Biologie structurale d’hétéropolyosides :cas des arabinogalactane-protéines degomme d’Acacia (Acacia senegal)
Christian Sanchez, ENSAIA-INPL, NancyLaurence Lavenant, Cédric Gaillard, Marie-Christine Ralet,Denis Renard, BIA-INRA, NantesAlain Lapp, LLB-CEA-CNRS, SaclayChristophe Schmitt, Nestlé, Lausanne
Origine de l’exsudationproduit au niveau des troncs et branchesaprès atteinte physiologique en saison sèche.Production déclenchée lorsque les tissus sontmis en contact avec l’extérieur par suite de lasaignée à des fins commerciales, ou de blessurescausées par le vent (silice), sécheresse, animaux,plantes parasites, attaque d’insectes foreurs—> réaction de défense pour limiter laperte en eau et l’invasion parasitaire
Lieu de BiosynthèseNodule de gomme formée sur arbre à maturité
(5-7 ans) dans la zone du cambium(pas au niveau de l’écorce interneni du xylème)
Polysaccharides identifiés de partet d’autre de la saignée identiquesà ceux de la gomme purifiée(Joseleau & Ullmann, Phytochemistry, 1990)—> comment se fait le transport ?(au niveau des cellules du cambium,pas de gradient pour le transport au pointd’exsudation)
Acacia senegal(localisation : nord-nord/est Afrique)
Exsudat de gomme d’Acacia
Motivations de l’étudeContextecompréhension des transitions structurales et de phaseslors de la complexation électrostatique protéine-polysaccharide
Objectifen l’absence de données cristallographiques sur les biopolymèresissus de la gomme d’Acacia, nécessité reconstruction modèles à basserésolution pour appréhender les structures tri-dimensionnelles—> positionnement dans l’espace des charges portées par les biopolymères
Démarchefractionnement, purification (chromatographies)évaluation degré de pureté (HPSEC-MALLS)composition biochimique (oses, acides aminés)études structurales (diffusion neutrons, lumière)reconstruction 3d (calculs)comparaison modèles 3d - microscopie
Relation structure-fonction(biologique/propriété d’usage)
Composition de la gomme d’Acacia (1)
Hétéropolyosides chargés de type arabinogalactane-protéines
GommeAcacia
AG(fraction I)
AGP(fraction II)
GP(fraction III)
Oses neutres (%)Arabinose, GalactoseRhamnose,
82.1 73.7 68.8 59.1
Oses chargés (%)Acide glucuroniqueAcide 4-O-methyl-glucuronique
15.4 15.6 11.8 8.8
Protéines (%)Riche en Hyp, Ser, Pro 2.4 1.1 9 24.6
AG : arabinogalactane (88%)AGP : arabinogalactane-protéine (10%)
GP : glycoprotéine (2%)
*Base du fractionnement : chromatographie d’interaction hydrophobe
Continuum d’espèces moléculaires différant entre elles par le ratio sucre/protéine et la densité de charge —> conséquence sur la structure ?
Structure des ArabinoGalactane-Protéines (AGP) d’Acacia
Le modèle de la fleur d’acacia(«wattle-blossom model», Fincher, 1983)
—> conformation sphérique
Le modèle de la corde torsadée poilue(«twisted hairy rope model», Lamport, 1991)
—> conformation bâtonnet
Le modèle de la fleur d’acacia modifié(«modified wattle-blossom model»,
Kieliszewski, 1994)basé sur l’hypothèse Hyp-contigus
—> conformation sphérique
Hypothèse de la contiguité des Hydroxyprolines (Hyp)et modèle associé du motif consensus de l’AGP (Kieliszewski, 2000)
Substitution Arabinosides sur Hyp ( P ) contigusSubstitution polysaccharidiques sur Hyp non contigus
Arrangement palindromique des résidus Hyp le long de la chaîne(Ser-O, centre palindromique) et distribution symétrique des
substitutions arabinosides et polysaccharidiques
—> arrangement tri-dimensionnel ?
Structure de la fraction I (AG)Relation [η]=f(M)
—> affinité solvant —> conformation
Mw (g/mol) 2.86.105
Mw/Mn 1.28Rg (nm) 6.6*
[η] (mL/g) 16.2Exposant α 0.46
11 12 13 14 15 16 17 180.0
5.0x10-5
1.0x10-4
1.5x10-4
Ve (ml)
C (g
/ml)
104
105
106
Mw (g/m
ol)
Profil d’élution HPSEC-MALLS—> masse, polydispersité
Affinité solvant moyenne
*neutrons
Distribution gaussiennepeu asymétrique
—> faible polydispersité
Structure de la fraction I (AG)Diffusion neutrons petits angles
Forme du polymère —> P(q) Caractère polyélectrolyte —> P(q)*S(q)
Écrantage totale des chargespour FI=50mM—> polyélectrolyte faible
—> Rg= 6.4 nm (Guinier)—> exposant = 2.03 (régime intermédiaire)—> exposant = 2.61 (début Porod)
Guinier régime Porodintermédiaire
Petit disque d’affinité moyenne pour le solvantà structure interne relativement dense
mais ajustement théorique de I(q) délicat
Structure de la fraction I (AG)Analyse des données de diffusion et reconstruction 3d de l’objet isolé
P(r) = f(r) —> distribution des distances I(q) = f(q) —> recalculée à partir de P(r)
Calculs ab initio —> modèles 3d basse résolution (Svergun, 1999)
Dmax
Transforméede Fourier
Forme de P(r) dépendentièrement de la formede l’objet
sphère
disque
Calcul de P(q) à partir dumodèle 3d et comparaisonavec l’expérience
Moyenné le plus probable
Imposer uneasymétrie et/ou une forme pourles objets hétérogènes
Ellipsoïde oblatea=b=9.6 nm c=1.0 nm
Rg=6.4 nm
Différentes vues du modèle le plus probable
(sur la base de 12 modèles analysés)
Structure de la fraction I (AG)
Structure ouverte à mettre en relation avec la faible densité de la molécule (1.007 g/mL)
aStructure de la fraction I (AG)
Comparaison modèlecalculé - MET
20 nm
Microscopie électronique à transmission (marquage acétate d’uranyle)
aStructure de la fraction I (AG)Résumé
•21 acides aminés•Absence de Trp, Cys•COOH (Asp, Glu)
exposés au solvant•Tyr en surface•Pas ou peu de structure II
Disque ou ellipsoïde oblate2a=2b=19.2nm; e=2nmRg=6.4nmMw=286000g/molAffinité solvant moyenne
Structure de la fraction II (AGP)Relation [η]=f(M)
—> affinité solvant —> conformation
Mw (g/mol) 1.86.106
Mw/Mn 1.33Rg (nm) 30
[η] (mL/g) 70.7Exposants α
0.36 (petites Mw) 0.69 (moyennes Mw) 1.13 (hautes Mw)
Profil d’élution HPSEC-MALLS—> masse, polydispersité
Distribution asymétriquePrésence de deux populations
—> polydisperse
12 14 16 180.0
5.0x10-5
1.0x10-4
1.5x10-4
Ve (ml)
C (g
/ml)
106
AGP (97%)
Mécanisme perméationanormal ( Mw avec Ve)
—> lien avec la conformation*
1000000 1.5E6 2E6 2.5E6 3E6 3.5E6 4E6 4.5E6
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
[η] ~ Mw
1.13
[η] ~ Mw0.69
Mw (g/mol)
[η] ~ Mw0.36
[η]
(ml/
g)
Affinité solvant avec Mw—> conformation de plus
en plus étendueavec l’augmentation de Mw
*démontré dans le cas de polymère de forme cylindrique(Gerle, Macromolecules, 1999)
Structure de la fraction II (AGP)
—> combinaisons de deuxformes théoriques approchantes(intermédiaire cylindre-disque)
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.007
0.008
0.009
0.010
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
q (nm-1)
I(q) q
2
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.007
0.008
0.009
0.010
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
q (nm-1)
I(q) q
2
Diffusion neutrons petits anglesForme du polymère —> P(q) P(r)=f(r) —> distribution des distances
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.007
0.008
0 10 20 30 40 50 60 70
r (nm)
P(r
)
Dmax
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.007
0.008
0 10 20 30 40 50 60 70
r (nm)
P(r
)
Dmax
ellipsoïde
disque
Cylindreelliptique
Molécule plutôt allongée avecdes hétérogénéités le long de celle-ci
Nécessité du calcul ab initio
—> forme de courbe avec nombreusesfluctuations s’apparentant àun objet allongé + hétérogénéités
Cylindre elliptiquea=7.7nmb=34nm
c=1.5 nm
Différentes vues du modèle le plus probable
(sur la base de 20 modèles analysés)
Structure de la fraction II (AGP)
Structure peu dense en deux sous-unités reliées entre elles par une structure spécifique de type hélice
aStructure de la fraction II (AGP)
Comparaison modèlecalculé - MET
Microscopie électronique à transmission (marquage acétate d’uranyle)
Sous-unité 1
Sous-unité 2
Forme moins allongée—> déshydratation ?
Ségrégation de la moléculeen deux sous-unités
—> ségrégation en relation avecl’affinité pour le solvant
(sucre-protéine)
aStructure de la fraction II (AGP)Résumé
Cylindre elliptique à 2 sous-unités2a=15.4nm2b=68nme=3nmRg=30nmMw=1860000g/molAffinité solvant médiocre
•529 acides aminés•Trp exposés au solvant•Absence de Cys•COOH (Asp, Glu)
exposés au solvant•Tyr en surface•pas d ’hélice α•27% PP2 (hélice gauche, 3 rés./tour)
•brin β, random coilOses féruloylés par monomère et dimère acide férulique(acide trans férulique et acide 8-5’ non cyclique diférulique)
a
b
Conclusions
AG : 99% sucres / 21 aa (proche de la séquence palindromique)—> Branches sucres très grosses et limitées —>structure centrale complexe
AGP : 90% sucres / 529 aa —>séquence palindromique répétée n fois (?)—> Branches sucres courtes et nombreuses —> structure centrale simple
Séquence palindromique : 15 aa, 62 sucres (M~11100 g/mol)Structuration en hélice (protéine)
Structuration en hélice (sucres)
Moteur de la structuration serait liée à la formationdes hélices «protéines» et/ou des hélices «sucres»
entre deux molécules différentes ou au sein de la même molécule
Relations structure-fonction
Conséquences de la symétrie dans le motif glycopeptidique—> compaction moléculaire—> reconnaissance potentiellement accrus—> auto-assemblage/auto-organisation
Lien avec les propriétés fonctionnelles de la gomme—> viscosité anormalement faibleen lien avec la petite taille et la très faible densité de la fraction majoritaire (AG)—> adhésion forte sur surface hydrophobe
en lien avec la chaîne polypeptidique ? A priori non, car celle-ci est hydrophile (Hyp)et mise en évidence d’une exposition au solvant de résidus supposés hydrophobes
en lien avec les substituants polysaccharidiques ? Peut être, car le squelette β-1,3galactane est une hélice amphipatique
en lien avec la structure dont l’épaisseur fine favoriserait l’adhésion
Fonction biologique : agit en tant qu’enduit d’étanchéité (après saignée)
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