8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
1/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
2/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
3/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
4/100
Enzime de restrictie de tipul I cu activitate anucleazei si metilazei intr-o singura enzima.
Ele se unesc 4-6pb ale ADN-ului gazda-
specific, fiind separate de 6-8pb si continandadenine metilate.
Zona de secţionare a ADN poate fi realizata la
o distanta de 1000 bp (perechi de baze) delocatia alipirii enzimei.Un exemplu este enzima EcoK intalnit la E.coli
K12. Aceasta recunoaste locatia:• 5’- A C N N N N N N G T G C• T G N N N N N N C A C G – 5’ • unde N reprezinta nucleotidele nonspecifice
iar rezidurile de adenina (A) sunt metilate.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
5/100
Tipul III• Tipul III de enzime de restrictie se aseamana cu cele
de Tip I in capacitatea lor de a metilan si de arestrictiona (de a taia) ADN-ul.
• Asemenea tipului I, acestea sunt enzime complexecu doua subunitati.
• Locatiile de recunoastere ale acestor enzime suntasimetrice iar clivajul substratului de ADN apare de laperechile de baze 24 – 26 spre capatul 3’.
• Un exemplu al tipului III de enzime este HINF III alH. influenzae. Recunoaste locatiile:
• 5’ - C G A A T• G C T T A –5’
• unde metilarea adeninei apare doar pe o catena.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
6/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
7/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
8/100
• Taierea ADN-ului la secvente specifice sta la baza multor
proceduri in tehnologia moleculara, inclusiv cartografierea,clonarea, ingineria genetica si analiza mutatiilor .
• Enzimele de restricite sunt folosite frecvent in laboratorul clinic,spre exemplu in analiza rearanjarii/redispunerii genelor si indetectarea mutatiilor.
• Desi toate enzimele de restrictie tip II functioneaza prinsimetria bilaterala, modelul lor bicatenar se desface diferit.
• Unele enzime desfac structura duplex printr-o separareesalonata la nivelul punctelor de recunoastere, lasand 2-4baze suspendate la capetele lanturilor ADN.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
9/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
10/100
Enzime tip II
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
11/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
12/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
13/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
14/100
These cuts produce
“blunt ends”
5’ TGACGGGTTCGAGG CCAG 3’ 3’ ACTGCCCAAGGT CC GG TC 5’
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
15/100
The names for restriction enzymes comefrom:
• the type of bacteria in which the enzyme is found
• the order in which the restriction enzyme was
identified and isolated.EcoRI for example
R strain of E.coli bacteria
I as it is was the first E . coli restriction enzyme tobe discovered.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
16/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
17/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
18/100
More examples of restriction sites ofrestriction enzymes with their cut sites
Hind III : 5’ AAGCTT 3’ 3’ TTCGAA 5’
Bam HI : 5’ GGATCC 3’
3’ CCTAGG 5’
Alu I : 5’ AGCT 3’
3’ TCGA 5’
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
19/100
• Unele enzime de restricţie prefera ADNmonocatenar altele preferandu-l pe cel
bicatenar.• Endonucleazele repararatoare functioneaza
in
• zonele de denaturare ale ADN-ului, cum ar fiportiunile fara baze (apurinice si apirimidinice),
• zone cu dimeri de timina sau cu baze
nepotrivite.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
20/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
21/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
22/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
23/100
• Eliminarea bazelor eronate este urmatăde încorporarea bazei corecte cu
ajutorul ADN polimerazei. Aceastăactivitate se exercită pe ADN simplu saudublu catenar.
• - activitatea exonucleazei 5'-3', enzimeleelimină nucleotidele de la 5' a ADN dublucatenar.
• Această activitate este utilizată în tehnicade marcaj prin translaţia secţiunii.
ADN li I
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
24/100
• ADN polimeraza I
• Această enzimă a fost purificată la început din culturibacteriene ale E. coli, exercită o activitate de ADN
polimerază, astfel că are două activităţi deexonucleaze.
• Activitatea exonucleazică 5'-3' a ADN pol I poate fiexercitată pe un hibrid ARN/ADN , ea esterezultatul deci a unei activităţi de RNază Hintrinsecă care constă în eliminarea unui lanţ de ARN
prin activitatea exonucleazei 5'-3'.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
25/100
• Această proprietate a fost exploatată în
reacţia de revertranscripţie pentrueliberarea primului lanţ de ADNsintetizat şi va permite sinteza unuiasecundar.
• El va avea rol de amorsă necesară şi la
sinteza celui de-al doilea lanţcomplementar.
L t lă t i lt i tili t
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
26/100
• La ora actuală sunt şi alte enzime utilizatepentru efectuarea de reacţii dereverstranscripţie.
• În activitatea exonucleazei 5'-3' a ADN pol Iare loc eliminarea unui grup fosfat în 5', careduce la imposibilitatea reacţiei de elongaţie.
• În consecinţă domeniul de aplicaţie al acesteienzime este de a limita marcajul sondei printranslaţia secţiunii, aplicaţie în care ea este
utilizată în strânsă legătură cu DNaza I.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
27/100
• Fragmentul Klenow se realizează printr -oproteoliză limitată a ADNpol I de la E.coli,enzimă monomerică care generează douăfragmente, foarte mari.
• Ele au pierdut activitatea exonucleazică 5'-3'dar conservă activitatea exonucleazică 3'-5' şicea de ADNpolimerază.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
28/100
• Aplicaţiile fragmentului Klenow:
• secvenţierea după metoda Sanger
• sinteza unui lanţ de ADN complementar
• marcare izotopică (32PdNTP) aextremităţii 3' a ADN prin reacţia deschimbare a nucleotidelor reci contranucleotidelor marcate, catalizată prinactivitate exonucleazică.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
29/100
• ADN polimeraza bacteriofagului T4 şi T7catalizează transferul fosforului radioactivγ32P pe ATP.
• Astfel ATP este marcat cu 32P pe a treia
grupare a fosfatului de pe extremitatea 5 afragmentului de ADN.
• Tehnica este aplicată pentru obţinerea
oligonucleotidelor marcate care vor fi utilizateca sonde pentru criblajul băncilor.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
30/100
• T4 ADN polimeraza
• Această enzimă a fost izolată la începutdin bacterioagul T4.
• ADN pol T4 şi are o activitate
exonucleazică 3'-5' foarte eficace pe ADN monocatenar şi este de 200 de orimai activă decât fragmentului Klenow de
la E.coli
• T7 ADN polimeraza
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
31/100
• T7 ADN polimeraza
• Această enzimă a fost obţinută prin izolarea ei de labacteriofagul T7, după infecţia bacteriei E.coli cu
fagul.• Este caracterizată prin eficacitate de sinteză,
replicarea rapidă a fagului în cursul ciclului de infecţie.
• Ea posedă în acelaşi timp o activitate exonucleazică3'-5' puternic exprimată, de aproximativ de 1000 deori mai mare decât a fragmentului Klenow. Aceastăactivitate importantă exonucleazică explică fidelitatea
mare a T7 ADN pol.• Aplicaţii principale:
• marcarea ADN în 3'
• mutageneza dirijată
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
32/100
• T7 ADN pol modificată: secvenoza
• Tratamentul chimic al T7 ADNpol modifică
enzima diminuând considerabil activitateaexonucleazică.
• Enzimele obţinute – secvenoza 1.0 şi 2.0 suntutilizate în reacţiile de secvenţiere de bunăcalitate.
• Taq ADNpol a fost izolată din Thermus
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
33/100
• Taq ADNpol a fost izolată din Thermusaquaticus. Prezintă particularitatea de a sedezvolta în izvoare calde la 80˚C. Este supusă
la temperaturi extreme.• Este o pol dependentă ADN. Posedă de
asemenea activitate exonucleazică 5'-3' dar
este lipsită de funcţii corectoare.• Temperatura optimă de funcţionare de 70-75˚C.
• Originea sa îi conferă o stabilitate remarcabilă
la temperaturi înalte. Timpul de înjumătăţireeste mai mare de două ore la 92˚C şi de 40minute la 95˚C.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
34/100
Heat-stable DNA polymerase
• Taq DNA polymerasewas isolated from thebacterium Thermusaquaticus.
• Taq polymerase is
stable at the hightemperatures (~95oC)used for denaturingDNA.
Hot springs at YellowstoneNational Park, Wyoming.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
35/100
PCR
• Această termorezistenţă stă la baza utilizării
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
36/100
• Această termorezistenţă stă la baza utilizăriisale în metode de amplificare genică precumPCR în timpul cărora se efectuează numeroase
cicluri termice care presupun temperaturi de 90-95˚C.• Alt avantaj hibridarea amorselor cu matricea
se face la o temperatură mai mare ceea cedetermină hibridarea specifică.
• Sensibilitate tehnicii este mare. Aceastăenzimă a fost clonată.
• Un anumit număr de ADN pol termostabile aufost extrase din alte bacterii Archebacterii şiEubacterii. Fiecare are o particularitate şi outilizare specifică.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
37/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
38/100
• începând de la amorse aleatorii numitehexanucelotide .
• RT este o ADN polimerază ARNdependentă.
• Această enzimă transformă ARN în ADN-ul său complementar şi poate sintetiza lanţ
compelmentar ADN nou sintetizat (seobţine un ADN dublu catenar).
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
39/100
Morfologie şi structură virusului HIV
Virion de formă sferică, diametru de 100nm, acoperit deo anvelopă prevăzută cu spiculi. Genomul este ARN monocatenar, compus din 3 gene
“gag“, “pol“,“env“.
“gag”-codifica proteinele capsidale“pol”- codifica enzimele virale“env”- codifica proteinele anvelopeiReverstranscriptaza este o enzimă caracteristică
retrovirusurilor
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
40/100
• ARN polimeraza
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
41/100
ARN polimeraza• T7 ARNpol este produsă de bacteriofagul T7, are o
specificitate crescută pentru situsul promotor al faguluiT7 de iniţiere a transcripţiei.
• Este foarte utilizată pentru sinteza 5'-3' in vitro a ARNobţinând sonde ARN şi
• poate fi utilizată pentru secvenţierea ADN clonat într -
un vector care conţine secvenţa promotoare T7. • Aplicaţii: sinteza ARN pornind de la ADN pentruobţinerea de sonde.
• SP6 ARNpolimeraza
• Spre deosebire de cealaltă enzimă aceasta esteprodusă de SP6 , cu afinitate foarte mare pentrusecvenţa situsului promotor SP6. Este utilizată pentrusinteza sondelor ARN.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
42/100
• T3 ARNpolimeraza
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
43/100
T3 ARNpolimeraza • Este ADN dependentă având o mare afinitate pentru
secvenţa promotorului bacteriofag T3, transcrie ADN în ARN de la 5' la 3'. Aplicaţii identice cu T7
ARNpolimeraza. • QB replicaza este ARN dependentă in vitro avândfuncţia de replicare a ADN genomic al fagului QB. Eaidentifică ADN de replicat pe baza structurii secundare.
• Enzime de modificare • Fosfataza alcalină catalizează hidroliza grupării 5'PO4 a ADN şi ARN eliberând un rest fosfat şi creândo extremitate 5'OH.
• Aplicaţii: prevenirea legării vectorilor de clonaj peei însăşi eliminând posibilitatea de formare alegăturilor fosfodiester; eliminarea grupării 5'PO4
înainte de marcajul acizilor nucleici prin T4polinucleotid kinaza.
• Această enzimă este foarte des utilizată ca
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
44/100
• Această enzimă este foarte des utilizată cagenerator de semnal de unde naturadependentă de substratul utilizat în sisteme de
detecţie a acizilor nucleici. • Polinucleotidkinaza catalizează transferul uneigrupe gama fosfat de la un ATP la extremitatea5'OH a unui ADN sau a ARN.
• ADN nativ fosfatat în 5' este adesea necesar săfie tratat în prealabil cu fosfatază.
• Aplicaţii: marcarea unei sonde ADN sau ARN în
5' terminal;• marcarea unei amorse utilizate pentru secvenţa
markerilor radioactivi utilizând gamma 32P,
gamma 33P şi gamma 35S.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
45/100
• ADN ligaza asigură formarea legăturilor
fosfodiester între deoxiriboză 3'OH şi 5'PO4 a
două nucleotide adiacente.• Permite legarea sau lipirea a două ADN dublucatenare.
• Are într-un fel activitate inversă enzimelor de
restricţie. • Aplicaţii: subclonarea produşilor de amplificare în vectori.
• Există T4 ADN ligază care leagă extremitatea5'PO4 a unui ADN sau ARN monocatenar cuextremitatea 3'OH.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
46/100
• Nucleazele sunt enzime care ataca aciziinucleici fie de la extremitatea 5' sau 3'
numite şi exonucleaze, fie din interiorsau endonucleaze.• ARNaza sau RNaze sunt endonucleaze
care hidrolizează puntea fosfodiesterică
de ARN: A, T1 şi H. • - RNaza A extrasă din pancreasul debovine distruge ARN monocatenar
îndeosebi după resturile C şi U.
• Hibrizii ADN- ARN şi ARN dublu catenarsunt rezistenţi.
Inhibitorii de RNază
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
47/100
• Inhibitorii de RNază • Inhibă activitatea RNazelor şi împiedică
distrugerea ARN de către acestea.• Aplicaţii: protejează ARNm în cursul RT; creşte
randamentul sintezei sondelor de ARN cuajutorul ARN polimerazelor; toate aplicaţiile în
care există riscul de degradare a ARN de cătreRNază • Proteinaza K, enzimă utilizată de extracţia
acizilor nucleici. Digeră celule întregi, nucleulchiar ţesuturi făcând astfel accesibil ADN şi ARN. Este stabilă la 40-60˚Cşi eficace înprezenţa detergenţilor, dintre care cel mai bun
este SDS anionic. • Alţi detergenţi neionici pot fi utilizaţi Non I P40
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
48/100
Alţi detergenţi neionici pot fi utilizaţi Non I, P40şi TWIN20.
• Ea şi pierde activitatea proteazică latemperatua de 90˚C.
• Aplicaţii: extracţia acizilor nucleici.
• Agaraza permite eliberarea acizilor nucleicidintr-un gel de agaroză. Digeră agaroza, dar nudistruge acizii nucleici. Este un mijloc deextragere a ADN din agaroză.
• Extracţie şi purificarea ADN
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
49/100
Extracţie şi purificarea ADN • Extracţia ADN • Comportă:recoltarea şi păstrarea probelor şi extracţia
propriu-zisă • Probele ADN trebuie potejate de: inhibitori aienzimelor utilizate (inhibitori ai Taq polimerază),nucleaze care pot degrada acizii nucleici (ARN este în
special sensibil).• Frecvent sunt probe totale de sânge ele pot fiseparate în plasma , ser şi leucocite. Alte medii curentfolosite sunt din:culturi (fagi, bacterii), urină, lichid
cefalorahidian, expectoraţii, probe rezultate prinpuncţionare şi biopsie. • Condiţii de prelevare• Probele trebuiesc recoltate steril.
• O probă de sânge poate fi colectată în tub uscat dacă
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
50/100
O probă de sânge poate fi colectată în tub uscat dacăcercetările obţinute se realizează din ser sau pe EDTAdacă se lucrează pe plasmă.
• Este recomandată lizarea globulelor roşii înainte deextracţia ADN ( de exemplu liza cu clorură deamoniu) apoi purificarea globulelor albe.
• Dacă se utilizează un anticoagulant trebuie să ţinem
cont de natura sa. Heparina este un inhibitor pentruTaq polimerază mai mult sau mai puţin dificil deeliminat după procesul de extracţie utilizat.
• Ţesuturile sunt bogate în nucleaze (proteaze, DNazeşi RNaze).
• În cazul LCR este recomandat păstrarea la frigider,imediat după recoltare. Este cunoscut faptul că LCR şi
urina sunt medii bogate în inhibitori.
• ARN este o moleculă fragilă foarte sensibilă
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
51/100
• ARN este o moleculă fragilă, foarte sensibilăla RN azele care sunt frecvente în mediupână şi pe degete.
• În cazul studiilor de ARN probele saufracţiunile lor trebuiesc congelate la -80°C înprimele 3 ore după recoltare.
• Probele pot fi expediate în gheaţă carbonică. În timpul manipulării este indispensabil săevităm contaminarea probei şi ARN să fieconservat (este fragil).
• Se recomandă: purtarea mănuşilor,autoclavarea materialelor, utilizarea de pipetespecial rezervate acestui scop la capete cu
filtre sterile. • În funcţie de tipul ADN-ului se cunosc 2
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
52/100
În funcţie de tipul ADN ului se cunosc 2tehnici de extracţie pentru tipul genomic şipentru cel plasmidic.
• Extracţia ADN cromozomial sau genomic • Metoda fenol cloroform • Extracţia ADN din sânge total este cea mai
utilizată. Parcurge 3 etape: • -liza celulelor şi denaturarea complexelornucleoproteice pentru eliberarea ADN dinmediul intracelular
• -extracţia propriu-zisă pentru eliminareaproteinelor
• -precipitarea pentru purificarea ADN
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
53/100
• Obţinerea fracţiunii de extras
• În practică ADN situat în celulele nucleate serecuperează centrifugând leucocitele pebaza gradientului de densitate.
• Se poate centrifuga tubul la viteză joasă şise recoltează de la interfaţă dintre plasmăşi coagulul de globule roşii.
• După spălare cu soluţie tampon proba estegata de extracţie.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
54/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
55/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
56/100
• Liza celulelor şi denaturarea complexelor
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
57/100
ş pnucleoproteice pentru eliberarea ADN din mediulintracelular
• Un sistem utilizat curent adaptat la toate tipurile deprobe este amestecul detergent/proteinază caredisociază ţesuturile, celulele, capsida virusurilor şieliberaază acizii nucleici.
• Proteinaza K, enzimă utilizată pentru extracţia acizilornucleici.
• Digeră celule întregi, nucleul chiar ţesuturi făcând
astfel accesibil ADN şi ARN. • Este stabilă la 40-60˚Cşi eficace în prezenţadetergenţilor, dintre care cel mai bun este SDS(dodecylsulfat de sodiu) anionic. Ea îşi pierde
activitatea proteazică la temperatua de 90˚C.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
58/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
59/100
• Fierberea in 8% sucroza, 8% detergent TritonX-100, tampon Tris si EDTA dupa tratarea cu
lizozim, determină eliberarea ADN ce poate fiimediat precipitat in alcool.
• ADN-ul extras cu NaOH sau prin procedurile
de fierbere, este denaturat (monocatenar) sieste posibil sa nu fie potrivit pentru metode carefolosesc enzimele de restrictie ce necesita ADNbicatenar.
• Avantajul acestor tipuri de extractie este vitezasi simplicitatea. Metodele de amplificare vorfunctiona folosind acest tip de izolare a ADN-
E t ţi i i ă
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
60/100
Extracţia propriu-zisă • Dupa eliberarea ADN-ului din celula, purificarile
ulterioare necesita eliminarea proteinelor,lipidelor, carbohidratilor si resturilorcelulare.
• Acest lucru este realizat folosind o combinatie
de salinitate mare, pH scazut si o mixturaorganica de fenol si cloroform. • Combinatia dizolva usor contaminantii
hidrofobici ca lipidele si lipoproteinele,
colecteaza resturile celulare si elimina cele maimulte proteine ADN-asociate.•
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
61/100
• Cand sunt adaugate fenol si cloroform din lizatull l hid fili f l i bif i
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
62/100
celular hidrofilic, se formeaza o emulsie bifazica.• Centrifugarea va favoriza aşezarea stratului hidrofobic
(lipidele si alte componente hidrofobice) la baza sistratul hidrofilic deasupra.
• ADN-ul se va dizolva in etapele apoase superioare. • Componentele amfifilice ce au atat proprietati
hidrofobice si hidrofilice ca si resturile celulare, se voraduna formand un precipitat alb la interfata dintre celedoua straturi.
• Etapa superioara, contine ADN colectat ce apoi
este precipitat folosind etanol sau isopropanol intr-o concentratie mare de sare (amoniu, potasiu sauacetat de sodiu, litiu sau clorura de sodiu).
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
63/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
64/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
65/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
66/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
67/100
• ARN-ul viral poate fi izolat direct din ser
sau alte fluide prin intermediul sferelor sau coloanelor special formate.
• Ca majoritatea metodelor de izolare a ADN-ului, nu se poate face diferenta intre ARNul microorganismelor si cel al celuleigazda, prin urmare folosirea unui preparat
fara celule fiind cea mai potrivita.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
68/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
69/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
70/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
71/100
• ADNaze pot fi adaugate direct in ARN ul
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
72/100
• ADNaze pot fi adaugate direct in ARN-ulabsorbit din coloana pentru a indeparta
ADNul contaminant.• Solutiile de spalare si eluantul pot fi atraseprin coloana, de catre gravitate, vid sau
forta centrifuga.• Coloane mici de material silica-based ce sepotrivesc inauntrul microtuburilor suntfolosite pe scara larga pentru izolarea derutina a acidului nucleic din toate tipurile despecimene.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
73/100
Extractia organica a ARN-ului total
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
74/100
g
Izolarea ARN-ului pe matrice
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
75/100
Izolarea ARN ului pe matricesolida
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
76/100
• Dupa spalarea ARN-ului rezidual, ARN-ul polyA
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
77/100
Dupa spalarea ARN ului rezidual, ARN ul polyAeste developat prin spalarea coloanei cu solutietampon calduta, slab salina ce contine detergent.
• Prin aceasta abordare, se poate obtine aproximativ30-40 ng de mARN din 1 microgram de ARN total.
• Exista limitari ale izolarii ARN-ului polyA folosind
oligo dT sau dU.• Eficienta legaturii polyA sau polyU este variabila.
• Structura secundara (puntile de hidrogenintracatenare sau intercatenare) din proba tintapoate concura cu legarea la oligomerul de prindere.
• Unele ţesuturi ca pancreasul, lichidulcefalorahidian (LCR) sunt foarte bogate în
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
78/100
cefalorahidian (LCR) sunt foarte bogate înRNaze.
• Deşi nu este posibil să le eliminăm, ele suntcapabile să se renatureze după supunereala şoc termic.
• Totuşi după încăzire adaosul deβmercaptoetanol agent reducător, ajută lapăstrarea RNazelor în stare denaturată
împiedicând reformarea punţilor disulfidice.
• Este indispensabilă neutralizarea acţiunii lor înlizatul celular tratând proba cu detergenţi şiagenţi haotropici ca βmercaptoetanol şitiocianat de guanidină.
• În laborator sunt două surse de contaminare cuRNaze: mâinile operatorului şi germenii în suspensie
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
79/100
RNaze: mâinile operatorului şi germenii în suspensiedin aer care se depun pe sticlărie şi consumabile.
• Deci este esenţial să se lucreze permanent cu
mănuşi, să se utilizeze materiale de unică folosinţă,sticlăria să fie tratată cu dietilpirocarbonat (DEPC0,1%) inhibitor puternic de RNază - apoi autoclavată (DEPC intră în reacţie cu bazele purinice), fie să fiesupusă la temperaturi foarte mari (200°C) la autoclavfără tratament cu DEPC.
• Materialul plastic este decontaminat cu sodă caustică0,1 N şi EDTA 1 mM apoi spălat cu DEPC. Reactivii şitampoanele trebuie tratate cu DEPC apoi autoclavate.
• Pentru tamponul TRIS nu se face autoclavare dar seutilizează apă tratată cu DEPC pentru preparareatamponului. Apa deionizată este în principiu lipsită de
ARNază.
• In concluzie sunt necesare trei etape succesive pentruobţinerea ARN purificat
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
80/100
obţinerea ARN purificat. • 1. Liza celulară. Se folosesc două grupe de
detergenţi puternici care inhibă RNazele. În primagrupă agentul disociant utilizat este t ioc ianatul deguanidină (GTC) iar în a doua se asociază cu
βmercaptoetanol . Ambii sunt inhibitori de RNază.• Utilizarea combinată permite disocierea proteinelor
liza celulelor, inactivarea RNazelor şi denaturareaARN.
• Dacă se doreşte eliminarea riscului de contaminare ARN cu ADN este necesară tratarea cu DNază.
• Tehnica uneşte metode care necesită utilizareafenolului şi a detergentului. Adesea se adaugă uninhibitor de RNaze /RNasin) izolat din pancreas debovine. RNazele sunt de asemenea inactivate cuSDS roteinaza K.
• 2. Extracţia propriu –zisă a ARN • ARN este extras cu fenol/cloroform Separarea se
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
81/100
• ARN este extras cu fenol/cloroform. Separarea seface pe baza precipitării diferite a ARN şi ADN înfuncţie de pH. În condiţii de pHacid ARN rămâne în
soluţie apoasă. ADN şi proteinele fiind în interfază.• În mediu alcalin ADN rămâne în soluţie apoasă. • 3.Precipitarea ARN. Se efectuează similar cu ADN cu
izopropanol sau etanol de asemenea se face spălarecu etanol 70%.
• ARN se mai poate obţine cu bile magnetice.• Există numeroase kituri de extracţie rapidă.
• Dozarea ARN. Poate fi necesară în Northern blot,RNazin Protein Assey.• Spectrofotometria. Este cea mai utilizată şi măsoară
densitatea optimă la 260-280 nm a unei diluţii de ARN.
• Sinteza unui ADNc in vi t ro M i l i t di ARN t dif ită di
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
82/100
• Manipularea şi studiu ARN este diferită dincauza marii sensibilităţi la ribonucleaze care-l
distrug. Este necesară recopierea secvenţei de ARN pentru a crea o structură stabilă şi care vafi amplificată în funcţie de necesităţi .
• ARNm purificat, utilizâd cromatografia prinafinitatea pe o coloană de oligodezoxitimidina,este legat în prima etapă cu oligonucleotide
poliT care se ataşează la coada polyA.
• Pornind de la extremitatea 3 a acestei amorse poly T, transcriptaza inversă, care este o ADN
polimerază, sintetizează un lanţ de ADNcomplementar al mesagerului de po rnire
• Odată ce s-a realizat această sinteză se degradeazăARN i t b ă t ib l ă
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
83/100
ARN printr-o bază tare sau o ribonucleazăspecifică.
• Lanţurile de ADN constituite formează spontan obuclă la extremitatea 3, sub forma de agrafă de păr,care se hibridează pe ea însăşi.
• Extrem itatea 3 a acestei bucle va servi ca situs de
demaraj pent ru ADN po l imeraza, care va sintet izaun lanţ de ADN complementar primei . Oribonuclează specifică ADN-ului monocatenar vasuprima bucla la extremitate.
• ADNc dublu catenar este sintetizat. Se poate astfelconstitui atât ADNc câţi ARNm există într -o celulă;• ansamblul acestor ADNc formează o bancă deADNc.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
84/100
• Electroforeza • Electroforeza este o metoda de separare a
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
85/100
Electroforeza este o metoda de separare aparticulelor incărcate electric prin migrarediferenţială sub actiunea unui câmp electric. Ne
permite cuantificarea de manieră precisă a ADN şi ARN, iar în anumite cazuri, aprecierea cantităţii deacizi nucleici prezenţi (prin raportarea la un markerde talie cunoscută).
• Se poate utiliza hârtie, acetat de celuloza, gel depoliacrilamidă, gel de agaroză, gel de amidon, gel desiliciu. Există două tipuri de gel utilizate mai frecventagaroză şi poliacrilamidă care permit o separaremai bună.
• Agaroza, polizaharid extras dintr-o varietate de algăroşie, este un polimer al unei unităţi dizaharidice; la încălzire în soluţii apoase formează hidrosoli, care larăcire se transformă în hidrogel.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
86/100
• n trecerea prin mediul de agaroză sau acrilamidă,moleculele se separă în funcţie de dimensiune.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
87/100
• Cele mai mari sunt reţinute, iar cele mai micimigrează.
• Acrilamida are putere mai mare separatoare decâtagaroza însă este mai toxică.• Tehnica electroforezei• După formarea, turnarea gelului, trasarea godeurilor şi
solidificarea acestuia se vor introduce probele de ADN.• În primul godeu se introduce un marker cunoscut, care
permite estimarea mărimii fragmentelor de ADN. Seutilizează frecvent ADN de fag restrictat cu oanumită enzimă. Fragmentele rezultate au o mărimecunoscută, ceea ce permite folosirea lor ca etalon.
• În godeurile rămase se introduc pe rând probele careurmează să fie analizate.
• Se adaugă doi coloranţi: unul bine vizibil pe gelcare va migra foarte rapid, albastru de bromfenol,
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
88/100
g p , ,pus înaintea fragmentelor de ADN pentru a delimitadistanţa parcursă până la anod.
• Al doilea, brom ura de et id iu, care se seintercalează între bazele de acizi nucleici şiimprimă o culoare oranj când acestea sunt expusela lumina UV. Astfel, moleculele de ADN
complexate cu bromură de etidiu devin vizibile. • Aparatul de electroforeză se cuplează la o sursă de
curent . Polul pozitiv este opus godeurilor.Cândfrontul de migrare ajunge în apropierea capătului
opus al gelului, se întrerupe sursa de curent. Sescoate tăviţa cu gel şi se vizualizează în UV la 254nm, se vor fotografia fragmentele de ADN digerate
în gel.
• Distanţa de migraţie este proporţională masamoleculară: există o proporţionalitate inversă între
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
89/100
moleculară: există o proporţionalitate inversă întremobilitatea şi logaritmul masei, dar relaţia estevalabilă pentru moleculele liniare având sub 20 kb.
Se determină astfel mărimea fragmentelor derestricţie obţnute şi se compară cu a celor demărime cunoscută.
• migrarea moleculelor mari de 20kb este aproapeindependentă de mărime şi nu mai apare o relaţie delinearitate;
• conformaţia cerc deschis CD/OC - open circle, cerccovalent închis CCI/CCC – covalenty closed cirle. Laaceeaşi masă moleculară, CCI au cea mai mare
mobilitate pe când conformaţia CD este mai lentă.Moleculele liniare au o mobilitate intermediară. • tamponul de electroforeză folosit este Tris Acetat
(TAE).
• După migrare probele se citesc la UV.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
90/100
• În unele cazuri moleculele care trebuiesc
separate sunt marcate prin încorporarea unuiizotop radioacitv care permite detectareaprin autoradiografie.
• Particulele energetice emise de radioizotopimprimă un film fotografic pe gel. Sedevelopează pentru a se vedea benzile negrecare corespund moleculelor marcate radioactiv.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
91/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
92/100
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
93/100
• La separarea unui amestec de proteineeste puţin probabilă alegerea acelui set decondiţii să poată garanta cel mai bun grad
de separare a fiecărei componente decelelalte.• Dacă într -un gel se obţine o singură bandă
această nu conţine în sine dovada
prezenţei unei singure componenteomogene.
• Gelurile plate verticale G i l il 0 5 1 5 C ât t
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
94/100
• Grosimea gelurilor 0,5-1,5 mm. Cu cât suntmai subţiri cu atât sunt mai rapide şi
eficiente pentru colorare, decolorare, iarrăcirea din timpul electroforezei este mairapidă şi mai uniformă. Aceasta permite
aplicarea unei tensiuni mai mari şi a unor timpide acţiune mai reduşi.
• Gelurile sunt obţinute în forme separate care
ulterior sunt inserate în aparat cu ajutorul unorgarnituri de cauciuc şi introduse în tamponul cereprezintă mediul de răcire (răcire realizată prinmijlocirea tuburilor de apă).
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
95/100
• Un colorant trasor este albastru debromfenol. Acesta migrează cu o vitezămai mare decât oricare dintrecomponententele macromoleculare aleprobei şi indică momentul stopăriielectroforezei.
• Gelurile se introduc în baie de colorant cu
bromură de etidiu 3 minute, apoi seexaminează la o lampă cu ultraviolete.
• Lipoproteinele, au caracter parţial proteic pot ficolorate înaintea electroforezei pentru a le deosebi deproteine Se foloseşte Sudan Black B
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
96/100
proteine. Se foloseşte Sudan Black B.• Există densiometre laser care scanează gelurile la
nivele de rezoluţie extrem de ridicată. Răspunsulscanner-ului poate fi computerizat ceea ce permite înregistrarea, redarea, evaluarea şi stocarea datelorpe disc sau imprimarea lor, precum şi compunerea adouă geluri diferite.
• Semnalul densitometric este preluat, înregistrat şi estecuantificat prin măsurarea suprafeţelor de sub peak-urile individuale.
• Se poate recurge la integrarea electronucă sau prin
achiziţionarea de date pentru calcul computerizat alsuprafeţelor de sub peak, metodă folosită pentruscanarea unui număr mai mare de geluri. Înălţimeapeak-ului depinde de distanţa materialuluiparcursă prin gel.
• Electroforeza proteinelor • Proteinele se pot separa prin electroforeză ca şi
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
97/100
• Proteinele se pot separa prin electroforeză ca şiacizii nucleici. Suportul poate fi acetat de celuloză,
pentru proteinele din serul uman, sau hârtie, într-untampon de pH de 8,6.
• Benzile corespunzătoare proteinelor separate,sunt vizualizate prin colorare cu un colorant
specific şi printr -o scanare densiometrică se obţinindicaţii despre cantitatea relativă a proteinelor dinfiecare bandă separată.
• Deşi mobilitatea proteinelor depinde în special desarcina electrică relativă a acestora, dimensiuneaproteinelor joacă de asemenea un rol important şiaceasta contribuie desigur la poziţia benzii
corespunzătoare moleculei de γglobulină • Electroforeza proteinelor în gel de poliacrilamidă • Gelul de poliacrilamidă se poate folosi în locul
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
98/100
Gelul de poliacrilamidă se poate folosi în loculacetatului de celuloză sau al hârtiei pentru separarea
proteinelor native.• Un astfel de gel este folosit în mod obişnuit înprezenţa dodecil sulfatului de sodiu (SDS).
• În acest caz proteinele oligomerice (alcătuite din
câteva unităţi polipeptidice) se pot separa însubunităţile lor individuale.
• Proteinele se separă într -o soluţie SDS 1%.
• Acest detergent desface majoritatea legăturilor dintreproteine şi dintre acestea şi lipide.
• Pentru a desface şi punţile disulfurice, se adaugăfoarte des şi 2-mercaptoetanol.
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
99/100
• Mobilitatea electroforetică a majorităţii proteinelor (darnu şi a glicoproteinelor), depinde de dimensiunea lor,
8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou
100/100
ş g p ), p ,deoarece sarcina negativă adusă de moleculele SDSlegată de proteină este mult mai mare decât sarcinanetă a proteinei însăşi.
• O distribuţie specifică (pattern) de benzi se obţine lacolorarea gelului cu Albastru Comassie.
• Gelul de agaroză poate fi folosit în locul celui depoliacrilamidă în cazul proteinelor mai mari sau pentrua obţine o separare diferită în absenţa SDS.
• Se poate aplica metoda PAGE bidimensională,folosind condiţii de lucru diferite de cele două direcţiide migrare: de exemplu un gradient constant de pH( H 4 7%) di ţi i H 11 14% li il idă