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Tesis Doctoral
Biología reproductiva y crecimiento deBiología reproductiva y crecimiento deBrachidontes rodriguezii (d´Orbigny,Brachidontes rodriguezii (d´Orbigny,
1846) en sustratos duros artificiales en1846) en sustratos duros artificiales enplayas arenosas de la provincia deplayas arenosas de la provincia de
Buenos AiresBuenos Aires
Torroglosa, María Eugenia
2015-03-26
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
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Cita tipo APA:
Torroglosa, María Eugenia. (2015-03-26). Biología reproductiva y crecimiento de Brachidontesrodriguezii (d´Orbigny, 1846) en sustratos duros artificiales en playas arenosas de la provinciade Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
Cita tipo Chicago:
Torroglosa, María Eugenia. "Biología reproductiva y crecimiento de Brachidontes rodriguezii (d´Orbigny, 1846) en sustratos duros artificiales en playas arenosas de la provincia de BuenosAires". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2015-03-26.
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Resumen
En las playas arenosas de la provincia de Buenos Aires, la presencia de
estructuras como escolleras y muelles ha constituído un sustrato duro alternativo, para
el desarrollo de la comunidad bentónica del intermareal rocoso. En la costa
bonaerense el mitílido Brachidontes rodriguezii, es la especie dominante de esta
comunidad denominada mejillinar. En sustratos artificiales de la localidad de Villa
Gesell, se ha observado el desarrollo de una población de B. rodriguezii característica
de las costas rocosas. En este estudio se describió el ciclo reproductivo, la talla de
primera madurez sexual y la caracterización morfológica gonadal mediante técnicas
histológicas. Se registró actividad gametogénica a lo largo del año en machos y
hembras. Se evidenció un período de desove comprendido en los meses de febrero y
mayo. Se estudió la espermatogénesis y la morfología del espermatozoide mediante
microscopia óptica, electrónica de transmisión y de barrido. El espermatozoide resultó
ser de tipo primitivo, como se ha descrito para otras especies del género. Así mismo,
como resultado de un estudio comparado en el puero de Mar del Plata, se observaron
alteraciones en las células espermatogénicas como resultado a la exposición a factores
antropogénicos. El crecimiento, se estudió in situ, mediante un método de marcado y
recuperación. Se utilizó calceína como marcador y se determinó el incremento de la
valva mediante microscopia óptica de florescencia. Se observó un crecimiento
diferencial en relación con la temperatura, la talla de los ejemplares y su distribución
vertical en relación a la exposición al agua.
Palabras clave: Brachidontes rodriguezii, biología reproductiva, crecimiento sustrato
artificial.
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Abstract
The rocky shore of Buenos Aires province has a dominance of mussel beds B.
rodriguezii. At sandy beaches, the presence of structures such as docks and piers is an
alternative hard substrate for the development of the benthic community of rocky
shores. In Villa Gesell town, the development of a population of B. rodriguezii proper
of rocky shores has been observed in artificial substrates in the dock.
The reproductive cycle and size at first sexual maturity were studied through
the histological characterization of the gonad. Males and females with an advanced
gonadal development were found throughout both years of study. There was a main
spawning event during summer. Size at first sexual maturity was determined during
two reproductive periods. Ultrastructure of spermatogenesis and sperm morphology
was studied. The sperm morphology is a taxonomic character and can be used in
subsequent phylogenetic studies. Our results show that spermatogenesis in B.
rodriguezii is very similar to that reported in other mytilids. The spermatozoon was of
the primitive or ect-aquasperm type. Also alterations in spermatogenic cells as a result
of exposure to anthropogenic factors at Mar del Plata harbour were detected and
described.
Growth determination was made through a marked and recuperation
experiment. For the marking the fluorochrome calcein was used. Growth increment
was observed by fluorescence microscopy. There was a relationship between growth,
temperature and water exposure and shell length.
Key words: Brachidontes rodriguezii, reproduction, growth, artificial hard substrate.
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Este trabajo fue posible GRACIAS a
Mi directora, Juliana Giménez que me enseñó a confiar y a creer que esto era posible.
Mis compañeros del laboratorio, que son mi familia del laboratorio, Mari, Henry, Vicky, Celes,
Juli, Paulas, Vane… Nora, gracias por las sugerencias!
La Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, el Departamento de Biodiversidad y Biología
Experimental y el Instituto de Biodiversidad y Biología Experimental y Aplicada.
El Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas.
El laboratorio de Ecosistemas Costeros del Museo Argentino de Ciencias Naturales
“Bernardino Rivadavia” y su director, el profesor Pablo Penchaszadeh y al Dr. Guido Pastorino.
Mis amigos consejeros y reflexólogos.
Mis viejos y mis hermanos, que me acompañan desde siempre y para siempre, abuelos, tíos,
primos y a mi sobrino, mucho de lo que soy tiene que ver con todos ustedes.
Diego… Amor ☺
Según vamos adquiriendo conocimiento, las cosas no se hacen más comprensibles sino
más misteriosas.
Albert Schweitzer
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Índice
1.� Introducción ………………………………..…………………................................……………….7
1.1 Introducción general…………….…….………………............................………………….8
1.2 Objetivos…………………………………………………………….................................…….10
2.� Área de estudio.…..…………...…………………………………..............................…………..11
2.1 Área de estudio ……………………………………………….................................………..12
2.2 Toma de muestras de los individuos de B. rodriguezii………....................…...13
3.� Morfología gonadal y gametogénesis …………………………..…….......................…...17
� 3.1 Introducción …………………………………………………………................................……18
� 3.2 Materiales y métodos …………………………...........................………….………...…...20
� 3.3 Resultados ………………………………………………………..................................……….21
� 3.4 Discusión …………………………………………………..……..................................………..37
4.� Caracterización ultraestructural de la espermatogénesis y del espermatozoide.
Alteraciones morfológicas………………….................................................……………40
4.1. Introducción………………………………................................…………………….………..41
4.2. Materiales y métodos………………………………….........................…….................43
4.3. Resultados.....................................................................................................44
4.4. Discusión………………………………………………………...................................………….55
5. Ciclo reproductivo……………………………………………………................................………..59
5.1. Introducción………………………………………….....................................................60
5.2. Materiales y métodos…………………………………...............................................61
5.3. Resultados……………………………………………………………..………………….…………….64
5.4. Discusión…………………………………….................................………………………..….79
6. Talla de primera madurez……………..………………...............................……...……………82
6.1. Introducción………………………………………….....................................................83
6.2. Materiales y métodos……………………………………............................................84
6.3. Resultados…………………………………….................................………………………….86
6.4. Discusión……………………..……………………….................................………………….95
7. Crecimiento……………………………………………..................................……………...……….98
7.1. Introducción………………………………….........................………............................99
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7.2. Materiales y métodos…………………………..….......................……....................102
7.3. Resultados.………………………………………….....................................................108
7.4. Discusión………………………………………..........................……...........................114
8. Conclusiones generales………………………………......................................................118
9. Bibliografía……………………………………………...........................................................120
10. Apéndice………………………………………………..........................................................140
11. Trabajos relacionados con esta tesis……………………..........................…….…........142
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1- Introducción.
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1.1 Introducción general
Los moluscos constituyen uno de los grupos de invertebrados marinos más
diversos conocido hasta la actualidad. Dentro de los moluscos, los bivalvos (con nueve
mil especies conocidas aproximadamente) son el segundo grupo más diversificado
después de los gasterópodos (Appeltans et al., 2012).
Brachidontes rodriguezii d´Orbigni 1846, es un bivalvo del orden Mytiloida que
pertenece a la familia Mytilidae Rafinesque, 1815 y al género Brachidontes Swainson,
1840. Las características morfológicas de la valva de B. rodriguezii se corresponden con
las descriptas para una valva de tipo mitiliforme. Es delgada, de tamaño pequeño a
mediano y alcanza aproximadamente 40 milímetros de longitud. El umbo es
subterminal redondeado, con dentículos marginales posteriores al ligamento y la
charnela presenta entre 5 y 6 dentículos pequeños. La ornamentación externa consiste
en cordones radiales muy delgados que pueden bifurcarse y ser interrumpidos por
algunas líneas de crecimiento. La superficie externa de la valva se encuentra revestida
por una capa de material orgánico que se denomina periostraco (Checa, 2000), en B.
rodriguezii es por lo general de color marrón claro en la mitad inferior de la valva y más
oscuro en la mitad superior, el revestimiento interior de la valva es de color rojizo
iridiscente (Adami et al., 2013). Es una especie dioica y la fecundación ocurre en el
agua, del huevo se origina una larva velígera libre, nadadora y planctotrófica. Son
animales filtradores, se alimentan de partículas que se encuentran suspendidas en el
agua como diatomeas y detritos orgánicos. Es una especie que se encuentra
fuertemente adherida al sustrato duro, tanto rocas como superficies artificiales, por
medio de los filamentos del biso. Estos filamentos, de naturaleza proteica, son
secretados por la glándula del biso, que está ubicada en la base del pie. Los filamentos
del biso permiten que los individuos soporten los embates de las olas (Penchaszadeh,
1973).
B. rodriguezii se encuentra desde la costa sur de Brasil hasta Punta Ninfas
(42o46¨S; 65o 02´O) en la provincia de Chubut, Argentina (Adami et al., 2007; Ríos,
2009) dentro del área biogeográfica denominada Provincia Argentina (30°-32° S; 41°-
44° S) (Balech y Ehrlich, 2008). La Provincia Argentina presenta una predominancia
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alternada de masas de agua de la Deriva Cálida Costera y de la corriente cálida de
Brasil (Piola y Rivas, 1997).
B. rodriguezii es la especie dominante en las costas rocosas del intermareal de
la provincia de Buenos Aires (López Gappa et al., 1990; Vallarino et al., 2002; Adami et
al., 2008) alcanzando densidades de aproximadamente 170.000 individuos por metro
cuadrado (Penchaszadeh, 1973). Monopoliza el sustrato rocoso y puede desplazar a
otras especies de organismos sésiles (Adami, 2005). Inclusive, en las playas arenosas
de la provincia de Buenos Aires, la presencia de estructuras como escolleras y muelles
constituye un sustrato alternativo para el desarrollo de la comunidad bentónica de
costas rocosas (Scelzo et al., 1996).
B. rodriguezii es comúnmente denominado mejillín y forma extensas
agrupaciones con altas densidades de individuos denominadas mejillinar. Estas
agrupaciones constituyen matrices complejas con numerosas capas o estratos de
individuos de diferentes edades y tamaños que se mantienen adheridos unos a otros
mediante los filamentos del biso (Alvarado y Castilla, 1996; Guiñez y Castilla, 1999;
Commito y Rusignuolo, 2000). Estas matrices generan microambientes con
propiedades físicas ligeramente diferentes del ambiente que rodea la matriz, por
ejemplo, en su interior, la intensidad de la luz y acción de las olas es reducida y la
retención de sedimento propicia un aumento de la humedad (Seed y Suchaneck,
1992). A medida que aumenta la complejidad de las matrices se observa un
incremento en la diversidad y riqueza de especies (Günther, 1996). La comunidad
constituida por los mejillines, las algas y los macroinvertebrados (nemertinos,
poliquetos, crustáceos) muestra fluctuaciones temporales en abundancia y diversidad.
Existen numerosas publicaciones que contribuyen al conocimiento de la dinámica de
esta comunidad (Penchaszadeh, 1973; Nugent, 1989; Vallarino et al., 2002;
Penchaszadeh et al., 2007; Adami et al., 2008; Calcagno et al., 2012; Arribas et al.,
2013). La diversidad de especies de la comunidad varía con la disposición espacial
(plano horizontal y plano vertical) donde se observa que en el plano vertical hay
mayores fluctuaciones durante el año que en el plano horizontal. Así como también se
registran cambios en la estructura de la comunidad como consecuencia del aumento
de la materia orgánica disuelta y la disminución de la salidad (Adami et al., 2004;
Adami, 2005; Elías et al., 2006;). Se han realizado estudios acerca de los cambios de la
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dinámica poblacional de B. rodriguezii frente a disturbios antropogénicos (López Gappa
et al., 1990; Vallarino et al., 2002; Elías et al., 2009), así como, estudios relacionados
con aspectos morfológicos y taxonómicos de B. rodriguezii (Van der Molen et al., 2012;
Adami et al., 2013; Trovant et al., 2013). Sin embargo, el conocimiento acerca de
aspectos de la biología reproductiva (ciclo reproductivo, la talla de primera madurez
sexual, la caracterización morfológica gonadal) y del crecimiento es escaso. Este
conocimiento es fundamental para el entendimiento de la biología de B. rodriguezii
que, además, resulta ser la especie dominante de la comunidad del intermareal rocoso
en la provincia de Buenos Aires y norte de la Patagonia.
1.2 Objetivos
El objetivo general de este trabajo fue estudiar aspectos de la biología
reproductiva relacionados con la talla y la variación estacional, así como el crecimiento
de Brachidontes rodriguezii.
Objetivos específicos
1) Describir la morfología gonadal de machos y hembras en base a la
caracterización histológica.
2) Describir la espermatogénesis y la morfología del espermatozoide
mediante microscopía electrónica.
3) Estudiar el ciclo reproductivo. Determinar la temporada de
reproducción, relacionar con cambios morfológicos a nivel gonadal y variables como la
temperatura superficial del agua y el fotoperíodo.
4) Determinar la talla de primera madurez sexual a través de estudios
histológicos.
5) Estudiar la variación del crecimiento en un sustrato artificial en relación
con la temperatura, la exposición a condiciones de inmersión y la talla de los
individuos.
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2- Área de estudio.
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2.1 Área de estudio
El área de estudio y muestreo incluyó la localidad de Villa Gesell en el partido
homónimo (56° 53´O; 37° 16´S) y la ciudad de Mar del Plata ( 57° 33´O ;38° 00´ S) en el
partido de General Pueyrredón (Figura 2. 1) ambas en la costa este y sureste de la
provincia de Buenos Aires.
Figura 2. 1. Áreas de estudio y distribución de Brachidontes rodriguezii (sombreado en
amarillo) para la costa argentina.
La localidad de Villa Gesell se encuentra sobre una planicie costera constituida
durante el holoceno (Violante, 1990). La costa presenta playas constituidas por arena
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mediana a fina (Marcomini y López, 1997). Las playas están expuestas a la acción del
oleaje que incide del sur y del sureste, dando origen a una corriente de deriva litoral
con dirección noreste. Las mareas son de tipo semidiurnas, es decir, hay 2 pleamares y
2 bajamares en un día (Perillo, 1979). La amplitud de marea máxima es de 1,30 m y la
promedio es de 0,69 m (Servicio Hidrografía Naval 2012). El nivel del mar también
puede ser modificado por las tormentas produciendo una movilización de arena desde
la porción más alta de la playa emergida hacia la playa sumergida (Komar, 1976). De la
combinación de un sistema de alta presión, ubicado sobre el océano Atlántico que
transporta aire frío desde la Patagonia hacia el este de la provincia de Buenos Aires, y
un sistema de baja presión que se encuentra en el centro y sur de la región
mesopotámica que aporta aire caliente y húmedo. Surge un fenómeno meteorológico
denominado sudestada, caracterizado por vientos fuertes del sudeste, que pueden
estar acompañados por lluvia o no (Servicio Meteorológico Nacional, 2003). La
incidencia de sudestadas en la costa de la provincia de Buenos Aires, puede elevar el
nivel del mar hasta 2 metros. Ocurren todo el año, pero son más frecuentes a fines del
invierno y principio de la primavera y el verano. La localidad de Villa Gesell cuenta con
un muelle de pescadores cuya construcción comenzó en 1971. El mismo mide 150
metros de largo y tiene una altura de 8 metros. Ha constituido un sustrato artificial que
permitió el desarrollo de la comunidad del mejillinar.
Dentro de la ciudad de Mar del Plata se realizaron muestreos en el puerto (57°
31´O; 38° 01´S). El mismo es un puerto artificial encerrado por dos importantes
escolleras (norte y sur). Es un puerto marítimo de ultramar, su actividad principal es la
pesca. Como actividades secundarias, el transporte de cereales, de petróleo y el
turismo.
2.2 Toma de muestras de individuos de Brachidontes rodriguezii
Se realizaron 24 muestreos mensuales y consecutivos durante el período mayo
2011- mayo 2013 en el muelle de Villa Gesell. En cada muestreo se registraron
parámetros físicos ambientales: temperatura del agua con termómetro de precisión
0,5o C y salinidad con salinómetro. Durante la marea baja se removieron con espátula
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porciones de la matriz (parches) que contituye B. rodriguezii (Figura 2. 2A) de la parte
inferior (en adelante estrato inferior) de las columnas del muelle ubicado en la playa
frontal (Figura 2. 2B). De esas muestras se separaron individuos de B. rodriguezii que
posteriormente fueron fijados en solución de Bouin.
En el puerto de Mar del Plata se realizaron dos muestreos mensuales durante
los meses de junio y julio de 2013 (Figura 2. 3A y B). Los individuos recolectados fueron
medidos con calibre de precisión de 0,01 mm, se retiraron las valvas y se fijaron
porciones de la gónada en glutaraldehído 2,5% durante 4 horas.
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Figura 2. 2. Área de estudio en la localidad de Villa Gesell. A. Muelle de pescadores. B. Detalle
de la disposición de B. rodriguezii en las columnas del muelle.
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Figura 2. 3. Área de estudio en el puerto de Mar del Plata. A. Fotografía del puerto tomada
desde la escolera sur. B. Fotografía de la cara interna de la escollera sur, donde se disponen los
parches de B. rodriguezii.
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3- Morfología gonadal y gametogénesis.
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3.1 Introducción
En los bivalvos, la gónada es de origen mesodérmico y se origina en la porción
posterior del cuerpo, próxima al ganglio visceral y por debajo de la cavidad pericárdica.
Siendo en su origen una estructura par y simétrica, a medida que se desarrolla
conforma una estructura constituida por numerosos túbulos y acinos (Sastry, 1979), va
penetrando en la masa visceral, rodeando al estómago, la glándula digestiva, desplaza
al tejido conectivo de los pliegues del manto hasta alcanzar su volumen máximo previo
a la reproducción (Barber et al., 2005; Franco et al., 2008). En los bivalvos el tejido
conectivo del manto posee importantes funciones fisiológicas, se encuentra altamente
irrigado y almacena sustancias (lípidos, glucógeno y proteínas) en células
especializadas llamadas vesiculares y adipogranulares (Lubet, 1959; Lowe et al., 1982;
Mathieu y Lubet, 1993; Villalva, 1995). Ambos tipos celulares almacenarían nutrientes
necesarios para el desarrollo de las gametas (Pipe, 1987a; Gimeno et al., 1991;
Mathieu y Lubet, 1993).
Existe una relación entre el desarrollo del tejido conectivo y el tejido gonadal.
Durante la gametogénesis, las sustancias de reserva energética (en particular, el
glucógeno) almacenados en el tejido conectivo serían direccionadas hacia los acinos
gonadales. Sumado a los cambios en la gónada, ocurre en simultáneo el ciclo de
acumulación de sustancias de reserva en el tejido conectivo (Gabbott, 1975; Bayne et
al., 1982; Lowe et al., 1982). Además, existen evidencias de que la glándula digestiva
también estaría involucrada en el suministro de energía durante el desarrollo gonadal
(Pérez et al., 2013).
La espermatogénesis y la oogénesis constituyen aspectos fundamentales
dentro de la biología reproductiva y han sido estudiados en numerosas especies de
moluscos, en particular en especies de importancia económica (Pipe, 1987b; Bernard
et al., 1988; Dorange y Le pennec, 1989a, b; De Gaulejac et al., 1995; Eckelbarguer y
Davies, 1996; Erkan y Sousa, 2002; Franco et al., 2011). La oogénesis puede ser
folicular o solitaria. Se considera oogénesis folicular cuando hay un epitelio de células
somáticas que rodea al oocito por completo durante su maduración (Jong-Brink et al.,
1983; Ituarte, 2009). Estas células somáticas son comúnmente llamadas foliculares y
mantienen aislado al oocito del medio intracinar. Dentro de los moluscos, la oogénesis
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de tipo folicular se encuentra en poliplacóforos y cefalópodos (Ituarte et al., 2010;
Laptikhovsky y Arkhipkin, 2001; Vélez-Arellano et al., 2014), mientras que en bivalvos,
la oogénesis suele ser de tipo solitaria (Raven, 1958; Sastry, 1979). En este caso, hay
escasas células somáticas rodeando al oocito. Algunos autores sugieren que estas
células migrarían desde la pared hacia el interior del acino (Dorange y Le pennec,
1989a). Estas células rodean por completo al oocito durante la diferenciación, al
comienzo de la vitelogénesis y conforme el oocito madura, se desplazan dejando al
oocito libre en el lumen del acino (Pipe, 1987b; Erkan, 2009; De Gaulejac et al., 1989;
Bernard et al., 1988). Cuando culmina la vitelogénesis los oocitos maduros son
liberados. Puede ocurrir que la evacuación de gametas no sea completa, dando lugar a
fenómenos de degradación y atresia como se han observado para Mytilus edulis (Pipe,
1987b) y Mytilus galloprovincialis (Suárez Alonso et al., 2007). Pérez et al. (2013)
menciona eventos de atresia únicamente para hembras de Aulacomya atra, durante la
primavera coincidiendo con la temporada reproductiva. Mientras que Suarez et al.
(2007) sugieren que la dificultad de detectar degradación y atresia en machos es una
consecuencia del tamaño reducido de las gametas masculinas. Luego de la evacuación
puede ocurrir una disminución de la actividad gametogénica (Vinuesa, 1981; Darriba et
al., 2004; Barber et al., 2005; Ángel-Pérez et al., 2007).
En la gónada masculina, el epitelio espermatogénico es de tipo estratificado.
Las células espermatogénicas se clasifican en: espermatogonias, espermatocitos,
espermátidas y espermatozoides. La maduración celular es de tipo centrípeta, los
diferentes estadios se distribuyen en capas (en algunos casos pueden encontrarse
agrupadas) las espermatogonias se encuentran próximas a las células de la pared del
acino, seguidas por los espermatocitos y las espermátidas, mientras que, los
espermatozoides suelen estar agrupados en numerosos sitios en el lumen del túbulo.
Junto con las células gametogénicas, se encuentran células somáticas denominadas
accesorias. Este tipo celular suele encontrarse cerca de los espermatozoides, por lo
que se cree que participarían de la espermatogénesis (Eckelbarguer y Davies, 1996).
Los objetivos de este capítulo fueron caracterizar la morfología gonadal de hembras y
machos de B. rodriguezii así como, los estadios celulares que comprenden la oogénesis
en las hembras de B. rodriguezii.
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3.2 Materiales y métodos
Se tomaron muestras de 826 individuos de Villa Gesell previamente fijados en
solución de Bouin. Se registró la medida del largo total (LT) con calibre de precisión de
0,01 mm (Figura 3. 1A). Se removieron las valvas y se realizaron cortes transversales en
dos zonas de la porción media del individuo (Figura 3.1B). Estas porciones
transversales de individuos completos fueron deshidratadas en una serie de alcohol
etílico de gradación creciente (80°, 90° y 96°) y fueron embebidas en historesin. Se
realizaron cortes histológicos de 5 µm y semifinos de 1 µm. Se utilizó hematoxilina de
Carazzi y Eosina alcohólica para colorear los cortes histológicos y azul de toluidina para
los corte semi finos (Ver Apéndice). Mediante la observación de cortes histológicos se
corroboró el sexo de los individuos y se consideraron para éste capítulo 50 individuos
entre machos y hembras de un rango de tallas de entre 15 y 22 mm, que presentaban
acinos gonadales en los pliegues del manto.
Figura 3. 1. A. Vista externa derecha de un individuo completo de B. rodriguezii. B. Vista lateral
izquierda de un individuo sin valva, nótese los filamentos el biso, el pliegue del manto, el
músculo aductor posterior y el borde de la valva derecha. Detalle de la sección transversal
(entre líneas discontinuas) utilizada para realizar los cortes histológicos. Referencias: (b)
filamentos del biso; (LT) largo total del individuo; (map) músculo aductor posterior; (pm)
pliegue del manto; (v) valva; (u) umbo. Escalas A y B: 5 mm.
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3.3 Resultados
El sexo de los individuos fue determinado a partir de la presencia de
espermatozoides y oocitos en el interior de los acinos gonadales, o bien de estadios
tempranos de la gametogénesis. Se observaron acinos gonadales en la masa visceral,
ambos pliegues del manto y en la región dorsal.
Hembras
Morfología de ovario
En los cortes histológicos, se observó que los acinos gonadales de las hembras
se encontraban en la región dorsal por encima del digestivo. Rodeando la glándula
digestiva, en ambos pliegues del manto y en la masa visceral debajo de la glándula
digestiva (Figura 3. 2).
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Figura 3. 2. Composición fotográfica de corte transversal de una hembra de B. rodriguezii del
mes de enero (LT 15,99mm). Se puede reconocer la disposición de acinos gonadales en la
región dorsal, por encima de los divertículos gástricos y del estómago. Debajo de la glándula
digestiva y los pliegues del manto. Referencias: (a) acinos gonadales; (br) branquias; (dg)
divertículos gástricos; (e) estómago; (gd) glándula digestiva; (mrp) músculos retractores
pedales; (pm) pliegue del manto. Escala: 500 µm.
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Los acinos gonadales se encontraban rodeados por tejido conectivo constituido
por células vesiculares y células adipogranulares (Figura 3. 3A). Las células vesiculares
presentaban morfología poligonal con núcleo acéntrico y contenían en su citoplasma
una gran vacuola. El fijador y la coloración utilizada no permitieron observar el
contenido, por eso en los cortes histológicos se evidenció un gran espacio vacío. Las
células adipogranulares, también presentaron morfología poligonal y en su interior se
observaron numerosas vesículas (Figura 3. 3A).
La pared de los acinos gonadales presentó un epitelio simple de células planas
denominadas comúnmente células de la pared del acino. En el interior del acino, se
observó el epitelio germinal junto con células somáticas. El epitelio germinal se ubicó
sobre la superficie interna del acino próxima a la masa visceral, mientras que la
superficie interna del acino próxima a la valva presentó un epitelio ciliado (Figura 3.
3B). Dentro de los acinos se observaron diferentes estadios de desarrollo de los
oocitos.
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Figura 3. 3. Acino gonadal de una hembra de B. rodriguezii en pliegue del manto. A. Elementos
del tejido conectivo, células vesiculares y adipogranulares y acino con oogonias agrupadas. B.
Epitelio ciliado sobre la pared del acino del lado del epitelio del manto. Dentro del acino se
observan oogonias agrupadas y oocitos previtelogénicos recientemente diferenciados.
Coloración utilizada: H y E. Referencias: (ag) células adipogranulares; (ec) epitelio ciliado; (em)
epitelio del manto; (o) oogonias; (pv) oocitos previtelogénicos; (v) células vesiculares. Escalas A
y B: 20 µm.
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Oogénesis
Durante los primeros estadios de la oogénesis dentro de los acinos se
observaron oogonias (Figura 3. 4A). El área de las oogonias fue 38,01 ± 7,60 µm2. La
diferenciación de las oogonias para dar lugar a los oocitos no era sincrónica. Es por ello
que, dentro de un mismo acino se encontraban en simultáneo los diferentes estadios
de desarrollo oocitario: oocitos previtelogénicos, vitelogénicos tempranos y
vitelogénicos.
En los oocitos previtelogénicos se observaron dos o tres células que rodeaban
por completo al oocito. La morfología de este tipo celular, denominado auxiliar fue
diversa (Figura 3. 4B). Los oocitos previtelogénicos se encontraron cerca de la pared
del acino, de forma alargada, con su eje mayor paralelo a la pared del acino y
presentaron entre 30 y 400 µm2 de superficie (Figura 3. 4B-C).
Durante el desarrollo de la vitelogénesis, el oocito adoptó una forma alargada y
en algunas ocaciones se observó un pedúnculo mediante el cual permaneció asociado
a las células de la pared del acino. Las células auxiliares se restringieron a la zona basal
del oocito asociadas al pedúnculo y en contacto con las células de la pared del acino
(Figura 3. 4D). Conforme la vitelogénesis progresó, la coloración utilizada en los cortes
histológicos permitió observar un proceso de diferenciación del contenido
citoplasmático. Los oocitos con vitelogénesis temprana presentaban una superficie
entre 350 y 800 µm2 y contenían gotas de vitelo en la región basal. En este estadio se
constituía la membrana gelatinosa. La distribución de las gotas de vitelo continuó
hasta que el contenido citoplasmático adquirió un aspecto uniforme. Los oocitos
vitelogénicos, listos para ser evacuados, medían entre 800 y 2700 µm2 y carecían de
pedúnculo. Estos se encontraron libres en el lumen del acino con el citoplasma
totalmente ocupado por gotas de vitelo (Figura 3. 5A).
Luego de la evacuación, en el interior de los acinos gonadales se observaron
estructuras membranosas desorganizadas, cuerpos amarillentos residuales y
hemocitos (Figura 3. 5B).
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Figura 3. 4. Oogénesis en B. rodriguezii. A. Detalle de un acino con oogonias y un oocito
previtelogénico recientemente diferenciado. B. Acino de mayor tamaño con oocitos previtelogénicos
con células accesorias. C. Acino con oocitos con diferente grado de avance de la vitelogénesis:
previtelogénicos, vitelogénicos tempranos y vitelogénicos. Obsérvese la heterogeneidad
citoplasmática y la membrana gelatinosa (punta de flecha). D. Acino con oocito con vitelogénesis más
avanzada, con saco vitelogénico y oocito con pedúnculo asociado a la pared del acino. Coloración
utilizada: H y E. Referencias: (a) células accesorias; (oo) oogonias; (p) pedúnculo; (pv) oocitos
previtelogénicos; (v) oocitos vitelogénicos; (vt) oocitos vitelogénicos tempranos. Escalas A-D: 20 µm.
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Figura 3. 5. Ovario de hembras de B. rodriguezii. A. Acinos con oocitos vitelogénicos previo a la
evacuación. B. Acinos con oocitos vitelogénicos y oocitos en proceso de degradación luego de
la evacuación. Coloración utilizada: H y E. Referencias: (v) oocitos vitelogénicos. Escalas Ay B:
50 µm.
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Machos
Morfología del testículo
En individuos sexualmente maduros se observaron acinos gonadales en
pliegues del manto, masa visceral y rodeando a la glándula digestiva (Figura 3. 6). La
pared del acino estaba formada por un epitelio simple de células planas. Dentro de
cada acino se encontraron células somáticas y células espermatogénicas. Las células
somáticas presentaron un núcleo irregular, un nucléolo conspicuo y bien definido y el
citoplasma de forma irregular al M.O. se observó claro (Figura 3. 7).
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Figura 3. 6. Distribución de la gónada masculina en un individuo maduro B. rodriguezii del mes
de enero (LT 20,05 mm). Se puede reconocer la disposición de acinos gonadales en la región
dorsal, por encima de los divertículos gástricos y del estómago. Debajo de la glándula digestiva
y en los pliegues del manto. Coloración utilizada: H y E. Referencias: (a) acinos gonadales; (br)
branquias; (dg) divertículos gástricos; (e) estómago; (gd) glándula digestiva; (mrp) músculos
retractores pedales; (pm) pliegue del manto. Escala: 500 µm.
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Figura 3. 7. Fotografía de corte semifino de gónada masculina de B. rodriguezii. Detalle de
células accesorias, espermatogonias y espermatocitos dentro del acino gonadal. En la periferia
del acino se reconocen células del tejido conectivo. Coloración utilizada: Azul de tolouidina.
Referencias: (a) células accesorias; (spc) espermatocito; (spg) espermatogonia, (tc) tejido
conectivo. Escala: 20 µm.
Espermatogénesis
En los machos se observó que dentro del acino, el epitelio germinal se ubicó
sobre la superficie interna del acino próximo a la masa visceral. Mientras que la
superficie interna del acino próxima a la valva presentaba un epitelio ciliado (Figura 3.
8).
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Figura 3. 8. Acino gonadal de un macho de B. rodriguezii donde se observa la disposición del
epitelio espermatogénico dentro del acino. Espermatogonias, espermatocitos y espermátidas.
El epitelio de la pared del acino próximo al epitelio del manto presenta cilias (flecha).
Coloración utilizada: H y E. Referencias: (em) epitelio del manto; (ep) epitelio de la pared del
acino; (spc) espermatocitos; (spg) espermatogonias; (spm) espermátidas. Escala: 20 µm.
El epitelio germinal se observó constituido por espermatogonias,
espermatocitos, espermátidas y espermatozoides. Las espermatogonias presentaron
una superficie de 9,01 ± 3,77 µm2, su núcleo era conspicuo y se ubicaron sobre la
pared del acino (Figura 3. 9A, B). Los espermatocitos y las espermátidas se encontraron
entre las espermatogonias y el lumen del acino (Figura 3. 9C). Los espermatozoides se
observaron agrupados y confinados al lumen del acino (Figura 3. 9D). Estos tipos
celulares se observaron durante todo el año aunque su proporción fue variable según
la época del año. A medida que progresó la espermatogénesis, los acinos aumentaron
de tamaño.
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Figura 3. 9. Espermatogénesis en B. rodriguezii. A. Acino del pliegue del manto con
espermatogonias. B. Estadio avanzado de la espermatogénesis, con espermatogonias y
espermatocitos. C. Acino gonadal próximo a un túbulo de la glándula digestiva con
espermatogénesis más avanzada ya que se pueden observar espermátidas. Nótese el sentido de
maduración de las células espermatogénicas. D. Acino de un individuo maduro, con
espermatozoides en el lumen. Coloración utilizada: H y E. Referencias: (*) lumen del acino; (gd)
glándula digestiva; (spc) espermatocito; (spg) espermatogonia; (spm) espermátidas; (spz)
espermatozoide; (tc) tejido conectivo. Escalas A-C: 20 µm. Escala D: 50 µm.
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Dentro los acinos, tanto del pliegue del manto como de la masa visceral, se
observaron agrupaciones compactas de hemocitos (Figura 3. 10A y B). Las
agrupaciones se focalizaron en el área de contacto con el epitelio del manto.
Figura 3. 10. Fotografías de gónada de un individuo macho de B. rodriguezii. A. Pliegue del manto
donde se observan masas de hemocitos en el interior de los acinos próximos al epitelio del manto
que está en contacto con la valva. B. Acinos de región dorsal próximos al riñón. Coloración utilizada H
y E. Referencias: (a) acinos gonadales; (em) epitelio del manto; (mh) masas de hemocitos; (r) riñón.
Escalas A y B: 100 µm.
Hermafroditas
Se registraron 4 individuos hermafroditas de un total de 826 individuos
estudiados. Este fenómeno fue registrado en diferentes meses del período estudiado
(octubre y diciembre de 2011 y julio y noviembre de 2012). Los individuos presentaron
un rango de tallas entre 7,10 y 22,8 mm de largo total. En dos individuos se observó
una diferencia en el aspecto externo de los pliegues del manto. En un pliegue del
manto se registró la coloración observada previamente en machos, mientras que el
otro pliegue presentaba la coloración observada en el pliegue del manto de las
hembras (Figura 3. 11). Mediante cortes histológicos fue posible evidenciar dos
modalidades de gónada hermafrodita simultánea. En un caso, los individuos
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presentaban algunos acinos donde tenía lugar la oogénesis y otros acinos donde
ocurría espermatogénesis (Figura 3. 12A y B). En estos casos el estado de maduración
gonadal era más avanzado en los acinos donde ocurría espermatogénesis. Mientras
que para la otra modalidad, se observó que dentro de un acino coexistían líneas
germinales tanto para oocitos como para espermatozoides. En este caso, la línea
germinal masculina se disponía en el centro del acino y la femenina hacia las paredes
del acino (Figura 3. 12C).
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Figura 3. 11. Composición fotografica de corte transversal de un individuo hermafrodita de B.
rodriguezii del mes de julio (LT 18,55 mm) con acinos gonadales en pliegues del manto (donde
ocurre espermatogénesis y oogénesis por separado) en posición dorsal, sobre divertículos
gástricos, estómago y glándula digestiva. Referencias: (a) acinos gonadales; (br) branquias; (dg)
divertículo gástrico; (e) estómago; (gd) glándula digestiva; (mrb) músculo retractor del biso; (p)
pie; (pm) pliegue del manto. Escala: 500 µm.
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Figura 3. 12. Detalles de acinos gonadales de individuos hermafroditas A. Detalle de un acino
masculino (recuadro A Figura 3. 11). B. Detalle de un acino femenino con oocitos
previtelogénicos y el epitelio ciliado (recuadro B Figura 3.11). C. Estadios de la
espermatogénesis y con espermatozoides y oocitos en un mismo acino. Coloración utilizada H
y E. Referencias: (a) acino gonadal; (ec) epitelio ciliado; (o) oocitos; (opv) oocitos
previtelogénicos; (spz) espermatozoide. Escalas A y C: 100 µm. Escalas B: 10 µm.
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3. 4 Discusión
En los moluscos bivalvos el sistema reproductor es simple, esto es habitual en
especies con fecundación externa (Kasyanov, 2001). La gónada está constituida por
una red de acinos y túbulos conectados entre sí (Sastry, 1979). Aumenta su superficie y
volumen a medida que progresa la gametogénesis (Eckelbarger y Davies, 1996; Franco
et al., 2008). Rodeando a los acinos gonadales, se encuentra el tejido conectivo, que
sostiene a los acinos y constituye uno de los centro de almacenaje de sustancias que
participan durante la gametogénesis (Pipe, 1987a, b; Berthelin et al., 2000; Gimeno et
al., 1991). La pared de los acinos está formada por un epitelio simple que presenta
cilias en la región próxima al epitelio del manto que está en contacto con la valva. Estas
estructuras favorecerían el transporte de las gametas hacia los gonoductos (Franco et
al., 2008).
La morfología gonadal de Brachidontes rodriguezii descripta en este estudio
resultó ser similar a la mencionada para bivalvos mitílidos (Vinuesa, 1981; Pipe, 1987b;
Bernard et al., 1988; Calvo et al., 1998; Kasyanov, 2001). En los acinos gonadales de
hembras y machos de B. rodriguezii se observó la presencia de cilias en el epitelio que
reviste la pared del acino próxima al epitelio del manto secretor de la valva. En las
hembras resultó más fácil observar las cilias en una etapa temprana de la oogénesis
mientras que en los machos era más fácil reconocer las cilias en acino evacuados.
En relación al proceso de formación y maduración de gametas, en hembras de
B. rodriguezii observamos que la oogénesis resultó ser de tipo solitaria. Se observaron
células somáticas en el interior de los acinos que estaban en contacto con los oocitos
en etapas tempranas del desarrollo, mientras que a medida que la vitelogénesis
progresaba, la interacción entre las células somáticas y el oocito disminuía. Estas
células somáticas se denominan accesorias (De Gaulejac et al., 1995; Ángel Pérez et al.,
2007) aunque, algunos autores las han denominado células foliculares (Pipe, 1987a;
Bernard et al., 1988; Eckelbarger y Davies, 1996). Aun así, se considera apropiado
denominar con el término folicular a aquellas células somáticas que constituyen un
epitelio que rodea por completo (un verdadero folículo) al oocito durante todo el
proceso de desarrollo y que participa por ejemplo, de la nutrición del oocito
(Laptikhovsky y Arkhipkin, 2001). Pipe (1987a) menciona para Mytilus edulis que las
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células “foliculares” tendrían la capacidad de incorporar, transformar y sintetizar
materiales, así como fagocitar partículas. Pero no encuentra evidencia de que este tipo
celular participe de la reabsorción del material que proviene de la degradación de los
oocitos no liberados. En especies incubadoras como Gaimardia trapesina, las células
foliculares además de acompañar al oocito durante el proceso de maduración,
participan de la incubación de los embriones (Ituarte, 2009), mientras que según
Dorange y Le Pennec (1989a) en Pecten maximus estas células darían origen a la
envoltura del oocito.
Para B. rodriguezii, al igual que se ha descripto para otras especies, la ubicación,
morfología y composición del ooplasma varía con la progresión de la vitelogénesis,
dado esto, se reconocieron diferentes estadios oocitarios. La maduración de las
gametas no es sincrónica, por lo que se observaron diferentes estadios dentro de un
mismo acino. Resultados similares se han mencionado para otras especies de mitílidos
(Bernard et al., 1988; De Gaulejac et al., 1995; Pipe, 1987a; Eckelbarger y Davies, 1996;
Ángel Pérez et al., 2007).
Se observaron células somáticas en el interior de los acinos de los machos de B.
rodriguezii que se encontraban próximas a la pared del acino y rodeadas por células
espermatogénicas. Las células somáticas llamadas accesorias participarían de la
espermatogénesis (Eckelbarger y Davies, 1996; Franco et al., 2008). La
espermatogénesis en Brachidontes rodriguezii es similar a la observada para otras
especies de bivalvos mitílidos (Bernard et al., 1988; Calvo et al., 1998: Reunov et al.,
1999; Eckelbarger y Young, 1999; Kádar et al., 2006; Yurchenko y Vaschenko, 2010).
La degradación de gametas masculinas, a diferencia de lo que ocurre con los
oocitos, no es un fenómeno apreciable debido al escaso citoplasma que tienen los
espermatozoides. Las masas de hemocitos en el interior de los acinos, según Suárez
Alonso et al. (2007) podrían ser una señal de atresia en machos. En este estudio, se
registró la presencia de hemocitos agrupados dentro de los acinos de machos de B.
rodriguezii. Los hemocitos constituyen el tipo celular más importante del sistema
inmune de los moluscos (Ottaviani, 2011). Algunos autores inclusive los denominan
inmunocitos (De Vico y Carella, 2012). Los hemocitos pueden formar nódulos, que
constituyen un tipo de respuesta inflamatoria frente a la necesidad de fagocitosis de
pequeñas partículas (De Vico y Carella, 2012).
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Se registraron individuos hermafroditas en muy baja frecuencia. Esta condición
ha sido mencionada en numerosas especies de bivalvos (Brousseau, 1982; Morton,
1991; Giguère et al., 1994; Ángel Pérez et al., 2007; Romo Piñera et al., 2009). Dentro
de la familia Mytilidae se registraron casos de hermafroditismo en especies marinas y
de agua dulce (Sunila, 1981; Villalba, 1995; Darrigran et al., 1998; Montenegro
Villalobos et al., 2010; Al-Barwani et al., 2013; Kefi et al., 2014). El hermafroditismo en
especies gonocóricas es considerado accidental (Coe, 1943) y suele ocurrir en baja
frecuencia (Morton, 1991). La determinación del sexo de los individuos ocurre en
algunos casos durante o después de la fertilización, mientras que en otros casos puede
verse influenciada por las condiciones ambientales a las que están sometidos los
juveniles (Morton, 1991). Se desconocen con profundidad las causas del
hermafroditismo en especies gonocóricas. Romo Piñera et al. (2009) describen para
Megapitaria squalida una frecuencia de individuos hermafroditas superior a la
esperada para una especie gonocórica y para dos poblaciones en Baja California,
México, una proporción de hembras mayor a la de machos. Proponen que M. squalida
podría estar respondiendo a un modelo de baja densidad. Esto es, cuando una
población disminuye en número por alguna razón, la selección natural favorece el
hermafroditismo (Ghiselin, 1969). M. squalida es una especie de importancia
económica y su pesquería ha afectado seriamente su densidad poblacional (Romo
Piñera et al., 2009). Este incremento en el número de hermafroditas podría ser
resultado de la plasticidad fenotípica para maximizar el éxito reproductivo (Morton,
1991). Por otro lado, considerando la regulación endocrina de procesos como la
reproducción, el crecimiento y el desarrollo, algunos autores han descripto la
presencia de ovotestis (órgano donde ocurre espermatogénesis junto con oogénesis)
en bivalvos y relacionan este fenómeno con la presencia de desechos urbanos y
descargas industriales de sustancias que podrían actuar como disruptores endocrinos.
Aun así, el mecanismo de acción aún no se ha estudiado (Horiguchi et al., 2000;
Chesman y Langston, 2006; Langston et al., 2007: Petridis et al., 2009). Dado que la
incidencia de individuos de B. rodriguezii que manifiestan la condición de hermafrodita
es baja en la localidad de Villa Gesell, consideramos que esta estrategia reproductiva
es alternativa.
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4- Caracterización ultraestructural de la espermatogénesis y del
espermatozoide. Alteraciones morfológicas.
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4.1 Introducción
En el capítulo anterior se mencionaron una serie de procesos que ocurren a
medida que la progresa la gametogénesis. Dentro de los bivalvos, para la familia
Mytilidae, se ha estudiado y caracterizado la oogénesis y la espermatogénesis, en
numerosas especies. Inclusive se han realizado estudios ultraestructurales de la
espermatogénesis y de la morfología del espermatozoide (Longo y Dornfield, 1967;
Lowe et al., 1982; Hodgson y Bernard, 1986). Lo mismo ocurre para la familia
Pectinidae (Dorange y Le Pennec, 1989b), mientras que dentro de la familia Ostreidae
el número de estudios es reducido (Thielley et al., 1993; Sousa y Oliveira, 1994;
Eckelbarger y Davies, 1996). La espermatogénesis es el proceso mediante el que se
obtienen las gametas masculinas. Las células espermatogénicas se clasifican en:
espermatogonias, espermatocitos y espermátidas. Las espermatogonias proliferan
mediante divisiones mitóticas, originando espermatocitos primarios, que se dividen
por meiosis, la división celular culmina con la formación de las espermátidas (Walker y
MacGregor, 1968). Luego durante la espermiogénesis se producen una serie de
cambios en la espermátida, se condensa el material nuclear, se forma el complejo
acrosomal, la célula adquiere una forma elongada y se desarrolla el flagelo. El proceso
de diferenciación de la espermátida culmina con la formación del espermatozoide
(Franzen, 1955). El epitelio germinativo es de tipo estratificado y la maduración celular
es de tipo centrípeta, es decir, las espermatogonias se encuentran próximas a las
células de la pared del acino, seguidas por los espermatocitos y las espermátidas. Es
posible reconocer a los espermatozoides agrupados en numerosos sitios en el lumen
del acino (Bernard et al., 1988; De Gaulejac et al., 1995).
El estudio de la espermatogénesis, ya sea la caracterización morfológica como
la histoquímica, constituye una herramienta que permite diferenciar células
espermáticas y establecer diferencias entre especies (Sousa et al., 1989; Rocha y
Azevedo, 1990; Sousa y Oliveira, 1994). El estudio ultraestructural del espermatozoide
se desarrolla en forma continua desde hace varios años. Estudios previos en especies
del mismo género muestran que la morfología del espermatozoide permanece
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altamente conservada, y se observan características morfológicas propias a nivel
específico. Por este motivo es considerada una herramienta fundamental en estudios
filogenéticos (Popham, 1979; Garrido y Gallardo 1996; Drozdov y Reunov, 1997;
Kafanov y Drozdov, 1998; Healy et al., 2000; Gladyshev y Drozdov, 2002; Bieler et al.,
2014). Dentro de los bivalvos mitílidos suele observarse un tipo característico de
espermatozoide, denominado primitivo o ect aquaesperma. El espermatozoide tipo
primitivo a menudo se encuentra en invertebrados que liberan sus gametos en el agua
y que se reproducen con fecundación externa (Jamieson y Rouse, 1989; Kafanov y
Drozdov, 1998; Eckelbarger y Young, 1999; Reunov et al., 1999). El espermatozoide de
tipo primitivo presenta un complejo acrosomal cónico, un núcleo de longitud reducida.
La pieza media consiste en un anillo de mitocondrias esféricas, que rodean dos
centriolos dispuestos de manera ortogonal y un flagelo simple con dos microtúbulos
centrales y rodeados por nueve tripletes de microtúbulos (disposición 9+2) (Healy et
al., 2001).
Trevisan et al. (2014) mencionan una serie de alteraciones en la morfología de
células de la branquia de Crossostrea gigas como consecuencia de la exposición a zinc.
En el mitílido Modiolus kurilensis se han descripto alteraciones ultraestructurales en
células espermatogénicas y somáticas dentro de la gónada, en ambientes expuestos a
elevadas concentraciones de metales pesado y DDT (Yurchenko y Vaschenco, 2010). Es
decir, el estudio de la ultraestructura de diferentes tipos celulares permite además,
hacer estudios comparados evaluando el impacto que generan las condiciones
ambientales en los organismos. Los estudios de biomonitoreo ambiental consideran
apropiado el uso de moluscos bivalvos por su amplia distribución geográfica, tipo de
alimentación (filtradores), la capacidad de acumular diferentes sustancias, tanto del
agua como de los sedimentos y los hábitos sedentarios (Gil et al., 2006; Arias et al.,
2009; Bigatii et al., 2009; Duarte et al., 2011; Schmidt et al., 2013).
B. rodriguezii es una especie clave en el intermareal costero de la provincia de
Buenos Aires (Adami et al., 2004; Carranza et al., 2009). Las características biológicas
de B. rodriguezii y su amplia distribución la convierten en una especie apropiada para
desarrollar estudios de biomonitoreo ambiental en ambientes costeros. El objetivo de
este capítulo fue describir la espermatogénesis y la morfología del espermatozoide, así
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como describir alteraciones encontradas en la gónada de individuos que habitan en
ambientes con elevados niveles de alteración antropogénica.
4.2 Materiales y métodos
Se tomaron muestras de 5 individuos de Brachidontes rodriguezii de Villa Gesell
en octubre de 2011 y 5 individuos de la escollera sur del puerto de Mar del Plata
durante los meses de junio y julio de 2013. Para los individuos de Villa Gesell y Mar del
Plata se utilizaron los siguientes protocolos:
Microscopia óptica y electrónica de transmisión (M.E.T.)
Muestras de manto de 4 mm3 fueron fijadas en glutaraldehído 2,5% en buffer
fosfato cacodilato 0,1 M, pH 7,2 y agua de mar durante 4 hs a 4°C. Luego de la fijación
se lavó en buffer fosfato. La postfijación se realizó en tetróxido de osmio 1% en buffer
durante 1:30 hs a temperatura ambiente. Las muestras fueron deshidratadas en
alcoholes de gradación creciente hasta etanol 100°/óxido de propileno (1:1) y luego en
óxido de propileno puro. Seguidamente las muestras fueron embebidas en una mezcla
de resina araldita. Los cortes semifinos de 1 µm fueron coloreados con azul de
toluidina y observados con microscopio óptico para dar orientación previa al material
que se observaría en microscopio electrónico de transmisión. Los cortes ultrafinos se
realizaron con ultramicrótomo Reichert y fueron contrastados con acetato de uranilo y
citrato de plomo. Las secciones fueron examinadas, observadas y fotografiadas con un
microscopio electrónico de transmisión Hitachi 300 y Jeol 1010 operado a 75–80 kV.
Microscopia electrónica de barrido (M.E.B)
Se tomaron muestras de porciones del pliegue del manto de los individuos de
de Villa Gesell para preparar suspensiones de tejido gonadal. Las porciones de tejido
gonadal fueron sometidas a agitación y fijadas en glutaraldehído 2,5% en buffer
fosfato cacodilato 0,1 M, pH 7,2 y agua de mar durante 4 hs a 4oC. Luego de la fijación
se lavó en buffer fosfato y la postfijación se realizó en alcohol absoluto.
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Las suspensiones de tejido gonadal fueron examinadas, observadas y
fotografiadas con un microscopio electrónico de barrido Philips modelo XL30 TMP y
procesadas con el software ANALYSIS.
4.3 Resultados
Dentro de los acinos gonadales, las células espermatogénicas se encontraban
dispuestas de forma centrípeta (Figura 4. 1). En el lumen del acino se observaban
espermatoziodes y espermátidas. Hacia la pared del acino, se disponían las
espermatogonias y los espermatocitos.
Figura 4. 1. Gónada de un individuo maduro de B. rodriguezii. En el interior del acino se
disponen los espermatozoides, espermátidas, espermatocitos y las espermatogonias.
Referencias: (spc) espermatocito; (spg) espermatogonias; (spm) espermátidas; (spz)
espermatozoide. Escala: 40 µm.
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Ultraestructura de la espermatogénesis
La serie espermatogénica estaba constituida por espermatogonias,
espermatocitos, espermátidas y espermatozoides.
Las espermatogonias se ubicaban en la región periférica en contacto con las
células de la pared del acino. En el interior de núcleo se encontraba el nucléolo y la
cromatina dispersa. El citoplasma presentaba vesículas. La fusión de estas vesículas
daría lugar al complejo acrosomal. Se observaron dos tipo de espermatogonias, un tipo
celular de morfología alargada y mayor volumen citoplasmático, próximo a la pared del
acino (Figura 4. 2A) y un segundo tipo con núcleo esférico y citoplasma reducido que
se encontraba distante a la pared (Figura 4. 2B).
Los espematocitos presentaban un núcleo esférico de mayor tamaño que en las
espermatogonias. En el interior del núcleo se observó la cromatina difusa y se
reconcieron los complejos sinaptonémicos de la profase meiótica en los
espermatocitos I (Figura 4. 1C).
Las espermátidas en su estadio temprano presentaban forma esférica.
Conforme avanzó el proceso de maduración, tuvo lugar la condensación de la
cromatina y la morfología del núcleo sufrió una ligera modificación, de esférico pasó a
ser alargado en el sentido antero-posterior. Durante la espermiogénesis conforme
avanzó la condensación del material nuclear, la envoltura nuclear comenzó a
invaginarse dando lugar a la formación de lagunas nucleares. Las mitocondrias
esféricas se dispusieron en el extremo posterior del núcleo donde se observó una
depresión o fosa que alojó dos centriolos (Figura 4 2D, E). En el extremo anterior el
complejo acrosomal, que en un principio tenía aspecto de vesícula esférica con
material electrodenso en su periferia, adquirió forma cónica. En la porción anterior de
la vesícula se observó material electrodenso y en su porción posterior material con una
densidad menor. La zona de la vesícula que estaba en contacto con el núcleo
presentaba una invaginación, dando lugar a un espacio entre la vesícula acrosomal y el
núcleo. Este espacio subacrosomal presentaba en su interior material fibrilar (Figura 4.
2H-M).
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Figura 4. 2. Ultraestructura de la espermatogénesis en B. rodriguezii. A-B. Espermatogonia con
vesículas proacrosomales (punta de flecha). C. Espermatocito. D. Espermátida en desarrollo. E.
Espermátida avanzada. F. Espermátida avanzada comenzando la espermiogénesis. G. Vesícula
acrosomal y vesícula subacrosomal de la espermátida. H-M. Formación de la vesícula
acrosomal durante la espermiogénesis. Referencias: (cd) centriolo distal; (cp) centriolo
proximal; (m) mitocondrias; (n) núcleo; (nu) nucléolo; (va) vesícula acrosomal; (vsa) vesícula
subacrosomal. Escala: 0,5 �m.
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Morfología del espermatozoide
El espermatozoide era la célula más pequeña de la línea germinal. En la región
apical se encontraba el complejo acrosomal, de aspecto cónico y presentaba una
prolongación anterior (Figura 4. 3A-B). En el extremo posterior, la pieza media estaba
constituida por mitocondrias que se encontraban íntimamente asociadas a la región
basal del núcleo (Figura 4. 3C). El núcleo presentaba forma ovalada, ligeramente
aplanada en los extremos. La longitud del complejo acrosomal era de 2,87 ±0,27 µm,
mientras la longitud aproximada del núcleo era de 1,70 ± 0,11 µm.
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Figura 4. 3. Morfología del espermatozoide de B. rodriguezii (M.E.B.) A. Aspecto general del
núcleo y acrosoma. B. Espermatozoide completo en vista longitudinal, con acrosoma
extendido y flagelo que continúa posteriormente a la pieza media. C. Mitocondrias esféricas
(punta de flecha) en la región posterior de la pieza media. Referencias: (a) acrosoma; (f)
flagelo. Escala: 1000 nm.
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En el interior del complejo acrosomal el material se disponía de manera
homogénea (Figura 4. 4A). La vesícula subacrosomal presentó un contenido granular
(Figura 4. 4B). En el interior del núcleo se observabaron lagunas nucleares distribuidas
al azar entre la heterocromatina (Figura 4.3 B, C). Hacia el extremo posterior se
observó la pieza media formada por cinco mitocondrias esféricas dispuestas en forma
contigua formando un anillo (Figura 4. 4 D, E) que a su vez, rodeaban dos centriolos
dispuestos de manera ortogonal (Figura 4. 4B, F). La talla de las mitocondrias resultó
ser de 0,76 ± 0,25 µm de diámetro. Desde el centriolo distal y hacia el extremo
posterior del espermatozoide se observó un flagelo simple (9+2) (Figura 4. 4G).
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Figura 4. 4. Morfología del espermatozoide de B. rodriguezii (M.E.T). A. Corte longitudinal de la
vesícula acrosomal. B. Corte longitudinal de una espermátida tardía, vesícula subacrosomal,
núcleo y pieza media mostrando el centriolo proximal, y el centriolo distal. C. Corte transversal
del núcleo. D. Corte transversal de porción anterior de la pieza media, es posible observar a las
mitocondrias en contacto estrecho con el núcleo. E. Sección transversal de la pieza media. F.
Sección transversal del centriolo distal. G. Sección transversal del flagelo. Referencias: (cd)
centriolo distal; (cp) centriolo proximal; (ln) lagunas nucleares (m) mitocondria; (n) núcleo; (va)
vesícula acrosomal; (vsa) vesícula subacrosomal. Escalas A-E: 0,5 �m. Escalas F y G: 0,1 µm.
La información proporcionada por la microscopía electrónica, tanto de
trasmisión como de barrido, permitió realizar la reconstrucción esquemática de la
morfología del espermatozoide de B. rodriguezii (Figura 4. 5).
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Figura 4. 5. Esquema del espermatozoide de B. rodriguezii. A. Esquema de corte longitudinal
del espermatozoide. Las líneas marcadas sobre el esquema en vista longitudinal se
corresponden con los esquemas de cortes tranversales (CT) de B. B. 1: CT de pieza media a
nivel de centriolo proximal, 2: CT de pieza media a nivel del centriolo distal, 3: CT de la base del
flagelo y 4: CT a nivel del flagelo. Escala: 1 µm.
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Alteraciones ultraestructurales en la gónada masculina de B. rodriguezii
En todos los individuos tomados del Puerto de Mar del Plata se observaron
vesículas con material electrodenso dispersas en el interior en la gónada masculina
(Figura 4. 6A). Estas vesículas contenían una serie de estructuras de forma irregular y
alta electrodensidad (Figura 4. 6A, Recuadro). Se observaron membranas plasmáticas
desorganizadas. Las vesículas se encontraban también dentro de células de la línea
espermatogénica (Figura 4. 6B).
En los espermatozoides se observó que el contenido de la vesícula acrosomal
era levemente electrodenso (Figura 4. 7A y B). La pieza media estaba constituida por
cinco mitocondrias esféricas dispuestas en anillo, rodeando un par de centriolos
dispuestos de manera ortogonal. Las crestas mitocondriales se observaban poco
contrastadas (difusas) (Figura 4. 7C).
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Figura 4. 6. Espermatogénesis de individuos de B. rodriguezii de Mar del Plata. A. Aspecto
general donde se reconocen numerosas vesículas entre las células espermatogénicas,
espermatocitos y espermátidas. Recuadro: Detalle de vesícula. B. Espermatocitos con
membranas desorganizadas (punta de flecha) y vesículas en su interior. Referencias: (epc)
espermatocitos; (epm) espermátidas; (v) vesículas. Escala A: 1 µm. Escala B: 2 µm. Escala
recuadro: 200 nm.
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Figura 4. 7. Fotografías de espermatozoides de B. rodriguezii de Mar del Plata. A.
Espermatozoide que presenta una vesícula acrosomal con contenido poco electrodenso. B.
Regiones del acrosoma con marcadas diferencias de electrodensidad del contenido. C.
Mitocondrias de la pieza media con crestas difusas. Referencias: (a) acrosoma; (m)
mitocondrias; (n) núcleo. Escalas A y B: 1 µm. Escala C: 0,5 µm.
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4.4 Discusión
La espermatogénesis en Brachidontes rodriguezii muestra similitudes con otras
especies de bivalvos mitílidos (Bernard et al., 1988; Reunov et al., 1999; Eckelbarger y
Young, 1999; Kádar et al., 2006; Yurchenko y Vaschenko, 2010). Al comienzo de la
espermatogénesis, en las espermatogonias y los espermatocitos de B. rodriguezii, se
pueden reconocer las vesículas que se fusionaran para dar lugar al complejo
acrosomal. La condensación de la heterocromatina y la elongación del núcleo ocurren
a medida que comienza a formarse el complejo acrosomal y la maduración continúa.
La gametogénesis culmina con la formación del espermatozoide.
En los moluscos las características del espermatozoide son altamente
conservadas a nivel específico y constituyen una herramienta en estudios taxonómicos
(Franzén, 1983; Drozdov y Reunov, 1997; Healy et al., 2000; Drozdov et al., 2009; Bieler
et al., 2014). Actualmente se realizan estudios filogenéticos integrando herramientas
morfológicas de la taxonomía clásica (características de la concha, larva, branquias, pie
y músculos, entre otros) con marcadores moleculares. Estos estudios sugieren que la
caracterización de los aspectos ultraestructurales del espermatozoide constituye una
herramienta fundamental. Junto con los caracteres morfológicos de la concha, la
descripción del espermatozoide proporciona casi el 50% de los caracteres informativos
(Bieler et al., 2014).
Para la familia Mytilidae, se ha descripto la morfología del espermatozoide en
numerosas especies (Kafanov y Drozdov, 1998; Eckelbarger y Young, 1999; Introíni et
al., 2004, 2009, 2010; Desouky, 2009). El espermatozoide de los mitílidos es de tipo
primitivo, y es característico de especies cuya fecundación ocurre en el agua (Jamieson
y Rouse, 1989; Kafanov y Drozdov, 1998; Eckelbarger y Young, 1999; Reunov et al.,
1999). El espermatozoide de tipo primitivo presenta un complejo acrosomal cónico,
puede ser simple o presentar diferentes grados de complejidad, por ejemplo, especies
del género Bathymodiolus presentan una vesícula acrosomal simple, mientras que para
Mytilus, la vesícula acrosomal es compleja, presentado zonas bien diferenciadas
(Popham, 1979; Eckelbarger y Young, 1999; Healy et al., 2000). El núcleo es por lo
general ovoide, la pieza media usualmente tiene 5 mitocondrias esféricas, pero esto
puede variar. Para el género Modiolus, dentro de la familia Mytilidae, la pieza media
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puede tener entre 12 y 14 mitocondrias (Kafanov y Drozdov, 1998; Healy et al., 2000;
Gladyshev y Drozdov, 2002).
El carácter aparentemente más variable, y que proporcionaría la mayor
cantidad de información es la morfología del complejo acrosomal. Mientras que los
menos informativos son, la estructura del flagelo y la forma de las mitocondrias
(Garrido y Gallardo, 1996; Healy et al., 2000; Introíni et al., 2004, 2009). La longitud del
núcleo y del complejo acrosomal, están relacionadas con la morfología del oocito. Es
decir, el complejo acrosomal es más largo en aquellas especies donde la cubierta
gelatinosa del oocito es gruesa. Mientras que para las especies con cubierta más
delgada, el complejo acrosomal tiene menor longitud. El medio donde ocurre la
fecundación también afectaría las características del acrosoma. Para las especies que
tienen fecundación en el agua, el complejo acrosomal sería más largo, y el núcleo
redondeado. Cuando la fecundación ocurre por ejemplo en la cavidad del manto, el
núcleo es más alargado y el acrosoma es reducido (Franzén, 1983). Para la familia
Mytilidae, Kavanov y Drozdov (1998) proponen una división en tres subfamilias en
base a la forma del núcleo y del contenido de la vesícula subacrosomal. La subfamilia
Mytilinae, (Mytilus, Perna y Crenomyilus) donde el acrosoma es elongado, y en la
vesícula subacrosomal hay una estructura de naturaleza proteica con forma alargada
denominada raíz axial que se prolonga en la vesícula subacrosomal rodeada por el
núcleo. La subfamilia Musculinae (género Musculus), donde el acrosoma es cónico y de
longitud reducida, mientras que el núcleo es muy alargado y en la vesícula
subacrosomal se observa raíz axial. Y la subfamilia Modiolinae (Modiolus, Alaucomya,
Brachidontes y Choromytilus entre otros) donde el complejo subacrosomal es cónico,
de longitud variable, con ausencia de raíz axial y el núcleo es de forma ovalada y de
longitud reducida.
La morfología del espermatozoide de Brachidontes rodriguezii se asemeja a la
morfología observada para otras especies del género, como Brachidontes solicianus y
Brachidontes darwinianus (Introíni et al., 2004). Brachidontes semistriatus (Reunov y
Hodgson, 1994) y Brachidontes purpuratus (Garrido y Gallardo, 1996; Briones et al.,
2012; Torroglosa y Giménez, 2015). El espermatozoide es de tipo primitivo, el
complejo acrosomal es cónico y ligeramente afinado hacia el extremo apical. La
vesícula acrosomal es simple y durante la espermiogénesis se observa una zona con
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mayor densidad hacia el extremo y menos densidad hacia la base, próxima al núcleo.
Estas diferencias no se observan en el espermatozoide. La región que presenta mayor
variabilidad morfológica entre las especies, resultó ser el acrosoma. B. rodriguezii
posee un acrosoma ligeramente más largo que el de B. purpuratus y de longitud
comparable a lo reportado para B. solisianus. Mientras que B. darwinianus, presenta
un complejo acrosomal ligeramente más corto que el descripto para B. rodriguezii, y la
morfología del núcleo también difiere, siendo más ovalado para este último. Vinuesa
(1981) menciona para Brachydontes purpuratus (Lmk.) en una descripción con
microscopía óptica, que la longitud del acrosoma junto con el núcleo es de entre 8 y
9,5 micrones, es decir, un espermatozide cuya porción anterior duplicaría en longitud
al tamaño obtenido para B. rodriguezii en este estudio. Bernard et al. (1988) describe
para Brachidontes virgiliae, un espermatozoide de tipo primitivo, al igual que para
otras especies de género, sin embargo la longitud del complejo acrosomal es
aproximadamente un quinto de la mencionada para B. rodriguezii. Y a diferencia de lo
que se observa habitualmente en la pieza media, que es la presencia de cinco
mitocondrias esféricas, B. virgiliae tiene seis. La descripción de la morfología del
espermatozoide de B. rodriguezii de este estudio, contribuye al conjunto de caracteres
taxonómicos que caracterizan a la especie.
Efectos de los disturbios antropogénicos en la ultraestructura de las células
espermatogénicas
Los individuos de B. rodriguezii de la población de la escollera sur del puerto de
Mar del Plata mostraron modificaciones en la estructura de algunas organelas y
presentaron vesículas electrodensas a diferencia de lo registrado para la población de
Villa Gesell. Se han mencionado para otras especies de moluscos alteraciones de la
línea germinal en ambientes contaminados (Yurchenco y Vaschenko, 2010; Vaschenko
et al., 2013). Cambios en la organización de las células germinales y somáticas dentro
de los acinos gonadales, alteraciones de la morfología celular, y de la composición
bioquímica son los resultados predominantes en los estudios realizados en
invertebrados marinos, frente a distintos tipos de disturbios ambientales (Au et al.,
2001; Yurchenco y Vaschenko, 2010; Podgurskaya y Kavun, 2012; Schmidt et al., 2013).
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Para el puerto de Mar del Plata se ha reportado la presencia de sustancias como
tributilestaño (TBT) (Cledón et al., 2006; Bigatti et al., 2009), PCB´s y pesticidas
organoclorados (Colombo et al., 2005). Los tributilestaños son componentes de
pinturas antiincrustantes y para los niveles registrados en Mar del Plata se han citado
malformaciones anatómicas en hembras de gasterópodos (Teso y Penchaszadeh, 2009;
Cledón et al., 2006; Arrighetti y Penchaszadeh, 2010; Averbuj y Penchaszadeh, 2010) y
cápsulas de embriones (Cledón et al., 2006). No se conocen hasta el momento efectos
del TBT en poblaciones de moluscos bivalvos para Mar del Plata. Estudios realizados en
ostras en sitios contaminados con TBT y DDT revelan que podría verse afectada la tasa
de crecimiento (Bayen et al., 2007) y el ciclo reproductivo (Steele y Mulcahy, 1999).
Mientras que, las alteraciones observadas en ambientes con alta concentración de
metales pesados incluyen: cambios en la morfología gonadal, atresia oocitaria e
infiltraciones de hemocitos en tejido gonadal, alteraciones de la actividad
gametogénica e inclusive el cese de la gametogénesis (Vaschencko et al., 2013). A nivel
ultraestructural: cambios en la morfología del complejo acrosomal, acrosomas
múltiples y acrosomas parcialmente degradados (Yurchenco y Vaschenko, 2010). Una
respuesta de los tejidos frente a la presencia de metales pesados es capturarlos y
aislarlos mediante vesículas membranosas que los acumulan selectivamente (George
et al., 1978). La acumulación de cobre y zinc que tiene lugar por ejemplo en los
hemocitos, culmina con la migración de las vesículas por diapédesis desde los
diferentes órganos hasta el epitelio del manto donde ocurriría la liberación de las
vesículas. Esto permitiría que las ostras continúen en un medio contaminado, sin ver
significativamente afectada su supervivencia (Abbe y Sanders, 1986). En los individuos
que habitan el puerto de Mar del Plata, se observaron vesículas en el interior de los
acinos gonadales, así como, membranas plasmáticas y crestas mitocondriales
desorganizadas. Esto último podría tener consecuencias funcionales en los
espermatozoides de la población del puerto de Mar del Plata. Según Au et al. (2001) en
erizos expuestos a elevados valores de cadmio se observó que las membranas que
constituyen las crestas mitocondriales se encontraban deformadas y sugieren que
podría verse comprometida la producción de ATP y la motilidad espermática.
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5- Ciclo reproductivo.
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5.1 Introducción
La permanencia de una especie a lo largo del tiempo y el tamaño que una
población puede alcanzar son fenómenos que están vinculados a la reproducción. En
muchos casos la actividad reproductiva consiste en un proceso cíclico que involucra a
aquellos organismos que han culminado su etapa juvenil (Giese y Pearse, 1974). Estos
procesos consisten en una serie de eventos, que incluyen la proliferación de las células
germinales, la diferenciación, maduración de gametas y los comportamientos
reproductivos asociados a la cópula o a la libración de gametas según las estrategias
reproductivas (Sastry, 1983). Los ciclos reproductivos están sometidos a la regulación
mediante componentes endógenos, propios de los organismos y exógenos. Estos
últimos representados por factores ambientales (temperatura, salinidad y
disponibilidad de alimento entre otros). De la interacción entre ambos factores, surgen
las características (periodicidad, extensión en el tiempo) de los ciclos reproductivos
(Ebert, 1994). La temperatura resulta ser uno de los parámetros ambientales más
importantes relacionado con el ciclo reproductivo, así como la disponibilidad de
alimento entre otros (Giese y Pearse, 1974; Lubet, 1981; Suarez et al., 2005; Fearman y
Moltschaniwskyj, 2010). En los bivalvos la acumulación de sustancias de reserva ocurre
en células especializadas del tejido conectivo, participando de esta manera del
desarrollo de la gónada. La gónada manifiesta cambios a medida que transcurre el
ciclo reproductivo (Pipe, 1987a; Gimeno et al., 1991; Mathieu y Lubet, 1993). Existe
una relación inversamente proporcional en relación al desarrollo del tejido conectivo y
el tejido gonadal, ya que este último depende de las sustancias (en particular, del
glucógeno) almacenadas en el tejido conectivo (Bayne et al., 1982; Lowe et al., 1982).
Se han descripto los ciclos reproductivos de numerosas especies de bivalvos y
en particular de especies de importancia económica (Sunila, 1981; Villalba, 1995;
Rodríguez-Moscoso y Arnaiz, 1998; Darriba et al., 2004; Barber et al., 2005; Suárez et
al., 2005; Ángel-Pérez et al., 2007; Herrmann et al., 2009a; Pérez et al., 2013). Aun así,
existe un conocimiento parcial acerca de las interacciones entre los factores exógenos
que determinan por ejemplo, la iniciación y duración del ciclo y la sincronicidad en la
formación de las gametas, en particular en las especies dioicas y con fecundación
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externa (Rogers et al., 1982). El objetivo de este capítulo fue describir el ciclo
reproductivo en hembras y machos de Brachidontes rodriguezii.
5.2 Materiales y métodos
Se recolectaron 487 individuos fijados en solución de Bouin de los meses
comprendidos entre mayo de 2011 y mayo de 2013 de la localidad de Villa Gesell
(Tabla 5.1). Mediante un protocolo de inclusión en parafina se obtuvieron cortes
histológicos. Se utilizó una coloración de hematoxilina de Carazzi y eosina alcohólica
(Apéndice). Se utilizaron individuos de un rango de tallas entre 11,75 y 25,50 mm de
largo total. Este rango de tallas comprende individuos maduros sexualmente. Del total
de 487 individuos estudiados se determinaron 242 hembras, 230 machos y 15
individuos de talla adulta, sexualmente indeterminados.
Hembras
Se observaron los cortes histológicos provenientes de 242 hembras (Tabla 5. 1).
Para cada hembra se fotografiaron al azar cinco campos del pliegue del manto. Se
midió el área de cada oocito con nucléolo visible (Figura 5. 1) y se calculó la frecuencia
de tallas oocitarias y además se calculó la frecuencia de los de estadios de desarrollo
oocitario (Tabla 5.2). Se utilizó el programa AxioVision (2013) 4.8.2 para procesar las
imágenes. Se estableció de manera cualitativa bajo M.O. el grado de desarrollo de la
gónada femenina. En función de la proporción de los diferentes estadios oocitarios
presentes y el grado de desarrollo del tejido conectivo que rodeaba los acinos, se
establecieron estadios de desarrollo gonadal.
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Hembras Machos
Año Mes N LT ± DS N LT (mm)±DS
mayo 10 19,43 ± 2,87 11 17,76 ± 1,59
junio 10 17,09 ± 2,11 19 16,95 ± 2,80
julio 10 14,85 ± 3,05 16 17,01 ± 3,41
agosto 10 17,77 ± 2,70 13 18,56 ± 4,78
septiembre 10 18,95 ± 4,27 19 17,78 ± 3,16
octubre 10 16,17 ± 2,6 14 15,52 ± 2,45
noviembre 10 14,16 ± 2,49 13 15,68 ± 3,24
2011
diciembre 10 15,28 ± 2,99 11 15,90 ± 3,71
enero 10 15,43 ± 2,32 8 15,25 ± 2,11
febrero 10 15,95 ± 4,09 10 14,53 ± 2,41
marzo 10 15,95 ± 3,7 6 15,38 ± 3,20
abril 10 16,93 ± 2,92 8 15,18 ± 2,81
junio 10 15,51 ± 3,42 9 18,06 ± 2,92
julio 10 18,10 ±3,01 7 18,98 ± 2,58
agosto 10 19,15 ± 2,58 7 18,65 ± 3,57
septiembre 11 17,63 ± 3,77 6 15,33 ±1,54
octubre 10 16,37 ± 2,42 6 15,99 ± 1,74
noviembre 10 17,90 ± 4,76 6 17,75 ± 5,76
2012
diciembre 10 17,19 ± 3,25 9 15,07 ± 3,42
enero 11 18,91 ± 3,39 6 17,89 ± 3,10
febrero 10 16,34 ± 2,34 6 16,76 ± 3,36
marzo 10 18,17 ± 3,62 7 16,17 ± 3,80
abril 10 16,43 ± 2,47 6 14,54 ± 1,37
2013
mayo 10 16,02 ± 2,46 6 16,45 ± 2,14
Tabla 5. 1. Datos de los individuos de B. rodriguezii utilizados en el estudio de ciclo
reproductivo. N: número de individuos, LT±DS: largo total promedio y desvío estándar.
Machos
Se consideraron entre 6 y 19 individuos por mes durante 24 meses (Tabla 5. 1).
Se estableció de manera cualitativa bajo M.O. el grado de desarrollo de la
espermatogénesis en el interior de los acinos gonadales. Se estimó la frecuencia de
desarrollo de la gónada masculina en función de los meses.
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Análisis de los datos
Mediante ANOVA de un factor se analizó la variación del área oocitaria de los
diferentes estadios de maduración (previtelogénicos, vitelogénicos tempranos y
vitelogénicos) de un total de 10400 oocitos en relación con las estaciones durante el
período de estudio. Se consideró que los meses de abril a junio se correspondían con el
otoño, el período julio –septiembre, con el invierno, octubre-diciembre se
correspondía con la primavera y el período enero-marzo con el verano. Se
comprobaron los supuestos de normalidad y homocedacea y se realizaron
comparaciones a posteriori mediante test de Tukey. Mediante ANOVA de un factor se
evaluaron las diferencias mensuales de la frecuencia de los oocitos vitelogénicos (Sokal
y Rohlf, 1995).
Figura 5. 1. Determinación del área de los oocitos en acinos gonadales de hembras de adultas
de B. rodriguezii. Dentro de los acinos se observan distintos tipos de oocitos, acompañados por
células accesorias y tejido conectivo. Referencias: (a) células accesorias; (o) oogonias; (pv)
oocitos previtelogénicos; (tc) tejido conectivo; (v) oocitos vitelogénicos. Escala: 50 µm.
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Año Mes Previtelogénicos Vitelogénicos
tempranos Vitelogénicos Total
mayo 75 1 45 122
junio 159 65 162 367
julio 146 98 152 397
agosto 205 66 228 499
septiembre 212 96 234 543
octubre 159 173 217 556
noviembre 182 134 221 537
2011
diciembre 170 118 272 588
enero 127 95 247 470
febrero 145 90 310 544
marzo 194 158 114 466
abril 46 43 82 171
junio 151 115 95 361
julio 89 126 40 255
agosto 156 163 101 419
septiembre 126 195 183 504
octubre 115 228 123 466
noviembre 111 206 198 515
2012
diciembre 173 172 145 500
enero 65 111 338 515
febrero 94 197 172 463
marzo 57 115 258 430
abril 46 143 200 389
2013
mayo 129 153 79 361
Tabla 5. 2. Cuantificación de los estadios oocitarios de hembras maduras B. rodriguezii para el
período de estudio.
5.3 Resultados
Registro de temperatura de agua superficial y salinidad
Para el período comprendido entre mayo de 2011 y mayo de 2013 se obtuvo el
registro de temperatura de agua de superficie y salinidad. El rango de temperatura fue
de entre 10,10 y 17,80 °C para otoño-invierno y de 14,20-21,70 °C para primavera-
verano y el de salinidad de 32-37 ‰. La exposición a horas de luz durante el día fue de
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9,75 - 11,68 horas durante otoño/inverno y 12,35 - 14,66 horas durante
primavera/verano.
Hembras
Estudio del área oocitaria
Se encontraron diferencias significativas para la variación del tamaño de los
estadios oocitarios entre estaciones para los dos años del estudio, oocitos
previtelogénicos (F (1,3119)=35,832; p=0,001); oocitos vitelogénicos tempranos (F
(1,3052)=50,051; p < 0,001) y para los oocitos vitelogénicos (F (1, 4202)= 83,316; p < 0,001)
(Figura 5. 2).
���5��0233
���������0233
����������0233
�������0230
���5��0230
���������0230
����������0230
�������0236
���5��0236
������7�
2
022
822
122
922
3222
3022
3822
3122
3922
#��������������:��
0;
���������� (�����
������� (����� ����������
������� (�����
Figura 5.2. Áreas promedio y DS de los diferentes estadios oocitarios para el período de
estudio compredido entre mayo de 2011 – mayo de 2013.
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Los oocitos previtelogénicos presentaron entre 30 y 400 µm2 de superficie. Las
áreas máximas se alcanzaron en primavera de 2011 y 2012 (Figura 5. 2). Del análisis de
la variación del área oocitaria (que resultó del test de Tukey) se observó un aumento
significativo en el área a partir de otoño de 2011, así como durante el inverno (F(1,
3119)= 197,461: p< 0,001). Registrándose en primavera de 2011 las áreas
significativamente mayores (F(1,3119)= 215,83; p< 0,001). Luego, en verano de 2012 se
registró una disminución en el área de los oocitos (F(1,3119)=200,24 ; p< 0,001) y no se
encontraron diferencias en otoño de 2012 respecto del otoño del 2011 (F(1,3119)=
156,35 ;p = 0,597). Para el período comprendido entre otoño de 2012 y otoño de 2013,
la variación del área de los oocitos previtelogénicos mostró un comportamiento similar
al del período anterior. Se registró un aumento del área de los oocitos durante los
meses de bajas temperaturas hasta alcanzar el máximo valor en primavera seguido de
una disminución hasta alcanzar en otoño de 2013 los valores más bajos del año. De la
comparación entre estaciones para los dos años del estudio resultó que no se
encontraron diferencias para la primavera de 2011 y 2012 (F(1, 3119)= 220,37 ; p= 0,996)
y el inverno de 2011-2012 (F(1, 3119)=183,26 ; p= 0,198). Para los meses de verano de
2012 y 2013 se registró una disminución significativa en el área promedio de 201,33
�m2 a 171,18 �m2 (F(1, 3119)= 171,30 ; p= 0,003). Finalmente para otoño 2012-2013 (F(1,
3119)=149.39; p= 0,984) no se registraron diferencias en las áreas promedio.
Los oocitos con vitelogénesis temprana presentaron entre 350 y 900 µm2 de
superficie. La variación del area promedio durante el período de estudio registró un
comportamiento similar al observado para los oocitos previtelogénicos, es decir, hubo
un aumento de la superficie en las estaciones de bajas temperaturas hasta alcanzar las
mayores superficies en la primavera (Figura 5. 2).
Para el primer año de estudio, de otoño 2011 a otoño 2012, no se registraron
variaciones sifgnificativas en el tamaño de los oocitos entre otoño e invierno de 2011
(F(1,3052)= 543,28 ; p= 0,993). Hubo un aumento ligeramente significativo de 496,38 a
548,02 �m2 hacia la primavera de ese año (F(1, 3052)= 543,28 ; p= 0,016). No se
registraron cambios significativos sino hasta el otoño de 2012, donde los oocitos
alcanzaron un área promedio de 622,38 �m2 (F(1,3052)= 607,66 ; p < 0,001). Para el
segundo año, no se registraron cambios significativos en el área sino hasta la
primavera de 2012, donde el area de los oocitos vitelogénicos tempranos alcanzó el
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máximo valor promedio (760,46 �m2) (F(1,3052)= 666,67 ; p= 0,006). En verano de 2013
se registró una disminución significativa (F(1,3052)=512,60 ; p < 0,001), mientras que no
se registraron variaciones significativas hacia el otoño de 2013 (F(1,3052)= 498,39 ; p =
0,984). A diferencia de lo observado para los oocitos previtelogénicos, la comparación
entre estaciones mostró diferencias significativas para otoño 2011 – 2012 (F(1,3052)=
607,66 ; p = 0,038) y otoño 2012-2013 (F(1,3052)=498,39 ;p < 0,001). Lo mismo ocurrió
para invierno 2011-2012 (F(1,3052)= 624,36 ; p < 0,001) y primavera 2011-2012 (F(1,3052)=
666,07 ; p < 0,001). Mientras que para verano 2012-2013 no se encontraron
diferencias (F(1,3052)= 512,60 ;p = 0,999).
En el citoplasma de los oocitos vitelogénicos se observaron numerosos gránulos
de vitelo. Para este estadio oocitario se observó la mayor variabilidad en cuanto al
tamaño ya que presentaron entre 800 y 2700 µm2 de área (Figura 5. 2).
Para el primer año del estudio se observó que el área promedio de los oocitos
vitelogénicos osciló entre 1.058,80 �m2 en verano de 2012 y 1.462,53 �m2 en otoño de
ese mismo año. Las variaciones resultaron ser significativas durante todo el período,
de otoño 2011 a invierno 2011 (F(1, 4202)= 1134,50 ; p < 0,001), de inverno a primavera
de ese mismo año (F(1, 4202)= 1372,70 ; p < 0,001) y durante la transición al verano de
2012 (F(1,4202)= 1101,5 ; p< 0,001). A partir del verano de 2012 y hasta el invierno de ese
año se observó un aumento en el área de los oocitos vitelogénicos. El valor promedio
más alto registrado fue de 1.622,76 �m2 y se alcanzó en invierno de 2012. El segundo
año del estudio también mostró variaciones significativas para el área de los oocitos
vitelogénicos, a excepción del período verano-otoño de 2013 (F(1,4202)= 1273,50 ; p =
0,999). El registro de la variación del área promedio de los oocitos vitelogénicos entre
estaciones resultó presentar diferencias significativas en la mayoría de los casos. Para
otoño 2011-2012 (F(1, 4202)= 1443,6 ; p = 0,019), invierno 2011-2012 (F(1,4202)= 1574,4 ; p
< 0,001), primavera 2011-2012 (F(1,4202)= 1406 ; p = 0,803), verano 2012-2013 (F(1,4202)=
1264,2 ; p < 0,001) y finalmente otoño 2012-2013 (F(1,4202)= 1273,5 ; p < 0,001).
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Frecuencia de los estadios oocitarios
El estudio de la frecuencia de los estadios oocitarios mostró variaciones a lo
largo del período comprendido entre los meses de mayo de 2011 y mayo de 2013
(Figura 5. 3).
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Figura 5. 3. Frecuencias relativas de estadios oocitarios de B. rodriguezii para el período de
estudio comprendido entre los meses de mayo de 2011 y mayo de 2013. Se pueden reconocer
los diferentes tipos de oocitos durante todo el año.
Dentro del primer año de estudio, se observó un aumento significativo del mes
de mayo a junio de 2011 (F (1,18)= 12,763; p= 0,002), al mes siguiente baja y en agosto
nuevamente se vió un aumento en la frecuencia (F (1, 18)= 6,620; p= 0,019). Para los
meses de septiembre a noviembre se observaron variaciones no significativas,
mientras que en diciembre se observó un aumento significativo en la proporción de
oocitos vitelogénicos (F (1, 18)= 5,162; p= 0,035). Durante el verano, se registraron
incrementos en la frecuencia de oocitos vitelogénicos hasta alcanzar el valor máximo
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en el mes de febrero. Hacia fines del verano en el mes de marzo se observó una
disminución significativa en el número de oocitos maduros (F (1, 18)= 42,203 ; p < 0,001).
Esta disminución sustancial en el número de oocitos indicó un evento de desove.
Comenzando el segundo año del período de estudio, se registró una disminución de la
frecuencia de oocitos vitelogénicos de abril a junio de 2012. Continuaron las
fluctuaciones no significativas hasta el mes de enero, donde se observó un aumento
significativo (F (1, 19)= 53,628 ; p < 0,001). En febrero de 2013 se registró nuevamente
un evento de desove. Al mes siguiente se registó un aumento significativo en la
frecuencia de oocitos vitelogénicos, mientras que, para el mes de abril se observó una
disminución ligeramente significativa (F(1, 18)= 4,215 ; p=0,031). Finalmente en mayo de
2013 (F(1, 18)= 24,451 ; p < 0,001) se registró nuevamente un desove.
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Figura 5. 4. Frecuencia de oocitos vitelogénicos de hembras adultas de B. rodriguezii para el
período comprendido entre mayo de 2011 y mayo de 2013. Se observa que existe una relación
entre la variación de la temperatura y el fotoperíodo con la frecuencia de oocitos
vitelogénicos. Los asteriscos (*) indican los meses donde se registraron variaciones
significativas en la proporción de oocitos vitelogénicos.
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Caracterización cualitativa de la gónada femenina
Se determinaron diferentes estadios de desarrollo gonadal (Figura 5. 4). En el
estadio I se observaron acinos gonadales de tamaño reducido rodeados por tejido
conectivo. Dentro del acino predominaban los oocitos previtelogénicos y los
vitelogénicos tempranos. En algunos casos se observaron escasos oocitos
previtelogénicos y cuerpos residuales de color amarillento (Figura 5. 5A). El estadio II
reflejaba un desarrollo más avanzado, los acinos presentaban un tamaño mayor dado
que se extendían a expensas del tejido conectivo. Dentro de los acinos se observaban
los diferentes estadios de desarrollo oocitario (Figura 5. 5B). En el estadio III la gónada
presentó acinos completamente expandidos. Ocupando todo el tejido del manto, en la
región dorsal y ventral al tubo digestivo y el pie. Los oocitos dentro del acino eran
principalmente vitelogénicos y de forma poligonal como consecuencia de la
compresión dentro del acino (Figura 5. 5C). Posterior a la evacuación de oocitos
vitelogénicos se evidenciaron dos estadios. El estadio IV con indicios de desove
reciente, se observaron acinos expandidos pero con menor densidad de oocitos.
Dentro del acino se observó zonas vacías que se correspondían con los sitios que
previamente ocupados por oocitos maduros (Figura 5. 6A). Finalmente, el estadio de
desove tardío representado por el estadio V (Figura 5. 6B) presentó acinos con cuerpos
residuales, escasos oocitos vitelogénicos y tejido conectivo que comenzaba a
regenerarse.
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Figura 5. 5. Fotografías de hembras de B. rodriguezii con diferentes estadios gonadales. A.
Estadio I (marzo), acinos con oocitos previtelogénicos y tejido conectivo rodeando los acinos.
B. Estadio II (julio), oogonias agrupadas, junto con los distintos estadios oocitarios. Tejido
conectivo rodeando los acinos. C. Estadio III (enero), acinos completamente ocupados
principalmente por oocitos vitelogénicos. Referencias: (o) oogonias; (pv) oocitos
previtelogénicos; (tc) tejido conectivo; (v) oocitos vitelogénicos; (vt) oocitos vitelogénicos
tempranos. Escalas A-C: 50 µm.
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Figura 5. 6. Fotografías de hembras de B. rodriguezii con diferentes estadios gonadales. A.
Estadio IV (enero), puede reconocerse el lumen del acino. B. Hembra en estadio V (abril), con
cuerpos amarillentos dentro del acino. Acinos colapsados luego de la evacuación con oocitos
previtelogénicos en su interior. Referencias: (*) lumen del acino; (pv) oocitos previtelogénicos.
Escalas A y B: 50 µm.
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Machos
Durante todo el año se observaron todos los estadios de la espermatogénesis
en los acinos de los pliegues del manto, así como en los acinos de la masa visceral. Para
los machos se establecieron cuatro estadios de madurez considerando: tamaño de los
acinos, desarrollo del tejido conectivo y proporción de tipos celulares de la
espermatogénesis. El estadio I se caracterizaba por presentar una gónada constituida
por acinos de tamaño reducido, con células de la serie espermatogénica pero sin
espermatozoides. El lumen del acino se encontraba totalmente ocupado por las células
espermatogénicas. Era posible reconocer tejido conectivo entre los acinos (Figura 5.
6A). En el estadio II, dentro de la gónada se observaban espermatozoides y un
ordenamiento característico de las células espermatogénicas de manera centrípeta. El
tejido conectivo era escaso. Es posible que durante ese estadio ocurrieran pequeñas
evacuaciones de espermatozoides (Figura 5. 6B). El tamaño de los acinos,
incrementaba a medida que la espermatogénesis progresaba. Para la gónada se
registró la superficie máxima a partir de este estadio. En el estadio III se observaban
acinos con señales de desove parcial dado que se reconocía parcialmente el lumen de
los acinos (Figura 5. 6C). El estadio IV se correspondía a un posdesove avanzado. Este
estadio se caracterizaba por presentar acinos evacuados prácticamente en su
totalidad. Se podían observar algunos espermatozoides que no habían sido liberados y
células gametogénicas iniciando un nuevo ciclo. El tejido conectivo se encontraba
parcialmente desarrollado (Figura 5. 6D).
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Figura 5. 6. Fotografías al microscopio óptico de secciones de manto de machos de B.
rodriguezii. A. Acino en estadio I, en su interior pueden reconocerse algunos estadios
tempranos de la espermatogénesis (diciembre). B. Estadio II, acinos de mayor tamaño, puede
reconocerse escaso tejido conectivo (noviembre). C. Individuo con acinos en estadio III, con
espermatozoides en el lumen del acino (julio). D. Individuo en estadio IV, acinos evacuados, y
una serie espermatogénica que comienza un ciclo nuevo, la punta de flecha indica epitelio
ciliado (septiembre). Referencias: (*) lumen del acino; (em) epitelio del manto. Escalas A y D:
100 µm. Escalas B y C: 50 µm.
Ciclo anual y actividad reproductiva
Hembras
Durante el período de estudio se observó que en los meses de otoño del primer
año predominaban los estadios VI y V para el mes de mayo y los estadios I y II en junio
(Figura 5. 7). Esto podría indicar que previo al mes de mayo de 2011 ocurrió un desove.
Al comienzo del invierno, en el mes de julio predominaban las hembras en estadio I,
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sin embargo, se reconocieron hembras en estadio IV (desove parcial). Promediando el
invierno y al comienzo de la primavera una pequeña proporción (10%) de las hembras
alcanzó el estadio III (previo al desove) mientras que disminuyó la proporción de
hembras en estadios I y IV. Durante la primavera de 2011 la mayoría de las hembras se
encontraba en estadio II, aunque se observaron algunas hembras en estadio IV con
desove reciente. Finalizando la primavera y comenzando el verano se observó una gran
proporción de hembras en estadio III. En enero de 2012 se registró la mayor
proporción de hembras en estadio IV, en febrero, se observó nuevamente una gran
proporción (60 %) de hembras en estadio III. Para el período marzo- abril de 2012, no
se observaron hembras en estadio III, predominaron las hembras en estadios I y IV y en
menor frecuencia, hembras en estadios II y V. En junio de 2012 se observó una
situación similar a la registrada en junio/julio de 2011.
Durante el invierno de 2012, algunas hembras se encontraron en estadio III y al
comienzo de la primavera se registraron hembras en estadio IV. Esto indicaría un
posible desove aislado. A partir del mes de octubre disminuyó notablemente la
proporción de hembras en estadio I mientras que aumentó la frecuencia de hembras
en estadio IV. Durante la primavera se mantuvo constante (20%) la proporción de
hembras en el estadio II. En diciembre se registró un aumento en la proporción de
hembras en estadio IV. Ese registro permaneció con valores similares durante todo el
verano de 2013, hasta el mes de abril cuando se elevó a 90 % la proporción de
hembras con desove parcial. Finalmente, en mayo de 2013, el 40 % de las hembras de
encontraron en estadio I.
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Figura 5. 7. Frecuencia de los estadios gonadales de hembras de B. rodriguezii en relación con
el fotoperíodo y la temperatura de agua superficial. El estadio III corresponde al de
predominancia de oocitos vitelogénicos, cuya frecuencia aumenta junto con la temperatura y
el fotoperíodo.
Machos
Para el período comprendido entre los meses de mayo 2011 y mayo de 2013 se
registraron machos en los diferentes estadios. Se observó una alta proporción de
machos en estadio II durante todo el período de estudio (Figura 5. 8).
En los meses de otoño de 2011, se observaron machos en todos los estadios,
siendo los estadios II y IV los más representados. Predominaron aquellos que se
encontraron maduros (estadio II) y aquellos machos para los que se evidenció
evacuación prácticamente total de gametas (estadio IV). En los meses de julio y agosto
incrementó la proporción de individuos en estadio I hasta llegar al 20%. La presencia
de machos con desoves parciales o totales continuó durante el invierno. A fines del
invierno del primer año de estudio la entre el 60 y el 70 % de los individuos se
encontraba en estadio II. La proporción de machos en estadio II se mantuvo alta
durante toda la primavera y alcanzó valores máximos en verano.
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Durante los meses de marzo y abril de 2012 se observó un aumento de la
proporción de machos con evacuaciones parciales (estadio III) y totales (estadio IV).
Hacia fines del otoño y comienzo de inverno, se registró un aumento en la proporción
de individuos en estadio I. Durante la primavera, se registraron individuos en estadio I,
junto con un incremento en la frecuencia de los individuos en estadio II. Mientras que
entre septiembre y diciembre de 2012 no se registraron individuos en estadio III y VI.
En el verano se registró un aumento en la proporción de machos en estadio II,
alcanzando al 100 % de los individuos en diciembre de 2012, febrero y marzo de 2013.
Finalizando el período de estudio, en otoño de 2013 se registró nuevamente una alta
proporción de machos en estadios III y VI.
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Figura 5. 8. Frecuencia de estadios gonadales de machos de B. rodriguezii en relación con el
fotoperíodo y la temperatura de agua superficial.
Acinos en estadio de posdesove
Se registraron 15 individuos de un total de 487 (3 %) en los que no fue posible
determinar el sexo a partir de la observación de los cortes histológicos (Tabla 5. 4).
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Estos individuos presentaban acinos en región dorsal y pliegues del manto, pero en su
interior se encontraban completamente vacíos o presentaban células que no pudieron
ser identificadas como espermatogonias u oogonias. A su vez en estos individuos el
tejido conectivo se encontraba muy desarrollado (Figura 5. 9).
Año Mes N LT (mm)
2011 julio 3 10,00 -15,55
septiembre 1 14,46
2012 marzo 3 10,45-14,10
junio 2 13,70-15,20
julio 3 14,25-16,30
agosto 2 14,15-18,10
septiembre 1 12,55
Tabla 5. 4. Registro de individuos con acinos indeterminados en B. rodriguezii para los años
2011 y 2012. N: número de individuos, LT: rango de talla en mm.
Figura 5. 9. Pliegue del manto de un individuo de sexo indeterminado de B. rodriguezii. A. Se
observa pliegue del manto con tejido conectivo desarrollado, acinos gonadales con escasa
células en su interior. B. Detalle del acino con células indiferenciadas sobre la pared del acino.
Referencias: (a) acino; (br) branquia; (em) epitelio del manto; (tc) tejido conectivo. Escala A:
100 µm. Escala B: 50 µm.
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5.4 Discusión
En este estudio, se analizó la actividad gametogénica en machos y hembras de
Brachidontes rodriguezii durante dos años consecutivos. Se registraron diferentes
eventos de evacuación de gametas durante el período de estudio y estos fueron
relacionados con la temperatura y el fotoperíodo. Según Giese y Pearse (1974) la
temperatura influye en la gametogénesis y en las regiones templadas donde los
organismos están sometidos a cambios cíclicos de temperatura y disponibilidad de
alimento, la reproducción es un proceso estacional. Según Fearman y Moltschaniwskyj
(2010) la velocidad con que se desarrolla la gametogénesis depende de la
temperatura, a bajas temperaturas ocurre a alta velocidad, mientras que a altas
temperaturas cesa. Esto podría deberse a que habría una mayor demanda de energía
destinada a procesos metabólicos, limitando los recursos destinados a la reproducción
en condiciones de altas temperaturas. La dinámica de los procesos gametogénicos, ha
sido estudiada en numerosas especies de mitílidos (Morton, 1995; Villalva, 1995; Toro
et al., 2002; Barber et al., 2005; Suárez et al., 2005; Oyarzún Cabañas et al., 2010). En
este estudio, en los meses de bajas temperaturas se registró una proporción mayor de
oocitos previtelogénicos y vitelogénico tempranos. Con un incremento significativo en
el tamaño, como consecuencia de la acumulación de nutrientes. Estas observaciones
sugieren que en la temporada de bajas temperaturas, las hembras destinarían recursos
a la producción de gametas.
Durante la primavera incrementó la proporción de oocitos vitelogénicos, en
detrimento de lo que ocurrió para los estadios previos y se registraron los oocitos
vitelogénicos de tamaños maximos. Esto coincidió con el aumento de la temperatura.
Durante el verano el aumento de la frecuencia de oocitos vitelogénicos se sostuvo, sin
embargo las tallas disminuyeron. Finalizado el verano se registró la menor frecuencia
de oocitos vitelogénicos, esto indicó un desove y a su vez, se observaron los oocitos
vitelogénicos de menor tamaño encontrados hasta ese momento.
Durante el período de otoño/invierno de 2012 el aumento de la frecuencia de
oocitos vitelogénicos se retrasó respecto del año anterior, sin embargo, se alcanzaron
las tallas más grandes registradas para este estudio. En octubre de 2012, la
disminución (no significativa) en la frecuencia de los oocitos vitelogénicos sugiere un
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desove parcial, aunque no se habían alcanzado las temperaturas máximas. Estos
resultados sugieren que podría haber una relación entre el tamaño de los oocitos
vitelogénicos y el momento de desove.
La frecuencia de oocitos vitelogénicos, alcanzó los valores más elevados en
verano y los más bajos en otoño. Esto se observó para los dos años de estudio. Para
marzo de 2012, febrero, abril y mayo de 2013 se registraron las disminuciones más
significativas de la frecuencia de oocitos vitelogénicos, sugiriendo un período de
desove hacia los fines de verano y principios del otoño. Aun así, los acinos gonadales
de las hembras evidenciaban la evacuación de gametas durante gran parte del año.
Algunos autores consideran a estos desoves parciales, como semi ciclos de
reproducción dentro un ciclo completo y que los desoves parciales podrían
corresponderse a individuos jóvenes que están ingresando al segmento reproductivo
de la población (Gorrostieta, 1997; Prado, 1998).
En numerosas especies de mitílidos (Vinuesa, 1981; Villalba, 1995; Rodríguez-
Moscoso y Arnaiz, 1998; Barber et al., 2005) se menciona la estrecha relación que hay
entre el tejido gonadal y el tejido concetivo. En las células adipogranulares y
vesiculares del tejido conectivo de Mytilus edulis, se almacena glicógeno, la
disminución del tejido conectivo a expensas de la gametogénesis se debe al suministro
de nutrientes que se destinan a la gónada. Entonces conforme progresa la
gametogénesis, aumenta el volumen de tejido gonadal y disminuye el volumen el
tejido de reserva (Vinuesa, 1981; Bayne et al., 1982). Para las hembras de B.
rodriguezii, fue posible reconocer una relación entre el desarrollo del tejido gonadal y
del tejido conectivo presente en el manto. El estadio con la mayor frecuencia de
oocitos previtelogénicos, presentó el mayor grado de desarrollo del tejido conectivo.
Los estadios gonadales previos al desove, se registraron en mayor frecuencia durante
otoño y primavera. Mientras que, cuando se registró la predominancia de oocitos
vitelogénicos, el tejido conectivo se encontraba poco desarrollado. El estadio que
presentaba la mayor frecuencia de oocitos vitelogénicos y la menor proporción de
tejido conectivo, se registró con mayor frecuencia durante los meses de verano. En los
meses posteriores a los desoves, se registraron las mayores frecuencias de estadios
gonadales con indicios de evacuación.
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Para un número reducido de individuos de B. rodriguezii se encontraron acinos
gonadales con características que podrían corresponderse con un estadio de
posdesove. Donde se pueden observar acinos sin presencia de células gametogénicas.
Algunos autores hacen referencia a estadios de inactividad, en época invernal luego
del período reproductivo (Barber et al., 2005; Suárez et al., 2005; Ángel- Pérez et al.,
2007).
La actividad gametogénica registrada para machos de B. rodriguezii, sugiere
que ocurre espermatogénesis todo el año. Se observaron machos maduros todo el año
y con acinos evacuados parcialmente durante la mayor parte del año. En otoño, se
registraron acinos prácticamente vacíos. Estas observaciones sugieren que los machos
realizan una serie de evacuaciones parciales durante todo el año. De estos eventos se
recuperarían pronto. Mientras que durante el período reproductivo principal que
ocurre en verano, la evacuación prácticamente completa impediría que la gónada se
recupere rápidamente.
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6- Talla de primera madurez.
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6.1 Introducción
La energía con la que cuenta un individuo participa de dos procesos, el
crecimiento somático y la demanda metabólica. Alcanzada la madurez sexual, la
reproducción pasa a formar parte de los procesos que requieren energía. De acuerdo
con la redistribución de los recursos energéticos, los individuos pueden continuar
creciendo o no luego de alcanzar la madurez (Hartnoll, 1983). El crecimiento, el
reclutamiento, la mortalidad y la migración, son parámetros que determinan la
dinámica de una población (Orenzans, 1986). El reclutamiento en invertebrados
bentónicos que habitan el intermareal es afectado numerosos factores: la intensidad
del oleaje, los cambios de humedad, temperatura y salinidad (Brown y McLachlan,
1990). Por otra parte, Delgado y Defeo (2007) proponen que frente a los cambios en
las condiciones ambientales, habría una respuesta demográfica por parte de las
especies en términos de estrategias reproductivas. El tamaño al que una especie
alcanza la madurez, es un parámetro muy importante dentro de los aspectos
reproductivos de la especie. Junto con el ciclo reproductivo, forma parte del conjunto
de estrategias que intentan maximizar el éxito reproductivo de una especie en un
ambiente determinado (Todd, 1985; Gage, 1995).
Roa et al. (1999) propone el concepto de talla de primera madurez poblacional.
Este concepto hace referencia a la longitud para la cual el 50 % de los individuos
alcanza la madurez. Se propone el modelo logístico como descripción matemática de la
relación entre la longitud de los individuos y la madurez sexual. Es decir, habría un
incremento en la proporción de individuos maduros, conforme aumenta el tamaño de
los individuos.
El parámetro poblacional, talla de primera madurez sexual, permite establecer
medidas de explotación comercial y pautas de control, como las tallas mínimas de
captura, en especies de interés pesquero (Chung, 2007; 2008). Provee herramientas de
monitoreo espacial (Camacho et al., 2012). Y permite evaluar cambios temporales
asociados a la explotación comercial (Torroglosa y Giménez, 2010).
El estudio de aspectos de la biología reproductiva de una especie, como el
desarrollo gonadal, el ciclo reproductivo y la talla de primera madurez sexual no solo
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amplía el conocimiento sobre esa especie, sino que también, genera un conjunto de
herramientas que permiten evaluar cambios espaciales y temporales.
El objetivo de este capítulo fue establecer la talla de primera madurez sexual
poblacional de Brachidontes rodriguezii. Para ello, la talla de madurez fue estudiada a
través del análisis del tejido gonadal mediante histología.
6.2 Materiales y métodos
Se recolectaron individuos del estrato inferior de las columnas del muelle de
Villa Gesell durante dos temporadas reproductivas. La primera desde diciembre de
2011 hasta febrero de 2012 y la segunda de diciembre de 2012 hasta febrero de 2013.
Los individuos recolectados fueron medidos con calibre de precisión de 0,01 mm y con
lupa según corresponda y fijados en solución de Bouin durante 12 h. Los individuos de
tallas menores a 8 mm fueron tratados con solución de Jenkins, para descalcificar las
valvas y removerlas con mayor facilidad sin dañar los tejidos. Se estudiaron 335
individuos de un rango de talla de 3,00 a 25,50 mm de longitud total (Tabla IV. 1).
Mediante la observación de los cortes histológicos se establecieron dos estadios de
condición: inmaduros y maduros.
Criterio histológico
Los individuos que carecían de acinos gonadales se consideraron inmaduros.
Aquellos individuos con acinos gonadales y gametogénesis en su interior fueron
considerados como individuos en desarrollo. El criterio utilizado para establecer la
madurez en hembras fue la presencia de acinos expandidos, ocupando todo el espacio
disponible en la región dorsal, ambos pliegues del manto y masa visceral. Así como
presentar oocitos vitelogénicos dentro de los acinos y escaso desarrollo el tejido
conectivo. Para establecer la madurez en los machos se consideró la presencia de
espermatozoides en el interior de los acinos.
Talla de madurez
Se establecieron intervalos de tallas de 1 mm cada uno. A partir de los 18 mm,
se agrupó a todos los individuos en un solo intervalo de tallas dado que presentaban la
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misma condición de madurez. Se obtuvo el porcentaje de individuos maduros para
cada intervalo de talla. Los datos de frecuencia de madurez se relacionaron con la
longitud de los individuos según un modelo no lineal mediante la ecuación logística:
Pm = a/1 + (LT/LT0) b
Donde Pm es la proporción de machos o hembras maduros, LT es la longitud
total del individuo, y LT0, a y b son constantes. La longitud a la que el 50 % de los
individuos se encuentran maduros se establece como talla de primera madurez sexual
(LT50).
Rango de talla verano 2012 verano 2013
3-3,99 3 10
4-4,99 6 12
5-5,99 5 18
6-6,99 6 11
7-7,99 9 9
8-8,99 11 10
9-9,99 13 9
10-10,99 11 10
11-11,99 13 8
12-12,99 10 11
13-13,99 12 10
14-14,99 13 8
15-15,99 9 11
16-16,99 10 10
17-17,99 10 14
18-25,5 13 15
Tabla 6. 1. Rango de tallas y número de individuos de B. rodriguezii considerados para la
determinación de la talla de primera madurez sexual durante los dos períodos reproductivos.
N: número total de individuos por intervalo de longitud.
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6.3 Resultados
Individuos inmaduros
Para todos los individuos de tallas comprendidas entre 3,00 y 3,99 mm no se
observaron acinos gonadales (Figura 6. 1). A estos individuos se los consideró
inmaduros sexualmente e indeterminados ya que no fue posible establecer el sexo. Se
observó que los pliegues del manto presentaban células del tejido conectivo. En la
región dorsal y rodeando al estómago sólo se reconocieron túbulos de la glándula
digestiva. Esta condición de inmadurez caracterizada por la ausencia de acinos fue
observada inclusive en un individuo que tenía una longitud de 7,28 mm.
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Figura 6. 1. Composición fotográfica de un individuo inmaduro de B. rodriguezii (LT 3,55 mm).
No se pueden reconocer acinos gonadales. Referencias: (br) branquia; (e) estómago; (gbm)
glándulas del borde del manto; (gd) glándula digestiva; (p) pie; (pm) pliegues del manto.
Escala: 200 µm.
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Individuos inmaduros con desarrollo gonadal temprano
A medida que la longitud de los individuos aumentaba, se registraron en la
región dorsal pequeñas agrupaciones de células con actividad mitótica (células en
metafase). Estas agrupaciones celulares se encontraban entre el epitelio del manto y
los túbulos de la glándula digestiva (Figura 6. 2). En esos individuos no era posible
reconocer el sexo aún. Esas células con actividad mitótica, mostraban marcadas
diferencias respecto de las células de los túbulos de la glándula digestiva y podrían
corresponderse con estadios muy tempranos de la gametogénesis. Se registraron
individuos de B. rodriguezii, con acinos de esas características para tallas entre 4,45
mm, y 4,75 mm.
Registro de actividad gametogénica
En las tallas comprendidas entre los 4,00 mm y 4,97 mm de LT se observaron
individuos con acinos que en su interior contenían estadios celulares tempranos de la
espermatogénesis (Figura 6. 3A) y la oogénesis respectivamente (Figura 6. 3B). En la
medida que se diferenciaban estadios de la espermatogénesis y de la oogénesis fue
posible establecer el sexo de los individuos inmaduros.
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Figura 6. 2. Fotografía de un individuo sexualmente inmaduro de B. rodriguezii (LT 4,45 mm)
con estadios tempranos de la gametogénesis. Se pueden observar acinos entre túbulos de la
glándula digestiva y el epitelio del manto con células con núcleos en metafase (punta de
flecha). Referencias: (em) epitelio del manto; (gd) glándula digestiva; (pa) células de la pared
del acino. Escala: 20 µm.
Figura 6. 3. Estadios tempranos de la gametogénesis en individuos de B. rodriguezii inmaduros.
A. Macho (LT 4,60 mm) de enero de 2012. B. Hembra (LT 4,97 mm) de diciembre de 2011.
Referencias: (ep) epitelio del manto; (gd) glándula digestiva; (o) oogonias. Escalas A y B: 20 µm.
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Dentro de los individuos inmaduros a los que se determinó el sexo, se
observaron machos con estadios tempranos de la espermatogénesis pero sin
espermatozoides hasta los 5,99 mm. En las hembras a partir de los 5,75 mm, se
observaron oocitos vitelogénicos y acinos de tamaño reducido en pliegues del manto y
región dorsal. Los acinos gonadales de machos (Figura 6. 4) y hembras (Figura 6. 5)
inmaduros se encontraban principalmente en la región dorsal y lateral. Los acinos eran
escasos y de tamaño reducido (Figura 6. 6A y B). A medida que la longitud del individuo
aumentaba, la distribución de los acinos se modificaba (Figura 6. 7). En individuos
maduros, se reconocían acinos con gametas en ambos pliegues del manto como se
mencionó previamente en el capítulo I. Se observaron hembras maduras a partir de los
6,99 mm, mientras que en los machos el estado de madurez se registró a partir de los
6mm.
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Figura 6. 4. Composición fotográfica de un individuo macho de B. rodriguezii en desarrollo (LT
7,30 mm). Se pueden reconocer acinos gonadales en posición dorsal al estómago y divertículos
gástricos y en ambos pliegues del manto (pm), no así entre los órganos de la masa visceral.
Referencias: (a) acinos gonadales; (br) branquia; (dg) divertículo gástrico; (e) estómago; (gbm)
glándula del borde del manto; (gd) glándula digestiva; (p) pie; (pm) pliegue del manto. Escala:
200 µm.
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Figura 6. 5. Hembra de B. rodriguezii en desarrollo (LT 8,00 mm). Se pueden reconocer
pequeños acinos gonadales en uno de los pliegues del manto. En la masa visceral se pueden
observar divertículos gástricos, el estómago, túbulos de la glándula digestiva. Referencias: (a)
acinos gonadales; (br) branquia; (dg) divertículo gástrico; (gd) glándula digestiva; (gbm)
glándula del borde del manto; (e) estómago; (mrp) músculos retractores pedales; (p) pie; (pm)
pliegue del manto. Escala: 200 µm.
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Figura 6. 6. Detalles de acinos gonadales de individuos inmaduros de B. rodriguezii en
desarrollo temprano. A. Macho (LT 7,60 mm) de enero de 2012, acino gonadal, ubicado junto a
un túbulo de la glándula digestiva con espermatogonias, espermatocitos y espermátidas. B.
Hembra (LT 8,00 mm) de diciembre de 2012 se reconocen dentro del acino, oogonias, oocitos
previtelogénicos y vitelogénicos temprano. Referencias: (em) epitelio del manto; (gd) glándula
digestiva; (spc) espermatocito; (spg) espermatogonia; (spm) espermátida; (o) oogonias; (pv)
oocitos previtelogénicos; (vt) oocitos vitelogénicos tempranos. Escalas A y B: 20 µm.
Figura 6. 7. Disposición esquemática de los acinos gonadales (sombreado) conforme aumenta
la longitud total en individuos inmaduros (A y B) y maduros (C).
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Talla de primera madurez poblacional de B. rodriguezii
Para los intervalos de talla comprendidos entre 3,00 y 3,99 mm todos los
individuos estudiados resultaron ser inmaduros (Figura 6. 8). La frecuencia de
individuos inmaduros sin acinos (indeterminados) disminuyó hasta los 7 mm donde la
frecuencia de individuos en esas condiciones fue reducida (sólo un caso). A partir de
los 4 mm se observaron individuos con acinos gonadales. Estos se disponían en la
región dorsal y/o lateral. En su interior se encontraban escasas células gametogénicas.
En el intervalo de tallas de 5 mm se observaron gametas en el interior de los acinos. La
presencia de gametas no era condición suficiente para alcanzar la madurez, como se
estableció en el critero histológico, es por ello que se consideraron inmaduros. Los
primeros registros de individuos maduros se obtuvieron a partir de los 6 mm. La talla
de primera madurez sexual estimada como la mediana de los individuos maduros
sexualmente resultó ser 8,30 mm. A partir de los 12 mm de longitud el 100 % de los
individuos estudiados se encontraban maduros (Figura 6.9).
0
25
50
75
100
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
LT (mm)
% i
nd
ivid
uo
s
maduros inmaduros
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Figura 6. 8. Talla de madurez gonadal en B. rodriguezii. Proporción de individuos inmaduros y
maduros respecto de la longitud total LT (mm). La intersección entre las dos líneas indica la
talla para la que el 50 % de los individuos se encontraba maduro.
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Figura 6. 9. Resumen de los eventos de maduración para B. rodriguezii conforme aumenta la
talla de los individuos.
6.4 Discusión
Los resultados de este estudio muestran que a medida que los individuos de B.
rodriguezii incrementan su longitud, la gónada se desarrolla, modificando su
disposición y morfología. La gónada de los bivalvos mitílidos se origina a partir de la
diferenciación de células mesodérmicas que se encuentran debajo de la cavidad
pericárdica (Sastry, 1979). Es una estructura que penetra tejidos a medida que crece, y
conforme se aproxima la madurez incrementa su volumen (Barber et al., 2005; Franco
et al., 2008). Los primeros acinos se registraron en la región dorsal y lateral. Conforme
los individuos crecen en longitud, los acinos incrementan su volumen y alcanzan los
pliegues del manto. En individuos maduros como se mencionó en el capítulo I, los
acinos gonadales de disponen alrededor de los órganos de la masa visceral, desplazan
al tejido conectivo de los pliegues del manto ocupando prácticamente todo el espacio
disponible.
8,30 mm: talla de primera madurez poblacional (LT50)
12 mm: toda lapoblación madura
6 mm: talla mínima de madurez
4 mm: comienzo de la espermatogénesis
6,99 mm: talla mínima de madurez
4,97 mm: comienzo de la oogénesis
Machos
Hembras
Longitud total
8,30 mm: talla de primera madurez poblacional (LT50)
12 mm: toda lapoblación madura
6 mm: talla mínima de madurez
4 mm: comienzo de la espermatogénesis
6,99 mm: talla mínima de madurez
4,97 mm: comienzo de la oogénesis
Machos
Hembras
Longitud total
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El desarrollo de los acinos gonadales está relacionado con el comienzo de la
gametogénesis. Se observó que el reconocimiento de los acinos gonadales a partir de
los cortes histológicos y la diferenciación entre oogénesis y espermatogénesis ocurre
en individuos de tallas comprendidas entre 4 y 5 mm. El estudio de Delgado y Defeo
(2007) menciona para Donax hanleyanus un intervalo (en términos de longitud) entre
individuos indiferenciados y aquellos donde es posible establecer el sexo de entre 2 y 3
mm. Este proceso de maduración abrupto podría estar asociado a la disponibilidad de
energía. En ambientes donde los organismos pueden disponer de más energía para
crecer hasta alcanzar un tamaño mayor, la madurez se retrasa y el aumento en la
proporción de individuos maduros ocurriría de forma más gradual.
En especies con fecundación externa, según Stearns (1992) las hembras tienden
a retrasar la madurez. Esto se debe a que en las hembras la fecundidad aumenta junto
con el tamaño a una tasa mayor de lo que ocurre en los machos. En este estudio se
observó que los machos de B. rodriguezii desarrollaban gametas a tallas ligeramente
más pequeñas que las hembras. Mientras que para Dreissena polymorpha se registró
que las hembras presentaban gametas a tallas mayores a los 5 mm y para machos se
observaban espermatozoides en individuos mayores a 6 mm (Vailati et al., 2001).
Trabajos previos en mitílidos muestran que la talla de primera madurez así
como la actividad gametogénica, varía en relación con la exposición a condiciones de
inmersión. Franz (1996) estudió la actividad gametogénica en Geukensia demissa en un
gradiente de exposición al oleaje y registró que la madurez se alcanzaba a tallas
menores en individuos que se encontraban sumergidos durante períodos más
prolongados. Sin embargo, cuando comparó el peso de los individuos maduros en
relación con el gradiente de exposición al oleaje, observó que los pesos eran similares,
es decir, la talla de madurez se encontraba íntimamente relacionada con el
crecimiento y la disponibilidad de alimento.
El conocimiento de la talla de primera madurez sexual es fundamental para
establecer pautas de manejo en especies de interés comercial (Chung, 2008; 2009;
Camacho et al., 2012). La explotación comercial de moluscos bivalvos en nuestro país,
involucra a un número reducido de especies. Dentro de la familia Mytilidae se
encuentran, la cholga Aulacomya atra, y el mejillón Mytilus platensis. Actualmente B.
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rodriguezii, no es una especie de importancia económica. Sin embargo, como
mencionamos en capítulos anteriores de este trabajo, reúne condiciones que le
confieren una gran importancia desde el punto de vista ecológico. En parámetro talla
de primera madurez puede proporcionar información acerca de la plasticidad que
manifiesta una población frente a cambios ambientales (Torroglosa y Giménez, 2010).
Esta información, junto con otras observaciones de aspectos reproductivos permite
conocer en profundidad algunos de los procesos que regulan la dinámica poblacional.
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7-Crecimiento.
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7.1 Introducción
El concepto de crecimiento ha sido establecido como el incremento de tamaño
o masa de un organismo en relación al tiempo. Para invertebrados bentónicos, así
como en otros organismos, se considera que hay un crecimiento en masa límite
(máximo) propio para cada especie y que no es un proceso lineal. Es decir, en las
etapas tempranas del desarrollo, el crecimiento es acelerado y a medida que se
alcanza la adultez se vuelve más lento (Brey, 1999). Esto respondería a la variación
entre las tasas de catabolismo y anabolismo respecto del tamaño corporal. La
demanda energética en relación al tamaño, aumenta más rápidamente que la
incorporación de energía y esto conduce a que los organismos puedan alcanzar un
tamaño máximo limitado (Reiss, 1991). Las condiciones ambientales y genéticas
derivan en un modelo de crecimiento característico para un individuo. Pero es posible
extrapolar este modelo a los individuos de una población en un mismo sitio mediante
un conjunto de parámetros y un modelo que describa el crecimiento de un individuo
promedio (Brey, 1999).
El crecimiento de un organismo forma parte de un conjunto de conocimientos
que brindan información biológica y ecológica de gran importancia para el estudio de
la dinámica poblacional de una especie (Kautsky, 1982; Antsulevich et al., 1999; Adami
et al., 2008; Herrmann et al., 2009b, 2011; Avendaño y Cantillanéz, 2013). En especies
de importancia económica permite estimar stocks de pesca, por lo tanto, constituye
información valiosa para la industria pesquera (Mahé et al., 2010; Moura et al., 2013).
En moluscos, las características morfológicas y la composición de las
estructuras calcáreas proveen información acerca del crecimiento. Anillos de la
superficie externa de la valva, anillos internos y anillos de micro crecimiento son
algunos de los elementos que se utilizan para estudiar el crecimiento (Richardson,
2001).
En moluscos bivalvos se ha estudiado el crecimiento mediante distintas
metodologías. El análisis de distribuciones de frecuencias de tallas (Maroñas et al.,
2003; Herrmann et al., 2009b; Avendaño y Cantillanéz, 2013), la cuantificación de
anillos de crecimiento (Brey y Mackensen, 1997; Kautsky, 1982; Richardson et al.,
1990; Richardson et al., 1999; Soldati et al., 2008; Moura et al., 2013; Bagur et al.,
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2013). Y mediante experimentos de marcado y recuperación (Day et al., 1995;
Herrmann et al., 2009b; Linard et al., 2011). Esta última metodología consiste en
colocar una marca en la valva y una vez transcurrido un período de tiempo, establecer
el incremento que ocurrió durante ese tiempo (Kaehler y McQuaid, 1999). Existen
diversas sustancias químicas, que permiten establecer marcas en estructuras rígidas de
carbonato de calcio y de esa manera, estudiar el crecimiento (Day et al., 1995; Fujikura
et al., 2003; Linard et al., 2011). Los organismos expuestos a esas sustancias
(marcadores químicos), incorporan el marcador en estructuras de carbonato de calcio
en formación. La eficiencia del marcador radica en su fácil detección, implementación,
tener duración prolongada y por sobre todo, no dañar al organismo en el cual se aplica
(Riascos et al., 2007). Dentro de los marcadores químicos, la calceína (C30H26N2O13) ha
sido utilizada en diferentes organismos, peces (Wilson et al., 1987), corales (Holcomb
et al., 2013), moluscos (Mahé et al., 2010; Linard et al., 2011; McCoy Loría y Huato-
Soberanis, 2014) y ha demostrado ser muy efectiva. Al someter a un individuo a una
solución de calceína, ésta es incorporada en estructuras de carbonato de calcio (Wilson
et al., 1987). Los moluscos generan su valva a partir de la acumulación periódica de
carbonato de calcio (CaCO3), junto con proteínas y azúcares que secretan las células
del epitelio del manto (Addadi et al., 2006). Entonces es posible establecer una marca
durante la secreción de la valva mientras el organismo es expuesto a calceína (Kaehler
y McQuaid, 1999; Moran, 2000). Es posible observar la marca que genera la calceína,
exponiendo la valva a luz azul, pudiendo reconocerse una región color verde lima
fluorescente (Wilson et al., 1987).
Se han realizado numerosos estudios in situ para determinar el crecimiento de
especies de moluscos bivalvos del intermareal, mediante la utilización de marcadores
químicos (Kaehler y McQuaid, 1999; Hermamm et al., 2009a; Lepore et al., 2009; Mahé
et al., 2010; Cáceres-Puig et al., 2011). Inclusive se han desarrollado estudios a grandes
profundidades (Tada et al., 2010). Esta metodología intenta minimizar el estrés por la
manipulación física, el aislamiento de organismos, el traslado a acuarios y de esta
manera, evitar estimaciones poco precisas (Kaehler y McQuaid, 1999).
En condiciones normales, el crecimiento está regulado por factores fisiológicos
y ambientales y dentro de los factores ambientales se destacan la temperatura, la
marea (Thompson, 1975) y la disponibilidad de alimento (Laing, 2000; Linard et al.,
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2011; Joubert et al., 2014). Para la ostra Pinctada margaritifera, Joubert et al. (2014)
observa que la tasa de deposición de carbonato de calcio en la valva ventral, se
relaciona positivamente con la concentración de alimento y el aumento de la
temperatura. A medida que aumenta la temperatura y el alimento disponible se
observa un incremento en el espesor de la valva. Sin embargo, a temperaturas altas
(~30°C) Pouvreau y Prasil (2001), observan un impacto negativo en el crecimiento,
sugiriendo la existencia de un umbral térmico para P. margaritifera. Por otra parte,
Bustamante y Branch (1996) mencionan que frente a una mayor la disponibilidad de
alimento (detritos y algas), mayor es la biomasa de organismos filtradores del
intermareal rocoso. Los organismos que habitan el intermareal están expuestos a
condiciones marinas cuando están sumergidos y a condiciones terrestres cuando baja
el nivel de la marea (Denny y Paine, 1998; Petes et al., 2008). La disponibilidad de
alimento está asociada a la exposición a las condiciones marinas, es decir, cuanto más
tiempo transcurran sumergidos, más alimento podrán incorporar y eso se vería
reflejado en el crecimiento (Petes et al., 2008). Según Connel (1972) los organismos
que se encuentran en la región superior del intermareal están expuestos a mayores
condiciones de estrés (condiciones aéreas) que aquellos que se encuentran en la
región inferior, sugiriendo que el estrés ambiental incrementa a lo largo del gradiente
vertical. Considerando que la temperatura y la disponibilidad de alimento influyen
directamente sobre el crecimiento. Y que el alimento disponible para los organismos
que habitan el intermareal, presenta una relación positiva con la exposición a
condiciones acuáticas, se plantean las siguientes hipótesis: H1: El crecimiento de B.
rodriguezii será menor en los individuos que permanezcan más expuestos a
condiciones aéreas. H2: El crecimiento de B. rodriguezii será variable a lo largo del año
y depende de la estacionalidad. H3: Para esta especie el crecimiento es diferencial en
las distintas tallas.
El objetivo del presente capítulo fue estudiar las variaciones del crecimiento de
Brachidontes rodriguezii en sustratos artificiales en relación a factores ambientales:
estación del año y la exposición a condiciones aéreas/sumergidas y a la talla de los
individuos en la localidad de Villa Gesell.
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7.2 Materiales y métodos
Diseño de muestreo y obtención de los individuos para experimentación
El área de estudio fue el muelle de la localidad de Villa Gesell en la provincia de
Buenos Aires. Se seleccionaron 8 columnas del muelle cercanas a la línea de costa,
donde la disposición de B. rodriguezii era de aspecto homogéneo. Se colectaron
manualmente utilizando espátula porciones de la matriz (parches) del estrato inferior y
del estrato superior de las columnas del muelle. Esto permitió evaluar si había
variación en el crecimiento en relación con el tiempo que los individuos permanecían
sumergidos. El estrato inferior correspondía a una zona que permanecía sumergida
durante todo el dia, inclusive durante la baja marea. Mientras que el superior sólo
permanecía sumegido durante 6 horas por dia aproximadamente durante la marea
alta. Los parches de individuos fueron trasladados a acuarios para su aclimatación
durante 6 hs. Para evaluar si existía relación con la estacionalidad este procedimiento
se repitió en tres momentos diferentes del año comenzando en: julio de 2012,
noviembre de 2012 y julio de 2013.
Experiencia sobre crecimiento in situ
Los organismos recolectados se dividieron en dos grupos. Un conjunto de
parches se mantuvo en los acuarios sin ser expuestos a la calceína fueron considerados
como control de la manipulación durante el experimento. Mientras que otros parches
fueron sumergidos en una solución de calceína (Sigma, CAS 1461-15-0) en agua de mar
(140 mg de calceína por litro de agua) durante cuatro horas. Éstos últimos fueron
considerados como parches tratados. Durante el marcado con calceína los individuos
permanecieron en acuarios con aireadores y en condiciones de oscuridad para evitar la
descomposición de la calceína (Figura 7. 1A). Transcurrido el período de marcado se
tomaron porciones de los parches de ambos grupos (control y tratados) de 3 x 4 cm y
fueron introducidos en dispositivos de 10 x 10 cm confeccionados con tela de malla
plástica de 2 mm de tamaño de poro unidos con hilo de nylon de 0,6 mm de diámetro.
Cada dispositivo se encontraba dividido a la mitad de manera que contenía un parche
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control y otro tratado en su interior (Figura 7. 1B). No se realizaron controles del
crecimiento con un tratamiento fisico (medición con calibre) para no desarmar el
parche. En el campo los dispositivos fueron colocados en los estratos superior e
inferior (rotulados diferencialmente) asegurados con hilo de nylon de 1 mm de
diámetro (Figura 7. 1C).
Figura 7.1. Metodología del experimento de marcado con calceína. A. Individuos de B.
rodriguezii sumergidos en la solución de calceína. B. Dispositivo utilizado para la
reintroducción en el mar. C. Disposición de los dispositivos en el estrato inferior y superior de
una columna del muelle de Villa Gesell. Escala C: 10 cm.
Se colocaron 8, 18 y 10 dispositivos en los meses de julio y noviembre de 2012 y
julio de 2013, respectivamente. El número de dipositivos colocados en el segundo
experimento (noviembre-diciembre) fue mayor que en julio-agosto. Se colocaron más
dispositivos debido a que en julio-agosto solo se recuperó el 40 % de los dispositivos.
En el último experimento el número de dispositivos colocados fue menor, esto se
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debió a que las condiciones del oleaje impidieron la colocación de los mismos (Figura
7. 2).
Figura 7. 2. Esquema de la ubicación de los dispositivos en los diferentes estratos (superior:
130 cm/ inferior: 20 cm) durante el experimento en el muelle de Villa Gesell, provincia de
Buenos Aires.
Los dispositivos colocados en julio de 2012 permanecieron en el muelle durante
26 días y luego se recuperaron 3 dispositivos del estrato inferior. Del estrato superior
no fue posible recuperar dispositivos dado que no se encontraron en la playa. Los
dispositivos colocados en el mes de noviembre se dejaron en el campo y luego de 26
días se recuperaron 4 dispositivos (2 del superior y 2 del inferior). Por último, en julio
de 2013, luego de 89 días se recuperaron dos dispositivos del estrato superior. La
experiencia de julio de 2013 se descartó del análisis. Durante el experimento no se
pudieron retirar los dispositivos en dos ocasiones porque se encontraban enterrados
en la arena. Al momento de retirarlos, los individuos se encontraban vivos pero como
no fue posible establecer cuanto tiempo habían permanecido enterrados y frente a la
posibilidad de que los experimentos no sean comparables, se optó por no considerar
esos resultados. Todos los dispositivos recuperados fueron trasladados al laboratorio.
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Preparación de las valvas y detección de marcas de calceína.
En el laboratorio se retiraron los individuos del interior de los dispositivos
recuperados. Las valvas vacías y aquellos individuos cuyas valvas estaban abiertas
fueron descartados. Se removieron las valvas de los individuos que se encontraban
cerrados (de esta manera se garantizó que las mediciones se realizaran en individuos
que sobrevivieron al período de experimentación) (Figura 7. 3A). Las valvas vacías se
limpiaron y secaron a temperatura ambiente durante 72 horas. Las valvas derechas
fueron medidas con calibre de precisión de 0,01 mm e incluidas en resina epoxi (Figura
7. 3B). Posteriormente, los tacos de resina fueron pulidos a mano con planchas de
gránulos de carburo de silicio (SiC) de 300, 150, 80 y 45 micrones de diámetro (Escala
ANSI). Las marcas de calceína se detectaron bajo un microscopio de fluorescencia
Zeiss®Axio Imager Z1, irradiado con luz azul (450-490 nm) mediante fotografías (Figura
7. 3C) y se utilizó el programa AxioVision (2013) 4.8.2 para procesar las imágenes. Se
midió la distancia entre la marca de calceína y el extremo posterior de la valva. Esa
distancia se consideró como el incremento en longitud de la valva durante el tiempo
que el individuo estuvo expuesto a las condiciones de experimentación.
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Figura 7. 3. Recuperación de los individuos de B. rodriguezii, inclusión y observación de marcas
de calceína. A. Dispositivo recuperado con individuos en su interior. B. Tacos de resina con
valvas en su interior. C. Extremo posterior de una valva derecha de B. rodriguezii al M.O. de
fluorescencia. Se observa la marca generada por la calceína. La línea entre las puntas de flecha
indica la longitud registrada como incremento de la valva. Abreviaturas: (p) periostraco. Escala
B: 10 mm. Escala C: 100 µm.
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Análisis de los datos
Se compararon mediante ANOVA de un factor (Sokal y Rohlf, 1995), los
registros de incrementos en las valvas de los individuos colocados en las columnas del
muelle con distinta distancia a la costa, para cada temporada y para cada tiempo de
experimentación. Los incrementos no difirieron entre distancias a la costa.
(Experimento de julio de 2012: F (1,20) = 0,369; p= 0,55. Experimento de noviembre: F
(1,166) = 0,123; p=0,72). A partir de estos resultados, los registros fueron tomados como
homogéneos en cuanto a esa variable
Para analizar el efecto del estrés en relación al grado de exposición al agua de
mar, se realizó una prueba t para comparar el incremento en dos estratos del
gradiente vertical en las columnas del muelle (superior/inferior) (Sokal y Rohlf, 1995).
Con el objetivo de estudiar la relación entre el incremento de la valva de los
individuos de esta especie y la estacionalidad se compararon las medias del
incremento para meses fríos y meses cálidos mediante una prueba t (Sokal y Rohlf,
1995). El período de meses fríos correspondió al período julio- agosto de 2012
mientras que el de meses cálidos correspondió a noviembre- diciembre de 2012.
Se estudió la relación entre el incremento y la talla al inicio del experimento de
los individuos para ambos estratos estudiando ajustes a distinto tipos de funciones. La
longitud de los individuos al inicio del expermiento se obtuvo a partir de la diferencia
entre la talla al momento de finalizar el exprimento y el incremento registrado
mediante M.O. Esa longitud se corresponde con la talla al momento de sumergir a los
invividuos en calceína. Dado que para los meses de julio y agosto de 2012 no se contó
con registros de ambos estratos, este análisis se llevó a cabo con los registros de
noviembre y diciembre.
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7.3 Resultados
El marcador fluorescente emitió una luz verde clara brillante que describía una
banda que se pudo observar desde el umbo hacia el extremo posterior de la valva. Esta
marca se presentó conspicua en los extremos de la valva. La efectividad del marcado
con calceína en los diferentes experimentos fue del 70 %. Los individuos del grupo
control así como algunos del grupo tratados no presentaron marca de calceína. Es
posible que durante la inmersión en la solución de calceína algunos ejemplares hayan
permanecido con las valvas cerradas evitando así la incorporación de calceína.
Incremento de la valva
Se obtuvieron individuos marcados en los experimentos tanto de invierno como
de primavera, así como para el estrato superior y el inferior (Tabla 7. 1).
Fecha Estrato N T(días) LT min (mm) LT máx (mm) LT (mm)±DS
Jul/ago inferior 21 26 4,91 26,3 16,52 ± 4,98
Nov/dic inferior 56 26 2,79 23,82 9,52 ±4,75
2012
Nov/dic superior 67 26 4,24 19,89 12,4 ± 4,21
Tabla 7. 1. Valores de largos totales (LT) de los individuos que presentaban marcas en los dos
estratos estudiados y días de duración del experimento en el muelle de Villa Gesell. N: número
de individuos con marcas de calceína, T: duración de cada experimento en días, LT ± DS:
longitud total promedio y desvío estándar.
Incremento en la longitud de la valva en relación con la disposición vertical en el
intermareal
Se observó una variación significativa estadísticamente en el incremento de la
valva en relación con la disposición vertical en el intermareal sobre las columnas del
muelle. Los individuos del estrato superior presentaron un incremento de 689,47�m.
Mientras que los individuos del estrato inferior presentaron un incremento promedio
� ��
de 2.530,40 �m durante el período noviembre – diciembre (Figura 7. 4) t(54)=9,5993;
p<0,0001.
��=����� ��������
�������
822
122
922
3222
3022
3822
3122
3922
0222
0022
0822
0122
0922
6222
0!4��5
Figura 7. 4. Incremento (I) de talla de individuos de B. rodriguezii de ambos estratos
(inferior/superior) del muelle durante el período noviembre - diciembre de 2012.
Incremento de la longitud de la valva y el período estacional
Para los individuos del estrato inferior se registró durante el período
comprendido entre julio y agosto un incremento promedio de 152,45 �m. Este valor
resultó ser significativamente menor que el registrado para los meses de noviembre y
diciembre que fue de 2.512,57 �m (t(75) = -9,555; p < 0,001) (Figuras 7. 5 y 7.6).
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*��>� � ���>���
�����
2
022
822
122
922
3222
3022
3822
3122
3922
0222
0022
0822
0122
0922
6222
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Figura 7. 5. Incremento (I) en longitud de la valva de individuos de B. rodriguezii del estrato
inferior durante los períodos: julio-agosto y noviembre-diciembre de 2012.
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Figura 7. 6. Esquema de corte transversal de una valva (modificado de Masu et al., 2008) el
recuadro indica la zona que se observa en detalle. Fotografía al M.O. de fluorescencia de
valvas de B. rodriguezii. A. Incremento de 164, 16 �m de un individuo de invierno (LT 14,23
mm). B. Incremento de 2.398,97 �m de un individuo de verano (LT 13,66 mm). Las puntas de
flecha indican la posición de la marca de calceína próxima al extremo posterior de la valva.
Referencias: (p) periostraco. Escala A: 100 µm. Escala B: 200 µm.
Incremento de la longitud de la valva en relación con la talla
Los incrementos obtenidos durante el verano para los estratos inferior y
superior, sugieren que hay una relación de tipo exponencial entre el incremento de la
valva y la talla de los individuos al inicio del experimento (Figuras 7. 7 y 7. 8). Se
observó que el incremento de la valva disminuyó a medida que los individuos
alcanzaron tallas superiores.
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La relación entre el incremento en la longitud de la valva y la talla inicial para
los registros del estrato inferior y del superior del período noviembre-diciembre
ajustaron a curvas exponenciales negativas (Estrato superior: LT0 = 1549,2764*exp (-
0,085*x); Estrato inferior: LT0 =5294,699 * exp (-0.093 * x). Sin embargo, la curva del
estrato superior se mostró más deprimida que la del inferior. Se registró un
comportamiento similar entre los estratos para los individuos de tallas mayores,
mientras que para las tallas pequeñas, se registraron diferencias más marcadas.
Figura 7. 7. Incremento de la valva para individuos de ambos estratos (inferior/ superior) en la
experiencia de verano. LTo: largo total al inicio del experimento.
2 0 8 1 9 32 30 38 31 39 02 00 08 01
6&�!4��5
2
3222
0222
6222
8222
4222
1222
?222
��:��;
���������
���������
� ��
Figura 7. 8. Esquema de corte transversal de una valva, (modificado de Masu et al., 2008) el
recuadro indica la zona que se observa en detalle. Valvas de B. rodriguezii con marca de
calceína al M.O. de fluorescencia provenientes del estrato inferior de la experiencia de verano.
A. Detalle del incremento en un individuo de LT 20,31 mm. B. Detalle del incremento en un
individuo de LT 4,08 mm. Las puntas de flecha indican la posición de la marca de calceína
próxima al extremo posterior de la valva. Abreviaturas: (p) periostraco. Escala A: 50 µm. Escala
B: 100 µm.
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7.4 Discusión
El experimento desarrollado in situ permitió registrar el incremento en las
valvas de individuos de Brachidontes rodriguezii. La metodología de marcado con
calceína y registro del incremento mediante observación con microscopía de
fluorescencia permitió analizar la relación entre el incremento de la talla, y factores
como el tiempo de exposición a condiciones de inmersión, la variación estacional y la
longitud inicial de los individuos. Los análisis realizados corroboraron las hipótesis
planteadas.
Efecto de la disposición vertical en el incremento de la talla
Los resultados obtenidos para el incremento de la talla de B. rodriguezii en
relación a la ubicación en el eje vertical de las columnas del muelle apoyaron la
primera hipótesis planteada.
En el gradiente vertical las variables ambientales (temperatura, salinidad,
mareas, etc.) experimentan cambios, y estos cambios en ocasiones pueden dar lugar a
zonas con características diferentes (McQuaid y Mostert, 2010). Esto implica que los
individuos de la zona superior están expuestos a una temperatura mayor (e.g. Petes et
al., 2008), humedad, disponibilidad de alimento y de oxígeno menor que la zona
inferior (Helmuth et al., 2011). Dentro del la zona donde se distribuye una especie
intermareal, como ocurre con algunos bivalvos mitílidos, Petes et al. (2008) observó
que durante la exposición aérea, en el límite superior de su distribución vertical,
Mytilus californianus adquiere una temperatura corporal que duplica a la que alcanzan
individuos en el estrato inferior.
Dado que la amplitud de marea en Villa Gesell es de 1,30 m (SHN, 2014), los
individuos del estrato superior permanecen sumergidos solo durante la marea alta.
Entonces, el menor incremento registrado en el estrato superior, podría deberse a que
los individuos en este estrato están expuestos a condiciones de mayor estrés (mayor
temperatura, menor humedad, menor alimento disponible) que los del inferior.
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Este crecimiento diferencial en la disposición vertical también ha sido
observado para otras especies de bivalvos mitílidos, como M. californianus (Petes et
al., 2008), Mytilus edulis (Anstulevich et al., 1999) y Geukensia demissa (Franz, 1996).
Como consecuencia del estrés, no solo se vería afectado el crecimiento sino
también algunos aspectos reproductivos, como sugiere Petes et al. (2007) quien
observó una reducción en las reservas energéticas destinadas a la reproducción y un
aumento en la frecuencia de evacuación de gametas para mitílidos.
Dado esto, nuestros resultados sugieren que el estrés ambiental al que están
sometidos los individuos del estrato superior afectaría la tasa de crecimiento de B.
rodriguezii, e incluso podrían verse afectados también aspectos reproductivos. Futuros
estudios podrían corroborar este último aspecto.
Variación estacional del crecimiento
En aguas templadas, los bivalvos marinos muestran un menor crecimiento
durante el otoño-invierno, como consecuencia de la disminución de la temperatura del
agua y del alimento disponible (Richardson et al., 1993). Nuestros resultados
mostraron un mayor incremento en la longitud de la valva de B. rodriguezii para los
meses de noviembre y diciembre que en los meses de julio y agosto, corroborando así
la hipótesis planteada. Para otros moluscos de la región (Giménez et al., 2004;
Herrmann et al., 2009b, 2011), se han reportado también menores incrementos en
estaciones del año con bajas temperatura (otoño/invierno) que en estaciones de
mayor temperatura. Las fluctuaciones estaciónales de la temperatura así como del
fotoperíodo afectan a la producción primaria (fitoplancton) en el mar (Carreto et al.,
1995; Sar et al., 2010). A su vez, la abundancia del fitoplancton, fuente de alimento de
B. rodriguezii, estaría determinando el crecimiento de esta especie. Así, los valores
máximos de abundancia del fitoplancton en verano determinarían un mayor
crecimiento en B. rodriguezii.
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Relación entre el crecimiento y la talla de los individuos
Los menores incrementos registrados en individuos con las tallas más altas de
B. rodriguezii en este estudio concuerdan con resultados observados en Ceratoderma
edule (Mahé et al., 2010) y Perna perna (Kaehler y McQuaid, 1999). Para poblaciones
de Mesodesma mactroides (Lepore et al., 2009) y Donax hanleyanus (Hermann et al.,
2009b) de la costa de la provincia de Buenos Aires, se observa que la relación entre la
tasa de crecimiento diaria y la longitud de los individuos es de tipo exponencial. Del
mismo modo, los resultados de este estudio también registraron curvas de tipo
exponencial negativa para el incremento en relación con la longitud de la valva. Esta
observación estaría relacionada con los cambios en el crecimiento que manifiesta un
organismo en las distintas etapas de la vida, acelerado en etapas tempranas del
desarrollo y desacelerado al alcanzar la madurez (Brey, 1999). En tallas donde los
individuos no alcanzan la madurez sexual, el crecimiento es mayor y en tallas donde el
individuo se encuentra maduro sexualmente, el crecimiento se ve desacelerado. Esto
podría deberse a un cambio en la utilización de los recursos energéticos ligado a la
madurez sexual (Giménez et al., 2004). Se ha observado para otros moluscos que los
individuos inmaduros destinan la mayor parte de la energía disponible al crecimiento
hasta que es alcanzada la madurez (Herrmann et al., 2009b; Hutchings y Haedrich,
1984). Es posible que esto también suceda con B. rodriguezii. Sumado a los cambios
fisiológicos que experimentan los individuos conforme crecen y se desarrollan, el
crecimiento de B. rodriguezii al igual que en otros mitílidos es densodependiente.
Las agrupaciones de B. rodriguezii constituyen matrices complejas que
consisten numerosas capas o estratos de individuos de diferentes edades y tamaños
donde se mantienen adheridos unos a otros mediante los filamentos del biso
(Alvarado y Castilla, 1996; Guiñez y Castilla, 1999; Commito y Rusignuolo, 2000). El
crecimiento varía en relación con la densidad de individuos y con la ubicación dentro
de la matriz. Debido a esto, en una porción de la matriz es posible encontrar individuos
de diferentes tallas que podrían tener la misma edad, o individuos de tallas similares
con edades diferentes (Kautski, 1982). Los factores que estarían regulando el
crecimiento son numerosos, sin embargo, un aspecto interesante de este trabajo es
que a lo largo de la disposición en el plano vertical, las curvas que describen el
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incremento de la talla en relación con la longitud de los invdividuos, son de forma
similar. Para los individuos que se encontraban en el estrato inferior del muelle, la
curva presentó valores de incrementos mayores, y esto podría deberse a que estos
individuos disponen de más alimento y permanecen más tiempo sumergidos.
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8. Conclusiones generales.
Los individuos presentan sexos separados, aunque, se registraron en baja
proporción individuos hermafroditas. Éstos presentaron en algunos casos acinos
femeninos y masculinos, y en otros casos, se observaron acinos mixtos donde células
espermatogénicas y células oogénicas compartían un mismo acino.
La oogénesis resultó ser de tipo solitaria. Conforme tiene lugar la oogénesis y
progresa la vitelogénesis, se observó una reducción en el tejido conectivo que rodeaba
a la gónada.
Se describió la ultraestructura del espermatozoide. Este resultó ser de tipo
primitivo. Posee acrosoma de forma cónica, con una prolongación anterior elongada.
Núcleo ligeramente ovalado y la pieza media compuesta por cinco mitocondrias que
rodean un par de centriolos dispuestos de forma ortogonal.
Se describieron los principales estadios de la espermatogénesis y se
reconocieron estructuras correspondientes a alteraciones histopatológicas en la
gónada masculina en zonas afectadas antropogénicamente.
La producción de gametas ocurre durante todo el año. El ciclo reproductivo de
Brachidontes rodriguezii varía estacionalmente.
El ciclo reproductivo presentó un evento de evacuación entre los meses de
febrero y mayo.
Se determinó la talla de primera madurez sexual gonadal. La talla mínima de
madurez sexual gonadal para machos fue de 6 mm y para las hembras fue de 6,99 mm.
La madurez estimada para el 50% de la población ocurre a 8,3 mm de longitud en
ambos sexos. Conforme incrementaba el tamaño de los individuos la gónada se
desarrollaba y proliferaba ocupando el espacio que previamente ocupaban otros
tejidos. A partir de los 12 mm el 100% de los individuos estudiados resultaron estar
maduros sexualmente.
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El crecimiento resultó estar relacionado con la estacionalidad. Registrándose un
mayor incremento en la longitud de la valva en primavera respecto de lo que ocurre en
invierno.
El crecimiento varía con respecto a la exposición a condiciones aéreas y
acuáticas. Los individuos que permanecen sumergidos durante más tiempo,
presentaron un mayor crecimiento respecto de aquellos que permanecen más tiempo
expuestos a condiciones aéreas.
Tallas correspondientes a individuos inmaduros sexualmente poseen mayor
incremento de longitud de valva. Mientras que las tallas en las que se observa un
menor incremento corresponden a individuos maduros sexualmente. Estas
observaciones sugieren que podría haber cambios fisiológicos conforme B. rodriguezii
crece y que estos cambios podrían estar acompañados por condicionamientos
energéticos. Los juveniles destinarían sus recursos al crecimiento y mantenimiento,
mientras que en los adultos destinarían la energía, al crecimiento, mantenimiento y a
la reproducción.
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10. Apéndice
Fijador
Solución de Bouin: 70 ml de solución acuosa saturada de ácido pícrico 25 ml de formaldehido 40 % 5 ml de acido acético glacial Deshidratación del material incluído en parafina.
Etanol 70o luego de la solución de Bouin. Etanol 80o durante una noche. Etanol 96o durante 1 hora Etanol 96o durante 1 hora Etanol 100o durante 1 hora. Aclarado en xilol durante 5 minutos. Parafina (Histoplast) dos cambios de dos horas cada uno. Coloración aplicada a material incluído en parafina.
Hematoxilina-Eosina
1) Desparafinado en xilol durante 5 minutos sumergido. a) Secar al aire. b) Alcohol 96%, 1 minuto. c) Alcohol 80%, 1 minuto. d) Alcohol 70%, 1 minuto. e) Alcohol 50%, 1 minuto. f) Agua destilada, por 1 minuto. 2) Coloración a) Hematoxilina de Carazzi por 8 minutos. b) Viraje en agua común hasta que tome color violeta. c) Eosina alcohólica 0,25% (en alcohol 70%) durante 3 minutos. 3) Deshidratación y montaje a) Alcohol 96%, pasaje rápido. b) Alcohol 100%, pasaje rápido. c) Xilol durante 3 minutos. d) Bálsamo de Canadá sintético.
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Coloración aplicada a material incluido en resina.
Hematoxilina-Eosina
1) Hidratar con agua destilada 10 minutos. 2) Coloración a) Hematoxilina de Carazzi por 15 minutos. b) Viraje en agua común hasta que tome color violeta. c) Eosina alcohólica 0.25% (en alcohol 70%) por 5 minutos. 3) Deshidratar y montar a) Pasaje rápido por alcohol 70%. b) Alcohol 96% pasaje rápido. c) Secar. e) Bálsamo de Canadá sintético. Resultados de la coloración: Núcleos: violetas y citoplasma: rojizo. La hematoxilina colorea los núcleos. Las sustancias coloreadas con la hematoxilina se denominan basófilas, dado que la hematoxilina un colorante alcalino. La eosina colorea el citoplasma (coloración de fondo). Las sustancias que toman el color de la eosina se llaman acidófilas por ser éste un colorante ácido.
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11. Trabajos relacionados con esta tesis Torroglosa, M.E. y Giménez, J. 2015. Spermatogenesis and sperm ultrastructure in
Brachidontes rodriguezii (d’Orbigny, 1846) and Brachidontes purpuratus (Lamarck,
1819) (Mytilidae, Bivalvia). Journal of Marine Biological Association of United Kingdom,
1-8. doi:10.1017/S0025315415000028.
Congresos 7th Congress of the European Malacological Societes. 7-11 de septiembre de 2014, Cambridge, Reino Unido. Reproductive seasonality and histochemical profile in Brachidones rodriguezii (dÓrbigny, 1846) from southwestern Atlantic Ocean Torroglosa, M.E., Ojeda, M, Di Stefano, V. y Giménez, J.. Participación: Panel.
Encuentro de las Américas,: Sociedad de Malacología de México, Asociación Latinoamericana de Malacología, American Malacological Society y Western Society of Malacologists. 22-27 de Junio de 2014, México D.F, México. Use of the fluorochrome calcein as an in situ growth marker in Brachidontes rodriguezii (d’Orbigny, 1846). Torroglosa, M. E., Ojeda, M. y Giménez, J. Participación: Panel
XXIII Encontro Braileiro de Malacologia, Rio de Janeiro, Brasil. 21-25 de Octubre de 2013. Caracterización de la glándula digestiva en Brachidontes rodriguezii y Siphonaria
lessoni en la costa Bonaerense. Alteraciones por contaminantes. Torroglosa M. E., Arrighetti, F., Knack de Almeida, H. y Giménez, J. Participación: Orador 78th American Malacological Society, Cherry hill, New Jersey, USA. 16-21 de Junio de 2012. Spermatozoa morphology of Brachidontes rodriguezii (d’Orbigny, 1846) (Bivalvia) from South western Atlantic Ocean. Torroglosa, M. E.
y Giménez, J. Participación: Panel 78th American Malacological Society, Cherry hill, New Jersey, USA. 16-21 de Junio de 2012. Spawn and larval development in Siphonaria lessoni (Siphonaridae: Gastropoda) from Buenos Aires, Argentina. Ojeda, M., Torroglosa, M. E.
y Giménez, J. Participación: Panel
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