 µL (0,6 mmol) da
solução de glutaraldeído 0,125%.
Deixou-se a reação sob agitação e temperatura ambiente por 2 horas.
Durante este período, são formadas interações eletrostáticas entre os
grupamentos aldeídicos e a superfície dos quantum dots11. Após o processo de interação entre os grupamento químicos presentes
nos dois sistemas, adicionou-se 1mg/mL (15 nmol) da albumina sérica bovina,
previamente solubilizada em água ultra-pura. O processo reacional foi mantido
por 12 horas à temperatura ambiente sem emprego de atmosfera inerte. Ao
término do processo, foi realizado o bloqueio com 1mL de tampão Tris 1mM.
Dois controles foram preparados para serem empregados no ensaio. O
primeiro foi composto por todos os reagentes utilizados no processo reacional,
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
66
excetuando-se o ponto quântico. No segundo controle foi empregado apenas o
quantum dot na mesma concentração utilizada no processo de bioconjugação
Etapa 2
A etapa de incubação foi idêntica a que foi previamente descrita na
Etapa 2 da seção 5.2.2.2.
5.3 – Bioconjugação dos pontos quânticos de ZnSe/ZnS
5.3.1 – Emprego de agentes de comprimento zero
5.3.2 – Procedimentos experimentais:
5.3.2.1 – Reagentes empregados: Todos os regentes empregados foram idênticos aos que foram
detalhados na Seção 5.2.2.1, excetuando-se o ponto quântico utilizado na
reação.
5.3.2.2 – Protocolo desenvolvido O processo desenvolvido para os quantum dots de ZnSe/ZnS foi similar
ao descrito na Seção 5.2.2.2 (Etapas 1 e 2). A única alteração efetuada foi a
quantidade utilizada da suspensão de pontos quânticos. Empregou-se 1,25mL
do colóide de ZnSe/ZnS. Diferentemente do que ocorre com o CdS/Cd(OH)2,
durante o processo reacional que emprega as NPs de ZnSe/ZnS, acontece a
ativação dos grupamentos carboxilatos presentes na superfície das
nanopartículas.
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
67
5.4 – Caracterização dos bioconjugados de CdS/Cd(OH)2-BSA e ZnSe/ZnS-BSA
Após o processo de acoplamento, os bioconjugados juntamente com os
controles e os pontos quânticos empregados nos ensaios, foram caracterizados
por meio de técnicas espectroscópicas.
Em testes iniciais tentou-se confirmar a formação dos bioconjugados
empregando-se técnicas de eletroforese em gel. Foram utilizadas duas
diferentes metodologias. A primeira consistiu na preparação de gel de agarose
e corrida em cuba horizontal, e a segunda foi composta por gel de
poliacrilamida e corrida em cuba vertical. Ambas as metodologias se
mostraram ineficazes, pois por meio destas não foi possível confirmar a
formação dos bioconjugados.
Empregou-se uma técnica de detecção quantitativa da intensidade de
fluorescência para confirmar a formação dos bioconjugados. Microplacas
negras de poliestireno foram utilizadas como fase sólida durante os ensaios.
Nestas microplacas são formadas interações eletrostáticas entre o polímero
que as recobre e os resíduos hidrofóbicos da proteína. Diferentes filtros de
excitação de emissão foram empregados nos ensaios, tendo em vista que os
dois pontos quânticos apresentam fluorescência em comprimentos de onda
distintos. Neste procedimento, utilizou-se o equipamento VICTOR 2 WALLAC
1420 com detector de fluorescência, fabricado pela Perkin Elmer (Figura 5.3).
Figura 5.3
– Equipamento VICTOR 2 WALLAC 1420.
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
68
A integridade da estrutura secundária da proteína foi demonstrada por
meio da espectroscopia de dicroísmo circular. Esta técnica permitiu investigar
as diferentes conformações estruturais que a albumina adotou após as etapas
de bioconjugação. As análises foram realizadas em um espectropolarímetro de
dicroísmo circular JASCO J-815.
As amostras bioconjugadas e as suspensões coloidais empregadas,
foram caracterizadas por espectroscopia de absorção eletrônica no UV/Visível.
Avaliou-se a presença de uma possível alteração na curva de absorção dos
pontos quânticos, após a etapa de acoplamento. Nesta análise, utilizou-se um
espectrofotômetro da marca Beckman modelo DU 7500. A região analisada foi
de 200 a 700nm.
Os espectros de emissão dos bioconjugados e dos pontos quânticos
dispersos em meio aquoso, foram realizados em um espectrofluorímetro ISS
K2 com uma lâmpada de xenônio de 300 W como fonte de excitação. Durante
a varredura foi aplicado passo de 1 nm e empregadas fendas de 1.0. Esta
caracterização teve como objetivo, comparar o perfil de emissão dos
bioconjugados com o perfil das nanopartículas não ligadas.
5.5 – Resultados e Discussão 5.5.2 – Bioconjugação via agentes de comprimento zero
A carbodiimida empregada, em meio ácido, reage com os grupamentos
fosfatos ou carboxilatos presentes na superfície dos pontos quânticos de
CdS/Cd(OH)2 e ZnSe/ZnS respectivamente. Resultando na formação de um
éster intermediário reativo. Este composto promove o ataque nucleofílico das
aminas primárias, presentes nos terminais lisina da albumina, aos grupamentos
carboxilatos ou fosfatos. Este processo origina ligações do tipo amida ou
fosforamidato, respectivamente12,14,15,26,27.
A maior dificuldade durante o processo reacional é a presença de outros
nucleófilos no sistema. A hidrólise da água juntamente com a presença de
moléculas de oxigênio no meio, resulta na desestabilização e clivagem do éster
intermediário. Este processo promove a formação de uma isouréia e a
regeneração dos grupamentos carboxilatos ou fosfatos; algo que é
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
69
extremamente indesejável durante a etapa de bioconjugação12,14,15. A
atmosfera inerte foi empregada para minimizar a quantidade de oxigênio no
meio reacional, conferindo maior estabilidade ao intermediário reativo.
A adição de outro agente de comprimento zero (Sulfo-NHS), combinado
com solventes que promovam a diminuição da constante dielétrica do meio,
possibilita um acréscimo no rendimento reacional. O processo mais indesejado
durante a etapa de ativação dos grupamentos carboxilatos, envolve a
racemização do intermediário reativo O-acilisouréia para uma N-aciluréia
estável12,14,15. Por este motivo, foi utilizado na preparação da albumina, uma
solução hidroalcoólica com 80% de água e 20% de etanol absoluto. A presença
de etanol na reação, promoveu otimização no desempenho do EDC e do Sulfo-
NHS, devido à diminuição da constante dielétrica.
Como pode ser visualizado na Figura 5.4, o Sulfo-NHS converte os
grupamentos carboxilatos das NPs em ésteres amino-reativos, contribuindo
ativamente na formação de uma ligação acilamida mais estável.
PQ
SO
OH
Ácido Carboxílico
H CH3N+NNH3C
O O
S
CH3H
O-Acilisouréia (Intermediário Ativo)
NSO3Na
O
O
Sulfo-NHSN
SO3Na
O
O
O
OS
H
BSAN
O
S
NSO3Na
O
O
HO
Sulfo-NHSÉster IntermediárioSulfo-NHS
Ligação AmidaEDC
HC
Cl-
H3C N
N N+CH3
CH3
Amina Primária
HO
H2N ASB
PQ
PQ
PQ
Figura 5.4 – Esquema reacional do EDC e Sulfo-NHS com os grupamentos carboxilatos presentes
nas nanopartículas de ZnSe/ZnS.
Como descrito na Seção 5.4, em testes iniciais tentou-se confirmar a
formação dos bioconjugados empregando-se técnicas de eletroforese em gel.
Dois trabalhos relatam a caracterização da conjugação PQ-proteína utilizando
eletroforese horizontal em gel de agarose30. Buscou-se, então, a caracterização
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
70
da ligação PQ-BSA fazendo uma adaptação do protocolo descrito na literatura,
para visualização da eventual formação
Foi proposto nos estudos realizados por Mamedova e colaboradores,
que bioconjugados de pontos quânticos e BSA apresentam menor migração
nas corridas eletroforéticas que as visualizadas para o padrão de BSA30.
Sugere-se que o conjugado formado, apresenta um menor deslocamento
durante a corrida devido o somatório das massas da proteína e do composto
inorgânico.
Na Figura 5.5, as bandas claramente definidas no gel correspondem à
albumina (bandas no fronte da placa). Entretanto, não foi possível distinguir a
formação de uma nova banda na corrida de eletroforese, a qual seria indicativa
do processo de acoplamento PQ-BSA. Por este motivo, empregou-se apenas a
técnica de detecção quantitativa da intensidade de fluorescência na
confirmação dos bioconjugados formados.
Nos ensaios que empregam as placas de poliestireno, ocorrem
interações químicas entre a proteína e o material que compõe a fase sólida. As
porções hidrofóbicas da proteína se ligam eletrostaticamente ao polímero que
reveste os poços da placa. Entretanto, os pontos quânticos não possuem a
capacidade de interagir com o revestimento polimérico presente no substrato.
Isto foi evidenciado por meio de ensaios, nos quais foram incubados apenas os
BSA (Padrão) PQ -BSA PQ -BSA PQ -BSA
Figura 5.5 - Corrida em gel de agarose 2% do padrão de BSA e dos bioconjugados formados entre os pontos quânticos e as moléculas da proteína. Amostras coradas em azul de coumassie.
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
71
quantum dots nas placas. Após o processo de lavagem por três vezes com
PBS, a placa foi submetida a leitura no equipamento com detector de
fluorescência. Para os dois pontos quânticos, o resultado de intensidade da
fluorescência em unidades arbitrárias, foi inferior ao das amostras
bioconjugadas. Comprovando que os quantum dots não possuem afinidade
química ou eletrostática pelo material que reveste os poços.
Os outros dois controles, um composto apenas pelos pontos quânticos e
outro formado por todos os reagentes exceto as NPs, também apresentaram
intensidades de fluorescência bem inferiores, em relação às detectadas para os
bioconjugados. A BSA apresenta emissão na faixa de 310 a 340 nm,
fluorescência que é oriunda de aminoácidos aromáticos que compõe a cadeia,
tais como, fenilalanina, tirosina e triptófano30. A emissão da proteína não pode
ser detectada no equipamento, tendo em vista que os filtros de excitação e
emissão não são apropriados para esta região espectral. Tudo isto corrobora
na comprovação da formação dos bioconjugados. Apenas as moléculas de
BSA que estão ligadas ao revestimento polimérico dos poços e acopladas aos
pontos quânticos, apresentam fluorescência com intensidade significativa na
região visível do espectro eletromagnético.
A Figura 5.6, exibe um esquema representativo do processo de
interação do bioconjugado com a placa de poliestireno.
PQ
Figura 5.6 – Esquema do processo de interação da BSA-ponto quântico e a placa de
poliestireno.
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
72
Foi estabelecido durante os ensaios, que intensidades de fluorescência
com valores em dobro em comparação aos verificados para os controles,
serviriam como indicativos da formação do bioconjugado.
O processo de bioconjugação com as NPs de CdS/Cd(OH)2 via agentes
de comprimento zero mostrou-se ineficaz. Isto se explica pelo fato da reação se
processar em meio ácido, o que acarreta a desestabilização do compósito.
O pH ácido do meio promove a degradação da camada de passivação
de Cd(OH)2, ocasionando a perda da fluorescência do ponto quântico. Por este
motivo não se evidenciou a formação do bioconjugado com o emprego da
técnica de detecção quantitativa da intensidade de fluorescência, como pode
ser observado na Tabela 5.1.
empre
moléc
empre
biocon
via c
apres
foram
apres
os co
dois c
C
Tabela
fluores
F535 n
5.1 – Resultados da análise de bioconjugação por detecção quantitativa de
cência, empregando-se o filtro de excitação F355 nm (± 40 nm) e o filtro de emissão
m (± 25 nm). D.P. = desvio padrão e C.V. = variância.
Por este motivo, os agentes de comprimento zero não foram mais
gados no processo de acoplamento entre as NPs de CdS/Cd(OH)2 e as
ulas da proteína. Não se realizou a caracterização da proteína
gando-se a técnica de dicroísmo circular, devido a não formação do
jugados. Como alternativa, foi desenvolvido um método de conjugação
rosslinker. Os resultados obtidos e a discussão detalhada serão
entados na Seção 5.5.3.
Os pontos quânticos de ZnSe/ZnS funcionalizados com AMA ou AMP,
conjugados com êxito às moléculas da BSA. Os bioconjugados
entaram intensidades bem superiores em comparação às verificadas para
ntroles. Na Tabela 5.2, são apresentados os valores de intensidade dos
ontroles e do bioconjugado ZnSe/ZnS – BSA. Neste experimento foram
Amostras
Média da Intensidade (u.a.)
D.P.
C.V. (%)
Controle TRIS 358,50 3,53 0,98
CdS/Cd(OH)2 281,66 11,37 4,03
dS/Cd(OH)2 - BSA 366,50 12,02 3,27
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
73
empregados pontos quânticos funcionalizados com AMA, com fluorescência na
faixa de 400 nm do espectro eletromagnético.
Na Figura 5.7 são exibidos os espectros de emissão das NPs de
ZnSe/ZnS e o do bioconjugado formado.
Amostras
Média da Intensidade (u.a.)
D.P.
C.V. (%)
Controle TRIS 457,33 12,01 2,63
ZnSe/ZnS 507,33 5,03 0,99
ZnSe/ZnS - BSA 1.032,67 16,50 1,60
Tabela
fluores
F420 n
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
Figura
Amostr
5.7 – Comparativo entre as emissões, antes e após o processo de bioconjugação.
as excitadas em 365 nm.
400 450 500 550 600
0
20000
40000
60000
80000
Comprimento de Onda (nm)
ZnSe/ZnS/AMA BSA - ZnSe/ZnS/AMA
5.2 – Resultados da análise de bioconjugação por detecção quantitativa de
cência, empregando-se o filtro de excitação F355 nm (± 40 nm) e o filtro de emissão
m (± 10 nm). D.P. = desvio padrão e C.V. = variância.
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
74
O espectro de emissão do bioconjugado apresentou um pequeno
deslocamento do pico de emissão para 405 nm e perdeu aproximadamente 3,5
vezes a intensidade de fluorescência.
Acredita-se que o decréscimo da intensidade de fluorescência das NPs
de ZnSe/ZnS é atribuído as mudanças de pH efetuadas no decorrer do
experimento de bioconjugação, requeridas para a reação de acoplamento via
EDC/Sulfo-NHS. Outro fator decisivo é a presença de álcool no meio reacional,
pois o mesmo proporciona desestabilização do sistema coloidal, tendo em vista
que os alcoóis são amplamente empregados em processos de precipitação
seletiva de pontos quânticos e outros sistemas coloidais aquosos.
As moléculas protéicas possuem a capacidade de absorver a luz
circularmente polarizada no sentido horário e anti-horário em diferentes
amplitudes. Este fenômeno que é denominado dicroísmo circular, permite
investigar as conformações estruturais que as proteínas adotam em diferentes
condições do meio34.
Durante os ensaios de bioconjugação foi empregada a técnica de
dicroísmo circular, com objetivo de avaliar as possíveis alterações estruturais e
conformacionais da proteína empregada.
Como pode ser visualizado na Figura 5.8, o espectro de dicroísmo
circular da BSA exibe duas bandas negativas na região do UV próximo entre
208 e 222 nm, sendo bem característico da estrutura α-hélice. De acordo com
os trabalhos realizados por Greenfield, a albumina sérica bovina possui cerca
de 52% da sua estrutura secundária sob a forma de α-hélice35.
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
75
Como pode ser observado na Figura 5.9, o processo de bioconjugação
promoveu modificações estruturais significativas na proteína.
0 30 60 90
-160
-140
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
DC
[mde
g]
Comprimento de Onda (nm)
BSA
200 230 260 290
Figura
de 1mg
229.0000 259.0000 289.0000 319.0000
-40
-20
0
20
40
DC
[mde
g]
Comprimento de Onda (nm)
ZnSe/ZnS-BSA
230 260 290 320
Figura
ZnSe/Z
5.9 – Espectro de dicroísmo circular de um bioconjugado formado entre as NPs de
nS e a BSA.
5.8 – Espectro de dicroísmo circular de uma solução aquosa de BSA na concentração
/mL.
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
76
A mudança no espectro de DC demonstra que ocorreu um possível
processo de desnaturação ou uma completa transição de α-hélice para β-folha.
O controle que possui todos reagentes, exceto os pontos quânticos, também
apresentou sinais de modificação da estrutura protéica (Figura 5.10). Isto
demonstra que principalmente a variação de pH, os reagentes empregados e
em menor proporção os pontos quânticos ligados aos resíduos de aminoácidos
presentes na cadeia polipeptídica da proteína, promoveram alterações nas
ligações intramoleculares (pontes de hidrogênio) da estrutura α-hélice.
C
bioconj
secund
maleido
7,0.
5.5.3 –
Figura
com a
229.0000 259.0000 289.0000 319.0000
-40
-30
-20
-10
0
10
20
Comprimento de Onda (nm)
DC
[mde
g]
Controle
230 260 290 320
5.10 – Espectro de dicroísmo circular de um controle (todos reagentes exceto as NPs)
BSA na concentração de 1mg/mL.
omo alternativa para otimizar os resultados durante a etapa de
ugação, preservando a estabilidade dos pontos quânticos e a estrutura
ária da proteína, pretende-se em ensaios futuros empregar a
imida Sulfo-SMCC, que apresenta bom rendimento reacional em pH
Bioconjugação via crosslinker homobifuncional
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
77
O crosslinker homobifuncional glutaraldeído promoveu o acoplamento
dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2 a BSA. O glutaraldeído em soluções
aquosas alcalinas sofre rearranjo estrutural formando polímeros com pontos de
insaturação. Os polímeros insaturados são extremamente reativos na presença
de agentes nucleófilos, especialmente aminas primárias11,12,13,30.
Como descrito na Seção 1.2.2, a reação resulta em alquilação dos
grupamentos aminas da proteína, proporcionando a formação de ligações do
tipo amida.
As reações de bioconjugação que empregam este aldeído envolvem
uma série de mecanismos possíveis. Dentre eles podemos destacar a
formação de bases de Schiff e a reação de adição do tipo Michael, que ocorre
devido à formação dos pontos de insaturação das moléculas polimerizadas em
meio alcalino12.
Sugere-se que durante o processo de conjugação entre as NPs e a
albumina, aconteçam principalmente reações de adição do tipo Michael, devido
o pH alcalino do meio (Figura 5.11).
Figura 5.11 – Esquema reacional do acoplamento entre a BSA e o glutaraldeído.
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
78
Os pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2 funcionalizados com
glutaraldeído, foram conjugados com sucesso as moléculas da proteína. Os
bioconjugados apresentaram intensidades bem superiores em comparação as
verificadas para os controles. Na Tabela 5.3, são apresentados os valores de
intensidade dos dois controles e do bioconjugado CdS/Cd(OH)2 – BSA.
Neste experimento foram empregados pontos quânticos com máximo de
emissão na região do verde (503 nm) do espectro eletromagnético visível.
Na Figura 5.12, são exibidos os espectros de emissão das NPs de
CdS/Cd(OH)2 e o do bioconjugado formado.
Amostras
Média da Intensidade (u.a.)
D.P.
C.V. (%)
Controle TRIS 410,66 1,52 0,37
CdS/Cd(OH)2 294,33 7,63 2,59
CdS/Cd(OH)2 - BSA 1019,50 94,04 9,22
Tabela
fluores
F535 n
Figura 5.12 – Comparativo entre as emissões, antes e após o processo de bioconjugação.
Amostras excitadas em 365 nm.
5.3 – Resultados da análise de bioconjugação por detecção quantitativa de
cência, empregando-se o filtro de excitação F355 nm (± 40 nm) e o filtro de emissão
m (± 25 nm). D.P. = desvio padrão e C.V. = variância.
400 450 500 550 600 650 700
0,0
2,0x104
4,0x104
6,0x104
8,0x104
1,0x105
CdS/Cd(OH)2- BSA
CdS/Cd(OH)2
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
79
A banda de emissão do bioconjugado se apresentou estreita (43 nm),
sem mudança de perfil e sem deslocamento do pico de emissão. Os espectros
de emissão do ponto quântico não conjugado e do bioacoplado, apresentam
valores de intensidade bastante próximos.
Sugere-se com isto, que o processo de acoplamento via crosslinker,
praticamente não interferiu nas propriedades ópticas do material e na
estabilidade coloidal.
Na Figura 5.13, são exibidos os espectros de dicroísmo circular de um
padrão de BSA na concentração de 1mg/mL e da amostra bioconjugada via
glutaraldeído 0,125%.
229.0000 259.0000 289.0000
-160
-140
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
DC
[mde
g]
λ (nm)
CdS/Cd(OH)2-BSA BSA
200 230 260 290
Figura 5.13 – Espectro de dicroísmo circular de um controle com a BSA na concentração de
1mg/mL e a amostra bioconjugada via crosslinker.
O espectro de dicroísmo circular do bioconjugado apresentou
modificações pouco significativas, apresentando perfil similar ao padrão de
BSA. O resultado apresenta indícios que aconteceu uma pequena transição de
Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA
80
α-hélice para β-folha. Entretanto, observa-se que praticamente não ocorreu
processo de desnaturação protéica.
Em trabalhos anteriores encontrados na literatura, resultados similares a
estes foram considerados indicativos de que a estrutura terciária da proteína se
manteve praticamente intacta30.
Os resultados obtidos com o processo de conjugação via crosslinker, se
apresentaram de modo satisfatório. Observa-se que, tanto a eficiência de
fluorescência do ponto quântico, quanto a estrutura secundária da proteína
sofreram alterações mínimas durante o processo de acoplamento. Sugere-se
com isto, que a metodologia que emprega o glutaraldeído apresenta viabilidade
nos ensaios de bioconjugação.
Capítulo 6
Conclusões e perspectivas
Capítulo 6: Conclusões e perspectivas
82
6.1 – Conclusões
Durante o desenvolvimento deste trabalho, as seguintes conclusões
foram obtidas:
• Os processos de obtenção e funcionalização dos pontos quânticos de
CdS/Cd(OH)2 e ZnSe/ZnS mostraram-se satisfatórios, viabilizando o
emprego destes sistemas inorgânicos em processos de bioconjugação;
• Há necessidade de otimizar os pontos quânticos sintetizados, com o
objetivo deles apresentarem uma melhor estabilidade em meio coloidal e
incremento na fluorescência;
• Após o processo de fotoativação, as NPs de ZnSe/ZnS apresentaram
aumento na intensidade de fluorescência, devido a formação da camada
de passivação proporcionada pela hidrólise dos grupamentos tióis do
estabilizante;
• Os protocolos de bioconjugação desenvolvidos se mostraram eficazes,
excetuando-se o processo de acoplamento via agentes de comprimento
zero para os pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2.
• Os bioconjugados formados foram confirmados pelo método de detecção
quantitativa da intensidade de fluorescência em fase sólida, demonstrando
que esta metodologia de caracterização é inovadora, simples, rápida e de
baixo custo;
• Os espectros de DC demonstraram que a estrutura secundária da BSA
praticamente não sofreu alteração, durante os ensaios de bioconjugação
que empregaram o glutaraldeído como agente de acoplamento;
• Os espectros de emissão dos conjugados de CdS/Cd(OH)2-BSA não
apresentaram alterações em relação ao pontos quânticos não acoplados.
Capítulo 6: Conclusões e perspectivas
83
Sugerindo que o processo de conjugação via glutaraldeído não altera as
propriedades ópticas do material;
• Os bioconjugados obtidos podem ser considerados protótipos na
preparação de imunocomplexos baseados em ligantes bioespecíficos,
visando o desenvolvimento de imunoensaios heterogêneos para o
diagnóstico sorológico de doenças.
6.2 – Perspectivas
Têm-se como perspectivas de aprimoramento deste trabalho:
• Melhorias nas reações de acoplamento durante o processo de
bioconjugação, empregando condições reacionais menos desfavoráveis
(pH e força iônica) para os sistemas inorgânicos e biomolécula;
• Utilização de maleidoimidas durante os processos de bioconjugação que
empregam agentes de comprimento zero. Este composto apresenta
reatividade ótima na faixa de pH=7-8, não interferindo na estabilidade e
funcionalidade das NPs e moléculas da proteína;
• Emprego das metodologias de bioacoplamento desenvolvidas na
formação de conjugados entre pontos quânticos e imunoglobulinas.
Visando o desenvolvimento de imunoensaios heterogêneos para o
diagnóstico sorológico de doenças.
Referências
84
REFERÊNCIAS
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ANEXO
88
Anexo A - Especificações técnicas da câmara de fotoestabilidade desenvolvida pelo Núcleo de Pesquisas em Nutrição Parenteral/UFPE. (AZEVEDO, 2008).
APÊNDICE
90
APÊNDICE A - Cálculo teórico da estimativa do diâmetro médio das nanopartículas de CdS/Cd(OH)2
10 20 30 40 50 600
10
20
30
40
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
2θθθθ
Figura A. Difratograma representativo de uma amostra de CdS/Cd(OH)2 .
Realizou-se o cálculo teórico da estimativa do diâmetro médio das
partículas por meio da equação de Scherrer:
d (Å) = (0,9 × λ) / (β × cosθ) (SANTOS, 2002).
Onde:
d – é o diâmetro médio das partículas em Å;
λ – Comprimento de onda da radiação incidente (Kα=1,5406 Å);
β – é a largura do pico de difração mais intenso a meia altura, em radianos;
θ – é o ângulo do pico mais intenso.
91
Cálculos: - Para a largura do pico de difração mais intenso a meia altura (β), foi
encontrado um valor de 2,21°. Para ser empregado na equação, o valor
encontrado deve ser convertido em Radianos.
1 Rad ----------- 57°
X ----------- 2,21°
X= 0,0387 Rad
- O ângulo do pico mais intenso, apresentou um valor de 2θ=26,74°. Portanto o
valor de θ, corresponde a 26,40°/2= 13,20°. Em seguida calculou-se o
Cosseno do valor de θ encontrado (13,30º), tendo como resultado
Cosθ=0,9731.
- Por fim, os valores obtidos foram inseridos na equação de Scherrer:
d(Å) = (0,9 x 1,5406) / (0,0387 x 0,9731)
d(Å) = 36,82 Å
Convertendo o valor encontrado em nanômetros, temos um diâmetro médio de
3,7 nm.
Observando as micrografias e o resultado do calculo teórico de
estimativa do diâmetro médio, podemos inferir que as suspensões coloidais de
CdS/Cd(OH)2 apresentam NPs de diâmetro médio no intervalo de 3,7- 8nm.
92
APÊNDICE B - Estimativa da quantidade de NPs/mL da Suspensão de CdS/Cd(OH)2 Realizou-se a estimativa da quantidade de NPs/mL, empregando como
referência o valor de diâmetro médio igual a 6 nm.
Para o sistema cristalino cúbico (blenda de zinco) a 300K, o
semicondutor sulfeto de cádmio apresenta distância entre as células unitárias
(Lattice Constant) = 0,583 nm.
Cálculos:
Assumiu-se as NPs de suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2 como
sistemas esféricos, com intuito de obter uma concentração estimada das
mesmas na suspensão.
- Inicialmente calculou-se o volume de uma nanopartícula de CdS/Cd(OH)2
com diâmetro médio de 6 nm,. Portanto, o valor do raio da NP, corresponde
3 nm..Em seguida, empregou-se a equação do volume da esfera.
V= 4/3 πr3
VNP= 4/3 x 3,14 x (3,0)3
VNP= 113,04 nm3
- Calculou-se o volume da célula unitária empregando a Lattice constant do
CdS/Cd(OH)2 cúbico a 300K.
VCEL= (0,583)3
VCEL= 0,198 nm3
93
- Em seguida, foi estimada a quantidade de células unitárias contidas em um
nanocristal de diâmetro médio= 6 nm.
VNP / VCEL= 113,04 nm3 / 0,198 nm3 = 570
Conclui-se que uma NP de diâmetro= 6 nm é formada por 570 células
unitárias. Foi possível estimar a quantidade de átomos de cádmio e enxofre em
uma NP de CdS/Cd(OH)2, pois sabe-se que cada célula unitária no formato
cúbico é constituída por 4 átomos de cádmio e 4 átomos de enxofre.
Cd – 570 células unitárias x 4 = 2280 átomos
S - 570 células unitárias x 4 = 2280 átomos
Uma nanopartícula de 6 nm de diâmetro, apresenta 2280 duplas Cd-S
em sua rede cristalina.
- Na etapa seguinte foi calculada a quantidade de átomos empregados durante
o processo de síntese.
Sabe-se que durante o processo de síntese (Seção 3.2.2), foi utilizado
2,5 x 10-5 mol de S2-, para um volume final de 100mL. Partindo-se deste valor
podemos calcular o número de átomos de S presentes na síntese, por meio do
número de Avogadro.
1mol de S----------- 6,02 x 1023 átomos
2,5 x 10-5 mol ----------- X
X= 1,5 x 1019 átomos de S na síntese.
94
- Por meio da razão entre a quantidade de átomos de S na síntese (QtdeSINT) e
a quantidade de átomos de S em uma nanopartícula (QtdeNP), estimou-se o
número de NPs (N°NPs) de CdS/Cd(OH)2 em 100mL da suspensão.
N°NPs = QtdeSINT / QtdeNP = 1,5 x 1019 / 2280
N°NPs = 6,5 x 1015 - Por fim, estimou-se o número de NPs de CdS/Cd(OH)2em 1ml da suspe
6,5 x 1015 NPs ---------- 100mL
Y ---------- 1mL
Y = 6,5 x 1013 NPs
Por meio dos cálculos realizados, pode-se concluir que a concentração fi
sistema é de 6,5 x 1013 NPs/mL.
~
nsão.
nal do
95
APÊNDICE C - Cálculo teórico da estimativa do diâmetro médio das nanopartículas de ZnSe/ZnS
10 20 30 40 50 60
0
2
4
6
8
10
12
14
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
2θ
ZnSe/ZnS
Figura B. Difratograma representativo de uma amostra de ZnSe/ZnS .
Realizou-se o cálculo teórico da estimativa do diâmetro médio das
partículas por meio da equação de Scherrer:
d (Å) = (0,9 × λ) / (β × cosθ) (SANTOS, 2002).
Onde:
d – é o diâmetro médio das partículas em Å;
λ – Comprimento de onda da radiação incidente (Kα=1,5406 Å);
β – é a largura do pico de difração mais intenso a meia altura, em radianos;
θ – é o ângulo do pico mais intenso.
96
Cálculos: - Para a largura do pico de difração mais intenso a meia altura (β), foi
encontrado um valor de 4,65°. Para ser empregado na equação, o valor
encontrado deve ser convertido em Radianos.
1 Rad ----------- 57°
X ----------- 4,65°
X= 0,0815 Rad
- O ângulo do pico mais intenso, apresentou um valor de 2θ=27,6°. Portanto o
valor de θ, corresponde a 27,6°/2= 13,8°. Em seguida calculou-se o Cosseno
do valor de θ encontrado (13,8º), tendo como resultado Cosθ=0,9711.
- Por fim, os valores obtidos foram inseridos na equação de Scherrer.
d(Å) = (0,9 x 1,5406) / (0,0815 x 0,9711)
d(Å) = 17,52 Å
Convertendo o valor encontrado em nanômetros, temos um diâmetro médio de
1,75 nm.
Observando as micrografias e o resultado do calculo teórico de
estimativa do diâmetro médio, podemos inferir que as suspensões coloidais de
ZnSe/ZnS apresentam NPs de diâmetro médio no intervalo de 1,7- 3nm.
97
APÊNDICE D - Estimativa da quantidade de NPs/mL Realizou-se a estimativa da quantidade de NPs/mL, empregando como
referência o valor de diâmetro médio igual a 2 nm.
Para o sistema cristalino cúbico (blenda de zinco) a 300K, o
semicondutor seleneto de zinco apresenta distância entre as células unitárias
(Lattice Constant) = 0,566 nm.
Cálculos:
Assumiu-se as NPs de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS como
sistemas esféricos, com intuito de obter uma concentração estimada das
mesmas na suspensão.
- Inicialmente calculou-se o volume de uma nanopartícula de ZnSe/ZnS com
diâmetro médio de 2 nm,. Portanto, o valor do raio da NP, corresponde
1 nm..Em seguida, empregou-se a equação do volume da esfera.
V= 4/3 πr3
VNP= 4/3 x 3,14 x (1,0)3
VNP= 4,18 nm3
- Calculou-se o volume da célula unitária empregando a Lattice constant do
ZnSe/ZnS cúbico a 300K.
VCEL= (0,566)3
VCEL= 0,181 nm3
98
- Em seguida, foi estimada a quantidade de células unitárias contidas em um
nanocristal de diâmetro médio= 2 nm.
VNP / VCEL= 4,18 nm3 / 0,181 nm3 = 23
Conclui-se que uma NP de diâmetro= 2 nm é formada por 23 células
unitárias. Foi possível estimar a quantidade de átomos de zinco e selênio em
uma NP de ZnSe/ZnS, pois sabe-se que cada célula unitária no formato cúbico
é constituída por 4 átomos de zinco e 4 átomos de selênio.
Zn – 23 células unitárias x 4 = 92 átomos
Se - 23 células unitárias x 4 = 92 átomos
Uma nanopartícula de 2 nm de diâmetro, apresenta 92 duplas Zn-Se em
sua rede cristalina.
- Na etapa seguinte foi calculada a quantidade de átomos empregados durante
o processo de síntese.
Sabe-se que durante o processo de síntese (Seção 3.2.2), foi utilizado
1 x 10-3 mol de Se, para um volume final de aproximadamente 71mL. Partindo-
se deste valor podemos calcular o número de átomos de Se presentes na
síntese, por meio do número de Avogadro.
1mol de Se ----------- 6,02 x 1023 átomos
1 x 10-3 mol ----------- X
X= 6,02 x 1020 átomos de Se na síntese.
99
- Por meio da razão entre a quantidade de átomos de Se na síntese (QtdeSINT)
e a quantidade de átomos de Se em uma nanopartícula (QtdeNP), estimou-se o
número de NPs (N°NPs) de ZnSe/ZnS em 71mL da suspensão.
N°NPs = QtdeSINT / QtdeNP = 6,02 x 1020 / 92
N°NPs = 6,54 x 1018 - Por fim, estimou-se o número de NPs de ZnSe/ZnS em 1ml da suspensão
6,54 x 1018 NPs ---------- 71mL
Y ---------- 1mL
Y = 9,21 x 1016 NPs
Por meio dos cálculos realizados, pode-se concluir que a concentração fina
sistema é de 9,21 x 1016 NPs/mL.
~
.
l do
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