Zeszyt Studentów Biotechnologii
numer 10
Kraków, wrzesień 2016
Od redakcji
DRODZY CZYTELNICY!
W dziesiątym numerze Zeszy-tów Naukowych zachęcamy dozapoznania się z bardzo cieka-wymi publikacjami z zakresubiotechnologii oraz biochemiii fizjologii roślin. W pierwszymartykule Marta Fifielska przed-stawi naukowe aspekty zyskują-cej na popularności alternatywiedla cukru - stewii. NastępnieSara Nawrocka przybliży nammetodę analizy parametrów fi-zjologiczno-biochemicznych ro-ślin za pomocą chormatografiigazowej oraz cieczowej . WiktorTokarek zapozna nas z mniejznanymi chlorofilami, a MariiaBorbuliak przedstawi nowator-skie narzędzie do badania pHwe wnętrzu komórki. Zaprasza-my także do wzięcia udziałuw międzynarodowej konferencjiBioChemMed Session organi-zowanej przez AkademickieStowarzyszenie Studentów Bio-technologii.
Życzymy miłej lektury!
ZESPÓŁ REDAKCYJNY
3
Zespół redakcyjny
Dobrochna DolickaAgnieszka Seretny
Irma Gryniuk
Okładka
Irma GryniukZdjęcie kryształów lizozymu zostało wykonane przez dra Rafała Dolota
w lipcu 2015 (Zakład Chemii Bioorganicznej , Centrum BadańMolekularnych i Makromolekularnych PAN w Łodzi), białka lizozymu
zostały wykrystalizowane przez Agnieszkę Dąbrowsk
Skład
Dobrochna Dolicka
Korekta
Zespół redakcyjny
Wydawca
KNSB Mygen
Nakład 500 szt
Kontakt
ISSN 1899-5535
Sfinansowane przez:
Spis treści:
Stewia jako alternatywa dla wysokokalorycznego cukru
Marta Fifielska, Karolina Hulisz 7
Wykorzystanie chromatografii gazowej oraz cieczowej w analizie
wybranych parametrów fizjologiczno-biochemicznych roślin
Sara Nawrocka 14
Od c do f, czyli mniej znane chlorofile
Wiktor Tokarek 23
pHluorins – a tool to measure intracellular pH
(artykuł w j. angielskim)
Mariia Borbuliak, Wiktor Tokarek 38
Zaproszenie na BioChemMed Session 46
5
Wstęp
Stewia wykorzystywana już była setki
lat temu przez Indian Guarani za-
mieszkujących Amerykę Południową
[19]. Tradycyjna metoda stosowania
tej rośliny przez paragwajskich Indian
polegała na suszeniu jej liści i użyciu
ich do słodzenia napojów. Stosowano
ją także w lecznictwie oraz jako słodką
przekąskę [9]. Japończycy wykorzystu-
ją stewię i jej produkty do pieczenia,
gotowania, w żywności przetworzonej ,
sokach owocowych, wyrobach tytonio-
wych czy gumach do żucia. Obecnie,
główne kraje, które zajmują się upra-
wą stewii to: Tajwan, Chiny, Japonia,
Korea w Azji oraz Brazylia i Paragwaj
w Ameryce Południowej [24].
Stewia jest rośliną jednoroczną, o roz-
budowanym systemie korzeniowym.
Charakteryzuje się dość długim pędem
sięgającym nawet do 120 cm wysoko-
ści [12]. Kwiatostan stanowią balda-
chogrona ułożone w luźne wiechy.
Drobne kwiaty są barwy białej lub ja-
snofioletowej . Niewielkie liście mają
kształt lancetowaty, owalny lub łopat-
kowy. Ich powierzchnię mogą pokry-
wać włoski [24]. Liście są organem
o najwyższej zawartości glikozydów.
Jednakże, związki te występują także
w mniejszych ilościach w kwiatach,
nasionach, łodygach czy korzeniach
[5].
Rozmnażanie stewii przez nasiona,
Stewia jako alternatywa dla wysokokalorycznego
cukruMarta Fifielska, Karolina HuliszKoło Naukowe Biotechnologii BioXKatedra Genetyki, Fizjologii i Biotechnologii RoślinWydział Rolnictwa i BiotechnologiiUniwersytet Technologiczno - Przyrodniczy w BydgoszczyPraca napisana pod opieką dr inż. Iwony Jędrzejczyk i dr inż. MagdalenyTomaszewskiej-Sowy
W ostatnim czasie obserwuje się wzrost zainteresowania zdrowym trybem
odżywiania. Coraz częściej konsumenci zwracają uwagę na skład
i kaloryczność produktów spożywczych. Nadmierna konsumpcja cukru
powoduje wiele dolegliwości i chorób, takich jak: cukrzyca, nadwaga, czy
nadciśnienie. Z tego względu, poszukiwane są niskokaloryczne produkty
obniżające ilość spożywanej sacharozy. Syntetyczne środki słodzące, takie
jak sukraloza czy sacharyna, budzą pewne obawy dotyczące ewentualnego,
negatywnego wpływu na zdrowie człowieka. W związku z tym faktem,
dobrą i zdrową alternatywą jest wykorzystanie stewii. Jest to roślina zielna
z rodziny Asteraceae, pochodząca z górskiego regionu Amambay leżącego
na pograniczu Brazylii i Paragwaju. Dzięki właściwościom słodzącym
określana jest jako "miodowy liść" lub "słodkie zioło". Za walory smakowe
odpowiada grupa związków nazywanych glikozydami stewiolowymi.
7
ogranicza zmienność genetyczna
oraz niska zdolność kiełkowania na-
sion. Sadzonkowanie, czyli metoda
rozmnażania wegetatywnego jest cza-
sochłonna i pozwala na uzyskanie ma-
łej liczby sadzonek otrzymanych
z pojedynczych roślin. Dlatego dobrą
alternatywą mogą okazać się kultury
tkankowe in vitro [1 1 ]. Mikrorozmna-
żanie pozwala na szybkie i masowe
namnażanie roślin identycznych gene-
tycznie. Uzyskany materiał roślinny
jest jednakowy pod względem składu i
zawartości glikozydów stewiolowych
[18].
Właściwości biologiczne
Glikozdydy stewiolowe, to grupa dzie-
więciu związków chemicznych, odpo-
wiadających za silne właściwości
słodzące stewii. Wśród nich wyróżnić
można stewiozyd i rebaudiozyd A
[Rys. 1 ] . Stanowią one odpowiednio
65% i 25% mieszaniny w ekstrakcie
z liści. Do pozostałych glikozydów zali-
cza się: rebaudiozyd B, C, D, E, F, duc-
lozyd A i C oraz stewiolbiozyd. Związki
te są pochodnymi stewiolu, połączone-
go wiązaniami glikozydowymi z gluko-
zą, ramnozą i ksylozą. Najbardziej
stabilny termicznie okazuje się rebau-
diozyd A, który stanowi 2-4% świeżej
masy liści. Jego potencjał słodzący
w porównaniu do sacharozy jest 150-
350 razy wyższy. Charakteryzuje się
najlepszą jakością sensoryczną i walo-
rami smakowymi, ma najmniej gorzka-
wy posmak. Nie ulega fermentacji
i odróżnia się od stewiozydu nieco lep-
szą rozpuszczalnością w wodzie.
Stewiozyd jest 200-450 razy słodszy
od sacharozy. Ma postać białego, bez-
wonnego, krystalicznego proszku. Wy-
ekstrahowany został z liści stewii,
a jego zawartość wynosi 6-18% ich
świeżej masy. Ze względu na to, że po-
woduje gorzkawy, lukrecjowy posmak,
jest mniej pożądany niż rebaudiozyd A.
Jednakże podobnie jak on, stewiozyd
pozostaje stabilny w wysokich tempe-
raturach i nie ulega fermentacji. Bar-
dzo dobrze rozpuszcza się
w alkoholach i wodzie. Proces pozy-
skiwania glikozydów stewiolowych od-
bywa się poprzez ekstrakcję
z surowców roślinnych. Polega to na
wymywaniu substancji z rozdrobnio-
nych i suchych liści. W celu rozpusz-
czenia, stosowana jest gorąca woda
lub rozpuszczalnik organiczny, np. al-
kohol. Ekstrakcji sprzyja wcześniejsza
hydroliza enzymatyczna surowca.
Obejmuje ona struktury tworzące
ściany komórkowe w budowie liścia
tj . pektyny, celulozy lub hemicelulozy.
Uzyskany ekstrakt poddaje się rożnym
metodom oczyszczania tak, aby otrzy-
mać koncentrat wysokiej jakości
[1 , 1 2].
Stewia, stanowiąca naturalny słodzik,
swoją niskokaloryczność zawdzięcza
właściwościom, jakie posiadają gliko-
zydy stewiolowe. Nie są one trawione,
tylko ulegają rozkładowi do glukozy
i stewiolu. Ich hydrolizę przeprowa-
dzają bakterie z rodzaju Bacteroides
sp. , które bytują w jelicie grubym.
Ze względu na to, że katabolizm tych
związków odbywa się dopiero na eta-
pie jelita grubego, mikroflora bakte-
ryjna wykorzystuje uwolnioną z nich
glukozę. Stewiol natomiast ulega
wchłonięciu w jelitach, następnie
transportowany jest do wątroby i tam8
9
Rys. 1 Struktura chemiczna glikozydów stewiolowych [13].
przekształcany do pochodnej glukuro-
nidu. W końcowym etapie wydalany
jest z moczem [3].
Korzyści zdrowotne
Obecnie znanych jest wiele roślin
zdolnych do wytwarzania substancji
glikozydowych. Wśród nich można
wyróżnić Stevia rebaudiana , która wy-
kazuje potencjał do syntezy chemicz-
nej pewnej grupy związków
posiadających wartościowe właściwo-
ści biologiczne. Wyciągi z liści Stevia
rebaudiana zawierają mieszaninę nie-
kancerogennych, niskokalorycznych,
niemutagennych glikozydów stewiolo-
wych, których konsumpcja wywiera
korzystny wpływ na zdrowie człowieka
[17]. Nie bez powodu od wielu lat
w Ameryce Południowej stosuje się
ekstrakty z liści stewii jako skuteczny
środek do leczenia cukrzycy ty-
pu 2 [1 5]. Ich regularne spożywanie
pozwala na zmniejszenie cukru
oraz cholesterolu we krwi. Badania
wykazały, że spożycie glikozydów ste-
wiolowych wpływa na obniżenie glu-
kozy we krwi. Jest to związane z pod-
niesieniem wrażliwości insulinowej
i tym samym zwiększoną aktywnością
komórek β wysp trzustki. W przypadku
cukrzycy wydzielanie hormonu pepty-
dowego przez wysepki Largenhansa
jest zaburzone, co powoduje wahania
poziomu glukozy we krwi [10, 21 , 22].
Spożycie glikozydów stewiolowych
przyczynia się również do łagodnego
obniżenia nadciśnienia tętniczego po-
przez wpływ na rozluźnienie skurczu
mięśniówki naczyń krwionośnych
[4, 20]. W przypadku glikemii, jak
i nadciśnienia tętniczego, dawka tera-
peutyczna glikozydów stewiolowych
powinna wynosić nie mniej niż 1000
mg/dobę. Kumari i Chandra [16]
w przeprowadzonych badaniach udo-
wodnili zarówno antyoksydacyjny,
przeciwbakteryjny, jak i przeciwdrob-
noustrojowy wpływ wyciągów stewii
w stosunku do szerokiej gamy patoge-
nów obecnych w żywności, tj . : Bacillus
subtilis, Klebsiella pneumoniae, Sal-
10
krzepnięcie krwi, wzmacnia naczynia
krwionośne oraz wpływa na odnowę
komórkową organizmu [17]. Roślina
może być spożywana przez osoby cho-
re na fenyloketonurię, ponieważ
nie zawiera w swoim składzie fenylo-
alaniny [2, 20].
Zastosowanie w przemyśle
Stewia, jako naturalny środek słodzą-
cy, jest dostępna i powszechnie stoso-
wana w technologii produktów
spożywczych w różnych rejonach
świata, tj . w Chinach (największy eks-
porter stewiozydu na świecie), Korei,
Japonii, Południowo-Wschodniej Azji,
czy w Ameryce Południowej . Wyjąt-
kiem są Stany Zjednoczone, gdzie za-
równo ekstrakt roślinny, jak
i sproszkowane liście wykorzystywane
są jako suplementy diety oraz składni-
ki produktów do pielęgnacji skóry [17].
Wszelkiego rodzaju substancje słodzą-
ce, takie jak tradycyjny cukier (sacha-
roza, syrop kukurydziany, glukoza, czy
fruktoza) i sztuczne środki słodzące
(aspartam, cykloaminiany, acesulfam
K), są często stosowane w przemyśle
spożywczym. Ze względu na ich szko-
dliwy oraz, w przypadku sztucznych
słodzików, kontrowersyjny wypływ
na zdrowie człowieka stopniowo zo-
stają one eliminowane z żywności i za-
stępowane przez niskokaloryczne
glikozydy stewiolowe [13]. Naturalne
źródło substancji słodzących znajduje
zastosowanie w wielu produktach spo-
żywczych, takich jak: słodycze bezcu-
krowe, czekolady, cukierki, lody,
ciastka, dżemy, owoce morza, fermen-
towane produkty mleczne, ogórki kon-
serwowe, gotowe do jedzenia zboża,
monella typhimurium, Pseudomonans
aeurginosa, Aspergillus niger, Alterna-
ria solani oraz Penicillium chryzoge-
num . Dzięki przeciwbakteryjnemu
działaniu glikozydy zapobiegają po-
wstawaniu owrzodzeń w przewodzie
pokarmowym oraz są przydatne w le-
czeniu oparzeń i ran. Ekstrakty z liści
stewii wykazują szerokie spektrum in-
hibicj i w stosunku do czterech seroty-
pów ludzkiego rotawirusa (HRV)
przyczyniającego się do zapaleń żołąd-
kowo-jelitowych [6, 17].
Stewia wywiera korzystny wpływ
na dziąsła oraz hamuje wzrost płytki
nazębnej [8]. Ekstrakty stewii przeja-
wiają działanie przeciwko szczepom
jamy ustnej , tj . Streptococcus mutans
stanowiących czynnik etiologiczny
próchnicy zębów. Dzięki działaniu
przeciwbakteryjnemu jest coraz czę-
ściej stosowana jako składnik past
do zębów [10, 23].
Stevia rebaudiana Bertoni będąca źró-
dłem mikroelementów, takich jak se-
len, żelazo, cynk, czy witamina C,
zapobiega nawrotom infekcji wiruso-
wych i bakteryjnych. W dodatku ste-
wiozydy stosowane jako zamienniki
sacharozy stają się świetną alternaty-
wą w leczeniu otyłości. Ich niski in-
deks glikemiczny, w porównaniu
z wysokokalorycznym cukrem, spra-
wia, że organizm ludzki zużywa zapasy
energetyczne z tkanki tłuszczowej ,
czego rezultatem jest spadek masy
ciała [20]. Badania kliniczne wykazały
również inne, prozdrowotne właściwo-
ści ekstraktów z liści stewii. Obejmują
one działanie przeciwnowotworowe,
przeciwzapalne, przeciwbiegunkowe
i diuretyczne. Ekstrakt poprawia
kawa, herbaty ziołowe, czy słodziki
stołowe [9, 14]. Od niedawna stewia
jest wykorzystywana również do pro-
dukcji pieczywa przeznaczonego dla
cukrzyków. Jej dodatek wpływa na tek-
sturę, miękkość i trwałość produktu
piekarniczego [9].
W przemyśle kosmetycznym jest uży-
wana jako składnik maseczek, działa-
jących leczniczo na wrzody i skórę
problematyczną (trądzikową). Przy-
spiesza gojenie się ran, dezynfekuje
skórę i zamyka rozszerzone pory [8].
Stewia może być stosowana w postaci
koncentratów, wyciągów oraz świe-
żych bądź suszonych liści, Do żywności
dodawana jest w formie tabletek,
proszku oraz płynu, roztworu skon-
centrowanego ekstraktu glikozydów
stewiolowych lub soku z liści [2, 13].
Glikozydy stewiolowe jako dodatki do
żywności zostały oznaczone na opako-
waniach symbolem E960 [13].
Podsumowanie
Stevia rebaudiana Bertoni jest staro-
żytną roślina wytwarzająca diterpeny
glikozydowe, które są naturalnymi,
bezkalorycznymi substancjami o wiel-
kim potencjale słodzącym, co odgrywa
ogromne znaczenie w produkcji nisko-
energetycznej żywności [7]. Stewia
jest również źródłem błonnika pokar-
mowego oraz związków o charakterze
antyoksydacyjnym. W porównaniu
z cukrem, charakteryzuje się ona
ogromną zawartością mikroelementów
(żelazo, mangan, cynk, selen, miedź),
których największa ilość zmagazyno-
wana jest w młodych liściach [8, 15].
Glikozydy stewiolowe nie ulegają fer-
mentacji. Co więcej , wykazują stabil-
ność w temperaturze 200°C,
co oznacza, że mogą być używane jako
słodzik do ciast, a intensywność słody-
czy nie ulega spadkowi [17]. Roślinne
związki wykazują działanie przeciw-
bakteryjne, antynowotworowe, immu-
nosupresyjne. Nie są mutagenne,
ani genotoksyczne, dzięki czemu moż-
liwe jest ich wykorzystanie w dietote-
rapii [15].
Uprawa w naturalnych warunkach
Stevia rebaudiana niesie ze sobą wiele
problemów. Jednym z nich jest hetero-
zygotyczność i samoniezgodność. Na-
siona tego gatunku odznaczają się
bardzo niską zdolnością kiełkowania,
co znacznie ogranicza jej uprawę.
Rozmnażanie przez nasiona nie po-
zwala na wytworzenie jednorodnych
populacji zarówno pod względem fe-
notypowym, jak i genotypowym. Roz-
wiązaniem dla tradycyjnych metod
rozmnażania, stają się roślinne kultury
tkankowe in vitro. Pozwalają one na
masowe i szybsze uzyskanie roślin
wolnych od patogenów, a otrzymane w
ten sposób rośliny są jednorodne pod
względem zawartości glikozydów ste-
wiolowych i składu chemicznego.
Bibliografia:
[1 ] Bugaj B. , Leszczyńska T., Pysz M.,
Kopeć A., Pacholarz J. , Pysz-Izdebska K.
2013. Charakterystyka i prozdrowotne
właściwości Stevia rebaudiana Bertoni.
Żywność, Nauka, Technologia, Jakość, 3
(88), 27-38.
[2] Brahmachari G. , Mandal, L.C. , Roy R.,
Mondal S. , Brahmachari A.K. 2011 .
11
Stevisoide and related compounds
molecules of pharmaceutical promise: A
critical review. Arch. Pharm. Chem. Life
Sci. , 1 , 5-19.
[3] Carakostas M.S. , Curry C.C. , Boielau
A.C. , Brusick D.J. 2008. Overview: The
history, technical function and safety of
rebaudioside A, a naturally occurring
steviol glycoside, for use in food and
beverages. Food and Chemical Toxicology,
46 (7): 1 -10
[4] Chan P., Tomlinson B., Yi-Jen C., Ju-Chi
L. , Ming-Hsiung H., Juei-Tang C. 2000. A
double-blind placebo-controlled study of
the effectiveness and tolerability of oral
stevioside in human hypertension. Br. J.
Clin. Pharmacol. , 50, 215-220.
[5] Christaki E. 2013. Stevia rebaudiana as
a novel source of food additives. Journal of
Food and Nutrition Research, 52 (4), 195-
202.
[6] De S. , Mondal S. , Banerjee S. 2013.
Stevioside – technology, applications and
health. Wiley Blackwell, II, 27-43.
[7] Debnath M. 2008. Clonal propagation
and antimicrobial activity of an endemic
medicinal plant of Stevia rebaudiana.
Journal of Medicinal Plant Research, 2 (2),
45-51 .
[8] Gęsiński K., Majcherczak E., Gozdecka
G. 2013. Stewia (Stevia rebaudiana
Bertoni) jako źródło wybranych
makroelementów. Inżynieria i Aparatura
Chemiczna, 52 (2), 74-75.
[9] Goyal, S. , Goyal, R. 2010. Stevia
(Stevia rebaudiana) a bio-sweetener: A
review. International Journal of Food
Sciences and Nutrition, 61 , 1 –10.
[10] Gregersen S., Jeppesen P.B. , Holst J.J. ,
Hermansen K. 2004. Antihyperglycemic
effects of stevioside in type 2 diabetic
subjects. Metabol. , 53 (1 ), 73-76.
[1 1 ] Hassanen S.A. , Khalil R.M.A. 2013.
Biotechnological Studies for Improving of
Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro
Plantlets. Middle-East Journal of Scientific
Research, 14 (1 ), 93-106.
[12] Kobus-Moryson M., Gramza-
Michałowska A., Kobus-Cisowska J. ,
Korczak J. 2014. Zawartość wybranych
pierwiastków w ekstraktach stewii (Stevia
rebaudiana Bertoni) [Contents of selected
elements in extracts from sweetleaf (Stevia
rebaudiana Bertoni)] . Probl. Hig.
Epidemiol. , 95 (2), 445–448.
[13] Kolanowski W. 2013.Glikozydy
stewiolowe – Właściwości i zastosowanie w
żywności. Bromat. Chem. Tokstkol. , XLVI
(2), 140-150.
[14] Koyama E., Kitazawa K., Ohori Y. ,
Izawa O., Kakegawa K., Fujino A., Ui M.
2003. In vitro metabolism of the glycosidic
sweeteners, stevia mixture and
enzymatically modified stevia in human
intestinal mikroflora. Food Chem. Toxicol. ,
41 , 359-374.
[15] Kulczyński M., Gramza-Michałowska
A., Człapka-Matysiak. 2015.
Charakterystyka żywieniowa stewii.
Aktualny stan wiedzy. Bromat. Chem.
Toksykol. , XLVIII (1 ), 1 1 -18.
[16] Kumari M., Chandra S. 2014. A sweet
medicinal herb Stevia rebaudiana:
perspectives in therapeutics. BMR
Phytomedicine, 1 (1 ), 1 -10.
[17] Lemus Mondaca R., Vega Galvez A.,
Zura Bravo L., Ah-Ken K. 2012. Stevia
rebaudiana Bertoni, source of high-
potencynatural sweetener: A
comprehensive review on the biochemical,
nutritional and functional aspects. Food
Chemistry, 132 (3), 1 121 -1 132.
[18] Luwańska A., Perz A., Mańkowska G.,
Wielgus K. 2015. Application of in vitro
12
stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) cultures
in obtaining steviol glycoside rich material.
Herba Polonica Journal, 61 (1 ), 50-62.
[19] Madan S., Ahmad S., Singh G.N., Kohli
K. , Kumar y. , Singh R., Garg M. 2010.
Stevia rebaudiana Bertoni - A review.
Indian Journal of Natural Products and
Resources, 1 (3), 267-286.
[20] Maki K.C. , Curry L.L. , Carakostas M.,
Tarka S., Reeves M.S. , Farmer M.V. 2008.
The hemodynamic effects of rebaudioside
A in healthy adults with normal and
lownormal blood pressure. Food
Chem.Toxicol. , 47, 40-46.
[21 ] Prakash I. , Clos J.F. , Prakash
Chaturvedula V.S. 2012. Stability of
rebaudioside A under acidic conditions and
its degradation products. Food Res. Int. ,
48, 65-75.
[22] Prakash I. , Dubois G.E. , Clos J.F. ,
Wilkens K.L. , Fosdick L.E. 2008.
Development of rebiana, a natural, non-
caloric sweetener. Food Chem. Toxicol. 46,
75-82.
[23] Roberts, A. , Renwick, A.G. , 2008.
Comparative toxicokinetics and
metabolism of rebaudioside A, stevioside,
andsteviol in rats. Food Chem.Toxicol. , 46,
31 -S39.
[24] Yadav A.K., Singh S., Dhyani D., Ahuja
S. 2011 . A review on the improvement of
stevia (Stevia rebaudiana Bertoni).
Canadian Journal of Plat Science, 91 , 1 -27.
13
Wstęp
Charakteryzując procesy biochemicz-
ne, biofizyczne i fizjologiczne w rośli-
nach warto zwrócić uwagę
na transpirację (proces biofizyczny),
metabolizm komórkowy, w tym foto-
syntezę (procesy biochemiczne), cał-
kowitą ilość chlorofilu znajdującą się
w nadziemnych częściach rośliny, po-
ziom kwasu askorbinowego oraz roz-
puszczalnych cukrów, przekładające
się na wzrost i prawidłowe funkcjono-
wanie roślin. Dane literaturowe wska-
zują na zainteresowanie badaczy
analizą procesów metabolicznych
i komponentów w nie zaangażowa-
nych, a także gazów uczestniczących
w przemianach fizjologicznych oraz fi-
tohormonów [1 , 3]. Co więcej ostatnie
lata wskazują na intensywny rozwój
metod analitycznych, które warunkują
precyzyjną i kompleksową analizę ca-
łego spektrum związków występują-
cych w badanej matrycy. Dążenie
do oznaczania największej liczby
związków chemicznych na coraz niż-
szym poziomie stężeń w coraz bardziej
złożonych matrycach i coraz krótszym
czasie pociąga za sobą konieczność
zoptymalizowania procedury badaw-
czej , także w kierunku jak najmniejszej
ilości wykorzystywanego materiału
badanego. Podstawą sukcesu oznacze-
nia ilościowego i jakościowego danego
komponentu na niskim poziomie stę-
Wykorzystanie chromatografii gazowej oraz
cieczowej w analizie wybranych parametrów
fizjologiczno-biochemicznych roślin
Sara NawrockaKoło Naukowe „BIO-TECH”Pozawydziałowy Zamiejscowy Instytut Biotechnologii Stosowanej i NaukPodstawowychUniwersytet [email protected] napisana pod opieką dr Magdaleny Duda
Chromatografia gazowa oraz cieczowa z powodzeniem są wykorzystywane
w analizie fizjologicznej oraz biochemicznej roślin. Wybór procedury
badawczej i techniki rozdziału zależy od rodzaju badanego materiału
roślinnego. Oba rodzaje omawianych w pracy technik dają szeroki
wachlarz możliwości w aspekcie rozdzielania składowych mieszanin
związków lotnych, stałych lub cieczy. Pozwala to na dokładniejsze
poznanie ich budowy, a w konsekwencji możliwości przypisania im
nowych, wcześniej niepoznanych właściwości.
W pracy przedstawiono wybrane aspekty zastosowania chromatografii
gazowej i cieczowej w analizie podstawowych parametrów fizjologiczno-
biochemicznych wpływających na wzrost, rozwój i plonowanie roślin.
14
żeń są z całą pewnością metody pobie-
rania próbek oraz zastosowane techni-
ki analityczne [13, 14].
Najczęściej wykorzystywanymi meto-
dami instrumentalnymi są między in-
nymi techniki chromatograficzne,
spektrofotometryczne i spektrome-
tryczne (m.in. atomowa spektrometria
absorpcyjna ASA) [1 ]. W pracy przed-
stawiono przykłady zastosowania
chromatografii gazowej i cieczowej
w wybranych obszarach analizy roślin.
System chromatografii gazowej (GC)
i cieczowej (LC) składa się z kilku pod-
stawowych elementów: układu dozo-
wania, termostatu, kolumny
chromatograficznej , detektora
oraz rejestratora otrzymanych wyni-
ków. W GC wykorzystywany jest on do
dokładnego oznaczenia ilościowego
badanej substancji przy wykorzystaniu
odpowiedniego gazu nośnego np. azo-
tu lub helu. Z kolei w LC, dzięki wyso-
kiemu wskaźnikowi czułości oraz
niezawodności, służy przede wszyst-
kim do analiz metabolitów pochodze-
nia roślinnego [4]. Wszystkie rodzaje
analiz chromatograficznych warunkują
rozdzielenie poszczególnych składni-
ków próbki dzięki różnicom w ich wła-
ściwościach fizykochemicznych [5, 13,
14]. Jak już wspomniano, chromato-
grafia gazowa oraz cieczowa łączą
w sobie elementy niezbędne do analizy
procesów fizjologicznych oraz bioche-
micznych przebiegających w roślinie.
Sposób wykonania procedury zależy
m.in. od rodzaju badanego materiału
roślinnego, który zostaje poddany sze-
regowi procesów, od inaktywacji prób-
ki po ekstrakcję, w celu uwidocznienia
związków chemicznych, które w na-
stępstwie zostają poddane analizom
chromatograficznym [2].
W pracy omówiono wybrane aspekty
chromatografii wykorzystywanej
w oznaczeniach ilościowych i jakościo-
wych komponentów zaangażowanych
w przemiany fizjologiczno-biochemicz-
ne w roślinach.
Przygotowanie próbek do analiz
chromatograficznych
W pierwszej kolejności podczas prze-
prowadzania analiz należy pamiętać
o określeniu problemu oraz potrzeb
planowanych badań. Kolejnym etapem
jest wybór metody, którą będziemy
wykorzystywać. Dobierana ona zostaje
w zależności od rodzaju próbki
oraz zawartego w niej analitu. Następ-
nie dochodzi do pobrania analizowanej
próbki, jej wstępnej obróbki oraz kon-
dycjonowania. Właściwe analizy mogą
być analizami jakościowymi oraz ilo-
ściowymi i wykonywane są odpowied-
nio w celu przeprowadzenia prób
analogicznych w porównaniu z bada-
nym materiałem oraz przygotowania
wzorców czystych, tj . bez analitu lub
z jego znaną ilością. Po zakończeniu
procedury analitycznej dochodzi
do sprawdzenia otrzymanych wyników,
oceny problemu badawczego oraz we-
ryfikacji końcowych rezultatów
(Rys. 1 ).
Uwzględniając występowanie substan-
cj i na poziomie śladów lub ultraśladów,
należy starannie zaplanować etap
przygotowywania próbek do analizy,
procedurę izolacj i kluczowego skład-
nika/składników (w tym usunięcie
składników interferujących) oraz
wzbogacania. Właściwe przygotowanie15
tego etapu zapewni polepszenie wy-
krywalności składnika, selektywne od-
dzielenie analitów od innych
składników próbki, czy wprowadzenie
do układu chromatograficznego czy-
stej matrycy. W celu ograniczenia strat
analitu podczas przygotowywania pró-
bek stosuje się techniki, które łączą
w sobie dwa lub więcej etapów w pro-
cedurze przygotowywania do analiz
próbek, np. izolację i wzbogacanie
próbki. Przykładem może być zastoso-
wanie do przygotowania próbek o cha-
rakterze ciekłym ekstrakcji w układzie
ciecz-ciecz; ciecz-ciało stałe, techniki
Quechers, czy mikroekstrakcji do fazy
stałej [13, 15]. Klejdus i in. już w
1999 roku wskazywali na efektywność
zastosowania techniki HPLC poprze-
dzonej ekstrakcją do fazy stałej
do oznaczania izoflawonoidów (da-
idzeiny, genisteiny, biochaniny A i bio-
chaniny B) wyizolowanych z koniczyny
łąkowej [21 ]. Należy zwrócić uwagę,
16
że związki analizowane przy użyciu GC
muszą odznaczać się odpornością ter-
miczną i odpowiednią lotnością. Nie
znaczy to, że związki trudnolotne
i nielotne nie będą analizowane tą
techniką, jednak ich oznaczanie musi
poprzedzić derywatyzacja (w tym
przypadku przeprowadzenie związku
nielotnego w bardziej lotny). Koniecz-
ność derywatyzacji badanych związ-
ków skierował zainteresowania
badaczy w kierunku chromatografii
cieczowej [10]. Obok derywatyzacji
do popularnych metod przygotowania
próbki przed analizą z wykorzystaniem
chromatografii gazowej należy także
estryfikacja kwasów tłuszczowych
(FAME), czy ekstrakcja z fazy gazowej
(nadpowierzchniowej) [12].
Oznaczanie ilościowe związane jest
z koniecznością wykorzystania wzorca
(standardu) wewnętrznego, który do-
daje się do analizowanej próbki. Po-
zwala to na wyznaczenie odzysków, co
ma szczególne znaczenie w analizie
pozostałości pestycydów, czy metabo-
litów. Wzorcem wewnętrznym może
być czysta forma komponentu, którego
spodziewamy się w analizowanej
próbce, jego izotopowe formy np. izo-
flawonoidów, czy substancja o podob-
nej strukturze i właściwościach
albo wręcz składnik niewystępujący
w badanej próbce [11 ].
Chromatografia gazowa i przykłady
jej zastosowania w analizie roślin
Chromatografia gazowa jest jedną
z najczęściej stosowanych w praktyce
laboratoryjnej metod, pozwalających
na określenie ilościowego i jakościo-
wego składu mieszanin. Umożliwia
szybką i dokładną analizę złożonych
mieszanin o charakterze gazów
lub par, a w zasadzie substancji gazo-
wych, ciekłych i stałych, których tem-
peratura wrzenia lub sublimacji nie
przekracza 350-400°C [3, 5]. Rozwój
chromatografii gazowej datuje się
na 1980 r. , kiedy nastąpiło gwałtowne
zainteresowanie dziedzinami nauk, ta-
kimi jak medycyna, farmacja, chemia,
nauki środowiskowe oraz przemysł.
Zasada metody opiera się na fizycznym
rozdziale mieszanin na dwa zasadnicze
elementy, z których jeden z nich jest
fazą ruchomą, a drugi stałą (stacjo-
narną). Złożony proces chromatogra-
ficzny to cyklicznie powtarzane
mechanizmy sorpcji oraz desorpcji,
w trakcie których badany materiał
przemieszcza się wzdłuż nieruchome-
go złoża znajdującego się w kolumnie
chromatograficznej (Rys. 2). Rozdział
następuje na podstawie zróżnicowanej
odpowiedzi specyficznych substancji
wchodzących w skład analizowanej
mieszaniny na warunki rozdziału [5].
Chromatografia gazowa może być wy-
korzystywana do wnikliwych badań
nad procesami fizjologicznymi
oraz przemianami metabolicznymi ro-
ślin. Analizy metaboliczne muszą zo-
stać poprzedzone ekstrakcją, w celu
uzyskania jak największej ilości mate-
riału poddawanego dalszym badaniom.
Chromatografia gazowa najlepiej
sprawdza się w badaniach lotnych me-
tabolitów wtórnych, mono- i seskwi-
terpenów wchodzących w skład np.
olejków eterycznych roślin, a także
w analizach flawonoidów, prostych li-
pidów oraz alkaloidów. Jednymi z nie-
licznych związków, które nie mogą17
zostać poddane analizom chromato-
graficznym są glikozydy, co jest spo-
wodowane ich dużą masą oraz niskim
poziomem lotności. Niestety z uwagi
na konieczność derywatyzacji, tj . pro-
ces postępowania podczas analizy
chemicznej doprowadzający do otrzy-
mania pochodnej badanego związku
o korzystniejszych parametrach, chro-
matografia gazowa jest rzadziej wyko-
rzystywana do wykrywania
flawonoidów, związków występujących
naturalnie w roślinach oraz pochod-
nych bezno-ɣ-pironu (chromonu),
w porównaniu do chromatografii cie-
czowej . Także w pracy badawczej Ma-
chowskiego [10] do analizy
flawonoidów zastosowano wysoko-
sprawną chromatografię cieczową
HPLC, która według autora jest ko-
rzystniejsza z uwagi na obniżenie
kosztów procedury badawczej
oraz czasu analizy. Metoda derywaty-
zacji została wskazana jako wymagana
w analizie hormonów roślinnych,
np. IAA [26], kwasu abscysynowego
[27], czy brassinosteroidów [28].
Analiza olejków eterycznych pod ką-
tem ich składu ilościowego i jakościo-
wego daje najlepsze efekty przy
wykorzystaniu chromatografii gazowej
sprzężonej ze spektrometrią mas, po-
przedzonej właściwym przygotowa-
niem próbki – z zastosowaniem
hydrodestylacj i [22]. Co więcej , chro-
matografię gazową z detektorem
płomieniowo-jonizacyjnym (FID) za-
stosowano do diagnozowania jakości
olejów roślinnych. W tym celu określa-
no lotne związki będące produktami
utleniania olejów roślinnych [23].
Fiehn i in. wskazali na możliwość wy-
korzystania GC-MS w analizie jako-
ściowej ekstraktów metanolowych
uzyskanych z liści Arabidopsis thalia-
na. W swoich badaniach wykryli ponad
300 pików odpowiadających określo-
nym związkom, z czego zidentyfikowali
tylko 30 aktywnych komponentów ro-
ślinnych, takich jak cukry (np. frukto-
18
za, glukoza), aminokwasy (np. lizyna,
alanina), kwas nikotynowy i innych
podobnych substancji mających udo-
kumentowane znaczenie w procesach
fizjologicznych roślin [29].
Chromatografia cieczowa i jej od-
miany w przemianach biochemicz-
nych i metabolizmie roślin
Chromatografia cieczowa (LC), podob-
nie jak gazowa, opiera się na fizycz-
nym rozdziale składników badanej
mieszaniny dzięki dwóm niemieszają-
cym się ze sobą fazom; ruchomej , czyli
eluentu, oraz stacjonarnej , którą może
być rozpuszczalnik odpowiednio dopa-
sowany do analizowanej mieszaniny.
Odmianą LC jest HPLC – wysoko-
sprawna chromatografia cieczowa,
która została opracowana przez Ho-
rvatha w latach 60-tych XX wieku
i służy do badania czystości lub iden-
tyfikacji związków chemicznych [24].
Zasadniczą różnicą między dwiema
pokrewnymi odmianami chromatogra-
fii jest ciśnienie zastosowane do prze-
pływu eluentu (faza ruchoma) przez
kolumnę. Z reguły różnica ciśnień
między LC a HPLC wynosi 100 atm.
Zasada działania LC jest podobna
do GC: próbka wstrzykiwana jest dzię-
ki otworowi wtryskowemu do fazy ru-
chomej , następnie dochodzi
do dostarczenia fazy ruchomej na ko-
lumnę przez pompę wysokociśnienio-
wą, a końcowy etap to transfer
do kolumny, gdzie następuje ostatecz-
ny rozdział [7]. Jedną z najważniej -
szych zalet chromatografii cieczowej
jest możliwość oznaczania związków
polarnych i wielkocząsteczkowych,
związków nielotnych o masie atomo-
wej nawet do kilku tysięcy Daltonów,
polimerów i związków nieorganicz-
nych. Ponadto analizowane są ciecze
i ciała stałe, w tym związki łatwo ule-
gające rozkładowi termicznemu. Pod-
stawowym warunkiem zastosowania
LC jest rozpuszczalność analitów
[13,14], a w przypadku związków
o podobnej polarności zastosowanie
wysokosprawnej (HPLC) lub ultra-
sprawnej (UHPLC) chromatografii cie-
czowej [13].
Chromatografia cieczowa znajduje za-
stosowanie w diagnostyce medycznej ,
farmacji, badaniach dotyczących bez-
pieczeństwa żywności, badaniach śro-
dowiskowych i podstawowych
analizach biochemicznych materiału
roślinnego, w tym do analizy metaboli-
tów roślinnych [13]. Analiza metabolo-
mów tkanek roślinnych wymaga
obróbki badanych tkanek, a biorąc pod
uwagę występowanie kluczowych
komponentów w niewielkich ilościach
i obecność ściany komórkowej utrud-
niającej izolację wybranych składni-
ków i ich swobodną migrację
do rozpuszczalnika, próbkę homogeni-
zuje się i poddaje działaniu ultradź-
więków. W materiale roślinnym obok
wysoce polarnych związków (np. sole
mineralne, witaminy B i C, monosa-
charydy, krótkołańcuchowe amino-
kwasy) odnotowuje się związki
niepolarne (tłuszcze i kwasy tłuszczo-
we, tokoferole, czy karotenoidy) [16].
Skowron i in. [16] opisali zastosowanie
LC z detektorem MS do oznaczania
ilościowego i jakościowego wybranych
cytokinin (cis- i trans-zeatyny), ich ry-
bozydów, kinetyny, rybozydu kinetyny
i izopentenyladeniny w liściach roślin19
wyższych. Dane literaturowe potwier-
dzają wykorzystanie LC w analizie fi-
tohormonów roślinnych – kwasu
jasmonowego, kwasu salicylowego, czy
kwasu abscysynowego [17-18]. Spo-
śród związków aktywnych w przemia-
nach biochemicznych i fizjologicznych
roślin o aktywnościach przeciwutle-
niających, owadobójczych i przeciw-
bakteryjnych analizuje się flawonoidy
i saponiny [10]. Pawłowski [19] pro-
wadząc badania nad analizą ziaren
słonecznika, wykorzystał technikę LC-
MS/MS do identyfikacji białek, co po-
zwoliło na stworzenie odmian odpo-
wiednich do uprawy pod względem
zawartości olejów i plonowania. Ta sa-
ma technika pozwoliła na identyfikację
białek w nasionach rzepaku ozimego
związanych ze szlakami metaboliczny-
mi [20]. Najczęściej analizowanymi
związkami przy użyciu chromatografii
cieczowej są prolina, gamma-amino
maślan oraz poliaminy [8].
Z kolei Kucharski i Sadowski [9]
w swoich badaniach wykazali zastoso-
wanie HPLC do analizy pozostałości
herbicydów takich jak fenmedifam,
desmedifan oraz lenacyl. Zastosowanie
HPLC do analizy pozostałości pestycy-
dów (bezpośrednio związanych z plo-
nowaniem roślin) pozostawała długo
w cieniu GC, ale ostatecznie zdolność
oznaczania związków labilnych ter-
micznie, o niskiej lotności, czy możli-
wość zastosowania praktycznie
nieograniczonej rozmaitości wypełnień
kolumn przeważyła nad zastosowa-
niem chromatografii cieczowej
do analizy składników występujących
w żywności i pestycydów [24]. Dzisiaj
z zastosowaniem HPLC i różnych de-
tektorów analizuje się pestycydy
z grupy syntetycznych pyretroidów,
karbaminianów, pochodnych fenylo-
mocznika, triazyn, pochodnych benzi-
midazolu [25].
Podsumowanie
Istnieje wiele metod, które umożliwia-
ją precyzyjną identyfikację i określenie
intensywności procesów biochemicz-
nych oraz zaangażowanych w nie
składników/biokomponentów charak-
terystycznych dla roślin. Jednak
to techniki chromatograficzne stały się
nieodzownym elementem pracy labo-
ratorium środowiskowego, przyrodni-
czego, czy diagnostyki medycznej .
Wykorzystywane są głównie pod ką-
tem oznaczeń analitycznych, lecz także
coraz częściej preparatywnych
lub procesowych. Ich głównym atutem
jest zdolność do rozdzielania wielo-
składnikowych substancji posiadają-
cych takie same, lub bardzo podobne
właściwości. Aktualny stan wiedzy po-
zwala na możliwie duże wykorzystanie
potencjału chromatografii gazowej
oraz cieczowej . Techniki chromatogra-
ficzne, dzięki szerokim możliwościom
wykrywania analizowanej substancji
oraz oznaczania jej nawet gdy wystę-
puje w minimalnych ilościach w obec-
ności szeregu innych nieoznaczonych
substancji, stały się jedną z najbardziej
rozpowszechnionych metod instru-
mentalnych w biotechnologii. Reasu-
mując, GC oraz HPLC najczęściej
stosowane są do jakościowej oraz ilo-
ściowej analizy mieszanin związków
organicznych i nieorganicznych;
w procesach takich jak kontrola zanie-
czyszczeń środowiska lub kontrola20
Bibliografia:
[1 ] Profiling Methods to Identify Cold-
Regulated Primary Metabolites Using Gas
Chromatography Coupled to Mass
Spectrometry, red. Dirk K. Hincha, E.
Zuther. , Springer New York, New York,
2014, str. 171 -172.
[2] Khoddami A., Techniques for Analysis
of Plant Phenolic Compounds, Molecules,
2013, 18(2), 2328-2375.
[3] Lisec J. , Gas chromatography mass
spectrometry-based metabolite profiling in
plants, Nature, 2006, 387-396.
[4] Qualitative Analysis of Flavor and
Fragrance Volatiles by Glass Capilary, Gas
Chromatography, red. W. Jennings,
Academic Press, A Subsidiary of Harcourt
Brace Jovanovich, 1980, str. 5-1 1 , str. 15-
16.
[5] Chromatography Today, red. C.F. Poole,
S.K. Poole. , Elsevier Science Publishers
B.V. , New York, 1991 , str. 1 -6.
[7] Liquid Chromatography: Mass
Spectrometry, Second Edition, red.
Wilfried M.A. Niessen, Marcel Dekker,
New York, 1999, str. 125-136.
[8] Obata T., Fernie A.R., The use of
metabolomics to dissect plant responses to
abiotic stresses, Cellular and Molecular
Life Sciences, 2013, 69(19), 3225-3243.
[9] Kucharski M., Sadowski J. , Herbicyde
residues in sugar beet roots. , Progress In
Plant Protection, 2014, 54(1 ), 6-7.
[10] Machowski M., Kaliszewska D., Kiss
A., Chromatograficzne metody izolacj i i
identyfikacji flawonoidów i saponin, Biul.
Wydz. Farm. WUM, 2010, 4, 27-37.
[1 1 ] Kaniewska J. , Przegląd metod
oznaczania izoflawonoidów, 2012,
Inżynieria Przetwórstwa Spożywczego,
4(4), 25-30.
[12] Snow N.H., Snack G.C. , Head-space
analysis on modern gas chromatography,
Trends Anal. Chem., 2002, 21 (9+10), 608-
617.
[13] Podstawy chromatografii i technik
elektromigracyjnych, Z. Witkiewicz, J.
Kałużna, Wydawnictwo Naukowo
Techniczne, Warszawa, 2012, str. 167-169
[14] Chemia analityczna. Chromatografia
cz. I-III, K. Hierasimczyk, W. Wardencki, J.
Namieśnik, Wydawnictwo Wydziału
Chemii, Politechnika Gdańska, 2002, str. 1 -
19, 1 -23, 1 -15
[15] Przygotowanie próbek
środowiskowych do analizy, J. Namieśnik,
Z. Jamrógiewicz, M. Pilarczyk, L. Torres,
Wydawnictwo Naukowo Techniczne,
Warszawa, 2000, str. 3-128.
[16] Skowron M., Grabowska-Polanowska
B., Waligórksi P. , Faber J. , Śliwka I. ,
Chromatografia cieczowa z tandemową
spektrometrią mas (LC-MS/MS), jako
przykład techniki łączonej – podstawy
teoretyczne i przykłady zastosowania,
Raport Nr 2089/Ch, Kraków, 2016, str. 1 -
44.
[17] Koojima K., Characteristics of HPLC
columns and mass spectra of LC-MS for
phytohormone analysis, JARQ, 2001 , 35(3),
149-154.
[18] Yu J. , Meng Q., Liu E. , Lu Y., Ren X.,
Analysis of acidic endogenous
21
procesów przemysłowych. Ponadto są
nieodzownym elementem badań fizy-
kochemicznych oraz badań struktural-
nych związków organicznych
występujących w roślinach, pozwalając
na śledzenie przebiegu procesów me-
tabolicznych i ich wpływu na wzrost
i rozwój roślin.
phytohormones in grapes by using online
SPE extraction coupled with LC-MS/MS,
Journal of Chromatographic Science, 2013,
7, 1 -5.
[19] Pawłowski T. , Proteomika nasion,
Biotechnologia, 2009, 1 (84), 104-118.
[20] Hajduch M., Casteel J.E. , Hurrelmeyer
K.E. , Song Z., Agrawal G.K. , Thelen J.J. ,
Proteomic analysis of seed filling in
Brassica napus. Developmental
characterization of metabolic isozymes
using high-resolution two-dimentional gel
electrophoresis, Plant Physiology, 2006,
141 (1 ), 32-46.
[21 ] Klejdus B., Vitamvasova D., Kuban V.,
Reversed-phase high-performance liquid
chromatographic determination of
isoflavones in plant materials after
isolation by solid-phase extracton, Journal
of Chromatography A, 1999, 839(1 -2), 261 -
263.
[22] Kwaśny J. , Vogt O., Lason E., Analiza
instrumentalna kompozycji olejków
eterycznych z roślin baldaszkowatych
(Apiaceae) na przykładzie olejku
anyżowego, 2012, Chemia. Czasopismo
Techniczne, 16(109), 71 -83.
[23] Gromadzka J. , Wardencki W.,
Opracowanie procedury oznaczania
lotnych produktów utlenienia olejów
roślinnych techniką statycznej analizy fazy
nadpowierzchniowej , 2009, 30, 103-1 17.
[24] Jędrzejczuk A., Góralczyk K., Czaja K.,
Struciński P. , Ludwicki J.K. ,
Wysokosprawna chroamtografia cieczowa
– jej zastosowanie w analizie pozostałości
pestycydów, Roczniki PZH, 2001 , 52(2),
1 27-138.
[25] Kryteria Zdrowotne Środowiska. Tom
78. Pestycydy ditiokarbaminianowe,
etylenotiomocznik i propylenotiomocznik.
Wprowadzenie ogólne, Instytut Medycyny
Pracy, Łódź, 1994.
[26] Edlund A., Eklof S. , Sundberg B.,
Moritz T. , Sandberg G., A microscale
technique for gas chromatography-mass
spectrometry measurements of picogram
amounts of indole-3-acetic acid in plant
tissues, Plant Physiology, 1995, 108, 1043-
1047.
[27] Duffield P.H., Netting A.G. , Methods
for the quantitation of abscisic acid and its
precursors from plant tissues, Anal.
Biochem., 2001 , 289, 251 -259.
[28] Shimada Y., Goad H., Nakaumra A.,
Takatsuto S. , Fujioka S. , Yoshida S. , Organ-
specific expression of brassinostreoid-
biosynthetic genes and distribution of
endogenius brassinosteroids in
Arabidopsis, Plant Physiology, 2003, 131 ,
287-297.
[29] Fiehn O., Kopka J. , Trethewey R.N.,
Willmitzer L. , Identification of uncommon
plant metabolites based on calculation if
elemental composition using gas
chromatography and quadrupole mass
spectrometry, Anal. Chem., 2000, 72, 3573-
3580.
22
Wstęp
Chlorofile (Rys. 1 -3) to dość szeroka
grupa barwników tetrapirolowych,
pełniących niezmiernie ważną rolę
w procesie fotosyntezy oksygenicznej .
Najogólniej , proces ten polega na za-
mianie energii promieniowania sło-
necznego na energię chemiczną, która
jest wykorzystana przez organizmy fo-
tosyntetyzujące do asymilacj i CO2. Pod
względem strukturalnym, większość
chlorofili jest chlorynami, czyli po-
chodnymi porfiryn o częściowo zredu-
kowanym układzie porfirynowym,
zawierającymi dodatkowy izocykliczny
pierścień (oznaczany jako E; Rys. 1 ).
Centralne miejsce w układzie chlory-
Od c do f, czyli mniej znane chlorofile
Wiktor TokarekZakład Fizjologii i Biochemii RoślinWydział Biochemii, Biofizyki i BiotechnologiiUniwersytet Jagielloński w KrakowiePraca napisana pod opieką dr hab. Beaty Myśliwej-Kurdziel
Chlorofile są grupą barwników fotosyntetycznych, występujących
w roślinach, glonach i sinicach. Są to związki tetrapirolowe, zawierają
w swojej strukturze układ porfirynowy lub chlorynowy. Ich struktura
chemiczna odpowiada za ich właściwości spektralne – chlorofile są zdolne
do absorpcji widzialnego promieniowania elektromagnetycznego
w zakresie niebieskiej i czerwonej barwy. Spośród wszystkich znanych
chlorofili, chlorofil a jest najbardziej rozpowszechniony w przyrodzie.
Często występuje w parze z chlorofilem b, jak ma to miejsce w przypadku
roślin. Oprócz chlorofili a i b naturalnie występują także chlorofile c, d i f,
odróżniające się od chlorofilu a podstawnikami i nasyceniem układu
tetrapirolowego. Barwniki te występują w komórkach glonów i sinic.
Chlorofile c, pośród których wyróżnia się 11 różnych form, pełnią rolę
barwników antenowych w kompleksach zbierających światło. Cechą
charakterystyczną tych barwników jest względnie słaba absorpcja
w czerwonym zakresie światła widzialnego. Chlorofil d i niedawno odkryty
chlorofil f charakteryzują się absorpcją przesunięta ku czerwieni
w porównaniu z innymi chlorofilami. Własności te umożliwiają
wykorzystanie światła z zakresu czerwieni i bliskiej podczerwieni
organizmom żyjącym w środowiskach odznaczających się niskim
natężeniem światła z zakresu widzialnego. Ponadto, cząsteczki chlorofilu
d są zaangażowane w przeprowadzanie kluczowej reakcji fotochemicznej
w centrach reakcji kompleksów fotosyntetycznych. Niniejszy artykuł
przytoczy najważniejsze fakty dotyczące odkryć i właściwości chlorofili c,
d i f, z uwzględnieniem ich występowania, budowy chemicznej
i charakterystyk spektralnych.
23
nowym zajmuje jon magnezu (Mg2+)
[1 ]. Cząsteczki chlorofili odznaczają
się występowaniem sprzężonego ukła-
du wiązań podwójnych. Pozwala to na
absorpcję promieniowania elektroma-
gnetycznego z zakresu widzialnego.
W widmie absorpcji tych związków ob-
serwuje się dwa złożone pasma – jedno
położone jest w zakresie długości fal
odpowiadających barwie niebieskiej ,
a drugie – czerwonej . Z powodu zniko-
mego pochłaniania światła o barwie
zielonej , roztwory i organizmy zawie-
rające chlorofile charakteryzują się
właśnie tą barwą. Kluczową rolę
w procesie fotosyntezy oksygenicznej
odgrywają kompleksy fotosyntetyczne
składające się z fotosystemu
oraz układu antenowego. Zadaniem
barwników antenowych jest pochła-
nianie światła i przekazywanie energii
wzbudzenia na chlorofil w centrum re-
akcji (tj . części rdzeniowej fotosyste-
mu). Wzbudzenie chlorofilu w centrum
reakcji prowadzi do zmiany jego po-
tencjału redoks i uwolnienia elektronu
(rozdział ładunku), co zapoczątkowuje
fotosyntetyczny łańcuch transportu
elektronów [2]. Chlorofil a jest najsze-
rzej występującym chlorofilem.
Do niedawna uważano ten barwnik za
jedyny chlorofil aktywny w reakcjach
redoks in vivo (w fotosyntezie oksyge-
nicznej) w centrach reakcji fotosyste-
mów I i II [1 ,2]. Oprócz chlorofilu a
(uniwersalnego barwnika fotosynte-
tycznego) i chlorofilu b (występujące-
go u roślin i niektórych glonów)
wyróżnia się także chlorofile c, d i f,
które znacznie różnią się od poprzed-
nich pod względem struktury che-
micznej , właściwości spektralnych
i znaczenia w fotosyntezie. Poniżej za-
prezentowane zostaną najnowsze in-
formacje dotyczące tej mniej znanej
grupy barwników, będących przedmio-
tem tej pracy.
Chlorofile c
Chlorofile c (Rys. 2, Tab. 1 ) stanowią
grupę barwników należących do porfi-
ryn. Oznacza to, że posiadają one
w pełni nienasycony układ tetrapirolo-
wy (także w pierścieniu D), a rozłoże-
nie sprzężonych wiązań podwójnych
jest symetryczne. Jest to cecha odróż-
niające te barwniki od pozostałych
Rys. 1 . Struktura chemiczna chlorofili a i b.
Uwzględniono oznaczenia pierścieni (A-E)
i numerację atomów węgla (za [38]). Gru-
bymi liniami zaznaczono układ chlorynowy,
wzbogacony o pierścień E. Zacieniowano
podstawniki boczne tego układu, mogące
się zmieniać w strukturach chlorofili c, d
i f. Przedstawiono także strukturę reszty
fitolu, oznaczanej na rycinach jako „fitol”.
24
chlorofili, będących chlorynami. Po-
nadto, chlorofile c w pozycji C-17
(pierścień D) posiadają resztę nieze-
stryfikowaną przez fitol (długołańcu-
chowy alkohol diterpenowy, zob.
Rys. 1 ). Pod względem strukturalnym,
chlorofile c posiadają budowę proto-
chlorofilidu, czyli produktu pośrednie-
go biosyntezy chlorofili a i b. Pomimo
tego, związki te są nazywane „chloro-
filami” z uwagi na to, że pełnią one
funkcję barwników fotosyntetycznych
w układach antenowych [3].
Chlorofil c został odkryty jako trzeci,
po chlorofilach a i b. Pierwsze donie-
sienia na temat tego barwnika, nazwa-
nego wtedy chlorofucyną, pochodzą
z roku 1873 [4]. Inne używane w prze-
szłości nazwy to chlorofilina γ i chlo-
rofil γ [5]. Struktura chemiczna
chlorofilu c została po raz pierwszy
zaproponowana w roku 1949, kiedy to
Granick przeprowadził badania z wy-
korzystaniem alkacymetrii i oznacza-
Rys. 2. Ogólna struktura chemiczna chlo-
rofili c. Podstawniki R1, R2 i R3 zostały
rozpisane w Tab. 1 . Strzałką zaznaczono
położenie wiązania odróżniającego układ
porfirynowy (w pełni nienasycony układ te-
trapirolowy) od układu chlorynowego, wi-
docznego na Rys. 1 .
Tabela 1 . Podstawniki w strukturach chemicznych chlorofili c (oznaczenia R1, R2 i R3 wg
Rys. 2); za [3]. Objaśnienia skrótów w tekście.
25
nia magnezu metodą żółcieni tytano-
wej [6]. Ostateczne potwierdzenie
struktur chemicznych nierozdzielo-
nych mieszanin chlorofili c (c1 i c2,
zob. Rys. 2 i Tab. 1 ) i rozdzielonych
estrów metylowych chlorofili c zostało
osiągnięte z wykorzystaniem technik
NMR i spektrometrii masowej [7-9].
Barwniki z grupy chlorofili c występują
głównie w glonach, takich jak okrzem-
ki czy bruzdnice [3,8,10-13], przy
czym zawartość chlorofili c w danym
organizmie zależy od warunków śro-
dowiskowych [14-16].
Obecnie wyróżnia się 11 form chloro-
filu c – c1 , c2, c3, monowinylo-chlorofil
c3 ([MV]-Chl c3]), cCS-170, 3,8-diwinylo-
protochlorofilid ([DV]-Pchlid), c2 typu
Pavlova gyrans , c1 typu Kryptoperidi-
nium , c2-MGDG (18:4/14:0), c2-MGDG
(14:0/14:0) oraz niepolarny c1 typu
Prymnesium parvym [3] (Tab. 1 ).
Pierwsze sześć związków to tak zwane
polarne chlorofile c, niezestryfikowane
w pozycji C-17, co sprawia, że są one
cząsteczkami hydrofilowymi.
Chlorofile c1 i c2 zostały opisane naj-
wcześniej i są najbardziej rozpo-
wszechnionymi przedstawicielami
chlorofili c. Pod względem struktural-
nym, chlorofil c1 posiada resztę etylo-
wą w pozycji C-8 (-CH2-CH3),
natomiast chlorofil c2 – winylową
(-CH=CH2) (Tab. 1 ) [17,18].
Właściwości spektralne chlorofili c zo-
stały podsumowane w tabeli 2. Barw-
niki te odznaczają się niską
intensywnością pasma absorpcji
w czerwieni (pasmo Qy), w porównaniu
do pozostałych chlorofili, oraz przesu-
nięciem maksimum absorpcji Qy w
stronę fal krótszych (Rys. 4, Tab. 2).
Wynika to z pełnego nienasycenia
wszystkich czterech pierścieni rdzenia
porfirynowego [2]. Widmo fluorescen-
cyjne chlorofilu c2 w stanie sześcio-
skoordynowanym, zmierzone
w tetrahydrofuranie w temperaturze
pokojowej , odznacza się maksimum
położonym przy 640 nm. Rozważania
teoretyczne przeprowadzone przez
Etinskiego i wsp. wykazały, że widma
fluorescencyjne chlorofili c1 i c2 po-
winny odznaczać się podobną struktu-
rą [19,20].
W rozważaniach nad właściwościami
widmowymi barwników fotosyntetycz-
nych należy także wziąć pod uwagę
otoczenie molekularne, np. białkowe
[2] lub rozpuszczalnik [21 ]. Przykłado-
wo Premvardhan i wsp. [22] wykazali,
że rezonansowe widma Ramana chlo-
rofilu c2 znajdującego się w białko-
wych kompleksach fukoksantyna-
-chlorofil a/c2 (FCP), wyizolowanych
z okrzemki Cyclotella maneghiniana ,
różnią się od tych zarejestrowanych
w 90% acetonie. Pomiary wykonywane
były w temperaturze ciekłego azotu
(77 K). Wyniki uzyskane przez Auto-
rów sugerują, że gdy barwnik ten jest
rozpuszczony w 90% acetonie, cen-
tralny atom magnezu przybiera formę
sześcioskoordynowaną. Zdefiniowane
otoczenie białkowe kompleksów FCP
ogranicza swobodę konformacyjną
chlorofilu c2, który przybiera formę
pięcioskoordynowaną. Co więcej , od-
działywania z owymi kompleksami
białkowymi wpływają na większe roz-
dzielenie maksimów absorpcji chloro-
fili a i c, w porównaniu do widm tych
barwników w acetonie. Autorzy
stwierdzili także, że wewnątrz FCP26
chlorofil c2 odznacza się większym
stopniem solwatacji niż chlorofil a
[22].
Niedawno opublikowane zostały wyni-
ki badań sugerujące, że chlorofil c2może zostać wykorzystany do łagodze-
nia objawów reakcji alergicznych.
Yoshioka i wsp. [23] wykazali, że za-
równo frakcja ekstraktu z brunatnicy
Sargassum horneri, wzbogacona
o chlorofil c2, jak i sam barwnik w czy-
stej postaci, są zdolne do ograniczenia
degranulacji szczurzych komórek RBL-
2H3 (bazofile, wyprowadzone od osob-
ników chorych na białaczkę bazofilo-
wą) in vitro. Jako że bazofile są
komórkami zaangażowanymi w odpo-
wiedź alergiczną, wyniki tych badań
mogą sugerować potencjalne zastoso-
wanie chlorofilu c2 w leczeniu chorób
alergicznych [23]. Ponadto, Fujiwara
i wsp. [24] przeprowadzili badania kli-
niczne na pacjentach cierpiących
na sezonowy alergiczny nieżyt nosa.
Otrzymywali oni chlorofil c2 w postaci
kapsułek w dawkach 0,7 mg dziennie.
Wyniki pokazały, że przyjmowanie ta-
kiej dawki chlorofilu c2 przez 8 tygodni
ogranicza potrzebę stosowania innych
leków przeciwalergicznych [24]. Nale-
ży jednak wspomnieć, że to badanie
zostało przeprowadzone w ograniczo-
nym stopniu i uzyskanych w nim wyni-
ków nie można łatwo przełożyć na
kliniczne znaczenie tego związku.
Chlorofil c3 został po raz pierwszy za-
obserwowany w ekstraktach z komó-
rek haptofitów Emiliania huxleyi.
Badania metodą chromatografii cien-
kowarstwowej pokazały, że barwnik
ten jest bardziej polarny niż chlorofile
c1 i c2 [25], a badania z wykorzysta-
niem technik NMR i spektrometrii ma-
sowej wykazały, że chlorofil c3 jest
7-desmetyl-7-metoksykarbonylową po-
chodną chlorofilu c2 [26] (Rys. 2,
Tab. 1 ). To dodatkowe ugrupowanie
przekłada się na zmianę właściwości
spektralnych tej formy chlorofilu c,
konkretnie na obniżenie intensywności
pasma absorpcyjnego w pasmie Qy [3].
Opisano także monowinylową pochod-
ną chlorofilu c3 ([MV]-Chl c3), posiada-
jącą resztę etylową zamiast winylowej
w pozycji C-8 [27,28], oraz chlorofil
cCS-170 (wyizolowany z glonów szczepu
Micromonas pusilla CS-170) będący
propionianową pochodną chlorofilu c3([7-metoksykarbonyl-8-winylo]-proto-
chlorofilid a) (Rys. 2, Tab. 1 ) [29-31 ].
[DV]-Pchlid (Rys. 2, Tab. 1 ), oznaczany
także jako MgDVP, został po raz
pierwszy zidentyfikowany w zielenicy
Mantoniella squamata [32], jednak ist-
nienie tego barwnika było początkowo
kwestionowane, z powodu koelucji
z parą chlorofili c1 i c2 [3]. Dopiero
późniejsze badania spektroskopowe
i chromatograficzne pozwoliły na jed-
noznaczne określenie natury tego
związku [29,33]. [DV]-Pchlid został
także wykryty w komórkach zielenic
Micromonas pusilla oraz sinic Pro-
chloron sp. i Prochlorococcus marinus
[33].
Oprócz opisanych powyżej polarnych
(niezestryfikowanych) form chlorofilu
c, opisano także związki posiadające
ugrupowanie przyłączone wiązaniem
estrowym do reszty w pozycji C-17
(Rys. 2, Tab. 1 ). Niepolarny chlorofil c2wyizolowany z E. huxleyi został ziden-
tyfikowany jako ester chlorofilu c2i monogalaktozylodiacyloglicerolu
27
opisanie ich właściwości fotochemicz-
nych oraz mechanizmów syntezy [3].
Chlorofil d
Pierwsze doniesienia o istnieniu kolej -
nego barwnika chlorofilowego pocho-
dzą z roku 1943, kiedy to wykryto
obecność nowego chlorofilu, oznaczo-
nego jako chlorofil d, w izolatach
z krasnorostów [41 ]. Okrycie to było
przez długi czas podważane, jako że
jeden z produktów utlenienia chlorofi-
lu a posiadał widmo identyczne z wid-
mem nowego barwnika [42]. Istnienie
chlorofilu d jako barwnika ważnego
w procesie fotosyntezy zostało osta-
tecznie potwierdzone w roku 1996,
kiedy to odkryto sinicę (nazwaną Aca-
ryochloris marina), zawierającą chlo-
rofil d jako główny barwnik [43].
W komórkach tego organizmu zawar-
tość chlorofilu d może sięgać 95-99%
całkowitej zawartości wszystkich chlo-
rofili. Chlorofil a jest także obecny
w tych komórkach, ale w znacząco
niższych ilościach niż chlorofil d
[44,45]. Zagadka obecności chlorofilu
d w krasnorostach została rozwiązana,
gdy wykazano, że Acaryochloris sp.
szczep Awaji jest zdolny do wzrostu
na plesze krasnorostów, co tłumaczy
obecność pochodzącego z tej sinicy
chlorofilu d w izolatach z krasnoro-
stów [42,46]. Późniejsze badania wy-
kazały, że fotoautotrofy produkujące
chlorofil d występują w bardzo szero-
kim zakresie warunków środowisko-
wych i są bardzo rozpowszechnione
[47]. Nowi przedstawiciele rodzaju
Acaryochloris są w dalszym ciągu od-
krywani [40,48,49].
Pod względem chemicznym, chlorofil d
(MGDG), zawierającego reszty kwasów
mirystylowego (14:0) i oktadekatetra-
enowego (18:4) [34]. Drugą bardzo
niepolarną formą chlorofilu c był chlo-
rofil c2-MGDG wyizolowany z haptofi-
tów Chrysochromulina polylepis,
w którym wykryto obecność dwóch
reszt kwasu mirystylowego (14:0) w
reszcie MGDG [35]. Ponadto opisano
występowanie estrów chlorofilu c1i MGDG w komórkach haptofitów
Prymnesium parvum [3,27]. Zasugero-
wano, że rolą estryfikacji chlorofili c
przez MGDG jest ułatwienie transpor-
tu chlorofilu c z miejsca jego syntezy
(bogatej w MGDG wewnętrznej błony
chloroplastów) do tylakoidów [36].
Właściwości chromatograficzne
i spektralne chlorofilu c wyizolowane-
go z haptofitów Pavlova gyrans suge-
rują, że barwnikiem tym jest chlorofil
c2 zestryfikowany niezidentyfikowa-
nym jeszcze ugrupowaniem [3,37].
Co więcej , opisano także estrową po-
chodną chlorofilu c1 z bruzdnic z ro-
dzaju Kryptoperidinium . Także w tym
przypadku określenie natury chemicz-
nej grupy przyłączonej do cząsteczki
chlorofilu wymaga dalszych badań
(Rys. 2, Tab. 1 ) [3].
Chlorofile c są bardzo heterogenną
grupą barwników, co wynika z przy-
stosowań syntezujących je organi-
zmów do różnych warunków
środowiskowych. Pełne poznanie funk-
cj i tych związków w procesach foto-
syntetycznych i znaczenia dla
adaptacji środowiskowej różnych or-
ganizmów wymaga dalszych badań.
W szczególności konieczne jest pełne
poznanie struktur chemicznych nie-
dawno odkrytych form chlorofilu c,28
jest 3-deswinyl-3-hydroksymetylową
pochodną chlorofilu a , posiadającą
grupę formylową w pozycji C-3
(Rys. 3) [50,51 ]. Ścieżka biosyntezy
chlorofilu d nie jest jeszcze poznana,
ale sugeruje się, że w reakcję syntezy
chlorofilu d z a może być zaangażowa-
na oksygenaza - cytochrom P450 [52].
Widmo absorpcyjne chlorofilu d jest
o tyle niezwykłe, że szczyt absorpcji
w paśmie Qy (światło czerwone) prze-
wyższa szczyt w paśmie Soreta (świa-
tło niebieskie; zob. Tab. 2 i Rys. 4).
Ponadto, szczyt ten jest znacznie prze-
sunięty ku czerwieni w porównaniu
z chlorofilem a. Umożliwia to rozsze-
rzenie zakresu promieniowania wyko-
rzystywanego w reakcjach
fotosyntetycznych. Jednak pomimo ab-
sorpcji większej ilości fotonów w tym
zakresie, całkowita zaabsorbowana
energia przez chlorofil d jest mniejsza
niż w przypadku chlorofilu a , co wyni-
ka z mniejszej energii przenoszonej
przez fotony odpowiadające większym
długościom fal. Kolejnym czynnikiem
odróżniającym chlorofil d od chlorofilu
a jest jego bardziej dodatni potencjał
redoks [51 ].
Chlorofil f
Ostatni z dotychczas opisanych rodza-
jów chlorofili – chlorofil f – został od-
kryty w 2010 roku podczas analiz
ekstraktów ze stromatolitów pocho-
dzących z Zatoki Rekina (Australia)
[53]. Później został on wykryty jeszcze
w sinicach szczepu KC1 [54], Halomi-
cronema hongdechloris [55], Lepto-
lyngbya sp. szczep JSC-1 [56] i nowo
opisanej sinicy z okolicy Jenolan Caves
w Australii [57].
Nowy barwnik został zidentyfikowany
jako [2-formyl]-chlorofil a (Rys. 3)
w oparciu o badania wykorzystujące
spektrometrię mas i spektroskopię
NMR [38,53].
Najnowsze badania przeprowadzone
przez Ho i wsp. [58] wykazały, że chlo-
rofil f jest syntezowany poprzez enzy-
Rys. 3. Struktury chemiczne chlorofili d i f.
29
Rys. 4. Widmo absorpcji ekstraktu z zielonego liścia, zawierającego chlorofile a i b, po roz-dziale Krausa, zmierzone w benzynie ekstrakcyjnej. Zaznaczono położenie pasm Soreta i Qoraz ogólne zmiany położenia szczytu w paśmie Qy w przypadku chlorofili c, d i f. Dokładnedane nt. położenia i intensywności poszczególnych szczytów absorpcji są wyszczególnionew tabeli 2.
Tabela 2. Właściwości absorpcyjne chlorofili c, d i f.
30
matyczne, czteroelektronowe utlenie-
nie chlorofilu a. Reakcję tę przepro-
wadza enzym syntaza chlorofilu f
(ChlF). Co ciekawe, ChlF jest foto-
oksydoreduktazą, bezpośrednio wyko-
rzystującą światło do utlenienia chlo-
rofilu a. Czyni to z tego białka drugi
opisany do tej pory fotoenzym w ścież-
kach biosyntezy chlorofili. Pierwszym
odkrytym białkiem o takich właściwo-
ściach była światłozależna oksydore-
duktaza protochlorofilidu [59].
Zhao i wsp. [60] odkryli, że w komór-
kach sinic Chlorogloeopsis fritschii
PCC 9212 i Chroococcidiopsis therma-
lis PCC 7203 biosynteza chlorofilu f
jest regulowana przez białka RfpA,
RfpB i RfpC, biorące udział w przeka-
zie sygnału związanego z odpowiedzią
na warunki oświetlenia daleką czer-
wienią. RfpA jest kinazą histydynową
pełniącą rolę fitochromu reagującego
na daleką czerwień. RfpB jest regula-
torem odpowiedzi mogącym wiązać się
do DNA. RfpC także zawiera domenę
umożliwiającą wiązanie do DNA i może
przenosić resztę fosforanową z RfpA
na RfpB [60].
Widmo absorpcyjne chlorofilu f posia-
da szczyt w paśmie Qy, który jest prze-
sunięty ku czerwieni najbardziej
ze wszystkich znanych chlorofili (za-
chodzi na zakres bliskiej podczerwieni;
Tab. 2, Rys. 4) [40]. Stanowi to adap-
tację do warunków środowiskowych,
które nie pozwalają na prowadzenie
fotosyntezy w oparciu o zakres spek-
tralny chlorofilu a. Widmo emisj i flu-
orescencji chlorofilu f odznacza się
maksimum położonym przy 714 nm
(aceton, temperatura pokojowa) [40].
Znaczenie chlorofili c, d i f w foto-
syntezie
Chlorofilom c przypisuje się funkcję
barwników wspomagających, których
rolą jest zaabsorbowanie fotonów
i przekazanie energii wzbudzenia
na cząsteczki chlorofilu a w centrum
reakcji. Do tej pory wykazano, że chlo-
rofile c1 , c2, c3, c-MGDG z E. huxleyi,
[DV]-Pchlid i chlorofil c z P. gyrans
znajdują się w kompleksach zbierają-
cych światło (ang. light-harvesting
complex, LHC) organizmów zdolnych
do fotosyntezy, w których dany chloro-
fil jest syntezowany [3,34,37,61 -63].
Niedawne badania pokazały, że trans-
fer energii wzbudzenia z chlorofilu c2na chlorofil a zachodzi w czasie 60 fs
[64]. Dodatkową postulowaną rolą
chlorofilu c jest wpływ na składanie
LHC poprzez tworzenie silnych wiązań
koordynacyjnych z ligandami we-
wnątrz białek LHC [65].
Zgodnie z najnowszymi badaniami,
chlorofil f także funkcjonuje jako
barwnik antenowy [54]. Jednakowoż
istnieją doniesienia dotyczące możli-
wości bezpośredniego przekazania
energii z chlorofilu f na chlorofil a
[66].
Chlorofil d wyróżnia się spośród pozo-
stałych omawianych chlorofili, gdyż
może on występować nie tylko w ukła-
dach antenowych, ale także w cen-
trach reakcji fotosystemów, co
do niedawna było opisywane jedynie
w przypadku chlorofilu a [2]. Wykaza-
no, że specjalna para chlorofili w foto-
systemie I A. marina jest
heterodimerem składającym się
z chlorofili d i d’ (który jest epimerem
132 chlorofilu d) [51 ,67,68]). W przy-31
Bibliografia:
[1 ] Sheer H. An Overview of chlorophylls
and bacteriochlorophylls: biochemistry,
biophysics, functions and applications. [w:]
Chlorophylls and bacteriochlorophylls, red.
Grimm B, Porra RJ, Rüdiger W, Scheer H,
Springer Netherlands, 2006, str. 1 -26.
[2] Björn LO, Papageorgiou GC,
Blankenship RE, Govindjee. A viewpoint:
why chlorophyll a? Photosynth Res.
2009;99(2):85-98.
[3] Zapata M, Garrido JL, Jeffrey W.
Chlorophyll c pigments: current status.
[w:] Chlorophylls and bacteriochlorophylls,
red. Grimm B, Porra RJ, Rüdiger W, Scheer
H, Springer Netherlands, 2006, str. 39-53.
[4] Sorby HC. On comparative vegetable
chromatology. Proc R Soc Lond.
1872;21 (139):139-47.
padku fotosystemu II tego organizmu,
natura chemiczna specjalnej pary
chlorofili nadal pozostaje niejasna
[51 ]. Sugeruje się, że może ona być
homodimerem dwóch cząsteczek chlo-
rofilu d [68,69] lub heterodimerem
złożonym z cząsteczki chlorofilu a
i chlorofilu d [70,71 ].
Rozszerzenie zakresu, w jakim możli-
wa jest absorpcja fotonów przez chlo-
rofil jest strategią ułatwiającą
przeżycie organizmom w warunkach
niskiej intensywności światła z zakresu
widzialnego, jak ma to miejsce
na przykład w przypadku A. marina
[72]. Wykorzystanie zakresu promie-
niowania o długościach fal 700-750 nm
zwiększa ilość dostępnych fotonów
o 19% [52,73]. Dzięki temu wydajność
gromadzenia energii w procesach fo-
tochemicznych przez sinice nie spada,
nawet pomimo mniejszej energii foto-
nów absorbowanych przez chlorofile d
i f [51 ,74,75].
Istnieją także organizmy, takie jak si-
nica Leptolyngbya sp. szczep JSC-1 ,
która zawiera w swoich komórkach
zarówno chlorofil d, jak i f. Oba te
barwniki są syntezowane w warunkach
oświetlenia daleką czerwienią, co po-
zwala tej sinicy przeżyć w takich, nor-
malnie niekorzystnych, warunkach
[56]. Fotoaklimatyzację w warunkach
oświetlenia bliską lub daleką czerwie-
nią opisano także dla innych organi-
zmów [76,77].
Podsumowanie
W ostatnim czasie ukazało się niewiele
prac przeglądowych dotyczących chlo-
rofili c, d i f [2 ,3,51 ], mimo ich dużego
znaczenia dla prowadzenia fotosyntezy
oksygenicznej . Działają one jako barw-
niki antenowe w LHC lub w przypadku
chlorofilu d – w centrach reakcji foto-
systemów. Ponadto, umożliwiają one
prowadzenie fotosyntezy przez organi-
zmy żyjące w środowiskach odznacza-
jących się bardzo niską intensywnością
promieniowania z zakresu światła wi-
dzialnego. Jednak pełne zrozumienie
i scharakteryzowanie korzystnych
z punktu widzenia fotosyntezy właści-
wości oraz szlaków biosyntezy tych
barwników i jej regulacji wymaga dal-
szych badań i ciągłego nakładu pracy.
Pozwoli to na dogłębne opisanie ko-
rzyści, jakie przynosi organizmom
zdolnym do fotosyntezy rozszerzanie
dostępnego dla nich zakresu promie-
niowania elektromagnetycznego.
32
[5] Strain HH, Manning WM. Chlorofucine
(chlorophyll γ), a green pigment of diatoms
and brown algae. J Biol Chem.
1942;144:625-36.
[6] Granick S. The pheoporphyrin nature of
chlorophyll c. J Biol Chem. 1949;179:505.
[7] Dougherty RC, Strain HH, Svec WA,
Uphaus RA, Katz JJ. Structure of
Chlorophyll c1 . J Am Chem Soc.
1966;88(21 ):5037-8.
[8] Dougherty RC, Strain HH, Svec WA,
Uphaus RA, Katz JJ. Structure, properties,
and distribution of chlorophyll c. J Am
Chem Soc. 1970;92(9):2826-33.
[9] Wasley JWF, Scott WT, Holt AS.
Chlorophyllides c. Canadian J Biochem.
1970;48:376-83.
[10] Jeffrey SW. Properties of two
spectrally different components in
chlorophyll c preparations. Biochim
Biophys Acta. 1969;177(3):456-67.
[1 1 ] Jeffrey SW, Sielicki M, Haxo T.
Chloroplast pigment patterns in
dinoflagellates. J Phycol. 1975;1 1 (4):374-
84.
[12] Zapata M, Jeffrey SW, Wright SW,
Rodriguez F, Garrido JL, Clementson L.
Photosynthetic pigments in 37 species (65
strains) of Haptophyta: implications for
oceanography and chemotaxonomy. Mar
Ecol Prog Ser. 2004;270:83-102.
[13] Zapata M, Rodríguez F, Fraga S, Barra
L, Ruggiero MV. Chlorophyll c pigment
patterns in 18 species (51 strains) of the
genus Pseudo-Nitzschia
(Bacillariophyceae). J Phycol.
2011 ;47(6):1 274-80.
[14] Kosakowska A, Lewandowska J, Stoń J,
Burkiewicz K. Qualitative and quantitative
composition of pigments in Phaeodactylum
tricornutum (Bacillariophyceae) stressed
by iron. Biometals. 2004;17(1 ):45-52.
[15] Bojko M, Brzostowska K, Kuczyńska P,
Latowski D, Olchawa-Pajor M, Krzeszowiec
W, Waloszek A, Strzałka K. Temperature
effect on growth, and selected parameters
of Phaeodactylum tricornutum in batch
cultures. Acta Biochim Pol.
2013;60(4):861 -4.
[16] Garrido JL, Brunet C, Rodríguez F.
Pigment variations in Emiliania huxleyi
(CCMP370) as a response to changes in
light intensity or quality. Environ
Microbiol. 2016 (w druku).
[17] Budzikiewicz H, Taraz K. Chlorophyll
c. Tetrahedron. 1971 ;27:1447-60.
[18] Strain HH, Cope BT, McDonald GN,
Svec WA, Katz JJ. Chlorophylls c1 and c2.
Phytochemistry. 1971 ;10:1 109-114.
[19] Etinsky M, Petković M, Ristić MM,
Marian CM. Electron–vibrational coupling
and fluorescence spectra of tetra-, penta-,
and hexacoordinated chlorophylls c1 and
c2. J Phys Chem B.
2015;1 19(32):10156–69.
[20] Hartzler DA, Niedzwiedzki DM,
Bryant DA, Blankenship RE, Pushkar Y,
Savikhin S. Triplet excited state energies
and phosphorescence spectra of
(bacterio)chlorophylls. J Phys Chem B.
2014;1 18(26):7221 -32.
[21 ] Jaramillo P, Coutinho K, Cabral BJC,
Canuto S. Explicit solvent effects on the
visible absorption spectrum of a
photosynthetic pigment: chlorophyll-c2 in
methanol. Chem Phys Lett. 2011 ;516(4-
6):250-3.
[22] Premvardhan L, Robert B, Beer A,
Büchel C. Pigment organization in
fucoxanthin chlorophyll a/c2 proteins (FCP)
based on resonance Raman spectroscopy
and sequence analysis. Biochim Biophys
Acta. 2010;1797(9):1647-56.
[23] Yoshioka H, Kamata A, Konishi T,
33
Takahashi J, Oda H, Tamai T, Toyohara H,
Sugahara T. Inhibitory effect of chlorophyll
c2 from brown algae, Sargassum horneri,
on degranulation of RBL-2H3 cells. J
Functional Foods. 2013;5(1 ):204-10.
[24] Fujiwara T, Nishida N, Nota J, Kitani T,
Aoishi K, Takahashi H, Sugahara T, Hato N.
Efficacy of chlorophyll c2 for seasonal
allergic rhinitis: single-center double-blind
randomized control trial. Eur Arch
Otorhinolaryngol. 2016 (w druku).
[25] Jeffrey SW, Wright SW. A new
spectrally distinct component in
preparations of chlorophyll c from the
micro-alga Emiliania huxleyi
(Prymnesiophycease). Biochim Biophys
Acta. 1987;894(2):180-8.
[26] Fookes CJR, Jeffrey SW. The structure
of chlorophyll c3, a novel marine
photosynthetic pigment. J Chem Soc Chem
Commun. 1989:1827-1828.
[27] Garrido JL, Zapata M, Muñiz S.
Spectral characterization of new
chlorophyll c pigments isolated from
Emiliania huxleyi (Prymnesiophyceae) by
high-performance liquid chromatography. J
Phycol. 1995;31 (5):761 -8.
[28] Garrido JL, Zapata M. Detection of
new pigments from Emiliania huxleyi
(Prymnesiophyceae) by high-performance
liquid chromatography, liquid
chromatography–mass spectrometry,
visible spectroscopy, and fast atom
bombardment mass spectrometry. J Phycol.
1998;34(1 ):70-8.
[29] Jeffrey SW. Chlorophyll c pigments
and their distribution in the chromophyte
algae. [w:] The chromophyte algae:
problems and perspectives, red. Green JC,
Leadbeater BSC, Diver WL, Clarendon
Press, Oxford, 1989, str. 13-36.
[30] Jeffrey SW. Structural relationships
between algal chlorophylls. [w:]
Phytoplankton pigments in oceanography:
guidelines to modern methods, red. Jeffrey
SW, Mantoura RFC, Wright SW, UNESCO
Publishing, Paris, 1997, str. 566-71 .
[31 ] Álvarez S, Rodríguez F, Riobó P,
Garrido JL, Vaz B. Chlorophyll cCS-170isolated from Ostreococcus sp. is [7-
methoxycarbonyl-8-
vinyl]protochlorophyllide a. Org Lett.
2013;15(17):4430-3.
[32] Wilhelm C. Purification and
identification of chlorophyll c1 from the
green alga Mantoniella squamata. Biochim
Biophys Acta. 1987;892(1 ):23-9.
[33] Helfrich M, Ross A, King GC, Turner
A, Larkum AWD. Identification of [8-vinyl]-
protochlorophyllide a in phototrophic
prokaryotes and algae: chemical and
spectroscopic properties. Biochim Biophys
Acta. 1999;1410(3):262-72.
[34] Garrido JL, Otero J, Maestro MA,
Zapata M. The main nonpolar chlorophyll c
from Emiliania huxleyi (Prymnesiophyceae)
is a chlorophyll c2-
monogalactosyldiacylglyceride ester: a
mass spectrometry study. J Phycol.
2000;36(3):497-505.
[35] Zapata M, Edvardsen B, Rodríguez F,
Maestro MA, Garrido JL. Chlorophyll c2monogalactosyldiacylglyceride ester (chl
c2-MGDG). A novel marker pigment for
Chrysochromulina species (Haptophyta).
Mar Ecol Prog Ser. 2001 ;219:58-98.
[36] Jeffrey SW, Anderson M. Emiliania
huxleyi (Haptophyta) holds promising
insights for photosynthesis. J Phycol.
2000;36(3):449-52.
[37] Fawley MW. A new form of chlorophyll
c involved in light-harvesting. Plant
Physiol. 1989;91 (2):727-32.
[38] Willows RD, Li Y, Scheer H, Chen M.
34
Structure of chlorophyll f. Org Lett.
2013;15(7):1588-90.
[39] Jeffrey SW, Mantoura RFC, Bjørnland
T. Data for the identification of 47 key
phytoplankton pigments. [w:]
Phytoplankton pigments in oceanography:
guidelines to modern methods, red. Jeffrey
SW, Mantoura RFC, Wright SW, UNESCO
Publishing, Paris, 1997, str. 449-559.
[40] Li Y, Cai ZL, Chen M. Spectroscopic
properties of chlorophyll f. J Phys Chem B.
2013;1 17(38):1 1309-17.
[41 ] Manning WM, Strain HH. Chlorophyll
d, a green pigment of red algae. J Biol
Chem. 1943;151 :1 -19.
[42] Murakami A, Miyashita H, Iseki M,
Adachi K, Mimuro M. Chlorophyll d in an
epiphytic cyanobacterium of red algae.
Science. 2004;303(5664):1633.
[43] Miyashita H, Ikemoto H, Kurano N,
Adachi K, Chihara M, Miyachi S.
Chlorophyll d as a major pigment.
1996;383:402.
[44] Miyashita H, Adachi K, Kurano N,
Ikemoto H, Chihara M, Miyachi S. Pigment
composition of a novel oxygenic
photosynthetic prokaryote containing
chlorophyll d as the major chlorophyll.
Plant Cell Physiol. 1997;38(3):274-81 .
[45] Loughlin P, Lin Y, Chen M. Chlorophyll
d and Acaryochloris marina: current
status. Photosynth Res. 2013;1 16(2-3):277-
93.
[46] Larkum AW, Kühl M. Chlorophyll d:
the puzzle resolved. Trends Plant Sci.
2005;10(8):355-7.
[47] Kashiyama Y, Miyashita H, Ohkubo S,
Ogawa NO, Chikaraishi Y, Takano Y, Suga
H, Toyofuku T, Nomaki H, Kitazato H,
Nagata T, Ohkouchi N. Evidence of global
chlorophyll d. Science.
2008;321 (5889):658.
[48] Behrendt L, Larkum AW, Norman A,
Qvortrup K, Chen M, Ralph P, Sørensen SJ,
Trampe E, Kühl M. Endolithic chlorophyll
d-containing phototrophs. ISME J.
2011 ;5(6):1072-6.
[49] Larkum AW, Chen M, Li Y, Schliep M,
Trampe E, West J, Salih A, Kühl M. A novel
epiphytic chlorophyll d-containing
cyanobacterium isolated from a mangrove-
associated red alga. J Phycol.
2012;48(6):1320-7.
[50] Chen M. Chlorophyll modifications
and their spectral extension in oxygenic
photosynthesis. Annu Rev Biochem.
2014;83:317-40.
[51 ] Allakhverdiev SI, Kreslavski VD,
Zharmukhamedov SK, Voloshin RA,
Korol'kova DV, Tomo T, Shen JR.
Chlorophylls d and fand their role in
primary photosynthetic processes of
cyanobacteria. Biochemistry (Mosc).
2016;81 (3):201 -12.
[52] Chen M, Blankenship RE. Expanding
the solar spectrum used by photosynthesis.
Trends Plant Sci. 2011 ;16(8):427-31 .
[53] Chen M, Schliep M, Willows RD, Cai
ZL, Neilan BA, Scheer H. A red-shifted
chlorophyll. Science.
2010;329(5997):1318-9.
[54] Akutsu S, Fujinuma D, Furukawa H,
Watanabe T, Ohnishi-Kameyama M i wsp.
Pigment analysis of a chlorophyll f-
containing cyanobacterium strain
KC1 isolated from Lake Biwa. Photomed
Photobiol. 2001 ;33:35-40.
[55] Chen M, Li Y, Birch D, Willows RD. A
cyanobacterium that contains chlorophyll f
- a red-absorbing photopigment. FEBS
Lett. 2012;586(19):3249-54.
[56] Gan F, Zhang S, Rockwell NC, Martin
SS, Lagarias JC, Bryant DA. Extensive
remodeling of a cyanobacterial
35
photosynthetic apparatus in far-red light.
Science. 2014;345(6202):1312-7.
[57] Behrendt L, Brejnrod A, Schliep M,
Sørensen SJ, Larkum AW, Kühl M.
Chlorophyll f-driven photosynthesis in a
cavernous cyanobacterium. ISME J.
2015;9(9):2108-11 .
[58] Ho MY, Shen G, Canniffe DP, Zhao C,
Bryant DA. Light-dependent chlorophyll f
synthase is a highly divergent paralog of
PsbA of photosystem II. Science.
2016;353(6302).
[59] Gabruk M, Myśliwa-Kurdziel B. Light-
dependent protochlorophyllide
oxidoreductase: phylogeny, regulation, and
catalytic properties. Biochemistry.
2015;54(34):5255-62.
[60] Zhao C, Gan F, Shen G, Bryant DA.
RfpA, RfpB, and RfpC are the master
control elements of Far-Red Light
Photoacclimation (FaRLiP). Front
Microbiol. 2015;6:1303.
[61 ] Wilhelm C, Wiedemann I. Evidence of
protein bound chlorophyll c3 in a light-
harvesting protein isolated from the
flagellate alga Prymnesium parvum
(Prymnesiophyceae). Photosynthetica
1991 ;25:249-255.
[62] Rhiel E, Lange W, Mörschel E. The
unusual light-harvesting complex of
Mantoniella squamata: supramolecular
composition and assembly. Biochim
Biophys Acta. 1993;1 143(2):163-72.
[63] Caron L, Douady D, De Martino A,
Quinet M. Light harvesting in brown algae.
Cah Biol Mar. 2001 ;42:109-124.
[64] Songaila E, Augulis R, Gelzinis A,
Butkus V, Gall A i wsp. Ultrafast energy
transfer from chlorophyll c2 to chlorophyll
a in fucoxanthin-chlorophyll protein
complex. J Phys Chem Lett.
2013;4(21 ):3590-5.
[65] Hoober JK, Eggink LL. A potential role
of chlorophylls b and c in assembly of light-
harvesting complexes. FEBS Lett.
2001 ;489(1 ):1 -3.
[66] Akimoto S, Shinoda T, Chen M,
Allakhverdiev SI, Tomo T. Energy transfer
in the chlorophyll f-containing
cyanobacterium, Halomicronema
hongdechloris, analyzed by time-resolved
fluorescence spectroscopies. Photosynth
Res. 2015;125(1 -2):1 15-22.
[67] Sivakumar V, Wang R, Hastings G.
Photo-oxidation of P740, the primary
electron donor in photosystem I from
Acaryochloris marina. Biophys J.
2003;85(5):3162-72.
[68] Tomo T, Okubo T, Akimoto S, Yokono
M, Miyashita H, Tsuchiya T, Noguchi T,
Mimuro M. Identification of the special
pair of photosystem II in a chlorophyll d-
dominated cyanobacterium. PNAS.
2007;104(17):7283-8.
[69] Itoh S, Mino H, Itoh K, Shigenaga T,
Uzumaki T, Iwaki M. Function of
chlorophyll d in reaction centers of
photosystems I and II of the oxygenic
photosynthesis of Acaryochloris marina.
Biochemistry. 2007;46(43):12473-81 .
[70] Schlodder E, Cetin M, Eckert HJ,
Schmitt FJ, Barber J, Telfer A. Both
chlorophylls a and d are essential for the
photochemistry in photosystem II of the
cyanobacteria, Acaryochloris marina.
Biochim Biophys Acta. 2007;1767(6):589-
95.
[71 ] Tomo T, Kato Y, Suzuki T, Akimoto S,
Okubo T i wsp. Characterization of highly
purified photosystem I complexes from the
chlorophyll d-dominated cyanobacterium
Acaryochloris marina MBIC 11017. J Biol
Chem. 2008;283(26):18198-209.
[72] Swingley WD, Chen M, Cheung PC,
36
Conrad AL, Dejesa LC i wsp. Niche
adaptation and genome expansion in the
chlorophyll d-producing cyanobacterium
Acaryochloris marina. Proc Natl Acad Sci
U S A. 2008;105(6):2005-10.
[73] Blankenship RE, Chen M. Spectral
expansion and antenna reduction can
enhance photosynthesis for energy
production. Curr Opin Chem Biol.
2013;17(3):457-61 .
[74] Mielke SP, Kiang NY, Blankenship RE,
Mauzerall D. Photosystem trap energies
and spectrally-dependent energy-storage
efficiencies in the Chl d-utilizing
cyanobacterium, Acaryochloris marina.
Biochim Biophys Acta. 2013;1827(3):255-
65.
[75] Li Y, Lin Y, Loughlin PC, Chen M.
Optimization and effects of different
culture conditions on growth of
Halomicronema hongdechloris - a
filamentous cyanobacterium containing
chlorophyll f. Front Plant Sci. 2014;5:67.
[76] Airs RL, Temperton B, Sambles C,
Farnham G, Skill SC, Llewellyn CA.
Chlorophyll fand chlorophyll d are
produced in the cyanobacterium
Chlorogloeopsis fritschii when cultured
under natural light and near-infrared
radiation. FEBS Lett. 2014;588(20):3770-7.
[77] Gan F, Shen G, Bryant DA. Occurrence
of Far-Red Light Photoacclimation
(FaRLiP) in diverse cyanobacteria. Life.
2015;5:4-24.
37
Introduction
The homeostasis of intracellular pH
and its regulation are of paramount
importance for the normal physiology
of the cells. Processes such as meta-
bolic pathways, the activity of ion
channels, membrane trafficking
or protein sorting require pH to be
kept within a well-defined range that
varies between the cytosol and diffe-
rent cellular organelles. pH values can
range from 4.7 in lysosomes to 8.0
in mitochondria, while the cytoplasmic
pH is close to neutral [1 ,2]. The
utmost importance of pH in numerous
cellular activities makes it a very use-
ful parameter to study in detail. It also
demonstrates the importance of relia-
ble sensors of intracellular pH. This
article will delineate the discovery and
properties of so-called “pHluorins”,
fluorescent proteins that can be used
to monitor the pH changes inside
the cells, and describe some recent
examples of the use of those proteins.
Green Fluorescent Protein and the
pH dependence of its fluorescence
Green Fluorescent Protein (GFP;
Fig. 1 ) is a fluorescent protein that
was first identified in the jellyfish
Aequorea victoria in 1962 [3]. It consi-
sts of 238 amino acids, corresponding
to a molecular weight of 26.9 kDa
[4,5]. The amino-acid chain folds into
a β-barrel structure comprising
of 1 1 β-sheets and one central α-helix.
pHluorins – a tool to measure intracellular pH
Mariia Borbuliak1, Wiktor Tokarek2
1Department of Biochemistry, Faculty of Biology,Ivan Franko National University of Lviv2Department of Plant Physiology and Biochemistry, Faculty of Biochemistry,Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University in KrakówWritten under the supervision of PD Dr. Jost Ludwig
Intracellular pH plays a crucial role in numerous cellular processes,
including protein synthesis and sorting, membrane trafficking and the
activity of ion channels. Moreover, cells must keep pH at certain levels
inside different cellular compartments in order to maintain their
function. Thus, pH values that can be found inside the cell can range
from ~4.7 to ~8.0, with 7.0-7.2 being the pH of the cytosol. Precise
measurements of intracellular pH values, and their changes, can be
extremely useful in elucidating the intricate processes occurring inside
the cells. pHluorins are a useful tool for such purposes. They are a group
of fluorescent proteins, characterized by predictable and measurable
changes in their spectral features in response to changing pH. This
article summarizes the history of the development of pHluorins, and
describes their spectral properties. Additionally it provides examples of
the uses of these genetically encoded sensors in current research.
38
That helical region contains the chro-
mophore formed from three intrinsic
residues – Ser65, Tyr66 and Gly67 –
by autocatalytic posttranslational mo-
dification: dehydration and oxidation
by atmospheric oxygen [6,7]. This tri-
amino acid structure is responsible for
GFP’s spectral properties. It absorbs
light at 395 nm and emits light with
a maximum at 508 nm (green flore-
scence). The excitation spectrum also
contains a small peak at 475 nm [8].
The spectral properties of GFP’s flu-
orescence depend on pH – the fluore-
scence intensity is stable within
the pH range of 6-10. Below that,
the intensity strongly diminishes.
On the other hand, it increases in pH
10-12 and decreases again in even hi-
gher pH [9,10]. The shape of the spec-
tra is generally not influenced by pH
changes, although the peaks ratio may
change in a pH-dependent manner
[11 ]. It was proposed that GFP can
exist in two distinct ground states dif-
fering in the protonation of the chro-
mophore. If the phenol group of Tyr66
is uncharged, the excitation peak
is located at ~395 nm. The charged
phenolate group of this residue corre-
sponds to the GFP variant exited
at ~475 nm [7,1 1 ,12]. At low pH
the phenol form is favored, which re-
sults in GFP being excited at
~395 nm. At alkaline pH Tyr66 exists
predominantly in the phenolate form,
which shifts the excitation maximum
to ~475 nm [7,1 1 ]. These properties
of GFP are remarkable and were used
to develop new mutants with enhan-
ced pH sensitivity.
Development of pHluorins
and their derivatives
The GFP mutants with enhanced pH
sensitivity were first developed
in 1 998. James Rothman’s group em-
ployed structure-directed combinato-
rial mutagenesis, using S202H GFP
mutant as a starting point. This mu-
tant protein showed slight changes
in its excitation spectrum in response
to a pH shifts from 7.4 to 6.0. Since
wild-type GFP does not exhibit chan-
ges in fluorescence spectrum in this
pH range, this mutant was a good
starting point for combinatorial muta-
genesis. By mutating key residues in-
volved in GFP’s proton-relay network,
the Authors generated two pH-sensiti-
ve fluorescent proteins, named “ratio-
metric” and “ecliptic” “pHluorins”
[13].
Ratiometric pHluorin (mutations39
Fig. 1 . Structure of Green FluorescentProtein, upon which the pHluorins are ba-sed (PDB: 1EMA).
E132D, S147E, N149L, N164I, K166Q,
I167V, R168H, S202H, L220F) is cha-
racterized by the bimodal excitation
spectrum with significant peaks
at ~395 and ~475 nm. The ratio
of fluorescence emission intensities
at those peaks changes in response
to pH changes between ~5.5 and
~7.5, and it can be calibrated using
buffers of known pH [13] (Fig. 2).
The ratiometric nature of the measu-
rement makes in not susceptible to er-
rors caused by wrong assessment
of protein concentration [2].
Ecliptic pHluorin (mutations S147D,
N149Q, T161 I, S202F, Q204T, A206T;
the original S202H substitution is
no longer present) is characterized by
a major excitation maximum at ~395
nm and a small one at ~475 nm. This
protein gradually loses its fluorescen-
ce in lower pH. The excitation peak
at 475 nm disappears in pH <6.0 and
the protein becomes invisible (it eclip-
ses) under such excitation [13].
pHluorins can be fused to other prote-
ins to study the pH in different cellular
compartments. Such is the case with
so-called synapto-pHluorins, which
are used to study neurotransmitters
release and the trafficking of their re-
ceptors. In this setup, pHluorin was
fused, for example, with VAMP-
2/streptabrevin [13,14].
In order to increase the brightness
of pH-sensitive GFP mutants, a new
derivative of ecliptic pHluorin, termed
“superecliptic pHluorin”, has been de-
veloped. Its primary structure contains
two additional amino acid substitu-
tions, namely F64L and S65T. These
mutations caused a nine-fold increase
in protein fluorescence yield, compa-
red to the original ecliptic pHluorin,
40
Fig. 2. Excitation spectra of ratiometric pHluorin in different intracellular pH va-lues of yeast cells’ cytosol. The intracellular pH was set to a given value by incu-bating yeast cells (Saccharomyces cerevisiae) in a buffer of that pH.
with no changes in the pH dependence
[15]. F64L and S65T substitutions we-
re first used in the development of En-
hanced GFP (EGFP), characterized by
an increased brightness in relation
to wild-type GFP [16,17]. These muta-
tions were introduced in ratiometric
pHluorin with the same result – an in-
crease in brightness and the mainte-
nance of the pH sensitivity. This novel
version was named “pHluorin2” [18].
Another mutation introduced in ratio-
metric pHluorin’s sequence was
M153R. It resulted in an increased
brightness and stability of its fusion
products [19]. RaVC is a derivative of
ratiometric pHluorin developed for vi-
sualizing and quantifying intracellular
pH in living fungal hyphae [20].
For studying pH changes in plants, yet
another pHluorin-related reporter
protein was created. This protein, na-
med Pt-GFP, was based not on GFP
isolated from A. victoria , but from the
orange sea pen Ptilosarcus gurneyi.
Pt-GFP is readily expressed in model
plant Arabidopsis thaliana without any
codon-usage modifications that were
necessary for the expression of A. vic-
toria GFP-based sensors [21 ,22]. Com-
pared to the original ratiometric
pHluorin, Pt-GFP has a lower pH sen-
sitivity. This is compensated by its
broader pH responsiveness (from pH
~3.8 to pH ~7.8), outstanding dyna-
mic ratio range and increased stability
at low pH [22]. An overview of pHlu-
orins derivatives can be found in
[2,23].
A new approach to enhance the sensi-
tivity of pHluorin-based assays was
made in 2015. This method is not ba-
sed on modifications of the pH sensiti-
ve proteins themselves, but on a diffe-
rent way of fluorescence
measurement, namely by using syn-
chronously scanned fluorescence
spectra. This allows the measurements
of changes in pH as small as <0.1 unit
[24].
pHluorins in research – a few
examples
In order to monitor proteins at the
surface of cells, one can employ diffe-
rent techniques, such as surface bioti-
nylation, antibody labelling of
extracellular epitopes in intact cells
for use in immunocytochemical
or ELISA assays and electrophysiolo-
gical tagging of ion channels. Howe-
ver, the pHluorin fluorescence-based
approach has potentially distinct ad-
vantages over these commonly used
strategies, because it simultaneously
achieves high temporal and spatial re-
solution. This should allow not only
real-time tracking of the delivery and
removal of proteins to and from
the cell surface, but also the simulta-
neous detection of the cellular regions
where these changes take place [25].
As we mentioned above, ecliptic pHlu-
orins are non-fluorescent at pH 6 un-
der 470 nm excitation, which
eliminates the background due to
the resting vesicles in synaptic cells
and thus these proteins are potentially
suited for detecting even single vesicle
fusion events. Moreover, ecliptic sy-
napto-pHluorins imaged by two-photon
or confocal microscopy could report
transmission in neural tissue of trans-
genic animals, in a transmitter- or cell41
type-specific manner with high sensi-
tivity [13].
By monitoring changes in fluorescence
of the ratiometric synapto-pHluorins,
it was possible to study exocytosis
in presynaptic terminals induced
by depolarization of hippocampal neu-
rons. The ratiometric nature of this
synapto-pHluorin allows consistent
and accurate analysis of changes
in pH, because it eliminates possible
artifacts introduced by cell movement,
focus changes or photobleaching. [25].
Synapto-pHluorin, a product of the fu-
sion between ecliptic pHluorin and sy-
naptic vesicle v-SNARE synaptobrevin
2, has been extensively used to study
synaptic vesicle recycling. Since pHlu-
orins have a pKa of 7.1 , it makes them
ideal for tracking varying pH of sy-
naptic vesicle lumen following
the passing of action potential impul-
ses through the plasma membrane.
pHluorins targeted to the synaptic ve-
sicle lumen (synapto-pHluorin) ena-
bled measurements of dynamic
changes in pH of vesicle lumen resul-
ting from exocytosis and endocytosis
of synaptic vesicles during presynaptic
activity. In addition, they provide
an analytical framework for under-
standing the magnitude of the optical
signals generated by fusion of synaptic
vesicles with the plasma membrane
[15].
Using an improved fluorescent repor-
ter comprising of pHluorin fused
to synaptophysin, it was found that
only a slow mode of endocytosis
(t = 1 5 s) operates at hippocampal sy-
napses when vesicle fusion is trigge-
red by a single nerve impulse or short
burst [26]. A new, improved fluore-
scent reporter of exocytosis and endo-
cytosis, sypHy, made by fusing
pH-sensitive GFP [13] to the synaptic
vesicle protein synaptophysin, was
used to measure synaptic vesicle re-
trieval after single action potentials.
While fast "kiss-and-run" mode has
been reported to be the predominant
mode of fusion, only one mode of en-
docytosis, which occurred with a time
constant of 15 s, was found. However,
vesicle fusion is triggered by a single
nerve impulse or short burst. Inhibi-
ting clathrin-mediated endocytosis, the
machinery for retrieving of synaptic
vesicles that can collapse on fusion,
completely blocked vesicle retrieval
after weak stimuli. These results pro-
vide clear evidence against the idea
that fast, clathrin-independent mecha-
nisms play a significant role at hippo-
campal synapses [26].
It was also found that vesicular gluta-
mate transporter VGLUT1 interacts
directly with endophilin, a component
of the clathrin-dependent endocytic
machinery. In the absence of its inte-
raction with endophilin, VGLUT1 re-
cycles more slowly during prolonged,
high-frequency stimulation. To study
VGLUT1 trafficking in real time, a su-
per-ecliptic pHluorin was fused into
the large, first lumenal loop of this
transporter. After expression in hippo-
campal neurons, VGLUT1 -pHluorin
colocalizes in varicosities with the sy-
naptic vesicle protein SV2. In addition,
the fluorescence of VGLUT1 -pHluorin
changes in response to neural activity.
Electrical stimulation (10 Hz for 60 s)
produces a rapid increase in fluore-42
scence, consistent with the relief
of fluorescence quenching on exposu-
re to higher external pH during sy-
naptic vesicle exocytosis [27].
Apart from studying neural cells,
pHluorins were also be successfully
used in measurements of intracellular
pH values in yeast cells [28]. The first
paper describing the studies on intra-
cellular pH using ratiometric pHluorin
was published in 2005. The Authors
showed that yeast Nhx1 protein,
an endosomal Na+/H+ exchanger, re-
gulated luminal and cytoplasmic pH,
which is essential for trafficking path-
ways out of the late endosome [29].
Martínez-Muñoz et al. described
the importance of vacuolar proton-
translocating ATPases for vacuolar
acidification in response to glucose
metabolism and for maintaining
the pH homeostasis [30]. Maresová et
al. used pHluorin to determine
the buffering capacity of yeast cells’
cytosol. The results, obtained with
a microplate reader, suggested that
this capacity is equal to ~52 mM/pH
[28]. Moreover, vacuolar pH was iden-
tified as a crucial regulator of ageing
ans mitochondrial function in yeast
cells [31 ].
Conclusions
The pHluorin technique is a very use-
ful tool for the non-invasive monitoring
of events such as exocytosis, endocy-
tosis and protein surface expression
in living neurons with high spatial and
temporal resolution [25], determining
the buffering capacity of yeast cyto-
plasm (understood as the ability
of cells to maintain a relatively stable
cytosolic pH when protons are either
added or withdrawn) in vivo. In seve-
ral studies, pHluorins were used
to study the cytosolic and intraorga-
nellar pH of S. cerevisiae, describing
the cells’ response to various growth
conditions, glucose pulses, respiratory
chain inhibitors and other treatments.
Furthermore, pHluorins can be used
to dynamically measure the pH of va-
rious intracellular compartments, such
as the cytoplasm, peroxisomes, endo-
somes and the trans-Golgi network,
to monitor lateral movements of pro-
teins within the plasma membrane li-
pid bilayer following exocytosis,
to analyze the dynamics and Ca2+-de-
pendency of presynaptic secretory ve-
sicle endocytosis and as a marker
of presynaptic development. Another
potential use for pHluorins is the study
of lateral protein diffusion within
the plasma membrane. pHluorin tech-
nique permits dynamic observation
of cell surface proteins, hence it is po-
ssible to selectively assess the lateral
movement of proteins through the li-
pid bilayer. Photobleaching protocols
can be used to measure the rates
and directions of protein movement
between different membrane microdo-
mains, such as synapses or lipid rafts
[25,29,30,32].
43
References:
[1 ] Casey JR, Grinstein S, Orlowski J.
Sensors and regulators of intracellular pH.
Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;1 1 (1 ):50-61 .
[2] Benčina M. Illumination of the spatial
order of intracellular pH by genetically
encoded pH-sensitive sensors. Sensors.
2013;13(12):16736-58.
[3] Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y.
Extraction, purification and properties of
aequorin, a bioluminescent protein from
the luminous hydromedusan, Aequorea. J
Cell Comp Physiol. 1962;59:223-39.
[4] Shimomura O. Structure of the
chromophore of Aequorea green
fluorescent protein. FEBS Letters.
1979;104(2):220-2.
[5] Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW,
Prendergast FG, Cormier MJ. Primary
structure of the Aequorea victoria green-
fluorescent protein. Gene.
1992;1 11 (2):229-33.
[6] Ormö M, Cubitt AB, Kallio K, Gross LA,
Tsien RY, Remington SJ. Crystal structure
of the Aequorea victoria green fluorescent
protein. Science. 1996;273(5280):1392-5.
[7] Campbell TN, Choy FYM. The effect of
pH on Green Fluorescent Protein: a brief
review. Molecular Biology Today.
2001 ;2(1 ):1 -4.
[8] Tsien RY. The green fluorescent
protein. Annu Rev Biochem. 1998;67:509-
44.
[9] Ward WW. Properties of the
coelenterate green-fluorescent proteins.
In: Bioluminescence and
chemiluminenscence: basic chemistry and
analytical applications. DeLuca MA,
McElroy WD eds. Academic Press, New
York, 1981 ;235-42.
[10] Patterson GH, Knobel SM, Sharif WD,
Kain SR, Piston DW. Use of the green
fluorescent protein and its mutants in
quantitative fluorescence microscopy.
Biophysical Journal. 1997;73(5):2782-2790.
[1 1 ] Kneen M, Farinas J, Li Y, Verkman AS.
Green fluorescent protein as a noninvasive
intracellular pH indicator. Biophysical
Journal. 1998;74(3):1591 -9.
[12] Chattoraj M, King BA, Bublitz GU,
Boxer SG. Ultra-fast excited state
dynamics in green fluorescent protein:
multiple states and proton transfer. Proc
Natl Acad Sci USA. 1996;93(16):8362-7.
[13] Miesenböck G, De Angelis DA,
Rothman JE. Visualizing secretion and
synaptic transmission with pH-sensitive
green fluorescent proteins. Nature.
1998;394(6689):192-5.
[14] Miesenböck G. Synapto-pHluorins:
genetically encoded reporters of synaptic
transmission. Cold Spring Harb Protoc.
2012;2012(2):213-7.
[15] Sankaranarayanan S, De Angelis D,
Rothman JE, Ryan TA. The use of
pHluorins for optical measurements of
presynaptic activity. Biophysical Journal.
2000;79(4):2199-208.
[16] Heim R, Cubitt AB, Tsien RY.
Improved green fluorescence. Nature.
1995;373(6516):663-4.
[17] Cormack BP, Valdivia RH, Falkow S.
FACS-optimized mutants of the green
fluorescent protein (GFP). Gene.
1996;173:33-8.
[18] Mahon MJ. pHluorin2: an enhanced,
ratiometric, pH-sensitive green florescent
protein. Advances in bioscience and
biotechnology. 2011 ;2(3):132-7.
[19] Morimoto YV, Kojima S, Namba K,
Minamino T. M153R mutation in a pH-
sensitive green fluorescent protein
stabilizes its fusion proteins. PLoS One.
2011 ;6(5):e19598.
44
[20] Bagar T, Altenbach K, Read ND,
Bencina M. Live-Cell imaging and
measurement of intracellular pH in
filamentous fungi using a genetically
encoded ratiometric probe. Eukaryot Cell.
2009;8(5):703-12.
[21 ] Moseyko N, Feldman LJ. Expression of
pH-sensitive green fluorescent protein in
Arabidopsis thaliana. Plant Cell Environ.
2001 ;24(5):557-63.
[22] Schulte A, Lorenzen I, Böttcher M,
Plieth C. A novel fluorescent pH probe for
expression in plants. Plant Methods.
2006;2:7.
[23] Martinière A, Desbrosses G, Sentenac
H, Paris N. Development and properties of
genetically encoded pH sensors in plants.
Front Plant Sci. 2013;4:523.
[24] Plášek J, Melcrová A, Gášková D.
Enhanced sensitivity of pHluorin-based
monitoring of intracellular pH changes
achieved through synchronously scanned
fluorescence spectra. Anal Chem.
2015;87(19):9600-4.
[25] Ashby MC, Ibaraki K, Henley JM. It’s
green outside: tracking cell surface
proteins with pH-sensitive GFP. Trends in
Neurosciences. 2004;27(5):257-261 .
[26] Granseth B, Odermatt B, Royle SJ,
Lagnado L. Clathrin-mediated endocytosis
is the dominant mechanism of vesicle
retrieval at hippocampal synapses.
Neuron. 2006;51 (6):773–786.
[27] Voglmaier SM, Kam K, Yang H, Fortin
DL, Hua Z, Nicoll RA, Edwards RH.
Distinct endocytic pathways control the
rate and extent of synaptic vesicle protein
recycling. Neuron. 2006;51 (1 ):71 –84.
[28] Maresová L, Hosková B, Urbánková E,
Chaloupka R, Sychrová H. New
applications of pHluorin - measuring
intracellular pH of prototrophic yeasts and
determining changes in the buffering
capacity of strains with affected potassium
homeostasis. Yeast. 2010;27(6):317-25.
[29] Brett CL, Tukaye DN, Mukherjee S,
Rao R. The yeast endosomal Na+ (K+)/H+
exchanger Nhx1 regulates cellular pH to
control vesicle trafficking. Mol Biol Cell.
2005;16(3):1396–1405.
[30] Martínez-Muñoz GA, Kane P. Vacuolar
and plasma membrane proton pumps
collaborate to achieve cytosolic pH
homeostasis in yeast. J Biol Chem.
2008;283(29):20309-19.
[31 ] Hughes AL, Gottschling DE. An early
age increase in vacuolar pH limits
mitochondrial function and lifespan in
yeast. Nature. 2012;492(7428):261 -5.
[32] Roos A, Boron WF. Intracellular pH.
Physiol Rev. 1981 ;61 (2):296–434.
45
46
W dniach 25-27 listopada 2016 Akademickie Stowarzyszenie Stu-dentów Biotechnologii (ASSB), Koło Studentów Biotechnologii(KSB), SKN Heterocyklika oraz SKN Chemii Medycznej organizująI międzynarodową konferencję pod nazwą „BioChemMed Session”,która odbędzie się w Gdańsku.
Wydarzenie skierowane jest do naukowców, przedzierających szlakitajemnej wiedzy z zakresu nauk medycznych, biologicznychoraz chemicznych. Jeżeli więc jesteś studentem I czy II stopnia lubjesteś doktorantem na studiach o profilu medycznym, biologicznym,chemicznym, biotechnologicznym lub kierunkach pokrewnychi chcesz podzielić się swoją wiedzą oraz doświadczeniem z innymimłodymi naukowcami, zarejestruj się na konferencję już dziś!
Prezentacja wyników naukowych będzie możliwa w formie prezen-tacji ustnych i posterowych. Zgłoszenia przyjmowane są do 31 paź-dziernika 2016r. Koszt uczestnictwa wynosi 60 zł dla członkówASSB i 100 zł dla pozostałych osób.
Więcej informacji oraz formularz zgłoszeniowy znajdują na stronieinternetowej http://assb.pl/Bcm_session/
Zaproszenie na BioChemMed Session
Publikacja w Acta Mygenica XI
Zachęcamy do publikacji w kolejnym numerze Zeszytów Naukowych"Acta Mygenica" Koła Naukowego Studentów Biotechnologii"Mygen". Akceptujemy artykuły przeglądowe i badawcze o tematy-ce z zakresu lifescience. Najlepsze z nadesłanych artykułów zostanąopublikowane w XI wydaniu "Acta Mygenica" w styczniu 2017 .
W razie pytań prosimy o kontakt z redaktor naczelną -Dobrochną Dolicką ([email protected]).
Poprzednie edycje zeszytów naukowych „Acta Mygenica” sądostępne pod adresem:
www.mygen.wbbib.uj .edu.pl/dzialalnosc/actamygenica
47
ISSN 1899-5535
Top Related