UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA
DEPTO. DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA CURSO DE PÓS GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
ATIVIDADE ANALGÉSICA DAS INTERLEUCINAS 4, 13 E 10 (IL-4, IL-13 E
IL-10) NA DOR INFLAMATÓRIA EXPERIMENTAL: Papel de células residentes e citocinas
MARIANA LIMA VALE
Dissertação apresentada ao Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial para a obtenção do título de Mestre em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. RONALDO DE ALBUQUERQUE RIBEIRO
FORTALEZA 2000
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Dedico este trabalho aos meus pais que sempre me deram a coisa mais importante na minha vida: o amor. Sem o carinho e o incentivo deles nada disso seria possivel.
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[DEUS] "Passei tanto tempo te procurando, não sabia onde estavas. Olhava o infinito, não te via e pensava comigo mesmo: "Será que Tu existes?" Não me encontrava na busca e prosseguia. Tentava te encontrar nas religiões e nos templos. E Tu não estavas. Te busquei através de sacerdotes e pastores e não Te encontrei. Senti-me só e desesperado. Te descri. Na descrença Te ofendi. Na ofensa, tropecei e caí. Na queda, senti-me fraco. Na fraqueza, pedi socorro. No socorro, encontrei amigos. Nos amigos encontrei carinho. No carinho, vi nascer o amor. Com o amor vi um mundo novo. No mundo novo, resolvi doar. Doando, recebi. Recebendo, me senti feliz. Feliz, encontrei a paz. E com paz, foi que Te enxerguei, pois dentro de mim Tu estavas. E sem Te procurar... foi que Te encontrei." -- Anônimo
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Agradecimentos
"O homem só envelhece quando nele os lamentos substituem os sonhos." -- John Barreymore.
Ao Prof. Ronaldo, por ter me orientado e incentivado e a realizar este trabalho e
principalmente pelo exemplo que dá a todos os seus orientandos de competência e
amor ao que faz.
Ao Prof. Fernando de Queirós Cunha pela co-orientação e amizade. Mesmo
estando longe sempre pude contar com a sua presteza e delicadeza em todas as horas,
além de gentilmente ceder as citocinas utilizadas nesse trabalho.
À prof. Gerly Anne por sua paciência e dedicação por nós sempre requisitadas.
Ao prof. Airton por suas idéias e ensinamentos no decorrer de nossa convivência
e deste trabalho.
Às estudantes de iniciação científica: Jaciara e Camila pela grandiosa ajuda
nesse trabalho.
Aos colegas do laboratório que me proporcionaram um ambiente alegre e
descontraido para trabalhar, Milena, Ana Maria, Carlos, Mirna, Renata, Vilma, Veruska,
Nilane, Sabrina, Breno, André, Gurgel, Moisés, Pedro Adriano, Ana Regina.
À nossa técnica de laboratório, Vandinha, tão competente e sempre pronta a nos
ajudar.
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Ao Sílvio pela ajuda com o computador
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia: Sílvia, Marta,
Joana, Sobrinho, Aroldo, Rose, Paulo, pela disposição em sempre me atender a aos
funcionários do Labioratório de Inflamação e Dor de Ribeirão Preto, pelo carinho e
disposicão em me ajudar durante o meu estágio lá.
À Dra. Atemisia pela atenção a mim concedida nas solicitações de animais no
biotério.
Ao CNPq pelo apoio financeiro concedido
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ABREVIATURAS UTILIZADAS NESTE TRABALHO
AAc ácido acético
AMP adenosina monofosfato
AMPc adenosina monofosfato cíclico
ATP adenosina trifos0fato
BK bradicinina
BK1 receptor do tipo B1 da bradicinina
BK2 receptor do tipo B1 da bradicinina
C grupo controle
Ca++ íon de cálcio
Cg Carragenina
C5a Quinto componente do sistema complemento ativado
COX cicloxigenase
COX-1 cicloxigenase constitutiva
COX-2 cicloxigenase induzida
D1 receptor do tipo D1 da dopamina
Db-GMPc dibutiril guanosina monofosfato cíclico
EPM erro padrão da média
g grama
G-CSF Fator estimulador de colônia de granulócitos
GM-CSF Fator estimulados de coloônia de granulócitos e macrófagos
GMP-c Guanosina monofosfato cíclico
H1 Receptor da histamina tipo H1
H2 Receptor da histamina tipo H2
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HOE-140 ([D-Arg1, Thi6, (1,2,3,4-tetrahydroisoquilonin-2-yl-arbonyl)8,
((3as,7as)-octahydroindol-2yl-carbonyl)9]bradykinin
IFN interferon
IFN-α interferon-alfa
IFN-γ interferon-gama
IgE anticorpo IgE
IL-1 Interleucina-1
IL-1ra antagonistas do receptor para IL-1
IL-2 Interleucina-2
IL-3 Interleucina-3
IL-4 Interleucina-4
IL-6 Interleucina-6
IL-8 Interleucina-8
IL-10 Interleucina-10
IL-13 Interleucina-13
ILO iloprost
Kda Quilodalton (s)
kg Kilograma (s)
l Litro
L-NAME L-NG-nitro arginine methyl ester ,
LPS Lipopolissacarídeo de bactéria
LTB4 Leucotrieno B4
LTC4 Leucotrieno C4
MCAF fator ativador e quimiotáxico para monócito,
MHC Complexo de histocompatibilidade maior
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mg miligrama (s)
min minuto (s)
ml mililitro
mm milimetros
MNF Fator nociceptivo secretado por macrófagos
Nº Número
ng Nanograma (s)
NO óxido nítrico
NOS enzima óxido nítrico sintase
NOSi enzima óxido nítrico sintase induzida
NOSc enzima óxido nítrico sintase constitutiva
PBS Solução salina tamponada
PGI2 Prostaciclina
PGE2 Prostaglandina E2
Pkc Proteína-quinase-C
PM peso molecular
r recombinante
Rhu Recombinante humana
RNA Ácido ribonucleico
RNAm Ácido ribonucleico mensageiro
RPMI Meio de cultura RPMI
S Salina
s.c. Subcutâneo
Th2 linfócitos T helper 2
Tg Tioglicolato
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TGF Fator transformador de crescimento
TNF Fator de necrose tumoral
UI Unidade (s) internacional (is)
v/v volume por volume
Zym Zymosan
α alfa
β beta
γ Gama
μg Micrograma
μl Microlitro
ºC Graus Célsius
< menor
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LISTA DE FIGURAS E ILUSTRAÇÕES
ILUSTRAÇÃO 1. A redução da população de células residentes diminui a atividade
nociceptiva do zymosan (ZYM) e do ácido acético (AAc) mas não a do iloptrost
(ILO)................................................................................................14
ILUSTRAÇÀO 2. O pretratamento com tioglicolato aumenta a atividade nociceptiva do
zymosan (ZYM) e do ácido acético (AAc) mas não a do iloptrost
(ILO)...................................................................................................................14
ILUSTRAÇÃO 3. O pré-tratamento crônico com 48/80 diminui a atividade nociceptiva do
zymosan (Zym) e do ácido acético (AAc), mas não a do iloptrost
(ILO)...................................................................................................................17
ILUSTRAÇÃO 4. Metodologia do teste de contorções abdominais..................41
ILUSTRAÇÃO 5. Metodologia do teste de incapacitação articular...................43
ILUSTRAÇÃO 6. Metodologia do teste da placa quente..................................44
ILUSTRAÇÃO 7. Metodologia do influxo de leucócitos para a cavidade
articular..............................................................................................................45
ILUSTRAÇÃO 8. Metodologia da obtenção do sobrenadante de macrófagos estimulados
in vivo com zymosan.....................................................................46
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FIGURA 1. Curva dose-resposta da atividade nociceptiva do ácido acético e zymosan no
modelo de contorções abdominais. ..............................................53
FIGURA 2. Efeito antinociceptivo da interleucina-4 (IL-4) nas contorções abdominais
induzidas por ácido acético ou zymosan. ......................................54
FIGURA 3. Efeito antinociceptivo da interleucina-10 (IL-10) nas contorções abdominais
induzidas por ácido acético ou zymosan. ......................................56
FIGURA 4. Efeito antinociceptivo da interleucina-13 (IL-13) nas contorções abdominais
induzidas por ácido acético ou zymosan........................................57
FIGURA 5. Efeito antinociceptivo da interleucina-4 (IL-4) sobre a incapacitação articular
induzida por zymosan..........................................................................59
FIGURA 6. Efeito antinociceptivo da interleucina-10 (IL-10) sobre a incapacitação
articular induzida por zymosan...................................................60
FIGURA 7. Efeito antinociceptivo da interleucina-13 (IL-13) sobre a incapacitação
articular induzida por zymosan...................................................62
FIGURA 8. Efeito da interleucina-4 (IL-4) sobre o influxo de células na cavidade articular
induzido por zymosan..........................................................................63
12
FIGURA 9. Efeito da interleucina-10 (IL-10) sobre o influxo de células na cavidade
articular induzido por zymosan...........................................................65
FIGURA 10. Efeito da interleucina-13 (IL-13) sobre o influxo de células na cavidade
articular induzido por zymosan...........................................................66
FIGURA 11. Efeito da interleucina-4 (IL-4) sobre o tempo de reação no teste da placa
quente. ....................................................................................................68
FIGURA 12. Efeito da interleucina-10 (IL-10) sobre o tempo de reação no teste da placa
quente.................................................................................................69
FIGURA 13. Efeito da interleucina-13 (IL-13) sobre o tempo de reação no teste da placa
quente.................................................................................................71
FIGURA 14. Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva da interleucina-4 (IL-4)
nas contorções abdominais induzidas por ácido acético.
...........................................................................................................................72
FIGURA 15. Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva da interleucina-10 (IL-
10) nas contorções abdominais induzidas por ácido acético.
...........................................................................................................................74
13
FIGURA 16. Efeito da naloxona na atividade antinociceptiva da interleucina-13 (IL-13)
nas contorções abdominais induzidas por ácido acético.
...........................................................................................................................75
FIGURA 17. Efeito da interleucina-4 (IL-4) na liberação de fator de necrose tumoral - α
(TNF-α) e interleucina-1beta (IL-1β) por macrófagos peritoneais induzidos por
zymosan......................................................................................78
FIGURA 18. Efeito da interleucina-10 (IL-10) na liberação do fator de necrose tumoral –
alfa (TNF-α) e da interleucina-1 beta (IL-1β) por macrófagos peritoneais induzidos por
zymosan....................................................................79
14
RESUMO
Atividade analgésica das interleucinas 4, 13 e 10 (IL-4, IL-13 e IL-10) na dor inflamatória experimental: papel de células residentes e citocinas. Mariana Lima Vale, Dissertação apresentada ao Departamento de fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Farmacologia. Orientador: Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro, Fortaleza, 2000.
Já está estabelecido que a liberação de produtos da cicloxigenase e aminas simpatomiméticas, mediadores finais da dor inflamatória é precedido pela geração, por células residentes, de uma cascata de citocinas. Recentemente dados do nosso laboratório demonstraram que no modelo de contorções abdominais (CA) a ativação dessa cascata é dependente também da presença de células residentes como macrófagos e mastócitos. Dados da literatura apontam algumas citocinas capazes de modular negativamente a função dessas células: IL-4,. IL-10, IL-13, IL-6, TGF-β e IFN-α. Com base nesses dados, o objetivo do presente trabalho foi estudar uma possível atividade analgésica de três citocinas: IL-4, IL-13 e IL-10. Para tanto injetou-se, via ip, IL-4 (1–5ng/animal), IL-13 (0.4-2.5ng/animal) ou IL-10 (0.4-10ng/animal) 30 min antes da administração de zymosan (Zym) ou ácido acético (AAc) para o teste de CA. IL-4 (2.5 e 5ng/animal), IL-13 (1 e 2.5ng/animal) ou IL-10 (2 e 10ng/animal) foi injetada, ip, 30 min antes do Zym (1 mg/animal; intra-articular) e logo após foi medida a incapacitação articular (IA) até a 4ª hora e na 6ª hora foi feita a contagem de leucócitos no fluido articular. As interleucinas estudadas também foram administradas (30 min antes) na dose que melhor inibiu as CA no teste da placa quente (PQ) e em camundongos que haviam recebido ou não a naloxona previamente ao estímulo (AAc) no teste de CA. IL-4 (5 ng/animal) ou IL-10 (10 ng/animal) foi injetada ip 30 min antes do Zym (ip) e após 15 min os animais foram sacrificados e o exsudato peritoneal foi colhido e posto em cultura para a dosagem de IL-1β e TNF-α no sobrenadante. No presente trabalho ficou demonstrado que as interleucinas-4, 13 e 10 são analgésicas tanto no modelo de CA induzidas por AAc (58.7, 89.2, 52% de inibição, efeito máximo, respectivamente, p<0.05) ou Zym (62.6, 61.7, 74.4% de inibição, efeito máximo, respectivamente, p<0.05) como também no modelo de IA induzido por Zym (49.2, 56.6, 69,9% de inibição, efeito máximo, respectivamente, p<0.05). As citocinas estudadas foram capazes de inibir o influxo de leucócitos para a cavidade articular (53.8, 92.1 e 62%, respectivamente - p<0,05). Foi demonstrado que o efeito analgésico parece ser de domínio periférico visto que nenhuma das citocinas modificou o tempo de reação na PQ, teste algesimétrico sensível apenas para drogas que exercem efeito central. Também foi demonstrado que a atividade analgésica das interleucinas testadas não depende da liberação de opióides endógenos, visto que o pré-tratamento com naloxona não foi capaz de reverter a atividade analgésica de nenhuma das interleucinas no modelo de CA. Contudo essa atividade analgésica parece depender da inibição da liberação de citocinas por células residentes visto que IL-4 e IL-10 foram capazes de diminuir a liberação de TNF-α (42 e 41.2% de inibição respectivamente - p<0.05) e IL-1β (61.9 e 80.9% de inibição respectivamente - p<0,05) por macrófagos peritoneais residentes.
15
ABSTRACT
Analgesic activity of interleukines 4, 13 and 10 (IL-4, IL-13 and IL-10) in experimental inflammatory pain: role of resident cells and cytokines – MARIANA LIMA VALE. Dissertation submitted as partial fulfillment of requirement to degree of Master’s in Phrmacology to the graduation Pharmacology course of the Ceará Federal University. Professor: Ronaldo de Albuquerque Ribeiro.
The release of cyclo-oxigenase products and sympathomimetics amines, the final mediators of inflammatory pain, is preceded by the generation of cytokines by resident cells. In recent years a number of cytokines such as IL-4, IL-10, IL-13, IL-6, TGF-β e IFN-α have been described to inhibit the production of TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-8 (cytokines regarded as pró-inflammatory) and possibly to exert their modulatory effect on macrophages and mast cells. Since it is known the capacity of those cytokines to inhibit the production of pro-inflammatory cytokines and the pivotal role of resident cells in the development of inflammatory pain we have decided to test the possibility of IL-4, IL-13 and IL-10 to modulate inflammatory pain. In short, IL-4 (1 – 5ng/animal), IL-13 (0.4 - 2.5ng/animal) or IL-10 (0.4 - 10ng/animal) was given 30 min before acetic acid (AAc) or zymosan (Zym) administration in the writhing model. IL-4 (2.5 e 5 ng/animal), IL-13 (1 e 2.5 ng/animal) or IL-10 (2 e 10 ng/animal) were injected, ip, 30 min before Zym (1 mg/animal; intra-articular) in the rat knee joint incapacitation test up to the 4th hour (the number of leukocytes was determined in the articular exsudate 6 hours later). Doses of those cytokines that exerted maximum effect in the writhing test were also injected 30 min before the hot plate test. These same doses were injected ip before naloxone administration in the AAc-induced writhing model in mice. TNF-α and IL-1β were determined in the supernatant of a macrophage culture which were collected from peritoneal fluid of mice treated with Zym and pre-treated with the cytokines under test. Our results show that interleukins 4, 13 and 10 inhibit writhing response in mice induced by AAc or Zym up to 58.7, 89.2 and 52%, and up to 62.6, 61.7 and 74.4%, respectively (p<0.05). Similar results were observed in the rat knee joint incapacitation test induced by Zym: 49.2, 56.6, 69,9% of inhibition (p<0.05). The same interleukins were able to inhibit Zym-induced leukocyte influx into articular cavity (53.8, 92.1 e 62% of inhibition, respectively - p<0,05). The analgesic activity of IL-4, IL-13 and IL-10 seems to be peripheral, since these cytokines presented no effect in the reaction time of the animals on hot plate test. This antinociceptive effect seems to have no relation with endogen opioid release since naloxone (opioid receptor antagonist) had no effect in reverting the antinociceptive effect of cytokines in the AAc-induced writhing in mice. However, IL-4 and IL-10 inhibit the release of TNF-α (42 e 41.2%, respectively - p<0.05) and of IL-1β (61.9 e 80.9%, respectively - p<0,05) by macrophages stimulated in vivo by Zym, indicating that their antinociceptive activities may be due to the inhibition of those cytokines release by resident cells.
16
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................................
RESUMO.............................................................................................................................
ABSTRACT..........................................................................................................................
I. INTRODUÇÃO...............................................................................................................
1. Dor inflamatória...................................................................................................
1.1. Aspectos gerais.........................................................................................
1.2. Mediadores da dor inflamatória.................................................................
1.2.1. Mediadores hiperalgésicos...................................................................
1.2.2. Mediadores que ativam diretamente o nociceptor................................
1.3. Citocinas e dor inflamatória.......................................................................
1.4. Células residentes e dor inflamtória...........................................................
1.4.1. Macrófagos...........................................................................................
1.4.2. Mastócitos............................................................................................
1.5. Controle periférico da dor inflamatória.......................................................
2. Citocinas que modulam negativamente a resposta inflamatória..........................
2.1. Interleucina-4............................................................................................
2.2. Interleucina-13...........................................................................................
2.3. Interleucina-10...........................................................................................
3. Justificativas e objetivos.......................................................................................
II. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................
1. Animais.................................................................................................................
2. Aparelhos e instrumentos laboratoriais...............................................................
17
3. Drogas, soluções, corantes, citocinas e antisoros................................................
4. Testes nociceptivos.............................................................................................
5. Influxo de leucócitos.............................................................................................
6. Obtenção do sobrenadante de cultura de macrófago..........................................
7. Dosagem de TNF-α e IL-1β em sobrenadante de cultura de macrófagos............
8. Efeito antinociceptivo das interleucinas – 4, 10 e 13 sobre as contorções
abdominais induzidas por ácido acético e zymosan........................................
9. Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva das interleucinas- 4, 10 e
13
10. Efeito antinociceptivo das interleucinas – 4, 10 e 13 sobre a incapacitação
articular induzida por zymosan.......................................................................
11. Efeito das interleucinas –4, 10 e 13 no teste da placa quente........................
12. Efeito das interleucinas –4, 10 e 13 no influxo de leucócitos para a cavidade
articular.............................................................................................................
13. Efeito das interleucinas –4 e 10 na liberação do fator de necrose tumoral
(TNF-α) e de interleucina-1 β (IL-1β) por macrófagos peritoneais de
camundongos estimulados in vivo por
zymosan.....................................................
14. Análise estatística............................................................................................
III- RESULTADOS..............................................................................................................
1. Atividade nociceptiva do ácido acético e do zymosan no modelo de contorções
abdominais..........................................................................................................
2. Bloqueio da atividade nociceptiva do acido acético e zymosan por interleucina-
4 no modelo de contorções abdominais..............................................................
18
3. Bloqueio da atividade nociceptiva do acido acético e zymosan por interleucina-
13 no modelo de contorções abdominais....................................................
4. Bloqueio da atividade nociceptiva do acido acético e zymosan por interleucina-
10 no modelo de contorções abdominais.....................................................
5. Efeito da injeção intraperitoneal de interleucina-4 sobre a atividade nociceptiva
do zymosan no modelo de incapacitação articular em joelho de rato...............
6. Efeito da injeção intraperitoneal de interleucina-13 sobre a atividade
nociceptiva do zymosan no modelo de incapacitação articular em joelho de
rato.
7. Efeito da injeção intraperitoneal de interleucina-10 sobre a atividade
nociceptiva do zymosan no modelo de incapacitação articular em joelho de
rato.
8. Efeito da interleucina-4 sobre o influxo de leucócitos na cavidade articular
induzido por zymosan....................................................................................
9. Efeito da interleucina-13 sobre o influxo de leucócitos na cavidade articular
induzido por zymosan....................................................................................
10. Efeito da interleucina-10 sobre o influxo de leucócitos na cavidade articular
induzido por zymosan....................................................................................
11. Efeito da interleucina-4 sobre o tempo de reação no teste da placa
quente.................
12. Efeito da interleucina-13 sobre o tempo de reação no teste da placa quente.....
13. Efeito da interleucina-10 sobre o tempo de reação no teste da placa quente.
14. Efeito do pré-tratamento com naloxona na antinocicepção obtida pela injeção
prévia de IL-4 nas contorções abdominais induzidas por ácido acético..........
19
15. Efeito do pré-tratamento com naloxona na antinocicepção obtida pela injeção
prévia de interleucina-13 nas contorções abdominais induzidas por ácido
acético.
16. Efeito do pretratamento com naloxona na antinocicepção obtida pela injeção
prévia de interleucina-10 nas contorções abdominais induzidas por ácido
acético.
17. Efeito da interleucina-4 na liberação de TNF-α e IL-1β por macrófagos
peritoneais residentes estimulados in vivo com zymosan..................................
18. Efeito da interleucina-10 na liberação de TNF-α e IL-1β por macrófagos
peritoneais residentes estimulados in vivo com zymosan...........................
IV. DISCUSSÃO...................................................................................................................
V. CONCLUSÃO..................................................................................................................
VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................
20
I. Introdução
21
1. DOR INFLAMATÓTRIA
1.1. Aspectos gerais
A dor nos estados inflamatórios está geralmente associada à presença de
mediadores químicos que são liberados por células não neuronais no local da injúria.
Dependendo da natureza do mediador este poderá apenas sensibilizar, isto é, diminuir o
limiar de ativação do nociceptor, ativar o receptor ou então ambas as coisas. A
sensibilização do nociceptor vem sendo denominada clinicamente como hiperalgesia,
caracterizada pelo abaixamento do limiar a estímulos térmicos, mecânicos ou químicos
na área inflamada. Os receptores descritos geralmente associados à essa sensação de
dor são os polimoidais de alto limiar conectados a fibras C pouco mielinizadas. No
entanto, mais recentemente, foi descrito na literatura a descoberta de receptores que
não podem ser ativados em situações normais, mas apenas em estados inflamatórios.
São pequenas fibras aferentes primárias, não mielinizadas, que não respondem a
estímulos térmicos nem a mecânicos de alta intensidade mas possuem sensibilidade
química, o que os torna responsivos quando uma reação inflamatória acontece. Esses
receptores já receberam denominações como “nociceptores dormentes” ou “aferentes
silenciosos”. Já foi caracterizada a sua presença em várias espécies incluindo rato, gato,
cão e macaco (MCMAHON & KOLTZENBURG, 1990, SHAIBLE E SCHMIDT, 1984;
1985; KOLTZENBURG E MCMAHON, 1986; GRIGG et al., 1986; HANDWERKER et al,
1989; DAVIS et al., 1989). Alguns estão situados em sítios viscerais e em articulações e
podem ser ativados pelos metabólitos da cicloxigenase e aminas simpatomiméticas
para um estado de hiperalgesia. (FERREIRA, 1993).
1.2. Mediadores da dor inflamatória
22
Durante o processo inflamatório várias etapas parecem estar associadas à ação
de substâncias endógenas que modificam fisiológica e bioquimicamente a estrutura do
local afetado. Essas substâncias químicas, geralmente chamadas de mediadores, são
inicialmente liberadas no local da injúria por uma reação de alarme, onde macrófagos
parecem ter um papel crucial (FERREIRA, 1980). Estas células sinalizam a presença de
material estranho ou a injúria através da liberação de mediadores clássicos da
inflamação e/ou de citocinas. Esses mediadores e citocinas recrutam células migrantes
como leucócitos polimorfonucleares, macrófagos, eosinófilos e/ou linfócitos que
possuem um papel amplificador no desenvolvimento da resposta inflamatória. A ação
de mediadores e citocinas em receptores específicos sinalizam a resposta tecidual, os
mecanismos de defesa, e produzem os sintomas da inflamação do qual a dor tem seu
papel particular (FERREIRA, 1993).
Os mediadores associados á dor no processo inflamatório podem ser
classificados em dois tipos: (1) aqueles que causam a sensibilização do nociceptor
(hiperalgésicos) e (2) aqueles que causam a sua ativação direta, provocando a dor
declarada em humanos, ou o comportamento característico em animais experimentais.
1.2.1. Mediadores hiperalgésicos
Os mecanismos associados à hiperalgesia inflamatória vem sendo estudados e
há evidências de que mediadores capazes de aumentar a concentração intracelular de
adenosina monofosfato cíclico (AMPc) e do íon cálcio (Ca++) estão associados com a
sensibilização dos nociceptores. Foi demonstrado que, a administração de dibutiryl
23
AMPc (um análogo de AMPc capaz de atravessar a membrana plasmática) ou Ca++
causa hiperalgesia em pata de rato (FERREIRA & NAKAMURA, 1979a). A mesma
evidência foi suportada por outros autores em outros modelos (FOLLENFANT et al.,
1990; TAIWO et al., 1989). Prostaglandinas e aminas simpatomiméticas (dopamina ou
noradrenalina) são mediadores conhecidos por estimular a síntese de AMPc neuronal e
já foram comprovados como substâncias que causam sensibilização de nociceptores
(WIESENFELD-HALLIN e HALLIN, 1984). Em 1972 FERREIRA demostrou que a injeção
de prostaglandina causa hiperalgesia e que drogas inibidoras da cicloxigenase inibem
esse efeito hiperalgésico. Da mesma maneira, foi demostrado que a injeção de
agonistas adrenérgicos (dopamina, adrenalina, isoprenalina) causava hiperalgesia em
pata de rato e que o pré-tratamento com bloqueadores adrenérgicos foi capaz de inibir
essa hiperalgesia como também aquela induzida por carragenina. Isso comprovou que
além de um componente eicosanoide, há um componente simpático participando da
sensibilização do nociceptor durante o processo inflamatório, provavelmente mediado
pelo receptor D1 da dopamina. No entanto o tipo de receptor envolvido pode variar de
acordo com o modelo experimental e com o tipo de animal utilizado (NAKAMURA &
FERREIRA, 1987). A importância dos dois tipos de mediadores na dor inflamatória foi
suportada por outros autores em outros modelos experimentais como o de contorções
abdominais induzidas por ácido acético e zymosan (DUARTE et al., 1988; Thomazzi,
1996). Em adição, mediadores capazes de estimular a síntese de prostaglandinas ou de
aminas simpatomiméticas são também ditos hiperalgésicos como é o caso de citocinas
como IL-1, TNF-α e IL-8. E ainda, mediadores que estimulam a síntese dessas citocinas
hiperalgésicas como é o caso da bradicinina, também podem entrar nessa mesma
classificação.
24
No entanto, há um outro sistema que parece participar da regulação dos
receptores da dor durante a inflamação, dessa vez aumentando o limiar de
excitabilidade dos nociceptores. O bloqueio direto da hiperalgesia, já instalada, induzida
por prostaglandina E2 (PGE2) foi observado após a administração local de dibutiril
guanosina monofosfato cíclico (Db-GMPc) (FERREIRA & NAKAMURA., 1979b) ou de
substâncias que estimulam a guanilato cilclase neuronal como por exemplo carbacol e
geradores de óxido nítrico (DUARTE et al., 1992). Parece que a regulação funcional de
nociceptores depende do equilíbrio entre as concentrações de AMPc e GMPc.
1.2.2. Mediadores que ativam diretamente o nociceptor
Dentre os mediadores capazes de ativar diretamente o nociceptor, a bradicinina
merece um papel de destaque. A injeção subcutânea de bradicinina, em humanos, vem
sendo há muito tempo associada à manifestação de dor (ARMSTRONG et al., 1953;
SICUTERI et al.; 1965; FERREIRA et al., 1972). Mas também já foi demostrado que
bradicinina em, alguns modelos experimentais, causa um posterior efeito hiperalgésico
demorado. Sugeriu-se que esse efeito hiperalgésico era mediado pela liberação de
prostanoides, pois foi inibido pela administração de indometacina (inibidor da
cicloxigenase), contudo, tal efeito não estava associado à dor declarada (TAIWO &
LEVINE, 1988; STERANKA et al., 1987; 1988).
Como já foi visto, a bradicinina parece ter um duplo papel na modulação da dor,
pois foi descrita como substância capaz de ativar diretamente o nociceptor e como um
mediador hiperalgésico. Isso pode ser explicado pela sua ligação a diferentes tipos de
receptores. Já foram descritos até 4 tipos de receptores para a bradicinina (Bk1 - Bk4)
mas dois deles, Bk1 e Bk2 , merecem destaque na modulação da dor inflamatória. O
25
receptor Bk2 foi associado com a ativação direta de fibras aferentes finas que foram
descritas como condutoras de estímulos da nocicepção (STERANKA e BURCH, 1991;
FARMER e BURCH, 1992). Entretanto, em um estudo mais recente, esse receptor foi
associado também à sensibilização do nociceptor, mediada pela liberação de uma
cascata de citocinas que irão estimular a liberação de produtos da cicloxigenase e de
aminas simpatomiméticas (FERREIRA et al., 1993), tema que será abordado
posteriormente. Então o receptor Bk2 já foi associado com nocicepção e com
hiperalgesia. Através do receptor Bk1 foi demonstrado a participação da bradicinina na
ativação direta do nociceptor. O antagonista para esse receptor da bradicinina foi capaz
de inibir a fase imediata do teste da formalina em camundongos (SHIBATA et al., 1989;
CORREA E CALIXTO, 1993). Mais recentemente (1997), TONUSSI e FERREIRA,
usando antagonistas específicos para cada tipo de receptor, demonstraram, no modelo
de incapacitação articular em ratos, que bradicinina induzia a sensibilização do
nociceptor através dos receptores Bk2 e que a ativação do nociceptor se devia à sua
ação em receptores Bk1.
Histamina, um mediador inflamatório conhecido, parece também estar associado
à resposta dolorosa. Encontra-se principalmente estocada em grânulos no interior de
mastócitos e é um dos principais mediadores da resposta alérgica. É liberada também
durante a reposta inflamatória e parece participar da dor inflamatória por ativar
diretamente o nociceptor. Entretanto, sua liberação está associada principalmente com
a sensação de prurido (FERREIRA et al., 1990). Além da histamina e da bradicinina
outros mediadores parecem também participar da ativação das terminações nociceptivas
durante a inflamação dentre eles: serotonina, substância P, adenosina trifosfato (ATP) e
prótons (RANG et al., 1991).
26
Em muitos caso a ativação do receptor por esses mediadores, para manifestação
de dor, só é possível mediante a sensibilização prévia por mediadores hiperalgésicos.
Dentre esses mediadores hiperalgésicos as citocinas merecem destaque.
1.3. Citocinas e dor inflamatória
Citocinas são polipeptídeos simples, ou glicopeptídeos, de peso molecular menor
ou igual a 80 kDa, com propriedades pleiotrópicas e regulatórias. São produzidas e
secretadas por diversos tipos célulares em resposta a uma infinidade de estímulos, para
agir em receptores específicos presentes em células alvo. Como são substâncias com
diversas funções regulatórias, tais moléculas não são produzidas de maneira contínua.
A sua produção é induzida ou suprimida por estímulos aos quais o organismo precisa
responder. Os vários tipos de citocinas incluem as interleucinas (IL), os fatores de
necrose tumoral (TNF), os interferons (IFN), os fatores estimulante de colônia da medula
óssea e uma variedade de outros fatores de crescimento (fatores de crescimento
derivados de fibroblastos , da epiderme e das plaquetas) (HOPKINS, 1990).
Alguns estudos tem demonstrado que citocinas podem influenciar a direção de
uma resposta imune por mecanismos parácrinos, endócrinos e autócrinos. A capacidade
que possuem de exercer efeito local, regional e sistêmico é um ponto importante da
biologia dessas substâncias, pois demonstra o papel fisiopatológico desses
mediadores na doença. A elevação da temperatura, indução de sono e supressão do
apetite são todas manifestações sistêmicas de doença, porém, isso pode representar
apenas alterações dos níveis de citocinas que normalmente controlam a nossa fisiologia
circadiana. Um aumento dos níveis de citocinas que estão associadas com a inflamação,
pode concomitantemente ativar células inflamatórias e alterar a fisiologia normal. Ambos
27
os eventos podem ser importantes no combate à doença através dos mecanismos de
defesa. Em adição, os efeitos sistêmicos associados com inflamação severa podem ser
exercidos pela produção exagerada de citocinas e pela manutenção dessa produção
pelas próprias citocinas (KUNKEL et al., 1991).
Uma citocina tende a ter múltiplas células alvo e múltiplas funções, no entanto,
citocinas diferentes podem ter ações similares. A exposição de células a duas ou mais
citocinas diferentes pode levar a respostas qualitativamente diferentes. Além disso uma
citocina pode aumentar (ou diminuir) a produção de outra citocina (ou dela mesma) ou a
expressão de receptores para outra citocina e assim resultar em ações indiretas. Um
exemplo disso seria a demonstração da ação mitogênica da IL-1 em timócitos murinos,
uma das primeiras descobertas nesse sentido. Essa ação mitogênica envolve a
estimulacão da produção de IL-2 por IL-1, sendo IL-2 a verdadeira molécula efetora
responsável pela estimulação da proliferação de timócitos (SMITH et al., 1980). Esse
efeito estimulatório de IL-1 na produção de IL-2 e o papel dessa interação na
proliferação de células T, tornou-se um paradigma para as ações de muitas outras
citocinas. Após isto, descobriu-se que IL-1 também é capaz de estimular a produção de
IL-6 (CONTENT et al., 1985), GM-CSF (ZUCALI et al., 1986), IL-8 (MATSUSHIMA et al.,
1989), e o fator ativador e quimiotáxico para monócito, MCAF (LARSEN et al., 1989) em
vários tipos celulares. Todas essas citocinas são também induzidas por TNF o que está
em consonância com as inúmeras similaridades vistas entre as ações de IL-1 e TNF (LE
E VILCEK, 1987, NETA et al., 1992). Em monócitos tanto TNF como IL-1 agem como
agentes estimulatórios com resposta individual, e em adição, eles estimulam a produção
um do outro, o que amplifica a resposta individual de ambos (NETA et al., 1992).
A participação dessas citocinas na dor inflamatória foi estudada e observou-se a
sua importância na hiperalgesia inflamatória. Como já foi dito, a hiperalgesia parece ser
28
causada pela ação de mediadores liberados por duas vias distintas: a hiperalgesia
causada por eicosanoides e a hiperalgesia causada por simpatomiméticos. Após essas
confirmações, foi demonstrado que a liberação de produtos da cicloxigenase e de
aminas simpatomiméticas é subsequente à liberação IL-1β (FERREIRA et al., 1988) e de
IL-8 (CUNHA et al., 1991) respectivamente, o que foi evidenciado no modelo de
hiperalgesia mecânica em pata de rato (Randall-Selitto modificado por FERREIRA et al.,
1978). Nesses estudos, a hiperalgesia induzida por IL-1β foi bloqueada por indometacina
(inibidor da ciloxigenase), mas não por drogas simpatolíticas (propanolol, atenolol ou
guanetidina), enquanto que a hiperalgesia induzida por IL-8 foi bloqueada pelo pré-
tratamento com simpatolíticos mas não por indometacina. Ademais, a hiperalgesia
induzida por carragenina foi parcialmente bloqueada por ambos os tipos de drogas
(CUNHA et al., 1991). Sabendo da capacidade de várias citocinas em induzir a sua
própria produção e a produção de outras citocinas como: TNF-α que induz a produção
de IL-1 (DINARELLO et al., 1986), IL-1 que induz a produção de IL-1 (DINARELLO et al.,
1987), IL-6 (VAN DAMME et al., 1987), e IL-8 (STREITER et al., 1989), esses mesmos
autores (CUNHA e colaboradores), em 1992a, demostraram um papel central para o
TNF-α na modulação da hiperalgesia induzida por carragenina no mesmo modelo
experimental. Foi proposto que TNF-α ativa uma cascata de liberação de citocinas. A
indução da liberação de IL-8 por TNF-α leva à hiperalgesia mediada por
simpatomiméticos, e a indução de IL-1β e IL-6 por TNF-α leva à hiperalgesia mediada
por produtos da cicloxigenase. Isso foi confirmado pelo fato de que a injeção de TNF-α
mimetizou a capacidade da carragenina em induzir a produção de IL-1β, IL-6 e IL-8 e
também pelo fato de que uma única injeção com o anticorpo anti-TNF-α foi capaz de
abolir esse efeito da carragenina (CUNHA et al., 1992a). As mesmas evidências foram
29
demonstradas no modelo de contorções abdominais (DUARTE et al., 1988; Thomazzi,
1996).
Mais tarde, ficou-se sabendo que a cascata de citocinas promovida por TNF-α na
hiperalgesia inflamatória, em alguns casos, era subsequente à ação da bradicinina,
dependendo da intensidade e do tipo de estímulo. Isto foi demonstrado por FERREIRA e
colaboradores (1993) em experimentos onde o pre-tratamento de animais com HOE-
140, um antagonista seletivo para o receptor Bk2 da bradicinina, foi efetivo em bloquear
hiperalgesia induzida por carragenina, mas não foi capaz de bloquear a hiperalgesia
induzida por TNF-α. Além disso, ao se pré- tratar os animais com um antisoro específico
para TNF-α (anti-TNF-α) a hiperalgesia induzida por bradicinina ficou bastante reduzida,
sugerindo que bradicinina estaria induzindo a liberação de TNF-α. Em adição, a
hiperalgesia induzida por altas doses de LPS não foi inibida por HOE-140, propondo que
se o estímulo hiperalgésico é de magnitude suficiente, a cascata de citocinas pode ser
acionada independentemente da estimulação do receptor Bk2 (FERREIRA et al, 1993).
Bradicinina pode não só iniciar a cascata de mediadores mas também contribuir para a
manutenção dessa cascata e da injúria através dos receptores Bk1, receptores que são
ativados por IL-1β mas não por TNF-α, demonstrado em modelos de hiperalgesia
térmica e mecânica (PERKINS & KELLY, 1993; DAVIS & PERKINS, 1994). Foi proposto,
então, que receptores Bk2 participariam da fase inicial da resposta dolorosa inflamatória
e Bk1 manteria o estado doloroso (DRAY & PERKINS, 1993). No modelo de contorções
abdominais também foi demostrado o papel inicial da bradicinina, a qual mesmo em
doses altas não foi capaz de induzir resposta nociceptiva, porém, a administração prévia
de HOE-140 diminui as contorções induzidas pela associação de TNF-α, IL-1 e IL-8
(THOMAZZI, 1996).
30
Outro mecanismo importante no extenso mundo de ações das citocinas é a
modulação da expressão de seus receptores. Um dos modelos mais estudados envolve
a indução, por IL-1, da expressão do receptor de alta afinidade por IL-2 em células T
(KAYE et al., 1984; LOWENTHAL et al., 1986). Outas citocinas como TNF e IL-6 (NOMA
et al., 1987; LOWENTHAL et al., 1989) também podem alterar a expressão do receptor
para IL-2, mas não tão eficientemente quanto IL-1.
Há também relatos não tão numerosos quanto ao das ações estimulatórias mas
evidências crescentes de que algumas citocinas também tem ações inibitórias sobre a
produção de outras citocinas. Esse assunto será abordado em detalhes adiante.
1.4. Células residentes e dor infamatória
1.4.1. Macrófagos
Mácrófagos tradicionalmente são associados com inflamação crônica. Na
verdade, são residentes nos tecidos e constituem as células de alarme do organismo
(FERREIRA et al.,1980). São hábeis em reconhecer o não próprio e com isso promover
a sinalização do processo inflamatório. Eles fazem isso através da liberação de
mediadores como prostaglandinas ou através da liberação de citocinas, substâncias que
agem tanto no local como sistemicamente. São células altamente secretórias. Seus
produtos, ao todo, mais de 100 descritos, incluem enzimas, inibidores enzimáticos,
proteínas do sistema complemento, proteínas regulatórias tipo IL-1, IL-8, IL-6, fator
transformador de crescimento-β (TGF-β), além dos derivados do ácido araquidônico
(TAKAEMURA & WERB, 1984; NATHAN, 1987; ADAMS & HAMILTON, 1988). A maioria
dessas moléculas são importantes na reação inflamatória, sendo que, a secreção de
31
muitas delas depende do estado metabólico do macrófago o que por sua vez depende
da interação do mesmo com seu microambiente (NATHAN , 1987).
Já foi descrito que macrófagos estimulados com lipopolissacarídeo derivado de E.
Coli (LPS) liberam, em cultura, um fator com um PM maior que 10 kDa que quando
injetado intraperitonealmente, em camundongos, é capaz de induzir contorções
abdominais. Essa substância, liberada por monocamadas de macrófagos, foi
denominada fator nociceptivo derivado de macrófago (MNF) (CAMPOS et al., 1988).
Posteriormente a esses achados, foi demonstrado que o MNF não é um produto da
cicloxigenase, visto que inibidores dessa enzima, como indometacina ou paracetamol,
não afetam a sua liberação. Foi sugerido então, que o MNF é um composto proteico, e
que sua atividade é devido à presença de citocinas como IL-1, IL-8 e TNF-α (THOMAZZI
et al., 1997), já descritas como componentes do sobrenadante de macrófagos
estimulados com LPS usado na preparação desse fator (RIBEIRO et al., 1993; 1995).
Em adição, a indução de contorções abdominais por MNF foi inibido pelo pré-tratamento
dos animais com indometacina, paracetamol, guanetidina e atenolol, indicando que a
sua atividade nociceptiva resulta da inducão da liberação de produtos da cicloxigenase e
de simpatomiméticos pelas citocinas supracitadas (THOMAZZI et al., 1997).
A importância da presença de células residentes, como macrófagos, no local da
injúria para a sinalização dos eventos da resposta inflamatória já foi descrita. Alguns
achados nesse sentido demonstram que a intensidade de neutrófilos que migram para a
cavidade peritoneal de animais estímulados com carragenina, zymosan e LPS
(estímulos exógenos) ou com IL-1 e TNF-α (estímulos endógenos) é proporcional ao
número de macrófagos residentes presente nessa cavidade (FACCIOLLI et al., 1990;
CUNHA & FERREIRA, 1986; DE SOUZA & FERREIRA, 1985; SOUZA et al, 1988). Na
dor inflamatória a presença dessas células parece ser crucial da mesma forma. O nosso
32
laboratório tem demonstrado, nos últimos anos, a importância de macrófagos residentes
na nocicepção induzida por estímulos como ácido acético e zymosan no modelo de
contorções abdominais. Alguns resultados, com a nossa participação inclusive,
demonstram que a depleção de células residentes da cavidade peritoneal, por lavagem
prévia, diminui significativamente a atividade nociceptiva do ácido acético e do zymosan
(ver ilustração 1) mas não a do iloprost (análogo estável da PGI2). Quando aumentamos
a população de macrófagos, através do pré-tratamento dos animais com tioglicolato (ver
ilustração 2), aumentam-se também o número de contorções induzidas por esses
estímulos (THOMAZZI, 1996, RIBEIRO et al, 2000a).
A B C D
C L0
20
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ILUSTRAÇÃO 1. A redução da poulação de células residentes diminui a atividade nociceptiva do zymosan (ZYM) e do ácido acético (AAc) mas não a do iloptrost (ILO). Painel A: número de células residentes peritoneais em
animais controles sham (C) e em animais submetidos à lavagem da cavidade peritoneal (L). Painel B, C e D: número
de contorções abdominais induzidas por iloprost (ILO, 1 μg/cavidade), zymosan (ZYM 1 mg/cavidade) ou ácido acético
(AAc, 0.6%) respectivamente, em animais sham (C) e em animais submetidos á lavagem da cavidade peritoneal (L). O
número de contorções foi contado em uma periodo de 30 minutos após a injeção do estímulo e os resultados são
expressos como média + EPM do número de animais por grupo indicado no topo de cada coluna. *p<0.05 (RIBEIRO et
al., 2000a).
33
A B C D
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ILUSTRAÇÃO 2. O pretratamento com tioglicolato aumenta a atividade nociceptiva do zymosan (ZYM) e do ácido acético (AAc) mas não a do iloptrost (ILO). Painel A: número de células residentes peritoneais em animais
pré-tratados com salina (C) e em animais pré-tratados com tioglicolato (Tg). Painel B, C e D: número de contorções
abdominais induzidas por iloprost (1 μg/cavidade), zymosan (1 mg/cavidade) ou ácido acético (0.6%) respectivamente,
em animais pré-tratados com salina (C) e em pré-tratados com tioglicolato (Tg). O número de contorções foi contado
em uma periodo de 30 minutos após a injeção do estímulo e os resultados são expressos como média + EPM do
número de animais por grupo indicado no topo de cada coluna. *p<0.05 (RIBEIRO et al., 2000a).
Além disso, como já foi descrito na literatura, macrófagos estimulados com LPS
liberam várias citocinas dentre elas IL-1, IL-8 e TNF-α, as quais promovem hiperalgesia
(CUNHA et al., 1991; CUNHA et al.,1992a). Essas citocinas, quando injetadas juntas,
induzem contorções abdominais em camundongos, enquanto que o pré-tratamento com
antisoros específicos contra essas citocinas bloqueia a atividade nociceptiva desses dois
estímulos no modelo de contorções abdominais em camundongos (RIBEIRO et al.,,
2000a).
1.4.2. Mastócitos
Os mastócitos são células capazes de secretar e produzir mediadores que podem
modificar eventos vasculares e celulares. Exercem um importante papel não só em
34
reações alérgicas mas também em inúmeros processos inflamatórios. Frente a um
estímulo inflamatório, mastócitos liberam mediadores (i) alguns pré- formados,
estocados em grânulos, como: histamina, serotonina, proteases, heparina e TNF
liberados imediatamente na presença do estímulo; (ii) outros sintetizados apartir do
metabolismo de lipídeos da membrana (prostaglandinas, leucotrienos e fator de ativação
plaquetária) que são liberados em poucos minutos; (iii) e também são capazes de
produzir citocinas dentre elas: IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8 e TNF. Além disso são
capazes de liberar óxido nítrico (MANNAIONI et al, 1991; BISSONNETTE et al, 1991;
SALVEMINI et al, 1990; MASINI et al, 1991).
A produção de citocinas por mastócitos não é uma mera resposta aguda à
ativação celular mediada por IgE, ela persiste por várias horas após a ativação por uma
variedade de estímulos incluíndo produtos bacterianos e prostanóides. A produção de
algumas citocinas por mastócitos não está necessariamente associada à liberação de
mediadores pré-formados, e pode ser um importante componente na patogênese de
doenças inflamatórias como a asma e artrite reumatóide (MARSHALL et al., 1996).
Mastócitos também devem contribuir para a migação de neutrófilos, pois
camundongos WBB6F1-W/Wv (W/Wv) deficientes de mastócitos mostraram uma
significante redução da migração de neutrófilos, que se segue à injeção de zymosan,
quando comparados com controles apropriados (cepa WWB6F1-+/+) (RAO et al, 1994).
Além disso, a migração de neutrófilos induzida por IL-8 ou leucotrieno B4 (LTB4)
depende do número da população de mastócitos residentes presentes no sítio do
estímulo (RIBEIRO et al., 1991; RIBEIRO et al., 1997).
Mastócitos são uma parte constitutiva do eixo neuroimmune e já foi mostrado,
através de microscopia eletrônica, que essas células estão intimamente associadas com
fibras contendo neuropeptídeos como substância P e o peptídeo relacionado ao gene da
35
calcitonina (CGRP) (STEAD et al., 1989) conhecido por estar envolvido na fisiopatologia
da dor (MAYER et al., 1994) via regulação da secreção de mediadores por mastócitos
humanos (LOWMAN et al., 1988).
Mastócitos residentes da cavidade peritoneal parecem importantes no
desenvolvimento da resposta dolorosa. Dados recentes do nosso laboratório, com a
nossa participação, mostram que a depleção de mastócitos peritoneais de camundongos
pelo pré-tratamento com o composto 48/80 diminui significantemente a atividade
nociceptiva do ácido acético e do zymosan no modelo de contorções abdominais
(RIBEIRO et al., 2000a).
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ILUSTRAÇÃO 3. O pré-tratamento crônico com o composto 48/80 diminui a atividade nociceptiva do zymosan (ZYM) e do ácido acético (AAc), mas não a do iloprost (ILO). Painel A: número de mastócitos
peritoneais em animais controles pré-tratados com salina (C) e em animais submetidos ao pré-tratamento com o
composto 48/80 (48/80). Painel B, C e D: número de contorções abdominais induzidas por iloprost (1 μg/cavidade),
zymosan (1 mg/cavidade) ou ácido acético (0.6%) respectivamente, em animais controles pré-tratados com salina
(C e em animais submetidos ao pré-tratamento com 48/80 (48/80). O número de contorções foi contado em uma
periodo de 30 minutos após a injeção do estímulo e os resultados são expressos como média + EPM do número
de animais por grupo indicado no topo de cada coluna. *p<0.05 (RIBEIRO et al., 2000a).
36
1.5. Controle periférico da dor inflamatória
Em 1993, Ferreira fez uma classificação do controle terapêutico periférico da dor
inflamatória. Tomando como base as diferentes propriedades farmacológicas dos
mediadores da dor tipo a capacidade de ativação direta do nociceptor e a sensibilização,
os agentes inibidores da resposta dolorosa foram classificados como: (1) inibidores da
ativação direta do nociceptor (2) agentes que previnem o desenvolvimento da
hiperalgesia e (3) agentes que inibem a hiperalgesia já instalada.
1. Inibidores da ativação direta do nociceptor. Esse primeiro grupo de substâncias
agem impedindo a ativação direta do nociceptor por antagonismo direto no receptor ou
pelo bloqueio do estímulo excitatório. Os agentes antihistamínicos, por exemplo, estão
nesse grupo por antagonizar os efeitos da histamina nos receptores H1 que estão
associados geralmente com uma classe especial nociceptores que manifestam a
sensação de prurido (FERREIRA, 1972) e nos receptores H2 por bloquear a produção de
ácido, eliminando assim a estimulação química dos nociceptores associados com a
úlcera gástrica e a sensação de queimação. Bloqueadores do sistema simpático também
podem ser encaixados nesse grupo. Já está descrito que o bloqueio regional com
antagonistas α-adrenérgicos como a fentolamina é efetivo em aliviar a dor declarada em
humanos (CODERRE et al., 1984). Assim como os anestésicos locais também estão
incluídos nesse grupo por serem capazes de bloquear o estímulo excitatório.
2. Agentes capazes de prevenir o desenvolvimento da hiperalgesia. Nesse
segundo grupo podemos citar as drogas bloqueadoras da cicloxigenase (COX). A
descoberta nos primeiros anos da década de 70 de que a aspirina e drogas relacionadas
37
eram analgésicas e antiinflamatórias por inibir a síntese de prostaglandinas, abriu
inúmeros campos de pesquisa nessa área (Vane, 1971). Por muitos anos se pensou que
a enzima responsável pela síntese de prostaglandina, COX, era expressa
constitutivamente em todos os tecidos e que a sua sensibilidade variada aos
antiinflamatórios não esteroidais (AINES) assim como suas ações variadas nos
diferentes órgãos era devido à isoformas da enzima. No entanto, em 1991, Needleman e
seu grupo descreveram que lipopolissacarídeo bacteriano era capaz de aumentar a
síntese de prostaglandinas em monócitos humanos in vitro (FU et al., 1990) e em
macrófagos murinos peritoneais in vivo (MASFERRE et al., 1990). O aumento de
prostaglandinas foi inibido pela dexametazona e foi associado com a síntese de uma
nova proteína para COX. Mais ou menos um ano depois, uma forma induzida de COX foi
identificada como isoforma distinta. Foi denominada de COX-2 e codificada por um gene
diferente da enzima constitutiva (COX-1) (XIE et al., 1991; O’BANION et al., 1991;
KUJUBU et al., 1992; SIROIS et al., 1992).
A COX-2 é normalmente indetectável na maioria dos tecidos, no entanto na
presença de um processo inflamatório, pode ser induzida por citocinas inflamatórias
como IL-1β e TNF-α em células residentes e naquelas recrutadas para o foco
inflamatório (SEIBERT et al., 1994; BAKHLE et al, 1996).
O envolvimento da COX-2 na hiperalgesia inflamatória já foi demonstrado por
FERREIRA et al. (1999). Ácido araquidônico, quando injetado em patas de ratos no
modelo modificado do teste de Randall-Sellito (FERREIRA et al., 1978), não é capaz de
provocar hiperalgesia, no entanto potencia a hiperalgesia induzida por IL-1 ou
carragenina (ambos conhecidos por induzir COX-2). Em adição, o ácido araquidônico
não foi efetivo em potenciar a hiperalgesia induzida por IL-8, citocina envolvida na
estimulação da liberação de aminas simpatomiméticas, ou pela administração direta de
38
PGE2 (FERREIRA et al., 1999). Novas drogas vem sendo decobertas seletivas para
COX-2, como o meloxicam dentre outras, e a sua importância está na diminuição dos
efeitos colaterais presentes com as drogas não seletivas.
Outros agentes capazes de prevenir a hiperalgesia são os inibidores da
fosfolipase A2 (glicocorticoides), que além de inibir a liberação de produtos da
cicloxigenase também inibem a expressão de citocinas (SHIMMER e PARKER, 1996;
WAAGE & BAKK, 1988; KERN et al., 1988) dentre estas as hiperalgésicas que já foram
comprovadas participar da dor inflamatória pela estimulação das duas vias de
sensibilização dos nociceptores (eicosanoide e simpática).
Outra forma de evitar a sensibilização do nociceptor seria inibir a produção de
citocinas hiperalgésicas. A exemplo disso podemos citar drogas capazes de inibir a
produção de TNF-α, a citocina de papel central e iniciadora da cascata de citocinas
hiperalgésicas liberadas durante o processo inflamatório. Talidomida, uma droga que era
usada como sedativa, imunossupressora e antiinflamatória, foi proscrita por seus efeitos
teratogênicos. Atualmente vem sendo usada na terapia do eritema nodoso da lepra. Em
um período recente foi descoberto que o mecanismo de ação dessa droga era a inibição
da produção de TNF-α (MOREIRA et al., 1993). Desde então alguns trabalhos vem
demonstrando o potente efeito antiinflamatório da talidomida em modelos experimentais
e em pacientes humanos, pela sua capacidade de inibir a produção de TNF-α. Dados
nossos mostram que talidomida também possui efeito antinociceptivo e
antihiperalgésico. Utilizando o modelo de hiperalgesia Randal-Selitto modificado, foi
demonstrado que talidomida bloqueia a hiperalgesia induzida por carragenina,
bradicinina mas não a por TNF-α e que essa inibição só é conseguida quando a droga é
dada antes do estímulo. No modelo de contorções abdominais a talidomida também
inibiu a nocicepção causada por ácido acético e zymosan (RIBEIRO et al, 2000b).
39
Outra droga, pentoxifilina, um inibidor de fosfodiesterase também foi descrita
como inibidora da síntese de TNF-α in vitro e in vivo (STRIETER et al., 1988; ZENI et al.,
1996). Além de inibir outras citocinas como IL-1, IL-6 e IL-8, pentoxifilina também
aumenta a produção de IL-10 (citocina com propriedades inibitórias sobre macrófagos).
Dados do nosso laboratório não publicados mostram que pentoxifilina também exerce
antinocicepção no modelo de contorção abdominal e de hiperalgesia mecânica em pata
de rato.
A depleção de aminas simpatomiméticas por drogas como guanetidina e o
bloqueio de receptores por antagonistas β-adrenérgicos (atenolol e propanolol) ou
dopaminérgicos (SCH 23390) também previne sensibilização do nociceptor, foi o que
demonstrou NAKAMURA & FERREIRA (1987) no modelo de hiperalgesia no teste de
Randall-Selitto modificado.
3. Agentes que inibem a hiperalgesia já instalada. Uma dúvida fundamental a ser
respondida seria a de que se depois de já instalada a hiperalgesia pode ser inibida.
Quando o nociceptor está estimulado, como acontece durante a hiperalgesia, drogas
tipo aspirina, que previnem o desenvolvimento da hiperalgesia, não promovem analgesia
imediata. Em outras palavras, drogas que só previnem a ação de mediadores que
causam a sensibilização do nociceptor não são efetivas em promover analgesia imediata
quando o estímulo já foi deflagrado. No entanto, a dessensibilzação de nociceptores foi
demostrada quando se estimula a guanilato ciclase neuronal. A descoberta da via L-
arginina/óxido nítrico/GMPc (MURAD, 1986; MURAD et al, 1986; PALMER et al, 1987)
estimulou a invesigação da participação do óxido nítrico na regulação da resposta
dolorosa.
O óxido nítrico (NO), molécula derivada do oxigênio molecular e do nitrogênio do
grupamento guanidino do aminoácido L-argenina, está envolvida em uma variedade de
40
processos fisiológicos e patológicos (MONCADA et al., 1991). A sua formação é
catalisada pela enzima óxido nítrico sintase (NOS), que foi descrita existir sobre a forma
constitutiva (NOSc) e sobre a forma induzida (NOSi) (FUKUTO et al., 1995). A forma
induzida é detectada em células somente após a exposição a agentes inflamatórios
como citocinas e endotoxinas. As atividades tumoricida e microbicida de macrófagos são
dependentes da produção em massa de NO pela NOSi, por essas células. NOSi ainda
contribui para a falência cardiovascular no choque endotoxêmico, assim como para as
lesões dos tecidos em doenças inflamatórias e para o dano neural. (WONG et al., 1996;
WRIGTH et al., 1992).
Há relatos na literatura sugerindo que a inibição de NO causa analgesia. Foi o
que demostrou o trabalho de MOORE e colaboradores (1991). Onde foi observado que o
inibidor da síntese de NO, L-NG-nitro argenine methyl ester (L-NAME), exerce atividade
analgésica tanto em modelos de dor periférica como de dor central. Dados do nosso
laboratório também mostram essa atividade analgésica do L-NAME no modelo de
incapacitação articular em ratos (ROCHA, 1999). A despeito disso, algumas evidências
apontam o NO como um modulador negativo da dor. Já foi demostrado a participação do
NO causando analgesia periférica devido à sua capacidade aumentar dos níveis de
GMPc em neurônio sensoriais primários (DUARTE et al., 1992; FERREIRA et al., 1991).
Recentemente FERREIRA e colaboradores (1999) demostraram que doadores de NO
bloqueiam a hiperalgesia induzida por PGE2 no modelo de Randal-selitto modificado e
que o azul de metileno (inibidor da guanilato ciclase) reverte esse efeito hiperalgésico
mas L-NMMA não. Mostrando que esse efeito antihiperalgésico do NO deve-se a
ativação da guanilato-ciclase. Drogas que estimulam a produção de óxido nítrico
consequentemente também exercem efeito antinociceptivo por estimular a guanilato
ciclase. Foi proposto que opiódes periféricos (FERREIRA et al., 1991) assim como
41
analgésicos conhecidos como dipirona e diclofenaco (LORENZETTI et al., 1996;
DUARTE et al., 1992; TONUSSI & FERREIRA, 1994) causam analgesia por estimular a
via L-arginina/NO/GMPc. Essas propostas foram baseadas nas observações de que o
efeito analgésico desses compostos é bloqueado por L-NMMA (inibidor da síntese de
NO) e azul de metileno (inibidor da guanilato ciclase) e é potenciado por inibidores da
fosfodiesterase do GMPc.
2. CITOCINAS QUE MODULAM NEGATIVAMENTE A RESPOSTA INFLAMATÓRIA Vem tornando-se cada vez mais importante a inibição de citocinas que participam
da resposta inflamatória e da dor inflamatória por estas serem de fundamental
importância para o desenvolvimento de ambas. .Muitos estudos vem utilizando inibidores
como o antagonistas do receptor para IL-1 (IL-1ra) ou proteínas ligantes para TNF ou IL-
1, como os seus receptores solúveis para esse fim. Outros trabalhos utilizando citocinas
que inibem a síntese de TNF e IL-1, dentre outras citocinas pró-inflamatórias, como
também citocinas que promovem a produção de seus inibidores naturais, mostraram que
a resposta inflamatória tem moduladores negativos endógenos, servindo como um freio
para a inflamação. Essas citocinas tem a vantagem de inibir tanto a síntese de IL-1 e
TNF como a de outras citocinas e mediadores. Na lista de citocinas que possuem essas
propriedades inibitórias estão: IL-4,. IL-10, IL-13, IL-6, TGF-β e IFN-α. No presente
trabalho procuramos dar destaque a IL-4, IL-10 e IL-13.
2.1. INTERLEUCINA-4
- Propriedades biológicas
42
IL-4 é uma glicoproteina pleiotrópica constituida de 129 aminoácidos (YOKOTA
et al., 1986) de peso molecular aproximado 20 kDa. Seu receptor é expresso em
pequena quantidade em vários tipos de células: linfócitos B e T, monócitos, granulócitos,
fibroblastos, células epiteliais e endoteliais (CABRILLAT et al., 1987; PARK et al., 1987).
É produzida linfócitos Th2, mastócitos, basófilos células da medula óssea (DE WAAL
MALEFYT et al, 1995 ; PAUL & OHARA, 1987). Dentre suas atividades podemos citar a
proliferação de linfócitos T e natural killer, ativação, diferenciação e proliferação de
linfócitos B, revisto por MIZEL e colaboradores (1989). Além da estimulação da atividade
tumoricida de macrófagos in vitro (CRAWFORD et al, 1987) e in vivo (TEPPER et al,
1989), aumenta a capacidade de fagocitose do parasita Trypanossoma cruzi por essa
célula (WIRTH et al, 1989). IL-4 também inibe células Th1 e diminui hipersensibilidade
tardia em amimais experimentais e em humanos (ROCKEN et al., 1996; ZURAUWSKI et
al, 1994).
- Atividade antiinflamatória
Atualmente muitos estudos vem demonstrando a atividade antiinflamatória dessa
citocina. Em 1990 MCBRIDE e colaboradores demostraram sua atividade inibitória sobre
a produção de TNF, por macrófagos murinos, induzida por LPS e IL-2 in vitro e in vivo.
IL-4 tanto inibe a produção de IL-1 como aumenta a produção de IL-1ra por monócitos
humanos induzidos por LPS (VANNIER et al., 1992) e por neutrófilos (COLOTTA et al.,
1993). IL-4 inibe a produção de mediadores pró-inflamatórios por monócitos (HART et al,
1989; ESSNER et al, 1989; DONNELLY, 1990) assim como também a produção de IL-
1β, TNF-α e PGE2 por macrófagos peritoneais humanos, originados do extravasamento
de monócitos para a cavidade peritoneal (HART et al., 1991), e IL-1β, TNF-α e IL-6 por
43
monócitos humanos (TE VELDE et al., 1990). Confirmando esses achados, um estudo
mais recente demostrou que IL-4 diminuiu a expressão de CD14, um receptor para LPS,
em monócitos humanos (LAUENER et al., 1990). Ainda dentre suas atividades
antiinflamatórias está a inibição da indução de COX2 e NOSi, diminuindo assim a
produção de prostaglandinas e óxido nítrico (SEITZ et al., 1994; ONOE et al., 1996), e a
indução de apoptose em monócitos (MANGAN et al., 1992).
Em 1999, CUNHA e colaboradores demonstraram que IL-4 é capaz de inibir
significativamente a hiperalgesia em pata de rato (Randal-selitto modificado) induzida
por carragenina, bradicinina e TNF-α em contraste ao seu anticorpo monoclonal que
reverteu esse efeito antihiperalgésico. Sugeriu-se que a IL-4 endógena deve estar
agindo como um freio regulador da resposta dolorosa. Mostrou-se então a capacidade
dessa citocina em inibir a dor do tipo inflamatória.
2.2. INTERLEUCINA-10
- Propriedades biológicas
A interleucina -10 humana consiste de 160 aminoácidos com peso molecular de
39 kDa e em solução está presente como um homodímero. IL-10 murina tem uma
massa molecular de aproximadamente 35 kDa (FIORENTINO et al., 1989). Tanto o
receptor murino como o humano já foram clonados e possuem 75% de homologia a
nível proteico e de DNA. É expresso em vários tipos de células e é consistente com as
repostas dessas células à IL-10.
44
Foi inicialmente descrita como “fator inibidor da síntese de citocinas” por sua
habilidade de suprimir a síntese de citocinas em certos tipos de células T. É
primariamente produzida por monócitos/macrófagos mas linfócitos T CD4+ e CD8+ e
linfócitos B também secretam-a após ativados (YSSEL et al, 1992; FIORENTINO et al,
1989; DE WAAL MALEFYT et al, 1991a e MOORE et al, 1990). A sua secreção por
macrófagos ativados é inibida por ela mesma (DE WAAL MALEFYT et al, 1991a) e é
secretada relativamente tarde em relação a outras citocinas, isso explica porque
macrófagos são capazes de liberar substancialmente muitas outras citocinas antes de
ocorrer a inibição por IL-10.
- Atividade antiinflmatória
IL-10 expressa uma potente atividade antiinflamatória tanto nas funções de
linfócitos como de monócitos (FIORENTINO et al., 1989). IL-10 inibe diretamente a
proliferação de linfócitos T e tem efeito inibitório indireto nos monócitos via a diminuição
da capacidade de apresentação do antígeno e de célula acessória dessas células
(YSSEL et al, 1992; FIORENTINO et al, 1989; DE WAAL MALEFYT et al, 1991a). Em
adição, IL-10 diminui a produção de uma série de citocinas pró-inflamatórias: IL-1β e α ,
IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α, fator de estimulador de colônias de granulócitos-macrófago
(GM-CSF) fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) por monócitos
humanos in vitro (DE WAAL MALEFYT et al, 1991) e por macrófagos (DE WAAL
MALEFYT et al, 1991b; FIORENTINO et al, 1991; OSWALD et al, 1992) além de inibir
outras funções dessas células como a expressão de classe II (DE WAAL MALEFYT et
al, 1991a) e adesão (FIORENTINO et al, 1991). IL-10 protege animais de laboratório
45
contra endotoxemia experimental (MOORE et al., 1993), mas há controvérsias sobre a
sua ação na produção de NO pela NOSi. Alguns estudos mostram um papel inibitório
sobre a NOSi (CUNHA et al., 1992b) e outros demontram um papel amplificador da
geração de NO (CORRADIN et al., 1993)
Recentemente foi sugerido que IL-10 é capaz de reduzir o número de receptores
de superfície para o TNF em monócitos humanos (JOYCE et al, 1994) e de aumentar o
pool de receptores solúveis de macrófagos do fluido sinovial humano. Em 1997, DI
SANTO e colaboradores observaram que a administração sistêmica de IL-10 humana
recombinante inibia a produção de TNF no sistema nervoso central, sugerindo a
capacidade de IL-10 atravessar a barreira hemato-encefálica abrindo um leque de
possibilidades dessa citocina ser usada clinicamente em distúrbios promovidos pelo TNF
no sistema nervoso central.
Em neutrófilos IL-10 é capaz de diminuir a produção de TNF-α, IL-1β e α, IL-8 e
IL-12 (CASSATELLA et al, 1993; KASAMA et al, 1994) assim como seletivamente
diminuir a expressão de COX-2 (HIROAKI et al, 1997) e inibir a degradação de RNAm
para IL-1ra (CASSATELLA et al, 1994; RE et al, 1993). Em mastócitos peritoneais de
ratos é capaz de inibir a produção de IL-6 (MARSHALL et al, 1996).
A importância da IL-10 como um regulador negativo da inflamação está bem
demostrado no estudo com camundongos deficientes de IL-10 cujo crescimento ficou
retardado, houve o desenvolvimento de anemia e de doença inflamatória crônica
resultando na doença inflamatória intestinal (KUHN et al, 1993). Em adição, IL-10 inibe
artrite induzida por colágeno (WALMSLEY et al, 1996; JOOSTEN et al, 1997), enquanto
que a neutralização com anticorpos para IL-10 murina aumenta a severidade da artrite
(KASAMA et al, 1995). IL-10 parece ser secretada por células sinoviais quando postas
em cultura (CUSH et al, 1995; KATSIKIS et al, 1994; ISOMÄKI et al, 1996a) e essa
46
produção endógena parece ser importante por funcionar como uma molécula
antiinflamatória em juntas artríticas. Comprovando isso foi visto que a sua neutralização
com anticorpos anti-IL-10 murina em cultura de células sinoviais aumenta a produção de
citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1β, GM-CSF e IFN-γ (KATSIKIS et al, 1994;
ISOMÄKI et al, 1996a). Além disso os mesmos autores confirmaram que particularmente
a produção de TNF-α é aumentada pelo anticorpo murino anti-IL-10, sugerindo que IL-10
é o maior regulador da produção de TNF-α em juntas artríticas (ISOMÄKI et al, 1996a).
Em contraste à neutralização do anticorpo murino anti-IL-10, a adição de IL-10
recombinante exógena à cultura de células sinoviais, além de prevenir a degradação da
cartilagem articular ainda diminui a produção de IL-1β e TNF-α (KATSIKIS et al, 1994;
ISOMÄKI et al, 1996a; CHOMARAT et al, 1995; VAN ROON et al, 1996).
Como TNF-α é uma citocina bastante atuante no desenvolvimento da dor crônica,
onde há injúria do nervo, é de se acreditar que a inibição dessa citocina possa diminuir a
nocicepção em alguns tipos de modelos de dor neuropática. Foi o que demonstrou
WAGNER et al (1998) quando inibiu a hiperalgesia termal após injúria neural com a
administração de IL-10.
Finalmente, IL-10 também já foi citada como uma citocina moduladora da dor
inflamatória. No modelo de hiperalgesia mecânica em pata de rato (Randall-Selito
modificado) POOL e colaboradores (1995) demonstraram que essa citocina tem
propriedades antinociceptivas pois é capaz de diminuir a hiperalgesia induzida por
carragenina, bradicinina, TNF-α e IL-6, mas não a por IL-8 e PGE2. Isso porque, como já
haviam descrito, a atividade hiperalgésica de carragenina e bradicinina depende da
indução da produção de TNF-α e IL-6 (FERREIRA et al, 1993) que por sua vez
47
dependem da indução da produção de outras citocinas como a IL-1β e IL-8 (CUNHA et
al., , 1992a). Já IL-8 induz à produção de aminas simpaticomiméticas (CUNHA et al,
1991) e PGE2 já é um mediador final da nocicepção inflamatória (FERREIRA, 1972),
eventos que não são inibidos por IL-10. O comportamento de IL-10, nesse modelo,
tornou mais consistente a idéia da cascata de mediadores liberados já proposta por esse
grupo de autores (CUNHA et al, 1991, 1992a; FERREIRA et al, 1993).
2.3. INTERLEUCINA-13
- Propriedades biológicas
IL-13 é secretada como uma proteína não glicosilada de 132 aminoácidos
(MCKENZIE et al., 1993). O gene da IL-13 possui 30% de homologia com a seqüência
do da IL-4 mas não tem homologia com nenhuma outra citocina conhecida. IL-13 é uma
citocina pleiotrópica descrita recentemente, derivada principalmente de linfócitos T CD4+
e CD8+ (MINTY et al, 1993; de WAAL MALEFYT et al, 1995) é produzida principalmente
por linfócitos Th0, TH1 e Th2 após ativação (DE WAAL MALEFYT et al, 1995).
Tanto IL-13 humana como a murina induz a proliferação de células TF-1
premieloides humanas. IL-13 também induz mudanças na morfologia de monócitos
humanos e no fenótipo tanto de monócitos como de células B humanas, aumentando a
expressão de MHC classe II e induzindo a expressão do receptor de IgE (MCKENZIE et
al., 1993; PUNNONEN et al., 1993). IL-13 é uma citocina homóloga que utiliza alguns
componentes do receptor da IL-4. A despeito disso, não tem nenhum efeito na
diferenciação de células T, mas tem efeitos similares aos da IL-4 em macrófagos e
48
neutrófilos como a diminuição de IL-1β e aumento da IL-1ra, e em neutrófilos aumentam
a expressão do receptor IL-1t2 (COLOTTA et al, 1994), reduz a síntese de outras
citocinas pró-inflamatórias como IL-8 e MIP-1, diminui a expressão de FcγRI (CD64),
FcγRII (CD32) e FcγRIII (CD16) em monócitos levando a uma redução da citotoxicidade
celular dependente de anticorpos (DE WAAL MALEFYT et al., 1993)
- Atividade antiinflamatória
Possui potente atividade antiinflamatória pois, o tratamento de macrófagos
murinos ativados e monócitos humanos com IL-13 recombinante inibiu a produção de
citocinas pró-inflamatórias como: IL-1β, IL-8, IL-6, IL-12p35, IL-12p40, MIP-1, GM-CSF,
IFN-γ e TNF-α além de IL-10 em resposta a IFN-γ e LPS (DE WAAL MALEFYT et al,
1993; DOHERTY et al., 1993; MINTY et al., 1993). Em contraste, aumenta a secreção
de IL-1ra (semelhante à IL-10 e IL-13) (DE WAAL MALEFYT et al, 1993). Além disso
reduz a produção de óxido nítrico e produtos reativos do oxigênio (DE WAAL MALEFYT,
1993).
IL-13 deve exercer um importante papel na regulação resposta inflamatória da
artrite reumatóide, pois está presente em níveis elevados no fluido sinovial (ISOMÄKI et
al, 1996b), e já foi demonstrado que IL-13 exógena diminui a produção de IL-1β e TNF-α
por células mononucleares presentes no fluido sinovial de pacientes com artrite
reumatóide (ISOMÄKI et al, 1996b), assim como a reabsorção óssea in vitro (ONOE et
al, 1996) e a injeção subcutânea de células geneticamente programadas para secretar
IL-13 diminuiu a artrite induzida por colágeno em camundongos (BESSIS et al, 1996).
49
3. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS Em face ao exposto nos itens anteriores , ficou claro que as citocinas por nós
destacadas são moduladoras negativas do processo inflamatório e dentre elas algumas
como IL-4 e IL-10 já foram demostradas serem analgésicas no modelo de hiperalgesia
inflamatória. Contudo, no campo da dor inflamatória o assunto ainda é pouco abordado e
o que já foi demonstrado na hiperalgesia ficou limitado apenas a uma especulação de
como essas citocinas estão agindo, sugerindo que as mesmas talvez estejam inibindo a
liberação de mediadores pró-inflamatórios por células residentes.
No modelo de contorções abdominais é possível demonstrar que essas células
residentes são importantes e que a presença delas é crucial para o desenvolvimento da
dor inflamatória. No intuito de investigar a atividade analgésica não só das citocinas IL-4
e IL-10 como também da IL-13 (citocina ainda não investigada) e como essas citocinas
exercem essa analgesia, resolvemos testar em outros modelos de dor inflamatória que
nos permitissem comprovar o verdadeiro papel dessas citocinas na modulação desse
tipo de dor. Para tanto escolhemos o modelo de contorções abdominais e o teste da
incapacitação articular como modelos de dor periférica e o teste da placa quente para
testar a possibilidade de alguma atividade a nível central
Pesquisamos ainda a possibilidade dessas citocinas estarem inibindo a liberação
de IL-1β e TNF-α por macrófagos peritoneais e por esse mesmo mecanismo estarem
inibindo o número de contorções abdominais.
50
II. Materiais e Métodos
51
1. ANIMAIS
1.1. Camundongos
Foram utilizados camundongos Swiss (Mus muscullus), machos, pesando entre 25 e 30
gramas, provenientes do Biotério Central do Campus do Pici – Universidade Federal do
Ceará e Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia dessa mesma
universidade e do Biotério do Departamento de Farmacologia da Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto – USP. Os animais foram mantidos em caixas de plástico com livre
acesso a ração e água
1.2. Ratos
Foram utilizados ratos Wistar (Ratus novergicus), machos, pesando entre 180 e 200
gramas, provenientes do Biotério Central do Campus do Pici – Universidade Federal do
Ceará e Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia dessa mesma
universidade.
2. APARELHOS E INTRUMENTOS LABORATORIAIS
Durante o decorrer dos experimentos foram utilizados diversos aparelhos e
instrumentos nominados a seguir:
- Aparelho para medir a incapacitação articular (gentilmente cedido e elaborado
pelo Prof. Marcus R. Vale do Depto. de Fisiologia e Farmacologia- UFC)
- Aparelho utilizado no tese da placa quente (gentilmente cedido pelo Prof.
Vietla S. Rao, Depto. de Fisiologia e farmacologia- UFC)
- Aparelho de ultracentrifugação (Amicon Corporation)
- Autoclave (FABE)
- Balança para pesagem de animais, mod. ID-1500 (FILIZOLA)
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- Balança analítica mod. AL200 e Ohaus, mod. AS260D (MARTE)
- Beckers (SIMAX)
- Câmara de Neubauer 0.100/0.0025 mm2
- Capela de fluxo laminar, vertical (modelo VLFS-12, Veco do Brasil Ind. Com.
Equip. Ltda, Campinas, SP, Brasil)
- Centrifuga Eppendorf – Mod. 5804R
- Estufa de CO2 para cultura (Nuaire TS Autoflow)
- Funis de vidro grandes
- Material cirúrgico (tesoura, pinça clínica e dente de rato)
- Membranas de ultrafiltração diaflo RYM-10 (Amicon Corporation)
- Microscópio óptico binocular (EMBRAEME)
- Micropipetas automáticas (GILSON)
- Ponteiras para pipetas automáticas - 200 ul e 1 ml (SIGMA)
- Seringas de 5 e 3 ml recicladas por autoclave
- Seringas novas de 1 ml
- Sonicador (Sonics & Materiais Inc. Danbury – Connecticut – USA)
- Tubos Eppendorf -1.5 ml (GIBCO)
- Tubos de ensaio de vidro (PIREX)
- Tubos plástico de 15 ml (FALCON)
3. DROGAS, SOLUÇÕES, CITOCINAS E ANTISOROS
3.1. Drogas
- Zymosan (from Saccharamyces cerevisiae, Sigma Chemical Co., St Louis, USA),
dissolvido em salina.
53
- Indometacina (Merck, Sharp and Dohme-MSD, USA) – dissolvida em solução de
bicarbonato de sódio a 5%.
- Cloridrato de morfina (Dimorf ; Laboratório Cristália-Brasil ) diluída em salina.
- Cloridrato de naloxona (Narcan – Rhodia Farma) diluído em salina.
- Éter Etílico (Syth)
- Heparina (Laboratório Cristália – Brasil)
- Hidrato de Cloral (Reagen)
- avidina-peroxidase (DAKO)
- o-fenilenediamina diidrocloreto (Sigma Chemical Co., St Louis, USA)- disolvido no
tampão substrato descrito no protocolo de ELISA.
3.2. Soluções
- Solução de ácido acético
Ácido Acético Glacial (Reagen), utilizado a 0.6% (v/v; concentração de 629 mg/100 ml),
dissolvido em água deionizada.
- Solução de bicarbonato de sódio
Bicarbonato de sódio (Merck, Sharp and Dohme – MSD, USA) utilizado a 5% (p/v)
dissolvido em água destilada.
- Solução Salina 0.9% estéril (Laboratório Cristália-Brasil)
- Solução de H2SO4 a 1M.
- albumina bovina 1% diluída em tampão de lavagem
- soro normal de carneiro
- Solução de Turk
Ácido acético glacial (Reagen )...........................................................20.0 ml
Violeta de genciana (Reagen)...............................................................2.0 ml
54
Água destilada.................................................................................1000.0 ml
3.3. Tampões utilizados para o ensaio imunoenzimático
- Tampão bicarbonato pH 8.2
NaHCO3 P.A. (Merck, Sharp and Dohme – MSD, USA)........................0,1 M
NaCl. P.A.(Merck, Sharp and Dohme – MSD, USA)...............................0,1 M
- Tampão Substrato pH 5.0
Ácido Cítrico......................................................................................34,7 mM
Na2HPO4.(Merck)..............................................................................66,7 mM
- Substrato
OPD.....................................................................................................0,4 mg
H2O2.....................................................................................................0,4 μl
Tampão substrato q.s.p. ......................................................................1 ml
- Tampão de lavagem PBS-tween 20, 0,1% v/v.
3.4. Meio de Cultura
- RPMI simples :
Meio RPMI 1640 Medium (Sigma, St Louis, USA; lote H0763).............10.4 g
Hepes.(Sigma Chemical Co., USA).......................................................2.38 g
Bicarbonato de sódio (Merk, Sharp and Dohme – MSD, USA).............2.20 g
Água deionizada Milli-Q autoclavada........................................................1 L
- RPMI completo:
Soro fetal bovino...................................................................................10 ml
Gentamicina (Gentamicin sulfate solution; Sigma G-1522)...................500 ul
Penicilina-Streptomicina (Sigma P-3539)..............................................500 ul
55
Meio RPMI simples q.s.p. ....................................................................100 ml
O meio de cultura foi filtrado em filtro Durapore (0.22 umGV) com membranas
estéreis (Millipore) de modo que após preparado o meio estava asséptico e
apirogênico.
3.5. Citocinas e Antisoros
3.5.1. Citocinas
- Interleucina –4 recombinante humana (rhuIL-4): Obtido do National Institute for
Biological Standards and Control (NIBSC), Inglaterra. Código 88/656. Cada
ampola continha 1.000 UI (100 ng).
- Interleucina-10 recombinante humana (rhuIL-10): Obtido do National Institute for
Biological Standards and Control (NIBSC), Inglaterra. Código 92/516. Cada
ampola continha 5.000 UI (1 μg).
- Interleucina-13 recombinante humana (rhuIL-13): Obtido do National Institute for
Biological Standards and Control (NIBSC), Inglaterra. Código 94/662. Cada
ampola continha 1.000 UI (1 mg).
3.5.2. Anticorpos específicos
- Soro anti-TNF-α (H92 ou XT 22.11). Obtido do National Institute for Biological
Standards and Control (NIBSC), Inglaterra.
- Soro anti-IL-1β (S5/B3) obtido do National Institute for Biological Standards and
Control (NIBSC), Inglaterra.
- anticorpo biotinilado anti-TNF-α (H92)
- anticorpo biotinilado anti-IL-1β (S329/B4)
56
Todas as citocinas e antisoros foram gentilmente cedidas pelo Prof. Fernando de
Queiróz Cunha do Departamento de Farmacologia da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto – USP.
4. TESTES NOCICEPTIVOS
4.1. Teste de contorção abdominal induzido por ácido acético ou zymosan
O modelo utilizado foi descrito anteriormente por COLLIER et al (1968). Foram
utilizados camundongos Swiss machos, pesando entre 25 e 30 g. Os estímulos: ácido
acético (0,6%; 0.01 ml/g de peso) ou zymosan (1 mg/animal) foram injetados por via ip e
a intensidade de nocicepção foi quantificada pelo número total de contorções
abdominais ocorridas nos primeiros 30 min após sua administração. Uma contorção
sendo identificada como a extensão das patas traseiras acompanhada por constricção
do abdomen.
ILUSTRAÇÃO 4
Injeção ip doestímulo:
Zymosan Ácido acético
Pré tratamento (ip): Salina IL-4 IL-10 IL-13
Contagem das contorções abdominais
durante 30 minutos
30’
57
4.2. Teste de incapacitação articular
O modelo foi descrito anteriormente por TONUSSI & FERREIRA (1992),
posteriormente modificado (MAGALHÃES et al, 1997, VIANA et al. 1998) e adaptado
para o nosso laboratório. Ratos Wistar machos, pesando entre 180 a 200 g receberam a
injeção intrarticular, no joelho posterior direito, de zymosan (1 mg/amimal; 50 μl) e foram
postos para deambular forçadamente em um carrosel de piso metálico (cilindro de
alumínio, 30 cm de diâmetro x 50 cm de de largura, coberto por uma tela de alumínio
nas mesmas proporções), giratório, com capacidade para 3 animais. A velocidade
utilizada foi de 3 RPM. As patas traseiras foram calçadas com sapatilhas metálicas,
onde a sapatilha da pata direita é conectada à porta de dados de um microcomputador.
Ao tocar com a sapatilha no piso metálico fecha-se um circuito e ao final de 1 min o
computador registra o tempo de suspensão da pata (TSP), isto é, o tempo que o animal
permaneceu com a pata levantada sem encostar no piso. O TSP é medido antes da
injeção do estímulo (tempo zero) e de hora em hora até a 4ª hora. Calcula-se o Δ TSP
que é a diferença entre medida do TSP de cada hora e a do tempo zero. Dessa forma,
um aumento do Δ TSP indica nocicepção (incapacitação articular), isto é, a incapacidade
do animal deambular normalmente sobre o carrossel. Vale ressaltar, que antes da
realização do ensaio o animais eram treinados, permitindo-se um período de
deambulação e adaptação ao ambiente.
58
ILUSTRAÇÃO 5
(ip)
Pré-tratamento: Salina IL-4
IL-10
IL-13
0 1 h 2 hs3 hs4 hs
30 min
Zymosan (i.a.)
Incapacitação Articular
4.3. Teste da placa quente
Para testar a eficácia contra a nocicepção térmica e de ação central foi utilizado o
método de EDDY & LEIMBACH (1953) com pequenas modificações. Durante o
experimento foi seguido o protocolo ético (NIH Guide for Care and Use of Laboratory
Animals).
Camundongos machos, pesando entre 25 e 30 g, foram postos em uma placa
quente mantida a 55 + 1º C e foram retirados quando observada a reação de saltar ou
lamber as patas traseiras. Foram feitas duas triagens separadas por um intervalo de 30
min, onde a primeira familiarizou o animal com o teste e serviu como uma pré-seleção
59
(aqueles que mostraram um tempo de reação superior a 10 segundos foram
descartados). A segunda serviu como o registro do tempo zero (tempo medido antes da
administração das substâncias a serem testadas). Além do tempo zero os animais foram
ensaiados nos 30, 60 e 90 min após a administração das drogas. 40 segundos foi
considerado o tempo máximo de reação para prevenir danos nas patas dos animais.
ILUSTRAÇÃO 6
550C550
C
0’ 30’60’90’
Injeção ip de:
Morfina
IL-4 IL-10
Contagem do tempo de permanência na placa quente
Salina
IL-13
5. INFLUXO DE LEUCÓCITOS
Os animais receberam a injeção intrarticular de zymosan (1 mg/animal) no joelho
posterior direito, após 6 horas foram anetesiados com hidrato de cloral (400 mg/kg; ip) e
sacrificados por decaptação exsanguinação. A pele e os ligamentos articulares do joelho
injetado foram removidos e procedeu-se a lavagem da cavidade articular pela injeção de
400 μl de salina heparinizada (40 UI/ml) através da membrana sinovial recolhendo-se o
60
exsudato articular. As alíquotas foram diluídas em solução de Turk a 10% e os
leucócitos foram contados em câmaras de Neubauer.
ILUSTRAÇÃO 7
6. OBTENÇÃO DO SOBRENADANTE DE CULTURA DE MACRÓFAGO
Os macrófagos foram tratados e estimulados in vivo. Para isso, camundongos
Swiss foram injetados, em grupos de 3 animais, por via ip com salina ou zymosan
(1mg/animal) e após 15 minutos foram sacríficados em câmara de éter. A cavidade
peritoneal foi lavada com 2 ml de meio de cultura (RPMI incompleto) em ambiente
asséptico (Fluxo laminar). Colheu-se o exsudado e este foi centifugado por 5 min a 3000
RPM. O sobrenadante foi desprezado e as células foram ressuspensas em 500 μl de
meio de cultura completo e colocadas em placas de cultura (1 poço por animal). Foram
Pré-tratamento:
Salina IL-4 IL-10 IL-13
Zymosan (i.a)
Sacrifício
Coleta do exsudato
da cavidade articular
30 min
centrifugação
Solução de Turk Turk
Contagem do númerototal de células
Remoção dosobrenadante
61
encubadas por 12 horas em estufa de CO2 a 37º C, numa atmosfera de 5%. Após a
adesão dos macrófagos os sobrenadantes foram colhidos e estocados a –70º C para
posterior análise. Todo o procedimento foi cuidadosamente elaborado de forma
apirogênica. Após o período de incubação foi checada a possibilidade de contaminação
por bactérias, sendo esta descartada.
ILUSTRAÇÃO 8
Injeção (ip) doestímulo:
Zymosan Pré tratamento (ip):
Salina IL-4 IL-10
30 min
Coleta do fluido peritoneal com meio
de cultura
centrifugação
Remoção do sobrenadante
Ressuspensão dascélulas com RPMI
completo Cultura em estufa de CO2
a 37º C por 12 horas
15 min
7. DOSAGEM DE TNF-α e IL-1β EM SOBRENADANTE DE CULTURA DE
MACRÓFAGOS
O sobrenadante estocado foi descongelado para a quantificação de citocinas como TNF-
α e IL-1β. O material foi dosado pelo protocolo de ELISA descrito a seguir:
62
• Incubação com 2 μg/ml de anticorpo anti-TNF-α (H92 ou XT 22.11) ou anti IL-1β
(S5/B3) (anticorpo de captura) diluído em tampão de bicarbonato (pH 8.2) - 100
μl/poço (placa de 96 poços) por 16-24h a 4° C.
• Lavagem da placa (3x) com PBS-tween 20, 0,1% v/v.
• Bloqueio com albumina bovina 1% diluída em tampão de lavagem, 100 μl/poço por 2h
à temperatura ambiente.
• Lavagem da placa (3x)
• Incubação com a curva padrão de TNF-α (5000-4,88 pg/ml) ou IL-1β(2000-1,95 pg/ml)
diluídas em tampão de lavagem e das amostras a serem dosadas (100 μl/poço por
16-24h à 4° C).
• Lavagem da placa (3x)
• Incubação com anticorpo biotinilado anti-TNF-α (H92) ou anti-IL-1β (S329/B4)
(anticorpo de detecção) diluído 1:1000 em tampão de lavagem contendo 1% de soro
normal de carneiro por 1 h à temperatura ambiente
• Lavagem da placa (3x)
• Incubação com avidina-peroxidase (DAKO) diluída 1:5000 em tampão de lavagem,
100 μl/poço por 15 min à temperatura ambiente.
• Lavagem da placa (3x)
• Incubação com o-fenilenediamina diidrocloreto (OPD) em tampão substrato, 100
μl/poço, cobrir a placa e deixar no escuro por 5-20 min à temperatura ambiente.
• A reação foi parada com 150 μl/poço de H2SO4 1M.
• A leitura foi feita em espectrofotômetro a 490 nm.
• Os resultados são expressos em ug/ml como a curva padrão.
63
8. EFEITO ANTINOCICEPTIVO DAS INTERLEUCINAS – 4, 10 E 13 SOBRE AS
CONTORÇÕES ABDOMINAIS INDUZIDAS POR ÁCIDO ACÉTICO E ZYMOSAN.
IL-4 (1 – 5 ng/animal), IL-10 (0.4 – 25ng/animal) ou IL-13 (0.4 – 2.5 ng/ml) foram
injetadas num volume de 250 μl por via ip 30 min antes da injeção também ip do
estímulo ácido acético (0.6%) ou zymosan (1 mg/animal). As contorções abdominais
foram computadas durante 30 min após a administração dos mesmos.
9. EFEITO DA NALOXONA SOBRE A ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DAS
INTERLEUCINAS- 4, 10 E 13.
Camundongos Swiss foram previamente tratados (30 min,; ip) com salina (250
μl), IL-4 (5 ng/animal), IL-10 (10 ng/animal) ou IL-13 (2.5 ng/ml) ou morfina (5 mg/kg; 15
min antes). Alguns grupos além das interleucinas ou da morfina, receberam também,
previamente (15 min) naloxona (2 mg/kg) por via ip. Ácido acético (0.6%) foi
administrado por via ip e logo em seguida as contorções abdominais foram computadas
durante 30 min.
10. EFEITO ANTINOCICEPTIVO DAS INTERLEUCINAS – 4, 10 E 13 SOBRE A
INCAPACITAÇÃO ARTICULAR INDUZIDA POR ZYMOSAN.
IL-4 (1 – 5 ng/animal), IL-10 (0.4 – 25ng/animal) ou IL-13 (0.4 – 2.5 ng/ml) foi
injetada num volume de 500 μl por via ip 30 min antes da injeção intrarticular de
64
zymosan (1 mg/animal; 50 μl). O tempo de suspensão da pata foi medido durante 60
segundos de hora em hora até a 4ª hora após a injeção do estímulo.
11. EFEITO DAS INTERLEUCINAS –4, 10 E 13 NO TESTE DA PLACA QUENTE.
Após a tomada do tempo zero IL-4 (1 – 5 ng/animal), IL-10 (0.4 – 25ng/animal),
IL-13 (0.4 – 2.5 ng/animal), morfina (5 mg/kg) ou indometacina (2 mg/kg) foi injetado (a)
por via ip e 30, 60 e 90 min depois foi registrado o tempo de reação (s) na placa quente
(55 + 1º C).
12. EFEITO DAS INTERLEUCINAS –4, 10 E 13 NO INFLUXO DE LEUCÓCITOS PARA
A CAVIDADE ARTICULAR.
IL-4 (1 – 5 ng/animal), IL-10 (0.4 – 25ng/animal), IL-13 (0.4 – 2.5 ng/animal) ou
salina foram injetadas por via ip 30 min antes da administração intrarticular de zymosan
(1 mg/animal). Após 6 horas da injeção do estímulo os animais foram sacrificados, as
cavidades articulares dos joelhos injetados foram lavadas e o exsudato foi colhido para a
contagem total do número de leucócitos.
65
13. EFEITO DAS INTERLEUCINAS –4 e 10 NA LIBERAÇÃO DO FATOR DE NECROSE
TUMORAL (TNF-α) E DE INTERLEUCINA-1 β (IL-1β) POR MACRÓFAGOS
PERITONEAIS DE CAMUNDONGOS ESTIMULADOS IN VIVO POR ZYMOSAN.
Os camundongos foram pré-tratados com IL-4 (5 ng/animal; ip) ou IL-10 (10
ng/animal; ip) 30 min antes da injeção ip de zymosan (1 mg/animal). 15 min depois, os
animais foram sacrificados e o exudato peritoneal foi colhido e posto em cultura por 12
horas. O sobrenadante foi retirado para a realização da dosagem de TNF-α e IL-1β pelo
protocolo de ELISA descrito anteriormente.
14. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos como média + o erro padrão da média (EPM). As
médias dos vários procedimentos experimentais foram comparadas utilizando a análise
de variância (ANOVA), e a significância entre os grupos estabelecida pelo teste Turkey.
O numero (N) de animais por grupo experimental está descrito nas figuras. A
significância mínima foi aceita ao nível de P<0.05.
66
III. Resultados
67
1. ATIVIDADE NOCICEPTIVA DO ÁCIDO ACÉTICO E DO ZYMOSAN NO MODELO
DE CONTORÇÕES ABDOMINAIS
A injeção intraperitoneal de ácido acético (figura1A) nas doses de 0.15, 0.3 e
0.6% ou de zymosan (figura1B) nas doses de 0.25, 0.5 e 1 mg/animal foi capaz de
induzir contorções abdominais em camundongos de forma dose dependente quando os
animais são observados durante 30 min após a injeção do estímulo. O número de
contorções foi significante para todas as doses de ambos os estímulos, sendo que a
atividade nociceptiva máxima foi alcançada na dose de 0.6% para o ácido acético
(p<0.05) e na dose de 1 mg/animal para o zymosan (p<0.05).
2. BLOQUEIO DA ATIVIDADE NOCICEPTIVA DO ACIDO ACÉTICO E ZYMOSAN
POR INTERLEUCINA-4 NO MODELO DE CONTORÇÕES ABDOMINAIS.
A injeção intraperitoneal de IL-4 nas doses de 1, 2.5 e 5 ng/animal, 30 min antes
do estímulo, foi capaz de reduzir de forma dose-dependente as contorções abdominais
induzidas por ácido acético (0.6%, ip; Figura 2A) ou zymosan (1 mg/animal, ip; Figura
2B) sendo o bloqueio significante apenas nas doses de 2.5 e 5 ng com 49.8% e 58.7%
(p<0.05) de inibição respectivamente para o ácido acético e 36.5% e 62.6% (p<0.05)de
inibição respectivamente para as mesmas doses, quando o estímulo utilizado foi o
zymosan.
68
A
C 0,15 0,3 0,60
15
30
45
60
AAc (%)
6*6
*6
*6
Nº d
e co
ntor
ções
B
C 0,25 0,5 10
5
10
15
Zym (mg/animal)
6
*6
*6
*6
Nº d
e co
ntor
ções
FIGURA 1. Curva dose-resposta da atividade nociceptiva do ácido acético e zymosan no modelo de contorções abdominais. Ácido acético (AAc, 0.15, 0.30 ou
0.6%; Painel A) ou zymosan (Zym 0.25, 0.5 e 1 mg/animal; Painel B) foi administrado por
via ip em camundongos Swiss. Em ambos os paineis C indica o grupo que recebeu
salina. As barras representam as médias + EPM do número total de contorções
ocorridas após 30 min da injeção do estímulo. Os números acima das barra indicam o
número de animais ensaiados de cada grupo. Os asteriscos indicam a diferença
estatística em relação ao grupo que recebeu salina (*p<0.05; Turkey – ANOVA).
69
A
S 1 2.5 50
25
50
75 IL-4 (ng/animal)
10
6
*5 *
8
AAc
Nº d
e co
ntor
ções
B
S 1 2.5 50
5
10
1510
4*5
*9
IL-4 (ng/animal)
Zym
Nº d
e co
ntor
ções
FIGURA 2. Efeito antinociceptivo da interleucina-4 (IL-4) nas contorções abdominais induzidas por ácido acético ou zymosan. Ácido acético (AAc, 0.6%;
Painel A) ou zymosan (Zym, 1 mg/animal; Painel B) foi administrado por via ip em
camundongos Swiss previamente tratados (30 min antes; ip) com salina (controle, S) ou
IL-4 (1, 2.5 e 5 ng/animal) no volume de 250 μl. As barras representam as médias +
EPM do número total de contorções ocorridas após 30 min da injeção do estímulo. Os
números acima das barra indicam o número de animais ensaiados de cada grupo. Os
asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina como
pré-tratamento (*p<0.01 ; Turkey – ANOVA).
70
3. BLOQUEIO DA ATIVIDADE NOCICEPTIVA DO ACIDO ACÉTICO E ZYMOSAN
POR INTERLEUCINA-10 NO MODELO DE CONTORÇÕES ABDOMINAIS.
A injeção intraperitoneal de IL-10 nas doses de 0.4, 2 e 10 ng/animal, 30 min
antes do estímulo, foi capaz de reduzir as contorções abdominais induzidas por ácido
acético (0.6%, ip; Figura 3A) ou por zymosan (1 mg/animal, ip; Figura 3B) sendo o efeito
significante para todas doses, com 31%, 35% e 52% (p<0.05) de inibição
respectivamente para o ácido acético e 42.63%, 47.28% e 74.4% (p<0.05) de inibição
respectivamente quando o estímulo utilizado foi o zymosan.
4. BLOQUEIO DA ATIVIDADE NOCICEPTIVA DO ACIDO ACÉTICO E ZYMOSAN
POR INTERLEUCINA-13 NO MODELO DE CONTORÇÕES ABDOMINAIS.
A injeção intraperitoneal de IL-13 nas doses de 0.4, 1 e 2.5 ng/animal, 30 min
antes do estímulo, foi eficaz em reduzir as contorções abdominais induzidas por ácido
acético (0.6%, ip; Figura 4A) ou por zymosan (1 mg/animal, ip; Figura 4B), de modo
significante com 55.1%, 62.1% e 89.26% (p<0.05) de inibição respectivamente quando
o estímulo utilizado foi o ácido acético ou com 57.7%, 58.7% e 61.7% (p<0.05) de
inibição quando o estímulo foi o zymosan para as três doses, respectivamente.
71
A
B
S 0.4 2 100
20
40
60
AAc
Nº d
e co
ntor
ções
IL-10 (ng/animal)
6
*6
*6
*6
S 0.4 2 100
5
FIGURA 3. Efeito antinociceptivo da interleucina-10 (IL-10) nas contorções abdominais induzidas por ácido acético ou zymosan. Ácido acético (AAc, 0.6%;
Painel A) ou zymosan (Zym, 1 mg/animal; Painel B) foi administrado por via ip em
camundongos Swiss previamente tratados (30 min antes; ip) com salina (controle, S) ou
IL-10 (0.4 - 10 ng/animal) no volume de 250 μl. As barras representam as médias + EPM
do número total de contorções ocorridas após 30 min da injeção do estímulo. Os
números indicados acima das barra indicam o número de animais ensaiados de cada
grupo. Os asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu
salina como pré-tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).
10
15
*6 *
6
*6
6
IL-10 (ng/animal)
Zym
Nº d
e co
nto
esrç
õ
72
A
S 0.4 1 2.50
25
50
75 IL-13 (ng/animal) AAc
Nº d
e co
ntor
ções
6
*6 *
6
*5
B
S 0.4 1 2.50
5
10
15
16
*16
*16 *
16
IL-13 (ng/animal)
Zym
Nº d
e co
ntor
ções
FIGURA 4. Efeito antinociceptivo da interleucina-13 (IL-13) nas contorções abdominais induzidas por ácido acético ou zymosan. Ácido acético (AAc, 0.6%;
Painel A) ou zymosan (Zym, 1 mg/animal; Painel B) foi administrado por via ip em
camundongos Swiss previamente tratados (30 min antes; ip) com salina (controle, S) ou
IL-13 (0.4, 1 e 2.5 ng/animal) no volume de 250 μl. As barras representam as médias +
EPM do número total de contorções ocorridas após 30 min da injeção do estímulo. Os
números indicados acima das barra indicam o número de animais ensaiados de cada
grupo. Os asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu
salina como pretratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).
73
5. EFEITO DA INJEÇÃO INTRAPERITONEAL DE INTERLEUCINA-4 SOBRE A
ATIVIDADE NOCICEPTIVA DO ZYMOSAN NO MODELO DE INCAPACITAÇÃO
ARTICULAR EM JOELHO DE RATO.
IL-4 foi administrada por via ip nas doses de 1 e 5 ng/animal 30 min antes da
injeção intrarticular de zymosan (1 mg/animal). Na Figura 5 observou-se que IL-4 foi
capaz de inibir a incapacitação articular (Δ tempo de suspensão da pata), de modo
significante, apenas quando dada na dose de 5 ng/animal com 49.2% (p<0.01) de
inibição na 3ª hora (pico de incapacitação).
6. EFEITO DA INJEÇÃO INTRAPERITONEAL DE INTERLEUCINA-10 SOBRE A
ATIVIDADE NOCICEPTIVA DO ZYMOSAN NO MODELO DE INCAPACITAÇÃO
ARTICULAR EM JOELHO DE RATO.
IL-10 foi administrada por via ip nas doses de 2 e 10 ng/animal 30 min antes da
injeção ia de zymosan (1 mg/animal). Na Figura 6 observou-se que IL-10 foi eficaz em
inibir a incapacitação articular, de modo significante, nas duas doses com 55.7% e
64.8% (p<0.05) de inibição na 3ª hora (pico de incapacitação) e 65.6% e 69.9% (p<0.05)
na 4º hora de incapacitação articular .
74
0 1 2 3 4 50
10
20
30
40
Salina
IL-4 (1 ng/animal)IL-4 (5 ng/animal)
*
Tempo (H)
ΔTe
mpo
de
susp
ensã
oda
pat
a (s
)
FIGURA 5. Efeito antinociceptivo da interleucina-4 (IL-4) sobre a incapacitação articular induzida por zymosan. Zymosan (1 mg/animal) foi administrado por via
intrarticular em joelhos de ratos previamente tratados com salina ou IL-4 (1 e 5
ng/animal) por via ip. Durante 60 segundos, a cada 1 hora, foi analisado o tempo de
suspensão da pata do animal. Os pontos representam a média + EPM do Δ tempo de
suspensão da pata (diferença entre o tempo de medida e o tempo zero), sendo N=6. O
asterisco indica a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina como
pré-tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).
75
0 1 2 3 4 50
10
20
30
40
SalinaIL-10 (2 ng/animal)IL-10 (10 ng/animal)
**
*
*
Tempo (H)
ΔTe
mpo
de
susp
ensã
oda
pat
a (s
)
FIGURA 6. Efeito antinociceptivo da interleucina-10 (IL-10) sobre a incapacitação articular induzida por zymosan. Zymosan (1 mg/animal) foi administrado por via
intrarticular em joelhos de ratos previamente tratados com salina ou IL-10 (2 e 10
ng/animal) por via ip. Durante 60 segundos, a cada 1 hora, foi analisado o tempo de
suspensão da pata do animal. Os pontos representam a média + EPM do Δ tempo de
suspensão da pata (diferença entre o tempo de medida e o tempo zero), sendo N=6. Os
asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina como
pre-tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).
76
7. EFEITO DA INJEÇÃO INTRAPERITONEAL DE INTERLEUCINA-13 SOBRE A
ATIVIDADE NOCICEPTIVA DO ZYMOSAN NO MODELO DE INCAPACITAÇÃO
ARTICULAR EM JOELHO DE RATO.
IL-13 foi administrada por via ip nas doses de 1 e 2.5 ng/animal 30 min antes da
injeção ia de zymosan (1 mg/animal). Na Figura 7 observou-se que IL-13 foi eficaz em
inibir a incapacitação articular, de modo significante, nas duas doses com 68.9% e
62.5% (p<0.05) de inibição na 2ª hora e 56.6% e 53.2% (p<0.05) na 3º hora de
incapacitação articular.
8. EFEITO DA INTERLEUCINA-4 SOBRE O INFLUXO DE LEUCÓCITOS NA
CAVIDADE ARTICULAR INDUZIDO POR ZYMOSAN.
A Figura 8 mostra que IL-4 administrada ip, 30 min antes do zymosan (1
mg/animal) nas mesmas doses usadas no teste de incapacitação articular (1 e 5
ng/animal) foi capaz de bloquear, de modo significante e dose-dependente, o influxo de
leucócitos para a cavidade articular, medido na 6ª hora após a injeção do estímulo,
quando comparada ao grupo que recebeu salina como pré-tratamento (29% e 53.8% de
inibição respectivamente, p<0.05).
77
0 1 2 3 4 50
10
20
30
40
Salina
IL-13 (2.5 ng/animal)
IL-13 (1 ng/animal)
*
**
*
Tempo (H)
ΔTe
mpo
de
susp
ensã
oda
pat
a (s
)
FIGURA 7. Efeito antinociceptivo da interleucina-13 (IL-13) sobre a incapacitação articular induzida por zymosan. Zymosan (1 mg/animal) foi administrado por via
intrarticular em joelhos de ratos previamente tratados com salina ou IL-13 (1 e 2.5
ng/animal) por via ip. Durante 60 segundos, a cada 1 hora, foi analisado o tempo de
suspensão da pata do animal. Os pontos representam a média + EPM do Δ tempo de
suspensão da pata (diferença entre o tempo de medida e o tempo zero), sendo N=6. Os
asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina como
pre-tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).
78
S 1 50.0
2.5
5.0 IL-4 (ng/animal)
6
*6
*6
Zym
Leuc
ócito
s/m
l x 1
03
FIGURA 8. Efeito da interleucina-4 (IL-4) sobre o influxo de leucócitos na cavidade articular induzido por zymosan. Zymosan (Zym, 1 mg/animal) foi administrado por via
intrarticular em joelhos de ratos previamente tratados (30 min) com salina ou IL-4 (1 e 5
ng/animal) por via ip. Após 6 horas da injeção do estímulo foi colhido o exudato articular
e feita a contagem dos leucócitos em câmara de Neubauer. As barras representam as
médias + EPM do número de leucócitos x 103/ml. Os números indicados acima das barra
indicam o número de animais usados de cada grupo. Os asteriscos indicam a diferença
estatística em relação ao grupo que recebeu salina como pré-tratamento (*p<0.05;
Turkey – ANOVA).
79
9. EFEITO DA INTERLEUCINA-10 SOBRE O INFLUXO DE LEUCÓCITOS NA
CAVIDADE ARTICULAR INDUZIDO POR ZYMOSAN.
A figura 9 mostra que IL-10 administrada ip, 30 min antes do zymosan (1
mg/animal) nas mesmas doses usadas no teste de incapacitação articular (2 e 10
ng/animal) foi capaz de bloquear, de modo significante e dose-dependente, o influxo de
leucócitos para a cavidade articular, medido na 6ª hora após a injeção do estímulo,
quando comparada ao grupo que recebeu salina como pré-tratamento (30.69% e 62%
de inibição, respectivamente, com p<0.05).
10. EFEITO DA INTERLEUCINA-13 SOBRE O INFLUXO DE LEUCÓCITOS NA
CAVIDADE ARTICULAR INDUZIDO POR ZYMOSAN.
A figura 10 mostra que IL-13 administrada ip, 30 min antes do zymosan (1
mg/animal) nas mesmas doses usadas no teste de incapacitação articular (1 e 2.5
ng/animal) foi capaz de bloquear, de modo significante, o influxo de leucócitos para a
cavidade articular, medido na 6ª hora após a injeção do estímulo, quando comparada ao
grupo que recebeu salina como pré-tratamento (92.1% e 75.3% de inibição,
respectivamente, com p<0.05).
80
S 2 100
1
2
3
4
5
IL-10 (ng/animal)
*6 *
6
6
Zym
Leuc
ócito
s/m
l x 1
03 FIGURA 9. Efeito da interleucina-10 (IL-10) sobre o influxo de células na cavidade articular induzido por zymosan. Zymosan (Zym, 1 mg/animal) foi administrado por via
intrarticulart em joelhos de ratos previamente tratados (30 min) com salina ou IL-10 (2 e
10 ng/animal) por via ip. Após 6 horas da injeção do estímulo foi colhido o exsudato
articular e feita a contagem dos leucócitos em câmara de Neubauer. As barras
representam as médias + EPM do número de leucócitos x 103/ml. Os números indicados
acima das barra indicam o número de animais usados de cada grupo. Os asteriscos
indicam a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina como pré-
tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).
81
S 1 2.50.0
2.5
5.0
7.5
IL-13 (ng/animal)
*6*
6
6
Zym
Leuc
ócito
s/m
l x 1
03
FIGURA 10. Efeito da interleucina-13 (IL-13) sobre o influxo de células na cavidade articular induzido por zymosan. Zymosan (Zym, 1 mg/animal) foi administrado por via
intarticular em joelhos de ratos previamente tratados (30 min) com salina ou IL-13 (1 e
2.5 ng/animal) por via ip. Após 6 horas da injeção do estímulo foi colhido o exudato
articular e feita a contagem dos leucócitos em câmara de Neubauer. As barras
representam as médias + EPM do número de leucócitos x 103/ml. Os números indicados
acima das barra indicam o número de animais usados de cada grupo. Os asteriscos
indicam a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina como pré-
tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).
82
11. EFEITO DA INTERLEUCINA-4 SOBRE O TEMPO DE REAÇÃO NO TESTE DA
PLACA QUENTE.
IL-4 (5 ng/animal - dose de maior efeito no testes de contorção abdominal e de
incapacitação articular), a exemplo do observado com a indometacina ou salina, quando
dada por via ip, não foi capaz de modificar o tempo de reação dos animais no teste da
placa quente (Figura 11). Efeito este diferente da morfina (5 mg/kg; ip) que foi capaz de
aumentar esse tempo em até 666% (p<0,05; maior efeito).
12. EFEITO DA INTERLEUCINA-10 SOBRE O TEMPO DE REAÇÃO NO TESTE DA
PLACA QUENTE.
IL-10 (10 ng/animal - dose de maior efeito nos testes de contorção abdominal e
de incapacitação articular), a exemplo do observado com indometacina ou salina,
quando dada por via ip não foi capaz de modificar o tempo de reação dos animais no
teste da placa quente (Figura 12). Efeito este diferente da morfina (5 mg/kg; ip) que foi
capaz de aumentar esse tempo em até 540% (p<0,05; maior efeito).
83
0 30 60 900
10
20
30
40SalinaMorfinaIndometacina
IL-4*
*
*
Tempo (min)
Tem
po d
e re
ação
(s)
FIGURA 11. Efeito da interleucina-4 (IL-4) sobre o tempo de reação no teste da placa quente. Salina, morfina (5 mg/kg), indometacina (2 mg/kg) ou IL-4 (5 ng/animal)
foram administradas por via ip imediatamente após a medição do tempo zero. O tempo
de reação foi medido em intervalos de 30 min até os 90min. Os pontos representam a
média + EPM do tempo de reação em segundos (N=6). Os asteriscos indicam a
diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina (*p<0.05; Turkey –
ANOVA).
84
0 25 50 75 1000
10
20
30
40SalinaMorfinaIndometacinaIL-10
*
**
Tempo (min)
Tem
po d
e re
ação
(s)
FIGURA 12. Efeito da interleucina-10 (IL-10) sobre o tempo de reação no teste da placa quente. Salina, morfina (5 mg/kg), indometacina (2 mg/kg) ou IL-4 (10 ng/animal)
foram administradas por via ip imediatamente após a medição do tempo zero. O tempo
de reação foi medido em intervalos de 30 min até os 90min. Os pontos representam a
média + EPM do tempo de reação em segundos. Os asteriscos indicam a diferença
estatística em relação ao grupo que recebeu salina (*p<0.05; Turkey – ANOVA).
85
13. EFEITO DA INTERLEUCINA-13 SOBRE O TEMPO DE REAÇÃO NO TESTE DA
PLACA QUENTE.
IL-13 (2.5 ng/animal - dose de maior efeito nos testes de contorção abdominal e
de incapacitação articular), a exemplo do observado com indometacina ou salina,
quando dada por via ip não foi capaz de modificar o tempo de reação dos animais no
teste da placa quente (Figura 13). Efeito este diferente da morfina (5 mg/kg; ip) que foi
capaz de aumentar esse tempo em até 379.5% (p<0,05; maior efeito).
14. EFEITO DO PRÉ-TRATAMENTO COM NALOXONA NA ANTINOCICEPÇÃO
OBTIDA PELA INJEÇÃO PRÉVIA DE IL-4 NAS CONTORÇÕES ABDOMINAIS
INDUZIDAS POR ÁCIDO ACÉTICO.
Naloxona (2 mg/kg,; ip) quando injetada antes da administração de IL-4
(5ng/animal, ip; dose de maior efeito) não foi capaz de reverter o bloqueio das
contorções abdominais induzidas por ácido acético (0.6%, ip) quando comparada ao
grupo pré-tratado somente com IL-4 na mesma dose. No entanto a mesma dose de
naloxona foi capaz de reverter completamente o bloqueio das contorções abdominais
por morfina (5mg/kg), quando este grupo é comparado ao grupo pré-tratado somente
com morfina (Figura 14).
86
0 30 60 900
10
20
30
40
50 SalinaMorfinaIndometacina
IL-13
*
**
Tempo (min)
Tem
po d
e re
ação
(s)
FIGURA 13. Efeito da interleucina-13 (IL-13) sobre o tempo de reação no teste da placa quente. Salina, morfina (5 mg/kg), indometacina (2 mg/kg) ou IL-13 (2.5
ng/animal) foram administradas por via ip imediatamente após a medição do tempo zero.
O tempo de reação foi medido em intervalos de 30 min até os 90min. Os pontos
representam a média + EPM do tempo de reação em segundos, sendo N=6. Os
asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina
(p<0.05; Turkey – ANOVA).
87
S IL-4 IL-4 Morf Morf0
30
60
90
120
+Nalox
+Nalox
4
*6
*6
*6
5#
AAc
Nº d
e Co
ntor
ções
FIGURA 14. Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva da interleucina-4 (IL-4) nas contorções abdominais induzidas por ácido acético. Ácido acético (AAc,
0.6%) foi administrado por via ip em camundongos Swiss previamente tratados (30 min
antes; ip) com salina (S) ou IL-4 (5 ng/animal) ou morfina (5 mg/kg). Dois grupos além da
IL-4 ou morfina, receberam também, previamente (15 min antes do AAc) naloxona (2
mg/kg) por via ip. As barras representam as médias + EPM do número total de
contorções abdominais ocorridas após 30 min da injeção do estímulo. Os números
indicados acima das barra indicam o número de animais ensaiados de cada grupo. Os
asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina como
pré-tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA) e o sustenido (#) indica a diferença
estatística entre o grupo da morfina e o grupo que recebeu naloxona previamente à
morfina (#p<0.05; Turkey – ANOVA).
88
15. EFEITO DO PRETRATAMENTO COM NALOXONA NA ANTINOCICEPÇÃO
OBTIDA PELA INJEÇÃO PRÉVIA DE INTERLEUCINA-10 NAS CONTORÇÕES
ABDOMINAIS INDUZIDAS POR ÁCIDO ACÉTICO.
Naloxona (2 mg/kg,; ip) quando injetada antes da administração de IL-10 (10
ng/animal, ip; dose de maior efeito) não foi capaz de reverter o bloqueio das contorções
abdominais induzidas por ácido acético (0.6%, ip) quando comparada ao grupo pré-
tratado somente com IL-10 na mesma dose. Entretanto, a mesma dose de naloxona foi
capaz de reverter completamente o bloqueio das contorções abdominais provocado por
morfina (5mg/kg), quando este grupo é comparado ao grupo pré-tratado somente com
morfina (Figura 15).
16. EFEITO DO PRÉ-TRATAMENTO COM NALOXONA NA ANTINOCICEPÇÃO
OBTIDA PELA INJEÇÃO PRÉVIA DE INTERLEUCINA-13 NAS CONTORÇÕES
ABDOMINAIS INDUZIDAS POR ÁCIDO ACÉTICO.
Naloxona (2 mg/kg,; ip) quando injetada antes da administração de IL-13 (2.5
ng/animal, ip; dose de maior efeito) não foi capaz de reverter bloqueio das contorções
abdominais induzidas por ácido acético (0.6%, ip) quando comparada ao grupo pré-
tratado somente com IL-13 na mesma dose. Contudo, a mesma dose de naloxona foi
capaz de reverter completamente o bloqueio das contorções abdominais provocado por
morfina (5mg/kg), quando este grupo é comparado ao grupo pré-tratado somente com
morfina (Figura 16).
89
S IL-10 IL-10 Morf Morf0
25
50
75
+Nalox
+Nalox
6
*6
*6
*6
6#
AAc
Nº d
e Co
ntor
ções
FIGURA 15. Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva da interleucina-10 (IL-10) nas contorções abdominais induzidas por ácido acético. Ácido acético (AAc,
0.6%) foi administrado por via ip em camundongos Swiss previamente tratados (30 min
antes; ip) com salina (S) ou IL-10 (10 ng/animal) ou morfina (5 mg/kg). Dois grupos além
da IL-10 ou morfina, receberam também, previamente (15 min antes do AAc) naloxona
(2 mg/kg) por via ip. As barras representam as médias + EPM do número total de
contorções abdominais ocorridas após 30 min da injeção do estímulo. Os números
indicados acima das barra indicam o número de animais ensaiados de cada grupo. Os
asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina como
pré-tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA) e o sustenido (#) indica a diferença
estatística entre o grupo da morfina e o grupo que recebeu naloxona previamente à
morfina (#p<0.05; Turkey – ANOVA).
90
S IL-13 IL-13 Morf Morf0
25
50
75
+Nalox
+Nalox
6
*4
*5
*6
4#
AAc
Nº d
e Co
ntor
ções
FIGURA 16. Efeito da naloxona na atividade antinociceptiva da interleucina-13 (IL-13) nas contorções abdominais induzidas por ácido acético. Ácido acético (AAc,
0.6%) foi administrado por via ip em camundongos Swiss previamente tratados (30 min
antes; ip) com salina (S) ou IL-13 (2.5 ng/animal) ou morfina (5 mg/kg). Dois grupos além
da IL-13 ou morfina, receberam também, previamente (15 min antes do AAc) naloxona
(2 mg/kg) por via ip. As barras representam as médias + EPM do número total de
contorções abdominais ocorridas após 30 min da injeção do estímulo. Os números
indicados acima das barra indicam o número de animais ensaiados de cada grupo. Os
asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina como
pré-tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA) e o sustenido (#) indica a diferença
estatística em relação ao grupo da morfina (#p<0.05; Turkey – ANOVA).
91
17. EFEITO DA INTERLEUCINA-4 NA LIBERAÇÃO DE TNF-α E IL-1β POR
MACRÓFAGOS PERITONEAIS RESIDENTES ESTIMULADOS in vivo COM
ZYMOSAN.
IL-4 na dose que induziu o maior efeito no bloqueio das contorções abdominais (5
ng/animal) foi capaz de inibir em 42% (p<0.05) a liberação de TNF-α (Figura 17A) e em
61.9% (p<0.05) a liberação de IL-1β (Figura 17B) por macrófagos peritoneais quando
injetada in vivo 30 min antes do estímulo zymosan, na mesma dose capaz de induzir
contorções abdominais (1 mg/animal). A inibição da liberação de IL-1β e TNF-α por IL-4
foi constatada pela dosagem das mesmas nos sobrenadantes de cultura dos
macrófagos obtidos das cavidades previamente tratadas com IL-4 e estimuladas com
zymosan. Para tal utilizou-se imunoensaios específicos paras ambas as citocinas já
descritos anteriormente.
18. EFEITO DA INTERLEUCINA-10 NA LIBERAÇÃO DE TNF-α E IL-1β POR
MACRÓFAGOS PERITONEAIS RESIDENTES ESTIMULADOS in vivo COM
ZYMOSAN.
IL-10 na dose de maior efeito em bloquear contorções abdominais (10 ng/animal)
foi capaz de inibir em 41.2% (p<0.05) a liberação de TNF-α (Figura 18A) e em 80.9%
(p<0.05) a liberação de IL-1β (Figura 18B) por macrófagos quando injetada in vivo 30
min antes do zymosan (na mesma dose capaz de induzir contorções abdominais- 1
mg/animal). A inibição da liberação de IL-1β e TNF-α por IL-10 foi constatada pela
92
dosagem das mesmas nos sobrenadantes de cultura dos macrófagos obtidos das
cavidades previamente tratadas com IL-10 e estimuladas com zymosan. Para tal utilizou-
se imunoensaios específicos paras ambas as citocinas já descritos anteriormente.
93
A B
S IL-40
1
2
*
Zym
TNF-α
(ng/
ml)
S IL-40.0
0.5
1.0
1.5
*
Zym
IL-1β
(ng/
ml)
FIGURA 17. Efeito da interleucina-4 (IL-4) na liberação de fator de necrose tumoral
– alfa (TNF-α) e interleucina-1 beta (IL-1β) por macrófagos peritoneais induzidos
por zymosan. Zymosan (Zym, 1 mg/kg) foi administrado em camundongos Swiss
previamente tratados (30 min) com salina ou IL-4 (5 ng/animal). 15 min após a injeção
do zymosan os macrófagos foram colhidos e postos em meio de cultura onde
permaneceram incubados em estufa de CO2, à 37º C por 12 horas. O sobrenadante foi
colhido e TNF-α (painel A) ou IL-1β (painel B) foram dosados por espectofotometria
(ELISA). As barras representam as médias + EPM da quantidade dosada TNF-α e IL-1β
de três animais por grupo. O asterisco indica a diferença estatística em relação ao grupo
que recebeu salina como pre-tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).
94
A
S IL-100
1
2
*
Zym
TNF-α
(ng/
ml)
B
S IL-100.0
0.5
1.0
1.5
*
Zym
IL-1β
(ng/
ml)
FIGURA 18. Efeito da interleucina-10 (IL-10) na liberação do fator de necrose
tumoral – alfa (TNF-α) e da interleucina-1 beta (IL-1β) por macrófagos peritoneais
induzidos por zymosan. Zymosan (Zym, 1 mg/kg) foi administrado em camundongos
Swiss previamente tratados (30 min) com salina ou IL-10 (10 ng/animal). 15 min após a
injeção do zymosan os macrófagos foram colhidos e postos em meio de cultura onde
permaneceram incubados em estufa de CO2, à 37º C por 12 horas. O sobrenadante foi
colhido e TNF-α (painel A) ou IL-1β (painel B) foram dosados por espectofotometria
(ELISA). As barras representam as médias + EPM da quantidade dosada de TNF-α e IL-
1β de três animais por grupo. O asterisco indica a diferença estatística em relação ao
grupo que recebeu salina como pre-tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).
95
96
IV. Discussão
97
Tem sido reconhecido que estímulos como ácido acético e o zymosan são
capazes de provocar nocicepção em animais experimentais como camundongos e ratos.
Quando injetados na cavidade peritoneal de camundongos induzem um comportamento
característico. Tal comportamento foi descrito como uma constricção em forma de onda,
começando no início do abdome, e indo em direção caudal, algumas vezes
acompanhada da torção do abdome e extensão das patas traseiras. Esta resposta vem
sendo denominada contorções abdominais (COLLIER et al., 1968). Em 1956 VANDE
WENDE & MARCOLIN e em 1957 SIGMUND et al. demonstraram que a injeção de
codeína, procaína ou morfina suprimia esse comportamento de contorção abdominal
induzido pela injeção de ácido acético e concluíram que essa resposta era nociceptiva e
que este seria um bom modelo para testar drogas analgésicas. Posteriormente foi
demonstrado que a injeção de zymosan também era capaz de induzir contorções
abdominais em camundongos (DOHERTY et al, 1985). Há dados na literatura que
indicam a participação de dois componentes na dor inflamatória induzida por ácido
acético ou por zymosan, o componente prostaglandínico e o componente simpático
(DUARTE et al, 1988; THOMAZZI, 1996). A clássica demonstração desses
componentes foi feita pré-tratando-se os animais com inibidores clássicos da
cicloxigenase tipo indometacina ou com agentes simpatolíticos como guanetidina,
reserpina, atenolol ou propanolol, ou ainda com a associação dos inibidores dos dois
sistemas envolvidos (DUARTE et al, 1988; THOMAZZI, 1996)
Sabendo-se disso escolhemos o ácido acético e o zymosan como estímulos
nociceptivos no teste de contorções abdominais. Procurou-se estabelecer a dose de
melhor resposta nociceptiva para esses dois estímulos. Para isso, foi realizada uma
curva dose resposta para o acido acético e outra para o zymosan. As doses eleitas
(0.6% para o ácido acético e 1mg/animal para o zymosan) foram utilizadas em todos os
98
testes de contorções abdominais.
De posse desses achados, investigou-se uma possível atividade analgésica das
interleucinas-4, 10 e 13 utilizando esses dois estímulos no modelo de contorções
abdominais. Como já foi dito, essas citocinas são reconhecidas moduladoras negativas
de alguns eventos da resposta inflamatória por inibir funções de certas células que
participam do processo inflamatório como macrófagos e mastócitos. Também já foi
mencionado na introdução desse trabalho que a atividade nociceptiva do ácido acético e
do zymosan parece depender da presença de tais células (RIBEIRO et al., 2000a). No
presente estudo, foi demonstrado que tanto a IL-4 , IL-10, como a IL-13 possuem
atividade analgésica nesse modelo pois foram capazes de inibir de maneira significativa
(p<0.05) as contorções abdominais induzidas pelo acido acético em 58.7%, 89.26% e
52% respectivamente, na dose de efeito máximo ou as induzidas por zymosan em
62.6%, 61.7% e 74.4%, respectivamente, na dose de maior efeito para cada citocina.
Procuramos reforçar a idéia de que IL-4, IL-10 e IL-13 possuem realmente uma
atividade analgésica periférica utilizando outro modelo de dor inflamatória experimental.
O modelo da incapacitação articular, descrito inicialmente por TONUSSI e FERREIRA
em 1992, é um teste mais objetivo. Esses autores demonstraram que a injeção de
carragenina na articulação de joelho de rato causa uma incapacitação articular dose-
dependente com o pico situado na 3a e 4a horas após a injeção do estímulo e que essa
incapacitação não era devido à formação do edema, visto que dextran, uma potente
substância edematogênica, não foi capaz de causar incapacitação (TONUSSI &
FERREIRA, 1992). O modelo também permite avaliar os mediadores inflamatórios e
algogênicos envolvidos no fenômeno. Neste mesmo estudo, a incapacitação articular
induzida por carragenina foi inibida tanto por bloqueadores da cicloxigenase como por
bloqueadores do sistema simpático, demonstrando que os mediadores que participam
99
do fenômeno são derivados de ambas as classes. Ficou demonstrado que a
incapacitação articular induzida por carragenina é um excelente modelo para testar
drogas analgésicas periféricas. Mais recentemente dados do nosso laboratório
mostraram que zymosan também é capaz de induzir incapacitação articular de maneira
significante e dose-dependente com o pico de incapacitação situando-se também entre a
3a e 4a hora (ROCHA et al., 1999; VIANA et al., 1998). ROCHA e colaboradores foram
mais além e demonstraram que a injeção de zymosan em articulações intactas induz
uma periartrite a qual é responsável pelo fenômeno da incapacitação articular, diferente
de quando o zymosan é injetado diretamente na sinóvia através de uma acesso cirúrgico
o qual não promove incapacitação articular (ROCHA et al., 1999). Esses achados estão
de acordo com a literatura, onde já foi demonstrado que a membrana sinovial possui
poucos nociceptores a maioria deles participam da função vascular autônoma
(HASSELBACHER et al., 1981), ao contrário da inervação da cápsula fibrosa, ligamento
articular e periósteo, estruturas ricamente inervadas por fibras simpáticas e somáticas
(KELLGREN et al., 1950; KENNEDY et al., 1982; GRÖNBLAD et al., 1985). Foi sugerido
que além da presença de mediadores liberados no local, a estrutura periarticular é
importante, tornando o local da injeção do estímulo crucial para o desenvolvimento da
incapacitação. Com base nesses achados escolhemos como estímulo o zymosan na
dose de maior efeito em promover incapacitação articular, (1 mg/animal; ROCHA et al,
1999; VIANA et al, 1998), injetado em articulações intactas, para testar a possível
atividade analgésica das interleucinas-4, 10 e 13 no modelo de dor articular.
Ficou demonstrado, no presente estudo, que tanto IL-4 como IL-10 ou IL-13
exercem uma atividade analgésica nesse modelo já que as mesmas foram capazes de
inibir de modo significante (p<0.05) a incapacitação articular induzida por zymosan com
49.2%, 68.9% e 69.9% de inibição, respectivamente para as doses de maiores efeitos de
100
cada citocina, sendo dose-dependente apenas o efeito da IL-4.
É interessante ressaltar que, o zymosan foi administrado localmente em
articulações intactas, enquanto que o pré-tratamento com as interleucinas foi feito por
via sistêmica (ip), observando-se uma inibição significativa no pico de incapacitação. No
entanto, IL-4 quando administrada localmente na articulação, na mesma dose, também
inibe o fenômeno, mas em uma percentagem inferior quando comparada à
administração sistêmica (dados não apresentados).
Na introdução do presente trabalho, ficou bem claro a importância de células
residentes do local da injúria para a sinalização dos eventos da resposta inflamatória,
assim como da dor inflamatória. A migração de neutrófilos para o foco inflamatório já foi
bem estudada. Nesse sentido, foi demonstrado que ela ocorre proporcionalmente ao
número de células residentes presentes no local da injúria. Como também já foi bem
discutido que as mesmas células participam dos eventos da inflamação através da
liberação de mediadores inflamatórios e provavelmente estas substâncias, dentre elas
os quimiotáxicos, são responsáveis pelo recrutamento de leucócitos para o local da
injúria.
Na artrite induzida por zymosan, foi observado que o estímulo causa intenso
influxo de células para a cavidade articular e que o fenômeno começa na 3ª hora e
atinge o máximo na 6ª hora, após a sua aplicação, com predominância de 80% de
neutrófilos (ROCHA et al, 1999). Também foi constatado, pelos mesmos autores, que
entre o grupo em que foi desenvolvida a periartrite e o grupo em que foi desenvolvido a
sinovite não existiu diferenças no influxo celular e permeabilidade vascular. Em adição,
apesar da presença de significante infiltrado celular na 3ª hora após a aplicação do
estímulo, o influxo só atingiu o pico na 6ª hora, enquanto que a incapacitação articular
atingiu o pico na 3ª e 4ª hora após sua indução. Essa discrepância cinética, além da
101
semelhança do influxo leucocitário entre os grupos de periartrite e sinovite, sugere que a
infiltração de células (neutrófilos) parece não ser relevante para o desenvolvimento da
incapacitação articular mas que esta nocicepção se correlaciona principalmente com a
sensibilização de determinados nociceptores situados nos tecidos periarticular
(periartrite). Isso pode implicar na importância da liberação de mediadores no local da
injeção por células residentes e não por células recrutadas.
Com base nesses dados, procuramos investigar se as interleucinas por nós
testadas, além de inibir a incapacitação articular, também seriam capazes de diminuir o
influxo celular na área de inflamação. Foi constatado que tanto IL-4 como IL-10 ou IL-13
quando administrada 30 min antes do zymosan por via ip, inibiram de modo significante
(p<0.05), em todas as doses, o número de leucócitos presentes no fluido articular com
53.8%, 62% e 92.1% de inibição, respectivamente para as doses de maior efeito de
cada citocina. A lavagem e coleta do fluido sinovial foi feito na 6ª hora (pico do influxo
celular).
Observando-se esses resultados não podemos associar a inibição do influxo de
leucócitos como sendo o responsável pela inibição da incapacitação articular, visto que,
o pico de influxo de leucócitos se encontra na 6ª hora após a injeção do estímulo e não
na terceira hora (pico de incapacitação). No entanto sugerimos que de uma maneira
indireta IL-4, IL-10 e IL-13 estão inibindo a dor articular e ao mesmo tempo o influxo de
leucócitos. Está descrito na literatura que na artrite induzida por zymosan em joelhos de
ratos os níveis de PGE2 no fluido articular encontram-se aumentados em torno da
terceira hora após a injeção do estímulo (GRIFFITHS et al., 1991) horário que coincide
com o nosso pico de incapacitação articular. Zymosan quando injetado em cavidade
peritoneal de camundongos também é capaz de promover um rápido extravasamento de
proteinas do plasma assim como a indução da síntese de PGE2, PGI2 e leucotrienos
102
(DOHERTY et al, 1985, 1987). Podemos sugerir que as citocinas por nós estudadas
foram capazes de inibir o influxo de leucócitos para a cavidade articular por estarem
inibindo a liberação, por células residentes da cavidade articular, de mediadores
quimiotáxicos ou de citocinas pró-inflamatórias que por sua vez iriam recrutar leucócitos
para o local da injeção do estímulo. A inibição da liberação desses mediadores então
causaria a diminuição do número de leucócitos na cavidade articular até a 6ª hora.
Já foi demonstrado que IL-10, quando dada sistemicamente, tem a capacidade de
atravessar a barreira hematoencefálica para agir no sistema nervoso central (DI SANTO
et al., 1997). Resolvemos testar então a possibilidade das citocinas por nós estudadas
estarem inibindo a nocicepção também por um efeito central. Essa hipótese foi
descartada pela incapacidade de IL-4, IL-10 e IL-13 inibirem a nocicepção térmica no
teste da placa quente, teste algesimétrico sensível apenas para drogas que agem a nível
supra espinal, ou seja, que exercem efeito central. Efeito esse diferente da morfina a
qual quando injetada em camundongos tornou-os totalmente irresponsivos ao teste.
A capacidade que algumas citocinas tem de estimular a liberação de peptídeos
opióides endógenos tipo β-endorfinas tem sido aventada na literatura principalmente
para IL-6 (BERTOLUCCI et al., 1996). Também tem sido referido que PGE2 parece
exercer esse mesmo tipo de efeito. Nesse contexto, no presente trabalho, procurou-se
mostrar que a atividade analgésica de IL-4, IL-10 e IL-13 era independente da indução
da liberação de tais substâncias. Foi observado que a antinocicepção conseguida pelo
pré-tratamento com as interleucinas estudadas não foi revertida pela naloxona, um
conhecido antagonista de receptores opióides, na mesma dose em que foi capaz de
reverter o efeito da morfina. O efeito antinociceptivo dessas citocinas portanto não
parece se relacionar com a liberação ou potenciação do efeito de opiódes endógenos.
Ao longo da introdução desse trabalho, foi bem discutido que macrófagos são
103
células hábeis em liberar diversas citocinas pró-inflamatórias como IL-1, TNF e IL-8, as
quais são potentes indutoras de hiperalgesia através da estimulação dos componentes
eicosanoide e simpático da dor inflamatória. Como também já foi demonstrado na
literatura que zymosan, o estímulo por nós utilizado na metodologia de contorções
abdominais, é capaz de induzir a liberação de mediadores inflamatórios dentre eles:
componentes do sistema complemento (PILLEMER AND ECKER, 1941),
prostaglandinas e leucotrienos (BONNEY et al., 1978; SCOTT et al., 1980; HUMES et
al., 1982), fator de ativação plaquetária (ROUBIN et al., 1982), espécies reativas do
oxigênio (NAUSEEF et al., 1983) e enzimas lisossomiais (BONNEY et al., 1978). Em
1985 foi demonstrado que a injeção intraperitoneal de zymosan (1 mg/animal) em
camundongos causou uma notável reação inflamatória consistindo de um rápido
acúmulo de proteínas e o acúmulo de células (macrófagos e mastócitos) em uma fase
mais tardia, indicando a rápida liberação de mediadores capazes de aumentar a
permeabilidade vascular e de mediadores quimiotáxicos. Uma resposta dolorosa
também foi observada (contorções abdominais) além da presença de prostagandina
(PGE2) e leucotrieno (LTC4) no flúido peritoneal (DOHERTY et al., 1985).
A dose de zymosan utilizada por esses autores coincide com a dose mais eficaz,
demonstrada por nós, em induzir contorções abdominais. Nesse sentido investigou-se a
capacidade desse estímulo estar induzindo a liberação de citocinas pró-inflamatórias
como IL-1β e TNF-α por macrófagos residentes e a possibilidade de que as citocinas
por nós estudadas estejam agindo diminuindo essa liberação. Para isso, foi usado a
mesma dose de zymosan utilizada no teste de contorções abdominais e as doses de
maior efeito da IL-4 e da IL-10 em inibir o número de contorções. A indução dos
macrófagos foi feita in vivo assim como o pré-tratamento com as interleucinas-4 e 10. O
sobrenadante de cultura de macrófagos obtidos desses animais foi avaliado quanto à
104
presença de TNF-α e IL-1β e foi observado então que tanto IL-4 quanto IL-10 foram
capazes de inibir, de forma significativa (p<0.05), nessas circunstâncias, a liberação de
TNF-α, com 42% e 41.2% de inibição, respectivamente, e também de IL-1β, com 61.9%
e 80.9% de inibição, respectivamente, por macrófagos estimulados in vivo por zymosan
e pré-tratados também in vivo com IL-10 e IL-4.
É bem sabido que interleucinas como IL-4, IL-10 e IL-13 são liberadas
tardiamente no processo infamatório. A liberação acontece somente após a secreção
das citocinas pró inflamatórias e assim agem como um freio regulador da inflamação. A
capacidade dessas citocinas inibirem a resposta dolorosa também pode ser explicada da
mesma maneira. Com a injeção dos estímulos, ácido acético ou zymosan, há uma
rápida liberação por células residentes de mediadores nociceptivos que dependem da
indução por citocinas pró-inflamatórias promovendo o comportamento de contorções
abdominais. Após um período de 30 a 40 minutos as contorções abdominais começam a
ficar escassas até desaparecerem (dados não apresentados). Isso pode ser explicado
pelo possível papel regulatório das citocinas inibitórias que são liberadas pouco tempo
depois do início da resposta inflamatória, freiando então a resposta dolorosa. Não
procuramos demonstrar que com ácido acético o mesmo ocorre por que já está descrito
na literatura que esse estímulo promove lise celular (DORHERTY et al., 1985)
dificultando a cultura de células e assim a dosagem de citocinas.
Por fim, o presente estudo procurou analisar o papel inibitório das interleucinas 4,
10 e 13 na dor inflamatória. Através de modelos experimentais conseguiu-se demonstrar
que as mesmas inibem a nocicepção de forma periférica e que sua ação analgésica se
deve principalmente a uma ação inibitória sobre células residentes as quais atuam
liberando citocinas hiperalgésicas responsáveis pela indução da nocicepção, à
semelhança do que demonstrou POOLE e cols., em 1995 e CUNHA e cols., em 1999
105
para IL-10 e IL-4, respectivamente. Isso nos permite associar a presença de tais
interleucinas como sendo freios reguladores da resposta nociceptiva durante os eventos
da resposta inflamatória fisiológica.
V. Conclusões
106
CONCLUSÕES
1. As interleucinas 4, 13 e 10 demonstraram ter atividade analgésica no modelo
de contorções abdominais induzidos por ácido acético ou zymosan.
2.As interleucias 4, 10 e 13 demonstraram atividade analgésica também no
modelo de incapacitação articular induzida por zymosan.
3. As mesmas interleucinas inibiram o influxo de leucócitos para a cavidade
articular, mostrando um efeito antiinflamatório.
4. A atividade analgésica das interleucinas estudadas parece se dever a um efeito
periférico, visto que não foram eficazes em inibir a nocicepção térmica induzida no teste
da placa quente, utilizado principalmente para medir a eficácia de substâncias
analgésicas que exercem efeito central.
5. O potencial analgésico das três interleucinas possivelmente não tem relação
com a liberação ou potenciação de opióides endógenos tipo β-endorfinas, visto que a
naloxona (clássico antagonista de receptores opióides) não foi capaz de reverter as suas
ação antinociceptiva.
6. As interleucinas 4 e 10 inibiram a liberação de TNF-α e IL-1β por macrófagos
estimulados in vivo e postos em cultura, sugerindo que a atividade analgésica exercida
por essas citocinas provavelmente se deva a uma ação modulatória sobre a liberação de
mediadores inflamatórios por células residentes presentes no local da injúria.
107
108
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