Análise de QTL associados com a qualidade de sementes
Uma abordagem rápida sobre o que foi apresentado no curso e sua relação com os trabalhos desenvolvidos no LBBB
Baseado em: 27/04/2012 – Quinta–feiraAnálise de QTL associados com a qualidade de sementes Prof. Dr. Henk W. W. Hilhorst
Apresentado por:
Dr. Guilherme Araújo Lacerda
Salvador – BA, 18 de maio de 2012
A qualidade das sementes é um conjunto de características complexas
Potencial de GerminaçãoGerminação sob condições normais
Germinação sob estresse osmótico
Germinação sob estresse salino
Germinação sob estresse térmico
Germinação sob estresse oxidativo
Dormência (pós-maturação vs. sementes frescas)
Logenvidade da semente
Germinação após deteriorização controlada
Germinação após o envelhecimento
Reserva nutricional
Tamanho e massa da semente
Arquitetura do embrião
Morfologia da plântulaPlântulas normais
Tamanho da parte aérea
Tamanho da raíz
Tamanho do hipocótilo
Raio de crescimento radicular
Arquitetura da raíz
Plantas utilizáveis
Plântulas de mamoneira
Gaspar-Oliveira et al (2010)
Gaspar-Oliveira et al (2010)
A qualidade da sementes é um conjunto de características complexas e poligências.
Abordagem integradaParâmetros fisiológicos (fenotipagem)
Herança genética e interação entre loci
Expressão genética (transcriptômicas)
Metabólitos e perfil hormonal (metabolômica)
Estudos usando sementes de Arabidopsis, Tomate e Alface
Plântulas de mamoneira
http://indocorporation.en.nobodybuy.com/pid753607/premium-jatropha-curcas-seeds-10-tons-av.htm
Lactuca sativa L. – arquivo pessoal
Como podemos encontrar o(s) gene(s) relacionado(s) a uma determinada característica?
Cromossomometafásico
Armação condensada –cromatina associada
Intérfase:Armação extendida –cromatina associada
Armação do cromossomo
Fibras de cromatina são compactadas em nucleossomos
“Contas de um colar” formam a cromatina
Região curta do DNA dupla hélice
“Conceito é melhor que definição, pois esta necessita ser absoluta”
João Nakagawa (2012)João Nakagawa (2012)
O conceito de gene
Um gene é visto como uma unidade física do cromossomo, relacionada a uma função específica, como a síntese de uma proteína.
“We’ve come to therealization that thegenome is full ofoverlapping transcripts.”— Phillip Kapranov
“Nós chegamos à conclusão de que o genoma está cheio de transcritos sobrepostos.” — Phillip Kapranov
Números cromossômicos importantes:
• As análises dos genótipos cultivados e silvestres de mamoneira Mirante e IAC-80 revelaram metáfases com 20 cromossomos (2n=20), todos metacêntricos (Barbosa et al. 2010).
• A espécie Jatropha curcas é uma espécie diplóide com 2n=22 cromossomos (NUNES, 2007).
O conceito de QTL (quantitative trait locus)
Versão - locus de característica quantitativa
A análise por QTL revela em qual cromossomo se encontra o gene e o nível de expressão relativa deste com sua interação com outros genes.
Adaptado de Hilhorst (2012)
Conceito de Análise de QTLs
É um método estatístico que conecta dois tipos de informação – dados fenotípicos (caracteres mensuráveis) e dados genotípicos (usualmente marcadores moleculares).
Miles e Wayne (2008)
Parentais
F1
F2
F2:3
⊗
⊗
×
A B
RC1, RIL , DHL Campo
PopulaçãoMAPEAMENTO DE QTLs
Dos QTLs para o genes
O mapa de QTL representa uma centana de genes. Então, como encontrar um único gene responsável por certa característica?
Abordagem clássica:Comfimação QTLs por novas linhagens isogênicas + subsequente mapeamento refinado;Novas Linhagens Isogênicas (NILs);Famílias endogâmicas heterogêneas (HIFs);Etc.
ISSO PODE LEVAR ANOS!
Figura 1. Desenvolvimento de linhagem F6 de mamona porte baixo com baixa concentração de toxinas.
Auld et al (2001)
NOVA ABORDAGEMConectando a variação genômica com o fenótipo e performance
VARIAÇÃO GENÉTICA
SNPs deletados, outros marcadores
PERFIS
TranscritosProteínas
Metabólitos
Interações
Performance dosFENÓTIPOS
Fenótipo PHT[cM]
210 190 203 159 206 . . 171
Marcadores # 1 2 3 4 5 .. M 1 B B H H A .. A 2 H A H A A .. H 3 B B H H H .. A 4 H H B B B .. H 5 H B H H A .. B . . . . . . . . . . . . . . . . N A H H H A .. A
Laboratório
Cromossoma 1
LOD score PHT
Análises
Parentais
F1
F2
F2:3
⊗
⊗
×
A B
RC1, RIL, DHLCampo
PopulaçãoMAPEAMENTO DE QTLs
Como a análise de QTL é conduzida?
A análise de QTL requer 2 ítens:
(3)Necessita-se de 2 ou mais variedades de organismos com diferenças genéticas considerando-se a característica de interesse;
(5)Requere-se marcadores genéticos que distinguem as linhagens parentais.
Miles e Wayne (2008)
Um comportamento normal exibe um padrão de expressão diferente de um controle.
O uso de microarrays permite conhecer que genes são usados (e com que intensidade) em uma infinidade de situações.
A análise da expressão de genes pode fornecer informações importantes sobre as funções da célula.
Microarray - compara expressão de genes
Arranjos (arrays), que contêm um grande número de genes distribuídos de forma ordenada sobre placas de vidro.
www.microarrays.med.uu.nl/pix/spotter1.jpg
Fundamentos:O princípio da técnica de microarray se baseia na habilidade da molécula de mRNA se ligar, ou hibridizar, ao DNA molde do qual foi originado.
http://www.imtek.de/anwendungen/content/workinggroups/topspotmikroarrayer/Microarray_Illustration_Kopplung.gif
Moléculas de mRNA são utilizadas como moldes para a sintese de cDNA marcadas com rótulos fluorescentes verdes Cy3 (Cianina 3).
Da mesma forma, as moléculas de mRNA da célula controle são separadas e transcritas, marcadas com tótulos vermelhos Cy5 (cianina 5).
Análise de expressão gênica usando microarray.
Duggan et al., 1999
Clones DNA Teste Referência
TranscriçãoReversa
Sondas com fluoroforos
Purificação eamplificação por PCR
Impressãorobótica
Alvos hibridizados para o microarranjo
Laser 1 Laser 2
excitação
emissão
Análise computacional
Fig. 1 Sensibilidade de germinação de sementes de Lactuca sativa cv. Salinas(Sal, círculos) e L. serriola UC96US23 (UC, triângulos) à temperaturae priming (não tratados, símbolos fechados; condicionadas, símbolos abertos).Sementes (25 em cada uma das duas repetições) foram embebidas em placas de Petri em cada temperatura e a emergência radícula foi observada 72 h após plantio.
Fig. 2 Respostas de temperaturade germinação do controle (a)e osmocondicionadas (b) as sementes de 89linhagens recombinantes (RILs)em 27-35 ºC. Duas réplicas de25 sementes foram testadas acada temperatura sobre uma mesa gradiente, a emergência da radículafoi observada 48 h após o plantio.Em ambos os painéis, RILs são classificados a fim de aumentar seupercentual de germinação dassementes ativadas no máximode temperatura à qual agerminação ocorreu.
LsNECD4 codifica para NINE-CIS_EPOXYCAROTENOID DIOXYGENASE 4uma enzima chave na síntese de ABA
LsGA3ox1 codifica para GA 3-ß-HYDROXYLASEregula a síntese de GA pela luz em alface
LsACS1 codifica para 1-aminocyclopropane carboxylate (ACC)uma enzima catalítica na biossintese de etileno
Confirmação do QTL por fenotipagem de uma nova linhagem isogênica com o alelo Htg6.1 a partir
de ambas variedades Salinas e UC96US23
Um QTL (Ht6.1) de efeito do priming mensurado a 35º C em 43cM colocado com LsNCED4 a 43.5 cM
Confirmado futuramente em mapa refinado (intevalo de < 1 cM)
Salinas
UC96US23
Inibição em alta temperatura
LsNCED4
ABA
Priming ou Htg6.1 alelo UCLsGA3ox1
LsACS1Luz
GAetileno
Germinação
Schwember e Bradford (2010)
Contato:[email protected]
Pós-doutorando do Programa de Pós-graduação
Bolsista do Programa Nacional de Pós-doutorado (PNPD)
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