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Confiabilidad de los resultados y Confirmación Metrológica en Microbiología
T.M. Lic. Fabiola Rojas C.Área Microbiología Metrológica Sección Metrología Alimentos y Ambiental2016
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Contexto
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Qué significa confiabilidad de los resultados?
Cuál es la utilidad?
Qué es confirmación metrológica?
Qué es la metrología?
Qué mido en microbiología?
Por qué debo realizar mediciones?
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Confiabilidad de los resultados: Confirmación Metrológica en Microbiología
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� Conceptos generales de sistemas de medición.
� Requerimientos de medición vs capacidades del sistema de� medición.
� El concepto de confirmación metrológica.
� Seguimiento y control de patrones de medición.
� Estimación de intervalos de confirmación metrológica.
� Análisis de la incertidumbre requerida.
� Aseguramiento de la trazabilidad.
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Confiabilidad de los resultados: Confirmación Metrológica en Microbiología
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• Mejorar la calidad y credibilidad de las medicionesmicrobiológicas.
• Entender cómo puede ayudar y aplicar la metrología para lograr este fin.
• Lograr cooperación entre la metrología y los expertosmicrobiólogos.
• Definir las necesidades de trazabilidad en medicionesmicrobiológicas.
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Acción
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� valor atribuido a un mensurando
-La indicación- El resultado sin corregir- El resultado corregido-Varios valores se promedian.
Una declaración completa del resultado de una medición incluye información sobre la incertidumbre de la medición.
Resultados de la medición
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Relación/Analogía
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Interacción
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Infraestuctura Nacional
de Calidad (INC)
Metrología
Normalización
Acreditación
Ensayos
Certificación
Inspección
Instrumentos de
control y vigilancia
ref. Resumen ejecutivo del trabajo del PTB y Focus Group
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Los 3 pilares de la Metrología
Metrología
Trazabilidad
Robustez en el sistema de medición
Incertidumbre
MétodoCapacidadAspectos
Comparabilidad
Fortaleza Compartido
Responsabilidad
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Ensayos
Análisis
Calibraciones
Dónde estamos?
Producción / Elaboración MR - MRC
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Salud Pública
•Seguimiento, evaluación y análisis de la situación en salud
• Vigilancia de la Salud Pública y control de riesgos
•Promoción de la Salud, con énfasis en Enfermedades no transmisibles
•Participación de la Comunidad, principalmente a través de la estrategia de Municipios Saludables
•Desarrollo de Políticas y Capacidad institucional de Planificación y gestión en Salud
•Fortalecimiento de la capacidad institucional de Regulación y Fiscalización en Salud
•Evaluación y Promoción del acceso equitativo a los servicios de Salud
•Desarrollo de Recursos Humanos y capacitación en Salud
•Garantía de calidad en servicios de salud individuales y colectivos
•Investigación desarrollo e implementación de soluciones innovadoras en salud
•Reducción del impacto de las emergencias y desastres en la salud11
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Salud Pública
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Qué debemos vigilar?
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Inocuidad alimentaria
Muestreo
Control/Vigilancia
Riesgo Análisis por el
laboratorio
Confiabilidad de los
resultados
Normas
/Reglamentación
Acreditación
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Fuente OMS 2009
Inocuidad Alimentaria
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Los alimentos transmiten más de 200 enfermedades
Las enfermedades transmitidas por los alimentos están aumentando en todo el mundo
La inocuidad de los alimentos es un problema mundial
Hay enfermedades emergentes ligadas a la producción de alimentos
Reducción del riesgo de gripe aviar
La prevención de las enfermedades empieza en el lugar de producción
Los alimentos pueden contaminarse con productos biológicos/químicos peligrosos
Todos podemos contribuir a la inocuidad de los alimentos
La escuela es un lugar privilegiado para la inocuidad de los alimentos
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Microbiología
Etiología enfermedad
Estudio de brotes
Vigilancia sanitaria
Biomonitoreo
Tratamientos y efectos
Microbiología y Epidemiología
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Tareas
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Qué se hace y cómo aseguramos la inocuidad alimentaria?
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Entonces….
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Por qué aseguramos la confiabilidad de nuestros resultados?
La competitividad e innovación sostenida, el crecimiento ladistribución global de las industrias y los servicios, requiereincrementar la exactitud y comparabilidad de las mediciones.
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Cómo aseguramos la confiabilidad de nuestros resultados?
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Personal idóneoTrazabilidad Uso de MR
y MRC
Disponer de un sistema de medición robusto
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Definición Confirmación metrológica
-Conjunto de operaciones necesarias para asegurar que elequipo de medición cumple con los requisitos para su usoprevisto.
- La confirmación metrológica generalmente incluye calibracióny/o verificación, cualquier ajuste necesario o reparación yposterior re calibración, comparación con los requisitosmetrológicos para el uso previsto del equipo de medición, asícomo cualquier sellado y etiquetado requeridos.
- La confirmación metrológica no se consigue hasta que sedemuestre y documente la adecuación de los equipos demedición para la utilización prevista.
- Los requisitos relativos a la utilización prevista pueden incluirconsideraciones tales como el rango, la resolución, los erroresmáximos permisibles, etc.
- Los requisitos de confirmación metrológica normalmente sondistintos de los requisitos del producto y no se encuentranespecificados en los mismos.
Cómo aseguramos la confiabilidad de los resultados: CONFIRMACIÓN METROLÓGICA
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CALIBRACIÓN
≠
VERIFICACIÓN
≠
AJUSTE
Cómo aseguramos la confiabilidad de los resultados: CONFIRMACIÓN METROLÓGICA
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ISO 10012 Measurement management systems -- Requirements for measurement processes and measuring equipment (Sistemas de gestión de las mediciones. Requisitos para los procesos
de medición y los equipos de medición)
Presenta herramientas que pueden emplearse como apoyopara el cumplimiento de los requisitos específicos de otrasnormas de gestión de calidad como ISO 9001, ISO/TS16949, así como ISO/IEC 17025 entre otras.
DEFINICIÓN CONFIRMACIÓN METROLÓGICA
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CONFIRMACIÓN METROLÓGICA
Calibración:
Operación que bajo condicionesespecificadas establece, en unaprimera etapa, una relaciónentre los valores y susincertidumbres de medidaasociadas obtenidas a partir delos patrones de medida, y lascorrespondientes indicacionescon sus incertidumbres asociadasy, en una segunda etapa, utilizaesta información para estableceruna relación que permita obtenerun resultado de medida a partirde una indicación.
Etapa que inicia con identificar las necesidades de confirmación metrológica
Verificación:
Contribución al aporte deevidencia objetiva que unelemento satisface los requisitosespecificados.
Es necesario conocer el error máximo tolerado del instrumento (el cual no hay que confundir con error de medición), mediante el proceso de evaluación de consistencia metrológica, una vez determinado el error máximo que se puede tolerar del instrumento es necesario que el usuario evalúe la conformidad de las características metrológicas encontradas en la calibración contra el error máximo tolerado (capacidad de medición requerida)
Ajuste:Ajuste de un sistema de medida(adapto, acomodo)
Conjunto de operacionesrealizadas sobre un sistema demedida para que proporcioneindicaciones prescritas,correspondientes a valoresdados de la magnitud a medir.
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Confirmación:
Asegurar objetivamente el cumplimiento de requisitosparticulares para un uso específico propuesto.
En esta etapa se toman las decisiones y acciones cuando unequipo no cumple con los requisitos de la aplicación a lacual es destinado.
CONFIRMACIÓN METROLÓGICA
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Trazabilidad
Propiedad del resultado de una medición o el valor de un patrón por el cual puede ser relacionado con lospatrones de referencia, usualmente nacionales o internacionales, a través de una cadena ininterrumpida decomparaciones, teniendo establecidas las incertidumbres.
CONFIRMACIÓN METROLÓGICA
Equipo
TrazabilidadProceso de medida
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Equipo
Características metrológicas
Bajo control metrológico: calibrado en intervalos adecuados
Cumple con los requisitos de uso propuesto
Manejo por personal competente
Infraestructura Condiciones ambientales
Personal
Formación
Habilidad
Experiencia
Demostrar competencia técnica
Evaluaciones periódicas
Metodología
Principio de medición
Método de Medición
Procedimiento de Medición
Realizado por personal competente
Infraestructura - Condiciones ambientales
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Incertidumbre
Parámetro no negativo, que caracteriza la dispersiónde los valores atribuidos a un mensurando, a partirde la información utilizada.
CONFIRMACIÓN METROLÓGICA
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Campo de mediciones:
- Mantener el control y el aseguramiento de la calidad en la producción;
- Cumplir y hacer cumplir con leyes y reglamentos;
- Conducir la investigación básica, y la investigación y el desarrollo aplicados en la ciencia y en la ingeniería;
- Calibrar patrones e instrumentos y realizar ensayos dentro de un sistema nacional de medidas, con el fin de conseguir trazabilidad a patrones nacionales;
- Desarrollar, mantener y comparar patrones de referencia físicos nacionales e internacionales, incluyendomateriales de referencia.
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Las características metrológicas del equipo de medición son factoresque contribuyen a la incertidumbre de la medición, la cual permite lacomparación directa con los requisitos metrológicos para establecer laconfirmación metrológica.
La caracterización de MR podría cumplir los requisitos de calibración
SISTEMAS DE CONFIRMACIÓN METROLÓGICA
ISO 10012:2003 Measurement management systems -- Requirements for measurement processesand measuring equipment. (Sistemas de gestión de las mediciones. Requisitos para los procesos demedición y los equipos de medición)
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Mantenimiento
El mantenimiento es una aplicación de la ingeniería paraobtener la máxima utilidad y disponibilidad del equipo einstrumentos, alta fiabilidad y seguridad, dentro de un marcoeconómico en una empresa.
� Seguro� Eficiente� Económico
SISTEMAS DE CONFIRMACIÓN METROLÓGICA
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LD en Microbiología
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Decreto N° 116 Ministerio de Economía, Fomento y Turismopromulgado el 04 de octubre 2012 y publicado el 25 de abril 2013
Considerando:
1. Que el reconocimiento y designación de un Laboratorio Nacional de Referencia,en el ámbito de las determinaciones microbiológicas y químico analíticas es degran importancia para asegurar la trazabilidad y comparabilidad de las medicionesrealizadas por laboratorios de ensayo y, a través de éstos, asegurar el debidoreconocimiento internacional de los productos de exportación.
2. Que los Laboratorios de la Sección de Metrología Ambiental y Alimentosdel Departamento de Salud Ambiental del Instituto de Salud Pública deChile han desarrollado capacidades en el ámbito de la Metrología Microbiológica yQuímica.
3. Que dichos Laboratorios cuentan con un Sistema de Calidad y deAseguramiento Metrológico que fue evaluado por sus pares, bajo los acuerdos delConsejo Internacional de Pesos y Medidas (CIPM) - Acuerdos de ReconocimientoMutuo (MRA).
Instituto de Salud Pública de ChileLaboratorio Designado en Microbiología y Química de Alimentos
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Decreto N° 116 Ministerio de Economía, Fomento y Turismopromulgado el 04 de octubre 2012 y publicado el 25 de abril 2013
Decreto:
Artículo 1º: Reconócese como Laboratorio Nacional de Referencia en el ámbito dela Metrología Química y Microbiológica que se expresa más adelante, a losLaboratorios de la Sección de Metrología Ambiental y Alimentos delDepartamento de Salud Ambiental del Instituto de Salud Pública de Chile, loscuales mientras mantengan la mejor capacidad analítica en estas materias,pasarán a integrarse a la Red Nacional de Metrología de Chile, que coordina ysupervisa el Instituto Nacional de Normalización, suscribiendo un convenio al
efecto.
Artículo 2º: Reconócese a los Laboratorios de la Sección Metrología Ambiental y Alimentos del Departamento de Salud Ambiental del Instituto de Salud Pública de Chile, la capacidad de entregar trazabilidad y comparabilidad en determinaciones analíticas realizadas a nivel nacional en el área de la medición y certificación en:
1.- Microorganismos Patógenos en alimentos y aguas.2.- Biotoxinas en mariscos y granos.3.- Plaguicidas en verduras y cereales.
Instituto de Salud Pública de ChileLaboratorio Designado en Microbiología y Química de Alimentos
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Laboratorio Designado
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�Morfológico �Enumeración
Métodos directos•Para unidades individuales y poblacionales ----- Microscopía, citometría de flujo.•Para biomasa -----Métodos gravimétricos, espectrofotométricos, Microscopía de epifluorescencia ( proteínas, ATP, componentes membrana celular)
Métodos indirectos•Para unidades individuales ---recuento colonias•Para unidades poblacionales o masas ------ NMP
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Mediciones en Microbiología
Ref. CAWG –CCQM 2016
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� Factores principales: • Componentes físicos (características tamaño, forma, aspecto, etc.)
• Sistemas biológicos (características funcionales, diferenciación, metabolismo, fisiología, secreción, etc.)
• Células en suspensión• Desarrollo irregular• Profundidad celular• Variación de tamaño• Confluencia• Células individuales • Células en grupo • Formación de bio-red• Formación de sistemas biológicos • Etc.
� Fuentes de incertidumbre célula:• Incertidumbre debido al mensurando• Incertidumbre debido a la obtención de imagen• Incertidumbre debido al análisis• Incertidumbre debido a la bioquímica celular
Desafío: Comportamiento emergente de células
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1.- Aplicaciones en citometría de flujo� Enumeración de células procariotas y eucariotas � Sitios de unión de anticuerpo por célula� Concentración CD3 y CD34
2.- Superficie plana� Densidad células procariotas y eucariotas� Fracción de confluencia de las células� Conformación de la célula eucariotas
3.- Mediciones de viabilidad celular4.- Toxicología (biofarmacéutica)5.- Células madre� Datos de referencia sobre células madre� Dosis y funciones entregada por un producto terapéutico específico
6.- Detección células raras (productos sanguíneos)7.- Autenticación e identificación de líneas celulares eucariotas 8.- Identificación células procariotas y cepas de referencia 9.- Caracterización de la interacción de nanopartículas con las células
Desafío: Capacidades de medición y posibles CMC
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Desafío: Servicios de medición actual
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Ref. CAWG –CCQM 2016
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MICROBIOLOGÍA
1.- Verificación y monitoreo de equipos e instrumentos
� Disponer de un Programa Mantención
� Control metrológico balanzas (calibración, calibración o verificación intermedia, verificación de rutina)
Condiciones ambientales
� Control metrológico masas (calibración masas patrón)
� Control metrológico incubadoras y Baños Termorregulado (perfil térmico y verificación de rutina)
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MICROBIOLOGÍA
� Control metrológico autoclave y hornos (perfil térmico y verificación de rutina con termómetro de máxima, control biológico, cinta química )
� Control metrológico termómetros (calibración termómetro patrón, sensores, calibración intermedia termómetros de trabajo)
� Control metrológico pHmetro (calibración rutinaria con estándares trazables, verificación del slope mV/pH, % eficacia)
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MICROBIOLOGÍA
� Confirmación metrológica material volumétrico
� Pipetas� Micropipetas� Probetas� Dispensador� Matraces
Nota: �Debe utilizarse material de alta calidad�Método gravimétrico
�Estimar rango aceptabilidad (utilizar valor tolerancia del material±)
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MICROBIOLOGÍA
� Verificación GBS: Para gabinetes utilizados en microbiología de los alimentos, el número de partículas no deberá exceder de 4.000 por metro cúbico.
Se recomienda GBS flujo aire vertical------ protección operador , muestra y ambiente trabajo
• Limpieza GBS y lámpara UV • Control poder germicida UV • Control calidad del aire• Control recuento partículas• Control flujo de aire
� Control homogeneizadores: peristáltico o tipo giratorio� Tipo licuadora: normalmente a 15.000 a 20.000 r/min ≤ 2,5 min (sujeto condiciones
del método, analito, tipo de muestra)
� Tipo peristáltico : velocidad ajustable: 230/265/300 ±5 y por un tiempo 1 a 3 min , normalmente 0,5 a 1 min.
(sujeto condiciones del método, analito, tipo de muestra)
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MICROBIOLOGÍA
El laboratorio debe conocer en los instrumentos de medición:
� Rango de medida--- Conjunto de valores del mensurando para los que el error de un instrumento de medida se supone comprendido entre los límites especificados.
� Sensibilidad --- magnitud más pequeña que puede medir (cambio en la respuesta de un instrumento de medida dividida por el cambio correspondiente en el estímulo).
� Estabilidad----capacidad de un instrumento de medición para mantener constantes sus características metrológicas con el tiempo.
� Exactitud ----Aptitud de un instrumento de medida para dar respuestas próximas a un valor verdadero.
� Resolución ----La menor diferencia de indicación de un dispositivo visualizador que puede percibirse de forma significativa.
� EMP---- Valores extremos de un error permitido por especificaciones, reglamentos, etc. para un instrumento de medida dado.
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MICROBIOLOGÍA
� 2.-Ensayos
� Cepas de referencia (Patrón Biológico)
� World Federation for Culture Collection� Word Data Centre for Microorganisms
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MICROBIOLOGÍA
� 2.-Ensayos
� Validación secundaria o Verificación de métodoISO/AWI 16140-3. Microbiology of food and animal feed -- Method validation –Part 3 : Protocol for the verification of reference and alternative methods implemented in a single laboratory. (bajo desarrollo)
Características relevantes del rendimiento de los métodos microbiológicos para las validaciones y verificaciones
Características de desempeño
Método cualitativo Método cuantitativo
Validación Verificación Validación Verificación
Veracidad ( sesgo) + +
Nivel de detección + +
Límite de cuantificación +
( si es relevante)
Repetibilidad + +
Reproducibilidad + +
(reproducibilidad
intralaboratorio)
Inclusividad + +
Exclusividad + +
Medición de la Incertidumbre + +
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ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS
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Validación/ Verificación
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Reproducibilidad
Sesgo
Inclusividad/
Exclusividad
Límite detección
Nivel detección
Incertidumbre
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Herramientas estadísticas
Distribución de frecuencias (absoluta, relativa, acumulativa)
Medidas de posición (Media Aritmética, Mediana, Moda, los cuartiles, Deciles y Percentiles)
Medidas de dispersión (varianza, desviación estándar, coeficiente de variación, desviación media)
Métodos Gráficos (Gráficos de barra, línea, diagrama de sectores, histogramas)
MICROBIOLOGÍA
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� Estimación de incertidumbre de la medición U =2SR
� Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations ISO/TS 19036.
� GUM--- Evaluation of measurement data – Guide to the expression of uncertainty in measurement
� Programas Interlaboratorios
Sección de Metrología Ambiental y de Alimentos programa de ensayos de aptitud bajo ISO 17043.
� Programas Intralaboratorios
� Duplicados de análisis por analista � Duplicados de análisis por matriz, por método� Uso MR y/o MRC
MICROBIOLOGÍA
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�Métodos de ensayo alimentos
� Validación métodos (AFNOR, AOAC, NORDAL)� Microbiology of the food chain -- Technical requirements and guidance on establishment or revision of
a standardized reference method—ISO 17468.
� Validación métodos alternativos :� Microbiology of food and animal feed -- Method validation -- Part 1: Vocabulary ISO 16140-1.
� Microbiology of food and animal feed -- Method validation -- Part 2: Protocol for the validation ofalternative (proprietary) methods against a reference method ISO 16140-2.
� Verificación de método (por el laboratorio o interna)� ISO/DIS 16140-3. Microbiology of food and animal feed -- Method validation –Part 3: Protocol for the
verification of reference and alternative methods implemented in a single laboratory. (bajodesarrollo)
Nota: implementar métodos validados, reconocidos, oficiales.
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�Métodos de ensayo matriz agua
� Water quality -- The variability of test results and the uncertainty ofmeasurement of microbiological enumeration methods-- ISO 29201:2012
� Water quality --Guidance on validation of microbiological methods—ISO /TR13843:2000
Water quality ---Requirements for establishing performance characteristics ofquantitative microbiological methods ISO/DIS 13843 (bajo desarrollo)
� Water quality -- Requirements for the comparison of the relative recovery ofmicroorganisms by two quantitative methods –ISO 17994:2014
� Standard methods for examination of water and wastewater
� Verificación/Validación de métodos (por el laboratorio)
Nota: implementar métodos validados, reconocidos, oficiales
Calidad
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Tomar medidas y realizar controles regularmente para asegurar que estas desviaciones y variaciones en su conjunto,
sean lo suficientemente pequeñas para garantizar que el resultado final cumple con sus requerimientos
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MICROBIOLOGÍA
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� Un material de referencia es aquelmaterial o sustancia, en la cual uno omás valores de sus propiedades sonsuficientemente homogéneos, establesy están claramente establecidos comopara poder ser utilizados en lacalibración de un aparato, laevaluación de un método de medida ola asignación de valores a materiales(Guía ISO 30:1992, Términos ydefiniciones utilizados en relación conlos materiales de referencia).
� Materiales Referencia y Materiales de Referencia Certificados
� Un material de referencia certificado esaquel en el que algunas de suspropiedades están certificadas por unprocedimiento técnico válido, además debeir acompañado con un certificado odocumento equivalente emitido por unórgano certificador.
� MRC deben por definición ser trazables enforma exacta a la unidad en la que losvalores de las propiedades se expresan.Cada valor de la propiedad debe estaracompañada de una incertidumbre con unnivel de confianza declarado.
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MICROBIOLOGÍA
Materiales Referencia y Materiales de Referencia Certificados ISP
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Enumeración S. aureus
en leche en polvo
Promedio resultados
Test Homogeneidad
ufc/g
Incertidumbre
expandida
log10 ufc/g (k=2)
Lote 01/02 del 2013 3,9 x103 0,17
Lote 01/03 del 2014 3,2 x103 0,12
Comparación Bilateral con Institutos Metrológicos
LD en microbiología metrológica organizó una CB con sus MR producidos
Para Enumeración S. aureus
Para Detección L. monocytogenes
Detección L. monocytogenes
en leche en polvo
Resultados Test
Homogeneidad
Incertidumbre expandida
log10 ufc/g (k=2)
Lote 01/01 del 2013
100% Detectado en 25 g NA
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CONCLUSIONES:
Los laboratorios participantes, en el análisis de lasmuestras presentaron:
Para el método cualitativo (Detección Listeriamonocytogenes) se obtiene que los resultados son100% concordantes con el valor asignado por elLaboratorio Designado.
En el método cuantitativo (Enumeración Staphylococcusaureus), los resultados son consistentes con el valorasignado por el Laboratorio Designado.
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Conclusiones
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General:Las mediciones están asociadas a:• La calidad del proceso y productos• Productividad y competitividad• Tecnología y planes estratégicos
Microbiología:• Las mediciones en microbiología requieren de las mismas exigencias que
otras especialidades o disciplinas, la diferencia es que no hay un SI paralas células.
• En este momento se puede decir que hay 2 desafíos claves para losmicrobiólogos, uno es la enumeración (cuanto hay) y el otro es laidentificación.
• La complejidad se debe a que estamos trabajando con un sistemas vivoso bio-sistemas y por lo tanto inherentemente variable, por lo cual hayun apreciable desafío metrológico.
• Internacionalmente se está trabajando para realización decomparaciones a través de estudios pilotos en el área biológica en elcampo clínico y ambiental para cuantificación células e identidadmolecular.
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GRACIAS
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