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CITOMETRIA DE FLUJO
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PARMETROS CELULARES MEDIDOS
El tamao celular relativo
La complejidad interna o granularidad relativa
Intensidades relativas de emisin de fluorescencia
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El tamao celular relativo LUZ DIFRACTADA- SE RELACIONA CON LA SUPERFICIE Y AREA
CELULARES-SE DETECTA EN EL EJE DE INCIDENCIA DEL LASER
La complejidad interna o granularidad
relativa LUZ REFLEJADA Y REFRACTADA-SE RELACIONA CON LA COMPLEJIDAD INTERNA DE
LA CELULA Y SU GRANULARIDAD
Intensidades relativas de emisin de
fluorescencia-SE DETECTA EN UN ANGULO DE 90 GRADOS CON EL HAZ
DEL LASER
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MARCACION DE CELULAS CON ANTICUERPOSFLUORESCENTES
Se utilizan, generalmente, inmunoglobulinas monoclonales contraantgenos de la supercicie de las celulas, marcadas con colorantesfluorescentes.
Control negativo: Anticuerpo del mismo isotipo marcado con el mismofluorocromo pero que no reconoce ninguna de las molculas de lasuperficie.
Control negativo: clulas que no fueron marcadas para determinarautofluorescencia.
Control positivo: clulas normales, clulas de lneas celulares.
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Fluorocromos utilizados
Citometra de Flujo
FL1
FL2
FL3FL4
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ANALISIS DE DATOS
Los datos colectados sepueden observar de 2maneras:
1) Histograma
Eventos
medidos
FLUORESCENCIA
Los datos colectados por el citometro los podemosanalizar de 2 maneras:
1)Histograma: Muestra cuantas celulas estan
marcadas con cierto color, y las distintasintensidades de fluorescencia de cada una.
2)Dot-plot: Muestra 2 valores a la vez, y cadapunto representa una celula individual. Sedividen en general en los 4 cuadrantes.
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HISTOGRAMA
En este grafico vemos el pico del control de isotipo (gris), que me marca loque se considera que no hay marca.Y despues veo 2 poblaciones con distinta intensidad de fluorescencia.
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Intensidad de fluorescencia y sitios deunin
Intensidad de fluorescencia FITC
Nmerodeeventos
FITC
FITC
FITC
FITCFITC
FITC
FITC
FITC
FITC FITC
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Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras:
2) Dot-plot
1)Dot-plot: Muestra 2
valores a la vez, y cadapunto representa unacelula individual. Sedividen en general en los
4 cuadrantes.
Analisis de datos
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Linfocitos
Monocitos
Analisis de datos
Granulocitos
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Aca vemos un resultado real.Vemos una muestra de sangre periferica, dondepodemos reconocer las 3 subpoblaciones deleucocitos.Los GR y plaq son mas chicos.Las 3 poblaciones de leucocitos las reconozco
mediante dot-plot de forward-scatter.Ademas esas celulas las marque con antiCD3 yanti CD4, y veo los histogramas de CD3 y CD4.
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CD3- CD4 en sangre total CD3 CD4 en gate de linfocitos
Elijo un gate:
Ej. linfocitos
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Aca vemos marca de CD3 y CD4.Queremos saber el porcentaje deCD3 y CD4 en sangre entera (verporcentajes en cuadrantes) y en elgate de linfocitos.
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Expresin de Resultados
Datos porcentuales Datos absolutos : Partculas de cuantificacin Datos estadsticos
Quadrant Statistics
Fi le: Normal01.05 Log Data Uni ts: L inear Value
Sample ID: Patient ID:
Tube: CD3/CD8 Panel : IMK-Lymphocyte
Acqui si tio n Date: 1 5-Jun -9 5 Gate: G1
Gated Events: 2383 Total Events: 6000
X Parameter: FL1-H CD3 (Log) Y Parameter: FL2-H CD8 (Log
Quad Location: 17, 17
Quad Event s % Gated % Total X Mean X Geo Mea Y Mean Y Geo Mea
UL 126 5.29 2.10 4.51 4.12 324.82 171.35
UR 508 21.32 8.47 268.00 249.17 2472.09 1624.51
LL 420 17.62 7.00 3.92 3.50 3.13 2.53
LR 1329 55.77 22.15 306.66 289.43 1.50 1.28
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EL programa tambien nos provee datosde:
-Porcentaje de celulas en el gate que yoelegi o en cada cuadrante
-El promedio de fluorescencia de ese gatepara la FL de X y para la de Y
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Separacin de clulas usando citometra de flujo(Cell sorting)
-El citmetro permite separar fsicamente,poblaciones de clulas-Se puede realizaren condiciones de esterilidad.
Citometra de Flujo
La separacion de las celulas de
interes se realiza por aplicacin deuna carga electrica a las gotas.El equipo mira la celula y si esa gotatiene una celula de interes le agregauna carga. Esa gota cargada esdeflectada por electrodos hacia el tubode coleccin.Luego uno lo que hace es volver apasar la muestra por el citometro, paradeterminar la pureza de la poblacion ysu fluorescencia.
Despus del cultivoBasal
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CFSE
X
luorescencia / clula
X / 2 X / 4
Despus del cultivoBasal
M1
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Se observan los picos querepresentan las distintas
generaciones decelulasprovenientes de laproliferacion de las celulas
parentales.
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Cytometric bead arrays (CBA)
Tonos de un color
Ac. unidos abeads, emitiendoa distintasintesidades deFL3
Varios analitos
Ac conjugados con PE
(emitiendo en FL2),proporcionales a la concdel analito.
Multiplex ensayo por CF
Citoquinas Determinacin de citoquinas secretadas por citometra
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IL-6
IL-10
MCP-1
IFN-g
TNF-a
IL-12
CBA para citoquinas inflamatorias
PBS CBE
FL-2 FL-2
FL-2: Da cuenta de la concentracin de la citoquina.
FL-3: Da cuenta de las diferentes citoquinas.
Citoquinas Determinacin de citoquinas secretadas por citometra
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Medida de fluorescencia en clulas
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Medida de fluorescencia en clulasindividuales por citometra de flujo
Propiedades Ventajas
Es especfica de color Permite estudio
multiparamtrico simultneoEs cuantitativa con un
amplio rango de medida
Altsima sensibilidad1974(3000mol/cel) 2003 (300mol/cel)
Altavelocidad
Mide en cantidades elevadasde clulas
Obtener conclusiones
estadsticamente fidedignas
bj ti d ibl
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