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Avaliação Quantitativa das Preparações Enzimáticas
Como diferenciar enzimas?
Quando não podemos determinar a concentração de uma enzima devemos diferenciar as enzimas por sua atividade (moléculas não podem ser contadas)
Reproduz-se em laboratório , sob condições controladas a catálise enzimática
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Problemas Clássicos na determinação da atividade de preparações enzimáticas
1- Não se conhece a estrutura completa e, consequentemente, o peso molecular da maioria das enzimas.
2- Nas preparações enzimáticas moléculas distintas podem exercer efeitos semelhantes, por exemplo, formação de grupos redutores.
3- Pode haver enzimas inativas que aumentam o conteúdo proteico na preparação.
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- Para que avaliação seja eficiente, o procedimento deve ser reprodutível.
- Também deve-se saber qual é o substrato natural da enzima.
Exemplo: xilose que por ação da glicose isomerase passa a xilulose (mesmo glicose a
frutose)
Como provar quem é o substrato natural?
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Uso de Substratos não NaturaisAlgumas vezes o substrato não natural pode ser muito mais bem catalisado pela enzima que o substrato natural.
Exemplo: Enzima beta-galactosidase – hidrolisa lactose a galactose
+ glicose que não absorvem no UV visível.
Por esta razão usa-se substrato não natural que pode ser catalisado pela enzima beta galactose ortonitrofenil.
O ortonitrofenilgalactosideo quando hidrolisado forma o ortonitrofenol que em pH alcalino é desprotonado e absorvido no UV-visivel.
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Montagem do Ensaio de Determinação da Atividade Enzimática
Escolha do Substrato:
Pode-se constituir um grande problemaa escolha do melhor e mais adequadosubstrato para o ensaio.
Escolha substrato que garanta areprodutibilidade do método.
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Concentração do Substrato:
Modelo de Henri-Michaelis e Menten - excesso de
substrato em relação a concentração de enzima, de
forma que a hipótese de estado estacionário seja valida
(velocidade de relação linear).
Um excesso de substrato pode proporcionar uma
saturação da enzima reduzindo assim sua atividade.
Determina-se a velocidade em t próximo de zero, de
modo que a concentração de S não se modifique
consideravelmente.
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Tempo de reação:
A unidade do tempo e fundamental na expressão e também na determinação da atividade enzimática.
Deve-se ter formado quantidade mensurável de produto, ou ter desaparecido quantidade significativa de substrato.
A reação P + E ES possa ser negligenciada
Velocidade = consumo de S ou surgimento de P
unidade de tempo
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pH:pH controlado – necessidade de manter grupos críticos do
centro ativo no estado de ionização correto para que a reação ocorra, conduzida em velocidade máxima. pH ótimo e necessário
- Efeito reversível do pH na velocidade máxima de reação.
- Mudança na afinidade enzima/substrato – reflete no valor de Km.
- Mudança na estabilidade da enzima – desnaturação irreversível em um ou em ambos extremos do ponto de pH para a atividade. Este ultimo efeito depende do tempo usado para medir a taxa de reação.
Todos os 3 efeitos podem ocorrer em conjunto.
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Temperatura:
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A limitada estabilidade térmica das enzimas resulta em inativação a elevadas
temperaturas.
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Inibidores:
Modulação positiva – ativação – interação modulador com a enzima favorece a reação.
Modulação negativa – inibição - interação modulador com a enzima envenena a reação.
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Expressão da Atividade EnzimáticaUnidade Internacionalçã UI – quantidade de enzima que catalisa a
transformacao de 1 micromol de substrato por minuto a 25 oC , sob condições otimizadas.
Atividade específica _ número de unidades de atividade de enzima por miligrama de proteína - indicador da pureza de uma enzima –
atividade dividida por unidade de massa proteíca total.
Atividade molar ou molecular ou numero de turnover - número de unidades de atividade por micromol de enzima ou seja , numero de moléculas de substrato transformado por uma única molécula
de enzima em um minuto.
Uma unidade alternativa foi sugerida pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica, mas raramente usada, que é o katal (SI), definida
como a quantidade de enzima capaz de causar a transformação de 1 mmol de substrato por segundo
sob condições específicas.
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Formas específicas de expressar a atividade de uma enzima
ou unidade Soxhlet/ mL, é definida como o número de
mililitros de leite que podem ser coagulados em 40 minutos a 35°C.
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Atividade lipásica: é a quantidade de enzima necessária para produzir certa
quantidade de ácido graxo, determinada por titulação em pH-stat, quer dizer, o
pH é mantido constante por certo período de tempo com a adição de soda. Dois
padrões podem ser utilizados: ésteres solúveis ou óleo de oliva (azeite) em uma
emulsão padronizada.
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Analise Quantitativa da atividade enzimática
A análise quantitativa pode ser conduzida de várias maneiras:
• Ensaios diretos: medida direta da concentração do substrato ou produto em função do tempo.
• Ensaios indiretos: quando a medida da concentração do substrato e do produto são próximas, a geração do produto pode ser acoplada a outra reação não enzimática, que produza um sinal mais conveniente.
• Ensaios acoplados: a reação enzimática de interesse é acoplada a uma segunda reação enzimática, que pode ser convenientemente medida, tendo como exemplo a reação da glicose oxidase
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Determinação da quantidade de proteínas
Realiza por diferentes métodos – os mais precisos são aqueles que determinam as ligações peptídicas existentes nas moléculas proteicas (Lowry, Bradford).
Outros determinam elementos naturais a natureza proteica , tal como nitrogênio orgânico (Keldhjal)
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Relações não-lineares dev versus [E]t
A preparação enzimática estocada sob condições de pH ou forçaiônica significativamente diferentes do ótimo de reação podemlevar ao “carreamento” destes parâmetros para a análise cinética.
De forma semelhante, a presença de certos agentes deestabilização (EDTA, tióis ou cátions específicos) podem inibir areação.
A medida de velocidade pode não ser uma medida verdadeira davelocidade inicial. Isto pode ocorrer quando a concentração desubstrato diminui significativamente (i.e., não segue uma cinéticade primeira ordem) antes da medida do produto formado.
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A preparação enzimática pode conter enzimas que convertam oproduto a outro composto que foge da detecção do métodoempregado.
A enzima pode ser instável sob as condições de análise (pH,temperatura, força iônica, etc.).
A preparação enzimática pode conter enzimas proteolíticas quese encontram inativas sob as condições de estocagem.
O método de análise pode ser impreciso em altas concentraçõesdo produto.
Os reagentes empregados para converter o produto em umaforma mensurável podem estar em condições limitantes.
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