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Amplificação (clonagem) dos
genes e seu armazenamento
Sistemas celulares-> bactérias, vírus, células
eucarióticas;
Sistemas acelulares-> Reação em cadeia da
polimerase (PCR)
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Reação em cadeia da polimerase
(PCR) 1985- Kary Mullis inventou a reação em cadeia
da polimerase (PCR) durante uma viagem decarro ao longo da costa da Califórnia. Sua ideia
foi a concepção de uma técnica genial,relativamente simples, que funciona comocomplemento perfeito para a clonagem
gênica. Novas disciplinas surgiram comoconsequência direta da invenção da PCR-ecologia molecular, arqueologia biomolecular,
ciência forense.
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Reação em cadeia da polimerase
(PCR
)
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Reação em cadeia da polimerase
(PCR
)
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Bibliotecas Genômicas
e de cDNA
Departamento de Biologia Celular e Molecular
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Bibliotecas
São coleções de sequencias de DNA usadas
para armazenar informação-> coleção de
genes recombinantes.
Ex. de usos:
isolamento de um gene específico;
sequenciamento;
clonagem; identificação de genes em diferentes
especies;
análise de proteínas relacionadas;
Etc...
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Tipos de Bibliotecas:
Biblioteca Genômica : uma coleção de clones
de DNA representando o genoma de um
organismo
Biblioteca de cDNA : coleção de clones com
insertos de DNA complementar (cDNA)
sintetizada a partir de moleculas de mRNA de
uma célula
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Fontes de DNA para a Biblioteca
DNA Genomico : o DNA genômico é cortado e pequenos pedaços são clonados.
Vantagem : todo o genoma é cortado e clonado em pequenos pedaços - pega toda asequencia.
Desvantagem : vem um monte de lixo.
Dois métodos: 1. fragmentação randômica do DNA em pequenos pedaços que sãoligados a oligonucleotídeos, as pontas contêm sítios de restrição.
2. Fragmentos parcialmente digeridos com enzima de restrição. Podevariar o tempo de digestão ou quantidade de enzima.
cDNA : DNA sintetizado a partir do mRNA com a transcriptase reversa.
Vantagem : somente os genes expressos são selecionados.Desvantagem : não é possivel selecionar sequencias de controle ou íntrons e
frequentemente dependem do nível de expressão gênica.
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Biblioteca genômica como fazer ?
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Acompanhamento da Reação: visualização em
eletroforese em gel de agarose
Variando o tempo de digestão
ou quantidade de enzima
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Biblioteca genômica
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Biblioteca genômica
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Biblioteca de cDNA
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Síntese decDNA
oligo-dT anela na caudapoly-A.
Síntese da primeira fitade DNA a partir do mRNAem presença datranscriptase reversa
Biblioteca de cDNA
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Sí ntese de cDNA
Remoção da fita original de RNAcom: Calor, alcali ou RNAse H.
Formação de grampo naextremidade 3 e extensão dogrampo com DNA polimerase
S1 nuclease (que corta bases nãopareadas)
Ligação de linkers com DNA ligase eclonagem em um vetor.
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Vetores de
clonagem
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Vetores
São usados para amplificar uma molécula de DNA . ODNA tem que ser inserido em um vetor de clonagem.
Um plasmídio tem uma origem de replicação e é capazde replicar em bactérias.
Os vetores são geneticamente modificados gerando:
- Plasmídeos;
- Fagos;
- Cosmídeos- BACs e
- YACs
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Vetores para bibliotecas de
DNA
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Plasmideos
Plasmideos são circulares,
dupla fita e encontrados em
bactérias.
Podem replicar idependentemente podendo terde poucas bases a 100 Kb.
Pode carrear fragmentos de até 10 kb
Plasmideos tem uma origem de replicação,marcador de seleção e sitios de restrição.
Após cultivo o clone pode ser recuperadofacilmente após a lise das celulas e o
fragmento de DNA ou mantido indefinitamente
em glicerol a 700
C.
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Biblioteca genômica: Bacteriofago
(Lambda) Para clonar insertos de 10 a 20 Kb
Bibiotecas em plasmídeos
comportam insertos de até 10 Kb
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O genoma do Bacteriofago
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Biblioteca Genômica: Bacteriofago
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Biblioteca de Cosmideo
Permite a clonagem defragmentos de até 45 kb
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BACs: Bacterial Artificial Chromosomes
Baseado no
bacteriofago P1, o
Plasmideo F e a região lacZ
do plasmideo pUC
É um plasmideo com
baixo número de cópias
Permite fragmentos
de 50-300kb
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YACs:Yeast Artificial Chromosomes
Permite insertos de até 500 kbs
YACs replicam como plasmideos embacterias quando sem inserto de DNA.
Assim que os fragmentos são inseridos,
YACs são transferidos para células, e
replicam como cromossomos eucarióticos
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Triagem dos clones
de interesse
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Triagem do Clone Recombinante
Biblioteca de Bacteriofagos ou plasmideos
Plaqueamento da Biblioteca
Triagem por:
Sondagem por Hibridização
Sondagem Imunológica
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Hibridização
O DNA em fita simples pode parear com outro DNAou RNA desde que este possua região complementar.
Técnicas que aplicam a hibridização:
± Southern blot: DNA digerido por enzima de restrição éseparado em um e de eletroforese
± Northern blot: usa RNA no gel ao invés do DNA
± Hibridização in situ : usando um tecido ± Hibridização de colonias : detecção de clones
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Processo de hibridização
O
D
NA é aquecido a alta temperatura ou empresença de NaOH e desnatura. As fitascomplementares a sonda anelam. Apóslavagem somente as sondas ligadas ficam.
Estringência: Q ual a necessidade dehomologia perfeita para que as fitas se
mantenham ligadas?DEPENDE DA ESTRINGENCIA
Em BAIXA concentração de salALTA temperatura (Depende da quantidade de
GC)MAIOR a necessidade de complementariedade.
Autorradiografia. Sonda marcadaimpressiona o filme de raioX.
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Processo de hibridização
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Processo de hibridização
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Hibridização com sonda radioativa
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Hibridização com sonda não
radioativa
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Hibridização com sonda não
radioativa
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Sondagem imunológica
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Sondagem imunológica
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Southern hybridization (DNA)
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Triando uma Biblioteca: Hibridização de colônias
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Hibridização de Colônias
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A sonda pode ser sintetizada?
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Triagem de biblioteca Genômica:
II.Colônia ImunoensaioA sonda é um anticorpo, as colônias são crescidas e a proteínarecombinante é expressa
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Triando uma Biblioteca Genômica:
II.Colônia Imunoensaio
A quimioluminescencia também irá impressionar o filme de raio-X
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Biblioteca Genomica: Bacteriofago
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Plaques - Bacteriofago
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Triando uma biblioteca de fago
Fagos recombinantes inseridos em
bactérias são plaqueados resultando
na formação de plaques;
As partículas de fagos e o genoma
do fago são transferidos para umfiltro de nitrocelulose;
O filtro é incubado com uma sonda
radioativa para um determinado gene;
Fago com o gene de interesse é
identificado por autoradiografia e este
clone pode ser isolado e inoculado em
um novo hospedeiro para mais uma amplificação
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