7 " d e " M a y o " d e " 2 0 1 8 ""
d e " t e j i d o s " a " m o l é c u l a s " " ""
UNIVERSDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
UNIDAD DE IMAGENOLOGÍA
Lupa simple
Fotónico compuesto
Estereoscopico binocular
Electrónico de barrido
Epifluorescencia Confocal 1P & 2P
Zacharias Janssen 1590
Anton van Leeuwenhoek >1660
Cristal de roca Niníve Imperio Asirio - 612 a.C.
Johan Giovanni Faber Microscopio 1624
Microscopio compuesto
S I S T E M A S D E U N M I C R O S C O P I O
ILUMINACIÓN M E C Á N I C O ÓPTICO
FUENTE DE
LUZ
CONDENSADOR
DIAFRAGMA
T. MACROMÉTRICO
T. MICROMÉTRICO
TUBO Y REVOLVER
OBJETIVOS
OCULARES
PIE
BRAZO Y
PLATINA
ÍNDICES DE REFRACCIÓN DE DIVERSOS MEDIOS
Medio Índice de refracción
Aire 1.00
Agua 1.33
Glicerina 1.45
Aceite de inmersión 1.51
Vidrio 1.52
Fluorita 1.43
Distintos tipos de óptica corregida utilizada en los microscopios
Tipo de óptica Corrección que realiza
Plan Esférica
Acrómatica Cromática
Neofluor Cromática con lentes de fluorita (λ290nm)
Planacromática Esférica y cromática
Planeofluor Esférica y cromática con lentes de fluorita (λ290nm)
Planapocromatica Esférica y cromática
Ultraflar λ230 – 700nm
Epiplan Luz reflejada
Pol Para polarización
Apertura numérica: es la medida de amplitud del cono luminoso formada por las lentes del microscopio (condensador u objetivo)
Distancia de trabajo: es la medida de la distancia entre la muestra y el objetivo
> aumento, >campo visual, distancia focal larga, para uso de gafas
Corrección planar (PL); Aumentos/distancia focal (10X/22), uso de gafas (M), campo amplio (WF),Harmonic component (HC)
Poder de Resolución
PR: Es la capacidad de percibir por separado dos puntos adyacentes y cercanos. El poder resolutivo aumenta a medida que disminuye la distancia que separa dichos puntos.
Objetivo Condensador
Límite de Resolución
LR= Longitud de onda
AN del objetivo + AN del condensador
LR: la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para que sean distinguidos por separado,
Lupa simple
Fotónico compuesto
Estereoscopico binocular
Electrónico de barrido
Fluorescencia Confocal 1P & 2P
Fluorescencia
Interacción entre la radiación y la materia, el segundo absorbe la radiación de una fuente específica y muy rápidamente emite luz.
Radiación Luz
1) La absorción de la luz de excitación elevala molécula del fluorocromo a un estado deexcitación con un mayor contenido deenergía, S1
2) En este estado de excitación semantienen un tiempo determinado, en elcual la molécula sufre cambiosconformacionales e interacciona con lasmoléculas de su entorno.Como consecuencia, parte de la energía delestado S1 se disipa, creándose un estadoS1’ de menor energía
3) Pasado este tiempo de excitación lamolécula emite luz de menor energíavolviendo a su estado fundamental, S0
S0
S1
S1’
1
2
3
Diagrama de Jablonski
1.#Absorción#de#energía#por#parte#del#fluorocromo##en# estado# fundamental# (S0)# lo# eleva# al# estado#excitado#(S1).##2.# Interacción# con# moléculas# del# entorno# S1,#cambios# conformacionales,# se# disipa# energía#creándose#un#estado#S1’.##3.# Emisión# de# luz# fluorescente# de#menor# energía#en#su#retorno#a#S0##
Diagrama de Jablonsky
Fluorocromo: molécula capaz de absorber y emitir fotones de menor energía. Fluoróforo: es la parte activa del fluorocromo responsable de la emisión de la fluorescencia.
Disminución de la fluorescencia
1. Photobleaching (Fotoblanqueo). Descomposición irreversible de las moléculas de los fluorocromos. Relacionado con la intensidad y tiempo de excitación de la muestra.
2. Quenching (efriamiento).Cualquier proceso que disminuye el tiempo del estado excitado o el tiempo de vida de un fluorocromo.
Las más utilizadas. Proporcionan excitación en el rango del ultravioleta así como en las regiones azul y verde.
Flujo luminoso estable y regular. Máximos irregulares entre 800 y 1.000 nm. Suficiente radiación en 440 a 540 nm, deficientes en el ultravioleta.
Mercurio
Xenon
Distintos tipos de óptica corregida utilizada en los microscopios
Tipo de óptica Corrección que realiza
Plan Esférica
Acrómatica Cromática
Neofluor Cromática con lentes de fluorita (λ290nm)
Planacromática Esférica y cromática
Planeofluor Esférica y cromática con lentes de fluorita (λ290nm)
Planapocromatica Esférica y cromática
Ultraflar λ230 – 700nm
Epiplan Luz reflejada
Pol Para polarización
M I C R O S C O P I O D E F L U O R E S C E N C I A
V E N T A J A S DESVENTAJAS CUANTITATIVA
IMÁGENES IN VIVO
PREVIO AL USO
DEL CONFOCAL
BAJA
RESOLUCIÓN
AUTOFLUORESCENCIA
ALTO
CONTRASTE
ALTA
ESPECIFICIDAD
RÁPIDO
FOTOBLANQUEO
ALTA DISPERSIÓN
DE LA LUZ
IMÁGENES 2D
FRAP, Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP y FLIP
Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) se decolora un área específicapor altos pulsos de láser de intensidad. Posteriormente la cinética de recuperación defluorescencia es registrada por imágenes de muestreo en intervalos de tiemporegulares con la iluminación de intensidad baja. Uso: Difusión y movilidad demacromoléculas.
Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) una célula fluorescente es decoloradapor el láser sostenidamente en una única región mientras se registra la célulacompleta. Cualquier región en contacto con el área afectada será gradualmentedecolorada por los movimientos laterales de las proteínas. En regiones sin conexiónla fluorescencia permanecerá intacta. Uso: evaluar continuidad entre áreas,movimiento de proteínas
FLIP, Fluorescence Loss in Photobleaching
FRAP y FLIP
Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) se decolora un área específicapor altos pulsos de láser de intensidad. Posteriormente la cinética de recuperación defluorescencia es registrada por imágenes de muestreo en intervalos de tiemporegulares con la iluminación de intensidad baja. Uso: Difusión y movilidad demacromoléculas.
Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) una célula fluorescente es decoloradapor el láser sostenidamente en una única región mientras se registra la célulacompleta. Cualquier región en contacto con el área afectada será gradualmentedecolorada por los movimientos laterales de las proteínas. En regiones sin conexiónla fluorescencia permanecerá intacta. Uso: evaluar continuidad entre áreas,movimiento de proteínas
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